CN104232687A - 一种重组腺相关病毒rAAV载体的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组腺相关病毒载体(rAAV)的分离纯化方法，通过添加磷灰石色谱中的钙离子，有效地改善磷灰石色谱对rAAV载体的结合与分离能力，通过所述方法获得的病毒载体，其纯度与二次氯化铯离心方法相当，并具有体内外生物活性，该方法纯化的重组腺相关病毒载体有望用于基因治疗。

Description

一种重组腺相关病毒rAAV载体的分离纯化方法

技术领域：

本发明涉及用于基因治疗的重组腺相关病毒载体rAAV的分离纯化。

背景技术：

将目的基因导入靶细胞，纠正先天基因缺陷或者合成具有治疗作用的蛋白，从而达到预防或治疗疾病的目的，是基因治疗的重要手段。病毒载体因能介导外源基因长期表达而广受关注。目前较为常用病毒载体有逆转录病毒(Retrovirus)、慢病毒(Lentivirus)、腺病毒(Adenovirus)和腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)等[许瑞安等，《分子基因药物学》，北京大学出版社&北京大学医学出版社，2008，北京]。

AAV是无包膜单链DNA病毒，属于细小病毒家族，包含4.7kb的单链DNA基因，是复制依赖型病毒，要在与辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒与其同时存在时才能在宿主细胞中复制、包装，产生新的病毒颗粒。AAV具有广泛的宿主范围，在人类和其他动物体的感染是无症状的，并且没有致病性，可以转染***或者非***细胞的广泛哺乳动物细胞。AAV在体内具有特定的组织分布，并且在体内可以长期表达。目前，已发现其有13种亚型及120多种变型。不同的亚型在人体内具有不同的器官靶向性，不同亚型的AAV在不同器官中表达蛋白的效率是不同的，这就为基因治疗的器官或组织特异性表达提供了可能。研究表明，AAV1可以高效转导骨骼肌和其他组织，AAV2可以广泛转导脑、视网膜，AAV4可以特异性地转导中枢神经***的室管膜细胞，AAV7、8和9型病毒在肝脏中都能高效表达蛋白，同时AAV9在肺部和肌肉组织中表达蛋白的效率最高[Dirk Kuck等,J Virol Meth,2007,140:17-24。Neal S等,N Engl J Med,2004,350:586-97]。因此，就有了特定的血清型治疗特定疾病的临床研究。

重组腺相关病毒(rAAV)载体的生产，需要质粒DNA、宿主细胞和培养基等作为原材料，因此，采用合适的分离、纯化方法，除去rAAV的细胞裂解液中可能存在的质粒DNA，宿主细胞蛋白，培养基成分，牛血清蛋白以及酶等杂质，得到纯度较高的病毒载体，才能用于基因治疗的试验研究。

目前，色谱方法纯化rAAV载体是保证临床用载体纯化的重要方法，已有不少的研究报道，主要包括阴、阳离子交换色谱、疏水色谱以及亲和色谱等。为了提高产品纯度，通常采取几种色谱联合应用或者色谱与密度梯度离心方式相互结合。如碘克沙醇梯度离心与肝素POROS HE，或者与阳离子交换色谱UNO-S1联合分离rAAV2[Zolotukhin,S等，Methods,2002,28(2):158-167]，阳离子色谱POROS HS与阴离子色谱Q Sepharosexl或者POROS HQ联合分离rAAV2[US 2007/0243615A1]。阳离子色谱POROS HS分离rAAV2，rAAV6，阴离子树脂POROS HQ分离rAAV1，rAAV8，阴离子POROS PI分离rAAV5等。

