TW202005694A - 自混合物製備多肽之系統及方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示案之實施例係關於自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法。該方法可包括使該混合物與包括多個層析區之疏水性相互作用層析(HIC)裝置接觸。該方法可進一步包括使該目標多肽穿過該HIC裝置之至少第一區及第二區之出口。包括該目標多肽之該混合物在第一區中之滯留時間可與一或多個移動相在該第二區中之滯留時間大致相同。

Description

自混合物製備多肽之系統及方法
本揭示案概言之係關於用於製備多肽之方法。更具體而言，本揭示案係關於使用層析方法自混合物製備多肽之方法。
作為藥物產品製備製程之一部分，可實施諸如疏水性相互作用層析(HIC)、親和層析及諸如此類等層析。在一些情況下，層析可尤其用於製備包括多肽之藥物產品。然而，標準分批HIC步驟或其他分批層析步驟之設備、材料、製備時間及運行時間可導致藥物產品製備製程之成本增加或效率降低。具體而言，運行HIC或其他層析分離製程中之每一階段所需之時間、所用緩衝液及/或分離介質之量及該製程之任何非自動化態樣可降低藥物產品製備之效率。
本文所揭示之方法及系統可改良多肽製備方法之效率及/或生產率。本文所揭示之方法及系統亦可改良藥物產品製備方法之效率及/或生產率，且可解決上文所鑑別之一或多種問題。
本揭示案之實施例可係關於自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法。該方法可包括使包括該目標多肽之該混合物與HIC裝置之第一區接觸，使移動相與該HIC裝置之第二區接觸，及使該目標多肽穿過該HIC裝置之該第一區及該第二區之出口，其中該第一區及該第二區各自可具有一或多個層析管柱及一出口。在一些實施例中，包括該目標多肽之該混合物在該第一區中之滯留時間可經構形以與該等移動相在該第二區中之滯留時間大致相同。
在一些實施例中，該目標多肽可為單株抗體。該目標多肽可以大於或等於50 g/L∙小時之生產率來製備。或者或另外，該等移動相可包括平衡緩衝液及洗滌緩衝液。在一些實施例中，本揭示案之方法可進一步包括將包括該目標多肽之流出物自該HIC裝置之該第一區傳送至該HIC裝置之該第二區。在一些實施例中，使該等移動相與該HIC裝置之該第二區接觸可包括使洗滌緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸，及在使該洗滌緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸之後，使該第二區再生。在一些實施例中，使該第二區再生可包括使水與該HIC裝置之該第二區接觸，使鹼性溶液與該HIC裝置之該第二區接觸，使醇溶液與該HIC裝置之該第二區接觸及使平衡緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸。在洗滌緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸之後，該目標多肽可穿過該HIC裝置之該第二區之出口。在一些實施例中，滯留溶液之紫外吸收、導電率或pH中之一或多者可在該第一區或該第二區之出口處量測。該第一區或該第二區可包括一個以上之層析管柱。在一些實施例中，該HIC裝置可進一步包括具有一層析管柱及一出口之第三區。在一些實施例中，該方法可進一步包括在該第三區上實施再生循環，其中實施該再生循環包括使移動相與該第三區接觸，其中該再生循環之持續時間經構形以與包括該目標多肽之該混合物在該第一區中之滯留時間大致相同。
在本揭示案之一些實施例中，自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法可包括將包括該目標多肽之該混合物傳送至HIC裝置中之複數個層析管柱中之第一管柱，將包括該目標多肽之流出物自該複數個管柱中之該第一管柱傳送至第二管柱，將一或多個移動相傳送至複數個管柱中之第三管柱，及使該目標多肽穿過該複數個管柱中之每一者之出口，其中該複數個管柱中之每一者包括可與該複數個管柱中之另一管柱連接之出口，且包括該目標多肽之該混合物在該第一管柱及該第二管柱中之滯留時間總和與該一或多個移動相在該第三管柱中之滯留時間總和實質上相同。
在一些實施例中，該方法可進一步包括將一或多個移動相傳送至該複數個管柱中之每一者。在一些實施例中，將一或多個移動相傳送至管柱可包括將洗滌緩衝液傳送至該管柱，且在將洗滌緩衝液傳送至該管柱之後，使該管柱再生，其中使該管柱再生包括將水、鹼性溶液、醇溶液或平衡緩衝液傳送至該管柱。在一些實施例中，使目標多肽穿過管柱出口之步驟可在將洗滌緩衝液傳送至該管柱之後發生。在一些實施例中，滯留溶液之紫外吸收、導電率或pH中之一或多者係在該第一管柱或該第二管柱之出口處量測。在一些實施例中，該方法可包括以大於或等於50 g/L∙小時之生產率製備該目標多肽。在其他實施例中，該HIC裝置可包括四個管柱，且包括該目標多肽之該混合物在該一管柱及該第二管柱中之滯留時間總和可與該第三管柱及第四管柱之再生時間總和實質上相同。
本揭示案之其他實施例可包括使用複數個層析管柱製備抗體之方法，其中該複數個層析管柱中之每一者包括疏水性相互作用介質。該方法可包括：在第一階段中，將一定量之包括該抗體之混合物裝載至該複數個管柱中之第一管柱中，將一定量之該混合物經由該第一管柱裝載至該複數個管柱中之第二管柱中，且在該複數個管柱中之第三管柱中實施包括洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之非裝載步驟；在第二階段中，將一定量之包括該抗體之該混合物裝載至該第二管柱中，將一定量之該混合物經由該第二管柱裝載至該第三管柱中，且在該第一管柱中實施包括洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之非裝載步驟；且在第三階段中，將一定量之包括該抗體之該混合物裝載至該第三管柱中，將一定量之該混合物經由該第二管柱裝載至該第三管柱中，且在該第二管柱中實施包括洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之非裝載步驟。
在一些實施例中，該方法可進一步包括在循環中連續重複該等第一、第二及第三階段，其中每一階段包括同時實施裝載及非裝載步驟。在一些實施例中，該等裝載步驟中之一者之持續時間經構形以與非裝載步驟之持續時間大致相同。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2018年7月2日提出申請之美國臨時申請案第62/693,024號之優先權，該臨時申請案係以全文引用的方式併入本文中。
本揭示案並不限於本文所揭示之特定組合物、調配物、材料製造商、藥物產品、器件、系統、實驗條件或具體方法，此乃因在熟習此項技術者之權限內許多變化形式係可能的。本文所用術語僅出於闡述特定實施例之目的，且不意欲具有限制性。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有熟習本揭示案所屬領域技術者所通常理解之相同含義。儘管在本揭示案之實踐或測試中可使用與本文所述之彼等方法及材料類似或等效之任何方法及材料，但現在闡述特定方法及。所提及之所有出版物均係以引用的方式併入本文中。
如本文所用之術語「接觸」係指兩個或更多個表面、溶液或化合物之會合、連接、界面或其他物理相互作用。儘管在本文中可將具體流體闡述為傳送至區域中、自區域傳送、傳送至區域或傳送穿過區域，但應理解，流體必定會接觸其所傳送至其中、自其傳送、傳送至其或傳送穿過其中之任何區域。類似地，將流體或組分引入至區域將構成該流體或組分接觸該區域。
如本文所用之術語「多肽」係指具有約20個以上之經由醯胺鍵共價連接之胺基酸之任何胺基酸聚合物。蛋白質含有一或多個胺基酸聚合物鏈(例如，多肽)。因此，多肽可為蛋白質，且蛋白質可含有多個多肽以形成單一功能生物分子。
轉譯後修飾可進一步修飾或改變多肽之結構。舉例而言，二硫橋(例如 ，半胱胺酸殘基之間的S-S鍵)可存在於一些蛋白質中。一些二硫橋對多肽、免疫球蛋白、蛋白質、輔因子、受質及諸如此類之適當結構、功能及相互作用至關重要。除二硫鍵形成以外，蛋白質亦可經受其他轉譯後修飾。彼等修飾包括脂化(例如，肉豆蔻醯基化、棕櫚醯基化、法尼醯基化、香葉醯香葉醯化及多醣磷脂肌醇(GPI)錨定物形成)、烷基化(例如 ，甲基化)、醯化、醯胺化、醣基化(例如 ，在精胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、羥離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及/或色胺酸處添加醣基)及磷酸化(亦即 ，將磷酸酯基添加至絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及/或組胺酸)。轉譯後修飾可影響疏水性、靜電表面性質或決定多肽參與之表面對表面相互作用之其他性質。
如本文所用，術語「蛋白質」包括生物治療性蛋白質、研究或療法中所用之重組蛋白質、捕獲蛋白質及其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白質、抗體、單株抗體、人類抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體樣分子、奈米抗體、重組抗體嵌合體、細胞介素、趨化介素、肽激素及諸如此類。所關注蛋白質(POI)可包括期望經分離、純化或以其他方式製備之任一多肽或蛋白質。POI可包括目標多肽或由細胞產生之其他多肽，包括抗體。
