ES2278663T3 - Antagonistas del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares vegf. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un antagonista del hVEGF, el cual es un receptor del hVEGF aislado, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores.
Description
Antagonistas del factor de crecimiento de
células endoteliales vasculares VEGF.
La presente invención se refiere a antagonistas
del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares
(VEGF), a composiciones terapéuticas que comprenden los
antagonistas, y a procedimientos para el uso de los antagonistas con
propósitos diagnósticos y terapéuticos.
Los dos componentes celulares mayoritarios del
sistema vascular son las células endoteliales y del músculo liso.
Las células endoteliales forman el recubrimiento de la superficie
interna de los vasos sanguíneos, y constituyen una interficie no
trombógena entre la sangre y los tejidos. Además, las células
endoteliales son un componente importante para el desarrollo de
nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células
endoteliales proliferan durante la angiogénesis o la
neovascularización asociadas al crecimiento tumoral y metástasis, y
a una diversidad de enfermedades no neoplásicas o alteraciones.
Varios polipéptidos, que ocurren de forma
natural, inducen presumiblemente la proliferación de las células
endoteliales. Entre esos polipéptidos se hallan los factores ácido y
básico de crecimiento de fibroblastos (FGF), Burgess y Maciag,
Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), el factor de crecimiento
endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF),
Ishikawa et al., Nature, 338:557 (1989), y el factor
de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Leung et al.,
Science 246:1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 161:851 (1989); Tischer et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 165:1198 (1989); Ferrara et al.,
patente publicada del PCT con el nº WO 90/13.649 (publicada el 15 de
noviembre de 1990); Ferrara et al., patente estadounidense
con nº de solicitud 07/360.229.
El VEGF se identificó primero en medio
acondicionado por células foliculares o foliculoestrelladas de la
pituitaria bovina. El análisis bioquímico indica que el VEGF bovino
es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de
aproximadamente 45.000 daltones, y con una especificidad mitogénica
aparente por las células endoteliales vasculares. El ADN que
codifica el VEGF bovino se aisló examinando una biblioteca de cADN
preparada a partir de tales células, usando oligonucleótidos basados
en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la
proteína como sondas de hibridación.
El VEGF humano se obtuvo examinando primero una
biblioteca de cADN preparada a partir de células humanas, usando
cADN de VEGF bovino como sonda de hibridación. Un cADN identificado
de ese modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene más
del 95% de homología con el VEGF bovino, proteína que se denomina
como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitogénica del VEGF humano
se confirmó expresando el cADN del VEGF humano en células huésped de
mamífero. El medio acondicionado por células transfectadas con el
cADN de VEGF humano promovió la proliferación de células
endoteliales de capilares, mientras que las células control no lo
hicieron. Leung et al., Science 246:1306 (1989).
Se identificaron varios cADN adicionales en
bibliotecas de cADN humano que codifican isoformas de 121, 189 y
206 aminoácidos del hVEGF (también denominadas colectivamente como
proteínas relacionadas con el hVEGF). La proteína de 121
aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la supresión de 44
aminoácidos entre los residuos 116 y 159 del hVEGF. La proteína de
189 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la inserción de 24
aminoácidos en el residuo 116 de hVEGF, y es aparentemente idéntica
al factor de permeabilidad vascular humano (hVPF). La proteína de
206 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de una inserción de 41
aminoácidos en el residuo 116 de hVEGF. Houck, et al., Mol.
Endocrin. 5: 1806 (1991); Ferrara, et al., J. Cell.
Biochem. 47:211 (1991); Ferrara, et al., Endocrine
Reviews 13:18 (1992); Keck, et al., Science
246:1309 (1989); Connolly, et al., J. Biol. Chem.
264:20017 (1989); Keck, et al., patente de la EPO
publicada nº 0.370.989 (publicada el 30 de mayo de 1990).
El VEGF no sólo estimula la proliferación de las
células endoteliales vasculares, sino que también induce la
permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que
implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de
endotelio preexistente, es un componente importante de una
diversidad de enfermedades y desórdenes, incluyendo el crecimiento
tumoral y la metástasis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la
ateroesclerosis, la retinopatía diabética, la fibroplasia posterior
del cristalino (retrolental fibroplasia), el glaucoma
neovascular, los hemangiomas, el rechazo inmune del tejido de la
córnea transplantado y de otros tejidos, y la inflamación
crónica.
En el caso del crecimiento tumoral, la
angiogénesis parece ser crucial para la transición desde hiperplasia
a neoplasia, y para proporcionar nutrientes al tumor sólido en
crecimiento. Folkman, et al., Nature 339:58 (1989). La
angiogénesis también permite que los tumores estén en contacto con
el lecho vascular del huésped, lo que puede proporcionar una ruta
para la metástasis de las células tumorales. La evidencia del papel
de la angiogénesis en la metástasis tumoral se obtiene, por
ejemplo, mediante estudios que muestran la correlación entre el
número y densidad de microvasos en cortes histológicos de carcinoma
de mama invasor humano y la presencia efectiva de metástasis
distantes. Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1
(1991).
\newpage
A la vista del papel del crecimiento de las
células endoteliales vasculares y de la angiogénesis, y del papel
de estos procesos en múltiples enfermedades y desórdenes, es
deseable disponer de medios para reducir o inhibir uno o más de los
efectos biológicos del VEGF. Es también deseable disponer de medios
de ensayo para la presencia de VEGF en condiciones normales y
patológicas, y especialmente cáncer.
