BRPI1015176B1

BRPI1015176B1 - método para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante (raav) de impurezas de processo em uma corrente de alimentação

Info

Publication number: BRPI1015176B1
Application number: BRPI1015176-1A
Authority: BR
Inventors: A Thorne Barbara; Nichols Gina; Mclean Quigley Sheldon Paulene; S Gagnon Peter
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2019-10-29
Also published as: US20210139860A1; EP3444335A1; KR20120047213A; EP2443233A4; SI3067417T1; PL2443233T3; RS57784B1; LT3067417T; IL253205B; CA2764176C; ES2588990T3; ES2881050T3; EP3067417A2; EP3919614A1; JP5956331B2; CA3077531A1; PT2443233T; US20150024467A1; LT3444335T; CN102803478A

Abstract

método para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante (raav) de impurezas de processo em uma corrente de alimentação a presente invenção refere-se a métodos para a purificação de vetores virais adenoassociados recombinantes (raav) que podem ser usados para transferência genética e especificamente para terapia ou vacinação genética. vetores aav recombinantes da invenção são substancialmente livres de impurezas no processo, incluindo componentes de produção como ácidos nucleicos celulares, proteínas celulares, vírus auxiliar e componentes de meios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA ISOLAR UMA POPULAÇÃO DE PARTÍCULAS DE VÍRUS ADENOASSOCIADO RECOMBINANTE (RAAV) DE IMPUREZAS DE PROCESSO EM UMA CORRENTE DE ALIMENTAÇÃO”.

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados [0001] Esse pedido de patente reivindica benefício do pedido de patente provisório US n° de série 61/187.601, depositado em 16 de junho de 2009, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Campo da Invenção [0002] A presente invenção, em geral, refere-se ao campo de purificação de vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) que podem ser usados para transferência genética e especificamente para terapia ou vacinação genética. Mais especificamente, ela se refere a métodos para purificação de vetores rAAV recombinantes que são substancialmente livres de componentes de produção de processo, como ácidos nucleicos celulares, proteínas celulares, vírus auxiliar e componentes de meios.

Antecedentes da Invenção [0003] Vírus adenoassociados (AAV) têm características únicas que os tornam atraentes como vetores para terapia de gene e vacinas genéticas. Infecção por AAV de células em cultura é não citopática, e infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa, assintomática e não implicada na etiologia de qualquer doença humana. Além disso, AAV infecta uma ampla faixa de tipos de células, incluindo muitas células mamíferas, permitindo a possibilidade de alcançar muitos diferentes tecidos in vivo. AAV infecta lentamente células que se dividem e que não se dividem e pode persistir essencialmente pelo tempo de vida dessas células como um epissomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). Cópias integradas de vetor rAAV em órgãos como fígado ou músculo são muito raras. Eficiente transferência genética a longo prazo tem sido relatada em uma série de tipos celulares incluindo olho, SNC e músculo. Veja, por exemplo, X. Xiao et al., J. Virol 70(11):8098-8108 (1996); R.R. Ali et al., Hum. Mol. Genet. 5(5):591-94

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2/64 (1996). Estudos clínicos atuais têm se concentrado grandemente no uso de vetores rAAV sorotipo 2, porém uma série de relatórios tem demonstrado que outros sorotipos de AAV, incluindo rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 e rAAV-8, têm única biodistribuição in vivo que os torna atraentes sorotipos virais para teste em ensaios clínicos.

[0004] Vírus adenoassociado (AAV) é um parvovírus de replicação deficiente, cujo genoma de DNA de filamento único tem cerca de 4,7 kb de comprimento incluindo 145 repetições terminais invertidas de nucleotídeos (ITRs). A sequência de nucleotídeo do genoma do AAV sorotipo 2 (AAV2) está apresentada em Srivastara et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983) como corrigido por Ruffing et al., J. Gen. ViroL, 75:33853392 (1994). Sequências de ação-c/s que direcionam replicação de DNA viral (rep.), encapsidação/empacotamento e integração de cromossomo de célula hospedeira estão contidas nas ITRs. Três promotores de AAV, p5, p19 e p40 (nomeados para suas localizações map relativas), acionam a expressão dos dois quadros de leitura aberta internos de AAV que codificam genes rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e p19), acoplados com a divisão diferencial do único íntron AAV nos nucleotídeos 2107 e 2227, resultam na produção de quatro proteínas rep (rep78, rep68, rep52 e rep40) do gene rep. Proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são em última análise responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. Sítios de início translacional de não consenso e de divisão alternativos são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação de consenso está localizado na posição map 95 do genoma de AAV. O ciclo de vida e genética de AAV estão revistos em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0005] Partículas de AAV compreendem um capsídeo proteináceo com três proteínas do capsídeo, VP1, VP2 e VP3, que encerram um genoma de DNA de único filamento linear de ~4,6 kb. Partículas individuais empacotam apenas um filamento da molécula de DNA, porém

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3/64 esse pode ser ou o filamento mais ou menos. Partículas contendo cada filamento são infecciosas, e replicação ocorre por conversão do filamento único de infecção parental a uma forma dúplex, e subsequente amplificação, a partir da qual filamentos únicos descendentes são deslocados e empacotados em capsídeos. Cópias de filamento único ou dúplex de genomas de AAV (algumas vezes referido como DNA proviral ou provírus) podem ser inseridas em plasmídeos ou fagemídeos bacterianos, e transfectadas para células infectadas com adenovírus. Veja Carter, Handbook of Parvoviruses, Vol. I, pp. 169-228 (1989), e Berns, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (1990) para uma revisão geral de AAV.

[0006] Produção de vetor rAAV em geral requer quatro elementos comuns: 1) uma célula hospedeira permissiva para replicação; 2) função de vírus auxiliar que pode ser fornecida por vírus auxiliar adequados como adenovírus ou vírus herpes, ou alternativamente por construtos de plasmídeo contendo as funções de auxiliar adenoviral mínimas; 3) um construto rep-cap de trans-empacotamento; e 4) um meio de produção adequado.

[0007] Partículas de AAV recombinante podem ser produzidas a partir de empacotamento de lisados celulares. Veja, por exemplo, Chirico e Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41. Entretanto, o lisado celular contém diversos componentes celulares como DNA de célula hospedeira, proteínas de célula hospedeira, componentes de meios e ou vírus auxiliar ou DNA de plasmídeo do vírus auxiliar que deve ser separado do vetor rAAV antes de estar adequado para uso in vivo. Recentes avanços em produção de rAAV incluem o uso de processos de suspensão celular não-aderente em biorreatores de tanque agitado e condições de produção, pelo que vetores rAAV são liberados nos meios ou sobrenadante reduzindo a concentração de componentes celulares hospedeiros presentes no material de produção, porém ainda contendo quantidades apreciáveis de impurezas no processo. Veja Patente US n° 6.566.118 e PCT WO 99/11764. Portanto, partículas de rAAV podem ser coletadas dos meios e/ou lisado celular e adicionalmente purificadas.

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4/64 [0008] Métodos incluindo centrifugação por gradiente de densidade empregados para a purificação de vetores rAAV e em particular rAAV-2 não são passíveis de extensão. Relatórios recentes quanto a vetores rAAV-2 descreveram métodos de purificação empregando cromatografia de troca iônica incluindo cromatografia de troca iônica de oposição (incluindo cromatografia de cátion e ânion). Veja, por exemplo, a Patente US n° 6.566.118 e PCT WO 99/11764 que descreve métodos para uso de uma combinação de cromatografia de troca iônica de oposição para purificar vetores virais adenoassociados recombinantes de uma sobrenadante de cultura e/ou um lisado celular. Aperfeiçoamentos adicionais em preparações de estoque de rAAV incluem o uso de tratamento com desoxicolato do lisado celular, separação por gradiente de iodixanol antes da cromatografia de afinidade, que resultaram em rAAV2 de título alto (Clark et al., Hum. Mol. Genet. 10(6):1031-39 (1999); Zolotukhin et al., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)). 0’Riordan et al (0’Riordan et al., J. Gene Med. 2:444-454 (2000); Patente US n° 7.015.026) também relataram processo de purificação cromatográfica escalável para vetores virais adenoassociados recombinantes e conforme particularmente exemplificado, vetores rAAV-2, usando cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de afinidade cellufine sulfate e cromatografia com quelato de zinco.

[0009] Dados recentes indicam que sorotipos de capsídeo de rAAV como rAAV-1, 4, 5 e 8 se ligam fracamente a resinas aniônicas ou como estoque de vírus purificado ou na presença de impurezas de produção no processo como DNA de célula hospedeira, proteínas de célula hospedeira, albumina do soro, componentes de meios e componentes de vírus auxiliar. Em Consequência, a purificação desses sorotipos de capsídeo tipicamente envolve cromatografia de troca iônica em combinação com outros métodos de purificação, como centrifugação por gradiente de densidade de iodixinol. Veja, por exemplo, Zolotukhin et al., Methods 28(2):158-167 (2002) e Kaludov et al., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002); e Publicação de Patente US n° 2004/0110266 A1.

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Entretanto, esses métodos não são prontamente escaláveis para processos de escala comercial.

[00010] Em conformidade, no desenvolvimento de vetores AAV recombinante, como aqueles para uso em terapia de gene e vacinas genéticas, existe uma necessidade de métodos de purificação de vetores rAAV a partir de componentes de produção no processo incluindo vírus auxiliar, assim como proteínas do vírus auxiliar, proteínas celulares, DNA da célula hospedeira e componentes de meios presentes no estoque de produção de rAAV. Tais métodos devem ser eficazmente empregados em uma escala que é adequada para a aplicação prática de técnicas de terapia de gene. Além disso, existe uma necessidade de desenvolvimento de processos de purificação para vetores rAAV que são escaláveis para proporcionar estoques comerciais altamente purificados de título alto úteis para terapia de gene de rAAV e vacinas de gene. Mais particularmente, existe uma necessidade de desenvolver processos de purificação para vetores rAAV que se ligam fracamente a resinas cromatográficas e em particular resinas aniônicas.

[00011] As descrições de todas as publicações, pedidos de patente e patentes citadas nesse relatório descritivo são aqui incorporadas por referência como se cada publicação, pedido de patente ou patente individual estivesse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Em particular, todas as publicações citadas aqui estão expressamente incorporadas aqui por referência para a finalidade de descrever e divulgar composições e métodos que devem ser usados em conjunto com a invenção. Embora a invenção provida aqui tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente para aqueles de conhecimento comum na técnica à luz dos ensinamentos dessa invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Sumário da Invenção [00012] A invenção proporciona métodos de isolar uma população de

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6/64 partículas de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) de qualquer sorotipo de capsídeo de impurezas no processo por captura das partículas de rAAV em um meio de cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG). Os métodos da invenção implicam processamento a montante (como, por exemplo, centrifugação, tratamento com Benzonase®, filtragem por troca iônica e/ou filtragem por fluxo tangencial) assim como processamento a montante (como, por exemplo, inativação térmica, filtragem, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão por tamanho e/ou cromatografia de troca aniônica). Os métodos a montante e a jusante podem ser usados sozinhos ou em diversas combinações.

[00013] A invenção proporciona métodos para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) de impurezas no processo em uma corrente de alimentação, compreendendo as etapas de: (a) contatar uma corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV com um meio de cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG), em que as partículas de rAAV se ligam ao meio de cromatografia de apatita; e (b) eluir as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita com um tampão de eluição contendo menos do que 3% (p / v) de PEG. Em determinadas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é hidroxiapatita de cerâmica (CHT) ou fluoroapatita de cerâmica (CFT). Em certas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição contendo menos do que 3% (p / v) de PEG. Em certas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição na ausência de PEG.

[00014] Em algumas modalidades, a ligação específica do meio de cromatografia de apatita é entre 10⁶ e 10¹⁶ partículas resistentes a DNase (DRPs) por mililitro. Em algumas modalidades, a ligação específica do meio de cromatografia de apatita é entre 10¹⁰ e 10¹⁶partículas resistentes a DNase (DRPs) por mililitro. Em algumas modalidades, a ligação específica do meio de cromatografia de apatita é

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7/64 entre 10¹² e 10¹⁶ partículas resistentes a DNase (DRPs) por mililitro. Em algumas modalidades, a ligação específica do meio de cromatografia de apatita é entre 10¹⁴ e 10¹⁶ partículas resistentes a DNase (DRPs) por mililitro.

[00015] Em algumas modalidades, o método também compreende uma etapa de filtragem de troca iônica antes da etapa de cromatografia com apatita, em que as partículas de rAAV estão no escoamento da filtragem de troca iônica. Em algumas modalidades, o método também compreende concentrar as partículas de rAAV do escoamento da filtragem de troca iônica por filtragem de fluxo tangencial antes da etapa de cromatografia com apatita. Em algumas modalidades, o método também compreende uma etapa de ligar as partículas de rAAV na corrente de alimentação eluída do meio de cromatografia de apatita a um meio de cromatografia aniônica. Em algumas modalidades, o método ainda compreende uma etapa de inativação térmica para inativar o vírus auxiliar. Em algumas modalidades, o método também compreende uma etapa de ligar as partículas de rAAV na corrente de alimentação a uma cromatografia de interação hidrofóbica após a cromatografia de apatita.

[00016] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG) e um tampão básico. Em algumas modalidades, o tampão básico é entre pH 7,2 e 10, entre pH 7,4 e 10, entre pH 7,6 e 10, entre pH 7,8 e 10, entre pH 8,0 e 10,0, entre pH 8,2 e 10,0, entre pH 8,4 e 10,0, entre pH 8,6 e 10,0, entre pH 8,8 e 10,0, entre pH 9,0 e 10,0, entre pH 9,2 e 10,0, entre pH 9,4 e 10,0, entre pH 9,6 e 10,0 ou entre pH 9,8 e 10,0. Em algumas modalidades, o tampão básico tem um pH de cerca de qualquer de 7,2; 7,6; 7,8; 8,0; 8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0; 9,2; 9,4; 9,6; 9,8 e 10,0. Qualquer tampão básico conhecido na técnica pode ser usado. M algumas modalidades, o tampão básico compreende borato. Em algumas modalidades, o tampão básico é borato.

[00017] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de

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8/64 cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG). Por exemplo, entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG podem ser usados. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v), cerca de 3,5% (p / v), cerca de 4% (p / v), cerca de 4,5% (p / v), cerca de 5% (p / v), cerca de 5,5% (p / v), cerca de 6% (p / v), cerca de 6,5% (p / v), cerca de 7% (p / v), cerca de 7,5% (p / v), cerca de 8% (p / v), cerca de 8,5% (p / v), cerca de 9% (p / v), cerca de 9,5% (p / v) ou cerca de 10% (p / v) de PEG.

[00018] Em algumas modalidades, o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 5.000 (PEG5000) gramas por mol e cerca de 15.000 (PEG15000) gramas por mol, tal como, cerca de 5.000 gramas por mol (PEG5000), cerca de 6.000 (PEG6000) gramas por mol, cerca de 7.000 (PEG7000) gramas por mol, cerca de 8.000 (PEG8000) gramas por mol, cerca de 9.000 (PEG9000) gramas por mol, cerca de 10.000 (PEG10000) gramas por mol, cerca de 11.000 (PEG10000) gramas por mol, cerca de 12.000 (PEG 12000) gramas por mol, cerca de 13.000 (PEG13000) gramas por mol, cerca de 14.000 (PEG14000) gramas por mol e cerca de 15.000 (PEG15000) gramas por mol. Em certas modalidades, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 6.000 (PEG6000) gramas por mol. Em certas modalidades, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 8.000 (PEG8000) gramas por mol. Em certas modalidades, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 10.000 (PEG10000) gramas por mol. Em certas modalidades, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 15.000 (PEG15000) gramas por mol.