如本文所用之術語「抗體」包括免疫球蛋白，其包含四條多肽鏈：兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，其由二硫鍵互連。通常，抗體之分子量超過100 kDa，諸如介於130 kDa與200 kDa之間，諸如約140 kDa、145 kDa、150 kDa、155 kDa或160 kDa。每一重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。該重鏈恆定區包含三個結構域CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH及VL區可進一步細分成具有超變性之區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端以以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (重鏈CDR可縮寫為HCDR1、HCDR2及HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1、LCDR2及LCDR3)。
一類稱為(例如)免疫球蛋白G (IgG)之免疫球蛋白常見於人類血清中，且包含四條多肽鏈：兩條輕鏈及兩條重鏈。每一輕鏈經由一個胱胺酸二硫鍵連接至一條重鏈，且兩條重鏈經由兩個胱胺酸二硫鍵彼此結合。其他類別之人類免疫球蛋白包括IgA、IgM、IgD及IgE。在IgG之情形下，存在四種亞類：IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4。每一亞類之其恆定區不同，且因此可具有不同效應功能。在本文所述之一些實施例中，POI可包含包括IgG之目標多肽。在至少一個實施例中，目標多肽包含IgG 4。
如本文所用之術語「抗體」亦包括全抗體分子之抗原結合片段。如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及諸如此類包括任何天然、可以酶方式獲得、合成或遺傳工程化多肽或醣蛋白，其特異性結合抗原以形成複合物。可使用任何適宜標準技術自(例如 )全抗體分子衍生抗體之抗原結合片段，該等技術諸如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變結構域及視情況恆定結構域之DNA之操縱及表現之重組遺傳工程技術。此DNA已知及/或可容易地自(例如)商業來源、DNA文庫(包括(例如)噬菌體-抗體文庫)獲得，或可合成。DNA可以化學方式或藉由使用分子生物學技術來定序及操縱，例如將一或多個可變及/或恆定結構域排列成適宜構形，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或缺失胺基酸等。
目標多肽可使用基於重組細胞之產生系統來產生，諸如昆蟲桿狀病毒系統、酵母系統(例如 ，畢赤酵母屬(Pichia sp.))、哺乳動物系統(例如 ，CHO細胞及CHO衍生物(如CHO-K1細胞))。術語「細胞」包括適於表現重組核酸序列之任一細胞。細胞包括以下之彼等細胞：原核生物及真核生物(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌 (E. coli )、芽孢桿菌屬 (Bacillus spp.)、鏈黴菌屬 (Streptomyces spp.)等之菌株)、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如 ，啤酒酵母 (S. cerevisiae )、粟酒裂殖酵母 (S. pombe )、巴斯德畢赤酵母 (P. pastoris )、甲醇畢赤酵母 (P. methanolica )等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如 ，SF-9、SF-21、受桿狀病毒感染之昆蟲細胞、粉紋夜蛾 (Trichoplusiani )等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物(諸如雜交瘤或四源雜交瘤)。在一些實施例中，細胞係人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施例中，細胞係真核的且係選自以下細胞：CHO (例如 ，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS (例如 ，COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎臟(例如 ，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60 (例如 ，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、賽特利細胞(Sertoli cell)、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及源自以上所提及細胞之細胞株。在一些實施例中，細胞包含一或多種病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如，PER.C6™細胞)。由細胞所產生之除目標多肽或POI以外之蛋白質或多肽可稱為宿主細胞蛋白質(HCP)。當在宿主細胞中製造POI及/或自宿主細胞純化POI時，可將HCP表徵為與產物及製程相關之污染物或雜質。
一些HCP (例如 ，酶)可與POI (例如 ，目標多肽)一起共純化，且可影響包括該等POI之混合物、調配物或藥物產品之組分。舉例而言，一些HCP之存在可影響產品穩定性、減少藥物產品之儲放壽命或甚至導致產品不能滿足藥典規定或監管微粒物質規格(例如 ，美國食品藥品管理局(U.S. Food & Drug Administration)規範)。作為另一實例，一些HCP可引起臨床效應，諸如投與時之免疫原性反應。雖然HIC或其他層析單獨或在組合時可用於自混合物、調配物或藥物產品純化及/或分離POI且去除HCP，由此降低HCP對藥物產品之潛在效應，但添加HIC或親和層析步驟需要增加設備、材料(例如 ，疏水性相互作用介質)及製備。此相當於增加時間、資源、實驗及成本。因此，期望具有一種進行層析製程之有效方法以將POI (例如，目標多肽)與一或多種共純化之HCP或其他雜質分離。
如本文所用之術語「層析」係指藉由使混合物穿過介質、從而使得該混合物之組分以不同速率穿過該介質來分離該混合物之組分之任一製程，其包括(但不限於)管柱層析、平面層析、薄層層析、置換層析、氣相層析、親和層析、離子交換層析、尺寸排除層析、反相層析、疏水性相互作用層析(HIC)、快速蛋白質液相層析、高效液相層析、反流層析、週期性反流層析或手性層析。雖然可關於例示性類型之層析製程(例如 ，HIC)或裝置來揭示本文實施例，但本文所揭示之實施例可適用於任一類型之層析。
如本文所用，術語「水」可係指任一適宜類型之實驗室級水，諸如去離子水或注射用水。舉例而言，在一些實施例中，可使層析裝置與去離子水或注射用水接觸。本文中對使用「水」之任何提及可係指去離子水、注射用水或另一類型之實驗室級水。
如本揭示案中所用，術語「移動相」可係指適於接觸層析區或管柱作為分離或純化製程之一部分之任一流體。移動相可包括(例如)水、緩衝溶液、酸性溶液、鹼性溶液及/或包含醇之溶液。術語「洗滌緩衝液」、「汽提緩衝液」及「平衡緩衝液」可用於闡述具有如本文所進一步闡述之特定特性之移動相。
在一些實施例中，自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法可包括使該混合物與層析裝置接觸。該層析裝置可包含複數個區，其中每一區包括一或多個層析管柱，其中該一或多個層析管柱包含疏水性相互作用介質。此等層析裝置可包括預製造之裝置(例如，Cadence™ BioSMB (Pall Biosciences)、BioSC® (novasep)、Varicol® (novasep)或Octave (Semba® Biosciences))、手工組裝之裝置或串聯使用之僅兩個或更多個標準分批層析裝置。
本揭示案之態樣可為製備目標多肽或其他分子之製程提供各種益處。舉例而言，同時使用層析裝置中之多個區可使個別管柱之裝載更有效且更充分，及/或容許使用較標準層析製程中更少之層析介質來實施分離製程。熟習此項技術者將明瞭本揭示案之態樣之其他益處及優點。
現將參考本揭示案之圖。
圖1繪示根據本揭示案之一些實施例之HIC裝置的層析管柱之部分100。該層析管柱包含疏水性相互作用介質。該疏水性相互作用介質包含支撐結構110及疏水性部分120，其中疏水性部分120附著至支撐結構110。該介質可呈層析介質之形式，例如以填充床管柱形式固持之珠粒或其他顆粒；呈膜形式；或呈可容納包含目標多肽(或其他POI)及污染物(例如 ，HCP)之混合物或其他液體之任一形式。因此，疏水性相互作用介質實例可包括瓊脂糖珠粒(例如 ，sepharose)、二氧化矽珠粒、纖維素膜、纖維素珠粒、親水性聚合物珠粒及諸如此類。
本揭示案之HIC裝置之層析管柱可經構形以使得疏水性相互作用介質之深度(例如 ，床高)為約0.5公分(cm)至約40 cm。舉例而言，在一些實施例中，HIC裝置之層析管柱之床高可為約0.5 cm至約30 cm、約0.5 cm至約20 cm、約0.5 cm至約10 cm、約0.5 cm至約5 cm、約1 cm至20 cm、約1 cm至約10 cm或約1 cm至約5 cm。在一些實施例中，層析管柱可經構形以使得層析管柱之內徑為約0.5 cm至約150 cm。舉例而言，在一些實施例中，層析管柱之內徑為約0.5 cm至約140 cm、約0.5 cm至約120 cm、約0.5 cm至約100 cm、約0.5 cm至約80 cm、約0.5 cm至約60 cm、約0.5 cm至約40 cm、約0.5 cm至約20 cm、約0.5 cm至約10 cm、約0.75 cm至約8 cm、約1 cm至約6 cm、約1 cm至約5 cm、約1 cm至約3 cm、約1.5 cm至約5 cm、約1.5 cm至約3 cm或約1 cm至約2 cm。舉例而言，在一些實施例中，層析管柱之內徑為約0.5 cm、約1 cm、約5 cm、約8 cm、約10 cm、約15 cm、約20 cm、約30 cm、約40 cm、約50 cm、約60 cm、約80 cm、約100 cm、約125 cm或約150 cm。在一些實施例中，本揭示案之HIC裝置之層析管柱之總體積(例如 ，持有混合物、移動相或其他物質之總容量)為約0.4毫升(mL)至約175 L。舉例而言，在一些實施例中，本揭示案之HIC裝置之層析管柱之總體積為約0.5 mL至約150 L、約0.5 mL至約130 L、約0.5 mL至約115 L、約0.5 mL至約100 L、約0.5 mL至約80 L、約0.5 mL至約60 L、約0.5 mL至約40 L、約0.5 mL至約20 L、約0.5 mL至約15 L、約0.5 mL至約10 L、約0.5 mL至約5 L、約0.5 mL至約1 L、約1 mL至約750 mL、約1 mL至約600 mL、約1 mL至約500 mL、約1 mL至約300 mL、約1 mL至約250 mL、約1 mL至約200 mL或約1 mL至約150 mL。舉例而言，在一些實施例中，本揭示案之層析管柱之總體積可為約0.5 mL、約1 mL、約5 mL、約10 mL、約50 mL、約100 mL、約150 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約1 L、約5 L、約10 L、約50 L、約80 L、約100 L、約120 L或約150 L。