La presente invención proporciona usos, tal y
como se definen en las reivindicaciones, de antagonistas del VEGF,
siendo dichos antagonistas el receptor del hVEGF y las variantes del
mismo. Los antagonistas inhiben la actividad mitogénica,
angiogénica, u otras actividades biológicas del hVEGF, y, por tanto,
son útiles para el tratamiento de los tumores, y especialmente los
tumores sólidos malignos.
En otros aspectos, los antagonistas del VEGF
están conjugados con una parte citotóxica.
El medicamento es para su administración a un
mamífero, preferiblemente un paciente humano, que precisa de dicho
tratamiento. Si se desea, el antagonista del VEGF se coadministra,
bien simultánea o secuencialmente, con uno o más de otros
antagonistas del VEGF, o con sustancias antitumorales o
antiangiogénicas.
La Figura 1 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o un
anticuerpo irrelevante contra un factor del crecimiento de
hepatocitos (anti-HGF), sobre la unión del
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF al hVEGF.
La Figura 2 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o un
anticuerpo anti-HGF irrelevante, sobre la actividad
biológica del hVEGF en cultivos de células endoteliales capilares
del córtex adrenal (ACE) bovino.
La Figura 3 muestra el efecto de anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1)
sobre la unión del hVEGF a células ACE bovinas.
La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento
con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre la
velocidad de crecimiento de tumores NEG55 en ratones.
La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento
con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el
tamaño de tumores NEG55 en ratones después de cinco semanas de
tratamiento.
La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento
con anticuerpo monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF (VEGF
Ab) sobre el crecimiento de tumores
SK-LM-1 en ratones.
La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento
con dosis variables de anticuerpo monoclonal A4.6.1
anti-hVEGF (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores
A673 en ratones.
La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el crecimiento y
supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.
La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre el crecimiento y
supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.
La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo
monoclonal A4.6.1 anti-hVEGF sobre la quimiotaxis de
células endoteliales humanas inducida por líquido sinovial
humano.
El término "hVEGF" se ha usado en la
presente invención para referirse al factor de crecimiento de
células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos, y a los
factores de crecimiento de células endoteliales relacionados de
121, 189 y 206 aminoácidos, según fueron descritos por Leung, et
al., Science 246:1306 (1989), y Houck, et al.,
Mol. Endocrin. 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y
procesadas, que ocurren de forma natural, de estos factores del
crecimiento.
La presente invención usa antagonistas del
hVEGF, tal y como se definen en las reivindicaciones, que son
capaces de inhibir una o más de las actividades biológicas del
hVEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los
antagonistas del hVEGF actúan interfiriendo la unión del hVEGF a un
receptor celular, incapacitando o matando células que han sido
activadas por el hVEGF, o interfiriendo la activación de las células
endoteliales vasculares después de la unión del hVEGF a un receptor
celular. Todos estos puntos de intervención mediante un antagonista
del hVEGF deberían considerase equivalentes para los propósitos de
esta invención. Por tanto, se encuentran incluidos dentro del
ámbito de la invención el receptor del hVEGF y fragmentos y
variantes de la secuencia de aminoácidos del mismo, los cuales son
capaces de unir el hVEGF.
El término "receptor del hVEGF" o
"hVEGFr", tal y como se usa en la presente invención, se
refiere a un receptor celular del hVEGF, ordinariamente un receptor
de la superficie celular que se encuentra en células endoteliales
vasculares, así como variantes del mismo que retienen la capacidad
de unir el hVEGF. Típicamente, los receptores del hVEGF, y las
variantes de los mismos que son antagonistas del hVEGF, estarán en
una forma aislada en vez de estar integrados en una membrana
celular o fijados a una superficie celular, como puede ser el caso
en la naturaleza. Un ejemplo de un receptor del hVEGF es la tirosina
quinasa similar a fms (flt), un receptor
transmembrana de la familia de las tirosina quinasas. DeVries, et
al., Science 255:989 (1992), Shibuya, et al.,
Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt comprende un
dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio
intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular
está implicado en la unión del hVEGF, mientras que el dominio
intracelular está implicado en la transducción de la señal.
Otro ejemplo de un receptor del hVEGF es el
receptor flk-1 (también denominado KDR).
Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026
(1991); Terman, et al., Oncogene 6:1677 (1991);
Terman, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579
(1992).
La unión del hVEGF al receptor flt
resulta en la formación de al menos dos complejos de elevado peso
molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y
300.000 daltones. El complejo de 300.000 daltones se cree que es un
dímero que comprende dos moléculas receptoras unidas a una única
molécula de hVEGF.
Las variantes del hVEGFr también se incluyen en
el ámbito de la presente invención. Los ejemplos representativos
incluyen las formas truncadas de un receptor en el que los dominios
transmembrana y citoplasmático están suprimidos en el receptor, y
las proteínas de fusión en las cuales los polímeros o polipéptidos
que no son del hVEGFr están conjugados con el hVEGFr, o,
preferiblemente, formas truncadas de los mismos. Un ejemplo de un
polipéptido de no es hVEGF es una inmunoglobulina. Es ese caso, por
ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con un
dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) pesada de una
inmunoglobulina, con el extremo C-terminal del
dominio extracelular del receptor unido covalentemente al extremo
amino-terminal del CH1, gozne, CH2 u otro fragmento
de la cadena pesada. Tales variantes se preparan de la misma forma
que las inmunoadhesinas conocidas. Ver, por ejemplo, Gascoigne,
et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84:2936 (1987); Capon,
et al., Nature, 337:525 (1989); Aruffo, et al.,
Cell, 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc. Nat.
