TR201815937T4 - Rekombinant AAV vektörlerinin purifikasyonu için geliştirilen yöntemler. - Google Patents
Rekombinant AAV vektörlerinin purifikasyonu için geliştirilen yöntemler. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201815937T4 TR201815937T4 TR2018/15937T TR201815937T TR201815937T4 TR 201815937 T4 TR201815937 T4 TR 201815937T4 TR 2018/15937 T TR2018/15937 T TR 2018/15937T TR 201815937 T TR201815937 T TR 201815937T TR 201815937 T4 TR201815937 T4 TR 201815937T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- raav
- cases
- apatite
- buffer
- particles
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 203
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 title abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 47
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 52
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 194
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 126
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 126
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 125
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 64
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 48
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 39
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 37
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 37
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 37
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 18
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 16
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 16
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 claims description 16
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 13
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012616 hydrophobic interaction chromatography medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 113
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 80
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 69
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 58
- 239000012092 media component Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 2
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 202
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 202
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 121
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 121
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 98
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 66
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 57
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 53
- 230000008569 process Effects 0.000 description 50
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 47
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 45
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 33
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 33
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 32
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 30
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 26
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 23
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 21
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 21
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 17
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 16
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 16
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 16
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 14
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 13
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 11
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 11
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 11
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 10
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 10
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 10
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 9
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 8
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 7
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 7
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 3
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000013621 viresolve pro solution Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 2
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- RKFCDGOVCBYSEW-AUUKWEANSA-N tmeg Chemical compound COC=1C(OC)=CC(C(OC(C=2OC)=C34)=O)=C3C=1OC(=O)C4=CC=2O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RKFCDGOVCBYSEW-AUUKWEANSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 101100495845 Caenorhabditis elegans cht-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 101150077651 VP35 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 235000005550 amino acid supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920005644 polyethylene terephthalate glycol copolymer Polymers 0.000 description 1
- TVPFLPJBESCUKI-UHFFFAOYSA-M potassium;n,n-dimethylcarbamodithioate Chemical compound [K+].CN(C)C([S-])=S TVPFLPJBESCUKI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012794 pre-harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000013645 rAAV1 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013646 rAAV2 vector Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 238000011172 small scale experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Burada sağlanan; gen tedavisi için ve spesifik olarak gen tedavisi ve aşılama için kullanılabilen rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörlerinin pürifikasyonu için yöntemlerdir. Buluşun rekombinant AAV vektörleri; esas itibarıyla hücresel nükleik asitler, hücresel proteinler, yardımcı virüs ve ortam bileşenleri gibi üretim bileşenlerini içeren süreç içi safsızlıklar hariçtir.
Description
TARIF NAME
REKOMBINANT AAV VEKTÖRLERININ PURIFIKASYONU içiN GELISTIRILEN
YÖNTEMLER
BULUSUN ALANI
Mevcut bulus da dahil bu açiklama, genel olarak gen transferi için ve spesifik olarak gen
tedavisi ile vaksinasyon için kullanilabilen rekombinant adeno iliskili virüs (rAAV) vektörlerinin
purifikasyon alani ile ilgilidir. Daha spesifik olarak, hücresel nükleik asitler, hücresel
proteinler, yardimci virüs ve ortam bilesenleri gibi büyük ölçüde süreç içi üretim bilesenleri
içermeyen rekombinant rAAV vektörlerine yönelik yöntemler ile ilgilidir.
BULUSUN ARKA PLANI
Adeno iliskili virüsler (AAV), gen tedavisi ve genetik asilara yönelik vektörler olarak onlari
çekici hale getiren benzersiz özelliklere sahiptir. Kültürdeki hücrelerin AAV enfeksiyonu
nonsitopatiktir ve insanlar ile diger hayvanlarin dogal enfeksiyonu; sessiz, asemptomatiktir ve
herhangi bir insan hastaliginin etiyolojisini içermez. Ayrica, AAV, in vivodaki birçok farkli
dokunun hedeflenmesi olasiligina imkan saglayan birçok memeli hücresini içeren çok sayida
hücre tipine enfekte olur. AAV, yavas yavas bölünen ve bölünmeyen hücrelere enfekte olur
ve transkripsiyonel olarak aktif bir nükleer epizom (ekstrakromozomal eleman) olarak esasen
bu hücrelerin ömrü boyunca sürdürülebilir. Karaciger ve kas gibi organlardaki rAAV
vektörünün entegre edilen kopyalari çok nadirdir. Etkili uzun süreli gen transferi; göz, CNS ve
kasi içeren birkaç hücre tipinde rapor edilmistir. Örnegin, bakiniz, X. Xiao et al., J. Virol.
çalismalar büyük ölçüde, serotip 2 rAAV vektörlerinin kullanimina odaklanmistir, ancak
birkaç rapor; rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 ve rAAV-8'i içeren diger AAV serotiplerinin, viral
serotiplerin klinik çalismalarda test edilmesi için onlari çekici hale getiren essiz in vivo
biyolojik dagilima sahip oldugu gösterilmistir.
Adeno iliskili virüs (AAV); içeren uzunlukta
yaklasik 4.7 kb'Iik replikasyon bakimindan eksik bir parvovirüs, tek dizili DNA genomudur.
Cis-aktiviteli sekanslar ile yöneltilen viral DNA replikasyonu (rep),
enkapsidasyon/ambalajlama ve konukçu hücre kromozom entegrasyonu, ITR'ler dahilinde
yer alir. Üç AAV promotörü, p5, p19 ve p40 (onlarin relatif planlama Iokasyonlari için
isimlendirilir), rep ve cep genlerini kodlayan iki AAV iç açik okuma çerçevesinin
ekspresyonunu yönlendirir. 2107 ve 2227 nükleotitlerindeki tekli AAV intronunun diferansiyel
eklemesi ile akuple olan iki rep promotörü (p5 ve p19), rep geninden elde edilen dört rep
proteininin (rep78, rep68, rep52 ve rep40) üretilmesine yol açar. Rep proteinleri, nihayetinde
viral genomun replikasyonundan sorumlu olan çoklu enzimatik özelliklerine sahiptir. Cap
geni, p40 promotöründen ifade edilir ve kapsid proteinleri VP1, VP2 ile VP35ü kodlar.
Alternatif ekleme ve konsensüs olmayan translasyonel baslangiç alanlari, ilgili üç kapsid
proteininin üretilmesinden sorumludur. Bir tekli konsensüs poliadenilasyon alani, AAV
genomunun plan pozisyonu 95'e yerlesir. AAV'nin genetikleri ve yasam süresi, Muzyczka,
AAV partikülleri; üç kapsid proteini VP1, VP2 ve VP3'e sahip olan bir proteinli kapsidi kapsar,
~4-6 kb lineer tek dizili bir DNA genomunu çevreler. Tekil partiküller sadece bir DNA molekül
dizisini paketler, ancak bu ya arti ya da eksi dizi olabilir. Her iki diziyi de içeren partiküller
infeksiyözdür ve replikasyon, tekli dizinin bir çift forma ve sonraki amplifikasyona enfekte olan
parenteral dönüsüm yoluyla meydana gelir, döl tekli dizileri yer degistirir ve kapsidlere
paketlenir. AAV genomlarinin çift ya da tek dizili kopyalari (bazen “proviral DNA" ya da
ve adenovirüs enfekteli hücreler haline transfekte edilebilir. AAV'nin genel bir gözden
rAAV vektör üretimi genel olarak dört yaygin eleman gerektirir: 1) replikasyon için istege
bagli bir konukçu hücre; 2) adenovirüs ya da herpes virüsü gibi uygun yardimci virüsler
tarafindan ya da alternatif olarak minimal adenoviral yardimci fonksiyonlar içeren plazmid
yapilari tarafindan saglanabilen yardimci virüs fonksiyonu; 3) paketleme arasi bir rep-kapak
yapisi; ve 4) uygun bir üretim ortami.
Rekombinant AAV partikülleri, hücre Iizatlarinin paketlenmesinden üretilebilir. Örnegin,
hücre DNAisi gibi çesitli hücresel bilesenler, konukçu hücre proteinleri, medya bilesenleri ve
ya yardimci virüs ya da yardimci virüs plazmid DNA'sini içerip, in vivo kullanimi için uygun
olmadan önce rAAV vektöründen ayrilmalidir. rAAV üretimindeki son gelismeler, karistirma
tanki biyoreaktörleri ve üretim kosullarindaki yapismayan hücre süspansiyon proseslerinin
kullanimini içerir, oysa ki rAAV vektörleri, üretim malzemesinde mevcut olan ancak yine de
süreç içi safsizliklari içeren konukçu hücre bilesenlerinin konsantrasyonunu azaltan ortam ya
nedenle, rAAV partikülleri, ortamdan ve/veya hücre Iizatindan toplanabilir ve ayrica
saflastirilabilir.
rAAV vektörlerinin ve özellikle rAAV-2'nin saflastirilmasi için kullanilan yogunluk gradyan
santrifügasyonunu içeren yöntemler, ölçek büyütmeden etkilenmez. rAAV-2 vektörleri için
son raporlar, ters iyon degisimi kromatografisini (katyon ve anyon kromatografisini içeren)
kapsayan iyon degisimi kromatografisi kullanilan saflastirma yöntemlerini tanimlamistir.
Örnek olarak, bir kültür süpematanti ve/veya bir hücre Iizatindan rekombinant adeno iliskili
virüs vektörlerinin saflastirilmasi için ters iyon degisimi kromatografisinin bir
kombinasyonunun kullanim yöntemlerini açiklayan U.S. Patent No. 6,566,118 ve PCT WO
99/11764'e bakiniz. rAAV stok preparasyonlarindaki ek iyilestirmeler; afinite
kromatografisinden önce hücre lizati, iyodiksanol gradyan separasyonunun deoksikolat
tedavisinin kullanimini içerir, yüksek titre rAAV2'ye sebep olur (Clark et al., Hum. Mol. Genet.
rekombinant adeno iliskili virüs vektörleri ve özellikle örnek vermek gerekirse, iyon degisimi
kromatografisi, hidroksiapatit kromatografisi, selüfin sülfat afinite kromatografisi ile çinko selat
kromatografisi kullanilarak rAAV-2 vektörleri için ölçeklenebilir kromatografik saflastirma
prosesi rapor edilmistir.
Son veriler; rAAV-1, 4, 5 ve 8 gibi rAAV kapsid serotiplerinin, ya saflastirilmis virüs stogu ya
da konukçu hücre DNA, konukçu hücre proteinleri, serum albumin, ortam bilesenleri ve
yardimci virüs bilesenleri gibi süreç içi üretim safsizliklarinin mevcudiyetinde anyonik
reçinelere zayif bir sekilde baglandigini gösterir. sonuç olarak, bu kapsid serotiplerinin
saflastirilmasi tipik olarak, iyodiksinol yogunluk gradyan santrifügasyonu gibi diger
saflastirma yöntemleri ile kombinasyonda anyon degisimi kromatografisini kapsar. Örnegin,
yöntemler, ticari ölçekli proseslere kolaylikla ölçeklenebilir degildir.
Bu dogrultuda, gen tedavisi ve gen asilarinda kullanilma amaçli olanlar gibi rekombinant
AAV vektörlerinin gelisiminde, rAAV üretim stogunda mevcut olan yardimci virüs proteinleri,
hücresel proteinler, konukçu hücre DNA ve ortam bilesenlerinin yanisira yardimci virüs
içeren süreç içi üretim bilesenlerinden rAAV vektörlerinin saflastirilma yöntemleri için bir
ihtiyaç vardir. Bu tip yöntemler, gen tedavi tekniklerinin pratik uygulamasi için uygun bir
ölçekte etkili bir sekilde kullanilmalidir. Ayrica, rAAV gen tedavisi ve gen asilari için kullanisli
yüksek titreli, son derece saflastirilmis ticari stoklari vermesi için ölçeklenebilen rAAV
vektörleri için saflastirma proseslerinin gelistirilmesi için bir ihtiyaç vardir. Daha ayrintili
olarak, kromatografik reçinelere ve bilhassa anyonik reçinelere zayif bir sekilde baglanan
rAAV vektörleri için saflastirma proseslerinin gelistirilmesi için bir ihtiyaç vardir.
Burada saglanan açiklama anlamayi netlestirmek amaci dogrultusunda illüstrasyon ve örnek
yoluyla biraz ayrintili olarak tanimlanmis oldugundan dolayi, belirli degisiklikler ve
modifikasyonlarin ayrica yapilabildigi bu açiklamanin ögretilerinin isiginda teknikte siradan
uzman kisilerce kolaylikla anlasilacaktir.
BULUSUN ÖZETI
Açiklama, polietilen glikol (PEG) varliginda bir apatit kromatografi ortamindaki rAAV
partiküllerinin yakalanmasi ile süreç içi safsizliklardan elde edilen herhangi bir kapsid
serotipinin rekombinant adeno iliskili virüs (rAAV) partiküllerinin bir popülasyonunun izole
edilme yöntemlerini saglar. Açiklama yöntemleri, asagi akim prosesinin (örnek olarak, isi ile
etkisizlestirme, filtrasyon, hidrofobik etkilesim kromatografisi, boyut dislama kromatografisi
ve/veya anyon degisimi kromatografisi gibi) yani sira yukari akim prosesine (örnek olarak,
santrifügasyon, Benzonase® ile tedavi, anyon degisim filtrasyonu ve/veya tegetsel akis
filtrasyonu gibi) neden olur. Yukari akim ve asagi akim yöntemleri tek basina ya da çesitli
kombinasyonlarda kullanilabilir.
Açiklama, asagidaki adimlari kapsayan bir besleme akisindaki süreç içi safsizliklardan elde
edilen rekombinant adeno iliskili virüs (rAAV) partiküllerinin bir popülasyonunun izole edilme
yöntemlerini saglar: (a) polietilen glikol (PEG) varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisi ile iliski kurmasi, burada rAAV partikülleri bir
apatit kromatografi ortamina baglanir; ve (b) %3 PEG'den (agirlik/hacim) daha azini içeren
bir elüsyon tamponu ile apatit kromatografi ortamina baglanan rAAV partiküllerinin
ayristirilmasi. Belirli durumlarda, apatit kromatografi ortami, seramik hidroksiapatit (CHT) ya
da seramik floroapatittir (CFT). Belirli durumlarda, apatit kromatografi ortamina bagli rAAV
partikülleri, %3 PEG'den (agirlik/hacim) daha azini içeren bir elüsyon tamponu ile ayristirilir.
Belirli durumlarda, apatit kromatografi ortamina bagli rAAV partikülleri, PEG yoklugunda bir
elüsyon tamponu ile ayristirilir.
Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortaminin spesifik baglanimi, her milimetre basina 106
ile arasindadir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi
ortaminin spesifik baglanimi, her milimetre basina 108 ile 1016 DNaz'a dayanikli partikül
(DRPller) arasindadir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortaminin spesifik baglanimi, her
milimetre basina arasindadir. Bazi
durumlarda, apatit kromatografi ortaminin spesifik baglanimi, her milimetre basina 1012 ile
arasindadir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi
ortaminin spesifik baglanimi, her milimetre basina 1014 ile 1016 DNaz'a dayanikli partikül
(DRPiler) arasindadir.
Bazi durumlarda, yöntem ayrica apatit kromatografi adimi öncesindeki bir anyon degisim
filtrasyon adimini kapsar, burada rAAV partikülleri anyon degisim filtrasyonunun sürekli
akisidir. Bazi durumlarda, yöntem ayrica apatit kromatografi adimi öncesindeki tegetsel akis
filtrasyonu ile anyon degisim filtrasyonunun sürekli akisindan elde edilen rAAV partiküllerinin
konsantre edilmesini kapsar. Bazi durumlarda, yöntem ayrica bir apatit kromatografi
ortamindan bir anyonik kromatografi ortamina kadar ayristirilan besleme akisindaki rAAV
partiküllerinin bir baglanma adimini kapsar. Bazi durumlarda, yöntem ayrica bir yardimci
virüsü etkisizlestirmek için bir isi inaktivasyon adimini kapsar. Bazi durumlarda, yöntem
ayrica apatit kromatografisi sonrasindaki bir hidrofobik etkilesim kromatografisi için besleme
akisindaki rAAV partiküllerinin bir baglanma adimini kapsar.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisi, polietilen glikol (PEG) ile bir
bazik tampon mevcudiyetinde bir apatit kromatografi ortami ile iliski kurar. Bazi durumlarda,
kullanilabilir. Bazi durumlarda, bazik tampon borat içerir. Bazi durumlarda, bazik tampon
borattir.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, polietilen glikol (PEG) varliginda
bir apatit kromatografi ortami ile iliski kurar. Örnek olarak, PEG'in yaklasik %3 (agirlik/hacim)
ile yaklasik %10'u (agirlik/hacim) arasi kullanilabilir. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi; yaklasik %3 (agirlik/hacim), yaklasik %3,5 (agirlik/hacim), yaklasik %4
(agirlik/hacim), yaklasik %4,5 (agirlik/hacim), yaklasik %5 (agirlik/hacim), yaklasik %5,5
(agirlik/hacim), yaklasik %6 (agirlik/hacim), yaklasik %6,5 (agirlik/hacim), yaklasik %7
(agirlik/hacim), yaklasik %7,5 (agirlik/hacim), yaklasik %8 (agirlik/hacim), yaklasik %8,5
(agirlik/hacim), yaklasik %9 (agirlik/hacim), yaklasik %9,5 (agirlik/hacim), yaklasik %10
agirlik/hacim) PEG varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar.
Bazi durumlarda PEG, her mol basina yaklasik gram ile her mol basina
yaklasik gram arasinda, örnegin, her mol basina yaklasik gram, her mol basina yaklasik
gram, her mol basina
yaklasik gram, her mol
basina yaklasik
gram, her mol basina yaklasik gram, her mol basina yaklasik gramlik bir ortalama molekül
agirligina sahiptir. Belirli durumlarda, PEG, her mol basina yaklasik
gramlik bir ortalama molekül agirligina sahiptir. Belirli somut durumlarda, PEG, her mol
basina yaklasik gramlik bir ortalama molekül agirligina sahiptir. Belirli
somut durumlarda, PEG, her mol basina yaklasik gramlik bir ortalama
molekül agirligina sahiptir. Belirli somut durumlarda, PEG, her mol basina yaklasik gramlik bir ortalama molekül agirligina sahiptir. Belirli somut durumlarda, PEG,
her mol basina yaklasik gramlik bir ortalama molekül agirligina sahiptir.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile
yaklasik %10 (agirlik/hacim) arasinda PEGGOOO varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3
(agirlik/hacim) PEGBOOO varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %4 (agirlik/hacim) PEGBOOO
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG6000 varliginda bir apatit kromatografi
ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %7 (agirlik/hacim) PEGBOOO
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %8 (agirlik/hacim) PEGGOOO varliginda bir apatit kromatografi
ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %10 (agirlik/hacim) PEGGOOO
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile
yaklasik %10 (agirlik/hacim) arasinda PEG8000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3
(agirlik/hacim) PEG8000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %4 (agirlik/hacim) PEG8000
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG8000 varliginda bir apatit kromatografi
ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %7 (agirlik/hacim) PEGSOOO
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %8 (agirlik/hacim) PEGBOOO varliginda bir apatit kromatografi
ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik
durumlarda, rAAV paitiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %10 (agirlik/hacim) PEG8000
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile
yaklasik %10 (agirlik/hacim) arasinda PEG10000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3
(agirlik/hacim) PEG10000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %4 (agirlik/hacim) PEG1000O
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG1000O varliginda bir apatit
kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme
akisi, yaklasik %6 (agirlik/hacim) PEG1000O varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %7
(agirlik/hacim) PEG10000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %8 (agirlik/hacim) PEG1000O
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %9 (agirlik/hacim) PEG10000 varliginda bir apatit
kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme
akisi, yaklasik %10 (agirlik/hacim) PEG10000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile
yaklasik %10 (agirlik/hacim) arasinda PEG15000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %3
(agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %4 (agirlik/hacim) PEG15000
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit
kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme
akisi, yaklasik %6 (agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %7
(agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi
durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik %8 (agirlik/hacim) PEG15000
varliginda bir apatit kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini
içeren besleme akisi, yaklasik %9 (agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit
kromatografi ortami ile temas kurar. Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme
akisi, yaklasik %10 (agirlik/hacim) PEG15000 varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar.
Bazi durumlarda, rAAV partiküllerini içeren besleme akisi, yaklasik 20 mM borat pH 9,0 ve
yaklasik %5 PEG (PEGGOOO gibi) içeren bir tampondaki bir apatit kromatografi ortami ile
temas kurar. Bazi durumlarda, besleme akisi; pH 9,0'da yaklasik 20 mM borat ve yaklasik
Bazi durumlarda, ortama bagli rAAv partiküllü bir apatit kromatografi ortami, rAAV
partiküllerini ayristirmadan önce süreç içi safsizliklarin giderilmesi için yikanir. Bazi
durumlarda, apatit kromatografi ortami, süreç içi safsizliklari gidermek için PEG'in azalan
konsantrasyonlarini içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi
durumlarda, bir apatit kromatografi ortami, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile yaklasik %10
(agirlik/hacim) arasinda PEG içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir.
Bazi durumlarda, yikama tamponu; yaklasik %10 (agirlik/hacim), 9.5% (agirlik/hacim), 9%
(agirlik/hacim), %8,5 (agirlik/hacim), %8 (agirlik/hacim), %7,5 (agirlik/hacim), %7
(agirlik/hacim), %6,5 (agirlik/hacim), %6 (agirlik/hacim), %5,5 (agirlik/hacim), %5
(agirlik/hacim), %4,5 (agirlik/hacim), %4 (agirlik/hacim), %3,5 (agirlik/hacim) ve %3
(agirlik/hacim) PEG'in herhangi birini içerir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami,
yaklasik %7,5 (agirlik/hacim) PEGSOOO içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla
defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik %7,5 (agirlik/hacim)
PEG8000 içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda,
apatit kromatografi ortami, yaklasik %7,5 (agirlik/hacim) PEG10000 içeren bir yikama
tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi dummlarda, apatit kromatografi ortami,
yaklasik %7,5 (agirlik/hacim) PEG15000 içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla
defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik %5 (agirlik/hacim)
PEG6000 içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda,
apatit kromatografi ortami, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG8000 içeren bir yikama tamponu
ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik
yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG15000
içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit
kromatografi ortami, yaklasik %3 (agirlik/hacim) PEGBOOO içeren bir yikama tamponu ile bir
ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik %3
(agirlik/hacim) PEG8000 içeren bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir.
Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, yaklasik %3 (agirlik/hacim) PEG1000O içeren
bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit
kromatografi ortami, yaklasik %3 (agirlik/hacim) PEG 15000 içeren bir yikama tamponu ile
bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami, PEG
içermeyen bir yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir.
Bazi durumlarda, yikama tamponu teknikte bilinen tamponlari kapsar. Bazi durumlarda,
yikama tamponu; borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve Tris-
HCI'den olusan gruptan seçilen bir tamponu kapsar. Bazi durumlarda, yikama tamponu
borati kapsar ya da borattir. Bazi durumlarda, yikama tamponu HEPES'i kapsar ya da
HEPESftir. Bazi durumlarda, yikama tamponu Tris-HCFI kapsar ya da Tris-HCI'dir. Bazi
durumlarda, yikama tamponu bazik pH'dadir. Bazi durumlarda, yikama tamponu; pH 7,0 ile
yikama tamponu, 8,0 ile 10,0 arasinda bir pH'da borati kapsar ya da borattir. Bazi
durumlarda, yikama tamponu pH 8,0'da borati kapsar ya da borattir. Bazi durumlarda,
yikama tamponu pH 9,0'da borati kapsar ya da borattir. Bazi durumlarda, yikama tamponu
pH 10,07da borati kapsar ya da borattir. Bazi durumlarda, yikama tamponu, 7,0 ile 10,0
arasinda bir pH'da HEPES'i kapsar ya da HEPES'tir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH
7,0'da HEPES'i kapsar ya da HEPES'tir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 8,0'da
HEPES'i kapsar ya da HEPES'tir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 9,0'da HEPESW
kapsar ya da HEPES'tir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 10,0'da HEPESii kapsar ya
da HEPES`tir. Bazi durumlarda, yikama tamponu, 7,0 ile 10,0 arasinda bir pH”da Tris-HCI'yi
kapsar ya da Tris-HCI'dir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 7,0'da Tris-HCI”yi kapsar ya
da Tris-HCI'dir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 8,0'da Tris-HCI'yi kapsar ya da Tris-
HCI'dir. Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 9,0`da Tris-HCI'yi kapsar ya da Tris-HCI`dir.
Bazi durumlarda, yikama tamponu pH 10,0'da Tris-HCI'yi kapsar ya da Tris-HCI'dir. Bazi
durumlarda, yikama tamponu ayrica 100 ile 500 mM arasinda fosfat da içerir. Bazi
durumlarda, yikama tamponu ayrica 50 ile 250 mM arasinda NaCI de içerir.
Bazi durumlarda, yikama adimi; yaklasik pH 9,0'da yaklasik 30 mM borat ve yaklasik %7,5
PEG içeren bir yikama tamponu ile birinci yikamayi; yaklasik pH 9,0'da yaklasik 150
potasyum fosfat, yaklasik 20 rnM borat ve yaklasik %5 PEG içeren bir yikama tamponu ile
ikinci yikamayi; yaklasik pH 9,0'da yaklasik 20 mM borat ve yaklasik %5 PEG içeren bir
yikama tamponu ile üçüncü yikamayi; ve pH 7,0'da yaklasik yaklasik 20 mM HEPES ve 150
mM NaCI içeren bir yikama tamponu ile dördüncü yikamayi kapsar.
Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortamina bagli rAAV partikülleri, PEG'in yoklugunda ya
da PEG'in düsük konsantrasyonlarini içeren bir elüsyon tamponu ile ayristirilir. Bazi
durumlarda, elüsyon tamponu; yaklasik %3'ten (agirlik/hacim) daha az PEG, yaklasik
içerir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu; yaklasik %2,5 (agirlik/hacim), yaklasik %2
(agirlik/hacim), yaklasik %1,5 (agirlik/hacim), yaklasik %1 (agirlik/hacim) ya da yaklasik
yaklasik %3'ten (agirlik/hacim) daha az PEG6000 içerir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu,
yaklasik %3'ten (agirlik/hacim) daha az PEG8000 içerir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu,
yaklasik %S'ten (agirlik/hacim) daha az PEG10000 içerir. Bazi durumlarda, elüsyon
tamponu, yaklasik %3'ten (agirlik/hacim) daha az PEG15000 içerir. Bazi durumlarda, apatit
kromatografi ortamina bagli rAAV partikülleri, PEGlin yoklugunda bir elüsyon tamponu ile
ayristirilir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu; borat, N-2-HidroksietiIpiperazin-Nt-Z-
etansülfonik asit (HEPES) ve Tris-HCl'den olusan gruptan seçilen bir tamponu kapsar. Bazi
durumlarda, elüsyon tamponu borati kapsar ya da borattir. Bazi durumlarda, elüsyon
tamponu HEPES'i kapsar ya da HEPES'tir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu Tris-HCI'yi
kapsar ya da Tris-HCI'dir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu nötral pH'dadir. Bazi
durumlarda, elüsyon tamponu nötral leda HEPESli kapsar ya da HEPES'tir. Bazi
durumlarda, elüsyon tamponu nötral pHida Tris-HCI'yi kapsar ya da Tris-HCI'dir. Bazi
durumlarda, elüsyon tamponu 100 mM fosfattan daha azini içerir. Bazi durumlarda, elüsyon
tamponu 50 mM fosfattan daha azini da içerir. Bazi durumlarda, elüsyon tamponu, 50 ile 250
mM arasinda NaCl de içerir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortamina bagli rAAV
partikülleri; yaklasik pH 7,0”da yaklasik 50 mM potasyum fosfat, yaklasik 20 mM HEPES ve
yaklasik 150 mM NaCl içeren bir elüsyon tamponu ile ayristirilir.
Bazi durumlarda, bir besleme akisindaki süreç içi safsizliklardan elde edilen rAAV
partiküllerinin izole edilme yöntemi asagidaki adimlari kapsar: (a) yaklasik pH 9,0'da bir bazik
tampondaki yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG varliginda bir apatit kromatografi ortami ile
rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisini içerir, burada rAAV partikülleri apatit
kromatografi ortamina baglanir; (b) yaklasik pH 9,0'da yaklasik 30 mM borat ve yaklasik
yaklasik pH 9,0'da yaklasik 150 potasyum fosfat ile yaklasik 20 mM borat ve yaklasik %5
PEG içeren bir ikinci yikama tamponlu bir apatit kromatografi ortaminin yikanmasi; (d)
yaklasik pH 9,0'da yaklasik 20 mM borat ve yaklasik %5 PEG içeren bir üçüncü yikama
tamponlu bir apatit kromatografi ortaminin yikanmasi; (e) yaklasik pH 7,0”da yaklasik 20 mM
HEPES ve 150 mM NaCl içeren bir dördüncü yikama tamponlu bir apatit kromatografi
ortaminin yikanmasi; ve (f) yaklasik pH 7,0'da yaklasik 50 mM potasyum fosfat, yaklasik 20
mM HEPES ve yaklasik 150 mM NaCl içeren bir elüsyon tamponlu apatit kromatografi
ortamina baglanan rAAV partiküllerinin ayristirilmasi.
Ayrica burada açiklanan, asagidaki adimlari kapsayan bir besleme akisindaki süreç içi
safsizliklardan elde edilen rekombinant adeno-iliskili virüs (rAAV) partiküllerinin bir
popülasyonunun izole edilmesi için yöntemlerdir: (a) rAAV partiküllerini içeren bir besleme
akisinin bir yüksek tuz tamponundaki bir hidrofobik etkilesim kromatografi (HIC) ortami ile
temas kurmasidir, burada rAAV partikülleri ve süreç içi safsizliklar HIC ortamina baglanir; ve
(b) bir orta tuz tamponu ile HIC ortamina baglanan rAAV partiküllerinin ayristirilmasi. Burada
yer alan açiklamaya göre bulus, asagidaki adimlari içeren, bir besleme akisindaki süreç içi
safsizliklardan rekombinant adeno-iliskili virüs (rAAV) partikülleri popülasyonunun izole
edilmesine yönelik bir yöntemi saglar: (a) rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisinin, bir
yüksek tuz tamponundaki bir hidrofobik etkilesim kromatografi (HIC) ortami ile temas
kurmasidir, burada yüksek tuz tamponu, 0.5M ile 2.0M arasinda sitrat içerir, rAAV partikülleri
ve süreç içi safsizliklar HIC ortamina baglanir; ve (b) bir orta tuz tamponu ile HIC ortamina
baglanan rAAV partiküllerinin ayristirilmasi, burada orta tuz tamponu, 0.5M'den az sitrat
içerir. Bulusun ilave bakis açilari somut örnekleri ekteki istemlerde ortaya konmustur. Bazi
somut örneklerde, HIC ortami; Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 6500, Tosoh Phenyl
reçineden olusan gruptan seçilir. Bazi
durumlarda ve mevcut bulusta, yüksek tuz tamponu, sitrat içerir ya da 0,5 M ile 2,0 M
arasinda sitrat (örnegin, sodyum sitrat) vardir. Bazi somut örneklerde, yüksek tuz tamponu;
Bazi durumlarda, orta tuz tamponu, sitrat içerir ya da 0,5 M`den daha az sitrat (örnegin,
sodyum sitrat) vardir. Bazi somut örneklerde, orta tuz tamponu 0,5 M ile yaklasik 0,3 M
arasinda sitrat içerir. Bazi somut örneklerde, orta tuz tamponu; sitratin yaklasik 0,45 M, 0,4
M, 0,35 M, 0,3 M ve 0,25 M'inin herhangi birini kapsar. Bazi somut örneklerde, yüksek tuz
tamponu ayrica 1 ile 100 mM arasinda fosfat içerir. Bazi somut örneklerde, yüksek tuz
tamponu ayrica 1 ile 100 mM arasinda fosfat içerir. Bazi somut örneklerde, orta tuz tamponu
ayrica 1 ile 100 mM arasinda fosfat içerir. Bazi somut örneklerde, orta tuz tamponu bos
kapsidler, kismen denatüre kapsidler, daha az infeksiyöz kapsidler ve/veya kismen tam
kapsidler ile rAAV partikülleri ayristirilmadan rAAV partiküllerini ayristirir. Bazi somut
örneklerde, orta tuz tamponu; bos kapsidler, kismen denatüre kapsidler, daha az infeksiyöz
kapsidler ve/veya kismen tam kapsidler ile rAAV partikülleri ayristirilmadan rAAV
partiküllerini ayristirir.
Burada açiklanan durumlarin veya somut örneklerin herhangi birinde, rAAV partikülleri; AAV-
AAV-13, AAV-14, AAV-15 ve AAV-16'dan olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid serotipine
sahiptir. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, rAAV partikülleri; AAV-1, AAV-4, AAV-5 ve
AAV-8'den olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid serotipine sahiptir. Bazi somut örneklerde,
rAAV partikülleri AAV-1'in bir kapsid serotipine sahiptir. Bazi durumlarda veya somut
örneklerde, rAAV partikülleri AAV-4'ün bir kapsid serotipine sahiptir. Bazi durumlarda veya
somut örneklerde, rAAV partikülleri AAV-5'in bir kapsid serotipine sahiptir. Bazi durumlarda
veya somut örneklerde, rAAV partikülleri AAV-8'in bir kapsid serotipine sahiptir. Bazi
durumlarda veya somut örneklerde, rAAV partikülleri; AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5,
16'den olusan gruptan seçilen bir AAV serotipinden elde edilen bir AAV kapsid proteinini
kapsar. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, rAAV partikülleri, zayif bir anyonik baglayici
olan bir AAV kapsid serotipine sahiptir. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, zayif bir
anyonik baglayici olan bir AAV kapsid serotipi; AAV-1, AAV-4, AAV-5 ve AAV-8'den olusan
gruptan seçilir. Bazi somut örneklerde, rAAV partiküllerini de içeren bir bilesim, üretim kültür
kontaminantlarini kapsar. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, üretim kültür
kontaminantlari; hasarli rAAV partikülleri, konukçu hücre kontaminantlari, yardimci virüs
kontaminantlari ve/veya hücre kültür kontaminantlarini kapsar. Bazi durumlarda veya somut
örneklerde, konukçu hücre kontaminantlari; konukçu hücre DNA'si, plasmidleri ya da
konukçu hücre proteinini kapsar. Bazi durumlarda veya somut ömeklerde, yardimci virüs
kontaminantlari; adenovirüs partikülleri, adenovirüs DNA ya da adenovirüs proteinlerini
kapsar. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, hücre kültür kontaminantlari; ortam
bilesenleri, serum albumin ya da diger serum proteinlerini kapsar. Bazi somut örneklerde,
hücre kültür kontaminantlari ortam bilesenlerini kapsar. Bazi durumlarda veya somut
örneklerde, hücre kültür kontaminantlari, serum albumin ya da diger serum proteinlerini
kapsamaz.
Burada tanimlanan çesitli somut örneklerin biri, birkaçi ya da tümünün, bu bulusun diger
somut örneklerini olusturmasi için biriestirilebildigi anlasilmis olacaktir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Sekil 1, rAAV üretim kültür hasadindan aritilmis süpernatantin Benzonase®
sindiriminin sonuçlarini sunar. Sonuçlar; asagidaki Benzonase® sindirimini sunan
mevcut herhangi bir yüksek molekül agirlikli DNA olmadigini kanitlar.
Sekil 2, Örnek 4'te tanimlandigi sekilde rAAV baglanma afinitesi için gösterilen tipik
bir reçine için tipik bir spektrofotometrik izlemeyi sunar. Absorbans (AU) ve iletkenlik
(mS/cm) gösterilmistir.
Sekil 3, PEG ile ya da PEG olmaksizin bir iyilestirme kapasite analizini sunar. Iki
model rAAV üretim kültürü, apatit reçinenin (CFT tip I) kapasitesini degerlendirmek
için kullanilmistir. Üst panel: yüklemede yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG6000
varligindaki ya da yoklugundaki serum içeren ya da serumsuz besleme akislarinin
yüklemesi süresince iyilestirmedir. Yükleme hacimleri, 1:1 baglantili dilüsyon
öncesinde baslangiç besleme akisini ifade eder ve her mL reçine hacmi basina
normalize edilmistir. Alt panel: %1 iyilestirmedeki yükleme hacimleri (ml) ve elüsyon
fraksiyonundaki geri kazanimdir. Deneyde degerlendirilen TFF hasatlari, rAAV
vektörleri için yaklasik olarak 1016 DRP/ml'lik bir konsantrasyonda olmustur. Yaklasik
olmaksizin 1,2 mL CFT reçinesi üzerine yüklenmis olup, 1,8 x 1014“Iük bir toplam
rAAV DRP yüklemesi ile ilgili kolon sürekli akisindaki >%1 rAAV mevcudiyeti olarak
belirlenmistir.
Sekil 4, tipik bir CHT I kromatogramini sunar. Burada gösterilenler; Amersham 3 mm
Skid tarafindan yapilan UV absorbans A ve iletkenlik
(mS/cm) ayni eksendedir. Ayraçlar, Örnek 7'de tanimlanan programin majör
segmentlerini isaret eder. “NaOH”, kolon dekontaminasyon adimini isaret eder.
Sekil 5, apatit reçinelerinden ayristirilan rAAV vektörlerinin relatif safligini gösterir.
Panel A; sürekli akis/izleme (FT), yüksek fosfat/%5 (agirlik/hacim) PEGGOOO
yikamasi (PO4), fosfat ve PEGGOOO (WIINVIII) gidermek için yikama ile elüsyon
arasindaki vektörün dagilimini gösterir. Durumlar arasindaki farkliliklarin hiçbiri,
mantiksal analizlerin kesinligi dahilinde kayda deger degildir ve kütle dengesizligi
tipiktir. Panel B, apatit kolonundan elde edilen elüsyon fraksiyonlari ile bir Sypro
turuncu boyali SDS PAGEden elde edilen ilgili seritleri gösterir. Her numune 2 x 1011
DRP/seritte yüklenmistir; seritler arasindaki belirgin migrasyon farki, jel üzerine
sigacak bir hacme evaporasyon yoluyla CFT elüsyonunu konsantre etmek için sahip
olmasi nedeniyle bir tuz yapisidir. Sadece predominant bantlar, AAV kapsid
proteinleri gibi görünür. Panel C, Ad5 proteinlerinin karsilastirilabilir araligini gösteren
açiklik için yeniden düzenlenen seritler ile bir Ad5 Western blotunun ilgili seritlerini
gösterir.
Sekil 6, SDS-PAGE ile prosesi boyunca purifikasyonun degerlendirmesini gösterir.
Bir temsili üretim kültür hasadindan elde edilen süreç içi numuneler, bir denatüre
edici/azaltici%10 poliakrilamid jelinde çalisilmis ve Sypro turuncusu ile boyanmistir.
Hasat sonrasi tüm numuneler, 1 x 1010 DRP/seritte yüklenmistir. TFF konsantrasyon
adimindan önce iki yukari akim (inisyal klarifikasyon adimi ve AEX sürekli akisi)
numunesi, jel üzerindeki hacim kisitlamalari nedeniyle sadece 1 x 109 DRP/seritte
yüklenebilir. Beta-galaktosidaz (B-Gal), jel boyunca boyamanin hassasiyeti ve
sürekliliginin degerlendirilmesi için 50 ng/seritte yüklenmistir. Üç AAV1 kapsid proteini
(VP1, 2 ve 3) gösterilmektedir.
Sekil 7, Örnek 1-12*de tanimlandigi sekilde rAAV purifikasyonu için adim adim geri
kazanimi gösterir. hasat öncesi süpernatantta mevcut olan toplam DRP %100 olarak
tanimlanmistir. Her adimdaki geri kazanim, 0 adim boyunca islenen toplam DRP ile
ilgili ortaya çikarilan toplam DRP'dir. Tüm proses için genel geri kazanim yaklasik
olarak %28 olmustur. D4 sup: üretim kültürü; AEX FT: anyon degisimi (Mustang® Q)
sürekli akis; tutma: apatit kromatografi; isi: isi inaktivasyonu ya da isi çikarmak; HIC:
hidrofobik etkilesim kromatografisi; SEC: boyut dislama kromatografisi; AEX: anyon
degisimi.
DETAYLI AÇIKLAMA
Hasarli rAAV partikülleri, yardimci virüs, yardimci virüs proteinleri, plazmidler, hücresel
proteinler ile DNA, ortam bilesenleri, serum proteinleri ve benzerleri gibi üretim kültür
kontaminantlarindan elde edilen herhangi bir AAV kapsid serotipinin rekombinant adeno
iliskili virüs (rAAV) partiküllerinin bir popülasyonunun izole edilmesi için yöntemleri saglamak,
bu bulusu içeren bu açiklamanin bir amacidir. Buna ek olarak, bu bulusu içeren bu
açiklamanin yöntemleri; yüksek titreli rAAV üretim kültür hasatlari ya da besleme
akislarindan elde edilen rAAV partiküllerinin bir popülasyonunun izolasyonu için düzenleyici
gereksinimler ile tutarli ticari olarak ölçeklenebilir, ortogonal prosesleri saglar. Bu bulusu
kapsayan bu açiklamanin yöntemleri ile izole edilen rAAV partiküllerinin popülasyonlari;
üretim kültür kontaminantlari ve/veya hasarli rAAV partikülleri, yardimci virüs, yardimci virüs
proteinleri, plazmidler, hücresel proteinler ile DNA, ortam bilesenleri, serum proteinleri ve
glukanlar gibi süreç içi kontaminantlari içeren büyük ölçüde serbest kontaminantlardir. Bu
bulusu kapsayan bu açiklamanin yöntemleri; örnek olarak, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 ve rAAV-
8 gibi zayif anyonik baglayicilar olan rAAV vektör serotiplerine özellikle uygundur. Bu bulusu
içeren açiklama ayrica; yogunluk gradyan santrifügasyonunun gerçeklestirilmesi için bir
gereksinim olmaksizin gen tedavi uygulamalarinda kullanilmasi için uygun üretim kültür
kontaminantlari ve/veya süreç içi kontaminantlari içeren büyük ölçüde serbest kontaminantli
rAAV partiküllerinin bir yüksek titreli popülasyonun izole edilmesi için bir yöntemini düsünür.
Tanimlar
Burada kullanildigi haliyle “izole” ya da “pürifiye” terimi, mevcut da olabilen diger bilesenlerin
en azindan birkaçindan yoksun rAAV partiküllerinin bir preparasyonunu ifade eder, burada
rAAV partikülleri dogal olarak meydana gelir ya da baslangiçta bunlardan hazirlanir.
Böylelikle, örnek olarak, izole rAAV partikülleri, bir kültür lizati ya da üretim kültür
süpernatanti gibi bir kaynak karisimindan zenginlestirilmesi için bir pürifikasyon teknigi
kullanilarak hazirlanabilir. Zenginlestirme; örnek olarak, bir çözeltide mevcut olan DNaz'a
dirençli partiküllerin (DRP'Ier) orani yoluyla ya da infektivite yoluyla oldugu gibi çesitli yollarla
ölçülebilir ya da asagida belirlendigi sekilde, üretim kültür kontaminantlari gibi kontaminantlar
ya da yardimci virüs, ortam bilesenleri ve benzerlerini içeren süreç içi kontaminantlar gibi
kaynak karisiminda mevcut olan bir ikinci, potansiyel olarak karisan madde ile iliskili olarak
ölçülebilir.
Eger infeksiyöz AAV partiküllerinin infeksiyöz yardimci virüs partiküllerine orani; en azindan
yaklasik 1061; daha da tercih edilebilir olarak en azindan yaklasik 108:1 ise, rAAV'nin bir
preparasyonunun, yardimci virüsün “büyük ölçüde serbest“ oldugu söylenir. Preparasyonlar
ayrica tercihen yardimci virüs proteinlerinin esdeger miktarlari hariç olacaktir (baska bir
deyisle, eger yukarida dikkate alinan yardimci virüs partikül safsizliklari bozulmus formda
mevcut ise proteinler, yardimci virüsün bu tip bir seviyesinin bir sonucu olarak mevcut
olacaktir). Viral ve/veya hücresel protein kontaminasyonu genel olarak SDS jelleri üzerindeki
Coomassie boyama bantlarinin mevcudiyeti olarak gözlenebilir (örnegin, AAV kapsid
proteinleri VP1, VP2 ve VP3'e karsilik gelenlerden baska bantlarin görünümüdür).