在一些實施例中，疏水性部分120結合至多肽之疏水性區域及疏水性表面。該等疏水性表面可為構成肽之胺基酸結構、上文所提及或其他轉譯後修飾或其組合之一部分。疏水性相互作用介質之疏水性程度可藉由選擇適當疏水性部分120來控制。疏水性部分120可經選擇以結合至特定目標多肽或POI，且可為任何現今已知或未來開發之疏水性部分。在一些實施例中，疏水性部分120可包括甲基、丙基、異丙基、丁基、己基、辛基及/或苯基。熟習此項技術者將瞭解，所選疏水性部分120之疏水性可基於給定應用之目標多肽及/或HCP/其他雜質以及自層析製程所期望之分離或純化之類型及程度而變化。
可採用疏水性相互作用介質以將目標多肽或其他POI與產物及製程相關之污染物及雜質(例如，HCP)分離。仍參考圖1，在一些實施例中，將含有目標多肽140及其他組分(諸如污染物130，例如 雜質、HCP或諸如此類)之混合物裝載至HIC裝置中。該混合物可包括經設計以促進目標多肽140中之疏水性基團結合至疏水性相互作用介質之疏水性部分120之溶液(例如 ，緩衝液)。一些目標多肽140藉由經分子內力結合至疏水性部分120而黏附至介質，而其他目標多肽140可穿過層析管柱。另外或另一選擇為，在混合物穿過管柱時，來自該混合物之一些污染物130可藉由經分子內力結合至疏水性部分120而黏附至疏水性相互作用介質，而其他污染物130則不能結合至疏水性部分120。在一些實施例中，目標多肽140含有來自組成型胺基酸之某些疏水性區域、轉譯後修飾或其組合，其容許目標多肽140以較某些污染物或雜質(例如，HCP)更高之親和力附著至疏水性部分120。如下文更詳細地闡述，接著可將其他移動相引入至管柱中以降低目標多肽140與疏水性部分120之間的親和力，從而容許目標多肽140穿過HIC裝置之層析管柱。
在其他實施例中，污染物130可較目標多肽140以更高之親和力附著至疏水性部分120。接著可將其他移動相引入至管柱中以降低污染物130與疏水性部分120之間的親和力，從而容許污染物130穿過HIC裝置之層析管柱。
可藉由添加添加劑(包括鹽，諸如鈉、鉀、磷酸鹽、參(羥甲基)胺基甲烷(Tris)、檸檬酸鹽或乙酸鹽)來改變包括目標多肽140之混合物之組成。可添加其他添加劑以改變目標多肽140、污染物130、疏水性部分120或其組合之疏水性或其他分子內相互作用。
根據本文所述之一些實施例，例示性HIC裝置200示意性地繪示於圖2中。HIC裝置200可包含第一區210、第二區220及第三區230。第一區210、第二區220及第三區230各自可包括一或多個層析管柱，諸如關於圖1所闡述之層析管柱。第一區210可具有第一入口212，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第一區210。第一區210亦可具有第一出口214，流出物(例如 ，已穿過第一區210之流體)可經由第一出口214自HIC裝置200傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第一互連件216自第一區210傳送至第二區220。第一區210亦可經由第三互連件236接收來自第三區230之流出物。
第二區220可經由第一互連件216接收來自第一區210之流出物。第二區220亦可具有第二入口222，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第二區220。第二區220亦可具有第二出口224，流出物(例如 ，已穿過第二區220之流體)可經由第二出口224自HIC裝置200傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第二互連件226自第二區220傳送至第三區230。
第三區230可經由第二互連件226接收來自第二區220之流出物。第三區230可具有第三入口232，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第三區230。第三區230亦可具有出口234，流出物(例如 ，已穿過第三區230之流體)可經由出口234自HIC裝置200傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第三互連件236自第三區230傳送至第一區220。
如熟習此項技術者將理解，已知用於層析裝置中之各種組件(例如，過濾器、感測器、計量表、溫度計)可納入至HIC裝置200中，但在圖2之簡化示意圖中未顯示。在一些實施例中，滯留溶液之UV吸收、導電率或pH中之一或多者可在HIC裝置200中之一或多個點處量測。用於量測UV吸收、導電率或pH之適宜點包括在入口212、222、232處、在區210、220、230內、在互連件216、226、236處或在出口214、224、234處。入口212、222、232、互連件216、226、236及出口214、224、234可經操作以自開放構形改變為閉合構形：開放構形容許流體穿過入口212、222、232、互連件216、226、236或出口214、224、234，且閉合構形防止流體穿過入口212、222、232、互連件216、226、236或出口214、224、234。HIC裝置200可包括一或多個幫浦，其提供壓力以在區210、220、230、入口212、222、232、互連件216、226、236及出口214、224、234之間傳輸流體。在一些實施例中，可移動一或多個互連件216、226、236以接合不同區210、220、230。舉例而言，在使用HIC裝置200之製程期間，可期望重新佈置互連件226自區220傳送流出物之位置。在彼等情形中，可在不中斷層析製程之情形下使互連件226重新構形，以將流出物自區220傳送至區210。此僅係一個實例；一般而言，任一互連件216、226、236可經重新構形以在不中斷進行中之層析製程之情形下連接不同區。
圖3A係根據本揭示案之一些實施例之方法之圖形繪示。在該圖之左軸上，由標記C1 、C2 及C3 界定三個單獨之列，其代表HIC裝置之第一管柱、第二管柱及第三管柱。頂軸代表時間，其向左方及右方無限延伸。每一管柱之持續佔用係本文所述實施例之示例；與習用HIC方法相比，此佈置減少或消除管柱之閒置時間(例如 ，「空檔時間」)。整個圖3A中所示之時間區段代表重複模式之一個例示性循環，其可在圖3A中所示之時間區段之前及/或之後重複。四個時間被標記為T1 、T2 、T3 及T4 ，且係可垂直穿過圖繪製之任一線T0 之實例。在一些實施例中，T1 與T2 之間的間隔與T2 與T3 之間的間隔實質上相同，該T2 與T3 之間的間隔在一些實施例中與T3 與T4 之間的間隔實質上相同。在一些實施例中，相鄰標記時間之間(例如，T1 與T2 之間或T3 與T4 之間)的間隔可大於或等於30秒(s)、小於或等於90分鐘(min)、為30 s至60 min、30 s至30 min、30 s至15 min、30 s至10 min、30 s至8 min、30 s至7 min、30 s至6 min、30 s至5 min、30 s至4 min、30 s至3 min、1 min至5 min或2 min至5 min。框410、412、414、415、417、419、424、420、422、424、425、427、429、430、432、434、435、437及439代表在每一框出現之時間間隔內在每一管柱C1 、C2 及C3 內發生之事件。舉例而言，每一框可代表混合物、移動相或其他滯留液體在其出現之管柱列內存在。
在圖3A中自左向右移動，在時間上「向前」前進，自T1 至T2 ，混合物之二次負載可位於第一管柱C1 中(框410)。自T2 至T3 ，混合物之一次負載可位於第一管柱C1 中(框412)，且自T3 至T4 ，一或多個移動相可位於第一管柱C1 中(框414)。在一些實施例中，管柱可接收混合物之一次負載或混合物之二次負載。混合物之「一次負載」係指傳送至HIC裝置之管柱之混合物負載，其無需先前首先穿過HIC裝置之另一管柱。混合物之「二次負載」係指在引入至給定管柱之前，經由HIC裝置之另一管柱傳送之混合物負載(例如，來自混合物之一次負載之流出物作為混合物之二次負載引入至另一管柱)。使流出物自一個管柱傳送至另一管柱(其中流出物包括目標肽)可容許管柱完全裝載而無需擔心浪費溢出，且可增加每一管柱之使用效率且可降低所消耗疏水性相互作用介質之體積。藉由在疏水性相互作用介質(其可已接收或可接收包括目標多肽之混合物之一次負載)上方傳送溢流，可降低所消耗疏水性相互作用介質之體積(相對於所處理裝載混合物之量)。
在一些實施例中，使一或多個移動相與管柱接觸可包括使洗滌緩衝液與該管柱接觸、使汽提緩衝液與該管柱接觸及/或使平衡緩衝液與該管柱接觸。在一些實施例中，洗滌緩衝液可包含一或多種鹽，諸如鈉、鉀、鎂、鈣、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、Tris或其他鹽。