Acad. Sci., 88:10535 (1991); Bennett. et al., J.
Biol. Chem., 266:23060 (1991). En otras realizaciones, el
hVEGFr se conjuga con un polímero no proteico tal como el
polietilenglicol (PEG) (ver, por ejemplo, Davis, et al.,
patente estadounidense nº 4.179.337; Goodson, et al.,
BioTechnology 8:343-346 (1990); Abuchowski,
et al., J. Biol. Chem. 252:3578 (1977); Abuchowski,
et al., J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)) o
carbohidratos (ver, por ejemplo, Marshall, et al., Arch.
Biochem. Biophys. 167:77 (1975)). Esto sirve para extender la
vida media biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el
receptor sea inmunogénico en el mamífero al cual se le administra.
El hVEGFr se usa sustancialmente de la misma forma que los
anticuerpos contra el hVEGF, teniendo en cuenta la afinidad del
antagonista y su valencia por el hVEGF.
El dominio extracelular del receptor del hVEGF,
bien por sí mismo o unido a un polipéptido de inmunoglobulina u otro
polipéptido portador, es especialmente útil como antagonista del
hVEGF, gracias a su capacidad para secuestrar hVEGF que está
presente en una célula huésped pero que no está unido a hVEGFr sobre
una superficie celular.
El término "recombinante", usado en
referencia al hVEGF, al receptor de hVEGF, a los anticuerpos
monoclonales, y otras proteínas, se refiere a proteínas que se
producen mediante expresión de cADN recombinante en una célula
huésped. La célula huésped puede ser procariota (por ejemplo, una
célula bacteriana tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo,
una célula de levadura o de mamífero).
En algunas realizaciones es deseable
proporcionar una parte citotóxica conjugada con el hVEGFr. En estas
realizaciones, la citotoxina sirve para incapacitar o matar células
que están expresando o uniendo hVEGF. El conjugado es dirigido
hacia la célula por el dominio, el cual es capaz de unirse a hVEGF,
hVEGFr, o al complejo hVEGF-hVEGFr. Por tanto, el
hVEGFr se conjuga a una citotoxina. No es necesario, en esta
realización, que el receptor sea capaz de nada más que de unirse al
hVEGF o al complejo hVEGF-hVEGFr.
Típicamente, la citotoxina es una citotoxina
proteica, por ejemplo, la difteria, ricina, o la toxina de
pseudomonas. No obstante, la citotoxina no necesita ser proteica, y
puede incluir agentes quimioterapéuticos empleados a partir de
ahora, por ejemplo, en el tratamiento de tumores.
La citotoxina está habitualmente unida a un
anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, mediante un enlace
amida de la estructura (backbone amide bond) dentro de (o en
lugar de parte o de la totalidad de) el dominio Fc del anticuerpo.
Cuando la función de dirigir la proporciona el hVEGFr, la porción
citotóxica se sustituye sobre cualquier dominio del receptor que no
participe en la unión del hVEGF; preferiblemente, la porción se
sustituye en lugar de o sobre los dominios transmembrana y/o
citoplasmático del receptor. El sitio de sustitución óptimo se
determinará mediante experimentación rutinaria, y se incluye entre
los conocimientos ordinarios.
Los conjugados que son fusiones de proteínas se
construyen fácilmente mediante cultivo de células recombinantes y
expresión de un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los
conjugados se construyen mediante entrecruzamiento covalente de la
porción citotóxica a la cadena lateral de un residuo aminoácido, o
al carboxilo C-terminal del anticuerpo o del
receptor, usando procedimientos conocidos per se, tales como
el intercambio de disulfuro, o el engarce a través de un enlace
tioéster usando, por ejemplo, iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimadato.
Los hVEGFr que son antagonistas del hVEGF
también se conjugan a sustancias que no pueden clasificarse
fácilmente como citotoxinas en sentido estricto, pero que aumentan
la actividad de las composiciones en la presente invención. Por
ejemplo, se fusionan hVEGFr, capaces de unirse al hVEGF o al
complejo hVEGF-hVEGFr, con polipéptidos heterólogos,
tales como secuencias virales, con receptores celulares, con
citoquinas tales como TNF, interferones, o interleucinas, con
polipéptidos que tienen una actividad procoagulante, y con otros
polipéptidos activos biológica o inmunológicamente. Tales fusiones
se consiguen fácilmente mediante procedimientos recombinantes.
Típicamente, tales polipéptidos que no son de inmunoglobulina se
sustituyen por el dominio transmembrana y/o intracelular de un
hVEGFr.