[00019] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v)

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PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 4% (p / v)de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 5% (p / v)de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 6% (p / v)de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 7% (p / v) de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 8% (p / v)de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 9% (p / v)de

PEG6000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 10% (p / v)de

PEG6000.

[00020] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 4% (p / v)de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode

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10/64 cromatografia de apatita na presença de cerca de 5% (p / v) de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 6% (p / v)de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 7% (p / v) de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 8% (p / v)de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 9% (p / v)de

PEG8000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 10% (p / v)de

PEG8000.

[00021] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v) de PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 4% (p / v)de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 5% (p / v)de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 6% (p / v)de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação

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11/64 contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 7% (p / v) de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 8% (p / v)de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 9% (p / v)de

PEG10000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 10% (p / v)de

PEG10000.

[00022] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 3% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 4% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 5% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 6% (p / v)de

PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 7% (p / v)de

PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 8% (p / v)de

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PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 9% (p / v)de

PEG15000. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meiode cromatografia de apatita na presença de cerca de 10% (p / v)de

PEG15000.

[00023] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV é contatada com um meio de cromatografia de apatita em um tampão compreendendo cerca de 20 mM de borato a pH 9,0, e cerca de 5% de PEG (como PEG6000). Em algumas modalidades, a corrente de alimentação é misturada em linha com um volume igual de um tampão que compreende cerca de 40 mM de borato a pH 9,0 e cerca de 10% de PEG para proporcionar uma concentração final de cerca de 20 mM de borato a pH 9,0 e cerca de 5% de PEG.

[00024] Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita com as partículas de rAAV ligadas ao meio é lavado para remover as impurezas de processo antes de eluir as partículas de rAAV. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo concentrações decrescentes de PEG para remover as impurezas de processo. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem contém cerca de qualquer de 10% (p / v), 9,5% (p / v), 9% (p / v), 8,5% (p / v), 8% (p / v), 7,5% (p / v), 7% (p / v), 6,5% (p / v), 6% (p / v), 5,5% (p / v), 5% (p / v), 4,5% (p / v), 4% (p / v), 3,5% (p / v) e 3% (p / v) de PEG. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo 7,5% (p / v) de PEG6000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo 7,5% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades,

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13/64 o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo 7,5% (p / v) de PEG10000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo 7,5% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo cerca de 5% (p / v) de PEG6000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo cerca de 5% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo cerca de 5% (p / v) de PEG10000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo cerca de 5% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG6000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG10000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG15000. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem que não contém PEG.

[00025] Em algumas modalidades, o tampão de lavagem contém tampões conhecidos na técnica. Em alguma modalidade, o tampão de lavagem compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em borato, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico (HEPES) e Tris-HCI. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é borato. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES. Em algumas modalidades, o tampão

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14/64 de lavagem compreende ou é Tris-HCI. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem está a pH básico. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem tem um pH entre pH 7,0 e pH 10,0, entre pH 7,2 e pH 10,0, entre pH 7,4 e pH 10,0, entre pH 7,6 e pH 10,0, entre pH 7,8 e pH 10,0, pH 8,0 e pH 10,0, pH 8,2 e pH 10,0, entre pH 8,4 e pH 10,0, entre pH 8,6 e pH 10,0, entre pH 8,8 e pH 10,0, entre pH 9,0 e pH 10,0, entre pH 9,2 e pH 10,0, entre pH 9,4 e pH 10,0, entre pH 9,6 e pH 10,0 ou entre pH 9,8 e pH 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem tem um pH a 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,8; 8,0; 8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0; 9,2; 9,4; 9,6; 9,8 ou 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é borato a um pH entre 8,0 e 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é borato a pH 8,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é borato a pH 9,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é borato a pH 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES a um pH entre 7,0 e 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES a pH 7,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES a pH 8,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES a pH 9,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é HEPES a pH 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é Tris-HCI a um pH entre 7,0 e 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é Tris-HCI a pH 7,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é Tris-HCI a pH 8,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é Tris-HCI a pH 9,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende ou é TrisHCI a pH 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem também compreende entre 50 e 250 mM de NaCL [00026] Em algumas modalidades, a etapa de lavagem compreende uma primeira lavagem com um tampão de lavagem que compreende cerca de 30 mM de borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 7,5% de PEG; uma segunda lavagem com um tampão de lavagem que

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15/64 compreende cerca de 150 fosfato de potássio, cerca de 20 mM borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 5% de PEG; uma terceira lavagem com um tampão de lavagem que compreende cerca de 20 mM de borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 5% de PEG; e uma quarta lavagem com um tampão de lavagem que compreende cerca de 20 mM de HEPES a pH de cerca de 7,0 e 150 mM de NaCI.

[00027] Em algumas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição contendo baixas concentrações de PEG ou na ausência de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG, menos do que cerca de 2% (p / v) de PEG ou menos do que cerca de 1% (p / v) de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém cerca de 2,5% (p / v), cerca de 2% (p / v), cerca de 1,5% (p / v), cerca de 1 % (p / v) ou cerca de 0,5% (p / v) de PEG, ou nenhum PEG. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG6000. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG8000. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG 10000. Em algumas modalidades, o tampão de eluição contém menos do que cerca de 3% (p / v) de PEG 15000. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição na ausência de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em borato, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico (HEPES) e Tris-HCI. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende ou é borato. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende ou é HEPES. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende ou é Tris-HCI. Em algumas modalidades, o tampão de eluição é a pH neutro. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende ou é Tris-HCI a pH neutro. Em algumas modalidades, o tampão de eluição também compreende menos do que cerca de 100 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão de eluição também

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16/64 compreende menos do que cerca de 50 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão de eluição também compreende entre cerca de 50 e 250 mM de NaCI. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição que compreende cerca de 50 mM de fosfato de potássio, cerca de 20 mM de HEPES a pH de cerca de 7,0 e cerca de 150 mM de NaCI.

[00028] Em algumas modalidades, o método de isolar as partículas de rAAV de impureza de processo em uma corrente de alimentação compreendendo as etapas de: (a) contatar uma corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV com um meio de cromatografia de apatita na presença de cerca de 5% (p / v) de PEG em um tampão básico a pH de cerca de 9,0, em que as partículas de rAAV se ligam ao meio de cromatografia de apatita; (b) lavar o meio de cromatografia de apatita com um primeiro tampão de lavagem compreendendo cerca de 30 mM de borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 75% de PEG; (c) lavar o meio de cromatografia de apatita com um segundo tampão de lavagem compreendendo cerca de 150 fosfato de potássio, cerca de 20 mM de borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 5% de PEG; (d) lavar o meio de cromatografia de apatita com um terceiro tampão de lavagem compreendendo cerca de 20 mM de borato a pH de cerca de 9,0 e cerca de 5% de PEG; (e) lavar o meio de cromatografia de apatita com um quarto tampão de lavagem compreendendo cerca de 20 mM de HEPES e pH de cerca de 7,0 e 150 mM de NaCI; e (f) eluir as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita com um tampão de eluição compreendendo cerca de 50 mM de fosfato de potássio, cerca de 20 mM de HEPES a pH de cerca de 7,0 e cerca de 150 mM de NaCI.

[00029] Também providos aqui são métodos para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante de impurezas de processo em uma corrente de alimentação, compreendendo as etapas de: (a) contatar uma corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV com um meio de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em um tampão com alto teor de sal, em que

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17/64 as partículas de rAAV e as impurezas de processo se ligam ao meio de HIC; e (b) eluir as partículas de rAAV ligadas ao meio de HIC com um tampão com teor de sal médio. Em algumas modalidades, o meio de HIC é selecionado a partir do grupo que consiste em Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl e resina Tosoh Has(butyl). Em algumas modalidades, o tampão com alto teor de sal compreende ou está entre 0,5 M e 2,0 M de citrato (por exemplo, citrato de sódio). Em algumas modalidades, o tampão com alto teor de sal compreende cerca de 0,5 M; 0,75 M; 1,0 M; 1,25 M; 1,5 M; 1,75 M e 2,0 M de citrato. Em algumas modalidades, o tampão com teor de sal médio compreende ou é menos do que 0,5 M de citrato (por exemplo, citrato de sódio). Em algumas modalidades, o tampão com teor de sal médio compreende entre 0,5 M a cerca de 0,3 M de citrato. Em algumas modalidades, o tampão com teor de sal médio compreende cerca de qualquer de 0,45 M; 0,4 M; 0,35 M; 0,3 M e 0,25 M de citrato. Em algumas modalidades, o tampão com alto teor de sal compreende entre 1 e 100 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão com teor de sal médio também compreende entre 1 e 100 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão com teor de sal médio elui as partículas de rAAV sem eluir partículas de rAAV com capsídeos vazios, capsídeos parcialmente desnaturados, capsídeos menos infecciosos e/ou capsídeos parcialmente cheios.

[00030] Em qualquer das modalidades descritas aqui, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV- 15 e AAV- 16. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-4, AAV-5 e AAV-8. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV de AAV-1. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV de AAV-4. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV de AAV-5. Em algumas

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18/64 modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV de AAV-8. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo de AAV de um sorotipo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV- 13, AAV- 14, AAV-15 e AAV- 16. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV que é um aglutinante aniônico fraco. Em algumas modalidades, o sorotipo de capsídeo de AAV que é uma ligação aniônica fraca é selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-4, AAV-5 e AAV-8. Em algumas modalidades, a composição contendo partículas de rAAV também compreende contaminantes de cultura de produção. Em algumas modalidades, os contaminantes de cultura de produção compreendem partículas de rAAV danificadas, contaminantes de célula hospedeira, contaminantes do vírus auxiliar e/ou contaminantes de cultura celular. Em algumas modalidades, os contaminantes de célula hospedeira compreendem DNA de célula hospedeira, plasmídeos ou proteína de célula hospedeira. Em algumas modalidades, os contaminantes do vírus auxiliar compreendem partículas de adenovírus, DNA de adenovírus ou proteínas de adenovírus. Em algumas modalidades, os contaminantes de cultura celular compreendem componentes de meios, albumina do soro ou outras proteínas do soro. Em algumas modalidades, os contaminantes de cultura celular compreendem componentes de meios. Em algumas modalidades, os contaminantes de cultura celular não compreendem albumina do soro ou outras proteínas do soro.

[00031] Fica entendido que uma, algumas ou todas as propriedades das diversas modalidades descritas aqui podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção.

Breve Descrição das Figuras [00032] Figura 1 apresenta os resultados da digestão com Benzonase® do sobrenadante clarificado coletado da cultura de produção de rAAV. Os resultados demonstram que nenhum DNA de alto peso molecular estava presente após digestão com Benzonase®.

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19/64 [00033] Figura 2 apresenta um traçado espectrofotométrico típico para uma triagem típica com resina para afinidade de ligação a rAAV conforme descrito no Exemplo 4. Absorbância (AU) e condutividade (mS/cm) foram indicadas.

[00034] Figura 3 apresenta uma análise da capacidade de avanço com e sem PEG. Duas culturas de produção de rAAV modelo foram usadas para avaliar a capacidade da resina de apatita (tipo CFT 1). Painel superior: avanço durante carga de correntes de alimentação contendo soro e livres de soro na presença ou ausência de cerca de 5% (p / v) de PEG6000 na carga. Volumes de carga se referem à corrente de alimentação de partida, antes da diluição online a 1:1, e foram normalizados por ml_ de volume de resina. Painel inferior: volumes de carga (ml) em que 1 % de avanço foi observado, e recuperação em fração de eluição. As coletas de TFF utilizadas no experimento estavam a uma concentração de aproximadamente 10¹⁶ DRP/ml para os vetores rAAV. Na presença de cerca de 5% (p / v) de PEG6000, 150 ml_ da coleta de TFF foram carregados a 1,2 ml_ de resina CFT sem avanço, que foi definido como a presença de > 1% de rAAV na coluna de escoamento, correspondendo a uma carga de 1,8 x 10¹⁴ de DRP de rAAV total.

[00035] Figura 4 apresenta um cromatograma de CHT I típico. Mostradas em linha, medições de absorbância de UV A280 (AU, unidade de absorbância) e condutividade (mS/cm) por Amersham 3 mm Skid. Parêntesis marcam os principais segmentos do programa descrito no Exemplo 7. NaOH marca a etapa de descontaminação da coluna.

[00036] Figura 5 mostra a pureza relativa de vetores rAAV eluídos a partir de resinas de apatita. O Painel A mostra a distribuição de vetor entre o escoamento/caça (FT), alto teor de fosfato/5% (p / v) de PEG6000 (PO4), as lavagens para remover fosfato e PEG6000 (WII/WIII), e a eluição. Nenhuma das diferenças entre os casos é significante na precisão da analítica, e a falta de equilíbrio de massa é típica. O painel B mostra as raias relevantes de um SDS PAGE corado com laranja Sypro com frações de eluição da coluna de apatita. Cada amostra foi carregada a 2 x 10¹¹ DRP/raia; a diferença de migração aparente entre as raias é

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20/64 um artefato de sal devido a ter que concentrar a eluição de CFT por evaporação a um volume que se ajustaria ao gel. As únicas bandas predominantes parecem ser proteínas do capsídeo de AAV. O Painel C mostras as raias relevantes de um Western Blot Ad5 com raias reordenadas para clareza, demonstrando depuração comparável de proteínas Ad5.

[00037] Figura 6 mostra avaliação de purificação através do processo por SDS-PAGE. Amostras de processo de uma coleta produção da cultura representativa foram corridas em um gel desnaturante/redutor de poliacrilamida a 10% e corado com laranja Sypro. Todas as amostras pós-coleta foram carregadas a 1 x 10¹⁰ DRP/raia. As duas amostras a montante antes da etapa de concentração de TFF (etapa de clarificação inicial e escoamento de AEX) só puderam ser carregadas a 1 x 10⁹DRP/raia devido a limites de volume com relação ao gel. Betagalactosidase (B-Gal) foi carregada a 50 ng/raia para avaliar a sensibilidade e consistência da marcação pelo gel. As três proteínas do capsídeo de AAV1 (VP1, 2 e 3) estão indicadas.

[00038] Figura 7 mostra a recuperação gradual para purificação de rAAV conforme descrito nos Exemplos 1-12. A DRP total presente no sobrenadante antes da coleta foi definida como 100%. A recuperação em cada etapa é o DRP total recuperado em relação à DRP total processada em relação a essa etapa. A recuperação geral para o processo inteiro foi aproximadamente 28%. D4 sup: cultura de produção; AEX FT: escoamento de troca aniônica (Mustang® Q); captura: cromatografia de apatita; calor: inativação térmica ou morte térmica; HIC: cromatografia de interação hidrofóbica; SEC: cromatografia de exclusão por tamanho; AEX: troca aniônica.

Descrição Detalhada [00039] É um objetivo dessa invenção proporcionar métodos para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) de qualquer sorotipo de capsídeo de AAV de contaminantes da cultura de produção como partículas de rAAV danificadas, vírus auxiliar, proteínas do vírus auxiliar, plasmídeos,

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21/64 proteínas celulares e DNA, componentes de meios, proteínas do soro e similares. Além disso, os métodos da presente invenção proporcionam processos ortogonais, comercial mente escaláveis consistentes com exigências regulatórias para isolamento de uma população de partículas de rAAV de coletas ou correntes de alimentação da cultura de produção de rAAV de alto título. As populações de partículas de rAAV isoladas através dos métodos da presente invenção são substancialmente livres de contaminantes, incluindo contaminantes da cultura de produção e/ou contaminantes de processo, como partículas de rAAV danificadas, vírus auxiliar, proteínas do vírus auxiliar, plasmídeos, proteínas celulares e DNA, componentes de meios, proteínas do soro e glucanos. Os métodos da presente invenção são particularmente adequados para sorotipos de vetor rAAV que são aglutinantes aniônicos fracos como, por exemplo, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 e rAAV-8. A invenção também contempla um método para isolar uma população de alto título de partículas de rAAV substancialmente livres de contaminantes, incluindo contaminantes da cultura de produção e/ou contaminantes de processo, adequado para uso em aplicações de terapia genética sem a necessidade de realizar centrifugação por gradiente de densidade.