在一些實施例中，汽提緩衝液可包含水、鹼性溶液或包含醇之溶液。舉例而言，去離子水可具有少於5體積% (vol.%)之溶解離子、少於1 vol.%之溶解離子、少於0.1 vol.%之溶解離子或甚至少於0.01 vol.%之溶解離子。根據一些實施例，鹼性溶液可包含一或多種鹼性離子化合物，諸如LiOH、NaOH、KOH、Ca(OH)2 、NH4 OH或其他鹼性化合物。汽提緩衝液中鹼性化合物之濃度可(例如)在以下範圍內：約0.1 N至約1.5 N、約0.1 N至約1 N、約0.1 N至約1.5 N、約0.5 N至約1.5 N、約0.1 N至約0.8 N、約0.1 N至約0.6 N、約0.1 N至約0.5 N、約0.1 N至約0.4 N或約0.1 N至約0.3 N。舉例而言，汽提緩衝液中鹼性化合物之濃度可為約0.1 N、約0.2 N、約0.3 N、約0.4 N、約0.5 N、約0.6 N、約0.7 N、約0.8 N、約0.9 N、約1 N、約1.1 N、約1.2 N、約1.3 N、約1.4 N或約1.5 N。包含醇之汽提緩衝液可包括甲醇、乙醇、丙醇、苄醇或其他醇。基於汽提緩衝液之總重量，汽提緩衝液中醇之濃度可在約0.1 vol.%至約30 vol.%範圍內，諸如約0.5 vol.%至約30 vol.%、約0.5 vol.%至約25 vol.%、約0.5 vol.%至約25 vol.%、約0.5 vol.%至約25 vol.%、約1 vol.%至約20 vol.%、約1 vol.%至約15 vol.%、約1 vol.%至約10 vol.%、約10 vol.%至約50 vol.%、約10 vol.%至約40 vol.%、約10 vol.%至約30 vol.%、約10 vol.%至約25 vol.%、約15 vol.%至約25 vol.%或約20 vol.%至約25 vol.%,。舉例而言，汽提緩衝液中醇之濃度可為約0.1 vol.%、約0.5 vol.%、約1 vol.%、約2 vol.%、約3 vol.%、約5 vol.%、約10 vol.%、約15 vol.%、約20 vol.%或約25 vol.%。
在一些實施例中，平衡緩衝液在組成上可與洗滌緩衝液相似或相同。在其他實施例中，與洗滌緩衝液相比，平衡緩衝液之組成可變化。在一些實施例中，平衡緩衝液可包含一或多種鹽，諸如鈉、鉀、鎂、鈣、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、Tris或其他鹽。
參考圖3A，可將在第一管柱中接觸一或多個移動相414分成單獨相，包括第一管柱中之洗滌緩衝液(框415)、第一管柱中之汽提緩衝液(框417)及第一管柱中之平衡緩衝液(框419)。在下一列(代表C2 )中，自T1 至T2 ，一或多個移動相可位於第二管柱中(框424)。同樣可將此分成單獨相，包括第二管柱中之洗滌緩衝液(框425)、第二管柱中之汽提緩衝液(框427)及第二管柱中之平衡緩衝液(框429)。向右移動，自T2 至T3 ，混合物之二次負載可位於第二管柱中(框420)，且自T3 至T4 ，混合物之一次負載可位於第二管柱中(框422)。
在下一列上，自T1 至T2 ，混合物之一次負載可位於第三管柱中(框432)。接下來，自T2 至T3 ，一或多個移動相可位於第三管柱中(框434)，且自T3 至T4 ，混合物之二次負載可位於第三管柱中(框430)。可將第三管柱中之一或多個移動相(框434)分成單獨相，包括第三管柱中之洗滌緩衝液(框435)、第三管柱中之汽提緩衝液(框437)及第三管柱中之平衡緩衝液(框439)。
在給定時間T0 ，可穿過圖繪製垂直線，使得自T0 由垂直線接觸之每一編號框代表此時管柱中之解決方案。因此，舉例而言，在時間T1 時，二次負載混合物引入至第一管柱C1 中(框410)、一或多個移動相傳送至第二管柱C2 (框424) (諸如將洗滌緩衝液傳送至C2 (框425))且一次負載混合物傳送至第三管柱C3 (框432)。儘管諸如細分部425、427及429等較寬相之細分部似乎佔據第二管柱中之一或多個移動相424之相等部分，但在一些實施例中，細分部可佔據較寬相之不相等部分。亦應理解，圖3A中所繪示之方法僅係根據本揭示案實施例之一個例示性進展。涵蓋其他順序、構形及步驟，且視為在本揭示案之範圍內。
圖3B至圖3D圖解說明如先前所述之自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法之例示性循環。圖3B繪示可在圖3A之時間間隔T1 至T2 期間發生之一系列事件。因此，圖3B顯示第一階段301中之HIC裝置，其中第一區310接收包括目標多肽之混合物306之二次負載且流出該二次負載之流出物307，其可被收集或丟棄。第二區320接收一或多個移動相315，且流出該一或多個移動相之流出物316，其可被收集或丟棄。第三區330接收混合物305之一次負載，且將混合物306之二次負載傳送至另一管柱。
圖3C顯示第二階段302 (在如圖3A中所示之間隔T2 至T3 內)中之HIC裝置，其中第一區310接收混合物305之一次負載，且將混合物306之二次負載傳送至另一管柱。第二區320接收混合物306之二次負載，且流出該二次負載之流出物307，其可被收集或丟棄。第三區330接收一或多個移動相315，且流出該一或多個移動相之流出物316，其可被收集或丟棄。
圖3D顯示第三階段303 (在如圖3A中所示之間隔T3 至T4 內)中之HIC裝置，其中第一區310接收一或多個移動相315，且流出該一或多個移動相之流出物316，其可被收集或丟棄。第二區320接收混合物305之一次負載，且將混合物306之二次負載傳送至另一管柱。第三區330接收一或多個移動相315，且流出該一或多個移動相之流出物316，其可被收集或丟棄。
根據本文所述之一些實施例，另一例示性HIC裝置500示意性地繪示於圖4中。HIC裝置500可包括第一區510、第二區520、第三區530及第四區540。第一區510可具有第一入口512，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第一區510。第一區510亦可具有第一出口514，流出物(例如，已穿過第一區510之流體)可經由第一出口514自HIC裝置500傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第一互連件516自第一區510傳送至第二區520。第一區510亦可經由第四互連件546接收來自第四區540之流出物。
第二區520可經由第一互連件516接收來自第一區510之流出物。第二區520亦可具有第二入口522，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第二區520。第二區520亦可具有第二出口524，流出物(例如 ，已穿過第二區520之流體)可經由第二出口524自HIC裝置500傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第二互連件526自第二區520傳送至第三區530。
第三區530可經由第二互連件526接收來自第二區520之流出物。第三區530可具有第三入口532，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第三區530。第三區530亦可具有出口534，流出物(例如 ，已穿過第三區530之流體)可經由出口534自HIC裝置500傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第三互連件536自第三區530傳送至第四區520。
第四區540可經由第三互連件536接收來自第三區530之流出物。第四區540可具有第四入口542，其經構形以使得包括目標多肽、一或多個移動相或其他液體之混合物可傳送至第四區540。第四區540亦可具有出口544，流出物(例如 ，已穿過第四區540之流體)可經由出口544自HIC裝置500傳送以被收集或丟棄。流出物亦可經由第四互連件546自第四區540傳送至第一區510。
已知用於層析裝置中之各種組件(例如 ，過濾器、感測器、計量表、溫度計)可納入至HIC裝置500中，但在圖4之簡化示意圖中未顯示。在一些實施例中，滯留溶液之UV吸收、導電率或pH中之一或多者可在HIC裝置500中之一或多個點處量測。用於量測UV吸收、導電率或pH之適宜點包括在入口512、522、532、542處、在區510、520、530、540內、在互連件516、526、536、546處或在出口514、524、534、544處。入口512、522、532、542、互連件516、526、536、546及出口514、524、534、544可經操作以自開放構形改變為閉合構形：開放構形容許流體穿過入口512、522、532、542、互連件516、526、536、546或出口514、524、534、544，且閉合構形不容許流體穿過入口512、522、532、542、互連件516、526、536、546或出口514、524、534、544。HIC裝置500可包括一或多個幫浦，其提供壓力以在區510、520、530、540、入口512、522、532、542、互連件516、526、536、546及出口514、524、534、544之間傳輸流體。在一些實施例中，可移動一或多個互連件516、526、536、546以接合不同區510、520、530、540。舉例而言，在使用HIC裝置500之一或多個層析製程期間，可期望重新佈置互連件536自區530傳送流出物之位置。在彼等情形中，可在不中斷層析製程之情形下使互連件536經重新構形，以將流出物自區530傳送至區520。此僅係一個實例，且一般而言，任一互連件516、526、536、546可經重新構形以在不中斷進行中之層析製程之情形下連接不同區510、520、530、540。
圖5A係根據本揭示案之一或多種方法之圖形繪示。在該圖之左軸上，由標記C1 、C2 、C3 及C4 界定四個單獨之列，其代表HIC裝置之第一管柱、第二管柱、第三管柱及第四管柱。頂軸代表時間，其向左方及右方無限延伸。每一管柱之持續佔用係本文所述實施例之示例，與習用HIC方法相比，此佈置減少或消除管柱之閒置時間(例如，「空檔時間」)。所示時間區段代表重複模式之一個循環，理解下文所述之編號框模式可在圖5A中所示之區段兩側重複。五個時間被標記為T1 、T2 、T3 、T4 及T5 ，且係可垂直穿過圖繪製之任一線T0 之實例。在一些實施例中，T1 與T2 之間的間隔可與T2 與T3 之間的間隔實質上相同，該T2 與T3 之間的間隔在一些實施例中可與T3 與T4 之間的間隔實質上相同，該T3 與T4 之間的間隔在一些實施例中可與T4 與T5 之間的間隔實質上相同。在一些實施例中，該等時間中之每一者之間的間隔可不同。在一些實施例中，相鄰標記時間之間(例如，T1 與T2 之間或T4 與T5 之間)的間隔可大於或等於30 s、小於或等於 90 min、為30 s至60 min、30 s至30 min、30 s至15 min、30 s至10 min、30 s至8 min、30 s至7 min、30 s至6 min、30 s至5 min、30 s至4 min、30 s至3 min、1 min至5 min或2 min至5 min。框710、712、714、724、720、722、734、730、732、742、744及740代表每一管柱C1 、C2 、C3 及C4 內之混合物、緩衝液或其他滯留液體。