La observación de que el hVEGF parece ser capaz
de formar un complejo con dos o más moléculas del hVEGFr sobre la
superficie de una célula sugiere que el hVEGF tiene al menos dos
sitios discretos para unirse al hVEGFr, y que se une a tales
receptores celulares de forma secuencial, primero en un sitio y a
continuación en el otro, antes de que ocurra la activación, de la
forma en que lo hacen la hormona del crecimiento, la prolactina y
similares (ver, por ejemplo, Cunningham, et al., Science
254:821 (1991); deVos, et al., Science 255:306
(1992); Fuh, et al., Science 256:1677 (1992)). En
consecuencia, se seleccionan variantes antagonistas del hVEGF en
las que un sitio de unión al receptor del hVEGF (típicamente, el
sitio implicado en la unión inicial del hVEGF al hVEGFr) permanece
inalterado (o, si se modifica, se varía para mejorar su unión),
mientras que un segundo sitio de unión al receptor del hVEGF
típicamente se modifica mediante sustitución o sustituciones no
conservadoras de residuos aminoácidos, o mediante supresión o
supresiones, con objeto de hacer no operativo el sitio de unión.
Los dominios de unión en el hVEGF y los dominios
unidores del hVEGF en el hVEGFr se determinan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los estudios con
rayos X, los análisis de mutaciones, y los estudios de unión a
anticuerpos. Las estrategias de mutaciones incluyen las técnicas de
mutagénesis de saturación aleatoria acoplada con la selección de
mutantes de fuga, y la mutagénesis por inserción. Otra estrategia
apropiada para identificar los dominios de unión al receptor en los
ligandos se conoce como mutagénesis por barrido con alanina (Ala).
Cunningham, et al., Science
244:1081-1085 (1989). Este procedimiento
implica la identificación de regiones que contienen cadenas
laterales de aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada
región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son
remplazados (una región por molécula mutante) con Ala, y se ensaya
la unión al receptor de los ligandos obtenidos, para verificar la
importancia de la región concreta en la unión al receptor. Un
potente procedimiento adicional para la localización de los
dominios de unión al receptor es a través del uso de anticuerpos
anti-hVEGF neutralizantes. Kim et al.,
Growth Factors 7:53 (1992). Habitualmente se usa una
combinación de éstos y similares procedimientos para localizar los
dominios implicados en la unión al receptor.
El término "variante de la secuencia de
aminoácidos" usado en referencia al hVEGF se refiere a
polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere
hasta cierto punto de las secuencias de aminoácidos de las formas
nativas del hVEGF. Ordinariamente, las variantes de la secuencias de
aminoácidos antagonistas poseerán al menos aproximadamente el 70%
de homología con al menos un dominio unidor al receptor de un hVEGF
nativo, y preferiblemente, serán aproximadamente el 80%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% homólogas con un
dominio de unión al receptor de un hVEGF nativo. Las variantes de la
secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones y/o
inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de
aminoácidos del hVEGF nativo, de tal forma que las variantes
retienen la capacidad para unirse al receptor del hVEGF (y, por
tanto, para competir con el hVEGF nativo por la unión al receptor
del hVEGF), pero no consiguen inducir uno o más de los efectos
biológicos del hVEGF, tales como la proliferación de las células
endoteliales, la angiogénesis, o la permeabilidad vascular.
"Homología" se define como el porcentaje de
residuos en la secuencia de aminoácidos que son idénticos a los
residuos en la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión al
receptor de un hVEGF nativo, después de alinear las secuencias e
introducir espacios, si es preciso, para conseguir el máximo
porcentaje de homología. Los procedimientos y programas de
ordenador para el alineamiento son bien conocidos en la técnica. Uno
de tales programas es el "Align 2" escrito por Genentech,
Inc., el cual se registró con la documentación del usuario en la
U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, el 10 de diciembre de
1991. Las variantes por sustitución son aquellas que tiene al menos
un residuo aminoácido en una secuencia nativa suprimido y un
aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición.
Las sustituciones pueden ser simples, en las que sólo se ha
sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en
las que dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma
molécula.
Las variantes por inserción son aquéllas que
tienen uno o más aminoácidos insertados de forma inmediatamente
adyacente a un aminoácido en una posición determinada en una
secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido
significa conectado, bien al grupo funcional
\alpha-carboxilo o \alpha-amino
del aminoácido.
Las variantes por supresión son aquéllas con uno
o más residuos aminoácidos suprimidos en una secuencia de
aminoácidos. Ordinariamente, las variantes por supresión tienen uno
o dos residuos aminoácidos suprimidos en una región determinada de
la molécula.
Los fragmentos y las variantes de la secuencia
de aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis
dirigida a un sitio del ADN que codifica el factor nativo. El ADN
mutado se inserta en un vector de expresión apropiado, y a
continuación se transfectan las células huéspedes con el vector
recombinante. Las células huéspedes recombinantes se cultivan en
medios de cultivo apropiados, y el fragmento deseado o la variante
de la secuencia de aminoácidos expresados en las células huéspedes
se recuperan entonces del cultivo de células recombinantes mediante
procedimientos cromatográficos u otros procedimientos de
purificación.
Alternativamente, los fragmentos y variantes de
aminoácidos del hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo,
mediante proteolisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis usando
procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida,
tal y como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc.
85:2149 (1963)), aunque pueden usarse otras síntesis
químicas equivalentes conocidas en la técnica. La síntesis en fase
sólida se inicia a partir del extremo C-terminal
del péptido, acoplando un \alpha-aminoácido
protegido a una resina apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la
cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en el campo para la
formación de enlaces peptídicos.