Burada alternatifli olarak kullanildigi haliyle ”zayif anyonik baglayici” ya da “düsük afiniteli
anyonik baglayici" terimi; kontaminantlarin (üretim kültür kontaminantlari ya da süreç içi
kontaminantlar) mevcudiyetinde bir kapsid serotipine sahip olan bir rAAV partikülünü ifade
eder, diger rAAV üretim kültür kontaminantindan rAAV partiküllerinin izolasyonuna olanak
saglamasi için yeterli afinite le baglanmaz. Bu tip kapsid serotipleri teknikte bilinmektedir ve
sinirlama olmaksizin AAV-1, AAV-5, AAV-8 ve AAV-4'ü içerir. teknikte tanimlandigi gibi, bu
tip zayif anyonik baglayicilar genel olarak iyodiksinol (Optiprep® ticari adi altinda satilir) ya
da sezyum klorür gradyan santrifügasyonunu içeren en azindan bir yogunluk santrifügasyon
adimini içeren yöntemler vasitasiyla pürifiye edilir.
Burada kullanildigi haliyle, “yardimci virüs” ya da “kirletici yardimci virüs” terimi; kendi basina
esleme yetenegine sahip olmayan adeno iliskili virüs gibi bir yardimci virüs bagimli viral
vektörünün kopyalari üretildigi zaman kullanilan bir virüsü ifade eder. Yardimci virüs, viral
vektörün yanisira ko-enfekte hücreler kullanilir ve viral vektörün genomunun replikasyonu
için gerekli proteinleri saglar. Terim; intakt viral partiküller, bos kapsidler, viral DNA ve
benzerlerini kapsar. rAAV partiküllerini üretmek için yaygin bir sekilde kullanilan yardimci
virüsler; adenovirus, herpes simplex virüsü, sitomegalovirüs, Epstein-Barr virüsü ve vaksiniya
virüsü nü içerir.
Burada kullanildigi haliyle ”üretim kültürü” terimi, rAAV vektör partikül üretimi için gerekli
bilesenleri içeren bir kabi ifade eder. üretim kültürleri sinirlama olmaksizin asagidaki
bilesenleri içerir: 1) uygun bir konukçu hücre; 2) yardimci virüs fonksiyonu; 3) AAV rep ve
cep genleri kap geni ve gen ürünleri; 4) AAV ITR sekanslari tarafindan kapsanan bir terapötik
transgen; ve 5) destek rAAV üretiminin bilindigi serum, serum türevli proteinler, vitaminler,
esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitler ve glikoz içeren uygun ortam, ortam bilesenleri
ve ortam tamamlayicilari.
Burada kullanildigi haliyle, burada alternatifli olarak kullanildigi haliyle “kontaminantlar",
ya da "kontaminantlar" terimleri; sinirlama olmaksizin, rAAV vektörlerinin üretim destegi için
teknikte bilinen ortam formülasyonlari; tuzlar, dana serumu, amino asit takviyeleri, vitamin
takviyeleri, büyüme faktörleri, serum albumin ile teknikte bilinen ortam formülasyonlarinda
mevcut diger düsük molekül agirlikli proteinler gibi ortam takviyeleri; permisif konukçu
hücreler, konukçu hücre proteinleri ya da konukçu hücre DNA'si; yardimci virüsler, yardimci
virüs proteinleri ya da dogal sus adenovirüs ya da herpes virüs proteinleri gibi yardimci virüs
DNA'si; ve besleme akisindan elde edilen rAAV vektörlerinin pürifikasyonunda
degerlendirilen glukanlar ya da kromatografi tamponlari gibi pürifikasyon prosesi süresince
yerlestirilen diger rAAV vektörü olmayan ya da rAAV vektör üretim kültür malzemelerini ifade
Burada kullanildigi haliyle "üretim kültür hasadi” terimi; sinirlama olmaksizin, transfeksiyon
prosesleri, stabil hücre dizisi üretimi, Ad-hibrid üretim sistemleri ya da bakulovirüs üretim
sistemlerini içeren teknikte bilinen sekilde rAAV vaktör üretim kültürlerinden üretilen rAAV
vektör partiküllerini kapsayan bir çözelti olarak tanimlanir. Buna ek olarak, burada kullanildigi
haliyle "üretim kültür hasadi” terimi; üretim kültür kabindan izole edilen malzemeyi ifade eder
ve hem teknikte bilinen sekilde rAAV üretici hücrelerinin lizisi vasitasiyla izole edilen
malzemeleri hem de intakt hücrelerinden ortama salinan rAAV partiküllerini vermesi için
teknikte bilinen kültür kosullari altinda korunan rAAV üretim kültürlerinden izole edilen
malzemeleri içerir. Bir üretim kültür hasadi, sinirlama olmaksizin asagidakilerin birkaçini ya
da tümünü kapsayabilir: rAAV vektör partikülleri, ortam bilesenleri, konukçu hücre proteinleri,
konukçu hücre DNA`si, konukçu hücreler, yardimci virüs, yardimci virüs proteinleri, yardimci
virüs DNA'si, plazmid DNA, tasiyici virüs DNA'si, serum, serum kökenli proteinler ve ortam
takviyeleri.
Burada kullanildigi haliyle “besleme akisi” terimi; bir kromatografik matris üzerine yüklenen,
içinden geçirilen ya da uygulanan rAAV vektör partiküllerinin bir kaynagini ifade eder. Bu
bulusu kapsayan bu açiklamanin besleme akislari; malzemeler, önceki adimdan saglanan
sürekli akis olarak mevcut olup olmadiginin, önceki adimda bagli ya da ayristirilmis olup
olmadiginin, önceki adimin bosluk hacminde mevcut olup olmadiginin ya da rAAV
partiküllerinin pürifikasyonu süresince elde edilen herhangi birfraksiyonda mevcut olup
olmadiginin mevcut bulus da dahil açiklamanin önceki kromatografik adimlarindan izole
edilen malzemeleri ve üretim kültür hasatlarini içerir. Bu tip besleme akislari; burada
tanimlandigi sekilde "kontaminantlar", "üretim kültür kontaminantlari", "süreç içi
kontaminantlar", "süreç içi safsizliklar" ya da "safsizliklar" ya da " kontaminantlar"in birini ya
da daha fazlasini içerebilir.
Alternatifli olarak burada kullanildigi haliyle ”tutma”, “bagli", “baglanir" ya da “baglanma"
terimleri; bir kromatografik ortama bir besleme akisinin bir bileseninin baglanimini,
tutunmasini ya da yapismasini ifade eder. Bilesenler; sinirlama olmaksizin, hidrofobik, iyonik
(anyonik ve katyonigi içeren), afinite, metal selasyonu ve selasyonu içeren teknikte bilinen
herhangi bir kuvvet ya da kimya vasitasiyla bir kromatografik ortama baglanabilir. Bilesenler,
apatit kromatografik ortamdaki gibi kimyanin bir tipinden daha fazlasi ile bir kromatografik
ortama baglanabilir.
Alternatifli olarak burada kullanildigi haliyle “apatit reçine”, “apatit kromatografik ortam”. apatit
matrisi” ya da “apatit oitami" terimleri; kalsiyum fosfatin bir mineralinden olusan bir
kromatografik ortami ifade eder ve sinirlama olmaksizin seramik hidroksiapatit (CHT) ve
seramik floroapatit (CFT) kromatografik ortami kapsar.
sahip olan kromatografik ortami ifade eder. Karisik mod kromatografik ortam; sinirlama
olmaksizin, kalsiyum kisimlari vasitasiyla metal afinite baglanimini, belkemiginde mevcut
olan hidroksil gruplari vasitasiyla hidrojen baglanimini, kalsiyum kisimlari vasitasiyla pozitif
yük repulsiyonu ile negatif yük atraksiyonu ve ortamda mevcut olan fosfat kisimlari
vasitasiyla negatif yük repulsiyonu ile pozitif yük atraksiyonunu sergileyebilen apatit
kromatografi ortami içerir.
ve bilesimlerine uygulanabilir.
Burada kullanildigi haliyle, “bir” yazisinin tekil sekli aksi belirtilmedikçe çogul referanslari
içerir. Örnek olarak, “bir virüs partikülü” tabiri, bir ya da daha fazla virüs partiküllerini içerir.
Buradaki “yaklasik” bir deger ya da parametreye yapilan atif, kendi basina 0 degere ya da
parametreye yönelik somut örnekleri içerir (ve tanimlar). Örnek olarak, “yaklasik X" ile ilgili
tanim, “X”in tanimini içerir.
Burada tanimlanan bulusun bakis açilari ve somut örnekleri, esas olarak bakis açilari ve
somut örneklerden olusur ve/veya olusanlari içerir.
rAAV Vektörlerinin üretimi
Transfeksiyon, stabil hücre dizisi üretimi ve Adenovirüs-AAV hibritler, herpesvirüs-AAV
hibritler ile bakulovirüs-AAV hibridleri içeren infeksiyöz hibrit virüs üretim sistemlerini içeren
rAAV vektörlerinin üretilmesi için teknikte çesitli yöntemler bilinmektedir. rAAV virüs
partiküllerinin tümünün üretilmesi için rAAV üretim kültürleri asagidakileri gerektirir; 1)
bakulovirüs üretim sistemleri durumunda örnek olarak, SF-Q gibi insekt kökenli hücre dizileri
ya da HeLa, A549 ya da 293 hücreleri gibi insan kökenli hücre dizilerini içeren uygun
konukçu hücreler; 2) dogal sus ya da mutant adenovirüs (sicakliga duyarli adenovirüs gibi),
herpes virüs, bakulovirüs ya da yardimci fonksiyonlari saglayan bir plazmid yapisi ile
saglanan uygun yardimci virüs fonksiyonu; 3) AAV rep ve cap genleri ve gen ürünleri; 4) AAV
desteklemek için uygun ortam ve ortam bilesenleri. Teknikte bilinen uygun ortam rAAV
vektörlerinin üretilmesi için kullanilabilir. Bu ortam; sinirlama olmaksizin, özellikle
rekombinant AAV vektörlerinin üretiminde kullanilmasi için özel ortam formülasyonlari ile ilgili
olarak, Modifiyeli Eagle Ortami (MEM), Dulbecco Modifiyeli Eagle Ortami (DMEM), U.S.
ortaminda tanimlananlar gibi özel formülasyonlari içeren Hyclone Laboratories and JRH
tarafindan üretilen ortami içerir.
Bu bulusu kapsayan bu açiklamanin uygun rAAV üretim kültür ortami, %0,5-%20`lik
(hacim/hacim ya da agirlik/hacim) bir seviyede serum ya da serum kökenli rekombinant
proteinleri ile desteklenebilir. Alternatif olarak, teknikte bilindigi gibi, rAAV vektörleri, hayvan
kökenli olmayan ürünler ile ortam olarak da ifade edilebilen serumsuz kosullarda üretilebilir.
Teknikte siradan deneyime sahip bir kisi; rAAV vektörlerinin üretilmesini desteklemesi için
tasarlanan ticari ya da özel ortamin, üretim kültürlerindeki rAAV'nin titresini arttirmak
amaciyla sinirlama olmaksizin glikoz, vitaminler, amino asitler ve/veya büyüme faktörlerini
içeren teknikte bilinen bir ya da daha fazla hücre kültür bilesenleri ile de desteklenebildigini
degerlendirebilir.
rAAV üretim kültürleri, degerlendirilmis belirli konukçu hücreye uygun çesitli kosullar (farkli
zaman uzunluklari ve benzerleri için, genis bir sicaklik araligi boyunca) büyüyebilir. Teknikte
bilindigi sekilde, rAAV üretim kültürleri; Örnek olarak, silindir siseler, içi bos elyaf filtreler,
mikro tasiyicilar ve dolgulu yatak ya da akiskan yatakli biyoreaktörler gibi uygun eke bagimli
kaplarda kültürlenebilen eke bagimli kültürleri içerir. rAAV vektör üretim kültürleri ayrica;
örnek olarak, çevirici siseler, karistirmali tank biyoreaktörleri ile Wave yastik sistemi gibi tek
kullanimlik sistemleri içeren çesitli yollarla kültürlenebilen HeLa, 293 ve SF- 9 hücreleri gibi
süspansiyona adapte konukçu hücreleri de içerebilir.
Bu bulusu kapsayan açiklamanin rAAV vektör partikülleri; üretim kültürünün konukçu
hücrelerinin Iizisi ile ya da üretim kültüründen etkisiz ortamin hasadi ile rAAV üretim
kültürlerinden hasat edilebilir, saglanan hücreler; U.S. Patent No. 6,566,118'de daha ayrintili
olarak tanimlandigi sekilde, rAAV partiküllerinin intakt hücrelerinden elde edilen ortama
dogru salimina sebep olmasi için teknikte bilinen kosullar altinda kültürlenir. Lize edilen
hücrelerin uygun yöntemleri ayrica teknikte iyi bilinir ve örnek olarak, birden çok
dondurma/eritme çevrimleri, sonikasyon, mikrofludizasyon ve deterjanlar ve/veya proteazlar
gibi kimyasallar ile tedaviyi içerir.
rAAV Vektörlerinin pürifikasyonu
Hasatta, bu bulusu kapsayan bu açiklamanin rAAV üretim kültürleri, asagidakilerin birini ya
da daha fazlasini içerebilir: (1) konukçu hücre proteinleri; (2) konukçu hücre DNAisi; (3)
plazmid DNA; (4) yardimci virüs; (5) yardimci virüs proteinleri; (6) yardimci virüs DNA'si; ve
(7) örnek olarak, serum proteinleri, amino asitler, transferrinler ile diger düsük molekül
agirlikli proteinleri içeren ortam bilesenleri. Ek olarak, rAAV üretim kültürleri ayrica AAV-1,
AAV-13, AAV-14, AAV-15 ve AAV-16`dan olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid serotipine
sahip olan rAAV partiküllerini içerir. Bazi durumlarda veya somut örneklerde, rAAV
partikülleri; AAV-1, AAV-4, AAV-5 ve AAV-8'den olusan gruptan seçilen bir kapsid serotipine
sahiptir.
Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, rAAV üretim kültür hasadi, konukçu hücre
debrisini gidermek için aritilir. Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, üretim kültür
hasadi; örnek olarak, bir derece DOHC Millipore Millistak+ HC Pod Filtresi, bir derece A1 HC
Millipore Millistak+ HC Pod Filtresi ve bir 0,2 pm Filtre Opticap XL10 Millipore Express SHC
Hidrofilik Membran filtresi. Aritma; santrifügasyon ya da 0,2 pm ya dateknikte bilinen daha
büyük gözenek büyüklügünde herhangi bir selüloz asetat filtresi vasitasiyla filtrasyon gibi
teknikte bilinen çesitli diger standart teknikler vasitasiyla da elde edilebilir.
Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, rAAV üretim kültür hasadi ayrica üretim
kültüründe mevcut olan herhangi bir yüksek molekül agirliginda DNA'yi sindirmesi için
Benzonase® ile tedavi edilir. Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, Benzonase®
sindirimi; örnek olarak, 30 dakika ile birkaç saatlik bir periyot süresince 37°C civarinda bir
sicaklik araliginda Benzonase®'in 1-2,5 birim/ml'lik bir nihai konsantrasyonu içeren teknikte
bilinen standart kosullar altinda gerçeklestirilir.
rAAV partikülleri, asagidaki pürifikasyon adimlarinin biri ya da daha fazlasi kullanilarak izole
edilebilir ya da aritilabilir: sürekli akis anyonik degisim filtrasyonu, rAAV partiküllerinin
konsantre edilmesi için tegetsel akis filtrasyonu (TFF), apatit kromatografisi ile rAAV tutma,
yardimci virüsün isi ile etkisizlestirilmesi, hidrofobik etkilesim kromatografisi ile rAAV tutma,
boyut dislama kromatografisi (SEC) ile tampon degisimi, nanofiltrasyon ve anyonik degisim
kromatografisi ile rAAV tutma. Bu adimlar; tek basina, çesitli kombinasyonlarda ya da farkli
sekillerde kullanilabilir. Bazi durumlarda, yöntem, asagida tanimlandigi sekilde sirasiyla tüm
adimlari kapsar.
Anyonik Degisim Filtrasyonu
Opsiyonel olarak bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, aritilan ve Benzonase® ile
tedavi edilen üretim kültür hasadi; rAAV vektörünün sürekli akista mevcut oldugu ve
kontamine edilen yardimci virüsün yüklü filtrede alikondugu kosullar altinda anyonik degisim
filtrasyonuna tabi tutulur. rAAV üretim kültür hasadinin iyonik gücünde, rAAV partikülleri;
yardimci virüsten, örnegin bir Mustang® Q filtresi (Pall Corp., East Hills, NY) gibi bir anyonik
filtre vasitasiyla geçmesi ile adenovirüsten ayirt edilebilir. Teknikte uzman bir kisi; aritilan,
Benzonase® ile tedavi edilen ve anyonik filtre edilen üretim kültüründe mevcut olan
adenovirüs (LRV) ile adenoviral proteinlerin optimal log azalmasini elde etmek için gerekli
filtrelerin boyutunu ve sayisini belirleyebilir. Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda,
LRV, en azindan bir log ve on Iogdan daha fazladir. Tercih edilen bir durum ya da somut
örnekte, LRV, en azindan iki ve sekiz Iogdan daha fazladir. Daha tercih edilen bir durum ya
da somut örnekte, LRV en azindan alti Iogdur.
Tegetsel Akis Filtrasyonu (TFF) Konsantrasyonu
Bazi somut örnekleri kapsayan bazi durumlarda, aritilan, Benzonase® ile tedavi edilen
besleme akisinin anyonik filtrasyonundan elde edilen sürekli akis, bir apatit kromatografi
ortamina uygulanmadan önce tegetsel akis filtrasyonu (“TFF“) vasitasiyla konsantre edilir.
TFF ultrafiltrasyonu kullanilarak virüslerin büyük ölçekli konsantrasyonu, R. Paul et al.,
TFF konsantrasyonu; bu bulusu kapsayan bu açiklamanin kromatografi adimlarina tabi
tutulmasi için besleme akisinin teknik olarak yönetilebilir hacme olanak saglar ve çok uzun
devirdaim süreleri için gereksinim olmaksizin kolonlarin daha makul olmasina izin verir.
Birkaç somut örnegi içeren bazi durumlarda, rAAV besleme akisi, en azindan iki kat ile en
azindan on kat arasinda konsantre edilir. Bazi durumlarda ya da somut örneklerde, sürekli
akis, en azindan on kat ile en azindan yirmi kat arasinda konsantre edilir. Bazi durumlarda
ya da somut örneklerde, sürekli akis, en azindan yirmi kat ile en azindan elli kat arasinda
konsantre edilir. Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi; pürifikasyon prosesinde sonraki adimin
gerçeklestirilmesinden önce tamponlarin degisimi için arzu edildigi yerde, pürifikasyon
prosesindeki herhangi bir adimda da kullanilabildigini de ayirt edecektir.
Polietilen Glikol'ün (PEG) Mevcudiyetinde Apatit Kromatografisi ile rAAV Tutma
Proteinlerin pürifikasyonu için FDA onayli prosesler ile insan klinik denemeleri ve farmasötik
ürünlerde kullanilmasi için uygun diger biyolojik ürünler, ticari ölçekte ortogonal proseslerine
dayanir. Çok adimli bir pürifikasyon semasi; eger Kartezyen uzaydaki bir ekseni temsil eden
her adim ile baska birinden ayri olan separasyon mekanizmalarini kullaniyorsa, bir ortogonal
prosesi içermesini dikkate alir. Örnek olarak, anyon degisimi ve hidrofobik etkilesim
kromatografisi (HIC) kullanilarak iki adimli bir proses, ortogonal olarak dikkate alinacaktir.
Burada tanimlanan bir üretim kültür hasadi ya da besleme akisindan elde edilen üretim kültür
kontaminantlari ya da süreç içi kontaminantlari gibi kontaminantlarin giderilmesi için
prosesler, nihai ürün (baska bir deyisle, bir rAAV vektörü) için çesitli kromatografik
ortamlardaki hem tutma hem de sürekli akis adimlarini içeren ortogonal proseslerdir. rAAV
vektörleri (spesifik olarak rAAV-2), anyonik reçinelere baglanmasi için teknikte ispat
edilmistir. rAAV-1, -5 ve -8 gibi rAAV vektörleri; daha az verimli ve daha düsük kalite
pürifikasyon semasina yol açan serum albumin, yardimci virüs bilesenleri, üretim ortam
bilesenleri ve konukçu hücre DNA'si gibi üretim bilesenlerinin mevcudiyetinde anyonik
degisim ortamina rAAV-Z'den çok daha az siki bir sekilde baglandigi ispat edilmistir.
AAV-1 gibi düsük afiniteli anyonik baglayicilar için teknikte tanimlanan daha önceki
pürifikasyon stratejileri; rAAV vektörünün anyonik degistiricilere daha siki bir sekilde
baglanimi elde etmek amaciyla üretim kültür kontaminantlari gibi kontaminantlarin relatif
konsantrasyonu ile süreç içi safsizliklari azaltan bir iyodiksinol adimina dahil edilir.
iyodiksinol adimi gradyanlari, burada tanimlanan ticari ölçekte proseslere kolaylikla
ölçeklenemez.
Bu basvurunun sahipleri; rAAV vektör partiküllerinin, apatit reçinelerini tutmasi ve elüsyonu
ile üretim kültür kontaminantlari ya da süreç içi kontaminantlari gibi kontaminantlardan izole
edilebildigi kesfedilmistir. Böylelikle, bir ham besleme akisindan elde edilen ürünün
tutulmasina ek olarak, apatit kolonu; yardimci virüs (Ad5 yardimci virüsü gibi) için ilave
klerens faktörlerinin saglanmasinin yanisira, konukçu hücre ile adenovirüs proteinleri,
glukanlar ve serum proteinlerini içeren çesitli proses ile iliskili safsizliklari giderir.
Apatit reçineler; sinirlama olmaksizin seramik hidroksiapatit (CHT) ve seramik floroapatit*i
(CFT) içeren kalsiyum fosfatin minerallerini içeren kromatografi ortamidir. Apatit
kromatografik ortam; apatitin, birden daha fazla baglanma kimyasi saglayan fonksiyonel
gruplara sahip oldugundan dolayi, karisik mod ya da çoklu mod ortami olarak da ifade edilir.
Teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, apatit ortami; belkemiginde mevcut olan hidroksil
kalintilarini, reçine üzerinde mevcut olan pozitif yüklü kalsiyum kisimlari ile negatif yüklü
fosfat kisimlarini içeren farkli kimyasal gruplarin bir konukçusu vasitasiyla kalsiyum metal
afinite baglanimi, hidrojen baglanimi, pozitif yük repulsiyonu, pozitif yük atraksiyonu, negatif
yük repulsiyonu ve negatif yük atraksiyonu için olanak saglar. Her baglanma kimyasi, sadece
tek modlu kromatografi için oldugu gibi karisik mod baglanimini uygular. Ancak, tek modlu
kromatografiden farkli olarak, çesitli baglanma ve elüsyon kimyalari bagimsiz degildir ve zit
yollarda çalisabilir. Örnek olarak, iyonik güç, hidrofobik baglanimi sürdürebilir. (T. Kawasaki,
mineralin bir kristalli formdan bir seramik forma dönüsümü için yüksek sicakliklarda
sinterlenen hidroksiapatit'in (Ca5(PO4)3OH)2 küre seklinde, makro gözenekli formlaridir. Bu;
bir büyük yüzey alani, sinirli kütle transfer direnci, yüksek mekanik mukavemet ve baz
direncini saglayan bir makro gözenekli yapili bir kromatografi ortami verir. Farkli sicakliklarda
ve zamanlarda sinterleme, kimyasal olarak özdes olan farkli fiziksel yapida tip I ve ll'ye yol
açar, ancak moleküllerin farkli siniflari için farkli kapasiteler önerir. CFT, asidik kosullar için
stabiliteyi arttirmada florin gruplari ile hidroksil gruplarinin kimyasal olarak yer degistirmesi
yoluyla hazirlanan floroapatit ile hidroksiapatitin bir kompozitindeki CHT'den farklidir. CFT ve
CHT reçineleri, ticari olarak temin edilebilir (örnegin, Bio-Rad Laboratories, lnc.'den).
Mevcut bulus da dahil mevcut açiklamanin sahipleri sasirtici bir sekilde; yükleme
tamponundaki polietilen glikolün (PEG) varliginin, rAAV vektör partikülünün apatit
reçinelerine baglanimi için kapasiteyi ve yeniden üretilebilirligi (sürekli akistaki rAAV
partiküllerinin degisken atilimin azaltilmasi ile) arttirdigini kesfetmislerdir. Teori ile
sinirlanmak istenmemekle birlikte, proses ile iliskili safsizliklarin çogunlugundan onlari ayirt
eden rAAV vektörlerinin bir niteligi, partiküllerin büyük fiziksel boyutudur. Bu boyut
diferansiyeli; tutma ve kromatografi baglaniminda polietilen glikolü (PEG) içermesi ile yikama
adimlari ve hidrasyon kabuklarinin enerjik olarak olumlu paylasimi bazinda büyük
moleküllerin baglanma durumu için bölme katsayilarini tercihen arttirmak için tamponlari
yikamaktan istifade etmistir. Viral ve bakteriyofaj vektörlerinin saflastirilmasinda PEG'in
kullanilmasi teknikte tanimlanmis oldugu halde, bu açiklamadan farkli olarak, Öncelikle
fiziksel olarak kümelenmesi için bir çöktürme maddesi olarak kullanilmistir ve çözeltiden viral
partikülleri giderir. PEG, viral partiküllerin agregasyonu ve presipitasyonuna olanak saglamak
için teknikte bilindiginden ve rAAV, 200 mM'nin altinda iyonik güçte kümelesmeleri
olusturmasi için teknikte tanimlanmis oldugundan dolayi (Wright et al., Molecular Therapy
tanimlandigi gibi immünoglobulin moleküllerinin iyon degistirici reçinelere ve örnek olarak,
Gagnon et al., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development,
March 4-6, 2009'da tanimlandigi gibi yüklü hidrofobik karisik mod reçineler için baglanima
olanak saglamasi teknikte bilinmektedir.
Bu basvurunun sahipleri; yaklasik %5 (agirlik/hacim) PEG6000”in bir relatif
konsantrasyonunun optimal oldugu besleme akisinda %3-10 (agirlik/hacim) arasindaki bir
konsantrasyon araligi boyunca PEGGOOO ile eksperimantasyon bazinda belirlenmistir.
Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi; PEG'in diger türlerinin ve molekül agirliklarinin,
sinirlama olmaksizin PEGBOOO, PEG10000 ve PEGlSOOO'i içerdiginin degerlendirilebildigini
ve rAAV vektör çözeltisindeki nihai konsantrasyonda PEG'in relatif konsantrasyonunun,
PEGiin uygun konsantrasyonunda, çözeltideki rAAV vektör partiküllerinin apatit reçineye
baglanmasinin devam ettirilmesi ancak kümelenmeleri ya da fiziksel presipitat olusmayacak
sekilde deneysel olarak belirlenebildigini degerlendirecektir.
Bazi durumlarda, rAAV vektör partikülleri, PEG'in mevcudiyetinde bir apatit reçinede
tutulmasi ve bir fosfat tamponundaki apatit reçineden bagli rAAV partikülünün elüsyonu ile
üretim kültür kontaminantlarindan izole edilir. Tercih edilen durumlarda, rAAV vektör
partikülleri; PEG'in mevcudiyetinde bir apatit reçinede tutulmasi ve PEG'in yoklugunda bir
tampondaki apatit reçineden bagli rAAV partikülünün elüsyonu ile üretim kültür
kontaminantlarindan izole edilir. Bazi durumlarda, zayif anyonik baglayicilar olan kapsitleri
içeren rAAV partikülleri; PEGlin mevcudiyetinde bir apatit reçinede tutulmasi ve PEG'in
yoklugunda bagli rAAV partikülünün bir tampondaki apatit reçineden ayristirilmasi ile üretim
kültür kontaminantlarindan izole edilir. Daha tercih edilebilir durumlarda, serotip 1'in (rAAV-1
serotip) kapsidlerini içeren rAAV partikülleri, PEG'in mevcudiyetinde bir apatit reçinede
tutulma ile üretim kültür kontaminantlarindan izole edilir ve reçineye bagli partikülleri içeren
rAAV-1 serotip kapsid, PEGiin yoklugunda tamponda ayristirilir. Bazi durumlarda, rAAV
vektör partikülleri; fosfat ve yetersiz PEG içeren bir elüsyon tamponundaki apatit reçineden
bagli rAAV“nin ayristirilmasi ve fosfat yoklugunda ama PEG varliginda bir yükleme
tamponundaki bir besleme akisinin yüklenmesini içeren bir yönteme göre üretim kültür
kontaminantlarindan izole edilir.
PEG varliginda apatit kromatografi, rAAV vektörlerinin pürifikasyonu için etkili bir tutma ya da
baglanma stratejisini yansittigi halde, birçok süreç içi safsizlik, pH 7,0'deki bir apatit reçine ile
de tutulmustur. Teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, bazik pH'da (7,0'dan daha büyük
pH) besleme akisinda mevcut olan proteinler; daha muhtemel olarak net bir negatif yüke
sahip olacak ve apatit reçinede mevcut olan negatif fosfat baglanma alanlari ile reddedilecek,
dolayisiyla kromatografik reçinenin toplam katyon degisimi baglanma kapasitesi
azaltilacaktir. Ancak, pozitif yük atraksiyonu ve metal afinitesi vasitasiyla baglanan apatit
reçinelerin verilen karisik mod dogasi yine de meydana gelebilir.
Borat tamponlari; sinirlama olmaksizin, preparasyon kolayligi, optimal çözünürlük,
mükemmel tamponlama kapasitesi ve düsük maliyet içeren istenen imalat özellikleri
nedeniyle bazik tamponlama sistemleri olarak teknikte düzenli olarak kullanilmaktadir. Bu
nedenle bazik tamponlama sistemi modeli olarak borat tamponlari, apatit reçinelerindeki
rAAV'nin tututulmasi için degerlendirilmistir. Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi; eger PEG
varliginda apatit reçinelere baglanan süreç içi safsizliklari seviyesini azaltiyorsa, diger bazik
tamponlarin belirlenmesi için degerlendirilebildigini takdir edecektir. Diger bazik tamponlar
test edilebilir ve rAAV tutulumu için kullanilabilir. Bazi durumlarda, PEGiin yoklugunda apatit
yükleme tamponu, bir borat tamponunu içerir. Tercih edilen durumlarda, borat tamponu,
yaklasik pH 8,0 ile yaklasik pH 9,9 arasinda bir pH'da formüle edilir. Tercih edilen
durumlarda, borat tamponu yaklasik 9,0'Iik bir pHida formüle edilir. Bazi durumlarda, borat
tamponu, yaklasik 5 mM ile yaklasik 500 mM arasinda bir konsantrasyondadir. Daha tercih
edilebilir durumlarda, borat tamponu, yaklasik 20 mM borat, pH 9,0'da formüle edilir. Bazi
durumlarda, pH 9,0'daki 20 mM borat tamponu spesifik olarak, küçük molekülün apatit
reçinedeki süreç içi safsizliklarin tutulumunu azaltir.
Bazi durumlarda, besleme akisi; PEG'in nihai konsantrasyonu iki defada PEG'i içeren bir
fosfat tamponu ile besleme akisinin süreç içi karisimi yoluyla PEG”in mevcudiyetinde fosfat
içeren bir tampondaki apatit reçine üzerine yüklenir. Bazi durumlarda, fosfat tamponun pH'i
pH 6,5 ile pH 7,0 arasindadir. Bazi durumlarda, PEG, PEGGOOO'dir. Bazi durumlarda,
yükleme tamponundaki PEGöOOO'in konsantrasyonu, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile yaklasik
PEGBOOO'in konsantrasyonu, yaklasik %5'tir (agirlik/hacim). Bazi durumlarda, apatit reçine
için yükleme tamponundaki fosfatin konsantrasyonu 5 mM ile 500 mM arasindadir.
Bazi durumlarda, PEG'in varliginda apatit reçinenin baglanma kapasitesi, PEG”in yoklugunda
apatit reçinenin baglanma kapasitesine göre gelistirilir. Bazi durumlarda, PEG'in varliginda
bir besleme akisindaki rAAV vektör partikülleri için apatit reçinenin baglanma kapasitesi,
PEG'in yoklugunda apatit reçinenin baglanma kapasitesi ile ilgili yaklasik bir logun yarisindan
yaklasik on loga kadar gelistirilir. Tercih edilen durumlarda, PEG'in varliginda bir besleme
akisinda mevcut olan rAAV partikülleri için apatit reçinenin baglanma kapasitesi için sekiz log
gelistirilir. Bazi durumlarda, PEG'in varliginda bir besleme akisindaki rAAV vektör partikülleri
için apatit reçinenin baglanma kapasitesi; her ml reçine basina en azindan yaklasik 106
partikül ile her ml reçine basina yaklasik 1016 partikül arasindadir (her mI reçine basina
Bazi durumlarda, PEG'in varliginda apatit reçinenin baglanma kapasitesi, her ml reçine
basina yaklasik 1014 partiküldür.
Ticari rAAV-1 pürifikasyonunun son derece yüksek verime, uygun maliyete olanak saglayan
PEG'in varliginda apatit reçinenin her mlisi basina rAAV-1'in yaklasik olarak 1012-1014ilik
DRP bu baglanma kapasitesi sasirtici iken, teknikte siradan uzmanlikta bir kisi; baglanma
kapasitesinin, her ml reçine basina baglanacak rAAV-11 ya da maksimum sayisini temsil
ettigini ve açiklamanin kapsamini operasyonel bazda sinirlamaya yönelik olmadigini
degerlendirecektir. Gerçekten de bulus sahipleri; rAAV-1 /ml için 1014-1016'dan daha az DRP
içeren rAAV-1 vektör hasat kültürlerinin, mevcut bulus da dahil bu açiklama tarafindan
aritilabildigini degerlendirir.
Bazi durumlarda, apatit ortamina bagli rAAV partikülleri, reçineden elde edilen rAAV
partiküllerinin ayristirilmasinda önce yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi ortami,
süreç içi safsizliklari gidermek için PEG'in konsantrasyonlarinin azaltilmasini içeren bir
yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, apatit kromatografi
ortami, yaklasik %3 (agirlik/hacim) ile yaklasik %10 (agirlik/hacim) arasinda PEG içeren bir
yikama tamponu ile bir ya da daha fazla defa yikanir. Bazi durumlarda, yikama tamponu;
yaklasik %10 (agirlik/hacim), %9,5 (agirlik/hacim), %9 (agirlik/hacim), %8,5 (agirlik/hacim),
(agirlik/hacim), %5,5 (agirlik/hacim), %5 (agirlik/hacim), %4,5 (agirlik/hacim), %4
(agirlik/hacim), %3,5 (agirlik/hacim) ve %3 (agirlik/hacim) PEG'in herhangi birini içerir. Bazi
duurmlarda, apatit ortami; rAAV partiküllerinin apatit ortamina baglanmasina olanak
saglamasi için kullanilan PEG konsantrasyonundan daha yüksek bir konsantrasyonda PEG
içeren bir yikama tamponu ile yikanir. Bazi durumlarda, apatit ortami ayrica PEG 'in
azaltilmis konsantrasyonu ile de yikanir. Bazi durumlarda, yikama tamponu, teknikte bilinen
tamponlari içerir. Bazi durumlarda, yikama tamponu; borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-2-
etansülfonik asit (HEPES) ve Tris-HCl'den olusan gruptan seçilen bir tamponu içerir. Bazi
durumlarda, yikama tamponu bazik pH'dadir. Bazi durumlarda, yikama tamponu; pH 7,0 ile
tamponu ayrica 100 ile 500 mM arasinda fosfat içerir. Bazi durumlarda, yikama tamponu
ayrica 50 ile 250 mM arasinda NaCI içerir.
Bazi durumlarda, PEG'in varliginda bir apatit reçinede tutulma yoluyla bir sürekli akistan
izole edilen rAAV vektörleri, PEGiin düsük konsantrasyonlarinda bir tamponda ayristirilir.
Bazi durumlarda, PEG'in düsük konsantrasyonlari yaklasik %2,9 (agirlik/hacim) ile yaklasik
tutulma yoluyla bir sürekli akistan izole edilen rAAV vektörleri, PEG'in yoklugunda bir
tamponda ayristirilir. Tercih edilen durumlarda, PEG”in varliginda bir apatit reçinede tutulma
yoluyla bir sürekli akistan izole edilen rAAV vektörleri, PEG'in yoklugunda fosfat içeren bir
tamponda ayristirilir.
Bazi durumlarda, PEG`in varliginda bir apatit reçinede tutulma yoluyla bir sürekli akistan
izole edilen rAAV vektörleri, fosfat içeren bir tamponda ayristirilir. Bazi durumlarda, PEG'in
varliginda bir apatit reçinede tutulma yoluyla bir sürekli akistan izole edilen rAAV vektörleri,
yaklasik 0,1 mM ila yaklasik 500 mM arasinda bir konsantrasyonda fosfat içeren bir
tamponda ayristirilir (örnegin, yaklasik 1 mM ile yaklasik 250 mM arasinda, yaklasik 10 mM
ile yaklasik . Tercih edilen durumlarda, PEG'in varliginda bir apatit
reçinede tutulma yoluyla bir sürekli akistan izole edilen rAAV vektörleri, bir 50 mM fosfat
tamponunda ayristirilir.
Bu basvurunun sahipleri; bir besleme akisinda mevcut olan rAAV vektörlerinin, PEG'in
varliginda bir apatit reçinede tutulmasi yoluyla izole edilebildigini kesfetmislerdir. Ancak eger
üretim kültüründe kullanilan yardimci virüsler (adenovirüs gibi), apatit reçineye uygulanan
besleme akisinda mevcut ise, onlar, PEG'in varliginda bir apatit reçine vasitasiyla tutulur.
PEG'in varliginda bir apatit reçine vasitasiyla tutulan rAAV vektör partikülleri, fosfat
tamponlarinda kendi elüsyon profili ile adenovirüsten kolaylikla izole edilebilir. rAAV vektör
partikülleri; PEG varliginda, elüt, 0 mM kadar düsük fosfat içeren tamponlardaki PEG”in
varliginda apatit reçineye baglanir; oysa ki yardimci virüs adenoviral partikülleri, rAAV vektör
partiküllerini ayristirmak için kullanilan fosfatin konsantrasyonlari altinda apatit reçinelerde
tutulur. Deneysel olarak, rAAV vektörleri, PEG'in varliginda 50 mM kadar az fosfatta bir tek
keskin pikte ayristirmak için bulunmustur, oysa ki eger mevcutsa adenovirüs gibi yardimci
virüs reçinede tutulur. Infeksiyöz adenovirüsün 89 DNaz'a dirençli partikülleri (DRP'Ier) ile
tutturulmus ve PEG'in varliginda apatit reçinelerde kromatografiye tabi tutulmus rAAV
besleme akislarindaki tutturma çalismalarinda, adenoviral proteinlerin yaklasik olarak 4 Iogu
apatit reçinede tutulurken, rAAV vektörleri, apatit reçinede tutulmus ve PEG'in yoklugunda 50
mM fosfat tamponunda ayristirilmistir. Bu dogrultuda, bazi durumlarda, bir besleme akisinda
mevcut olan rAAV vektörleri, PEG'in yoklugunda fosfat tamponlarinda elüsyon ve PEG'in
varliginda bir apatit reçinede tutularak kontamine edici yardimci virüsten izole edilir. Bazi
durumlarda, fosfat tamponlari, apatit reçineye bagli kontamine yardimci virüsü tutan
konsantrasyonlarda formüle edilir. Bazi durumlarda, her ml apatit reçine basina
adenovirüsün sekiz Iogu tutulur. Bazi durumlarda, bir besleme akisinda mevcut olan rAAV
vektörleri, apatit reçineye bagli yardimci virüsü tutan kosullar altinda 0-500 mM fosfat
tamponunda ( bir apatit
reçineden elüsyon yoluyla izole edilir.
rAAV vektörlerini üretmek için teknikte bilinen üretim sistemleri; %0,5-%20'Iik (hacim/hacim)
aralikta serum içeren üretim ortamini içerebilir ya da tümüyle serum yoklugu olabilir. Buna ek
olarak, teknikte tanimlanan pürifikasyon semalari; apatit reçineye uygulanan besleme
akisindaki serum proteinleri ve diger serum bilesenlerinde bir artisan yol açabilen bir ya da
daha fazla konsantrasyon adimlarini içerebilir. Örnek olarak, %1 (hacim/hacim) serum ile
formüle edilmis olan burada tanimlandigi sekilde üretim kültür süpernatanti, TFF adiminda
yaklasik olarak yirmi kat konsantre edilmistir, öyle ki besleme akisi, serumsuz formüle edilen
bir üretim kültüründen saglanan bir besleme konsantresine nazaran %20 kadar çok serum
protein kontaminantlarini kapsayan apatit reçine üzerine yüklenir. Bu basvurunun sahipleri,
serum varliginda ya da yoklugunda formüle edilen üretim kültürlerinden saglanan besleme
akisi konsantreleri ile burada saglanan apatit tutma yöntemleri test edilmistir. Besleme
akisindaki serum proteinlerinin mevcudiyetinin, apatit kromatografi adiminin performansi
üzerine herhangi bir etkiye sahip olmadigi bulunmustur.
Yardimci Virüsün Isi Inaktivasyonu (Isi Öldürme)
Eger infeksiyöz adenovirüs rAAV üretimi için üretim kültürlerinde bir yardimci virüs kaynagi
olarak kullaniliyorsa, opsiyonel bir isi inaktivasyon (isi öldürme) adimi, besleme akisinda
mevcut olabilen herhangi bir kalinti adenoviral partikülleri inaktive etmek için birlestirilebilir.
yararlanir: adenovirüs partikülleri, yaklasik olarak 54-56°C'Iik sicakliklarda inaktive edilir iken
AAV ve rAAV viral partikülleri stabil ve bu sicakliklarda etkisizdir. Mevcut bulus da dahil bu
açiklamada, bulus sahipleri, burada gerçeklestirilen 250 L ölçekli üretim kültürleri gibi büyük
ölçekli proses optimizasyonunu saglamak için isi inaktivasyon adimini ayarlamistir. Bilhassa,
apatit eluat; karistirma için 12°'Iik bir açi ile 40 devir/dakikalik bir sallama hizinda 53°C'ye
ayarli bir sicaklik kontrollü sallama platformunda (20L Dalga isitici pan) steril, tek kullanimlik
bir 5 L biyoproses çantasinda isi ile inaktive edilmistir. Apatit eluat, 52°C'ye erisene dek
platformda inkübe edilmis ve daha sonra ilave bir 10 dakika süresince o sicaklikta
tutulmustur. MgClz, isitma süresince rAAV vektörünü stabilize etmek için 2 mM'lik bir nihai
konsantrasyonda apatit eluata ilave edilmistir. Teknikte siradan uzmanlikta bir kisi; isitma için
ölçek, nihai ayar noktasi ve isitma zamaninin, rAAV partiküllerinin infektivitesi ve
bütünlügünü korurken adenoviral partiküllerini inaktive etmede optimal kosullari bulmak için
deneysel olarak test edilebildigini takdir edebilir. Isi inaktivasyon adimi, yardimci fonksiyonu
saglamasi için plazmid yapilardan faydalanan üretim kültürlerinden rAAV partiküllerinin
pürifikasyonu için dahil edilmeyebilir.
Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi
Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi (HIC), kendi yüzey hidrofobisitesindeki farkliliklar bazinda
biyomolekülleri ayirmak için bir tekniktir. Dolayisiyla, HIC, AAV prosesindeki diger
pürifikasyon adimlarina bir ortogonal yöntem olarak dikkate alinir. HIC kromatografik ortami,
lineer zincir hidrokarbonlari (örnegin, propil (C3), bütil (C4), hekzil (C6) ya da oktil (C8)) ya da
aromatikler (örnegin, fenil) gibi hidrofobik Iigandlari içerir. Saf suda, hidrofobik etki, Iigand ile
proteinler arasindaki ya da proteinlerin kendi arasindaki fonksiyonel etkilesim için çok zayiftir.