陶瓷羟磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT)是一种由磷酸钙构成的无机盐色谱，以良好的流速、高结合能力，价格低廉等优点，广泛用于蛋白质的工业分离。CHT主要通过基质中的磷酸根基团或者钙离子的亲和性，与蛋白质相互作用，分离蛋白质[HJerten et al.,1956]。目前有研究报道，CHT色谱可以用于分离rAAV9[Jingmin Zhou，2011]以及rAAV载体[CN 102803478A]。以上报道分离的rAAV载体，均系通过溶液中添加PEG作为辅助成分，从而增加CHT色谱对rAAV的结合能力和纯度。但是，实验研究发现，加入PEG组成之后，溶液、管路会变得黏滑，树脂不容易进一步再生，操作不当，极易对进一步纯化造成困难，因而需要寻找更加合适的附加剂，辅助CHT色谱纯化rAAV载体。

在保持载体活性情况下，最大限度地兼顾载体的纯度及得率，是rAAV载体纯化工艺的巨大挑战。

为了更好地解决上述问题，本实验室探讨了利用钙离子替代PEG用于rAAV载体的纯化，发现在钙离子存在的条件下，磷灰石CHT色谱能够在含有AAV的细胞裂解液中捕获rAAV颗粒，实现rAAV从CHT色谱中的分离纯化。

本发明所述将rAAV载体细胞裂解液或细胞培养上清液，经Bezonase核酸内切酶处理、在金属钙离子存在的情况下，采用磷灰石色谱(CHT)，或陶瓷氟磷灰石(CHF)色谱，结合细胞裂解液或者上清液中的rAAV载体，再经含钙离子的洗涤液洗涤和不含钙离子的洗脱液洗脱，然后经阴离子色谱进一步分离纯化rAAV的方法，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供从细胞裂解液或细胞培养上清液中分离纯化rAAV载体的方法，包括以下步骤：

(1)将要分离的细胞裂解液，经过核酸内切酶处理，离心后的上清液用调节成不同钙离子浓度的结合缓冲液溶液，初步除去部分杂蛋白；

(2)经过钙离子处理澄清的细胞裂解液部分，流经CHT色谱时，rAAV与CHT色谱结合；

(3)rAAV与CHT色谱结合后，再经含钙离子的洗涤缓冲溶液和不含钙离子的洗脱缓冲溶液洗脱；

(4)然后经阴离子色谱如ANX-sepherose，POROS HQ，DEAE-sepherose或者Q-sepherose等进一步分离纯化rAAV。

其中：

与CHT结合及洗涤缓冲溶液所用的钙离子浓度选自1ppm到500ppm的任意一个；与CHT结合溶液、洗涤缓冲溶液、洗脱缓冲溶液的pH值可在pH6.5到pH10.0的范围，优选中性值pH7.0；所用的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液，可以选用磷酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)或者相互组合的缓冲溶液；所用结合溶液、洗涤、洗脱缓冲溶液还包含1-2000mM的NaCl。

本发明所述rAAV载体的分离方法可适用于rAAV1，rAAV2，rAAV3，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV8，rAAV9，rAAV10，rAAV11，rAAV12，rAAV13，rAAV14，rAAV15，rAAV16，rAAV17，rAAV18，rAAV19，rAAV20等载体的纯化。

附图说明：

图1.不同浓度钙离子作用下的CHT色谱分离rAAV9

其中：A-rAAV2基因组滴度回收率的百分比(n＝3,x±s.)

B-rAAV2蛋白量回收率的百分比(n＝3,x±s.)

**P<0.05-无钙组vs钙离子组

图2.rAAV9与CHT色谱的结合能力

其中：A-CHT分离rAAV9色谱图

B-基因组拷贝数测定(n＝3,x±s.)

图3.SDS/PAGE银染鉴别rAAV9纯度

其中：A-CHT色谱方法纯化

B-CsCl方法纯化

图4.纯化rAAV9-kal的活性测定

其中：A-体外转染rAAV9-kal NCI-H446细胞的kallistatin蛋白表达

(n＝3,x±s.)

B-小鼠体内转染rAAV9-kal裸鼠2周后血清中的kallistatin蛋白表达

(n＝3,x±s.)