Para las aplicaciones terapéuticas, los
antagonistas de la invención se administran a un mamífero,
preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación
farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que pueden
administrarse a un humano intravenosamente como un bolo, o mediante
infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante ruta
intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea,
intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral,
tópica, o de inhalación. Los antagonistas también se administran de
forma apropiada mediante ruta intratumoral, peritumoral,
intralesión, o perilesión, para ejercer efectos terapéuticos
locales, así como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal
sea especialmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de
ovarios.
Tales formas de dosificación abarcan portadores
farmacéuticamente aceptables que son, de forma inherente, no
tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen
los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de
aluminio, la lecitina, las proteínas del suero, tales como la
albúmina de suero humano, sustancias tamponantes, tales como
fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas
parciales de glicérido de ácidos grasos vegetales saturados, agua,
sales, o electrolitos tales como el sulfato de protamina, el
fosfato hidrógeno de disodio, el fosfato hidrógeno de potasio, el
cloruro sódico, las sales de zinc, el sílice coloidal, el
trisilicato de magnesio, la polivinilpirrolidona, las sustancias
basadas en la celulosa, y el polietilenglicol. Los portadores para
formas tópicas o basadas en gel del antagonista incluyen
polisacáridos tales como la carboximetilcelulosa sódica o la
metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los
polímeros del bloque
polioxietileno-polioxipropileno, el
polietilenglicol, y los alcoholes de ceras de madera. Para todas
las administraciones se usan apropiadamente formas de almacenamiento
convencionales. Tales formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas,
nano-cápsulas, liposomas, emplastos, formas para
inhalación, vaporizadores nasales, tabletas sublinguales, y
preparaciones de liberación sostenida. El antagonista se formulará
típicamente en tales vehículos a una concentración de desde 0,1
mg/ml hasta 100 mg/ml.
Los ejemplos apropiados de preparaciones de
liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, matrices que
están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida
incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
tal y como los describen Langer et al., J. Biomed. Mater.
Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech.,
12:98-105 (1982)), o poli(vinilalcohol),
poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.619), copolímeros de
ácido L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman et al., Biopolymers, 22:547 (1983)),
etilenvinilacetato no degradable (Langer et al., ver más
arriba), copolímeros degradables de ácido láctico y ácido
glicólico, tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas
inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido
glicólico y acetato de leuprólido), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros tales como el etilvinilacetato u el ácido
láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante
más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante
períodos de tiempo más breves. Cuando los antagonistas
polipeptídicos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un
tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar a resultas de la
exposición a humedad a 37ºC, lo que resulta en una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden desarrollar estrategias racionales para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse
modificando los residuos sulfhidrilos, liofilizando a partir de
soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando
aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de
matriz de polímeros.
Las composiciones de antagonista del hVEGF de
liberación sostenida también incluyen los hVEGFr atrapados
liposomalmente. Los liposomas que contienen los antagonistas se
preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales
como los descritos en Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:4030 (1980); patente estadounidense nº
4.485.045; patente estadounidense nº 4.544.545. Ordinariamente los
liposomas son pequeños (aproximadamente 200-800
angstroms), del tipo unilamelar, en los que el contenido lipídico
es superior a aproximadamente el 30% molar de colesterol,
ajustándose la proporción seleccionada para la terapia HRG óptima.
En la patente estadounidense nº 5.013.556 se descubren liposomas con
tiempos de circulación mejorados.
\newpage
Otro uso de la presente invención comprende la
incorporación de un antagonista del hVEGF en artículos moldeados.
Tales artículos pueden usarse para modular el crecimiento de las
células endoteliales y la angiogénesis. Además, la invasión del
tumor y la metástasis pueden modularse con estos artículos.
La dosificación apropiada del antagonista, para
la prevención o tratamiento de una enfermedad, dependerá del tipo
de enfermedad a tratar, tal y como se define más arriba, la gravedad
y el curso de la enfermedad, tanto si los anticuerpos se
administran con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia
previa, el historial clínico del paciente, y la respuesta al
antagonista, y la opinión del médico que lo atienda. El antagonista
se administra apropiadamente al paciente de una vez o a lo largo de
una serie de tratamientos.
Los antagonistas del hVEGF son útiles en el
tratamiento de diversas enfermedades y alteraciones neoplásicas.
Los neoplasmas y condiciones relacionadas que son tratables incluyen
los carcinomas de mama, los carcinomas de pulmón, los carcinomas
gástricos, los carcinomas esofágicos, los carcinomas colorectales,
los carcinomas hepáticos, los carcinomas ováricos, los tecomas, los
arrenoblastomas, los carcinomas cervicales, los carcinomas
endometriales, la hiperplasia endometrial, la endometriosis, los
fibrosarcomas, los coriosarcomas, el cáncer de cabeza y cuello, el
carcinoma nasofaríngeo, los carcinomas laringeales, los
hepatoblastomas, el sarcoma de Kaposi, los melanomas, los
carcinomas de la piel, los hemangiomas, los hemangiomas cavernosos,
los hemangioblastomas, los carcinomas de páncreas, los
retinoblastomas, los astrocitomas, los glioblastomas, los
Schwannomas, los oligodendrogliomas, los meduloblastomas, los
neuroblastomas, los rabdomiosarcomas, los sarcomas osteogénicos,
los leiomiosarcomas, los carcinomas del tracto urinario, los
carcinomas de tiroides, los tumores de Wilm, los carcinomas de
células renales, los carcinomas de próstata, la proliferación
vascular anormal asociada con la facomatosis, los edemas (tales como
los asociados con tumores cerebrales), y el síndrome de Meig.