Ancak, iyotropik tuzlar hidrofobik etkilesimleri gelistirir ve tuz ilavesi, HIC ortami için
proteinleri tutulmasini sürdürür. Bundan dolayi, HIC reçineleri genellikle yüksek tuz
konsantrasyonlari altinda yüklenir ve düsük tuz konsantrasyonlarinda ayristirilir. Teknikte
siradan uzmanlikta bir kisinin degerlendirecegi sekilde, amonyum sülfat [(NH4)2SO4];
Hofmeister dizisindeki hem amonyum hem de sülfat iyonlarinin yüksek Iiyotropik siralamasi
ve tuzun yüksek çözünürlügü nedeniyle, HIC kromatografisi vasitasiyla proteinlerin
tutulumunu kontrol etmek için en yaygin kullanilan tuzdur. Bu açiklamada, bir besleme
akisinda mevcut olan rAAV partikülleri; sirasiyla 2 M amonyum sülfat + 50 mM BisTris
tamponu (pH 7,0):besleme akisinin 75:25`Iik (hacim:hacim) ayni eksende karismasi ile bir
HIC reçine üzerine yüklenmistir. Yükleme tamponu ile besleme akisinin ayni eksende
karisimi, tamponda mevcut olan amonyum sülfatin yüksek konsantrasyonu ile herhangi bir
rAAV vektör presipitasyonu riskini engeller. Teknikte siradan uzmanlikta bir kisinin
degerlendirecegi gibi, tuz (amonyum sülfat) konsantrasyonu, rAAV baglanimi için optimal
konsantrasyonu elde etmek için manipüle edilebilir. Bu dogrultuda, bazi durumlarda,
amonyum sülfat konsantrasyonu 1 M ile 3 M arasindadir. Tercih edilen bazi durumlarda,
yükleme tamponundaki amonyum sülfat konsantrasyonu 2 mM'dir. Teknikte siradan
uzmanlikta bir kisinin degerlendirecegi gibi, amonyum sülfat ile besleme akisinin ayni
eksende karisimi, kolaylik ve birim operasyon akisi için gerçeklestirilir, ancak bir tanesi,
teknikte bilinen herhangi bir suretle yükleme tamponunun uygun konsantrasyonu ile besleme
akisi ve daha sonra HIC kromatografik ortami üzerine yükleme besleme akisi + yükleme
tampon çözeltisi kolaylikla karistirabilir.
Kosolventler de hidrofobik etkilesimi etkileyebilir. Örnek olarak, etilen ya da propilen glikol,
protein ile immobilize Iigand arasindaki etkilesimi azaltabilir ve dolayisiyla elüsyon
profillerinin gelistirilmesi için kullanisli olabilir. Bu dogrultuda, HlC kolonu; 2M amonyum
(hacimzhacim) tamponunun (EMD BioSciences) 75:25'Iik (hacimzhacim) bir karisimi ile
yikanmistir ve rAAV, bir düsük tuz tamponu ve ayrica Propilen Glikol (800 mM amonyum
sülfat + 50mM BisTris tamponu (pH 7,0) + %4 Propilen Glikol'de ayristirilmistir. Bu elüsyon
kosullari altinda, kolon üzerine yüklenen besleme akisinda mevcut olan herhangi bir kalinti
yardimci virüsü ve proteinleri, kolona bagli kalacaktir. Bu örnekteki Propilen Glikol, Propilen
Glikol olmaksizin tamponun genis elüsyon profiline nazaran daha keskinlestirmek için
tamponlara ilave edilmistir, ancak proseste opsiyoneldir.
Uygun hidrofobik reçinelerin örnekleri; sinirlama olmaksizin, Tosoh Butyl 650M, Tosoh
SuperButyI 6500, Tosoh Phenyl 6500, and EMD Fractogel Phenyl (Tosoh Bioscience LLC,
PA) içerir.
rAAV üretim proseslerinden gelen atik, en azindan asagidaki iki sebep için ortadan
kaldirilmadan önce siki dekontaminasyon gerektirir: (1) ürün, bir viral vektör içerir; ve (2)
üretim kültürleri yaygin bir sekilde rAAV üretimi için bir yardimci virüs olarak canli adenovirüs
tip 5 (ad5) kullanir. Kromatografi operasyonlarindan gelen sivi atik, tipik olarak ilk önce
kullanim noktasinda beyazlatma ile dekontamine edilir ve daha sonra nötralizasyon ve imha
etme öncesinde yüksek pH'da tutularak ayrica daha ileri dekontaminasyona tabi tutulur.
HIC tamponlarinda mevcut olan amonyum sülfat, sirasiyla tehlikeli klorin ve amonyak gazini
serbest birakmasi için hem beyazlatma hem de sodyum hidroksit ile reaksiyon verir. Bu
nedenle, HIC kromatografi adiminin proses optimizasyonu için öncelikli bir degerlendirme,
teknikte bilinen yöntemler vasitasiyla güvenli bir sekilde dekontamine edilebilen uygun bir
tampon sisteminin gelistirilmesi olmustur.
Teknikte siradan uzmanlikta bir kisinin degerlendirecegi gibi, hidrofobik etkilesim
kromatografisinde kullanilan yüksek asit konsantrasyonlu tamponlar, ya akis hizlarini
sinirlayabilen ya da karistirma problemlerine sebep olabilen yüksek geri basinca yol açabilen
viskozite sorunlari için ayrica taranmalidir, dolayisiyla depolama ya da operasyon için
kullanilan sicakliklarda meydana gelen tamponlardaki tuz kristalizasyonu ile ürünün
presipitasyon riskini arttirir. Asagidaki Tablo 6'daki veriler ve yukarida tanimlanan faktörlerin
degerlendirmesi bazinda, sitrat tamponlarinin 0,5 M ila 2,0 M araligindaki
konsantrasyonlardaki hidrofobik etkilesim kromatografisinde kullanilabilmesine ragmen,
bulus sahipleri, rAAV vektörlerinin HIC kromatografik ortamina baglanmasi için optimal
tampon olarak 1 M sodyum sitrati (pH 7,0) seçer.
Boyut Dislama Kromatografisi (SEC) ile Tampon Degisimi
TFF ve diyalizi içeren burada tanimlanan tampon degisimini gerçeklestirmek için teknikte
bilinen çesitli yöntemler vardir. Boyut dislama kromatografisinin kullanilmasi, tamponlarin
degisimi için gerekli zaman açisindan nispeten hizli ve reçinelerdeki gözenekler arasindan
geçmesi için boyutlandirilan proteinlerin daha ileri protein klerensinin saglanan ilave
avantajina sahiptir. Tampon degisimi; önceki adimin HIC eluatinin, prosesteki nihai anyon
degisim kromatografi adimina baglanan rAAV için uygun bir tampon için degistirilmis
oldugunun saglanmasi için bu adimda gerçeklestirilmistir.
Harici Ajan (Viral Klerens)
Opsiyonel olarak, bir besleme akisinda mevcut olabilen harici virüsler gibi iz
kontaminantlarinin daha ileri bir temizleme adimi; proses, dolayisiyla ticari olarak akla yatkin
ortogonal proses bünyesine dahil edilebilir. Böylelikle, bazi durumlarda ya da somut
örneklerde, proses ayrica bir viral klerens filtresini içerir. bu tip filtrelerin örnekleri; teknikte
bilinmektedir ve Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm) ve Asahi 70 nm'yi
Anyon Degisim Kromatografisi
Apatit kromatografisine tabi tutulan rAAV vektörü için bir anyon degisim yakalama adimi,
nihai bir konsantrasyon ve boyama adimi seklinde gerçeklestirilmistir. Uygun anyon degisim
kromatografi ortami teknikte bilinmektedir ve sinirlama olmaksizin, Unosphere Q (Biorad,
Hercules, California), örnegin, POROS 50 PI ya da herhangi bir DEAE, TMAE, üçüncül ya da
dördüncül amin gibi N-yüklü amino ya da imino reçineleri ya da teknikte bilinen PEI tabanli
uzmanlikta bir kisi; uygun iyonik güçte yikama tamponlarinin, rAAV reçineye bagli kalacak
sekilde tanimlanabilir iken sinirlama olmaksizin, pürifikasyon adiminda degerlendirilen çesitli
filtrelerden süzülmesi ile yerlestirilebilen glukanlari içeren süreç içi diger safsizliklar siyrilir.
Bazi durumlarda, yikama tamponu 60 mM NaCl'dir ve rAAV vektörü; serum albumin ya da
yardimci virüs gibi mevcut herhangi bir kalinti iz süreç içi safsizliklari kolonda tutulacak
sekilde, 130 mM NaCI ile kolondan ayristirilir.
ÖRNEKLER
Örnek 1: Kültür ortami durult_ma & Benzonase® sindiriminden rAAV-1'in hasat edilmesi
rAAV-1 vektörünü içeren teknikte bilinen herhangi bir yöntem vasitasiyla üretilen bir 250 L
rAAV-1 viral üretim kültüründen harcanan rAAV-1 üretim ortami (Süpernatant), süpernatantta
yer alan bazi hücreleri gidermesi için durultulmustur. Süpernatant, asagidakileri içeren dizide
bagli bir dizi filtre içinden geçirilmistir: (1) bir Millipore Millistak+® HC Pod Filtresi, Grade
DOHC (Millipore Corp., Bedford, MA)(4 defa); (2) bir Millipore Millistak+® HC Pod Filtresi,
Grade A1HC; ve (3) adim adim 4 LPM'ye azaltilmis olan her dakika basina 5 litrelik (LPM)
hizda bir Opticap® XL10 Millipore Express SHC Hidrofilik Membran 0.2 pm Filtre.
Tüm filtreler, imalatçi talimatlari geregince ters ozmoz / de-iyonize (“RO/DI") suda önceden
yikanmistir. Sürekli akis, Benzonase® sindirimi için bir biyoproses çantasinda toplanmistir.
konsantrasyonu, rAAV-1 üretim ortaminda çözünmüs ve 2,5 birim/ml”lik bir nihai
konsantrasyon elde etmek için durultulan viral süpernatantina ilave edilmistir. Süpernatant ve
ayrica Benzonase®, DNA sindirimine izin vermek için 4 LPM'deki sabit devirdaim ile çevre
sicakliginda inkübe edilmistir. Benzonase® sindiriminden elde edilen veriler Sekil 1'de
gösterilmekte olup, asagidaki Benzonase® sindiriminde mevcut yüksek molekül agirlikli DNA
olmadigini ispat eder.
Örnek 2: Anyonik degisim vasitasiyla üretim kontaminantlarinin giderilmesi
Durultulan rAAV-1 ve Örnek 1'den elde edilen Benzonase® ile sindirilmis süpernatant, seri
halde bagli yirmiiki inç Pall Mustang® Q ("MQ") filtreleri (Pall Corp., katalog numarasi
NP6MSTGQP1) ile iki inçlik bir dizi üzerinden geçmistir. rAAV-1 viral, süpernatantin
yüklemesinden önce, filtreler; 15 dakikalik bir bekletme süresi ile 0,5 LPM'de 0,5 M NaOH'in
L'si ile sanitize edilmis, 6 LPM'Iik bir hizda 15 L TMEG + 2M NaCI (TMEG: 0,05 M Tris-
HCI, pH ile
durulanarak yüklenmis ve 6 LPM'de vektör üretim ortaminin 15 L'si ile dengelenmistir.
Süpernatant daha sonra bir dizi filtre üzerinden yaklasik olarak 6 LPM'Iik bir hizda
pompalanmis ve bir biyoproses çantasinda toplanmistir. Üretim ortaminin iyonik gücünde,
anyonik degisim MQ filtresi; kontaminantlarin yüklü membrana baglanmasi ile rAAV-1
süpernatantindan gelen diger safsizliklar arasinda yardimci virüs ve kalinti DNA”sini
giderdigi ispat edilmistir. Ancak, üretim kültürünün iyonik gücünde, rAAV-1 vektörü, anyonik
degisim membrani boyunca akan süpernatantta mevcuttur. Proses optimizasyonu süresince,
Ad5 yardimci virüsünü içeren prosesteki kontaminantlarda bir ilerlemeye yol açan bir tekli
MQ filtre kullanilarak deneysel olarak belirlenmistir. Sonuç olarak ikinci bir filtre, diziye ya da
prosesteki tandeme ilave edilmistir.
Örnek 3: rAAV-1 vektör süpernatantinin konsantrasyonu
Örnek 1 ve 2'de islem gören bütün rAAV-1 vektör üretim süpernatanti, yaklasik olarak 250
L'Iik bir baslangiç hacminden yaklasik olarak 12,5 L'Iik bir hacme kadar tegetsel akis
filtrasyonu (“TFF”) vasitasiyla yaklasik olarak 20 kat konsantre edilmistir. Bir 100 kD molekül
agirlikli kesme, C ekrani ve 5 m2 toplam yüzey alanli tegetsel akis polietersülfon filtre
kartuslari (Millipore Pellicon® 2 Biomax, Katalog No. PZB100C05); RO/DI suyun 50 L'si ile
çalkalanmis, 15 dakikalik bir bekletme adimi ile 0,5 M NaOH'in 15 L'si ile sanitize edilmis,
WIFI'nin (HyPureTM WFI purified water; HyCIone, Logan, UT) 100 L*si ile tekrar çalkalanmis
ve en sonunda rAAV-1 üretim ortaminin 15 L'si ile dengelenmistir. Süpernatant, 16 LPM'lik
bir devirdaim hizi ile yaklasik olarak 3 LPM'Iik bir akis hizinda TFF kartusu içinden
geçirilmistir. Filtrede tutulan TFF malzemesi (“filtre edilmeyen kisim"), yaklasik olarak 10,5
L'ye konsantre edilmis ve bir rezervuara aktarilmistir. Filtre, üretim ortaminin yaklasik olarak
2 L'si ile çalkalanmistir. Yikama ve konsantre daha sonra yaklasik olarak 12,5 L'Iik bir nihai
hacim vermesi için toplanmistir.
rAAV-1'in TFF ile 12,5 L'Iik bir hacme konsantrasyonu, yaklasik olarak 20 kati ile çözeltide
kalan rAAV-1 üretim kontaminantlari da konsantre edilmesi ile olmustur. Dolayisiyla, bir
imalat bekletme adimi; TFF konsantresinin, bir 4-inç Opticap 0,22 uM filtre membrani
(Millipore Opticap® Katalog No. KVSC04HBS) üzerinden filtre edilmesi süresince TFF adimini
takiben geçirilir. Bu ekstra filtrasyon adimi, diafiltrasyon ve tampon degisimini
gerektirmeksizin proseste sonraki adima devam etmesi için rAAV-1 içeren TFF
konsantresine olanak saglar. TFF sonrasi malzeme; teknikte bilinen deneyler vasitasiyla
degerlendirilen vektör verimi ya da infektivite ile ölçüldügü sekilde stabilitede hiçbir kayip
olmadan ayrica isleme tabi tutulmadan önce, 24 saat kadar az ve 3 ay ya da daha fazlasi
kadar çogunu kapsayan herhangi bir zaman periyodu süresince 2-8°C'de saklanabilir.
Alternatif olarak, burada tanimlandigi sekilde gerçeklestirilen TFF, rAAV-1 vektörünü
konsantre etme ya da tampon degisimi için pürifikasyon prosesinde herhangi bir adimda
kullanilabilir.
Örnek 4: rAAV-1 vektörüne karsi proses safsizlik baglanimi için reçine taramasi
Proteinlerin ve diger biyolojik ürünlerin ticari FDA onayli prosesleri, ortogonal prosesleri ticari
ölçekte birlestirmesine baglidir. Ortogonal prosesler; örnek olarak, bir rAAV-1 vektörü gibi
nihai ürün için hem tutma hem de sürekli akis adimlarini içeren süreç içi safsizliklarin
giderilmesi için birden fazla adim ya da prosese sahip olan proseslerdir. rAAV vektörleri
(spesifik olarak rAAV-2), anyonik reçinelere baglanmasi teknikte ispat edilmistir. rAAV-1, -5
ve -8 gibi rAAV vektörleri; serum albumin, yardimci virüs bilesenleri, üretim ortam bilesenleri
ve daha az verimli ve daha düsük kalitede bir pürifikasyon semasina yol açan konukçu hücre
DNA'si gibi üretim bilesenlerinin varliginda anyonik degistiricilere rAAV-Z'den çok daha az
siki bir sekilde baglandigi ispat edilmistir.
AAV-1 gibi düsük afiniteli anyonik baglayicilar için teknikte tanimlanan önceki pürifikasyon
stratejileri, rAAV vektörünün anyonik degistiricilerine daha siki bir baglanimini elde etmek
amaciyla üretim bilesenlerinin relatif konsantrasyonunu azaltan bir iyodiksinol adim
gradyanini içerir. Iyodiksinol adim gradyanlari, burada tanimlananlar gibi ticari ölçekte
proseslere kolaylikla ölçeklenemez. Bu nedenle, ultrasantrifügasyon ve adim gradyanlarini
gerçeklestirmek için gerektirmeyen rAAV-1 gibi düsük afiniteli anyonik baglayicilar için rAAV
vektör pürifikasyonunu optimize etmek amaciyla, reçinelerin sayisi; rAAV vektörlerine kendi
baglanma yetenegi için taranmistir ya da ticari olarak ölçeklenebilir, ortogonal ve verimli bir
rAAV pürifikasyon prosesini gelistirmek amaciyla üretim kültürlerinde bulunan konukçu hücre
DNA'si, yardimci virüs, serum albumin, serum proteinleri (eger serum, üretim ortamina dahil
edilirse) ve diger düsük molekül agirlikli proteinleri içeren yaygin bir sekilde gözlenen proses
safsizliklarinin baglanma ve sürekli akis yetenegi ile karsilastirilirsa sürekli akistaki rAAV
vektörleri hariç tutulur.
Reçine taramasi, imalatçi tavsiyeleri ile ilgili olarak ciddi bir sekilde yetersiz yüklü her reçine
için tedarikçi tarafindan tavsiye edilen lineer akis hizlari ile bir 1 ml”lik (5 cm yatay yüksekligi)
kolon kullanilarak gerçeklestirilmistir. 280 nanometredeki ultraviyole absorbansinin (A230)
spektrofotometrik izleri, her reçineden ayristirilmasi ve her reçineye baglanmasi için
toplanmistir. Pikler, hem rAAV-1 vektörü hem de temsili proses safsizliklari için uygun deney
vasitasiyla analiz edilmistir. Sekil 2'de sunulan veriler, listedeki tipik bir reçine için tipik bir
spektrofotometrik izi temsil eder. Tablo 2, rAAV-1 vektörü ve çesitli proses safsizliklari için
reçinenin relatif baglanma afinitelerinin yanisira taranan reçinelerin bazilarini da listeler.
Tablo 2: Proses kontaminantlarinin baglanmasina nazaran rAAV-1'in baglanmasi için
reçinelerin taranmasi
Reçine Reçine Tipi rAAV-1 Yardimi Konukçu Serum Serum
Virüs Hücre DNA'si Albumin Proteinleri
UnoS pH 5,5 Katyon + 0 - + +
Degisimi
UnoS pH 7,0 Katyon - - - - _
Reçine Reçine Tipi rAAV-1 Yardimi
Degisimi
UnoQ pH 8,5 Anyon + ++
Degisimi
UnoQ pH 7,0 Anyon + +++
Degisimi
Fractogel Katyon + ++
EMD 803 Degisimi
CHT Apatit + 0
CFT Apatit + 0
HIC Fenil Hidrofobik - -
Degisim
HIC Bütil Hidrofobik + ++
Degisim
HIC Hekzil Hidrofobik + ++
Degisim
HIC PPG Hidrofobik - -
Degisim
Source S Iyon Degisimi + 0
Source Q Iyon Degisimi + 0
TMAE Iyon Degisimi + 0
Superdex Jel Filtrasyonu geçersiz geçersiz
HW55 Jel Filtrasyonu geçersiz geçersiz
HW65 Jel Filtrasyonu geçersiz geçersiz
HW75 Jel Filtrasyonu geçersiz geçersiz
Konukçu
Hücre DNA'si
takipte
takipte
takipte
takipte
Albumin
takipte
takipte
takipte
takipte
Proteinleri
takipte
takipte
takipte
takipte
Anahtar: (-) = sürekli akista mevcut (baglanma yok): + = zayif bagli (gradyanda çok erken
ayristirilan); ++ ila ++++ = daha güçlü bir baglanma (gradyan boyunca ayrica ayristirilan).
Örnek 5: rAAV-1'in tutulumu icin polietilen qlikol (“PEG”) varliginda apatit
kromatografisinin gelistirilmesi
Örnek 4'tegerçeklestirilen reçine taramasinin sonuçlari bazinda, bir apatit reçine ya da
seramik apatit reçine, rAAV-1 için tutma reçinelerinin biri olarak seçilmistir. Baslangiç
deneyleri, CFT II reçineleri kullanilarak gerçeklestirilmistir, ancak sonraki pürifikasyon için,
reçine, asagida detayli sekilde tartisildigi gibi CHT lie degistirilmistir. Veriler, her iki
kromatografik reçinenin de esit bir biçimde gerçeklestirilmis oldugunu göstermistir. Deneyler;
apatit reçinenin rAAV-1 baglanma kapasitesini daha da arttirmak için gerçeklestirilmistir ve
rAAV-1 partikülleri ile diger süreç içi safsizliklar arasinda ayrim yapmak için reçinenin
yetenegini gelistirmistir. Apatit reçinenin fonksiyonu için iki anahtar gelisim, burada
tanimlandigi sekilde daha da gelistirilmistir: 1) PEG ilavesi; ve 2) yükleme tampon
kosullarinin gelisimi.
Ticari olarak makul kolon boyutlarindaki kapasite meseleleri nedeniyle apatit kolonun
degisken ilerlemesi bazinda, PEG; Örnek 4'teki kolona baglanmasi için rAAV-1 vektörüne
üstün gelen serum albumin, yardimci virüs ve diger protein safsizliklari gibi diger süreç içi
safsizliklar ile ilgili olarak rAAV-1 vektörünün baglanmasini arttirmak amaciyla apatit
reçinede yükleme öncesinde TFF konsatresi ile karistirilmistir (yukaridaki Örnek 3'e bakiniz).
PEG'in varliginda apatit kromatografisi; birçok proses safsizligi pH 7,0'daki apatit reçine ile
de tutulmasina ragmen, rAAV-1 vektörlerinin pürifikasyonu için verimli bir tutulma ya da
baglanma stratejisini temsil eder.