Definições [00040] O termo isolado ou purificado conforme usado aqui se refere a um preparo de partículas de rAAV desprovidas de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde as partículas de rAAV ocorrem naturalmente ou são inicialmente preparadas a partir de. Assim, por exemplo, partículas de rAAV isoladas podem ser preparadas usando uma técnica de purificação para enriquecer a partir de uma mistura de origem, como um lisado de cultura ou sobrenadante de cultura de produção. O enriquecimento pode ser medido em uma variedade de modos, como, por exemplo, pela proporção de partículas resistentes a DNase (DRPs) presentes em uma solução, ou por infectividade, ou ele pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura de fonte, como contaminantes, incluindo contaminantes da cultura de

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22/64 produção ou contaminantes de processo, incluindo vírus auxiliar, componentes de meios e similares, conforme definido abaixo.

[00041] Um preparo de rAAV é dito como sendo substancialmente livre de vírus auxiliar se a razão de partículas de AAV infecciosas para partículas de vírus auxiliar é pelo menos cerca de 10²:1; preferivelmente pelo menos cerca de 10⁴:1, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10⁶:1; ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10⁸:1. Preparos também são preferivelmente livres de quantidades equivalentes de proteínas do vírus auxiliar (isto é, proteínas como estariam presentes como um resultado de tal nível de vírus auxiliar se as impurezas de partículas do vírus auxiliar notadas acima estivessem presentes em forma interrompida. Contaminação de proteína viral e/ou celular pode em geral ser observada como a presença de bandas coradas com Coomassie em géis SDS (por exemplo, o surgimento de bandas diferentes daquelas correspondentes a proteínas do capsídeo de AAV VP1, VP2 e VP3).

[00042] O termo aglutinante aniônico fraco ou aglutinante aniônico de baixa afinidade conforme usado aqui se refere alternadamente a uma partícula de rAAV com um sorotipo de capsídeo que, na presença de contaminantes (incluindo contaminantes de cultura de produção ou contaminantes de processo), não se liga com afinidade suficiente para permitir o isolamento das partículas de rAAV de outros contaminantes de cultura de produção de rAAV. Tais sorotipos do capsídeo são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, AAV-1, AAV-5, AAV-8 e AAV-4. Conforme descrito na técnica, tais aglutinantes aniônicos fracos são em geral purificados por métodos que incluem pelo menos uma etapa de centrifugação por densidade incluindo iodixinol (vendido sob o nome comercial Optiprep®) ou centrifugação por gradiente de cloreto de césio.

[00043] Conforme usado aqui, o termo vírus auxiliar ou vírus auxiliar contaminante se refere a um vírus usado quando produzindo cópias de um vetor viral dependente do vírus auxiliar, como vírus adenoassociado, que não tem a capacidade de se replicar por conta própria. O vírus auxiliar é usado para coinfectar células ao lado do vetor viral e

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23/64 proporciona as proteínas necessárias para replicação do genoma do vetor viral. O termo abrange partículas virais intactas, capsídeos vazios, DNA viral e similares. Vírus auxiliar comumente usados para produzir partículas de rAAV incluem adenovírus, vírus herpes simplex, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr e vírus vaccínia.

[00044] O termo cultura de produção conforme usado aqui se refere a um recipiente contendo os componentes necessários para produção de partícula de vetor rAAV. Culturas de produção incluem, sem limitação, os componentes a seguir: 1) uma célula hospedeira adequada; 2) função de vírus auxiliar; 3) produtos de genes rep e cap de AAV; 4) o transgene terapêutico flanqueado por sequências ITR de AAV; e 5) meios adequados, componentes de meios e suplementos de meios, incluindo sem limitação soro, proteínas derivadas do soro, vitaminas, aminoácidos essenciais e não essenciais e glicose conhecidos por apoiar a produção de rAAV.

[00045] Como usados aqui, os termos contaminantes, contaminantes de cultura de produção, contaminantes de processo, impurezas de processo, impurezas ou contaminantes, como usados alternadamente aqui, se referem, sem limitação, a formulações de meios conhecidas na técnica por apoiar a produção de vetores rAAV; suplementos de meios como sais, soro de bezerro, suplementos de aminoácidos, suplementos de vitaminas, fatores de crescimento, albumina do soro e outras proteínas de baixo peso molecular presentes em formulações de meios conhecidas na técnica; células hospedeiras permissivas, proteínas de célula hospedeira ou DNA de célula hospedeira; vírus auxiliar, proteínas do vírus auxiliar ou DNA do vírus auxiliar como adenovírus do tipo selvagem ou proteínas do vírus da herpes; e outros materiais de cultura de produção de vetor não-rAAV ou vetor rAAV introduzidos durante o processo de purificação como glucanos ou tampões de cromatografia utilizados na purificação de vetores rAAV de correntes de alimentação.

[00046] O termo coleta da cultura de produção como usado aqui é definido como uma solução que compreende partículas de vetor rAAV de

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24/64 culturas de produção de vetor rAAV por meios conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, processos de transfecção, produção em linha de célula estável, sistemas de produção de Ad-híbrido ou sistema de produção de baculovíros. Além disso, o termo coleta da cultura de produção como usado aqui se refere ao material isolado do recipiente de cultura de produção e inclui ambos materiais isolados por lise de células produtoras de rAAV por meios conhecidos na técnica e materiais isolados de culturas de produção de rAAV mantidas sob condições de cultura conhecidas na técnica para proporcionar partículas de rAAV liberadas nos meios a partir de células intactas. Uma coleta da cultura de produção pode conter alguns ou todos os seguintes, sem limitação: partículas de vetor rAAV, componentes de cultura de produção, como componentes de meios, proteínas de célula hospedeira, DNA de célula hospedeira, células hospedeiras, vírus auxiliar, proteínas do vírus auxiliar, DNA do vírus auxiliar, DNA plasmídeo, DNA do vírus carreador, soro, proteínas derivadas do soro e suplementos de meios.

[00047] O termo corrente de alimentação como usado aqui se refere a uma fonte de partículas de vetor rAAV que são carregadas, passadas através ou aplicadas a uma matriz cromatográfica. Correntes de alimentação da presente invenção incluem coletas da cultura de produção, e materiais isolados das etapas cromatográficas anteriores da invenção se o material estava presente como escoamento da etapa anterior, ligado e eluído na etapa anterior, presente no volume vazio da etapa anterior ou presente em qualquer fração obtida durante a purificação de partículas de rAAV. Tais correntes de alimentação podem incluir um ou mais contaminantes, contaminantes de cultura de produção, impurezas de processo, ou impurezas ou contaminantes, conforme definido aqui.

[00048] Os termos captura, ligado, se liga ou ligação como usados aqui se referem alternadamente à ligação, aderência ou colagem de um elemento de uma corrente de alimentação a um meio cromatográfico. Componentes podem ser ligados a um meio cromatográfico através de qualquer força ou química conhecida na

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25/64 técnica, incluindo, sem limitação, hidrofóbica, iônica (incluindo aniônica e catiônica), afinidade, quelação de metal e quelação. Componentes podem ser ligados a um meio cromatográfico através de mais de um tipo de química, como em meios cromatográficos de apatita.

[00049] Os termos resina de apatita, meio de cromatografia de apatita, matriz de apatita e meio de apatita conforme usados aqui se referem alternadamente a um meio cromatográfico compreendido de um mineral de fosfato de cálcio e inclui, sem limitação, meios cromatográficos de hidroxiapatita cerâmica (CHT) e fluoroapatita cerâmica (CFT).

[00050] Os termos modo misto e multimodal se referem a meios cromatográficos que têm a capacidade para mais do que uma química de ligação. Meios cromatográficos de modo misto incluem, sem limitação, meios cromatográficos com apatita, que são capazes de exibir ligação por afinidade a metal através das porções de cálcio, ligação de hidrogênio através dos grupos hidroxila presentes na estrutura, repulsa à carga positiva e atração à carga negativa através das porções de cálcio e repulsa à carga negativa e atração à carga positiva através das porções de fosfato presentes nos meios.

[00051] Referência geral a a composição ou composições inclui e é aplicável a composições da invenção.

[00052] Como usado aqui, a forma singular dos artigos um, uma e o a inclui as referências plurais a menos que indicado de outra forma. Por exemplo, a expressão uma partícula de vírus inclui uma ou mais partículas de vírus.

[00053] Referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referindo-se a cerca de X inclui descrição de X.

[00054] Fica entendido que aspectos e modalidades da invenção descritos aqui incluem consistindo e/ou consistindo essencialmente em aspectos e modalidades.

Produção de Vetores rAAV

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26/64 [00055] Numerosos métodos são conhecidos na técnica para produção de vetores rAAV, incluindo transfecção, produção em linha de célula estável e sistemas de produção de vírus híbrido infeccioso que incluem híbridos Adenovírus-AAV, híbridos herpesvírus-AAV e híbridos baculovírus-AAV. Culturas de produção de rAAV para a produção de partículas de vírus de rAAV todas requerem: 1) células hospedeiras adequadas, incluindo, por exemplo, linhagens celulares derivadas de seres humanos como células HeLa, A549 ou 293, ou linhagens celulares derivadas de insetos como SF-9, no caso de sistemas de produção de baculovírus; 2) função de vírus auxiliar adequada, provida por adenovírus do tipo selvagem ou mutante (como adenovírus sensível à temperatura), vírus herpes, baculovírus ou construto de plasmídeo que provê funções de auxiliar; 3) genes rep e cap de AAV e produtos de gene; 4) um transgene (como um transgene terapêutico) flanqueado por sequências ITR de AAV; e 5) meios adequados e componentes de meios para apoiar produção de rAAV. Meios adequados conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de vetores rAAV. Esses meios incluem, sem limitação, meios produzidos por Hyclone Laboratories e JRH incluindo Modified Eagle Médium (MEM), Dulbecco’s Modified Eagle Médium (DMEM), formulações personalizadas como aquelas descritas na Patente US n° 6.566.118, e meios Sf-900 II SFM como descrito na patente US n° 6.723.551, cada uma é aqui incorporada por referência em sua totalidade, particularmente com relação às formulações de meios personalizadas para uso na produção de vetores AAV recombinantes.

[00056] Meios de cultura de produção de rAAV adequados da presente invenção podem ser suplementados com proteínas do soro ou recombinantes derivadas do soro a um nível de 0,5% - 20% (v/v ou p / v). De maneira alternativa, como é conhecido na técnica, vetores rAAV podem ser produzidos em condições livres de soro que também podem ser referidas como meios sem produtos derivados de animais. Aquele de conhecimento comum na técnica pode apreciar que meios comerciais ou personalizados projetados para apoiar a produção de vetores rAAV também podem ser suplementados com um ou mais componentes de

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27/64 cultura celular conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, glicose, vitaminas, aminoácidos e ou fatores de crescimento, a fim de aumentar o título de rAAV em culturas de produção.

[00057] Culturas de produção de rAAV podem ser desenvolvidas sob uma variedade de condições (através de uma ampla faixa de temperatura, para comprimentos variantes de tempo e similares) adequadas para a célula hospedeira particular sendo utilizada. Como é conhecido na técnica, culturas de produção de rAAV incluem culturas dependentes de fixação que podem ser cultivadas em recipientes dependentes de fixação adequados como, por exemplo, garrafas de rolo, filtros de fibra oca, microcarreadores e biorreatores de leito empacotado ou leito fluidizado. Culturas de produção de vetor rAAV também podem incluir células hospedeiras adaptadas para suspensão como células HeLa, 293 e SF-9 que podem ser cultivadas em uma variedade de modos, incluindo, por exemplo, frascos giratórios, biorreatores de tanque agitado e sistemas descartáveis como o sistema de bolsa Wave.

[00058] Partículas de vetor rAAV da invenção podem ser colhidas a partir de culturas de produção de rAAV por lise das células hospedeiras da cultura de produção ou por coleta dos meios gastos da cultura de produção, desde que as células sejam cultivadas sob condições conhecidas na técnica para causar liberação de partículas de rAAV nos meios de células intactas, conforme descrito mais detalhadamente na Patente US n° 6.566.118). Métodos adequados de lise de células também são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, múltiplos ciclos de congelamento/descongelamento, sonicação, microfluidização e tratamento com substâncias químicas como detergentes e/ou proteases. Purificação de Vetores rAAV [00059] Na coleta, culturas de produção de rAAV da presente invenção podem conter um ou m ais dos seguintes: (1) proteínas de célula hospedeira; (2) DNA de célula hospedeira; (3) DNA plasmídeo; (4) vírus auxiliar; (5) proteínas do vírus auxiliar; (6) DNA do vírus auxiliar e (7) componentes de meios incluindo, por exemplo, proteínas do soro, aminoácidos, transferrinas e outras proteínas de baixo peso molecular.

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Em adição, culturas de produção de rAAV também incluem partículas de rAAV com um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV- 15 e AAV-16. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV têm um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-4, AAV-5 e AAV-8.

[00060] Em algumas modalidades, a coleta da cultura de produção de rAAV é limpa para remover restos de célula hospedeira. Em algumas modalidades, a coleta da cultura de produção é limpa por filtragem através de uma série de filtros profundos, incluindo, por exemplo, um Filtro grade D0HC Millipore Millistak+ HC Pod, um Filtro grade A1HC Millipore Millistak+ HC Pod e um Filtro Opticap XL10 Millipore Express SHC de Membrana Hidrofílica de 0,2 pm. Clarificação também pode ser alcançada através de uma variedade de outras técnicas padrão conhecidas na arte, como centrifugação ou filtragem através de qualquer filtro de acetato de celulose de tamanho de poro de 0,2 pm ou mais conhecido na técnica.

[00061] Em algumas modalidades, a coleta da cultura de produção de rAAV é ainda tratada com Benzonase® para digerir qualquer DNA de alto peso molecular presente na cultura de produção. Em algumas modalidades, a digestão de Benzonase® é realizada sob condições padrão conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, uma concentração final de 1-2,5 unidades/ml de Benzonase® a uma variação de temperatura ambiente a 37 °C por um período de 30 minutos a diversas horas.

[00062] Partículas de rAAV podem ser isoladas ou purificadas usando uma ou mais das seguintes etapas de purificação: filtragem por troca aniônica de escoamento, filtragem de fluxo tangencial (TFF) para concentração das partículas de rAAV, captura de rAAV por cromatografia de apatita, inativação térmica de vírus auxiliar, captura de rAAV por cromatografia de interação hidrofóbica, troca de tampão por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), nanofiltragem e captura

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29/64 de rAAV por cromatografia de troca aniônica. Essas etapas podem ser usadas sozinhas, em diversas combinações ou em diferentes ordens. Em algumas modalidades, o método compreende todas as etapas na ordem como descrita acima.

Filtragem por Troca Aniônica [00063] Opcionalmente em algumas modalidades, a coleta da cultura de produção tratada com Benzonase® e limpa é submetida à filtragem por troca aniônica sob condições onde o vetor rAAV está presente no escoamento e vírus auxiliar contaminante é retido no filtro carregado. Com a força iônica da coleta da cultura de produção de rAAV, as partículas de rAAV podem ser distinguidas do vírus auxiliar, por exemplo, adenovírus por passagem através de um filtro aniônico como um filtro Mustang® Q (Pall Corp., East Hills, NY). Aquele versado na técnica pode determinar o tamanho e número de filtros necessários para alcançar a redução de log ótima de adenovírus (LRV) e proteínas adenovirais presentes na cultura de produção filtrada aniônica e tratada com Benzonase®, limpa. Em algumas modalidades, o LRV é pelo menos um log e maior do que dez logs. Em uma modalidade preferida, o LRV é pelo menos dois e mais do que oito logs. Em uma modalidade preferida, o LRV é pelo menos seis logs.

