JP7142643B2 - Hdac阻害剤またはrepタンパク質を伴う細胞培養方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年3月22日に出願された米国出願番号第62/475,112号に基づく利益および優先権を主張しており、この出願の全体の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
本発明は、HDAC阻害剤またはアデノ随伴ウイルス(AAV)repタンパク質の使用を伴う細胞培養法に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、非病原性の複製欠損パルボウイルスである。組換えAAV(rAAV)ベクターは、それらを遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものとする多くの独特の特徴を有する。特に、rAAVベクターは、***細胞および非***細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。rAAVの幅広い治療応用を考えると、多量のウイルスを費用対効果の高い様式で産生することは有用である。安定な真核細胞株は、宿主ゲノムの第19染色体に優先的に組み込まれるrAAVベクターを用いてそれらをトランスフェクトするによって生成されうる。しかし、典型的には費用対効果の高い製造工程を開発するのに十分高いrAAV収率を有する1つの産生細胞株を同定するために、数千の細胞クローンが複数回のトランスフェクション実行からスクリーニングされなければならない。したがって、高収率のrAAVを産生する安定細胞株を生成する方法の改善に対する必要性がある。
AAV rep mRNAの送達が、例えば、rAAV安定細胞株の生成およびこれらの細胞から収集されるrAAVベクターの力価を増強するために使用されうることが今や発見された。したがって、本発明の一態様は、rAAVベクター力価を増加させる、または、例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、rAAV収率を増強する方法を提供する。方法は、rAAVベクターをrep mRNA(例えば、rep68および/またはrep78 mRNA)と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達(co-delivering)すること、ならびに細胞培養物からrAAVを収集することを含む。
本発明は、トリコスタチンAなどのHDAC阻害剤が、組換えポリヌクレオチドと共に真核細胞に共送達され得、それが例えば、真核細胞におけるポリヌクレオチドの組み込みおよび/または発現を促進できるという発見に部分的に基づいている。本発明は、rep mRNA(例えば、rep68およびrep78)ならびに/またはHDAC阻害剤が、rAAVベクターと共に宿主細胞に共送達されてよく、例えば宿主細胞へのrAAVの送達および組み込み、宿主細胞でのrAAVの増幅ならびに/または宿主細胞によって産生されるrAAVの力価を増強するという発見にも部分的に基づいている。
I.rAAVの産生の増加
II.安定細胞株の生成
III.組換えポリヌクレオチドのHDAC阻害剤を伴う共送達
懸濁液で培養したHeLa S3細胞を、それらを接着培養条件に適合させるためにトランスフェクションの前日に蒔いた。トランスフェクション当日に、15μgのrAAVベクターを0、0.75または1μgのrep68 mRNAと0、30nMまたは100nMトリコスタチンA(TSA)と組み合わせて混合し、次に0.2cmギャップキュベット(gap cuvette)中100V、30msでのエレクトロポレーションによって細胞106個にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、細胞を10%FBSを含有するDMEM培地を含む96ウエルプレートに蒔く前に室温で、5分間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、400ng/mlピューロマイシンを含有する培地を、それらのゲノムに組み込まれたrAAVベクターを有する細胞を選択するために使用した。トランスフェクション後10日目に増殖したコロニーの数を各プレートで計数した。図1は、rAAVベクターの、種々の量のrep68 mRNAおよび/またはTSAを伴う共送達後の細胞コロニーの定量を示している。結果は、96ウエルプレートに蒔き、抗生物質選択した後に増殖したコロニーの数を表している。TSAを含まない1μgのrep68のトランスフェクション条件下のコロニーの数は、10枚の96ウエルプレートからの平均であった(+/-標準偏差)。結果は、rAAVベクターのrep68 mRNAを伴う同時トランスフェクションがコロニー形成を顕著に増強し、TSAもコロニー形成を中程度に増加させることを示している。
rAAV産生
安定細胞株の生成
安定細胞株からのrAAV収率
番号付き実施形態
a)rAAVベクターをrep mRNAと共に真核細胞培養物に共送達すること;および
b)前記真核細胞培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増加させること
を含む方法。
a)rAAVベクターをrep mRNAと共に真核細胞に共送達すること;
b)真核細胞ゲノムに組み込まれたrAAVベクター配列を含有する真核細胞を同定すること;および
c)必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増強すること
を含む方法。
参照による組み込み
均等物
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
組換えAAV(rAAV)ベクター力価を増加させる方法であって、
a)rAAVベクターをrep mRNAと共に真核細胞培養物に共送達すること;および
b)前記真核細胞培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増加させること
を含む方法。
(項目2)
前記rep mRNAがrep68 mRNAおよびrep78 mRNAからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目8に記載の方法。
(項目11)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目8に記載の方法。
(項目12)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがDEAEデキストランへの曝露を含む、項目8に記載の方法。
(項目13)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目8に記載の方法。
(項目14)
組換えAAV(rAAV)を産生するための細胞株を開発する方法であって、
a)rAAVベクターをrep mRNAと共に真核細胞に共送達すること;
b)真核細胞ゲノムに組み込まれたrAAVベクター配列を含有する真核細胞を同定すること;および
c)必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増強すること
を含む方法。
(項目15)
前記rep mRNAがrep68 mRNAおよびrep78 mRNAからなる群から選択される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目14に記載の方法。
(項目18)
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目14に記載の方法。
(項目19)