实施方案：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》 腺相关病毒载体的制备

根据[Wright,J.F.等，Mol.Ther.12,171–178.]方法，HEK293细胞(ATCC)培养于含有青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)(Gibico)、10％胎牛血清(FBS,BI)的DMEM(Gibico)培养基中，37℃，5％的CO2培养，当细胞汇合度达到60％-70％时，胰酶消化，按照2.0E7-3.0E7的细胞数量，接种于转瓶(roller bottle)中，转瓶培养箱，37℃，5％的CO2培养，当细胞汇合度达到60％-70％的时候，包装质粒pH29，腺病毒复制功能质粒pfd6以及目的基因载体质粒，三种质粒按1:1:1的量，磷酸钙转染]到HEK293细胞[许瑞安、陈凌、肖卫东主编《分子基因药物学》北京大学出版社&北京大学医学出版社2008，北京]，次日细胞换液，换成不含血清的DMEM培养基，培养72小时，收获细胞。

收获的细胞，采用4000rpm/min，20℃，离心10min，得到细胞沉淀部分以及上清液部分，分别处理。细胞沉淀部分加入30ml/ruller的200mM NaCl超声破碎(NBRANSON)，加入benzonase(Sigma)至终浓度为50U/ml，37℃水浴60min，8000rpm/min，4℃离心30min，得到细胞裂解液。

《实施例2》 重组腺相关病毒载体的氯化铯超速离心法分离纯化

采用优化的氯化铯(CsCl)超速离心法[E.Ayuso，2010]，将澄清的细胞裂解液加入40％PEG 8000/2.5M NaCl至终浓度为8％PEG 8000/0.5MNaCl，4℃放置2小时，4,000rpm/min离心30分钟，保留沉淀，细胞沉淀部分，按照100ml细胞裂解液加入20mlCsCl轻液(1.37g/cm³)溶解，然后覆盖到CsCl重液(1.5g/cm³)上层，采用Beckman超速离心机的T70i转子，20℃，18,000rpm/min超速离心24h。离心结束，收集载体条带部分，再进行第二次CsCl超速离心，采用Beckman超速离心机的NTI65转子，20℃，50,000rpm/min超速离心20h，注射器吸取载体部分，放入透析袋，PBS透析3次，最后一次透析液为含有0.01％的F-68[CN 101018858A]的PBS。滴度测定之后，制成1×10¹³V.G./ml，0.2um过滤，无菌分装-80℃保存备用。

《实施例3》 不同浓度钙离子对CHT与rAAV结合的影响

细胞裂解溶液，采用1M CaCl₂调整终浓度至1200,960，720,480,240,120ppm，室温放置2小时，8000rpm/min，4℃离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0.2um滤膜过滤后用于色谱纯化。将50mM NaCl，5mM NaPO₄，pH7.0的平衡缓冲溶液加入1MCaCl₂调整终浓度为300、240、180、120、60、30ppm平衡CHT色谱10个柱体积(column volume,CV)，之后，30ml澄清的细胞裂解液上样，结束之后采用平衡缓冲溶液洗涤10CV，然后180mM NaCl的20mM NaPO4(pH7.0)洗脱3CV，分别收集穿透、洗涤及洗脱峰，测定穿透、洗涤及洗脱峰中不同浓度钙离子条件下rAAV基因组滴度及蛋白质的回收率(图1)，结果发现，加入钙离子的病毒滴度收率均在90％以上，不同浓度的钙离子对载体的产率没有显著性差异，但是与不加入钙离子的溶液相比，则有显著性差异。实验结果还表明，高浓度的钙离子可能与溶液中存在的磷酸根离子结合，生成磷酸钙沉淀，可能会导致仪器管路的堵塞，因此30ppm的钙离子浓度足够用于载体与树脂的结合。