在圖5A中自左向右移動，在第一列(代表第一管柱C1 )中，自T1 至T2 ，混合物之二次負載可位於第一管柱中(框710)。自T2 至T3 ，混合物之一次負載可位於第一管柱中(框712)，且自T3 至T5 ，一或多個移動相可位於第一管柱中(框714)。
仍參考圖5A，可將第一管柱中之一或多個移動相714分成單獨相，包括第一管柱中之洗滌緩衝液(框715)、第一管柱中之汽提緩衝液(框717)及第一管柱中之平衡緩衝液(框719)。在下一列(代表第二管柱C2 )中，自前一週期之T4 至T5 繼續，自T1 至T2 ，一或多個移動相可位於第二管柱中(框724)。同樣可將此分成單獨相，包括第二管柱中之洗滌緩衝液(框725)、第二管柱中之汽提緩衝液(框727)及第二管柱中之平衡緩衝液(框729)。向右移動，自T2 至T3 ，混合物之二次負載可位於第二管柱中(框720)，且自T3 至T4 ，混合物之一次負載可位於第二管柱中(框722)。
在下一列(代表管柱C3 )上，自T1 至T3 ，一或多個移動相可位於第三管柱中(框734)。可將第三管柱中之一或多個移動相734分成單獨相，包括第三管柱中之洗滌緩衝液(框735)、第三管柱中之汽提緩衝液(框737)及第三管柱中之平衡緩衝液(框739)。接下來，自T3 至T4 ，二次負載可位於第三管柱中(框730)，且自T4 至T5 ，混合物之一次負載可位於第三管柱中(框732)。
在下一列(代表管柱C4 )上，自T1 至T2 ，混合物之一次負載可位於第四管柱中(框742)。接下來，自T2 至T4 ，一或多個移動相可位於第四管柱中(框744)，且自T4 至T5 ，混合物之二次負載可位於第三管柱中(框740)。可將第四管柱中之一或多個移動相744分成單獨相，包括第三管柱中之洗滌緩衝液(框745)、第三管柱中之汽提緩衝液(框747)及第三管柱中之平衡緩衝液(框749)。
在給定時間T0 ，可穿過圖繪製垂直線，使得自T0 由垂直線接觸之每一編號框代表此時管柱中之解決方案。因此，舉例而言，在時間T1 時，二次負載混合物引入至第一管柱中710，一或多個移動相位於第二管柱中724 (諸如汽提緩衝液727)，且一次負載混合物傳送至第三管柱732。應注意，儘管諸如細分部725、727及729等較寬相之細分部似乎佔據第二管柱中之一或多個移動相724之相等部分，但在一些實施例中，細分部可佔據較寬相之不相等部分。亦應理解，圖5A中所繪示之方法僅係實施例方法之一個實例。涵蓋其他順序、構形及步驟，且視為在本揭示案之範圍內。
圖5B至圖5E圖解說明如先前所述自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法之例示性循環。圖5B繪示在圖5A之間隔T1 至T2 中發生之一系列事件。圖5B顯示第一階段601中之HIC裝置，其中第一區610接收包括目標多肽之混合物606之二次負載，且流出該二次負載之流出物607，其可被收集或丟棄。第二區620接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第三區630接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第四區640接收混合物605之一次負載，且將混合物606之二次負載傳送至另一管柱。
圖5C顯示第二階段602 (在如圖5A中所示之間隔T2 至T3 內)中之HIC裝置，其中第一區610接收混合物605之一次負載，且將混合物606之二次負載傳送至另一管柱，包括可被收集或丟棄之目標多肽。第二區620接收包括目標多肽之混合物606之二次負載，且流出該二次負載之流出物607，其可被收集或丟棄。第三區630接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第四區640接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。
圖5D顯示第三階段603 (在如圖5A中所示之間隔T2 至T3 內)中之HIC裝置，其中第一區610接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第二區620接收混合物605之一次負載，且將混合物606之二次負載傳送至另一管柱，包括可被收集或丟棄之目標多肽。第三區630接收包括目標多肽之混合物606之二次負載，且流出該二次負載之流出物607，其可被收集或丟棄。第四區640接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。
圖5E顯示第四階段604 (在如圖5A中所示之間隔T2 至T3 內)中之HIC裝置，其中第一區610接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第二區620接收一或多個移動相615，且流出該一或多個移動相之流出物616，其可被收集或丟棄。第三區630接收混合物605之一次負載，且將混合物606之二次負載傳送至另一管柱，包括可被收集或丟棄之目標多肽。第四區640接收包括目標多肽之混合物606之二次負載，且流出該二次負載之流出物607，其可被收集或丟棄。
圖6繪示自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之例示性方法800之流程圖。該方法可包括將包括目標多肽之混合物傳送至複數個管柱中之第一管柱(例如 ，圖3A之框410) (步驟810)。該方法可進一步包括將來自該第一管柱之包括該目標多肽之流出物傳送至該複數個管柱中之第二管柱(例如 ，混合物306之二次負載，如圖3B中所示) (步驟820)。該方法可進一步包含將一或多個移動相傳送至該第一管柱(例如 ，框414) (步驟830)。在一些實施例中，該方法可進一步包括使該目標多肽穿過該複數個管柱中之每一者之出口(例如 ，一或多個移動相之流出物316，如圖3B至圖3D中所示) (步驟840)。雖然比較係針對圖3A至圖3D作出，但熟習此項技術者將明瞭，亦可針對圖5A至圖5E進行比較。
在本揭示案之實施例中，含有目標多肽之混合物亦可包含一或多種HCP。在使用一或多種實施例方法自該混合物製備目標多肽之後，可獲得若干種流出物樣品。該等樣品可自一或多種混合物負載之流出物及/或一或多個移動相之流出物收集。舉例而言，該等樣品可自混合物之一次負載或混合物之二次負載(或混合物之任何其他負載)之流出物收集。在一些實施例中，樣品可僅自一或多種洗滌緩衝液之流出物收集。在其他實施例中，樣品可自其他移動相及/或混合物之一次或二次負載之流出物收集。所收集之含有目標多肽之所有樣品之總集合稱為庫。
在一些實施例中，可進行一或多種量測以確定所採用製備目標多肽之方法之效率。如本揭示案中所用，效率係指三種不同因子之組合：高分子量分子餘隙因子(HMW CF)、產率及生產率。在一些實施例中，更有效之方法較低效方法具有更高之HMW CF、更高之產率及更高之生產率。在其他實施例中，更有效之方法具有高於低效方法之生產率，同時維持HMW CF大於或等於1.3且維持產率大於或等於80%。在其他實施例中，更有效之方法具有高於低效方法之生產率，同時維持HMW CF大於或等於1.5且維持產率大於或等於90%。
高分子量分子餘隙因子(HMW CF)係與裝載之混合物相比，所收集庫中相對蛋白質含量之近似值。在一些實施例中，可實施分析型粒徑篩析層析以測定可歸因於高分子量分子(例如 ，蛋白質)之樣品之百分比(HMW%)。在其他實施例中，可使用離心技術，當將樣品離心時，其基於樣品之組成組分之質量而分離成多層，最重的層(亦即下層物(infranatant))通常含有最重的分子，包括蛋白質。HMW%可藉由將離心樣品之下層物稱重質量且除以樣品之總質量來計算。使用任一方法，HMW CF可根據如下所示之方程式1來計算。
Figure 02_image001
方程式(1)
如方程式(1)中所示，HMW CF可藉由將裝載混合物之HMW%除以庫之HMW%來計算。在一些實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之HMW CF大於或等於1.3。在其他實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之HMW CF大於或等於1.4、大於或等於1.5、大於或等於1.6、大於或等於1.8或大於或等於2.0。
產率係與裝載混合物中目標多肽之量相比，庫中所收集目標多肽之量之量度。樣品中目標多肽之量可藉由UV吸收、導電率或酶免疫分析(例如 ，ELISA)來量化。產率可根據如下所示之方程式2來計算。
Figure 02_image003
方程式(2)
如方程式2中所示，產率可藉由將裝載至HIC裝置中之目標多肽之質量除以庫中所收集目標多肽之質量來計算。由於樣品中目標多肽之質量不能直接量測，因此可將濃度(藉由UV吸收、導電率或酶免疫分析計算)乘以體積以確定質量。在一些實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之產率大於或等於55%。在其他實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之產率大於或等於60%、大於或等於65%、大於或等於70%、大於或等於75%、大於或等於80%、大於或等於85%、大於或等於90%或大於或等於95%。
生產率係對製備一定量之目標多肽所需之時間及成本之量化。生產率可根據如下所示之方程式3來計算。
Figure 02_image007
方程式(3)