Concentração de Filtragem de Fluxo Tangencial (TFF) [00064] Em algumas modalidades, o escoamento da filtragem aniônica da corrente de alimentação tratada com Benzonase®, limpa é concentrado através de filtragem de fluxo tangencial (TFF) antes de ser aplicado a um meio de cromatografia com apatita. Concentrações em grande escala de vírus usando ultrafiltragem de TFF foi descrita por R. Paul et aL, HUMAN GENE THERAPY, 4:609-615 (1993). A concentração de TFF da corrente de alimentação possibilita um volume tecnicamente administrável de corrente de alimentação a ser submetido a etapas de cromatografia da presente invenção e permite dimensionamento mais razoável de colunas sem a necessidade de longos tempos de recirculação. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação de rAAV é concentrada entre pelo menos duas vezes e pelo menos dez

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30/64 vezes. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação é concentrada entre pelo menos dez vezes e pelo menos vinte vezes. Em algumas modalidades, a corrente de alimentação é concentrada entre pelo menos vinte vezes e pelo menos cinquenta vezes. Aquele de conhecimento comum na técnica também irá reconhecer que TFF também pode ser usado em qualquer etapa no processo de purificação onde seja desejável trocar tampões antes de realizar a próxima etapa no processo de purificação.

Captura de rAAV por Cromatografia de Apatita na Presença de Polietileno Glicol (PEG) [00065] Processos aprovados pela FDA para purificação de proteínas e outros produtos biológicos adequados para uso em triagens clínicas humanas e produtos farmacêuticos se baseiam em processos ortogonais de escala comercial. Um esquema de purificação de múltiplas etapas é considerado como incluindo um processo ortogonal se ele emprega mecanismos de separação que são distintos entre si, com cada etapa representando um eixo no espaço Cartesiano. Por exemplo, um processo de duas etapas usando cromatografia de troca iônica e de interação hidrofóbica (HIC) seria considerado ortogonal. Os processos para remover contaminantes, como contaminantes de cultura de produção ou contaminantes de processo, de uma coleta ou corrente de alimentação de cultura de produção descrita aqui são processos ortogonais incluindo tanto etapas de captura quanto de escoamento em uma variedade de meios cromatográficos para o produto final (isto é, um vetor rAAV). Demonstrou-se na técnica que vetores rAAV (especificamente rAAV-2) se ligam a resinas aniônicas. Foi demonstrado que vetores rAAV como rAAV-1, -5 e -8 se ligam muito menos fortemente do que rAAV-2 a meios de troca iônica na presença de componentes de produção como albumina do soro, componentes do vírus auxiliar, componentes de meios de produção e DNA de célula hospedeira, resultando em um esquema de purificação menos eficiente e de qualidade inferior.

[00066] Estratégias de purificação anteriores descritas na técnica para aglutinantes aniônicos de baixa afinidade como AAV-1 incluíram um

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31/64 gradiente de etapa de iodixinol que reduz a concentração relativa dos contaminantes, como contaminantes de cultura de produção e impurezas de processo, a fim de alcançar uma ligação mais forte do vetor rAAV a trocadores aniônicos. Gradientes de etapa de iodixinol não são prontamente escaláveis para processos de escala comercial descritos aqui.

[00067] Os inventores do presente pedido de patente descobriram que partículas de vetor rAAV podem ser isoladas de contaminantes, como contaminantes de cultura de produção ou contaminantes de processo, por captura ou eluição de resinas de apatita. Assim, além de capturar produto de uma corrente de alimentação bruta, a coluna de apatita remove uma variedade de impurezas relacionadas ao processo, incluindo proteínas de célula hospedeira e do adenovírus, glucanos e proteínas do soro, assim como proporciona fatores de depuração adicionais para vírus auxiliar (como vírus auxiliar Ad5).

[00068] Resinas de apatita são meios de cromatografia que compreendem minerais de fosfato de cálcio, incuindo, sem limitação, hidroxiapatita cerâmica (CHT) e fluoroapatita cerâmica (CFT). Meios cromatográficos de apatita também são referidos como modo misto ou meios de múltiplos modos porque a apatita tem grupos funcionais que proporcionam mais do que uma ligação química. Sem desejar estar ligado à teoria, meios de apatita proporcionam a oportunidade para ligação por afinidade a metal de cálcio, ligação de hidrogênio, repulsa à carga positiva, atração à carga positiva, repulsa à carga negativa e atração à carga negativa através de um hospedeiro de diferentes grupos químicos, incluindo resíduos de hidroxila presentes na estrutura, porções de cálcio positivamente carregadas e porções de fosfato negativamente carregadas presentes na resina. Cada ligação química se aplica a ligação de modo misto assim como para cromatografia de modo único. Entretanto, ao contrário de cromatografia de modo único, as diversas ligações e químicas de eluição não são independentes e podem trabalhar em modos opostos. Por exemplo, aumentar a força iônica pode acionar ligação hidrofóbica. (T. Kawasaki, M. Niikura, and Y. Kobayashi, J.

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Chrom. 515:125-148 (1990) and P.S. Gagnon, P. Ng, J. Zhen, C. Aberin, and J. He, BioProcess lnt'l 4:50-60 (2006)). Especificamente, CHT e CFT são formas esféricas, macroporosas de hidroxiapatita (Ca5(PO4)3OH)2 sinterizadas a altas temperaturas para converter o mineral de uma forma cristalina em uma forma cerâmica. Isso proporciona um meio de cromatografia com uma estrutura macroporosa proporcionando uma área de grande superfície, resistência à transferência de massa limitada, alta força mecânica e resistência de base. Sinterização a diferentes temperaturas e tempos resulta em diferentes estruturas físicas tipos I e II, que são quimicamente idênticas, porém oferecem diferentes capacidades para diferentes classes de moléculas. CFT difere de CHT em que é uma combinação de fluoroapatita e hidroxiapatita preparada substituindo-se quimicamente os grupos hidroxila com grupos de flúor para aumentar a estabilidade em condições ácidas. Resinas de CFT e CHT estão comercialmente disponíveis (por exemplo, por Bio-Rad Laboratories, Inc.).

[00069] Os inventores da presente invenção descobriram surpreendentemente que a presença de polietileno glicol (PEG) no tampão de carga aumenta de maneira dramática a capacidade e reprodutibilidade (reduzindo o avanço variável de partículas de rAAV no escoamento) de ligação de partícula de vetor rAAV a resinas de apatita. Sem desejar estar ligado à teoria, um atributo de vetores rAAV que os distingue da maioria das impurezas relacionadas ao processo é o grande tamanho físico das partículas. Esse diferencial de tamanho foi explorado nas etapas de captura e lavagem incluindo-se polietileno glicol (PEG) na ligação de cromatografia e tampões de lavagem para preferencialmente aumentar os coeficientes de divisão de moléculas maiores para o estado ligado com base em compartilhamento energeticamente favorável de conchas de hidratação. Embora o uso de PEG na purificação de vetores virais e bacteriófagos tenha sido descrito na técnica, ao contrário da presente invenção, ele foi usado principalmente como um agente de precipitação para agregar fisicamente e remover partículas virais da solução. Visto que PEG é conhecido na técnica por facilitar a agregação

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33/64 e precipitação de partículas virais e rAAV foi descrito na técnica por formar agregados à força iônica de 200 mM (Wright et al., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)), o efeito de PEG sobre ligação de vetor rAAV a resinas de apatita foi imprevisível. PEG era conhecido na técnica por facilitar a ligação de moléculas de imunoglobulina a resinas de troca iônica conforme descrito, por exemplo, em Gagnon, J. Chromtogr. 743A:51-55 (1996), e para resinas de modo misto hidrofóbicas carregadas conforme descrito, por exemplo, em Gagnon et al., 22^ndInternational IBC Conference on Antibody Production and Development,

4-6 de março de 2009.

[00070] Os inventores do presente pedido de patente determinaram com base em experimentação com PEG6000 sobre uma faixa de concentração entre 3-10% (p / v) na corrente de alimentação que uma concentração relativa de cerca de 5% (p / v) de PEG6000 era ótima. Aquele versado na técnica irá apreciar que outras espécies e pesos moleculares de PEG podem ser utilizados incluindo, sem limitação, PEG8000, PEG10000 e PEG15000, e que a concentração relativa de PEG na concentração final na solução de vetor rAAV pode ser empiricamente determinada de modo à concentração apropriada de PEG, partículas de vetor rAAV na solução são acionadas para se ligarem à resina de apatita, porém não formam agregados ou se precipitam fisicamente.

[00071] Em algumas modalidades, as partículas de vetor rAAV são isoladas de contaminantes de cultura de produção por captura em uma resina de apatita na presença de PEG e eluição da partícula de rAAV ligada a partir da resina de apatita em um tampão de fosfato. Em modalidades preferidas, as partículas de vetor rAAV são isoladas de contaminantes de cultura de produção por captura em uma resina de apatita na presença de PEG e eluição da partícula de rAAV ligada a partir da resina de apatita em um tampão na ausência de PEG. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendendo capsídeos que são aglutinantes aniônicos fracos são isoladas de contaminantes de cultura de produção por captura em uma resina de apatita na presença de PEG

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34/64 e a partícula de rAAV ligada eluída da resina de apatita em um tampão na ausência de PEG. Em modalidades preferidas, partículas de rAAV compreendendo capsídeos do sorotipo 1 (sorotipo rAAV-1) são isoladas de contaminantes de cultura de produção por captura em uma resina de apatita na presença de PEG e as partículas contendo capsídeo sorotipo rAAV-1 ligadas à resina são eluídas em tampão na ausência de PEG. Em algumas modalidades, as partículas de vetores rAAV são isoladas de contaminantes de cultura de produção de acordo com um método que compreende carregar uma corrente de alimentação em um tampão de carga na ausência de fosfato, porém na presença de PEG e eluir o rAAV ligado da resina de apatita em um tampão de eluição que compreende fosfato e sem PEG.

[00072] Embora cromatografia de apatita na presença de PEG represente uma estratégia eficiente de captura ou ligação para purificação de vetores de rAAV, muitas impurezas de processo também foram retidas pela resina de apatita a pH 7,0. Sem desejar estar ligado à teoria, proteínas presentes na corrente de alimentação a pH básico (pH maior do que 7,0) seriam mais prováveis de ter uma carga líquida negativa e serem repelidas pelos sítios de ligação de fosfato negativos presentes na resina de apatita, desse modo reduzindo a capacidade de ligação por troca de cátion geral da resina cromatográfica. Dada a natureza de modo misto de resinas de apatita, entretanto, ligação através de atração à carga positiva e afinidade a metal ainda poderia ocorrer.

[00073] Tampões de borato são usualmente usados na técnica como sistemas de tamponamento básicos por causa de suas propriedades de fabricação desejáveis incluindo, sem limitação, facilidade de preparo, ótima solubilidade, excelente capacidade de tamponamento e baixo custo. Portanto tampões de borato como o sistema de tamponamento básico de modelo foram avaliados quanto à captura de rAAV em resinas de apatita. Aquele de conhecimento comum na técnica pode apreciar que outros tampões básicos poderíam ser avaliados para determinar se eles reduziram o nível de ligação de impurezas de processo a resinas de apatita na presença de PEG. Outros tampões básicos podem ser

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35/64 testados e usados para captura de rAAV. Em algumas modalidades, o tampão de carga de apatita na ausência de PEG compreende um tampão de borato. Em algumas modalidades, o tampão de borato é formulado a um pH entre cerca de 8,0 a cerca de pH 9,9. Em uma modalidade preferida, o tampão de borato é formulado a um pH de cerca de 9,0. Em algumas modalidades, o tampão de borato está a uma concentração entre cerca de 5 mM a cerca de 500 mM. Em modalidades preferidas, o tampão de borato é formulado a cerca de 20 mM de borato, pH 9,0. Em algumas modalidades, o tampão de borato a 20 mM a pH 9,0 reduz especificamente a captura de impurezas de processo de moléculas pequenas na resina de apatita.

[00074] Em algumas modalidades, a corrente de alimentação é carregada sobre uma resina de apatita em um tampão contendo fosfato na presença de PEG através da mistura online da corrente de alimentação com um tampão de fosfato que compreende PEG a duas vezes a concentração final de PEG. Em algumas modalidades, o pH do tampão de fosfato é entre pH 6,5 e pH 7,0. Em algumas modalidades, o PEG é PEG6000. Em algumas modalidades, a concentração de PEG6000 no tampão de carga é entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v). Em modalidades preferidas, a concentração de PEG6000 no tampão de carga é de cerca de 5% (p / v). Em algumas modalidades, a concentração de fosfato no tampão de carga para a resina de apatita é entre 5 mM e 500 mM.

[00075] Em algumas modalidades, a capacidade de ligação da resina de apatita na presença de PEG é aumentada em relação à capacidade de ligação da resina de apatita na ausência de PEG. Em algumas modalidades, a capacidade de ligação da resina de apatita para partículas de vetor rAAV em uma corrente de alimentação na presença de PEG é aumentada de cerca de metade de um log a cerca de dez logs em relação à capacidade de ligação da resina de apatita na ausência de PEG. Em modalidades preferidas, a capacidade de ligação da resina de apatita para partículas de rAAV presentes em uma corrente de alimentação na presença de PEG é aumentada oito logs. Em algumas

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36/64 modalidades, a capacidade de ligação da resina de apatita para partículas de vetor rAAV em uma corrente de alimentação na presença de PEG é pelo menos cerca de 10⁶ partículas de rAAV por ml de resina a cerca de 10¹⁶ partículas por ml de resina (tal como cerca de qualquer de 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶ partículas por ml de resina). Em algumas modalidades, a capacidade de ligação da resina de apatita na presença de PEG é cerca de 10¹⁴ partículas por ml de resina.

[00076] Embora essa surpreendente capacidade de ligação de aproximadamente 10¹² - 10¹⁴ DRP de rAAV-1 por ml de resina de apatita na presença de PEG permite escala custo-benefício, altamente eficaz de purificação de rAAV-1 comercial, aquele de conhecimento comum na técnica irá apreciar que a capacidade de ligação representa o número máximo ou rAAV-1 que irá se ligar por ml de resina e não se destina a limitar operacionalmente o escopo da invenção. De fato, os inventores apreciam que coleta de culturas de vetor rAAV que contêm menos do que 10¹⁴ - 10¹⁶ DRP de rAAV-1/ml podem ser purificadas pela presente invenção.

[00077] Em algumas modalidades, as partículas de rAAV ligadas ao meio de apatita são lavadas antes de eluição das partículas de rAAV da resina. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo concentrações decrescentes de PEG para remover as impurezas de processo. Em algumas modalidades, o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo entre cerca de 3% (p / v) e cerca de 10% (p / v) de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem contém cerca de qualquer de 10% (p / v); 9% (p / v); 8,5% (p / v); 8% (p / v); 7,5% (p / v); 7% (p / v); 6,5% (p / v); 6% (p / v); 5,5% (p / v); 5% (p / v); 4,5% (p / v); 4% (p / v); 3,5% (p / v) e 3% (p / v) de PEG. Em algumas modalidades, o meio de apatita é lavado com um tampão de lavagem contendo PEG a uma concentração superior à concentração de PEG usada para permitir ligação das partículas de rAAV ao meio de apatita. Em algumas modalidades, o meio

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37/64 de apatita é ainda lavado com concentração decrescente de PEG. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem contém tampões conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em borato, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico (HEPES) e Tris-HCI. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem está a pH básico. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem tem um pH entre pH 7,0 e pH 10,0; entre pH 7,2 e pH 10,0; entre pH 7,4 e pH 10,0;

entre pH 7,6 e pH 10,0; entre pH 7,8 e pH 10,0; pH 8,0 e pH 10,0; pH 8,2 e pH 10,0; entre pH 8,4 e pH 10,0; entre pH 8,6 e pH 10,0; entre pH 8,8 e pH 10,0; entre pH 9,0 e pH 10,0; entre pH 9,2 e pH 10,0; entre pH 9,4 e pH 10,0; entre pH 9,6 e pH 10,0 ou entre pH 9,8 e pH 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem tem um pH a 7,0; 7,2; 7,4; 7,6; 7,8; 8,0; 8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9,0; 9,2; 9,4; 9,6; 9,8 ou 10,0. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem também compreende entre 100 e 500 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem também compreende entre 50 e 250 mM de NaCI.