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目14に記載の方法。
(項目20)
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目14に記載の方法。
(項目21)
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目14に記載の方法。
(項目22)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがDEAEデキストランへの曝露を含む、項目21に記載の方法。
(項目26)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目21に記載の方法。
(項目27)
HDAC阻害剤および組換えポリヌクレオチドを真核細胞に共送達することを含む方法。
(項目28)
前記真核細胞の1つのゲノムへの前記組換えポリヌクレオチドの組み込みを検出するステップをさらに含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記真核細胞ゲノムに組み込まれた前記組換えポリヌクレオチドを含む安定細胞株を確立するステップをさらに含む、項目27または28に記載の方法。
(項目30)
前記真核細胞内の前記組換えポリヌクレオチドの存在に依存して遺伝子産物を発現するステップをさらに含む、項目27から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記遺伝子産物がリボ核酸である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記遺伝子産物がポリペプチドである、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記ポリヌクレオチドが前記遺伝子産物をコードする、項目30に記載の方法。
(項目34)
前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスベクターを含む、項目30に記載の方法。
(項目35)
前記組換えウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAVベクター)である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記真核細胞の培養物から組換えウイルスを収集するステップをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記真核細胞の培養物から組換えAAVを収集するステップをさらに含む、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目27に記載の方法。
(項目39)
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目27に記載の方法。
(項目40)
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目27に記載の方法。
(項目41)
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目27に記載の方法。
(項目42)
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目27に記載の方法。
(項目43)
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目27に記載の方法。
(項目44)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目43に記載の方法。
(項目47)
前記化学物質に基づくトランスフェクションがDEAEデキストランへの曝露を含む、項目43に記載の方法。
(項目48)
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目43に記載の方法。
(項目49)
前記HDAC阻害剤がトリコスタチンAである、項目27から48のいずれか一項に記載の方法。
Claims (22)
- 組換えAAV(rAAV)ベクター力価を増加させる方法であって、
a)rAAVベクターをAAV rep mRNAと共に真核細胞培養物に共送達すること;
b)前記真核細胞培養物にヘルパーアデノウイルスを感染させること;および
c)前記真核細胞培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増加させること
を含み、前記rep mRNAが、rep68 mRNAおよびrep78 mRNAからなる群から選択される、方法。 - 前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することが磁気ビーズを伴う、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがナノ粒子を伴う、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがセルスクイージングを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することが脂質への曝露を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがリン酸カルシウムへの曝露を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することがDEAEデキストランへの曝露を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記共送達することが活性化デンドリマーへの曝露を含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えAAV(rAAV)を産生するための細胞株を開発する方法であって、
a)rAAVベクターをAAV rep mRNAと共に真核細胞培養物に共送達すること;
b)前記真核細胞培養物にヘルパーアデノウイルスを感染させること;
c)真核細胞ゲノムに組み込まれたrAAVベクター配列を含有する真核細胞を同定すること;および
d)前記真核細胞を含む培養物からrAAVを収集することであって、前記rep mRNAを伴う前記共送達が前記収集されるrAAVの力価を増強すること
を含み、前記rep mRNAが、rep68 mRNAおよびrep78 mRNAからなる群から選択される、方法。 - 前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することが磁気ビーズを伴う、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがナノ粒子を伴う、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがセルスクイージングを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することが脂質への曝露を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがリン酸カルシウムへの曝露を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することがDEAEデキストランへの曝露を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記共送達することが活性化デンドリマーへの曝露を含む、請求項12に記載の方法。
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