如方程式3中所示，生產率可藉由將庫中所收集目標多肽之質量除以所用疏水性相互作用介質之體積與製備庫中所收集多肽質量所經過的時間(例如 ，循環時間)之乘積來計算。在一些實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之生產率大於或等於約35 g/L∙小時。在其他實施例中，自混合物製備目標多肽之方法之生產率大於或等於約40 g/L∙小時、大於或等於約50 g/L∙小時、大於或等於約75 g/L∙小時、大於或等於約100 g/L∙小時、大於或等於約125 g/L∙小時、大於或等於約150 g/L∙小時、大於或等於約175 g/L∙小時、大於或等於約200 g/L∙小時或大於或等於約220 g/L∙小時。實例
以下實例意欲說明本揭示案而在本質上不具有限制性。應理解，本揭示案涵蓋與前述闡述及以下實例一致之其他態樣及實施例。
在一些以下實例中，參考「連續層析」或「連續HIC」。該等術語係指包括兩個或更多個層析管柱(例如，HIC管柱)之方案及/或裝置，該等管柱中之每一者可在穿過所有管柱之重複層析循環之不同部分中。本揭示案之實施例(例如，圖2至圖5E中所繪示)係連續層析及/或連續HIC之實例。連續層析(例如，連續HIC)方案之特徵可在於目標為與習用分批層析相比，降低或消除管柱閒置時間(亦稱為「空檔時間」)。
在以下實例中，使用根據本揭示案實施例之若干種不同方法，自包括目標多肽及HCP之混合物製備目標多肽。亦使用習用分批處理方法作為比較實例製備若干目標多肽庫。實例 1
在第一實例中，製備目標抗體。將300 mL包括目標抗體之12.2 g/L混合物以1.67 mL/min之裝載流速裝載至三管柱HIC裝置中，其中每一管柱具有2.5 cm床高、1.6 cm內徑及5 mL之管柱體積。裝載緩衝液/混合物包括30毫莫耳(mM)檸檬酸鈉溶液，且用2 M乙酸溶液調整至pH為6.0。將裝載緩衝液/混合物裝載至該三個管柱中之第一及第二管柱中。該第二管柱經由該第一管柱裝載(亦即，來自該第一管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第二管柱中)。在將混合物裝載至HIC裝置之該第一及該第二管柱中後，將混合物裝載至該三個管柱中之該第二管柱及第三管柱中，其中該第三管柱經由該第二管柱裝載(亦即，來自該第二管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第三管柱中)。
當將裝載緩衝液/混合物裝載至該第二及該第三管柱中時，將一系列移動相傳送至HIC裝置之該第一管柱以將目標抗體與該第一管柱中混合物之其他組分分離且收集目標抗體，之後將一系列汽提緩衝液傳送至該第一管柱以使該管柱再生。該第二及該第三管柱之裝載與該第一管柱之洗滌及汽提同時進行。在此步驟後，將裝載緩衝液/混合物裝載至該第三及該第一管柱中，其中該第一管柱經由該第三管柱裝載(亦即，來自該第三管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第一管柱中)，在此期間將緩衝液傳送至該第二管柱以自該第二管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第二管柱以使該第二管柱再生。該第三及該第一管柱之裝載與該第二管柱之洗滌及汽提同時進行。最後，將裝載緩衝液/混合物再次裝載至該第一及該第二管柱中，其中該第二管柱如先前所述經由該第一管柱裝載，在此期間將緩衝液傳送至該第三管柱以自該第三管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第三管柱以使該第三管柱再生。該第一及該第二管柱之裝載與該第三管柱之洗滌及汽提同時進行。將此製程循環重複兩次。
該一系列移動相包括洗滌緩衝液、一系列汽提緩衝液及平衡緩衝液。該洗滌緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。為洗滌每一管柱，將四個管柱體積之洗滌緩衝液添加至管柱。
在施加洗滌緩衝液且自管柱收集作為庫之一部分之包括目標抗體之流出物後，將一系列汽提緩衝液傳送至該管柱作為管柱再生製程之一部分。第一汽提緩衝液包括去離子水，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。如本文所用，管柱體積係指給定管柱可保留之液體體積。下一汽提緩衝液包括1 N NaOH，在第一汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包含去離子水，在先前鹼性汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包括20 vol.%乙醇，且在先前去離子水汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。將包括去離子水之最終汽提緩衝液添加至管柱(以等於兩個管柱體積之量)。在施加汽提緩衝液後，將四個管柱體積之平衡緩衝液添加至管柱。該平衡緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。
在自實例1中運行之方法收集庫之後，如本文先前所闡述量測且計算該方法之HMW CF、產率及生產率。結果彙總於下表1中。實例 2
在第二實例中，製備目標抗體。將729 mL包括目標多肽之12.4 g/L混合物以1.67 mL/min之裝載流速裝載至三管柱HIC裝置中，其中每一管柱具有2.5 cm床高、1.6 cm內徑及5 mL之管柱體積。裝載緩衝液/混合物包括30毫莫耳(mM)檸檬酸鈉溶液，且用2 M乙酸溶液調整至pH為6.0。將裝載緩衝液/混合物裝載至該三個管柱中之第一及第二管柱中。該第二管柱經由該第一管柱裝載(亦即，來自該第一管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第二管柱中)。在將混合物裝載至HIC裝置之該第一及該第二管柱中後，將混合物裝載至該三個管柱中之該第二管柱及第三管柱中，其中該第三管柱經由該第二管柱裝載(亦即，來自該第二管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第三管柱中)。
當將裝載緩衝液/混合物裝載至該第二及該第三管柱中時，將一系列移動相傳送至HIC裝置之該第一管柱以將目標抗體與該第一管柱中混合物之其他組分分離且收集目標抗體，之後將一系列汽提緩衝液傳送至該第一管柱以使該管柱再生。該第二及該第三管柱之裝載與該第一管柱之洗滌及汽提同時進行。在此步驟後，將裝載緩衝液/混合物裝載至該第三及該第一管柱中，其中該第一管柱經由該第三管柱裝載(亦即，來自該第三管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第一管柱中)，在此期間將緩衝液傳送至該第二管柱以自該第二管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第二管柱以使該第二管柱再生。該第三及該第一管柱之裝載與該第二管柱之洗滌及汽提同時進行。最後，將裝載緩衝液/混合物再次裝載至該第一及該第二管柱中，其中該第二管柱如先前所述經由該第一管柱裝載，在此期間將緩衝液傳送至該第三管柱以自該第三管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第三管柱以使該第三管柱再生。該第一及該第二管柱之裝載與該第三管柱之洗滌及汽提同時進行。將此製程循環重複四次。
該一系列移動相包括洗滌緩衝液、一系列汽提緩衝液及平衡緩衝液。該洗滌緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。為洗滌每一管柱，將四個管柱體積之洗滌緩衝液添加至管柱。
在施加洗滌緩衝液且自管柱收集作為庫之一部分之包括目標抗體之流出物後，將一系列汽提緩衝液傳送至該管柱作為管柱再生製程之一部分。第一汽提緩衝液包括去離子水，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。如本文所用，管柱體積係指給定管柱可保留之液體體積。下一汽提緩衝液包括1 N NaOH，在第一汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包含去離子水，在先前鹼性汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包括20 vol.%乙醇，且在先前去離子水汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。將包括去離子水之最終汽提緩衝液添加至管柱(以等於兩個管柱體積之量)。在施加汽提緩衝液後，將四個管柱體積之平衡緩衝液添加至管柱。該平衡緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。
在自實例2中運行之方法收集庫之後，如本文先前所闡述量測且計算HMW CF、產率及生產率。結果彙總於下表1中。實例 3
在第三實例中，製備目標多肽。將726 mL包括目標多肽之12.4 g/L混合物以6.70 mL/min之裝載流速裝載至三管柱HIC裝置中，其中每一管柱具有2.5 cm床高、1.6 cm內徑及5 mL之管柱體積。裝載緩衝液/混合物包括30毫莫耳(mM)檸檬酸鈉溶液，且用2 M乙酸溶液調整至pH為6.0。將裝載緩衝液/混合物裝載至該三個管柱中之第一及第二管柱中。該第二管柱經由該第一管柱裝載(亦即，來自該第一管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第二管柱中)。在將混合物裝載至HIC裝置之該第一及該第二管柱中後，將混合物裝載至該三個管柱中之該第二管柱及第三管柱中，其中該第三管柱經由該第二管柱裝載(亦即，來自該第二管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第三管柱中)。