[00078] Em algumas modalidades, os vetores rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG são eluídos em um tampão em baixas concentrações de PEG. Em algumas modalidades, baixas concentrações de PEG são entre cerca de 2,9% (p / v) e cerca de 0,1% (p / v). Em algumas modalidades, os vetores rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG são aluídos em um tampão na ausência de PEG. Em modalidades preferidas, os vetores de rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG são eluídos em um tampão contendo fosfato na ausência de PEG.

[00079] Em algumas modalidades, os vetores rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG são eluídos em um tampão contendo fosfato. Em algumas modalidades, os vetores rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG

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38/64 são eluídos em um tampão contendo fosfato a uma concentração entre cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM (tal como, entre cerca de 1 mM a cerca de 250 mM, entre cerca de 10 mM a cerca de 100 mM). Em modalidades preferidas, os vetores rAAV isolados de uma corrente de alimentação por captura em uma resina de apatita na presença de PEG são eluídos em um tampão de fosfato a 50 mM.

[00080] Os inventores do presente pedido de patente descobriram que vetores rAAV presentes em uma corrente de alimentação podem ser isolados por captura em uma resina de apatita na presença de PEG. Entretanto, se vírus auxiliar usados na cultura de produção (como adenovírus) estão presentes na corrente de alimentação aplicada à resina de apatita, eles podem ser capturados pela resina de apatita na presença de PEG. Partículas de vetor rAAV capturadas pela resina de apatita na presença de PEG podem ser facilmente isoladas de adenovírus por seu perfil eluição em tampões de fosfato. Partículas de vetor rAAV ligadas à resina de apatita na presença de PEG eluem, na ausência de PEG, em tampões contendo um mínimo de 0 mM fosfato; ao passo que partículas adenovirais do vírus auxiliar são retidas nas resinas de apatita sob concentrações de fosfato usadas para eluir as partículas de vetor rAAV. Experimentalmente, verificou-se que vetores rAAV eluem em um único pico agudo em um mínimo de 50 mM de fosfato na ausência de PEG, ao passo que vírus auxiliar como adenovírus, se presentes, foram retidos na resina. Em estudos de pico em que correntes de alimentação de rAAV foram enriquecidas com 8⁹ partículas resistentes a DNase (DRPs) de adenovírus infecciosos e submetidas à cromatografia em resinas de apatita na presença de PEG, os vetores rAAV foram capturados na resina de apatita e eluídas em tampão de fosfato a 50 mM na ausência de PEG, enquanto aproximadamente 4 logs de proteínas adenovirais foram retidos na resina de apatita. Em conformidade, em algumas modalidades, os vetores rAAV presentes em uma corrente de alimentação são isolados de vírus auxiliar contaminantes por captura em uma resina de apatita na presença de PEG e eluição em tampões de fosfato na ausência de PEG. Em algumas

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39/64 modalidades, os tampões de fosfato são formulados a concentrações que mantêm vírus auxiliar contaminante ligado à resina de apatita. Em algumas modalidades, dois a oito logs de adenovírus são retidos por ml de resina de apatita. Em algumas modalidades, os vetores rAAV presentes em uma corrente de alimentação são isolados por eluição de uma resina de apatita em tampão de fosfato a 0-500 mM (tal como 0-400 mM, 0-300 mM, 0-200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) sob condições que mantêm vírus auxiliar ligado à resina de apatita.

[00081] Sistemas de produção conhecidos na técnica por produzir vetores rAAV podem incluir meios de produção contendo soro na faixa de 0,5% - 20% (v/v), ou podem ser desprovidos de soro completamente. Além disso, esquemas de purificação descritos na técnica podem incluir uma ou mais etapas de concentração que podem resultar em um aumento de proteínas do soro e outros componentes do soro na corrente de alimentação aplicada à resina de apatita. Por exemplo, o sobrenadante da cultura de produção como descrito aqui que foi formulado com soro a 1% (v/v) foi concentrado aproximadamente vinte vezes na etapa de TFF, de modo que a corrente de alimentação carregada sobre a resina de apatita continha tanto quanto 20% de contaminantes de proteína do soro em comparação a um concentrado de corrente de alimentação de uma cultura de produção formulada sem soro. Os inventores do presente pedido de patente testaram os métodos de captura de apatita providos aqui com concentrados de corrente de alimentação de culturas de produção formuladas na presença ou ausência de soro. Verificou-se que a presença de proteínas do soro na corrente de alimentação não tem efeito sobre a performance da etapa de cromatografia de apatita.

Inativacão Térmica de Vírus Auxiliar (Morte Térmica) [00082] Se adenovírus infeccioso é usado como uma fonte de vírus auxiliar nas culturas de produção para produção de rAAV, uma etapa de inativação térmica (morte térmica) opcional pode ser incorporada para inativar quaisquer partículas adenovirais residuais que podem estar presentes na corrente de alimentação. A etapa de morte térmica tem a

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40/64 vantagem de uma das principais diferenças entre AAV e adenovírus: partículas de adenovírus são inativadas a temperaturas de aproximadamente 54-56 °C, enquanto partículas de AAV e rAAV são estáveis e não afetadas por essas temperaturas. Na presente invenção, os inventores ajustaram a etapa de inativação térmica para acomodar a otimização de processo em maior escala como as culturas de produção de 250 L de escala realizadas aqui. Em particular, o eluato de apatita foi inativado por calor em uma bolsa de bioprocessamento de 5 L de uso único, estéril em uma plataforma de balanço controlada por temperatura ajustada a 53 °C a uma velocidade de balanço de 40 RPM, com um ângulo de 12° para mistura (panela aquecedora Wave de 20 L). O eluato de apatita foi incubado na plataforma até que alcançou 52 °C, e em seguida mantido nessa temperatura por mais 10 minutos. MgCh foi adicionado ao eluato de apatita a uma concentração final de 2 mM para estabilizar o vetor rAAV durante aquecimento. Aquele de conhecimento comum na técnica pode apreciar que o ponto de ajuste final de escala para aquecimento, e tempo de aquecimento podem ser empiricamente testados para encontrar condições ótimas para inativar partículas adenovirais ao mesmo tempo mantendo a infectividade e integridade das partículas de rAAV. A etapa de inativação térmica pode ser omitida para purificação de partículas de rAAV de culturas de produção que utilizam construtos de plasmídeos para proporcionar função auxiliar. Cromatografia de Interação Hidrofóbica [00083] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é uma técnica para separar biomoléculas com base em diferenças em sua hidrofobicidade superficial. Assim, HIC é considerada em método ortogonal para as outras etapas de purificação no processo de AAV. Meios cromatográficos de HIC contêm ligantes hidrofóbicos como hidrocarbonetos de cadeia linear (por exemplo, propila (C3), butila (C4), hexila (C6) ou octila (C8)) ou aromáticos (por exemplo, fenila). Em água pura, o efeito hidrofóbico é muito fraco para interação funcional entre o ligante e proteínas ou entre as próprias proteínas. Entretanto, sais liotrópicos aumentam interações hidrofóbicas, e a adição de sal aciona a

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41/64 captura de proteínas para meios de HIC. Por essa razão, resinas de HIC são usualmente carregadas sob altas concentrações de sal e eluídas a baixas concentrações de sal. Como aquele de conhecimento comum na técnica irá apreciar, sulfato de amônio [(NH4)2SO4] é o sal mais comumente usado para controlar a captura de proteínas através de cromatografia HIC devido à alta posição liotrópica de ambos íons de amônio e sulfato na série Hofmeister, e a alta solubilidade do sal. Na presente invenção, partículas de rAAV presentes em uma corrente de alimentação foram carregadas a uma resina de HIC por mistura em linha de uma razão a 75:25 (volume:volume) de sulfato de amônio a 2 M + tampão BisTris a 50 mM (pH 7,0):corrente de alimentação, respectivamente. Mistura em linha da corrente de alimentação com o tampão de carga evita o risco de qualquer precipitação de vetor rAAV pelas altas concentrações de sulfato de amônio presente no tampão. Como aquele de conhecimento comum na técnica pode apreciar, a concentração de sal (sulfato de amônio) pode ser manipulada par alcançar a concentração ótima para ligação a rAAV. Em conformidade, em algumas modalidades, a concentração de sulfato de amônio é entre 1 M e 3 M. Em algumas modalidades preferidas, a concentração de sulfato de amônio no tampão de carga é 2 mM. Como aquele de conhecimento comum na técnica pode apreciar, mistura em linha do sulfato de amônio e corrente de alimentação são realizadas para conveniência e fluxo da operação da unidade, porém é possível misturar facilmente a corrente de alimentação com a concentração apropriada de tampão de carga através de qualquer meio conhecido na técnica e em seguida corrente de alimentação de carga + solução de tampão de carga sobre os meios cromatográficos de HIC.

[00084] Cossolventes também podem afetar a interação hidrofóbica. Por exemplo, etileno ou propileno glicol podem reduzir a interação entre proteína e o ligante imobilizado e, assim, ser útil para melhorar perfis de eluição. Em conformidade, a coluna de HIC foi lavada com uma mistura a 75:25 (v:v) de sulfato de amônio a 2M + tampão BisTris a 50 mM (pH 7,0): BisTris a 50 mM (pH 7,0) + tampão de Propileno Glicol a 10% (v:v)

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42/64 (EMD BioSciences), e rAAV foi eluído em um tampão com baixo teor de sal mais propileno glicol (sulfato de amorno a 800 mM + tampão BisTris a 50 mM (pH 7,0) + Propileno Glicol a 4%. Sob essas condições de eluição, qualquer vírus auxiliar residual e proteínas presentes na corrente de alimentação carregadas sobre a coluna permaneceríam ligados à coluna. O Propileno Glicol nesse exemplo foi adicionado aos tampões para evidenciar o perfil de eluição, em comparação ao perfil de eluição amplo do tampão sem Propileno Glicol, porém é opcional no processo.

[00085] Exemplos de resinas hidrofóbicas adequadas incluem, sem limitação, Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C e EMD Fractogel Phenyl (Tosoh Bioscience LLC, PA).

[00086] Refugo de processos de produção de rAAV requer descontaminação rigorosa antes do descarte por pelo menos duas razões: (1) o produto compreende um vetor viral; e (2) culturas de produção comumente usam adenovírus vivo tipo 5 (Ad5) como um vírus auxiliar para produção de rAAV.

[00087] Refugo líquido de operações de cromatografia é tipicamente descontaminado primeiro com alvejante em ponto de uso e em seguida sofre descontaminação adicional pela manutenção em pH elevado antes da neutralização e descarte.

[00088] O sulfato de amônio presente nos tampões de HIC reage com ambos alvejante e hidróxido de sódio para liberar cloro perigoso e gás de amônia, respectivamente. Portanto, uma consideração primordial para a otimização do processo da etapa de cromatografia de HIC foi o desenvolvimento de um sistema de tampão adequado que podería ser descontaminado de forma segura por métodos conhecidos na arte.

[00089] Como uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica pode apreciar, tampões com altas concentrações de sal utilizados em cromatografia de interação hidrofóbica devem ser adicionalmente peneirados por questões de viscosidade que podem resultar em altas contrapressões que podem ou limitar as taxas de fluxo ou causar problemas de mistura, aumentando assim o risco de precipitação do produto por cristalização de sal nos tampões que ocorrem em

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43/64 temperaturas usadas para armazenamento ou operação. Com base nos dados na Tabela 6 abaixo e na consideração dos fatores descritos acima, os inventores selecionaram citrato de sódio a 1 M (pH 7,0) como o tampão ótimo para a ligação de vetores rAAV ao meio cromatográfico de HIC, embora tampões de citrato possam ser usados em cromatografia de interação hidrofóbica em concentrações que variam de 0,5 M a 2,0 M. Troca de Tampão por Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) [00090] Diversos métodos são conhecidos na técnica para realizar a troca de tampão aqui descrita, incluindo TFF e diálise. Uso de cromatografia de exclusão por tamanho tem a vantagem adicional de prover depuração de proteína adicional de proteínas dimensionadas para passar através dos poros nas resinas e de ser relativamente rápida em termos de tempo necessário para trocar os tampões. A troca de tampão foi realizada nesta etapa para garantir que o eluato de HIC da etapa anterior fosse trocado por um tampão apropriado para ligação a rAAV para a etapa final de cromatografia de troca aniônica no processo. Agente Adventício (Depuração Viral) [00091] Opcionalmente, uma etapa adicional para limpar contaminantes de traço, tais como vírus adventícios que podem estar presentes na corrente de alimentação, pode ser incorporada ao processo, gerando assim um processo ortogonal comercialmente razoável. Assim, em algumas modalidades, o processo ainda inclui um filtro de depuração viral. Exemplos de tais filtros são conhecidos na técnica e incluem Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm) e Asahi 70 nm.

Cromatografia de Troca Aniônica [00092] Uma etapa de captura de troca aniônica para o vetor rAAV submetido a cromatografia de apatita foi realizada como uma concentração final e uma etapa de polimento. Meios adequados de cromatografia de troca aniônica são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, Unosphere Q (Biorad, Hercules, Califórnia) e resinas amino ou imino carregadas com N, como por exemplo, 50 POROS PI, ou qualquer DEAE, TMAE, amina terciária ou quaternária, ou resinas à base

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44/64 de PEI conhecidas na técnica (Patente US No. 6.989.264; N. Brument et al, Mol. Therapy 6 (5) :678-686 (2002);. G. Gao et al, Hum Gene Therapy. 11:2079-2091 (2000)). Alguém com conhecimentos comuns na técnica pode apreciar que tampões de lavagem de força iônica adequada podem ser identificados de modo que o rAAV permanece ligado à resina, enquanto outras impurezas do processo que incluem, sem limitação, glucanos que podem ser introduzidos por lixiviação de vários filtros utilizados na etapa de purificação são removidas. Em algumas modalidades, o tampão de lavagem é NaCI a 60 mM e o vetor rAAV é eluído da coluna com NaCI a 130 mM, de tal forma que quaisquer impurezas do processo de traço residual presentes, tal como soro albumina ou vírus auxiliar, são retidas na coluna.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Coleta de rAAV-1 a partir da digestão de Benzonase® & clarificacão do meio de cultura [00093] O meio de produção de rAAV-1 gasto (sobrenadante) a partir de uma cultura de produção viral de rAAV-1 de 250 L produzida por qualquer método conhecido na técnica contendo o vetor rAAV-1 foi limpo para remover quaisquer células contidas no sobrenadante. O sobrenadante foi passado por uma série de filtros ligados em série, incluindo: (1) um filtro Millistak Millipore +® HC Pod, Grade D0HC (Millipore Corporation, Bedford, MA) (4 vezes); (2) um filtro Millistak Millipore + ® HC Pod, Grade A1HC; e (3) um filtro Opticap ® XL10 Millipore Express SHC de Membrana Hidrofílica de 0,2 pm a uma taxa de 5 litros por minuto (LPM), que foi reduzido gradualmente até 4 LPM.

[00094] Todos os filtros foram pré-lavados em osmose reversa / água deionizada (RO / Dl), conforme as especificações do fabricante. O escoamento foi coletado em uma bolsa de bioprocesso para a digestão Benzonase ®. Uma concentração final de 2 unidades / ml de Benzonase ® (EM Industries número de catálogo 1.01695.0002) foi dissolvida no meio de produção de rAAV-1 e adicionada ao sobrenadante viral limpo para atingir uma concentração final de 2,5 unidades / ml. O sobrenadante mais Benzonase ® foi incubado à temperatura ambiente com

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45/64 recirculação constante em 4 LPM para permitir a digestão de DNA. Dados da digestão de Benzonase ® estão mostrados na Figura 1, o que demonstra que nenhum DNA de alto peso molecular estava presente após a digestão de Benzonase ®.