Dependiendo del tipo y gravedad de la
enfermedad, aproximadamente desde 1 \mug/kg hasta 15 mg/kg de
antagonista es una dosis inicial candidata para la administración al
paciente, bien sea, por ejemplo, mediante una o varias
administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis
diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta
100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba.
Para administraciones repetidas a lo largo de varios días, o más,
dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que
ocurre la supresión deseada de síntomas de la enfermedad. No
obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El
progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas
y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, la imaginología
radiográfica de tumores.
Según otra realización de la invención, la
efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad
puede mejorarse administrando el antagonista en serie, o en
combinación con otro agente que es efectivo para esos propósitos,
tal como el factor de la necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz
de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor ácido
o básico del crecimiento de fibroblastos (FGF), o del factor del
crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o
neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido,
proteína C, o proteína S (ver Esmon, et al., patente
publicada del PCT nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de
1991), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como,
por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico,
anti-metabolitos del metabolismo del ácido nucleico,
antibióticos, análogos de pirimidina,
5-fluorouracilo, nucleósidos de purina, aminas,
aminoácidos, triazol-nucleósidos, o
corticoesteroides. Tales otros agentes pueden estar presentes en la
composición que se está administrando, o pueden administrarse de
forma separada. También, el antagonista se administra de forma
apropiada en serie o en combinación con tratamientos radiológicos,
no importa si implican irradiación o administración de sustancias
radioactivas.
En una realización, la vascularización del tumor
se ataca mediante terapia combinada. Se administran uno o más
antagonistas del hVEGF, a pacientes que tienen un tumor, en dosis
terapéuticamente efectivas, según se determina, por ejemplo,
observando la necrosis del tumor o de su foco metastásico, si hay
alguno. Esta terapia se continua hasta el momento en que no se
observa ningún efecto beneficioso ulterior, o hasta que el examen
clínico no muestra trazas del tumor o de ningún foco metastático. A
continuación, se administra TNF, sólo o en combinación con un
agente auxiliar, tal como el alfa-, beta-, o
gamma-interferón, el anticuerpo
anti-HER2, la heregulina, un anticuerpo
anti-heregulina, el factor D, la
interleucina-1 (IL-1), la
interleucina-2 (IL-2), el factor
estimulante de las colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o
agentes que promueven la coagulación microvascular en tumores,
tales como el anticuerpo anti-proteína C, el
anticuerpo anti-proteína S, o la proteína unidora
del C4b (ver Esmon, et al., patente publicada del PCT nº W0
91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), o el calor, o la
radiación.
Puesto que los agentes auxiliares variarán en su
efectividad, es deseable comparar su impacto sobre el tumor
examinando la matriz de forma convencional. La administración de
antagonista del hVEGF y del TNF se repite hasta que se consigue el
efecto clínico deseado. Alternativamente, el(los)
antagonista(s) del hVEGF se administra(n) junto con
el TNF y, opcionalmente, agente(s) auxiliar(es). En
los casos en que los tumores sólidos se hallan en las extremidades
o en otras ubicaciones susceptibles de estar aisladas de la
circulación general, los agentes terapéuticos descritos en la
presente invención se administran al tumor u órgano aislado. En
otras realizaciones, se administra un antagonista del FGF o del
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tal como un
anticuerpo neutralizante anti-FGF o
anti-PDGF, conjuntamente con el antagonista del
hVEGF. El tratamiento con antagonistas del hVEGF puede suspenderse
óptimamente durante períodos de cicatrización de heridas o de
neovascularización deseable.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente a
modo de ilustración, y no se pretende que limiten la invención en
modo alguno.
Para obtener hVEGF conjugado a hemocianina de
lapa "ojo de cerradura" (keyhole limpet) (KLH) para la
inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung,
et al., Science 246:1306 (1989), con KLH en una
proporción de 4:1, en presencia de 0,05% de glutaraldehído, y la
mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas con
agitación suave. A continuación se dializó la mezcla frente a
solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC, durante la
noche.
Se inmunizaron ratones Balb/c cuatro veces cada
dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales con 5 \mug de
hVEGF conjugado a 20 \mug de KLH, y se potenciaron con la misma
dosis de hVEGF conjugado a KLH cuatro días antes de la fusión
celular.
Las células de bazo procedentes de los ratones
inmunizados se fusionaron con células de mieloma P3X63Ag8U.1,
Yellon. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1
(1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35% según se describe.
Yarmush, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2899
(1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.
Los sobrenadantes procedentes de los cultivos
celulares se examinaron en busca de producción de anticuerpo
anti-hVEGF mediante un ensayo de ELISA, usando
placas de microvaloración recubiertas con hVEGF. El anticuerpo que
se había unido al hVEGF en cada uno de los pocillos se determinó
usando inmunoglobulina IgG anti-ratón, de cabra,
conjugada con fosfatasa alcalina, y el sustrato cromagénico
p-nitrofenilfosfato. Harlow y Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratoy, 1988).
Las células de hibridoma, que se determinó de este modo que
producían anticuerpos anti-hVEGF, se subclonaron
mediante dilución limitada, y dos de estos clones, denominados
A4.6.1 y B2.6.2, se escogieron para estudios ulteriores.