Deneyler; eger modifiye ediliyorsa, tamponlama kosullarinin, süreç içi diger safsizliklardan
rAAV-1,in kararliligini gelistirebildiginin saptanmasi gerçeklestirilmistir. Küçük ölçekli
deneyler; CFT reçineli 6 cm'lik bir yatay yüksekliginde paketlenmis 1,2 mL Tricorn 5 kolonlari
(GE Healthcare) ile donatilmis bir AKTAeprorer FPLC Sistemi (GE Healthcare, Piscataway,
NJ) kullanilarak gerçeklestirilmis, 150 cm/saatlik bir akis hizinda çalistirilmistir. Bu kolonlar;
molekül süreç içi safsizliginda, rAAV-1 vektör tutulumuna karsi bovin serum albüminin
(“BSA”) baglanmasi için degerlendirilmistir.
rAAV-1 ya da BSA; ya %5 (agirlik/hacim) PEG6000'in varliginda ya da yoklugunda test
edilecek tampon sisteminde CFT kolonundaki küçük hacimlerde (toplam hacme göre < %5)
enjekte edilmistir. Küçük hacimler, numunelerin tampon degisimi için gereksinimi gereksiz
kilmasi amaciyla kullanilmistir. Ürünler, bir 500mM PO4 gradyani boyunca ayristirilmistir. 50
mM 2-(N-morfolino) etansülfonik asit ("MES"), pH=6,50'deki tampon sistemi için kullanilmistir
ve 20 mM borat, pH 9,0'daki tampon sistemi için kullanilmistir.
Model küçük molekül süreç içi safsizlikta BSAlnin baglanimi, spektrofotometrik izler
tarafindan gösterildigi sekilde %5 (agirlik/hacim) PEG6000'in varliginda pH 9,0'da önemli
ölçüde azalmis iken, Tablo 3'te sunulan veriler, apatit reçinesine baglanan rAAV-1
vektörünün, %5 (agirlik/hacim) PEG6000lin varliginda pH 6,5 ya da pH 9,0'da esasen ayni
oldugu ispat edilmistir (veriler gösterilmemistir). BSA baglaniminda klerens ya da
redüksiyonun ilave seviyeleri, rAAV-1 vektörü ile birlikte ayristirilan ve apatit reçineye fiilen
bagli kolon üzerine yüklenen BSA'nin sadece ~%0,1'ini birakan sonraki yikama adimlari
(~%19) süresince elde edilebilir iken, enzime bagli immünosorbent deneyi (“ELISA") ile bazik
tampon yükleme kosullarinda (baska bir deyisle, pH=9,0) apatit kolonuna baglanmasi için
BSA'nin azaltilmis kapasitesinin daha ileri analizi; çogu BSA'nin (~%78), pH 9,0 tamponu
kosullarinda sürekli akista mevcut oldugunu gösterir. rAAV-1 partikülleri, ayristirilan DNaz
dirençli partiküllerin (“DRP") sayisinda azalma ya da kayipsiz infektivite ile gösterildigi sekilde
pH=9,0'da stabil olmustur.
apatit reçine için rAAV-1 ve BSA'nin baglaniminin relatif gücü
Baglanma kosullari BSA rAAV-1
pH=6,50 + %5 (agirlik/hacim) ++ ++++
pH=9,00 + %5 (agirlik/hacim) + ++++
Anahtar: + = zayif baglanma; ++ = orta düzeyde baglanma; ++++ = kuvvetli baglanma.
Örnek 6: PEG'in varliginda aigatit kromatografisi vasitasiyla rAAV-1 tutulumunda
rAAV-1 hasat kültüründe serumun em
Eger üretim kültürleri serum içeren ortamda büyümüs ise, rAAV1 vektör üretim kültürleri ya
da burada tanimlanan yöntemler ile saflastirilacak rAAV-1 içeren besleme akislari serum ve
serum proteinlerini içerebilir. Serumun çok düsük konsantrasyonlarini (baska bir deyisle, %1
ya da daha az) kullanan rAAV-1 vektör üretimi (örnegin, bakiniz, U.S. Pat. No. 6,995,006)
tanimlanmis oldugu halde, Örnek 3'te tanimlandigi sekilde üretim kültürü ya da besleme
akisinin konsantrasyonu, üretim kültür hasadinin 20 kat konsantrasyonunun bir sonucu
olarak %20 serum ve serum proteinlerini etkin olarak içeren bir besleme akisini üretebilir.
Apatit kromatografisinin performansi üzerinde serum bilesenlerinin etkisini degerlendirmek
amaciyla, deneyler, PEG6000'in varliginda ya da yoklugunda serumun varliginda ya da
yoklugunda üretilen üretim kültürlerinde gerçeklestirilmistir.
Iki model rAAV-1 üretim kültürleri, toplam dört kolon yükleme deneyindeki geleneksel
iyilestirme analizi ile apatit reçinenin (CFT tip I) kapasitesini degerlendirmek için
kullanilmistir. Bir deneyde, üretim kültürleri serum içerir; ve ikinci deneyde üretim kültürü
serum içermez. Her iki besleme akisi da %5 (agirlik/hacim) PEGGOOO'ün varliginda ya da
PEG'in yoklugunda test edilmistir. Besleme akislari; hasat prosesinin temsili olmustur ve bir
anyon degisim filtresi üzerinden geçmis olan durultulmus kültür süpernatantlari olmus ve
burada tanimlandigi sekilde tegetsel akis filtrasyonu yoluyla 20 kat konsantre edilmistir. CFT
tip I kolonlari, pH=9,0'da bir borat tamponu ile besleme akisinin 1:1 baglantili karisimi ile
yüklenmistir. Tampon ya %0 ya da %10 (agirlik/hacim) PEG6000 içerir (%5 (agirlik/hacim)
PEG6000iin nihai bir konsantrasyonunu elde etmek için). Kolonlar yüklendigi sekilde, sürekli
akis, DRP-PCR tarafindan ürün için analiz edilmis olan bir dizi fraksiyonda toplanmistir.
Fonksiyonel kapasite, baglantili dilüsyona hesaba katildiktan sonra kolona giren
konsantrasyonun sadece %1'ine erisen kolonun çikisindaki ürün konsantrasyonundaki nokta
olarak tanimlanmistir. PEG içeren kolon yüklemeleri için, kromatografi prosesinin geri
kalanina, daha sonra elüsyon fraksiyonlarindaki vektör geri kazanimini degerlendirmek için
çalisilmistir.
Sekil 3'te sunulan veriler; PEGGOOO ilavesinin, serumun üretim kültüründe mevcut olup
olmadigina bakilmaksizin rAAV-1 vektör baglanimi için apatit reçinenin kapasitesini arttirdigi
ispat edilir. Teori ile sinirlanmak istenmemekle birlikte, PEG`in varliginda TFF sonrasi
süpernatanti, elüsyon tamponundaki fosfat varligi ile üstün gelebilen fosfat kisimlarina bir
anyonik etkilesim vasitasiyla diger süreç içi safsizliklar üzerindeki apatit reçineye rAAV-1
tercihen baglanir. Ek olarak, apatit reçineye rAAV-1 baglanimi, tuz varligi ile üstün gelebilen
metal etkilesimi vasitasiyla süreç içi safsizliklardan ayrica ayrim yapar. Tutma ve elüsyon
tamponlarinin, tabiati geregi öncelikle iyonik olarak formüle edildigi sekilde (baska bir deyisle,
Öncelikle hidrofobik etkilesimler ile baglanan ayristirma bilesimlerinde daha yaygin bir sekilde
kullanilan ya da 150 mM fosfat içeren elüsyon tamponlarina nazaran 50 mM fosfat içeren
elüsyon tamponu), rAAV-1'in fosfat kisimlarina baglanimi öncelikle hidrofobisite ile
sürdürülür. Bu yüksek tuz altinda, düsük fosfat elüsyon kosullari, kalinti yardimci virüsü,
konukçu hücre DNA`si ve üretim kültürlerinin süpernatantinda yer alan diger düsük molekül
agirlikli proteinler, mevcut oldugu takdirde reçine üzerinde tutulacaktir. Sasirtici bir sekilde,
veriler; PEG 1,2›<1012 DRP/mL (bir
1mL yükleme) ila 1,5x1014 DRP/mL'den daha fazlasinin apatit reçineleri için bir baglanma
kapasitesini gösteren ya serum içeren ya da serumsuz ortamda üretildigini gösterir. %5
(agirlik/hacim) PEG6000 yoklugunda, TFF hasadi için apatit reçinenin baglanma kapasitesi;
CFT eluatinda geri dönüstürülmüs rAAV-1 vektörü olmayacak sekilde, serumsuz ortamda
üretilen vektörler için 7,2›<1O12 DRP/ml ve ortami içeren serumda üretilen vektörler için
2,4›<1012 DRP/mL'den daha düsük olmustur.
Örnek 7: Apatit kromatografisi vasitasiyla rAAV-1tin pürifikasvonu
CHT Tip I kolonu, 2 M NaCl ile paketlenmis ve 1 M NaOH ile sanitize edilmistir. Yükleme
öncesinde, kolon, 20 mM borat (pH = 9) + %5 (agirlik/hacim) PEGGOOO'in 6 kolon hacmi
(“CV") ile dengelenmistir. TFF besleme akisi konsantresi, 96 cm/saatlik bir akis hizinda daha
önceden tanimlandigi sekilde hazirlanan bir 923 ml (14 cm çap X 6 cm yatay yüksekligi) CHT
kolonu üzerinde bir 3mm BioProcess Skid (GE Healthcare) vasitasiyla yüklenmistir. TFF
besleme akisi konsantresi, 20 mM borat (pH = 9) + %5 (agirlik/hacim) PEGBOOO'in nihai bir
konsantrasyonunu vermesi için bir 40 mM borat (pH = 9) + %10 (agirlik/hacim) PEGöOOO
tamponunun bir esit hacmi ile sirali olarak karistirilmistir.
4 ardisik yikamali bir dizi, kolondaki rAAV-1 vektörü tutulurken süreç içi safsizliklari gidermek
için gerçeklestirilmistir. Yikama 1 (“takip"), PEG6000 ile tüm yükleme hatlarini takip etmek
borat (pH = 9,0) + %10 (agirlik/hacim) PEG6000'in 5 CV'sinin sirali olarak karistirilmasiyla
gerçeklestirilmistir. Ayrica, bu adimin, tercihen rAAV-1 vektörlerinin baglanma afinitesini
arttirdigi bulunmustur. Yikama 2; kolon üzerinde rAAV-1 tutulurken. serum albumin ve diger
düsük molekül agirlikli protein süreç içi safsizliklarinin çogunlugunu gidermek için 150 mM
potasyum fosfat + 20 mM borat (pH = 9) + %5 (agirlik/hacim) PEGGOOO'in 15 CV'si ile
gerçeklestirilmistir. Yikama 3 (Sekil 5'te “WII”); herhangi bir kalinti fosfati gidermek için 20
mM borat (pH = 9) + %5 (agirlik/hacim) PEGßOOO'in 15 CV'si ile gerçeklestirilmistir, böylece
rAAV-1, PEGGOOO giderilir giderilmez kolona bagli kalir. Yikama 4 (Sekil 5'te “WIII”);
+ 150mM NaCI tamponu ile gerçeklestirilmistir, dolayisiyla rAAV-1 ile kolona bagli kalabilen
protein kontaminantlari gibi herhangi bir kalinti yardimci virüsü ya da diger süreç içi
safsizliklar arasindaki ayrima izin verir.
tamponunun 6 CV'si ile kolondan ayristirilmistir. Sekil 4, CHT I kromatografi prosedürü için
iletkenlik ile 280 nm'deki UV absorbansinin (A230) tipik bir spektrofotometrik izini gösterir.
Sekil 5, apatit reçineden ayristirilan rAAV vektörlerinin relatif safligini gösterir.
Agatit kromatografisi ile glukan klerensi
Glukanlar, üretim kültürlerinden elde edilen rAAV-1 partiküllerini hasat etmek için kullanilan
selüloz tabanli derinlik filtresinden proses içine nüfuz eden selüloza benzer
karbonhidratlardir. ~1 ng/mL üzerinde konsantrasyonlardaki glukanlar, bakteriyel endotoksin
kontaminasyonu için standart Limulus amöbosit Iizat ("LAL") testleri ile engellenebilir.
Asagidaki Tablo 4'te gösterildigi gibi, apatit CHT Tip l kolonu, üretim kültüründen glukanlarin
~2,5 Iogunu temizler. Burada tanimlanan tampon kosullari altinda, glukanlarin büyük
çogunlugu, sürekli akista mevcut olmustur ve kolona baglanmamistir.
Tablo 4: Prosesteki glukan klerensi
Glukan konsantrasyonu Her lot basina toplam miktar (ng)
Proses adimi __
(ng/mL) (250L olçek)
CHT elüsyonu 1,9 4,769
Post HIC ve SEO 0,2 662
Nihai An on De“i im
y 9 s 0,1 71
Eluati
Numuneler, glukanlara özgü bir LAL tabanli kinetik kromojenik deney kullanilarak glukan için
test edilmistir (Glucatell®, Cape Cod, MA).
Apatit kromatografisi ile Ad5 yardimci virüs klerensi
CHT kromatografisinin besleme akisindan Ad5'i temizlemesinin onaylanmasi için, sivri bir
baslangiç çalismasi, nihai yukari akinti prosesinden elde edilen besleme akisi kullanilarak
gerçeklestirilmistir. Ad5 basak seviyeleri, CFT II reçineleri ile faz I viral klerens çalismasindan
elde edilen veriler bazinda ayarlanmistir ve besleme akisinin üç farkli yükleme orani
kullanilmistir 6,6 mL; 13,5 mL; ve her mL CHT reçinesi basina TFF sonrasi besleme akisinin
33 mL'si.
Tablo 5'te sunulan verilerde, CHT tarafindan Ad5 klerensi; Ad5 viral klerensinin yaklasik
olarak 4 logunu gösteren 4 LRV klerensi ile karsilastirilmistir ve degerlendirilen 5 kat aralik
dahilinde yüklenen besleme akisinin hacminden bagimsiz olacagi izlenimi vermistir. Düsük
Ad5 geri kazanimi; Ad5”i degerlendiren tampon kosullari altinda, apatit reçineye rAAV-1'den
daha siki baglandigini gösteren daha önceki veriler ile tutarlidir.
Tablo 5: CHT kolon fraksiyonlarindaki Ad5'im toplam infeksiyöz birimi
Fraksiyon yükleme orani 6,6 mL 13,5 mL 33 mL
Log redüksiyon degeri (LRV) > 4,1 > 4,3 > 3,4
Ad5tin toplam 8><109 infeksiyöz partikülü (baska bir deyisle, ~10'Iuk bir Pzl'li toplam partikül).
1,2 mL CHT kolonunda çalismasi için TFF sonrasi besleme akisinin farkli hacimlerine
tikanmistir. Kolonlar, 100 cm/saatte çalisilmistir ve fraksiyonlar, infeksiyöz titre deneyi ile
DRP ve Ad5 tarafindan vektör için denenmesi için toplanmistir. Ad5 infektivite deneyinin
spike kontrollü bir versiyonu, hem yükleme hem de CHT elüsyon numunelerinin yüksek
konsantrasyonlarinin, hücre tabanli deneye müdahale etmesinden dolayi kullanilmistir. Ad5
klerensi, elüsyon fraksiyonunda (Log Redüksiyon Degeri) geri kazanilan Ad5”in toplam
miktari ile bölünerek yüklenen Ad5'im toplam miktarinin Iogaritmasi olarak hesaplanan Log
Redüksiyon Degeri (“LRV") olarak belirlenmistir.
Örnek 8: Kalinti yardimci virüsünün Isi Inaktiiasvong
Bir isi inaktivasyon adimi, CHT I eluatinda mevcut olan herhangi bir kalinti yardimci virüsünü
inaktive etmek ve gidermek amaciyla gerçeklestirilmistir. Daha küçük ölçekte denemeler için,
CHT I eluati, iki 1 Lilik PETG (Nalgene®) sisesi arasinda bölünmüstür ve MgCIz, rAAV-1
vektörünün stabilitesini arttirmak amaciyla 2 mM'lik nihai bir konsantrasyona ilave edilmistir.
Siseler; sisedeki sicaklik yaklasik olarak 52°C'ye erisene dek karistirma ile 53,5°C'Iik bir su
banyosunda inkübe edilmistir. Siseler daha sonra çevre sicakliginda bir su banyosuna
aktarilarak sogutulmus ve sisedeki sicaklik, çevre sicakligindan 5°C`den daha büyük
olmayana dek karistirilmistir. Isi-öldüren karisim, bir 4-inç Opticap® 0,22 pM filtre membrani
(Millipore Opticap® catalog number KVSCO4HBß) üzerinden filtre edilmistir. Alternatif olarak,
daha büyük ölçekli deneylerde, CHT I eluati, 12°'Iik bir karistirma açisi ile 40 devir/dakikalik
bir sallama hizinda 53°Cilik bir sicaklik ayar noktali bir sicaklik kontrollü sallama
platformunda (20L Dalga isitici pan) steril, tek kullanimlik bir biyoproses çantasinda (Custom
Hyclone 5 L çanta, CX5-14 film) isi ile inaktive edilmistir. CHT I eluati, sicaklik 52°C'ye
erisene dek platformda inkübe edilmis ve daha sonra ilave bir 10 dakika süresince
tutulmustur. Isitma süresince rAAV vektörünü stabilize etmek için, MgCIz, 2 mM'Iik bir nihai
konsantrasyona ilave edilmistir. Isitma sonrasinda, ürün; bir 0,2 um filtre üzerinden filtre
edilmis ve sonraki hidrofobik etkilesim kolonundaki olasi sicaklik etkilerini minimize etmek
için çevre sicakliginda gece boyunca tutulmustur.
Örnek 9: Hidrofobik Etkilesim Kromatografisi ("HIC") vasitasiyla rAAV-1 tutulumu
HIC, kendi yüzey hidrofobisitesindeki farkliliklar bazinda biyomolekülleri ayirmak için bir
tekniktir. Dolayisiyla, HIC, rAAV-1 prosesindeki diger pürifikasyon adimlarina bir ortogonal
yöntem olarak dikkate alinir. HIC ortami, lineer zincir hidrokarbonlari (örnegin, propil (CB),
bütil (C4), hekzil (CG) ya da oktil (C8)) ya da aromatik hidrokarbonlar (örnegin, fenil) gibi
hidrofobik Iigandlari içerir. Saf suda, hidrofobik etki, Iigand ile proteinler arasindaki ya da
proteinlerin kendi arasindaki fonksiyonel etkilesim için çok zayiftir. Ancak, iyotropik tuzlar
hidrofobik etkilesimleri gelistirir ve böyle tuz ilavesi, HIC ortami için proteinlerin
adsorpsiyonunu sürdürür. Bundan dolayi, HIC reçineleri genellikle yüksek tuz
konsantrasyonlari altinda yüklenir ve düsük tuz konsantrasyonlarinda ayristirilir.
Amonyum sülfat tamponlari ile HIC kromatografisi
Kisa bir süreligine, bir 170 ml (6 cm çap X 6 cm yatay yüksekligi) HIC bütil kolonu
(Toyopearl® Butyl 650M; Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA; Katalog numarasi14702);
0,5 M NaOH'in birkaç kolon hacmi ile sanitize edilmis ve 2 M amonyum sülfat + 50 mM Bis
dengelenmistir. Isi ile öldürülmüs rAAV-1 vektör apatit eluati; 2 M amonyum sülfat + 50 mM
Bis Tris (pH = bir oranda sirali olarak
karistirilmasi ile 3,3 L/saatlik bir hizda yüklenmistir. Sirali karistirma, tamponda mevcut olan
amonyum sülfat tarafindan herhangi bir rAAV-1 vektör presipitasyonu riskinden kaçinir.
Kolon; bir 2 M amonyum sülfat + 50 mM Bis Tris pH = 7,0 tamponz5O mM Bis Tris pH = 7,0 +
bir ya da daha fazla kolon hacmi ile yikanmistir. Bu örnekteki Propilen Glikol; proseste
opsiyonel olmasina ragmen, Propilen Glikol olmadan tamponun genis elüsyon profiline
nazaran daha keskin bir elüsyon profili için tamponlara ilave edilmistir. rAAV-1 vektörü; 800
mM amonyum sülfat + 50 mM Bis Tris (pH = 7,0) tamponu + %4 Propilen Glikol ile kolondan
ayristirilmistir. Degerlendirilen elüsyon kosullarinda, yükte mevcut olan herhangi bir kalinti
yardimci virüsü ve proteinler, kolona bagli kalacaktir.
rAAV-1 üretim proseslerinden gelen atik, hem bir viral vektör olarak ürün hem de üretim için
bir yardimci virüs olarak canli adenovirüs tip 5'in (Ad5) kullanimindan dolayi imha öncesinde
siki dekontaminasyon gerektirir. Kromatografi operasyonlarindan gelen sivi atik tipik olarak
ilk önce kullanim noktasinda beyazlatma ile dekontamine edilir ve daha sonra nötralizasyon
ve imha etme öncesinde yüksek thda tutularak ayrica dekontamine edilir. HIC
tamponlarinda mevcut olan amonyum sülfat, sirasiyla beyazlatma ile tehlikeli klor ve
amonyak gazinin salimi için sodyum hidroksitin her ikisi ile de reaksiyon verir. Bu nedenle,
HIC kromatografi adiminin proses optimizasyonu için öncelikli bir düsünce, teknikte bilinen
yöntemler ile güvenli bir sekilde dekontamine olabilen uygun bir tampon sisteminin
gelistirilmesi olmustur.
HIC kolonuna baglanan rAAV-1 için Uvqun Tamponlarin Taranmasi
rAAV-1 vektörü, çesitli farkli tampon kosullarinda kolonlar üzerine yüklenmistir ve relatif
baglanma etkinligi, sürekli akis fraksiyonunda mevcut olan rAAV-1 vektörünün miktarinin
ölçülmesi ile belirlenmistir (Tablo 6). Degerlendirilen tamponlar; bir karisik mod etkilesiminin
(HIC / katyon degisimi) potansiyel olarak meydana gelebildigi yerde, hem HIC kromatografik
prosesleri ile karakteristik olarak degerlendirilen yüksek konsantrasyon liyotropik tuzlari hem
de birkaç düsük thli tamponu içerir. hem Tosoh Bütil 650M hem de EMD Fenil reçineleri,
alternatif tamponlarin birkaçinda vektöre baglidir.