Exemplo 2: Remoção de contaminantes de produção através de troca aniônica [00095] O rAAV-1 limpo e o sobrenadante digerido por Benzonase ® do Exemplo 1 foram passados por uma série de filtros Pall Mustang ® Q (MQ) de 5,08 cm (duas polegadas) por 55,88 cm (22 polegadas) ligados em série (Pall Corp, número de catálogo NP6MSTGQP1). Antes do carregamento do sobrenadante viral de rAAV-1, os filtros foram higienizados com 15 L de NaOH a 0,5 M a 0,5 LPM com um tempo de espera de 15 minutos, carregados por enxague com 15 L de TMEG + NaCI a 2M (TMEG: Tris- HCI a 0,05 M, pH 7,5, 2-mercaptoetanol a 1 mM, Na2EDTA a 1 mM, 10% (v / v) de glicerol) a uma taxa de 6 LPM e equilibrados com 15 L de meio de produção do vetor a 6 LPM. O sobrenadante foi então bombeado a uma taxa de aproximadamente 6 LPM através da série de filtros e coletado em uma bolsa de bioprocessamento. Na força iônica do meio de produção, o filtro MQ de troca aniônica demonstrou limpar vírus auxiliar e DNA residual, entre outras impurezas, do sobrenadante de rAAV-1 através da ligação dos contaminantes à membrana carregada. Na força iônica da cultura de produção, no entanto, o vetor rAAV-1 presente no sobrenadante fluiu através da membrana de troca aniônica. Durante a otimização do processo, foi determinado experimentalmente que o uso de um único filtro MQ resultou em um avanço de contaminantes no processo, incluindo o vírus auxiliar Ad5. Consequentemente, um segundo filtro foi adicionado em série ou em tandem no processo.

Exemplo 3: Concentração de Sobrenadante do Vetor rAAV-1 [00096] O sobrenadante de produção de vetor rAAV-1 completo processado nos exemplos 1 e 2 foi concentrado cerca de 20 vezes por filtragem de fluxo tangencial (TFF) a partir de um volume inicial de aproximadamente 250 L a um volume de aproximadamente 12,5 L.

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Cartuchos de filtro de polietersulfona de fluxo tangencial com um corte de peso molecular de 100 kD, tela em C e uma área de superfície total de 5 m² (Millipore Pellicon ® 2 Biomax, número de Catálogo P2B100C05) foram lavados com 50 L de água RO / Dl, higienizados com 15 L de NaOH a 0,5 M com uma etapa de espera de 15 minutos, lavados novamente com 100 L de WIFI (água purificada HyPure ™ WFI; HyClone, Logan, UT), lavados com 15 L de TMEG + NaCI a 2 M, e finalmente equilibrados com 15 L de meio de produção de rAAV-1. O sobrenadante foi passado através do cartucho TFF a uma taxa de fluxo de aproximadamente 3 LPM com uma taxa de recirculação de 16 LPM. O material TFF retido no filtro (retentado) foi concentrado a cerca de 10,5 L e foi transferido para um reservatório. O filtro foi lavado com cerca de 2 L de meio de produção. A lavagem e o concentrado foram então agrupados para produzir um volume final de aproximadamente 12,5 L.

[00097] A concentração de rAAV-1 a um volume de 12,5 L por TFF também concentrou os contaminantes de produção de rAAV-1 restantes na solução em aproximadamente 20 vezes. Assim, uma etapa de manutenção de fabricação foi introduzida após a etapa TFF, durante a qual o concentrado TFF foi filtrado através de uma membrana de filtro Opticap 0,22 μM de 10,16 cm (4 polegadas) (Millipore ® Opticap número de catálogo KVSC04HB3). Esta etapa de filtragem extra permite que o concentrado de TFF contendo rAAV-1 avance para a etapa seguinte no processo sem a necessidade de diafiltração e troca de tampão. O material pós-TFF pode ser armazenado a 2 - 8 ° C por qualquer período de tempo, incluindo tão pouco quanto 24 horas até 3 meses ou mais, antes de processamento adicional, sem nenhuma perda de estabilidade, conforme medido pelo rendimento vetorial ou infectividade avaliada por ensaios conhecidos na técnica. Alternativamente, TFF realizada como aqui descrito pode ser usada em qualquer etapa no processo de purificação para concentrar ou trocar o tampão do vetor rAAV-1.

Exemplo 4: Peneiramento de Resina para Vetor rAAV-1 Versus Ligação a Impureza de Processo.

[00098] Processos comerciais aprovados pela FDA para a purificação

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47/64 de proteínas e outros produtos biológicos se baseiam em processos ortogonais que incorporam escala comercial. Processos ortogonais são processos que têm mais de uma etapa ou processo para a remoção de impurezas de processo, incluindo etapas de captação e escoamento para o produto final como, por exemplo, um vector rAAV-1. Demonstrou-se na técnica que vetores rAAV (especificamente rAAV-2) se ligam a resinas aniônicas. Foi demonstrado que vetores rAAV, tais como rAAV-1, -5 e -8, se ligam de maneira muito menos forte do que rAAV-2 a trocadores aniônicos na presença de componentes de produção, tais como albumina do soro, componentes de vírus auxiliar, componentes de meios de produção e DNA da célula hospedeira, resultando em um esquema de purificação menos eficiente e de menor qualidade.

[00099] Estratégias de purificação anteriores descritas na arte para aglutinantes aniônicos de menor afinidade, como AAV-1, incluem um gradiente de etapa de iodixinol que reduz a concentração relativa dos componentes de produção a fim de alcançar uma ligação mais forte do vetor rAAV a trocadores aniônicos. Gradientes de etapa de iodixinol não são facilmente escaláveis para processos em escala comercial como aqueles aqui descritos. Portanto, a fim de otimizar a purificação do vetor rAAV para aglutinantes aniônicos de baixa afinidade como rAAV-1 sem a necessidade de realizar gradientes de etapa e ultracentrifugação, uma série de resinas foi triada por sua capacidade de se ligar a vetores rAAV ou excluir os vetores rAAV no escoamento, em comparação com a capacidade de se ligar ou impurezas de processo comumente observadas em escoamento, incluindo DNA da célula hospedeira, vírus auxiliar, albumina do soro, proteínas do soro (se o soro está incluído no meio de produção), e outras proteínas de baixo peso molecular encontradas nas culturas de produção, a fim de desenvolver um processo de purificação de rAAV comercialmente escalável, ortogonal e eficiente.

[000100] A triagem de resina foi realizada utilizando uma coluna de 1 ml (altura de leito de 5 cm) com taxas de fluxo lineares recomendadas pelo vendedor para cada resina em capacidades severamente

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48/64 subcarregadas em relação às recomendações do fabricante. Traçados espectrofotométricos de absorção ultravioleta a 280 nanômetros (A280) foram coletados para ligação e eluição de cada resina. Picos foram analisados pelo ensaio apropriado para o vetor rAAV-1 e impurezas típicas do processo. Os dados apresentados na Figura 2 representam um traçado espectrofotométrico típico para uma resina típica na lista. A Tabela 2 lista algumas das resinas tríadas, bem como as afinidades de ligação relativas da resina quanto ao rAAV-1 e diversas impurezas do processo.

Tabela 2: Triagem de Resinas quanto à Ligação de rAAV-1 em Comparação à Ligação de Contaminantes de Processo

Resina	Tipo de resina	rAAV-1	Vírus auxiliar	DNA da célula hospedeira	Albumina do soro	Proteínas do soro
UnoS pH 5,5	Troca catiônica	+	0	-	+	+
UnoS pH 7,0	Troca catiônica	-	-	-	-	-
UnoQ Ph 8,5	Troca aniônica	+	++	++++	++	++
UnoQ pH 7,0	Troca aniônica	+	+++	++++	++	++
Fractogel EMD SO₃	Troca catiônica	+	++	-	0	0
CHT	Apatita	+	0	++	+	+
CFT	Apatita	+	0	++	+	+
HIC Phenyl	Troca hidrofóbica	-	-	-	0	0
HIC Butyl	Troca hidrofóbica	+	++	-	0	0
HIC Hexyl	Troca hidrofóbica	+	++	-	0	0
HIC PPG	Troca hidrofóbica	-	-	-	0	0
Source S	Troca iônica	+	0	0	++	0
Source Q	Troca iônica	+	0	0	++	0
TMAE	Troca	+	0	0	++	0

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Resina	Tipo de resina	rAAV-1	Vírus auxiliar	DNA da célula hospedeira	Albumina do soro	Proteínas do soro
	iônica
IMAC FeCI₃		0	0	-	+	+
Superdex 200	Filtragem em gel	Vazio	Vazio	caça	caça	caça
HW55	Filtragem em gel	Vazio	Vazio	caça	caça	caça
HW65	Filtragem em gel	Vazio	Vazio	caça	caça	caça
HW75	Filtragem em gel	Vazio	Vazio	caça	caça	caça

[000101] Legenda: (-) = presente em escoamento (sem ligação); + = fracamente ligado (eluído muito cedo no gradiente); ++ a +++ = ligação mais forte (eluído adicionalmente com o gradiente).

Exemplo 5: Desenvolvimento de Cromatografia de Apatita na Presença de Polietileno Glicol (PEG) para Captura de rAAV-1 [000102] Com base nos resultados da triagem de resina realizada no Exemplo 4, uma resina de apatita ou resina de apatita cerâmica foi escolhida como uma das resinas de captura para rAAV-1. Experimentos iniciais foram realizados utilizando resinas CFT II, mas para purificação posterior a resina foi trocada para CHT I, conforme discutido em detalhes abaixo. Os dados indicaram que ambas as resinas cromatográficas executaram de forma equivalente. Experimentos foram realizados para aumentar ainda mais a capacidade de ligação a rAAV-1 da resina de apatita e melhorar a capacidade da resina de discriminar entre partículas de rAAV-1 e outras impurezas do processo. Duas melhorias fundamentais para a função das resinas de apatita foram adicionalmente desenvolvidas como descrito aqui: 1) a adição de PEG, e 2) desenvolvimento das condições de tampão de carga.

[000103] Com base no avanço variável da coluna de apatita devido a problemas de capacidade em tamanhos coluna comercialmente razoáveis, PEG foi misturado com o concentrado TFF (ver Exemplo 3 acima) antes de carregamento à resina de apatita, a fim de aumentar a ligação do vetor rAAV-1 em relação a outras impurezas de processo

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50/64 como albumina do soro, vírus auxiliar e outras impurezas de proteínas que competiram com o vetor rAAV-1 quanto à ligação à coluna no Exemplo 4.

[000104] Cromatografia de apatita na presença de PEG representa uma captura eficiente ou estratégia de ligação para a purificação de vetores rAAV-1, embora muitas impurezas de processo também tenham sido retidas pela resina de apatita a pH 7,0.

[000105] Experimentos foram realizados para determinar se modificar as condições de tamponamento poderia melhorar a resolução de rAAV-1 a partir de outras impurezas de processo. Experimentos de pequena escala foram realizadas utilizando um FPLC AKTAexplorer System (GE Healthcare, Piscataway, NJ), equipado com 5 colunas Tricorn de 1,2 mL (GE Healthcare) empacotadas a uma altura de leito de 6 cm com resina CFT, executados a uma taxa de fluxo de 150 cm / hr. Essas colunas foram avaliadas quanto à captura de vetor rAAV-1 versus ligação de albumina sérica bovina (BSA), uma impureza de processo de molécula pequena modelo, em diversos sistemas de tampão na presença ou ausência de PEG6000 a 5%.

[000106] rAAV-1 ou BSA foi injetado em pequenos volumes (<5% do volume total) na coluna CFT no sistema de tampão a ser testado, na presença ou ausência de PEG6000 a 5% (p / v). Pequenos volumes foram usados a fim de evitar a necessidade de troca de tampão das amostras. Produtos foram eluídos ao longo de um gradiente de PO4 a 500 mM. Ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES) a 50 mM foi usado para tamponar o sistema a pH = 6,50; e borato a 20 mM foi usado para tamponar o sistema a pH 9.0.

[000107] Os dados apresentados na Tabela 3 demonstram que ligação de vetor rAAV-1 à resina de apatita foi essencialmente a mesma em pH 6,5 ou pH 9,0 na presença de PEG6000 a 5% (p / v), enquanto ligação de BSA, a impureza de processo de molécula pequena de modelo, foi drasticamente reduzida em pH 9,0 na presença ou ausência de PEG6000 a 5% (w / v), como indicado pelos traçados espectrofotométricos (dados não mostrados). Análises adicionais da

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51/64 capacidade reduzida de BSA de se ligar à coluna de apatita em condições de carga de tampão básico (ou seja, pH = 9,0) por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) demonstraram que a maioria do BSA (~78%) estava presente no escoamento em condições tampão a pH 9,0, enquanto níveis adicionais de depuração ou redução de ligação de BSA poderíam ser alcançados durante as etapas de lavagem subsequentes (~19%), deixando apenas ~0,1% do BSA carregado à coluna realmente ligada à resina de apatita e coeluição com o vetor rAAV-1. Partículas de rAAV-1 foram estáveis a pH = 9,0, conforme indicado por nenhuma perda de infecciosidade ou diminuição do número de partículas resistentes a DNase (DRP) eluídas.

Tabela 3: Força Relativa de Ligação de rAAV-1 e BSA à Resina de APATITA a pH = 6,5 ou pH = 9,0, com ou sem PEG6000 a 5%

Condições de ligação	BSA	PEG6000 a 5% (p / v)
pH = 6,5	+-1-	+
pH = 6,5 + PEG6000 a 5% (p / v)	++	++++
pH = 9,0	+	+
pH = 9,00 + PEG6000 a 5% (p / v)	+	++++

[000108] Legenda: + = ligação fraca; ++ = ligação média; ++++ = ligação forte.

Exemplo 6: Efeito de Soro na Coleta da Cultura de rAAV-1 sobre Captura de rAAV-1 através de Cromatografia de Apatita na Presença de PEG [000109] Culturas de produção do vetor rAAV-1 ou correntes de alimentação contendo rAAV-1 a serem purificadas através dos métodos descritos aqui podem conter soro e proteínas do soro se as culturas de produção foram cultivadas em meio contendo soro. Embora a produção de vetor rAAV-1 que usa concentrações muito baixas de soro (por exemplo, 1% ou menos) (veja, por exemplo, Patente US n° 6.995.006) tenha sido descrita, concentração da cultura de produção ou corrente de alimentação como descrito no Exemplo 3 pode produzir uma corrente de alimentação que efetivamente contém 20% de soro e proteínas do soro como resultado da concentração a 20 vezes da coleta da cultura de

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52/64 produção. A fim de avaliar o efeito de componentes do soro sobre o desempenho da cromatografia de apatita, experimentos foram realizados em culturas de produção produzidas na presença ou ausência de soro, na presença ou ausência de PEG6000.