當將裝載緩衝液/混合物裝載至該第二及該第三管柱中時，將一系列移動相傳送至HIC裝置之該第一管柱以將目標抗體與該第一管柱中混合物之其他組分分離且收集目標抗體，之後將一系列汽提緩衝液傳送至該第一管柱以使該管柱再生。該第二及該第三管柱之裝載與該第一管柱之洗滌及汽提同時進行。在此步驟後，將裝載緩衝液/混合物裝載至該第三及該第一管柱中，其中該第一管柱經由該第三管柱裝載(亦即，來自該第三管柱之出口容許裝載緩衝液傳送至該第一管柱中)，在此期間將緩衝液傳送至該第二管柱以自該第二管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第二管柱以使該第二管柱再生。該第三及該第一管柱之裝載與該第二管柱之洗滌及汽提同時進行。最後，將裝載緩衝液/混合物再次裝載至該第一及該第二管柱中，其中該第二管柱如先前所述經由該第一管柱裝載，在此期間將緩衝液傳送至該第三管柱以自該第三管柱中裝載之混合物分離且收集目標抗體，之後將該一系列汽提緩衝液傳送至該第三管柱以使該第三管柱再生。該第一及該第二管柱之裝載與該第三管柱之洗滌及汽提同時進行。將此製程循環重複四次。
該一系列移動相包括洗滌緩衝液、一系列汽提緩衝液及平衡緩衝液。該洗滌緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。為洗滌每一管柱，將四個管柱體積之洗滌緩衝液添加至管柱。
在施加洗滌緩衝液且自管柱收集作為庫之一部分之包括目標抗體之流出物後，將一系列汽提緩衝液傳送至該管柱作為管柱再生製程之一部分。第一汽提緩衝液包括去離子水，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。如本文所用，管柱體積係指給定管柱可保留之液體體積。下一汽提緩衝液包括1 N NaOH，在第一汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包含去離子水，在先前鹼性汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。下一汽提緩衝液包括20 vol.%乙醇，且在先前去離子水汽提緩衝液後，將兩個管柱體積之此緩衝液添加至每一管柱。將包括去離子水之最終汽提緩衝液添加至管柱(以等於兩個管柱體積之量)。在施加汽提緩衝液後，將四個管柱體積之平衡緩衝液添加至管柱。該平衡緩衝液包括40 mM Tris及30 mM檸檬酸鈉，且調整至pH為6.0。
在自實例3中運行之方法收集庫之後，如本文先前所闡述量測且計算HMW CF、產率及生產率。結果彙總於下表1中。比較實例 A
使用如本文所闡述之習用分批製程自混合物製備目標多肽，作為實例1至實例3之方法之比較。裝載添加劑、洗滌緩衝液、汽提緩衝液及平衡緩衝液與實例方法中所用之彼等裝載添加劑、洗滌緩衝液、汽提緩衝液及平衡緩衝液相同，但採用習用分批方法。將590 g之13.1 g/L裝載混合物添加至層析管柱。在混合物穿過管柱後，將4個管柱體積之洗滌緩衝液添加至管柱且收集流出物。在自比較實例方法收集庫之後，表徵HMW CF、產率及生產率。結果彙總於表1中。 表1
Figure 108122728-A0304-0001
如自表1中之數據可見，實例2及實例3之生產率高於比較實例分批方法。另外，實例3能夠達成高於其他實例之生產率，同時仍維持HMW CF大於或等於1.5且維持產率大於或等於90%。實例 4
使用具有三種不同裝載速度之HIC製備目標抗體以比較不同速度下之雜質突破點(impurity breakthroughs)。如表2中所闡述準備管柱： 表2
Figure 108122728-A0304-0002
按順序運行之裝載速度為300 cm/h (3.93 mL/min，或在管柱中之滯留時間為4.0 min)、200 cm/小時 (2.62 mL/min，或在管柱中之滯留時間為6.0 min)及400 cm/小時 (5.24 mL/min，或在管柱中之滯留時間為3.0 min)。所有試驗均係在同一管柱中實施。在於0.5 N NaOH中之400 cm/小時試驗之前實施隔夜浸泡。
如圖7A中所繪示，高分子量物質百分比(HMW%)繪製為隨負載而變。裝載材料之HMW%為1.78%。200 g/L-樹脂及400 g/L-樹脂下之累積庫HMW%示於下表3中： 表3
Figure 108122728-A0304-0003
使用F665 CHO HCP ELISA套組(Cygnus Technologies)，對每一裝載速度以百萬分率量化宿主細胞蛋白質。如圖7B中所繪示，所得量繪製為隨負載而變。作為比較，自相同裝載材料之陰離子交換層析庫量化宿主細胞蛋白質，且發現以549.61 ppm存在。實例 5
使用HIC在兩個具有不同床高(20 cm (如實例4中所用)及2.5 cm)之管柱中製備目標抗體。實施兩個試驗，使得每一管柱中之滯留時間為3分鐘(亦即，在20 cm床高管柱中線速度為400 cm/小時)。裝載材料之HMW%為2.2%。如圖7C中所示，每一管柱庫之HMW%繪製為隨負載濃度而變。實例 6
使用具有三個管柱之HIC裝置製備IgG1目標抗體，該三個管柱經構形以實施連續HIC方案。該HIC裝置中之每一HIC管柱具有10 cm床高及0.77 cm內徑。循環重複四次來實施連續HIC方案。將目標抗體作為包括30 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載至經歷該方案之裝載步驟之管柱中，平衡至pH為6.0。利用包括40 mM tris及30 mM檸檬酸鈉之緩衝液自經歷該方案之溶析步驟之管柱溶析目標抗體，平衡至pH為6.0 ± 0.1。使用具有單一鹼性溶液之單一溶液方案在該方案之再生步驟期間使管柱再生。該方案之參數及結果連同比較實例B之參數及結果一起彙總於表4中。比較實例 B
使用習用分批製程自混合物製備IgG1目標多肽，作為與實例6之方法之比較。裝載添加劑、洗滌緩衝液、汽提緩衝液及平衡緩衝液與實例6之方法中所用之彼等添加劑及緩衝液相同，但採用習用分批方法。如在實例6中，將目標多肽作為包括30 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載，平衡至pH為6.0。利用包括40 mM tris及30 mM檸檬酸鈉之緩衝液溶析目標多肽，平衡至pH為6.0 ± 0.1。在再生步驟期間使用具有鹼性溶液之單一溶液方案。參數及結果連同實例6之參數及結果一起彙總於表4中。如自表4中之數據可見，實例6之連續HIC方法之生產率大約係比較分批製程實例之3.4倍。 表4
Figure 108122728-A0304-0004
 實例 7
使用具有三個管柱之HIC裝置製備IgG1目標多肽，該三個管柱經構形以實施連續HIC方案。該HIC裝置中之每一HIC管柱具有10 cm床高及0.77 cm內徑。循環重複四次來實施連續HIC方案。將目標多肽作為包括30 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載至經歷該方案之裝載步驟之管柱中，平衡至pH為5.5。利用包括40 mM tris及30 mM檸檬酸鈉之緩衝液自經歷該方案之溶析步驟之管柱溶析目標多肽，平衡至pH為5.5 ± 0.1。使用具有單一鹼性溶液之單一溶液方案在再生步驟期間使管柱再生。該方案之參數及結果連同比較實例C之參數及結果一起彙總於表5中。比較實例 C
使用習用分批製程自混合物製備IgG1目標多肽，作為與實例7之方法之比較。裝載添加劑、洗滌緩衝液、汽提緩衝液及平衡緩衝液與實例7之方法中所用之彼等添加劑及緩衝液相同，但採用習用分批方法。如在實例7中，將目標多肽作為包括30 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載，平衡至pH為5.5。利用包括40 mM tris及30 mM檸檬酸鈉之緩衝液溶析目標多肽，平衡至pH為5.5 ± 0.1。在再生步驟期間使用具有鹼性溶液之單一溶液方案。結果連同實例7之參數及結果一起彙總於表5中。如自表5中之數據可見，實例7之連續HIC方法之生產率大約係比較分批製程實例之2.1倍。 表5
Figure 108122728-A0304-0005
 實例 8
使用具有四個管柱之HIC裝置製備IgG4目標抗體，該四個管柱經構形以實施連續HIC方案。該HIC裝置中之每一HIC管柱具有2.5 cm床高及1.6 cm內徑。循環重複四次來實施連續HIC方案。將目標抗體作為包括40 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載至經歷該方案之裝載步驟之管柱中，平衡至pH為6.5。利用包括40 mM tris及40 mM檸檬酸鈉之緩衝液自經歷溶析步驟之管柱溶析目標抗體，平衡至pH為6.5 ± 0.1。使用包括一系列以下各項之方案在再生步驟期間使管柱再生：(1) 水，(2) 鹼性溶液，(3) 水，(4) 醇溶液，及(5) 水。參數及結果連同比較實例D之參數及結果一起彙總於表6中。比較實例 D
使用習用分批製程自混合物製備目標多肽，作為實例7之方法之比較。裝載添加劑、洗滌緩衝液、汽提緩衝液及平衡緩衝液與實例8之方法中所用之彼等添加劑及緩衝液相同，但採用習用分批方法。如在實例8中，將目標抗體作為包括40 mM檸檬酸鈉之混合物之一部分裝載，平衡至pH為6.5。利用包括40 mM tris及40 mM檸檬酸鈉之緩衝液溶析目標抗體，平衡至pH為6.5 ± 0.1。使用包括一系列以下各項之方案使管柱再生：(1) 水，(2) 鹼性溶液，(3) 水，(4) 醇溶液，及(5) 水。參數及結果連同實例8之參數及結果一起彙總於表6中。如自表6中之數據可見，實例8之連續HIC方法之生產率大約係比較分批製程實例之5.7倍。 表6
Figure 108122728-A0304-0006
 實例 9
使用自實例6收集之數據來開發闡述層析裝置所含管柱之數量與使用該裝置之連續HIC之生產率之間的關係之模型，其中生產率視為每小時每公升樹脂所純化目標抗體克數(g/L *h)之量度。該模型假定使用單一鹼性再生溶液及IgG1目標抗體。該模型亦假定恆定97.3%產率、恆定4.7 mL/min裝載速率、恆定裝載濃度及恆定15 CV (管柱體積)裝載體積。當預測包括三個以上管柱之HIC裝置之生產率時，調整理論洗滌、汽提及平衡流速以維持在連續HIC期間所有管柱均連續佔據之模型。此外，為尤其模擬雙管柱裝置，假定一個管柱將處於裝載步驟中且一個管柱將處於洗滌/汽提/再生步驟中，如同在其他連續HIC方案中一般省略兩階段裝載步驟。表7列示用於生成每一HIC裝置之預測生產率之數據。圖8A顯示與52.1 g/L∙小時之批生產率相比所模擬關係之圖。 表7
Figure 108122728-A0304-0007
 實例 10