Hidrofobik etkilesim kromatografisinde kullanilan yüksek tuz konsantrasyonlu tamponlar;
tamponlarin depolama ya da isletme sicakliklarinda tuz kristalizasyonundan ötürü ürünün
presipitasyon riski ile ya akis hizlarini sinirlayabilen ya da karistirma problemlerine sebep
olabilen yüksek ters basinçlara yol açabilen viskozite sorunlari için ayrica taranmalidir.
Asagida Tablo 6'daki veriler bazinda ve yukarida tanimlanan faktörlerin dikkate alinmasi
sonrasinda, 1 M sodyum sitrat, pH = 7,0, rAAV-i vektörlerinin HIC kromatografik ortamina
baglanmasi için optimal tampon olarak seçilmistir.
Tablo 6: Alternatif tamponlarda AAV-1 baglanimi için tarama
Test Edilen Tampon Sistemi Bütil 650M (sürekli EMD-Fenil (sürekli
akistaki %) akistaki %)
Test Edilen Tampon Sistemi Bütil 650M (sürekli EMD-Fenil (sürekli
akistaki %) akistaki %)
1,1 M Sodyum Sülfat (pH = 7) %0 %0
1 M Sodyum Sitrat (pH = 7) %0 %0
1,3 M Potasyum Fosfat (pH = 7) %3 %3
2,9 M NaCl, 50 mM Sodyum Sitrat (pH = 4) %0 %28
1 M Glisin, 50 mM Sodyum Sitrat (pH = 4) %4 %1
50 mM Potasyum Fosfat (pH = 4,5) %3 NT
50 mM Sodyum Sitrat (pH 4) %4 NT
2,9 M NaCI, 50 mM Potasyum Fosfat (pH 4,5) %17 NT
Deneyler, saflastirilmis rAAV-1 vektörü kullanilarak Tricorn 5/50 kolonlari (6 cm yatak
yüksekligi, üzerinde çevre sicakliginda gerçeklestirilmistir. Kolonlar,
listelenen tamponlar ile dengelenmistir ve ~2><1011 DRP ya da rAAV-1, kolona yüklenmistir.
rAAV-1, Propilen Glikol'den elde edilen bir
CV lineer gradyan üzerinde ayristirilmistir. Sürekli akis toplanmis ve üzerinden akan
kolona uygulanan rAAV-1'in fraksiyonu için DRP analizine tabi tutulmustur ya da
baglanmamistir.
Daha ileri karakterizasyon, daha önceki deneyde rAAV-1 'in iyi baglanimini gösteren çesitli
tamponlardaki HIC kolonunda süreç içi safsizliklarin klerensinde gerçeklestirilmistir. Model
kontaminant baglanimi için asagidaki Tablo 7'deki veriler; mevcut oldugu takdirde besleme
akisindaki hem adenovirüs hem de DNA'nin, HIC kromatografi adimi ile etkili bir sekil ayirt
edildigini ispat eder.
Tablo 7: Farkli HIC tamponlarindaki rAAV-1ie karsi model süreç içi safsizliklarin relatif
baglanimi
Tampon Sistemi rAAV-1 Ad5 DNA
0,1 M sodyum sülfat + bis tris tamponu, pH = 7,0 + ++ -
0,8 M sodyum sülfat, bis tris tamponu, pH = 7,0 + ++ 0
1 M sodyum sitrat, pH = 7,0 + ++ 0
2,9 M NaCl (pH = 4,0'daki tampon için 50 mM sodyum sitrat) - - 0
Anahtar: "0" = sürekli akista mevcut baglanma malzemesi yoktur; = çok zayif baglayici;
Deneyler, saflastirilmis rAAV-1 vektörü kullanilarak Tricorn 5/50 kolonlari (6 cm yatak
yüksekligi, üzerinde çevre sicakliginda gerçeklestirilmistir. Kolonlar,
listelenen tamponlar ile dengelenmistir ve gösterilen numuneler kolona yüklenmistir. Her
numune, bir 20 CV lineer gradyan üzerinde ayristirilmistir. Numuneler toplanmis ve ilgili
yükleme malzemesi için deneye tabi tutulmustur.
Sodyum sitrat tamponlari ile HIC kromatoqrafisi
ve herhangi bir kalinti proses safsizliklarini ayrica azaltmak amaciyla bir HIC bütil kolonu
üzerine sonradan yüklenmistir. Bir 373 ml (6 cm çap x 8,9 cm yatak yüksekligi) HIC bütil
kolonu (Tosoh Biosciences Toyopearl® Butyl 65OM katalog numarasi 14702); 0,5 M NaOH'in
birkaç kolon hacmi ile sanitize edilmis ve 1 M Sitrat + 20 mM sodyum fosfatz20mM sodyum
fosfatin 75:25'lik (hacim:hacim) bir karisiminin 5 CV'si ile dengelenmistir. lsi ile öldürülmüs
rAAV-1 vektör CHT l eluati; 1 M sitrat + 20mM sodyum fosfatCHT l eluatinin 75:25'lik
(hacimzhacim) bir oranda sirali olarak karistirilmasi ile 106 cm/saatlik bir hizda yüklenmistir.
Sirali karistirma, herhangi bir rAAV-1 vektör presipitasyonu riskinden kaçinir. Kolon; 1 M
sitrat + 20mM sodyum fosfat:20mM sodyum fosfat tamponunun 75:25'lik (hacimshacim) bir
karisiminin 5 CV'si ile yikanmistir. rAAV-1 vektörü; 0,35 M sitrat + 20 mM sodyum fosfatin 6
CV'si ile kolondan ayristirilmistir. Kolon daha sonra 20mM sodyum fosfat tamponunun , daha yüksek tuzlu elüsyon
tamponunda ayristirilan rAAV-1 vektör partiküllerinden onlarin elüsyon profilinde hidrofobik
olarak belirgin olan rAAV-1 vektör partiküllerinin bir fraksiyonunu ayristirir. Gerçekten de,
eger düsük tuzlu ayristirilmis fraksiyon izole edilmisse ve tanimlanan kosullar altinda HIC
kolonuna yeniden uygulanmissa, fraksiyonu gösteren sadece düsük tuzlu fraksiyonda
ayristirilan vektör popülasyonu , kolonun kapasitesinde bir Ilerlemenin sonucu olmamistir.
Infektivite analizi; rAAV-i'in bu fraksiyonunun, bos kapsidler, kismen denatüre kapsidler,
daha az infeksiyöz kapsid malzemesi ve kismen tam kapsidleri içeren bir popülasyonu temsil
ettigini ileri sürer. Bu nedenle, bu gözlem, daha az infeksiyöz olan rAAV-1 partiküllerinin
separasyonunda gelismelere yol açabilir ve bu nedenle ürün malzemesi olarak daha az arzu
edilirdir. Elüsyon kosullarinda degerlendirilen yükte mevcut olan herhangi bir kalinti yardimci
virüsü ve proteinler, kolona bagli kalacaktir ve böylelikle düsük tuz seridinde mevcut
olmalidir.
Örnek 10: Boyut dislama kromatoqrafisi (“SEC”) ile tampon degisimi
Boyut dislama kromatografisi ile tampon degisimi; reçinelerdeki gözenekler içinden geçmesi
için boyutlandirilan proteinlerin ilave protein klerensini saglar ve tamponlarin degisimi için
gerekli süre açisindan nispeten hizlidir. Bu adimda gerçeklestirilen tampon degisimi; önceki
adimin HIC eluatinin, prosesteki nihai anyon degisim kromatografi adimina baglanan rAAV-1
için uygun bir tampona degistirilmis oldugu saglanmistir. Bir 3,2 L (14 cm çap x 21 cm yatak
yüksekligi) Amersham Superdex® 200 prep sinifi reçine (Amersham/GE Healthcare,
sanitize edilmesi ile hazirlanmis ve 20 mM NaCl + 20 mM Tris'in (pH = 8,0) 2,8 CV'si ile
dengelenmistir. HIC elüsyonu; her çevrim için SEC kolon hacminin %12.5`den daha çok
olmayan yüklemenin her biri yaklasik olarak 400 ml'lik üç ardisik çevrimde SEC üzerinde
proses için bölünmüstür. Üç SEC çevriminden elde edilen ürün pikleri (bos hacimlerde yer
alan), tek kullanimlik bir biyoproses çantasinda toplanmistir. HIC eluati, 49 cm/saatlik bir akis
hizinda kolon üzerine yüklenmistir. Kolon; takip edilmis ve 20 mM NaCI + 20mM Tris'in (pH =
8,0) 1,4 CV'si ile yikanmistir ve HlC eluatinda mevcut olan bir rAAV-l vektörü, kolonun bos
hacminde mevcut idi. Tanimlandigi sekilde bos hacmin koleksiyonunu takiben, ikinci ve
üçüncü fraksiyonlar yüklenmis ve birinci fraksiyon için önceden tanimlandigi sekilde ardisik
olarak ayni kolonda toplanmistir.
Örnek 11: Harici ajan (viral klerens)
Iz kontaminantlari olarak mevcut olabilen harici virüsleri temizlemek ve dolayisiyla ticari
olarak makul ortogonal proses vermesi için opsiyonel bir proses olarak, bir viral klerens
filtresi, proses içine yerlestirilmistir. Bu tip filtrelerin örnekleri; teknikte bilinmektedir ve
Millipore Viresolve® NFR (50 nm), Pall Ultipore® VF (50 nm) ve Asahi 70 nm'yi içerir. Bir
Millipore Viresolve® NFR (Millipore 4" Virosolve NFR filtresi Katalog numarasi KZRV O4T CS)
viral klerens filtresi; imalatçi talimatlarina göre hazirlanmis, 20 mM NaCI + 20 mM Tris (pH =
8,0) ile yikanmistir ve SEO elüsyonu, membran üzerinden filtre edilmistir. Filtre; 20 mM NaCI
+ 20 mM Tris-HCI'nin (pH 8,0) birkaç hacmi ile yikanmis ve filtre edilen SEC eluati ile
toplanmistir.
Örnek 12: Anyonik Degisim Kromatografisi
rAAv- vektörü için ikinci bir anyon degisimi tutma adimi; bir Unosphere® Q reçinedeki (Biorad,
Hercules, CA) nihai bir konsantrasyon ve boyama adimi olarak gerçeklestirilmistir. Bir 373 ml
(8.9 cm çap x 6 cm yatak yüksekligi) kolonu; 0,5 M NaOH'in birkaç kolon hacmi ile sanitize
edilmis ve 20 mM NaCI + 20 mM Tris (pH = 8,0) tamponunun 7 CV'si ile dengelenmistir. SEC
bos hacim fraksiyonu ya da opsiyonel olarak viral olarak filtre edilen eluat, 309 cm/saatlik bir
hizda yüklenmistir. Kolon, 60 mM NaCFnin 10 CV'sini yikamistir. Yikama çözeltisinin iyonik
gücü; pürifikasyon adimlarinda faydalanilan çesitli filtrelerden süzülmesi ile içine katilabilen
glukanlar gibi diger süreç içi safsizliklarin herhangi biri çikarilirken reçineye bagli rAAv-1'i
tutmasi için seçilmistir. rAAV-1 vektörü, bir 130 mM NaCI'nin 6 CV'si ile kolondan
ayristirilmistir. 130 mM NaCl tuz elüsyonunun iyonik gücü; serum albumin ya da yardimci
virüs gibi herhangi bir kalinti süreç içi safsizliklari bagli kalacak iken, kolondan rAAv-1 'i
çikaracaktir.
Sekil 6, SDS-PAGE ile çesitli proses adimlari boyunca pürifikasyon derecesini karsilastirir.
Temsili bir üretim kültür hasadindan elde edilen süreç içi numuneler; bir denatüre edici /
indirgeyici %10 poliakrilamid jeIi üzerinde çalisilmis ve Sypro Orange ile boyanmistir. Tüm
hasat sonrasi numuneleri, 1X101° DRP / seritte yüklenmistir. TFF konsantrasyon adimindan
önce iki yukari akim numunesi (baslangiç durultma adimi ve anyon degisimi (“AEX”) sürekli
akis), jel üzerindeki hacim kisitlamalari yüzünden sadece 1><1O9 DRP/seritte yüklenebilir.
Beta-galaktosidaz (B-Gal), jel boyunca boyamanin hassasiyeti ve tutarliligini degerlendirmek
için 50 ng/seritte yüklenmistir. Üç AAV1 kapsid proteini (VP1, 2 ve 3) gösterilmektedir.
Örnek 13: Pürifikasyon süresince rAAV'nin Yüzde Geri Kazanimi
Sekil 7'de sunulan veriler, bir rAAV-1 vektörünün temsili bir üretim kültüründen elde edilen
saflastirma semasinin her proses adimi sonrasinda infeksiyöz rAAv partiküllerinin yüzde geri
kazanimini gösterir. Yüzde geri kazanim, yüklenen DRP'Ierin ya da bu pürifikasyon adimina
tabi tutulma toplam sayisi ile bölünen her proses adimindan geri kazanilan rAAV-1
vektörünün toplam DRP'leri bazinda hesaplanmistir. Veriler; pürifikasyon prosesindeki her
adimda, yaklasik olarak %60 ya da daha büyük geri dönüsümlerin elde edilmis oldugunu
gösterir. sayisiz deneyde, her proses adimindan geri kazanim araligi en azindan %60 ila
(baska bir deyisle, apatit kromatografi adimi) geri kazanim araligi %57'den %90'dan daha
fazlasina kadar araliktadir. Buna ek olarak, HIC adimindaki geri kazanim araligi %60 ila %80
araligindadir.
Bu bulusu kapsayan yukaridaki açiklamaya ragmen, anlasilmasini netlestirmek amaçli örnek
ve örnekleme yoluyla biraz daha detayli olarak tanimlanmistir, özel minör degisiklikler ve
modifikasyonlarin uygulanacak olmasi, teknikte uzman kisilerce anlasilirdir. Bu nedenle,
tanim ve örnekler, bulusun kapsamini sinirlayici olarak kabul edilmemelidir.
Mevcut açiklamanin tercih edilen durumlari asagida açiklanir ve durum E1 ila E42 olarak
belirtilir.
E1. Bir besleme akisindaki süreç içi safsizliklardan elde edilen rekombinant adeno iliskili
virüs (rAAV) partiküllerinin bir popülasyonunun izole edilmesi için bir yöntem olup, asagidaki
adimlari kapsar:
(a) polietilen glikol (PEG) varliginda bir apatit kromatografi ortami ile rAAV partiküllerini
içeren bir besleme akisi ile iliski kurmasi, burada rAAV partikülleri bir apatit kromatografi
ortamina baglanir; ve
(b) %3 PEG`den (agirlik/hacim) daha azini içeren bir elüsyon tamponu ile apatit kromatografi
ortamina baglanan rAAV partiküllerinin ayristirilmasi.
E2. Durum 1`deki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortami, seramik hidroksiapatittir
E3. Durum 1'deki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortami, seramik floroapatittir (CFT).
E4. Durum 1'deki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortaminin rAAV partiküllerine
spesifik baglanimi, her mililitre basina 1014 ile 1016 DNaz dirençli partikülü arasindadir
E5. Durum 1'deki yöntemdir, ayrica bir apatit kromatografi ortamindan bir anyonik
kromatografi ortamina ayristirilan besleme akisindaki rAAV partiküllerinin bir baglanma
adimini kapsar.
Eö. Durum 1'deki yöntemdir, burada adim (a)'daki rAAV partiküllerini içeren besleme akisi,
polietilen glikol (PEG) ve bir bazik tampon varliginda bir apatit kromatografi ortami ile iliski
E7. Durum 6'daki yöntemdir, burada bazik tampon; pH 7,6 ile 10 arasindadir.
E8. Durum 6'daki yöntemdir, burada bazik tampon, pH 8,0 ile 10,0 arasindadir.
E9. Durum 6'daki yöntemdir, burada bazik tampon, pH 9,0 ile 10,0 arasindadir.
E10. Durum 6'daki yöntemdir, burada bazik tampon, borat içerir.
E11. Durum 1'deki yöntemdir, burada PEG, her mol basina yaklasik gram
ile her mol basina yaklasik gram arasinda olan ortalama molekül
agirligina sahiptir.
E12. Durum 11'deki yöntemdir, burada PEG, her mol basina yaklasik gram
olan ortalama molekül agirligina sahiptir.
E13. Durum 1`deki yöntemdir, burada adim (a)2daki rAAV partiküllerini içeren besleme akisi,
yaklasik %3 (w/v) ile yaklasik %10 (w/v) arasindaki PEG varliginda apatit kromatografi
ortami ile iliski kurar.
E14. Durum 131teki yöntemdir, burada besleme akisi, yaklasik %5 (w/v) PEGBOOO varliginda
apatit kromatografi ortami ile iliski kurar.
E15. Durum 13'teki yöntemdir, burada besleme akisi, yaklasik %10 (w/v) PEGBOOO
varliginda apatit kromatografi ortami ile iliski kurar.
E16. Durum 1'deki yöntemdir, ayrica besleme akisinin apatit kromatografi ortami ile iliski
kurmasindan sonra ancak rAAV partiküllerinin apatit kromatografi ortamindan
ayristirilmasindan önce apatit kromatografi ortaminin yikama tamponu ile yikanmasini
adimini içerir.
E17. Durum 16'daki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortami, yaklasik %7.5 (w/v) PEG
içeren bir yikama tamponu ve/veya yaklasik %5 (w/v) PEG içeren yikama tamponu ile bir
veya birkaç kez yikanir.
E18. Durum 17”deki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortami ayrica, yaklasik %3'ten
(w/v) az PEG içeren yikama tamponu ve/veya PEG içermeyen yikama tamponu ile yikanir.
E19. Durum 167daki yöntemdir, burada yikama tamponu, borat, N-2-Hidroksietilpiperazin-N'-
2-etansülfonik asit (HEPES) ve Tris-HCI'den olusan gruptan seçilen bir tamponu içerir.
E20. Durum 16'daki yöntemdir, burada yikama tamponu, bazik pH degerine sahiptir.
E21. Durum 20'deki yöntemdir, burada yikama tamponu, yaklasik 8,0 ile yaklasik 10,0
arasinda olan bir pH degerinde borat içerir.
E22. Durum 21'deki yöntemdir, burada yikama tamponu, yaklasik 8,0 pH degerinde borat
E23. Durum 217deki yöntemdir, burada yikama tamponu, yaklasik 9,0 pH degerinde borat
E24. Durum 21'deki yöntemdir, burada yikama tamponu, yaklasik 10,0 pH degerinde borat
fosfat içerir.
E26. Durum 20'deki yöntemdir, burada yikama tamponu ayrica, 50 ile 250 mM arasinda
NaCl içerir.
E27. Durum 1ideki yöntemdir, burada apatit kromatografi ortamina bagli rAAV partikülleri,
PEG yoklugunda veya düsük konsantrasyonlarda PEG içeren elüsyon tamponu ile ayristirilir.
E28. Durum 27'deki yöntemdir, burada elüsyon tamponu, nötral pH degerinde borat, N-2-
Hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve Tris-HCl'den olusan gruptan seçilen
birtamponu içerir.
E29. Durum 27'deki yöntemdir, burada elüsyon tamponu, yaklasik %3'ten (w/v) az PEGGOOO
E30. Durum 29'daki yöntemdir, burada elüsyon tamponu ayrica 100 mM'den az fosfat içerir.
E31. Durum 30ldaki yöntemdir, burada elüsyon tamponu ayrica 50 mM fosfat içerir.
E32. Durum 31'deki yöntemdir, burada elüsyon tamponu ayrica 50 ile 250 mM arasinda
NaCI içerir.
E33. Asagidaki adimlari içeren, bir besleme akisinda süreç içi safsizliklardan rekombinant
adeno-iliskili virüs (rAAV) partikülleri popülasyonunun izole edilmesine yönelik bir yöntemdir:
(a) rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisinin, yüksek tuz tamponunda hidrofobik
etkilesim kromatografisi (HIC) ile temas kurmasi, burada rAAV partikülleri ve süreç içi
safsizliklar, HlC ortamina baglanir; ve
(b) orta tuz tamponu ile HIC ortamina bagli rAAV partiküllerinin ayristirilmasi.
E34. Durum 33`teki yöntemdir, burada HIC ortami, Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyI
reçineden olusan
gruptan seçilir.
E35. Durum 33'teki yöntemdir, burada yüksek tuz tamponu, yaklasik 0.5 M ile yaklasik 2.0 M
arasinda sitrat içerir.
E36. Durum 35lteki yöntemdir, burada yüksek tuz tamponu ayrica, yaklasik 1 ile yaklasik 100
mM arasinda fosfat içerir.
E37. Durum 33'teki yöntemdir, burada orta tuz tamponu, 0.5 M”den az sitrat içerir.
E38. Durum 37'deki yöntemdir, burada orta tuz tamponu ayrica, yaklasik 1 ile yaklasik 100
mM arasinda fosfat içerir.
E39. Durum 37'deki yöntemdir, burada orta tuz tamponu, 0.2 M ila 0.5 M sitrat içerir.
E40. Durum 397daki yöntemdir, burada bos kapsidler, kismen denatüre kapsidler, daha az
Infeksiyöz kapsid materyali ve/veya kismen tam kapsidler Içeren rAAV partiküllerinin bir
popülasyonu, orta tuz tamponu ile elüsyon sonrasinda HIC ortamina baglanir.
E41. Durum 1 veya durum 33'teki yöntemdir, burada rAAV partikülleri, AAV-1, AAV-2, AAV-
14, AAV-15 ve AAV-16'dan olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid serotipinden elde dilen bir
AAV kapsid proteinini içerir.
E42. Durum 41”deki yöntemdir, burada rAAV partikülleri, AAV-1, AAV-4, AAV-5 ve AAV-
8'den olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid serotipinden elde edilen bir AAV kapsid
proteinini içerir.
Serit Numune
E' U'et" v:t..":5' sa-ga'a"
CFT Ilerleme Analizi
Seruma karsi serumsuz besleme akisindaki PEG'in etkisi
2 ~ 9-. ` . PEC
a', 5090 mes-we( run >
%!“ -g-SEFUmSU: pEGIÜK
0% 1 1 . .4 .V «o-w-ox-
mL CFTLImL reçine
Serum PEG YOK ~ 2 ?OK
Serumsu: PEG YOK ~ 6 TOK
Serum +PEG >150 71%
Serumsuz +PEG >150 691”n
Tutma Kolonu - 08:055
P'Odlyi'kârlna' '4 ' r-'H `
- - - - ileîkenlik
Avristirma :: r.