[000110] Dois modelos de culturas de produção de rAAV-1 foram usados para avaliar a capacidade da resina de apatita (CFT tipo I) por análise de escoamento tradicional em um total de quatro experimentos de carga de coluna. Em um experimento, as culturas de produção continham soro; e no segundo experimento, a cultura de produção não continha soro. Ambas correntes de alimentação foram testadas na presença de PEG6000 a 5% (p / v) ou na ausência de PEG. Correntes de alimentação foram típicas do processo de coleta, e foram sobrenadantes de cultura limpos que foram passados através de um filtro de troca iônica e concentrados em 20 vezes por filtragem de fluxo tangencial conforme descrito aqui. Colunas tipo I de CFT foram carregadas por mistura em linha a 1:1 da corrente de alimentação com um tampão de borato a pH = 9,0. O tampão continha ou 0% ou 10% (p / v) de PEG6000 (para alcançar uma concentração final de 5% (p / v) de PEG6000). Na medida em que as colunas foram carregadas, o escoamento foi coletado em uma série de frações que foram analisadas quanto ao produto por DRP-PCR. A capacidade funcional foi definida como o ponto em que a concentração do produto no fluxo de saída só alcançou 1 % da concentração que entra na coluna, após considerar a diluição em linha. Para cargas de coluna contendo PEG, o restante do processo de cromatografia foi então executado para avaliar a recuperação de vetor nas frações de eluição.

[000111] Os dados apresentados na Figura 3 demonstram que a adição de PEG6000 aumenta a capacidade da resina de apatita de ligação ao vetor rAAV-1 independente se soro estava presente na cultura de produção. Sem desejar estar ligado à teoria, o sobrenadante pós-TFF na presença de PEG preferivelmente liga rAAV-1 à resina de apatita sobre outras impurezas de processo através de uma interação aniônica às porções de fosfato que podem ser superadas (outcompeted) pela presença de fosfato no tampão de eluição. Em adição, ligação de rAAV-1

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53/64 à resina de apatita é ainda descriminada de impurezas de processo através da interação de metal que pode ser superada pela presença de sal. A ligação de rAAV-1 às porções de fosfato não é acionada principalmente por hidrofobicidade, visto que os tampões de captura e eluição são formulados para serem principalmente de natureza tônica (isto é, o tampão de eluição contém fosfato a 50 mM, em comparação a tampões de eluição que contêm fosfato a 150 mM ou usualmente superiores usados em composições de eluição ligadas por interações principalmente hidrofóbicas). Sob essas condições de baixa eluição de fosfato e alto teor de sal, vírus auxiliar adicional, DNA da célula hospedeira e outras proteínas de baixo peso molecular contidas no sobrenadante das culturas de produção seriam, se presentes, retidos na resina. Surpreendentemente, os dados demonstram que na presença de PEG6000, vetores rAAV-1 produzidos em meios contendo soro ou livres de soro demonstram uma capacidade de ligação para as resinas de apatita de pelo menos 1,2 x 10¹² DRP/mL (uma carga de 1 ml_) a mais do que 1,5 x 10¹⁴ DRP/mL de resina (150 mL). Na ausência de PEG6000 a 5% (p / v), a capacidade de ligação da resina de apatita para a coleta de TFF foi menos do que 2,4 x 10¹² DRP/mL para vetores produzidos em meios contendo soro e 7,2 x 10¹² de DRP/mL para vetores produzidos em meios livres de soro, visto que nenhum vetor rAAV-1 foi recuperado no eluato de CFT.

Exemplo 7: Purificação de rAAV-1 através de Cromatografia de Apatita [000112] A coluna Tipo I de CHT foi empacotada com NaCI a 2M e higienizada com NaOH a 1 M. Antes do carregamento, a coluna foi equilibrada com 6 volumes de coluna (CV) de borato a 20 mM (pH = 9) + PEG6000 a 5% (p/v). O concentrado da corrente de alimentação de TFF foi carregado através de um 3mm BioProcess Skid (GE Healthcare) em uma coluna de CHT de 923 ml (14 cm de diâmetro x 6 cm de altura de leito) preparada conforme anteriormente descrito a uma taxa de fluxo de 96 cm/hr. O concentrado da corrente de alimentação de TFF foi misturado em linha com um volume igual de um tampão de borato a 40 mM (pH = 9) + PEG6000 a 10% (p / v) para proporcionar uma

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54/64 concentração final de borato a 20 mM (pH = 9) + PEG6000 a 5% (p / v). [000113] Uma série de 4 lavagens sequenciais foi realizada para remover impurezas de processo ao mesmo tempo mantendo o vetor rAAV-1 na coluna. A Lavagem 1 (o segmento) foi realizada por mistura em linha de 5 CV de um borato a 20 mM a 50:50 (volume:volume) (pH = 9,0) + PEG6000 a 5% (p/v) : borato a 40 mM (pH = 9,0) + PEG6000 a 10% (p / v) para segmentar todas as linhas de carga com PEG6000. Em adição, verificou-se que essa etapa preferivelmente aumenta a afinidade de ligação dos vetores rAAV-1. A Lavagem 2 realizada com 15 CV de fosfato de potássio a 150 mM + borato a 20 mM (pH = 9) + PEG6000 a 5% (p / v) para remover a maior parte da albumina do soro e outras impurezas de processo de proteína de baixo peso molecular ao mesmo tempo mantendo rAAV-1 na coluna. A Lavagem 3 (Wll na Figura 5) foi realizada com 15 CV de borato a 20 mM (pH = 9) + PEG6000 a 5% (p/v) para remover qualquer fosfato residual de modo que o rAAV-1 permaneceu ligado à coluna uma vez que o PEG6000 foi removido. A Lavagem 4 (Wlll na Figura 5) foi realizada com 5 CV de tampão de HEPES a 20 mM (pH = 7,0) + 150 mM de NaCI para remover o PEG6000 e ajustar a concentração de sal, permitindo assim discriminação entre rAAV-1 e qualquer vírus auxiliar residual ou outras impurezas de processo, como contaminantes de proteína, que podem permanecer ligados à coluna.

[000114] O vetor rAAV-1 foi eluído a partir da coluna por 6 CV de um tampão de fosfato de potássio a 50 mM + HEPES a 20 mM (pH = 7,0) + NaCI a 150 mM. A figura 4 mostra um traço espectrofotométrico típico de absorbância de UV a 280 nm (A280) e condutividade para o procedimento cromatográfico de CHT I. A figura 5 mostra a pureza relativa de vetores rAAV eluídos a partir da resina de apatita.

Depuração de Glucano por Cromatografia de Apatita [000115] Glucanos são carboidratos similares à celulose que lixiviam no processo a partir do filtro profundo à base de celulose usado para colher partículas de rAAV de culturas de produção.

[000116] Glucanos a concentrações acima de ~1 ng/mL podem

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55/64 interferir com testes de lisado de amebócito do Limulus (LAL) padrão para contaminação por endotoxina bacteriana. Como demonstrado na Tabela 4^a abaixo, a coluna do Tipo I de CHT de apatita limpou ~2,5 logs de glucanos da cultura de produção. Sob as condições de tampão descritas aqui, a grande maioria dos glucanos estava presente no escoamento e não se ligou à coluna.

Tabela 4: Depuração de Glucano no Processo

Etapa de processamento	Concentração de glucano (ng/mL)	Quantidade total por lote (ng) (escala de 250 L)
Clarificação	10,4	2.600.000
TFF	136	1.541.016
Eluição de CHT	1,9	4.769
Pós HIC e SEC	0,2	662
Eluato de troca aniônica final	0,1	71

[000117] Amostras foram ensaiadas quanto a glucano usando um ensaio cromogênico cinético à base de LAL específico para glucanos (Glucatell ®, Cape Cod, MA).

Depuração de vírus auxiliar Ad5 por cromatografia de apatita [000118] Para confirmar que a cromatografia CHT limpou Ad5 da corrente de alimentação, um estudo de pico preliminar foi realizado usando corrente de alimentação do processo a montante final. Níveis de pico de Ad5 foram ajustados com base em dados obtidos do estudo de depuração viral fase I com resinas CFT II, e três razões de carga diferentes de corrente de alimentação foram usadas: 6,6 mL; 13,5 mL e 33 mL de corrente de alimentação pós-TFF por mL de resina CHT.

[000119] Os dados apresentados na Tabela 5, depuração de Ad5 por CHT foi comparável à depuração 4 de LRV demonstrou aproximadamente 4 logs de depuração viral de Ad5 e pareceu ser independente de volume de corrente de alimentação alimentada, dentro da faixa de 5 vezes avaliada. A baixa recuperação de Ad5 é consistente com dados anteriores indicando que, sob as condições de tampão utilizadas, o Ad5 se liga mais forte do que rAAV-1 à resina de apatita.

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Tabela 5: Unidades Infecciosas Totais de Ad5 em Frações de Coluna de

CHT

Fração de razão de carga	6,6 mL	13,5 mL	33 mL
Carga	9,0 x 10⁸	1,3x10⁹	9,0x10⁸
Escoamento + caça	<2,5x 10⁵	<3,6x10⁵	<6,9x10⁵
Lavagem com PO4	2,9 x 10⁶	2,7x10⁶	<2,6x10⁶
Lavagens II & III	3,6 x 10⁶	2,2x10⁶	2,8x10⁶
Eluição	< 6,9 x 10⁴	<6,9x10⁴	<3,5x10⁵
Valor de redução de log (LRV)	>4,1	>4,3	>3,4

[000120] Um total de 8 x 10⁹ partículas infecciosas de Ad5 (ou seja, partículas totais com um P:l de ~10) foram intensificadas em diferentes volumes de corrente de alimentação pós-TFF para execução em 1,2 mL de colunas de CHT. As colunas foram executadas a 100 cm/hr e frações foram coletadas para ensaio de vetor por DRP e Ad5 por ensaio de título infeccioso. Uma versão controlada por pico do ensaio de infectividade de Ad5 foi usada visto que altas concentrações de carga e amostras de eluição de CHT são conhecidas por interferir no ensaio à base de células. Depuração de Ad5 foi determinada como o valor de redução de Log (LRV), calculado como o logaritmo da quantidade total de Ad5 carregado dividida pela quantidade total de Ad5 recuperada na fração de eluição (Valor de Redução de Log).

Exemplo 8: Inativacão Térmica de Vírus Auxiliar Residual [000121] Uma etapa de inativação térmica foi realizada a fim de inativar e remover qualquer vírus auxiliar residual presente na eluato de CHT I. Para experimentos de menor escala, o eluato de CHT I foi dividido entre duas garrafas de 1 L PETG (Nalgene ®) e MgCh adicionado a uma concentração final de 2 mM a fim de aumentar a estabilidade do vetor rAAV-1. As garrafas foram incubadas em um banho de água a 53,5 °C com mistura até que a temperatura na garrafa alcançou aproximadamente 52 °C. As garrafas foram então esfriadas por transferência para um banho de água à temperatura ambiente e misturadas até que a temperatura na garrafa não era maior do que 5 °C acima da temperatura ambiente. A mistura morta por calor foi filtrada

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57/64 através de uma membrana de filtro de 0,22 μΜ Opticap® de 10,16 cm (4 polegadas) (Millipore Opticap® número de catálogo KVSC04HB3). De modo alternativo, para experimentos em maior escala, o eluato de CHT I foi inativado por calor em uma bolsa de bioprocessamento estéril, de único uso (bolsa de 5 L Custom Hyclone, película CX5-14) em uma plataforma de balanço controlada por temperatura com um ponto de ajuste de temperatura de 53 °C a uma velocidade de balanço de 40 RPM e um ângulo de mistura de 12° (panela aquecedora Wave de 20 L). O eluato de CHT I foi incubado na plataforma até que a temperatura alcançou 52 °C e em seguida mantida por mais 10 minutos. Para estabilizar o rAAV-1 durante aquecimento, MgCh foi carregado à concentração final de 2 mM. Após aquecimento, o produto foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm e mantido de um dia para o outro à temperatura ambiente para minimizar possíveis efeitos da temperatura sobre a subsequente coluna de interação hidrofóbica.

Exemplo 9: Captura de rAAV-1 através de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC) [000122] HIC é uma técnica para separar biomoléculas com base em diferenças em sua hidrofobicidade superficial. Como tal, HIC é considerada um método ortogonal para as outras etapas de purificação no processo de rAAV-1. Meios de HIC contêm ligantes hidrofóbicos como hidrocarbonetos de cadeia linear (por exemplo, propila (C3), butila (C4), hexila (C6) ou octila (C8)) ou hidrocarbonetos aromáticos (por exemplo, fenila). Em água pura, o efeito hidrofóbico é muito fraco para interação funcional entre o ligante e proteínas, ou entre as próprias proteínas. Entretanto, sais liotrópicos aumentam interações hidrofóbicas, e adicionar tais sais aciona a adsorção de proteínas a meios de HIC. Por essa razão, resinas de HIC são usualmente carregadas sob altas concentrações de sal e eluídas a concentrações de sal mais baixas. Cromatografia HIC com Tampões de Sulfato de Amônio [000123] Em resumo, uma coluna de butila de HIC de 170 ml (6 cm de diâmetro x 6 cm de altura de leito) (Toyopearl® Butyl 650M; Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA; número de catálogo 14702) foi

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58/64 higienizada com diversos volumes de coluna de NaOH a 0,5 M e equilibrada com uma mistura a 75:25 (volume:volume) de sulfato de amônio a 2 M + Bris Tris a 50 mM (pH = 7,0) : BisTris a 50 mM (pH = 7,0). O eluato de apatita de vetor rAAV-1 morto por calor foi carregado a uma taxa de 3,3 L/hr com mistura em linha a uma razão de 75:25 (volume : volume) de sulfato de amônio a 2 M + Bis Tris a 50 mM (pH = 7,0) : eluato de apatita de rAAV-1. A mistura em linha evita o risco de qualquer precipitação do vetor rAAV-1 pelo sulfato de amônio presente no tampão. A coluna foi lavada com um ou mais volumes de coluna de uma 75:25 (volume : volume) de um tampão de sulfato de amônio a 2 M + Bris Tris a 50 mM pH = 7,0 : Bris tris a 50 mM pH = 7,0 + Propileno Glicol a 10% (volume : volume) (EMD Biosciences). O propileno glicol nesse exemplo foi adicionado aos tampões para evidenciar o perfil de aluição, em comparação ao perfil de eluição amplo do tampão sem propileno glicol, embora seja opcional no processo. O vetor rAAV-1 foi eluído a partir da coluna com tampão de sulfato de amônio a 800 mM + Bis Tris a 50 mM (pH = 7,0) + propileno glicol a 4%. Às condições de eluição utilizadas, qualquer vírus auxiliar residual e proteínas presentes na carga permaneceríam ligados à coluna.

[000124] Refugo de processos de produção de rAAV-1 exigem rigorosa descontaminação antes do descarte, devido ao produto a ser um vetor viral e o uso de adenovírus vivo tipo 5 (Ad5), como um vírus auxiliar para a produção. Refugo líquido das operações de cromatografia é tipicamente descontaminado primeiro com alvejante em ponto de uso e, em seguida, adicionalmente descontaminado mantendo-se o pH elevado antes da neutralização e descarte. Sulfato de amônio presente nos tampões de HIC reage com alvejante e hidróxido de sódio para liberar cloro perigoso e gás de amônia, respectivamente. Portanto, uma consideração primordial para a otimização do processo da etapa de cromatografia HIC foi o desenvolvimento de um sistema de tampão adequado que poderia ser descontaminado de maneira segura por métodos conhecidos na técnica.

Triagem para Tampões Adequados para Ligação de rAAV-1 à Coluna de

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HIC [000125] Vetor rAAV-1 foi carregado em colunas em uma variedade de diferentes condições de tampão e eficiência de ligação relativa foi determinada através da medição da quantidade de vetor rAAV-1 presente na fração de escoamento (Tabela 6). Tampões avaliados incluíram tanto sais liotrópicos de alta concentração tradicionalmente utilizados com processos cromatográficos HIC e vários tampões de pH baixo, onde uma interação de modo misto (HIC / troca catiônica) poderia ocorrer. Ambas as resinas Tosoh Butyl 650M e EM D Phenyl resinas ligaram vetor em diversos dos tampões alternativos.