Las especificidades de unión de los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF producidos por los
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los
anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de
microvaloración que previamente se habían recubierto con hVEGF, FGF,
HGF, o factor de crecimiento epidermal (EGF). El anticuerpo unido
se detectó con inmunoglobulinas IgG de cabra
anti-ratón conjugadas con peroxidasa. Los resultados
de esos ensayos confirmaron que los anticuerpos monoclonales
producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero
no, de forma detectable, a los otros factores de crecimiento
proteicos.
Se usó un ELISA competitivo para determinar si
los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unían a los mismos o distintos epítopos (sitios) con el
hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun. 57:944 (1989). Se
añadieron los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF
individuales sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2) o anticuerpo irrelevante
anti-HGF (isotipo IgG1) a los pocillos de placas de
microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. A
continuación se añadieron anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1
o BIO-B2.6.2). La proporción de anticuerpo
biotinilado respecto el anticuerpo sin marcar fue de 1:1000. La
unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó mediante la
adición de peroxidasa conjugada con avidina, seguida por
o-fenilenediamina dihidrocloruro y peróxido de
hidrógeno. El color de la reacción, que indica la cantidad de
anticuerpo biotinilado hallada, se determinó midiendo la densidad
óptica (O.D.) a la longitud de onda de 495 nm.
Tal y como se muestra en la Figura 1, en cada
caso, la unión del anticuerpo biotinilado
anti-hVEGF fue inhibida por el correspondiente
anticuerpo sin marcar, pero no por el otro anticuerpo
anti-hVEGF sin marcar o el anticuerpo
anti-HGF. Estos resultados indican que los
anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se unen a epítopos diferentes del hVEGF.
Los isotipos de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras del
medio de cultivo (sobrenadante), en el que estaban creciendo cada
uno de los hibridomas, a los pocillos de placas de microvaloración
que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con
diferentes inmunoglobulinas anti-ratón de cabra,
conjugadas con fosfatasa alcalina, específicas para cada isotipo, y
la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos
monoclonales anti-hVEGF se determinó mediante la
adición de p-nitrofenilfosfato. El color de la
reacción se midió a 405 nm con un lector de placas de ELISA.
Mediante este procedimiento, se determinó el
isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos
hibridomas A4.6.1 y B2.6.2.
Las afinidades de los anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y
B2.6.2 se determinó mediante ensayos de unión competitiva. Se añadió
una concentración predeterminada subóptima de anticuerpo monoclonal
a muestras que contenían 20.000-40.000 c.p.m. de
^{126}I-hVEGF (1-2 ng) y varias
cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1000
ng). Transcurrida 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100
\mul de antisuero Ig anti-ratón de cabra
(Pel-Freez, Rogers, AR, EE.UU.), y se incubaron las
mezclas otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de
anticuerpo y proteína unida (complejos inmunes) se precipitaron
mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG,
peso molecular 8000) a 4ºC, seguida por centrifugación a 2000 x G.
durante 20 minutos a 4ºC. La cantidad de
^{126}I-hVEGF unida al anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el
material apelotonado en un contador gamma.
Las constantes de afinidad se calcularon a
partir de los datos mediante análisis de Scatchard. Se calculó que
la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF
producido por el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 \times 10^{9}
litros/mol. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 era de
2,5 \times 10^{9} litros/mol.
Se sembraron células endoteliales capilares del
córtex adrenal (ACE) bovino, Ferrara. et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4}
células/ml en 12 placas multipocillo, y se añadieron 2,5 ng/ml de
hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de varias
concentraciones de anticuerpos monoclonales
anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o
B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal anti-HGF
irrelevante. Después de cultivarlas durante 5 días, se contaron las
células en cada pocillo con un contador Coulter. Como control, se
cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.
Tal y como se muestra en la Figura 2, ambos
anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la
capacidad del hVEGF añadido para soportar el crecimiento o
supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad
mitogénica del hVEGF (más del 90% de inhibición), mientras que el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 sólo inhibía
parcialmente la actividad mitogénica del hVEGF.
Las células ACE bovinas se sembraron a una
densidad de 2,5 \times 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas
de microvaloración de 24 pocillos, en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero bovino, glutamina 2 mM,
y 1 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos. Después
de cultivarlas durante la noche, se lavaron las células una vez en
tampón de unión (volúmenes iguales de DMEM y medio F12, más HEPES 25
mM y 1% de albúmina de suero bovino) a 4ºC.
Se preincubaron 12.000 c.p.m. de
^{126}I-hVEGF (aproximadamente 5 \times 10^{4}
c.p.m./ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma
A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1 (volumen total de 250 ml), y, a
continuación, se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en
las placas de microvaloración. Después de incubar las células
durante 3 horas a 4ºC, se lavaron las células 3 veces con tampón de
unión a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH
0,2 N, y se contaron en un contador gamma.
Tal y como se muestra en la Figura 3 (superior),
los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos
por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a
las células ACE bovinas. Por contra, el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no
tenía un efecto aparente sobre la unión del hVEGF a las células ACE
bovinas. De forma consistente con los resultados obtenidos en el
ensayo de proliferación celular descrito más arriba, en anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del
hVEGF a un nivel superior que el anticuerpo monoclonal producido por
el hibridoma B2.6.2.
Tal y como se muestra en la Figura 3 (inferior),
el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió
completamente la unión del hVEGF a las células ACE bovinas, a una
proporción molar 1:250 de hVEGF respecto el anticuerpo.