Yikama ll Yikamall
0 20 40 60 80
Hacim (L)
A Fraksiyon CFT ' OHT
P04 1% 2%
Elüsyon 71% 65%
Kütle Dengesi 72% _38%
MW 1. .2
MW 7 Mark '2
17 CFTeIL'iswnu
27 CHTeIUsyonu
CFT elüsvonuiTEB D???
CHT el'usyonuijî E9 DRPji
Ad5 ij3E7 DHGji
Ad5 ij
M avi r.-1`i.^."' ye b a k
Tutma yükü MEB DRP::
200 kDa
97.4 kDa
88.3 kDa
554 kDa
.5 kDa
3' 0 kDa
21 .b k'Ja
1E9 1E10/lane
3x “E x“
qqi-mi-uictin›
4 " HÜA
eiiigoueN
Proses adimi
Claims (10)
1. Bir besleme akisinda süreç içi safsizliklardan rekombinant adeno-iliskili virüs (rAAV) partikülleri popülasyonunun izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: (a) rAAV partiküllerini içeren bir besleme akisinin, yüksek tuz tamponunda hidrofobik etkilesim kromatografisi (HIC) ortami ile temas kurmasi, burada yüksek tuz tamponu, 0.5M ile 2.0M arasinda sitrat içerir, rAAV partikülleri ve süreç içi safsizliklar, HIC ortamina baglanir; ve (b) orta tuz tamponu ile HIC ortamina bagli rAAV partiküllerinin ayristirilmasi, burada orta tuz tamponu, 0.5M'den az sitrat içerir.
2. istem 1'in yöntemi olup, özelligi yüksek tuz tamponunun, 0.5M ile 2.0M arasinda sodyum sitrat içermesidir.
3. Istem 1 veya 2'nin yöntemi olup, özelligi yüksek tuz tamponunun, yaklasik 0.5M,
4. Istemler 1 ila 3'ten herhangi birinin yöntemi olup, özelligi yüksek tuz tamponunun, 1M sodyum sitrat (pH 7.0) içermesidir.
5. Istemler 1 ila 4lten herhangi birinin yöntemi olup, özelligi HIC ortaminin, Tosoh Butyl Has(butyl) reçineden olusan gruptan seçilmesidir.
6. Istemler 1 ila 5'ten herhangi birinin yöntemi olupi özelligi yüksek tuz tamponunun ayrica, yaklasik 1 ile yaklasik 100 mM arasinda fosfat içermesidir.
7. Istemler 1 ila 6'dan herhangi birinin yöntemi olup, özelligi orta tuz tamponunun,
8. Istemler 1 ila 7'den herhangi birinin yöntemi olup, özelligi orta tuz tamponunun ayrica, yaklasik 1 ile yaklasik 100 mM arasinda fosfat içermesidir.
9. Istemler 1 ila 8'den herhangi birinin yöntemi olup, özelligi bos kapsidler, kismen denatüre kapsidler, daha az infeksiyöz kapsid materyali ve/veya kismen tam kapsidler içeren rAAV partikülleri popülasyonunun, orta tuz tamponu ile elüsyon sonrasinda HIC ortamina baglanmasidir.
10. Istemler 1 ila 9'dan herhangi birinin yöntemi olup, özelligi rAAV partiküllerinin, AAV- AAV-5 ve AAV-8'den olusan gruptan seçilen bir AAV kapsid proteininden elde edilen bir AAV
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18760109P | 2009-06-16 | 2009-06-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201815937T4 true TR201815937T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=43356746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/15937T TR201815937T4 (tr) | 2009-06-16 | 2010-06-16 | Rekombinant AAV vektörlerinin purifikasyonu için geliştirilen yöntemler. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10017746B2 (tr) |
| EP (4) | EP3067417B1 (tr) |
| JP (3) | JP5956331B2 (tr) |
| KR (2) | KR20180000341A (tr) |
| CN (2) | CN102803478B (tr) |
| BR (1) | BRPI1015176B1 (tr) |
| CA (2) | CA3077531C (tr) |
| CY (3) | CY1117936T1 (tr) |
| DK (2) | DK3444335T3 (tr) |
| ES (3) | ES2881050T3 (tr) |
| HK (1) | HK1165830A1 (tr) |
| HR (2) | HRP20181743T1 (tr) |
| HU (3) | HUE054940T2 (tr) |
| IL (3) | IL216960A (tr) |
| LT (2) | LT3444335T (tr) |
| MX (2) | MX2011013613A (tr) |
| PL (2) | PL2443233T3 (tr) |
| PT (3) | PT2443233T (tr) |
| RS (2) | RS62086B1 (tr) |
| RU (1) | RU2016119739A (tr) |
| SG (2) | SG10201403290SA (tr) |
| SI (2) | SI3067417T1 (tr) |
| TR (1) | TR201815937T4 (tr) |
| WO (1) | WO2010148143A1 (tr) |
Families Citing this family (96)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2400235T3 (es) | 2006-04-28 | 2013-04-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de producción escalable de AAV |
| CA3077531C (en) | 2009-06-16 | 2022-09-20 | Genzyme Corporation | Improved methods for purification of recombinant aav vectors |
| CA2787009C (en) | 2010-01-15 | 2018-04-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Surface neutralization of apatite |
| US8895707B2 (en) | 2010-08-18 | 2014-11-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
| US9592540B2 (en) | 2011-02-02 | 2017-03-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite surface neutralization with alkali solutions |
| EP3318571B1 (en) | 2011-03-16 | 2021-02-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Ion exchange chromatography with improved selectivity for the separation of polypeptide monomers, aggregates and fragments by modulation of the mobile phase |
| EP2700399B1 (en) * | 2011-04-18 | 2017-05-31 | National Center of Neurology and Psychiatry | Drug delivery particles and method for producing same |
| ES2558168T3 (es) | 2011-09-08 | 2016-02-02 | Uniqure Ip B.V. | Eliminación de virus contaminantes en preparaciones AVV |
| US9815695B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-11-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | In situ restoration of apatite-based chromatography resins |
| EP2854980B1 (en) * | 2012-05-31 | 2017-11-01 | Agency For Science, Technology And Research | Selective binding of biological targets to solid phase ureides |
| GB2525562B (en) * | 2013-02-15 | 2017-10-11 | T Gjerde Douglas | Methods for purification of biological cells |
| US11332719B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-05-17 | The Broad Institute, Inc. | Recombinant virus and preparations thereof |
| KR102200278B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2021-01-07 | 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 | 무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 확대가능한 제작 방법 |
| EP2986310B1 (en) | 2013-04-17 | 2020-08-05 | Genzyme Corporation | Compositions for treating and preventing macular degeneration |
| KR102069561B1 (ko) * | 2013-07-11 | 2020-01-23 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 외피 비보유 바이러스의 제조 방법 |
| TWI687225B (zh) | 2014-02-06 | 2020-03-11 | 美商健臻公司 | 用於治療及預防黃斑部病變的組成物及方法 |
| IL292951B1 (en) | 2014-05-02 | 2024-06-01 | Genzyme Corp | AAV vectors for gene therapy in the central nervous system and retina |
| US10577627B2 (en) | 2014-06-09 | 2020-03-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
| EP3157551B1 (en) | 2014-06-23 | 2023-02-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite in-situ restoration |
| CN105392569B (zh) | 2014-06-23 | 2019-08-20 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 磷灰石预处理 |
| WO2016006658A1 (ja) | 2014-07-10 | 2016-01-14 | タカラバイオ株式会社 | 非エンベロープウイルス粒子の製造方法 |
| CN104232687A (zh) * | 2014-09-17 | 2014-12-24 | 许瑞安 | 一种重组腺相关病毒rAAV载体的分离纯化方法 |
| CA2966620A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease |
| US10597660B2 (en) | 2014-11-14 | 2020-03-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
| SG11201703419UA (en) | 2014-11-14 | 2017-05-30 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
| US11697825B2 (en) | 2014-12-12 | 2023-07-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scAAV |
| EP3243904A4 (en) | 2015-01-09 | 2018-06-27 | Takara Bio Inc. | Method for producing non-enveloped viral particles |
| US10429288B2 (en) | 2015-01-20 | 2019-10-01 | Genzyme Corporation | Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles |
| EP3054007A1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-08-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant adeno-associated virus particle purification comprising an immuno-affinity purification step |
| EP3054006A1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-08-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography |
| PL3256594T3 (pl) | 2015-02-10 | 2022-02-14 | Genzyme Corporation | Ulepszone dostarczanie cząstek wirusa do prążkowia i kory |
| TWI707951B (zh) | 2015-04-08 | 2020-10-21 | 美商健臻公司 | 過大腺相關載體之製造 |
| CN105907729B (zh) * | 2015-05-05 | 2019-08-16 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种制备人***瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 |
| US20170067028A1 (en) * | 2015-05-15 | 2017-03-09 | Douglas J. Ballon | Radiolabeling of adeno associated virus |
| JP6985250B2 (ja) | 2015-05-16 | 2021-12-22 | ジェンザイム・コーポレーション | 深部イントロン突然変異の遺伝子編集 |
| US9663766B2 (en) | 2015-07-24 | 2017-05-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for purifying adenovirus vectors |
| US11098286B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
| WO2017100674A1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aav1 |
| US11028372B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
| ES2934848T3 (es) | 2015-12-11 | 2023-02-27 | Univ Pennsylvania | Método de purificación escalable para AAV8 |
| CN108603199A (zh) | 2015-12-15 | 2018-09-28 | 建新公司 | 用于治疗粘脂贮积症ii型的腺伴随病毒载体 |
| WO2017112948A1 (en) * | 2015-12-24 | 2017-06-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Improved aav production using suspension adapted cells |
| DK3436593T3 (da) | 2016-03-28 | 2023-02-20 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc | Fremgangsmåder til varmeinaktivering af adenovirus |
| SG11201808354PA (en) * | 2016-03-31 | 2018-10-30 | Spark Therapeutics Inc | Column-based fully scalable raav manufacturing process |
| WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
| EP3448874A4 (en) | 2016-04-29 | 2020-04-22 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE |
| GB201608046D0 (en) | 2016-05-09 | 2016-06-22 | Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The | Treatment of complement-mediated disorders |
| KR102392236B1 (ko) | 2016-05-18 | 2022-05-03 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | 조절성 폴리뉴클레오티드 |
| SG11201809643UA (en) | 2016-05-18 | 2018-12-28 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating huntington's disease |
| GB201612248D0 (en) | 2016-07-14 | 2016-08-31 | Puridify Ltd | New process |
| MX2019001938A (es) | 2016-08-15 | 2019-07-04 | Genzyme Corp | Metodos para detectar aav. |
| MX2019000935A (es) | 2016-08-16 | 2019-07-04 | Regeneron Pharma | Metodos para cuantificar anticuerpos individuales de una mezcla. |
| CA3034527A1 (en) | 2016-08-23 | 2018-03-01 | Emmanuel John Simons | Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject |
| US11298041B2 (en) | 2016-08-30 | 2022-04-12 | The Regents Of The University Of California | Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same |
| US11795473B2 (en) | 2016-10-14 | 2023-10-24 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | Use of tonicifying agents to enhance recombinant adeno-associated virus yield |
| CN109923411B (zh) | 2016-10-25 | 2022-05-31 | 里珍纳龙药品有限公司 | 用于色谱数据分析的方法和*** |
| CA3040288A1 (en) * | 2016-11-04 | 2018-07-12 | Baxalta Incorporated | Adeno-associated virus purification methods |
| US10626376B2 (en) * | 2016-11-14 | 2020-04-21 | St. Jude Children's Research Hospital | Method for isolating and purifying adeno-associated virus particles using salt |
| JP7142643B2 (ja) | 2017-03-22 | 2022-09-27 | ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド | Ｈｄａｃ阻害剤またはｒｅｐタンパク質を伴う細胞培養方法 |
| WO2018204803A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating huntington's disease |
| CN110913866A (zh) | 2017-05-05 | 2020-03-24 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法 |
| JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
| MX2020000216A (es) * | 2017-06-30 | 2020-09-03 | Spark Therapeutics Inc | Metodos de purificacion por columna de vectores aav. |
| WO2019018342A1 (en) | 2017-07-17 | 2019-01-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM |
| JP7221275B2 (ja) | 2017-08-03 | 2023-02-13 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ａａｖを送達するための組成物および方法 |
| WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
| JP7502991B2 (ja) | 2017-10-16 | 2024-06-19 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療 |
| JP7299896B2 (ja) * | 2017-12-29 | 2023-06-28 | 武田薬品工業株式会社 | アデノ随伴ウイルス精製方法 |
| US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
| EP3755795A4 (en) | 2018-02-19 | 2022-07-20 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF |
| WO2019212921A1 (en) * | 2018-04-29 | 2019-11-07 | Regenxbio Inc. | Scalable clarification process for recombinant aav production |
| TW202005694A (zh) | 2018-07-02 | 2020-02-01 | 美商里珍納龍藥品有限公司 | 自混合物製備多肽之系統及方法 |
| CN112770812A (zh) * | 2018-07-24 | 2021-05-07 | 沃雅戈治疗公司 | 产生基因治疗制剂的***和方法 |
| JP7070238B2 (ja) * | 2018-08-22 | 2022-05-18 | 株式会社島津製作所 | 液体クロマトグラフ分析装置、移動相供給装置、液体クロマトグラフ分析方法および移動相供給方法 |
| CA3112824A1 (en) * | 2018-09-21 | 2020-03-26 | Nightstarx Limited | Compositions and methods for manufacturing gene therapy vectors |
| AU2019357039A1 (en) | 2018-10-12 | 2021-06-03 | Genzyme Corporation | Generation of improved human pah for treatment of severe PKU by liver-directed gene replacement therapy |
| TW202039854A (zh) | 2018-11-16 | 2020-11-01 | 美商編碼製藥公司 | 治療威爾遜氏病的組合物和方法 |
| JP2022530126A (ja) | 2019-04-23 | 2022-06-27 | アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） | 新規アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）バリアント及び遺伝子治療のためのその使用 |
| US10653731B1 (en) | 2019-07-15 | 2020-05-19 | Vigene Biosciences Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency |
| US10557149B1 (en) | 2019-07-15 | 2020-02-11 | Vigene Biosciences, Inc. | Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus |
| US10801042B1 (en) | 2019-07-15 | 2020-10-13 | Vigene Biosciences, Inc. | Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus |
| TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
| JP2023513004A (ja) | 2020-01-29 | 2023-03-30 | ジェンザイム・コーポレーション | 眼科遺伝子療法のための改変されたアデノ随伴ウイルスカプシドタンパク質およびその使用方法 |
| IL295747A (en) | 2020-02-21 | 2022-10-01 | Akouos Inc | Preparations and methods for the treatment of hearing impairment that is not related to age in humans |
| EP3919613A1 (en) * | 2020-06-05 | 2021-12-08 | Bia Separations D.O.O. | Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna |
| WO2021255835A1 (ja) * | 2020-06-16 | 2021-12-23 | ＨＯＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｓｕｒｇｉｃａｌ株式会社 | アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法 |
| CN111808828B (zh) * | 2020-09-14 | 2020-11-17 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 腺相关病毒的分离纯化方法 |
| EP4222251A1 (en) | 2020-10-01 | 2023-08-09 | Genzyme Corporation | Human pah expression cassette for treatment of pku by liver-directed gene replacement therapy |
| US20240150726A1 (en) | 2021-03-09 | 2024-05-09 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for Producing Recombinant AAV9 Virion |
| JP2024511409A (ja) | 2021-03-22 | 2024-03-13 | ジェンザイム・コーポレーション | 空および完全ａａｖキャプシドのサイズ排除クロマトグラフィー解析 |
| US20230405151A1 (en) | 2022-04-12 | 2023-12-21 | Genzyme Corporation | Use of irak4 modulators for gene therapy |
| TW202405430A (zh) | 2022-04-12 | 2024-02-01 | 美商健臻公司 | 對於基因療法藥劑的先天免疫原性之樹突細胞試驗 |
| WO2023201274A1 (en) | 2022-04-12 | 2023-10-19 | Genzyme Corporation | Use of an irak4 modulator for gene therapy |
| US20230346977A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-11-02 | Universitat Autònoma De Barcelona | Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein |
| US20230398192A1 (en) | 2022-05-16 | 2023-12-14 | Genzyme Corporation | Methods of treating metachromatic leukodystrophy |
| WO2023240062A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Melanopsin variants for vision restoration |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6143548A (en) | 1995-08-30 | 2000-11-07 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV) |
| DK1009808T3 (da) | 1997-09-05 | 2013-01-21 | Genzyme Corp | Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer |
| US6989264B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-01-24 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| US6723551B2 (en) | 2001-11-09 | 2004-04-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of adeno-associated virus in insect cells |
| US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
| WO2006074664A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | Maxygen Holdings Ltd. | Method for purification of factor vii |
| SG179488A1 (en) * | 2007-03-14 | 2012-04-27 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | Virus like particle purification |
| GB2467320A (en) | 2009-01-28 | 2010-08-04 | Surrey Nanosystems Ltd | Two methods of forming carbon nano-materials using filtered acetylene gas |
| CA3077531C (en) | 2009-06-16 | 2022-09-20 | Genzyme Corporation | Improved methods for purification of recombinant aav vectors |
-
2010
- 2010-06-16 CA CA3077531A patent/CA3077531C/en active Active
- 2010-06-16 RU RU2016119739A patent/RU2016119739A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-06-16 DK DK18184138.8T patent/DK3444335T3/da active
- 2010-06-16 EP EP16166278.8A patent/EP3067417B1/en active Active
- 2010-06-16 SI SI201031783T patent/SI3067417T1/sl unknown
- 2010-06-16 KR KR1020177036434A patent/KR20180000341A/ko active IP Right Grant
- 2010-06-16 LT LTEP18184138.8T patent/LT3444335T/lt unknown
- 2010-06-16 ES ES18184138T patent/ES2881050T3/es active Active
- 2010-06-16 EP EP21167739.8A patent/EP3919614A1/en active Pending
- 2010-06-16 PT PT107901555T patent/PT2443233T/pt unknown
- 2010-06-16 MX MX2011013613A patent/MX2011013613A/es active IP Right Grant
- 2010-06-16 BR BRPI1015176-1A patent/BRPI1015176B1/pt active IP Right Grant
- 2010-06-16 PL PL10790155T patent/PL2443233T3/pl unknown
- 2010-06-16 LT LTEP16166278.8T patent/LT3067417T/lt unknown
- 2010-06-16 SG SG10201403290SA patent/SG10201403290SA/en unknown
- 2010-06-16 SG SG2011088259A patent/SG176283A1/en unknown
- 2010-06-16 RS RS20210884A patent/RS62086B1/sr unknown
- 2010-06-16 MX MX2015002859A patent/MX352986B/es unknown
- 2010-06-16 PT PT181841388T patent/PT3444335T/pt unknown
- 2010-06-16 ES ES16166278.8T patent/ES2693194T3/es active Active
- 2010-06-16 WO PCT/US2010/038897 patent/WO2010148143A1/en active Application Filing
- 2010-06-16 HU HUE18184138A patent/HUE054940T2/hu unknown
- 2010-06-16 HU HUE10790155A patent/HUE028341T2/en unknown
- 2010-06-16 RS RS20181266A patent/RS57784B1/sr unknown
- 2010-06-16 EP EP10790155.5A patent/EP2443233B1/en active Active
- 2010-06-16 TR TR2018/15937T patent/TR201815937T4/tr unknown
- 2010-06-16 HU HUE16166278A patent/HUE040636T2/hu unknown
- 2010-06-16 PL PL16166278T patent/PL3067417T3/pl unknown
- 2010-06-16 CN CN201080027012.3A patent/CN102803478B/zh active Active
- 2010-06-16 ES ES10790155.5T patent/ES2588990T3/es active Active
- 2010-06-16 DK DK16166278.8T patent/DK3067417T3/en active
- 2010-06-16 EP EP18184138.8A patent/EP3444335B1/en active Active
- 2010-06-16 CA CA2764176A patent/CA2764176C/en active Active
- 2010-06-16 JP JP2012516278A patent/JP5956331B2/ja active Active
- 2010-06-16 SI SI201032079T patent/SI3444335T1/sl unknown
- 2010-06-16 CN CN201610205860.8A patent/CN105861454B/zh active Active
- 2010-06-16 PT PT16166278T patent/PT3067417T/pt unknown
- 2010-06-16 KR KR1020117029956A patent/KR101812813B1/ko active IP Right Grant
-
2011
- 2011-12-13 IL IL216960A patent/IL216960A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-12-16 US US13/328,306 patent/US10017746B2/en active Active
-
2012
- 2012-07-04 HK HK12106494.4A patent/HK1165830A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-06-16 JP JP2016119498A patent/JP6496684B2/ja active Active
- 2016-08-29 CY CY20161100843T patent/CY1117936T1/el unknown
-
2017
- 2017-06-27 IL IL253205A patent/IL253205B/en not_active IP Right Cessation
-
2018
- 2018-06-12 US US16/006,210 patent/US10696952B2/en active Active
- 2018-06-21 IL IL260215A patent/IL260215A/en unknown
- 2018-10-23 HR HRP20181743TT patent/HRP20181743T1/hr unknown
- 2018-10-25 CY CY20181101103T patent/CY1121442T1/el unknown
-
2019
- 2019-03-11 JP JP2019043324A patent/JP6788056B2/ja active Active
-
2020
- 2020-09-28 US US17/035,480 patent/US11840710B2/en active Active
-
2021
- 2021-07-13 HR HRP20211120TT patent/HRP20211120T1/hr unknown
- 2021-07-14 CY CY20211100639T patent/CY1124323T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201815937T4 (tr) | Rekombinant AAV vektörlerinin purifikasyonu için geliştirilen yöntemler. | |
| AU758708B2 (en) | Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant AAV vectors | |
| AU2019285186A1 (en) | Anion exchange chromatography for recombinant AAV production | |
| US20180135024A1 (en) | Method for isolating and purifying adeno-associated virus particles using salt | |
| US20240141377A1 (en) | Controlled expression of viral proteins | |
| KR20230011935A (ko) | 아데노 연관 바이러스 입자 또는 아데노바이러스를 정제하기 위한 방법 및 조성물 | |
| RU2588387C2 (ru) | Улучшенные способы очистки векторов на основе рекомбинантного aav |