《实施例4》 不同pH值细胞裂解液对CHT与rAAV结合的影响

细胞裂解溶液，采用1M CaCl₂调整终浓度至Ca²120ppm，室温放置2小时，8000rpm/min，4℃离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0.2um滤膜过滤后用于色谱纯化。将50mM NaCl，30ppm Ca²⁺的5mM NaPO₄的平衡缓冲溶液以及稀释的细胞裂解液调整至pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，平衡缓冲溶液至10个柱体积(column volume,CV)，之后，30ml澄清的细胞裂解液A泵上样，上样结束之后采用平衡缓冲溶液洗涤10CV，然后180mM NaCl的20mM NaPO4(pH7.0)洗脱3CV，收集洗脱峰。测定不同pH条件下洗脱液rAAV9载体滴度及蛋白得率(表1)，结果表明，不同pH值对载体的产率没有显著性差异，但是，过高pH值同样有生成磷酸钙沉淀的风险。因此，本发明确定选择平衡细胞裂解液pH值为中性的7.0作为CHT分离rAAV的条件。

表.1.不同pH条件下rAAV9洗脱液得率(n＝3，x±s.)

《实施例5》 CHT与rAAV结合能力测定

细胞裂解溶液，采用1M CaCl₂调整终浓度至120ppm，室温放置2小时，8000rpm/min，4℃离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0.2um滤膜过滤后用于色谱纯化。采用50mM NaCl，5mM NaPO₄，30ppm Ca²⁺，pH7.0的平衡缓冲溶液平衡4ml的CHT树脂达10个CV，381ml澄清的细胞裂解液(蛋白含量45.6mg)A泵上样，穿透峰每10CV取样一次，上样结束，平衡缓冲溶液洗涤10CV，然后180mMNaCl的20mM NaPO4(pH7.0)洗脱3CV，收集洗脱峰。由图2A可见，在该分离条件下，可以得到尖锐的载体洗脱峰。通过定量PCR法测定样品、穿透峰、洗涤峰、洗脱峰中载体基因组拷贝数表明，在穿透峰、洗涤峰中，基本未检测到载体滴度，仅在洗脱液中可以明显检测到载体滴度(见图2B)。样品的基因组拷贝数为1.61×10¹⁴G.C.，4ml的CHT色谱获得基因组拷贝数为1.45×10¹⁴G.C的病毒载体，载体得率达90％。换算每毫升的CHT色谱，可以结合3.6E13G.C.以上的病毒载体。

《实施例6》 rAAV9载体纯化工艺流程的确定

细胞裂解溶液，采用1M CaCl₂调整终浓度至120ppm，室温放置2小时，8000rpm/min，4℃离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0.2um滤膜过滤后用于色谱纯化。陶土磷灰石色谱CHT(I型，bio-rad)采用含有50mM NaCl，30ppmCa²⁺的5mM NaPO₄(pH7.0)，2ml/min平衡10CV，澄清的细胞裂解液A泵上样，上样结束之后，采用平衡缓冲溶液洗涤10CV，180mM NaCl的20mM NaPO4(pH7.0)洗脱3CV，收集洗脱峰。色谱柱然后使用pH6.5的400mM的磷酸盐溶液再生，1M NaOH在线消毒。将CHT洗脱液按照阴离子ANX色谱方法进一步纯化。CHT洗脱液稀释一倍，调节pH至8.0，样品1ml/min上样于含有100mM NaCl的20mM Tris平衡过的ANX色谱柱，上样结束，采用平衡液洗涤5CV，再用100-500mM NaCl梯度洗脱，在180-200mMNaCl时获得病毒载体吸收峰，收集洗脱峰，D-PBS(pH7.4)透析2次，最后一次透析液为含有5％D-山梨醇，0.0001％F-68[CN 101018858A]的D-PBS溶液。本发明涉及rAAV9载体纯化的工艺流程如下所示。