使用自實例8收集之數據來開發闡述層析裝置所含管柱之數量與使用該裝置之連續HIC之生產率之間的關係之模型。該模型假定使用包括水、鹼性溶液及醇溶液之多流體再生程序。該模型亦假定恆定86.4%產率、恆定5.0 mL/min裝載速率、恆定裝載濃度及恆定10.3 CV裝載體積。當預測包括三個以上管柱之HIC裝置之生產率時，調整理論洗滌、汽提及平衡流速以維持在連續HIC期間所有管柱均連續佔據之模型。表8列示用於生成每一HIC裝置之預測生產率之數據。圖8B顯示與21.1 g/L∙小時之批生產率相比所模擬關係之圖。 表8
Figure 108122728-A0304-0008
熟習此項技術者應瞭解，本揭示案所基於之概念可容易地用作用於設計供實施本揭示案之解決方案及目的之其他方法及系統之基礎。因此，申請專利範圍不應視為受前述說明所限制。
併入本說明書中且構成本說明書之一部分之附圖圖解說明各個例示性實施例，且與本說明一起用於解釋所揭示實施例之原理。本文所述實施例或實例(例如，組合物、調配物、方法等)之任何特徵可與任一其他實施例或實例組合，且所有此等組合均涵蓋於本揭示案中。此外，所闡述之系統及方法既不限於任一單一態樣或其實施例，亦不限於此等態樣及實施例之任何組合或排列。為簡潔起見，本文中未單獨論述及/或說明某些排列及組合。
圖1係繪示根據本揭示案之一些實施例之層析裝置之區域的一部分之示意圖。
圖2係根據本揭示案之一些實施例之層析裝置之示意性繪示。
圖3A係根據本揭示案之一些實施例之用於製備目標多肽的例示性方法之圖形繪示；且
圖3B至圖3D係繪示如圖3A中所示用於製備目標多肽之方法之簡化圖解。
圖4係根據本揭示案之一些實施例之層析裝置之示意性繪示。
圖5A係根據本揭示案之一些實施例之用於製備目標多肽之例示性方法之圖形繪示；且
圖5B至圖5E係繪示如圖5A中所示用於製備目標多肽之方法之簡化圖解。
圖6係根據本揭示案之一些實施例之用於製備目標多肽之方法之流程圖。
圖7A係根據本揭示案之一態樣，高分子量物質百分比隨負載而變之圖。
圖7B係根據本揭示案之一態樣，宿主細胞蛋白量隨負載而變之圖。
圖7C係根據本揭示案之一態樣，高分子量物質百分比隨負載濃度而變之圖。
圖8A係根據本揭示案之一態樣，生產率隨層析管柱數而變之圖。
圖8B係根據本揭示案之一態樣，生產率隨層析管柱數而變之圖。
如本文所用，術語「包含(comprises、comprising)」或其任何其他變化形式意欲涵蓋非排他性內含物，使得包含一系列要素之製程、方法、物件或裝置並非僅包括彼等要素，而是可包括未明確列出或此製程、方法、物件或裝置所固有之其他要素。術語「例示性」係以「實例」而非「理想」之意義上使用。除非另有明確說明，否則對於術語「舉例而言」及「諸如」以及其文法等效形式而言，應理解片語「且不限於」跟隨其後。
如本文所用，術語「約」意在解釋由實驗誤差所致之變化。當應用於數值時，術語「約」可指示自所揭示數值變化+/- 10% (除非指定不同變化)。除非上下文另外明確指示，否則如本文所用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
應注意，本文所揭示之所有數值(包括所有所揭示之值、限值及範圍)可自所揭示數值具有+/- 10%之變化(除非指定不同變化)。此外，在技術方案中，值、限值及/或範圍意指該值、限值及/或範圍+/- 10%。類似地，如本文所用之片語「大致相同」可意指在+/- 10%變化內之等效值。此外，應理解所有範圍均包括終點，例如1公分(cm)至5 cm將包括1 cm、5 cm之長度及介於1 cm與5 cm之間的所有距離。

Claims (20)

  1. 一種自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法，該方法包含： 使包括該目標多肽之該混合物與疏水性相互作用層析(HIC)裝置之第一區接觸，該第一區具有一或多個層析管柱及一出口； 使一或多個移動相與該HIC裝置之第二區接觸，該第二區具有一或多個層析管柱及一出口；及 使該目標多肽穿過該HIC裝置之至少該第一區及該第二區之該等出口； 其中包括該目標多肽之該混合物在該第一區中之滯留時間經構形以與該一或多個移動相在該第二區中之滯留時間大致相同。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該目標多肽係單株抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多個移動相包含平衡緩衝液及洗滌緩衝液。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含將包括該目標多肽之流出物自該HIC裝置之該第一區傳送至該HIC裝置之該第二區。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使該一或多個移動相與該HIC裝置之該第二區接觸包括： 使洗滌緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸；及 在使該洗滌緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸之後，使該第二區再生，其中使該第二區再生包含： 使水與該HIC裝置之該第二區接觸， 使鹼性溶液與該HIC裝置之該第二區接觸， 使醇溶液與該HIC裝置之該第二區接觸，及 使平衡緩衝液與該HIC裝置之該第二區接觸。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中在使洗滌緩衝液與該HIC裝置之第二區接觸之後，使該目標多肽穿過該HIC裝置之該第二區之該出口。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中滯留溶液之紫外吸收、導電率或pH中之一或多者係在該第一區或該第二區之出口處量測。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該目標多肽係以大於或等於50 g/L∙小時之生產率製備。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一區或該第二區包括一個以上層析管柱。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該HIC裝置進一步包括具有一或多個層析管柱及一出口之第三區，且其中該方法進一步包含： 在該第三區上實施再生循環，其中實施該再生循環包含使一或多個移動相與該第三區接觸，其中該再生循環之持續時間經構形以與包括該目標多肽之該混合物在該第一區中之該滯留時間大致相同。
  11. 一種自包括目標多肽之混合物製備該目標多肽之方法，該方法包含： 將包括該目標多肽之該混合物傳送至疏水性相互作用層析(HIC)裝置中之複數個層析管柱中之第一管柱，其中該複數個管柱中之每一者包含可與該複數個管柱中之另一管柱連接之出口； 將包括該目標多肽之流出物自該複數個管柱中之該第一管柱傳送至第二管柱； 將一或多個移動相傳送至該複數個管柱中之第三管柱，及 使該目標多肽穿過該複數個管柱中之每一者之該等出口，其中包括該目標多肽之該混合物在該第一管柱及該第二管柱中之滯留時間總和與該一或多個移動相在該第三管柱中之滯留時間總和實質上相同。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其進一步包含將一或多個移動相傳送至該複數個管柱中之每一者。
  13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中將一或多個移動相傳送至管柱包括： 將洗滌緩衝液傳送至該管柱；及 在將洗滌緩衝液傳送至該管柱之後，使該管柱再生，其中使該管柱再生包含將水、鹼性溶液、醇溶液或平衡緩衝液傳送至該管柱。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中使目標多肽穿過該管柱出口之步驟係在洗滌緩衝液已傳送至該管柱之後發生。
  15. 如申請專利範圍第11項之方法，其中滯留溶液之紫外吸收、導電率或pH中之一或多者係在該第一管柱或該第二管柱之該出口處量測。
  16. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該目標多肽係以大於或等於50 g/L∙小時之生產率製備。
  17. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該HIC裝置包括四個管柱，且包括該目標多肽之該混合物在該一管柱及該第二管柱中之滯留時間總和與該第三管柱及第四管柱之再生時間總和實質上相同。
  18. 一種使用複數個層析管柱製備抗體之方法，其中該複數個層析管柱中之每一者包括疏水性相互作用介質，該方法包含： 在第一階段中： 將一定量之包括該抗體之混合物裝載至該複數個管柱中之第一管柱中； 將一定量之該混合物經由該第一管柱裝載至該複數個管柱中之第二管柱中，及 在該複數個管柱中之第三管柱中實施包括洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之非裝載步驟； 在第二階段中： 將一定量之包括該抗體之該混合物裝載至該第二管柱中； 將一定量之該混合物經由該第二管柱裝載至該第三管柱中；及 在該第一管柱中進行包含洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之該非裝載步驟；且 在第三階段中： 將一定量之包括該抗體之該混合物裝載至該第三管柱中； 將一定量之該混合物經由該第二管柱裝載至該第三管柱中；及 在該第二管柱中實施包括洗滌、汽提及平衡製程中之至少一者之該非裝載步驟。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其進一步包含在循環中連續重複該等第一、第二及第三階段，且其中每一階段包含同時實施該等裝載及非裝載步驟。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該等裝載步驟中之一者之持續時間經構形以與該非裝載步驟之持續時間大致相同。
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