[000126] Tampões com altas concentrações de sal utilizados na cromatografia de interação hidrofóbica devem ser adicionalmente triados quanto a questões de viscosidade que podem resultar em altas contrapressões que podem ou limitar as taxas de fluxo ou causar problemas de mistura e o risco de precipitação do produto devido à cristalização de sal a temperaturas de armazenamento ou de operação dos tampões. Com base nos dados da Tabela 6 abaixo, e após consideração dos fatores descritos acima, citrato de sódio a 1 M, pH = 7,0 foi escolhido como o tampão ideal para ligação de vetores rAAV-1 aos meios cromatográficos de HIC.

Tabela 6: Triagem quanto à Ligação de AAV1 em Tampões Alternativos

Sistema de Tampão testado	Butyl 650M (% em escoamento)	EDM-Phenyl (% em escoamento)
Sulfato de Sódio a 1,1M (pH=7)	0%	0%
Citrato de Sódio a 1M (pH=7)	0%	0%
Fosfato de Potássio a 1,3M (pH=7)	3%	3%
NaCI a 2,9M, Citrato de Sódio a 50 mM (PH=4)	0%	28%
Glicina a 1M, Citrato de Sódio a 50 mM (PH=4)	4%	1%
Fosfato de Potássio a 50 mM (pH=4,5)	3%	NT
Citrato de Sódio a 50 mM (pH 4)	4%	NT
NaCI a 2,9M, Fosfato de Potássio a 50 mM (pH 4,5)	17%	NT

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60/64 [000127] Os experimentos foram realizados à temperatura ambiente em colunas Tricorn 5/50 (6 cm de altura de leito, 1,2 ml_ de volume de coluna) usando vetor rAAV-1 purificado. Colunas foram equilibradas com os tampões listados e ~2x10¹¹ DRP ou rAAV-1 foram carregados na coluna. rAAV-1 foi eluído por um gradiente linear de 20 CV de Bis Tris a 145 mM (pH = 7,0), propileno glicol a 10% (v / v). O escoamento foi coletado e analisado por análise de DRP quanto à fração de rAAV-1 aplicada à coluna que escoou ou não se ligou.

[000128] Caracterização adicional foi realizada quanto à depuração de impurezas de processo na coluna de HIC nos diversos tampões demonstrando boa ligação de rAAV-1 no experimento anterior. Os dados da Tabela 7 abaixo para ligação de contaminantes modelo demonstram que ambos os adenovírus e DNA, se presentes na corrente de alimentação, são efetivamente discriminados pela etapa cromatográfica HIC.

Tabela 7: Ligação Relativa de rAAV-1 Versus Impurezas de Processo Modelo em Diferentes Tampões de HIC

Sistema de Tampão	rAAV-1	Ad5	DNA
Sulfato de sódio a 0,1 M + tampão bis tris, pH=7,0	+	++	-
Sulfato de sódio a 0,8M, tampão bis tris, pH=7,0	+	++	0
Citrato de sódio a 1M, pH=7,0	+	++	0
NaCI a 2,9M (citrato de sódio a 50 mM para tampão a pH=4,0)	-	-	0

[000129] Legenda: 0 = material não vinculativo presente em escoamento; = aglutinante muito fraco;+ = aglutinante forte;++ = aglutinante mais forte.

[000130] Experimentos foram realizados à temperatura ambiente em colunas Tricorn 5/50 (6 cm de altura de leito, 1,2 mL de volume de coluna). Colunas foram equilibradas com os tampões listados e as amostras indicadas foram carregadas na coluna. Cada amostra foi eluída em um gradiente linear de 20 CV. As amostras foram coletadas e

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61/64 analisadas quanto ao material de carga relevante. Cromatografia HIC com Tampões de Citrato de Sódio [000131] O eluato de apatita de vetor rAAV-1 morto por calor foi subsequentemente carregado a uma coluna de HIC butila a fim de reduzir ainda mais quaisquer impurezas de processo residuais e como uma etapa de concentração e dessalinização. Uma coluna de HIC butila de 373 ml (6 cm de diâmetro x 8,9 cm de altura de leito) (Tosoh Biosciences Toyopearl ® Butyl 650M número de catálogo 14702) foi higienizada com diversos volumes de coluna de NaOH a 0,5 M e equilibrada com 5 CV de uma mistura a 75:25 (volume : volume) de Citrato a 1 M + fosfato de sódio a 20 mM : fosfato de sódio a 20 mM. O eluato de CHT I de vetor rAAV-1 morto por calor foi carregado a uma taxa de 106 cm / hr com mistura em linha a uma razão de 75:25 (volume: volume) de Citrato a 1 M + fosfato de sódio a 20 mM : eluato de CHT I. Mistura em linha evita o risco de qualquer precipitação do vetor rAAV-1. A coluna foi lavada com 5 CV de uma mistura a 75:25 (volume : volume) de citrato a 1 M + fosfato de sódio a 20 mM : tampão fosfato de sódio a 20 mM. O vetor rAAV-1 foi eluído da coluna com 6 CV de citrato a 0,35 M + fosfato de sódio a 20 mM. A coluna foi então lavada com 3,5 CV de tampão de fosfato de sódio a 20 mM. Esta lavagem com baixo teor de sal (sódio a 20 mM) elui uma fração de partículas de vetor rAAV-1 que são hidrofobicamente distintas em seu perfil de eluição das partículas de vetor rAAV-1 que eluem no tampão de eluição com maior teor de sal. De fato, se a fração eluída com baixo teor de sal foi isolado e reaplicado à coluna de HIC sob as condições descritas, essa população do vetor ainda eluiu apenas na fração com baixo teor de sal, indicando que a fração não foi o resultado de um avanço na capacidade da coluna. Análise de infectividade sugere que essa fração de rAAV-1 provavelmente representa uma população que compreende capsídeos vazios, capsídeos parcialmente desnaturados, material de capsídeo menos infeccioso e capsídeos parcialmente cheios. Portanto, essa observação pode levar a melhorias na separação de partículas de rAAV1 que são menos infecciosas e, portanto, menos desejáveis como

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62/64 material de produto. Nas condições de eluição utilizadas, qualquer vírus auxiliar residual e proteínas presentes na carga permaneceríam ligados à coluna e, assim, deveríam estar presentes na faixa de baixo teor de sal. Exemplo 10: Troca de Tampão por Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) [000132] Troca de buffer por cromatografia de exclusão por tamanho proporciona depuração de proteína adicional de proteínas dimensionadas para passarem através dos poros nas resinas, e é relativamente rápida em termos de tempo necessário para trocar os tampões. A troca de tampão realizada nessa etapa foi para garantir que o eluato de HIC da etapa anterior fosse trocado por um tampão apropriado para ligação de rAAV-1 para a etapa de cromatografia de troca aniônica final no processo. Uma resina de grau 200 prep. Amersham Superdex® de 3,2 L (14 cm de diâmetro x 21 cm de altura de leito) (Amersham / GE Healthcare, Piscataway, NJ, número de catálogo 17-1043-04) foi empacotada e preparada por higienização com NaCI a 2 M + NaOH a 1 M e equilibrada com 2,8 CV de NaCI a 20 mM + Tris a 20 mM (pH = 8,0). A eluição de HIC foi subdividida para processo sobre a SEC em três ciclos sequenciais de aproximadamente 400 ml cada, carga não superior a 12,5% do volume da coluna de SEC para cada ciclo. Os picos de produto (contido nos volumes vazios) dos três ciclos de SEC foram coletadas em uma única bolsa de bioprocessamento. O eluato de HIC foi carregado na coluna a uma taxa de fluxo de 49 cm / hr. A coluna foi segmentada e lavada com 1,4 CV de NaCI a 20 mM + Tris a 20 mM (pH = 8,0) e o vetor rAAV-1 presente no eluato de HIC estava presente no volume vazio da coluna. Após a coleta do volume vazio, tal como descrito, as segunda e terceira frações foram carregadas e coletadas na mesma coluna sequencialmente como anteriormente descrito para a primeira fração.

Exemplo 11: Agente Adventício (Depuração Viral) [000133] Como um processo opcional para limpar vírus adventícios que podem estar presentes como contaminantes traço e, assim, produzir um processo ortogonal comercial mente razoável, um filtro de depuração viral

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63/64 foi introduzido no processo. Exemplos de tais filtros são conhecidos na arte e incluem Millipore ® Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore ® VF (50 nm) e Asahi 70 nm. Um filtro de depuração viral Millipore Viresolve® NFR (filtro Millipore 4 Virosolve NFR Número de catálogo KZRV 04T C3) foi preparado de acordo com as instruções dos fabricantes, lavado com NaCI a 20 mM + Tris a 20 mM (pH = 8,0) e a eluição de SEC foi filtrada através da membrana. O filtro foi lavado com vários volumes de NaCI a 20 mM + Tris-HCI a 20 mM (pH 8,0) e agrupado com o eluato de SEC filtrado.

Exemplo 12: Cromatografia de Troca Aniônica [000134] A segunda etapa de captura por troca aniônica do vetor rAAV1 foi realizada como uma concentração final e etapa de polimento em uma resina Unosphere ® Q (Biorad, Hercules, CA). Uma coluna de 373 ml (8,9 cm de diâmetro x 6 cm de altura de leito) foi higienizada com diversos volumes de coluna de NaOH a 0,5 M e equilibrada com 7 CV de tampão NaCI a 20 mM + Tris a 20 mM (pH = 8,0). A fração de volume vazio de SEC ou opcionalmente o eluato filtrado viral foi carregado a uma taxa de 309 cm / hr. A coluna foi lavada 10 CV de NaCI a 60 mM. A força iônica da solução de lavagem foi escolhida para reter rAAV-1 ligado à resina ao mesmo tempo retirando quaisquer outras impurezas de processo, como glucanos, que podem ser introduzidas por lixiviação de diversos filtros utilizados nas etapas de purificação. O vetor rAAV-1 foi eluído da coluna com 6 CV de NaCI a 130 mM. A força iônica da eluição de sal de NaCI a 130 mM irá retirar rAAV-1 da coluna, enquanto quaisquer impurezas de processo traço residuais, como albumina do soro ou vírus auxiliar, permaneceríam ligadas.

[000135] A figura 6 compara o grau de purificação através das diversas etapas de processo por SDS-PAGE. Amostras de processo de uma coleta da cultura de produção representante foram executadas em um gel desnaturante / redutor de poliacrilamida a 10% e corado com laranja Sypro. Todas as amostras pós-coleta foram carregadas a 1 x 10¹⁰ DRP / raia. As duas amostras a montante antes da etapa de concentração de TFF (etapa de clarificação inicial e escoamento de troca aniônica

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64/64 (AEX)) só poderíam ser carregadas a 1 x 10⁹ DRP / raia devido a restrições de volume no gel. Beta-galactosidase (B-GAI) foi carregada a 50 ng/raia para avaliar a sensibilidade e consistência de coloração em todo o gel. As três proteínas do capsídeo de AAV1 (VPL, 2 e 3) são indicadas.

Exemplo 13: Recuperação Percentual de rAAV Durante Purificação [000136] Os dados apresentados na Figura 7 mostram a recuperação percentual de partículas de rAAV infecciosas após cada etapa de processo do esquema de purificação de uma cultura de produção representante de um vetor rAAV-1. A recuperação percentual foi calculada com base nos DRPs totais do vetor rAAV-1 recuperado a partir de cada etapa de processo, dividido pelo número total de DRPs carregados ou submetidos a essa etapa de purificação. Os dados demonstram que a cada etapa no processo de purificação, recuperações de cerca de 60% ou mais foram alcançados. Em numerosos experimentos, a faixa de recuperação de cada etapa de processo foi pelo menos 60% a 90%. Particularmente notável, a faixa de recuperação na etapa de captura (ou seja, a etapa de cromatografia de apatita) em experimentos individuais variou de 57% a mais de 90%. Além disso, a faixa de recuperação na etapa de HIC variou de 60% a 80%.

[000137] Embora a invenção acima tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, é evidente para aqueles versados na técnica que certas pequenas alterações e modificações serão praticadas. Portanto, a descrição e exemplos não devem ser interpretados no sentido de limitar o escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) de impurezas de processo em uma corrente de alimentação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) contatar uma corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV com um meio de cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG), em que as partículas de rAAV se ligam ao meio de cromatografia de apatita; e (b) eluir as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita com um tampão de eluição contendo menos do que 3% (p / v) de PEG.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cromatografia de apatita é hidroxiapatita cerâmica (CHT).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cromatografia de apatita é fluoroapatita cerâmica (CFT).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ligação específica do meio de cromatografia de apatita às partículas de rAAV é entre 10¹⁴ e 10¹⁶ partículas resistentes a DNase por mililitro (DRP/mL).
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de ligar as partículas de rAAV na corrente de alimentação eluída do meio de cromatografia de apatita a um meio cromatográfico aniônico.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV na etapa (a) é contatada com um meio de cromatografia de apatita na presença de polietileno glicol (PEG) e um tampão básico.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tampão básico está entre pH 7,6 e 10.

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8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tampão básico compreende borato.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio entre 5.000 (PEG5000) gramas por mol e 15.000 (PEG15000) gramas por mol.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV na etapa (a) é contatada com o meio de cromatografia de apatita na presença de entre 3% (p / v) e 10% (p / v) de PEG.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de lavar o meio de cromatografia de apatita com um tampão de lavagem depois que a corrente de alimentação é contatada com o meio de cromatografia de apatita, porém antes da eluição das partículas de rAAV do meio de cromatografia de apatita.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio de cromatografia de apatita é lavado uma ou mais vezes com um tampão de lavagem contendo 7,5% (p / v) de PEG e/ou um tampão de lavagem contendo 5% (p / v) de PEG.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de cromatografia de apatita é lavado ainda com um tampão de lavagem contendo menos do que 3% (p / v) de PEG e/ou um tampão de lavagem sem PEG.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão de lavagem compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em borato, ácido N-2hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico (HEPES) e Tris-HCI.
15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão de lavagem tem um pH básico.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tampão de lavagem compreende entre 100 e 500 mM de um fosfato.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado

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3/5 pelo fato de que o tampão de lavagem compreende entre 50 e 250 mM de NaCI.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de rAAV ligadas ao meio de cromatografia de apatita são eluídas com um tampão de eluição contendo baixas concentrações de PEG ou na ausência de PEG.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em borato, ácido N-2hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico (HEPES) e Tris-HCI a pH neutro.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição contém menos do que 3% (p / v) de PEG6000.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende ainda menos do que 100 mM de fosfato.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende ainda 50 mM de fosfato.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende ainda entre 50 e 250 mM de NaCI.
24. Método para isolar uma população de partículas de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) de impurezas de processo em uma corrente de alimentação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) contatar uma corrente de alimentação contendo as partículas de rAAV com um meio de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em um tampão com alto teor de sal, em que as partículas de rAAV e impurezas de processo se ligam ao meio de HIC; e (b) eluir as partículas de rAAV ligadas ao meio de HIC com um tampão com teor de sal médio.

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25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo de AAV de um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV14, AAV-15 e AAV-16.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o meio de HIC é selecionado a partir do grupo que consiste em resina Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EM D Fractogel Phenyl e Tosoh Has(butyl).
27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que tampão com alto teor de sal compreende entre 0,5 M e 2,0 M de citrato.
28. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o tampão com alto teor de sal também compreende entre 1 e 100 mM de fosfato.
29. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o tampão com teor de sal médio compreende menos do que 0,5 M de citrato.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tampão com teor de sal médio também compreende entre 1 e 100 mM de fosfato.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tampão com teor de sal médio compreende 0,2 M a 0,5 M de citrato.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que uma população de partículas de rAAV com capsídeos vazios, capsídeos parcialmente desnaturados, e/ou capsídeos parcialmente cheios é ligada ao meio de HIC após a eluição com o tampão com teor de sal médio.
33. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo de AAV de um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a

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5/5 partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV14, AAV-15 e AAV-16.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo de AAV de um sorotipo de capsídeo de AAV selecionado a partir do grupo que consiste em AAV-1, AAV-4, AAV-5, e AAV-8.