《实施例7》 rAAV载体纯度的测定

rAAV载体经过CHT色谱纯化，再经过ANX色谱分离，得到的纯度由SDS-PAGE/银染(Applied Biosystems,Forster city,CA)检测，纯度测定结果(见图3)，可见本发明CHT色谱方法获得的载体纯度与CsCl获得载体纯度没有明显差异。

本发明提供的色谱及氯化铯纯化方法获得的rAAV9-kal载体，采用ELISA方法，对残余的宿主细胞蛋白(HEK293细胞)和Benzonase酶进行含量测定，用定量PCR方法，对残余的宿主细胞DNA和质粒DNA进行测定(表2.)，结果显示，本发明所提供色谱方法纯化得到的病毒载体，其纯度与二次氯化铯方法获得的载体纯度相当。

表2.rAAV9-KAL载体纯度分析(n＝3，x±s.)

《实施例8》 纯化rAAV-Kal体外活性检测

采用ELASA试剂盒检测rAAV9-kal蛋白表达：汇合度为60％-70％的NCI-H446细胞，胰酶消化后，按照3×10³/孔细胞密度，100ul的体积接种于96孔板密度，8小时后加入对应10ul的MOI(Multiplicity of Infection)为10000的色谱以及氯化铯纯化获得的rAAV9-kal载体，3个复孔，培养72小时，收集细胞培养上清，采用Human SerpinA4/Kallistatin DuoSet的ELISA(R&D DY1669)试剂盒标准操作方法，测定细胞上清液中的kallistatin蛋白表达情况。即用稀释捕获抗体(鼠抗人kallistatin)包被96孔板，过夜，洗板，样品稀释液封闭，洗板，然后加入细胞上清液样品以及标准样品封闭2h，洗板后加入检测抗体封闭，洗板，加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-HRP)，四甲基联苯胺即TMB显色，计算蛋白表达情况。结果见(图4A)，rAAV9-kal在MOI为10000能有效地转染NCI-H446细胞，并且分泌kallistatin蛋白。

《实施例9》 纯化rAAV-Kal体内活性检测

NCI-H446细胞，胰酶消化后，按照3×10⁴/只的剂量接种于裸鼠皮下，7天后，肿瘤体积增殖到50mm3时，随机分组，按照浓度生理盐水组，腹腔注射色谱以及氯化铯纯化的rAAV9-kal(1.0×10¹²V.G./只)给药浓度，此后，每周尾静脉取血，ELISA测定kallistatin蛋白表达量(图4B)，结果表明，CHT色谱与氯化铯纯化的rAAV9-Kal，均能在裸鼠体内有效转导，蛋白表达情况没有显著性差异，但是PBS组的裸鼠不能表达kallistatin蛋白。

Claims (8)

1.一种重组腺相关病毒载体rAAV的分离纯化方法，其特征是，所述方法是将rAAV载体细胞裂解液或细胞培养上清液经核酸内切酶处理，在钙离子存在下，采用磷灰石色谱与经缓冲液处理的细胞裂解液或者上清液中的rAAV载体结合，再经含钙离子的洗涤缓冲溶液洗涤和不含钙离子的洗脱缓冲溶液洗脱，然后经阴离子色谱进一步分离纯化rAAV。

2.权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的磷灰石色谱，包含陶瓷羟基磷灰石CHT和陶瓷氟磷灰石CHF色谱。

3.权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的结合缓冲溶液和洗涤缓冲溶液均包含钙离子。

4.权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的结合缓冲溶液和洗涤缓冲溶液的钙离子浓度选自1ppm至500ppm。

5.权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液pH值可以在6.5-10.0范围，优选中性pH7.0。

6.权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液选自磷酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷Tris和羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes缓冲溶液，或者相互组合的缓冲溶液。

7.权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的阴离子色谱可以是ANX-sepherose、POROS HQ、DEAE-sepherose或者Q-sepherose。

8.权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中可适用的rAAV载体包括：rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAV14、rAAV15、rAAV16、rAAV17、rAAV18、rAAV19、rAAV20等载体的纯化。