Para determinar si el anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1
reacciona con las formas del hVEGF de 121 y 189 aminoácidos, se
ensayó la capacidad del anticuerpo de inmunoprecipitar esos
polipéptidos.
Se transfectaron células 293 humanas con
vectores que incluían la secuencia codificante de nucleótidos de
los polipéptidos de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, tal y como se
describe en Leung, et al., Science 246:1306 (1989).
Dos días después de la transfección, se transfirieron las células a
medio que carecía de cisteína y metionina. Se incubaron las células
30 minutos en ese medio, y a continuación se añadieron al medio 100
\muCi/ml de cada uno de ^{36}S-metionina y
^{36}S-cisteína, y se incubaron las células otras
dos horas. El marcaje se cazó transfiriendo las células a medio sin
suero e incubando durante tres horas. Se recolectó el medio de
cultivo, y se lisaron las células mediante incubación durante 30
minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM; 1% de NP40, 0,5% de
deoxicolato, 0,1% de sodiododecilsulfato (SDS), Tris 50 mM,
pH 8,0). Los restos celulares se suprimieron mediante
centrifugación a 200 \times G. durante 30 minutos.
Se incubaron muestras de 500 \mul de los
medios de cultivo y de los lisados de células con 2 \mul de
anticuerpo del hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora a 4ºC, y
a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG
anti-ratón de cabra durante 1 hora a 4ºC. Los
complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{36}S y anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF se precipitaron con Sepharosa
de proteína A (Pharmacia), se sometieron a continuación a
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12%
en condiciones reductoras. Se expuso el gel a película para rayos X
para el análisis mediante autoradiografía de las proteínas
radiomarcadas inmunoprecipitadas.
Los resultados del análisis indican que el
anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el
hibridoma A4.6.1 presentaba reacción cruzada con ambos, los formas
de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF.
Las secuencias codificantes de nucleótidos y
aminoácidos del receptor flt de hVEGF se descubren en
Shibuya, et al., Oncogene 5:519-524
(1990). La secuencia codificante del dominio extracelular del
receptor flt del hVEGF se fusionó en un proceso de dos pasos
a la secuencia codificante de la cadena pesada de IgG1 humana.
Se usó la mutagénesis dirigida contra un sitio
para introducir un sitio de restricción BstBI en el ADN que
codificaba el flt, en un sitio 5' respecto el codón para el
aminoácido 759 del flt, y para convertir el único sitio
BstEII en el plásmido pBSSK FC, Bennett, et at., J. Biol.
Chem. 266:23060-23067 (1991), en un sitio
BstBI. El plásmido modificado se digirió con EcoRI y BstBI, y el
gran fragmento resultante de ADN plasmídico se ligó junto con un
fragmento EcoRI-BstBI del ADN de flt que
codificaba el dominio extracelular (aminoácidos
1-758) del receptor flt del hVEGF.
Se digirió la construcción resultante con CalI y
NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, que a
continuación se inserta mediante ligación en el sitio de clonación
múltiple del vector de expresión en mamíferos pHEB02 (Leung, et
al., Neuron 8:1045 (1992). Los extremos del fragmento de
3,3 kb se modifican, por ejemplo, mediante la adición de eslabones,
para obtener la inserción del fragmento en el vector en la posición
correcta para su expresión.
Se transfectaron células huésped de mamífero
(por ejemplo, células CEN4 (Leung, et al., ver más arriba)
con el plásmido pHEB02, que contenía el inserto flt, mediante
electroporación. Las células transfectadas se incubaron en medio que
contenía aproximadamente un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2
mM, y antibióticos, y, a aproximadamente un 75% de confluencia, se
transfirieron a medio sin suero. Se acondiciona el medio durante
3-4 días antes de su recolecta, y la proteína de
fusión flt-IgG se purifica a partir del medio acondicionado
mediante cromatografía sobre una matriz de afinidad de proteína A,
esencialmente según se describe en Bennett, et al., J. Biol.
Chem. 266:23060-23067 (1991).
Se ensayaron mediante ELISA varias líneas
celulares tumorales humanas, que crecían en cultivos, en busca de la
producción de hVEGF. Se halló que las líneas celulares de tumores de
ovarios, pulmón, colon, gástricos, mama, y de cerebro producían
hVEGF. Se usaron para estudios ulteriores tres líneas celulares que
producían hVEGF: NEG 55 (también conocida como G55) (línea celular
de glioma humano, procedente del Dr. M. Weslphal, Departamento de
Neurocirugía, Hospital Universitario de Eppendor, Hamburgo,
Alemania, también denominada como G55), A-673
(línea celular de rabdomiosarcoma humano, obtenida del The American
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU., 20852,
como línea celular número CRL 1598), y
SK-LMS-1 (línea celular de
leiomiosarcoma, obtenida del ATCC como línea celular número HTB
88).
Se inyectaron subcutáneamente ratones
"Beige/nude" hembra (Charles River Laboratory, Wilmington,
Massachusetts, EE.UU.), de seis a diez semanas de edad, con
1-5 \times 10^{8} células tumorales en
100-200 \mul de PBS. A diversos intervalos
después de que se estableciera el crecimiento del tumor, se
inyectaron los ratones intraperitonealmente una o dos veces por
semana con varias dosis de anticuerpo monoclonal
anti-hVEGF de A4.6.1, un anticuerpo monoclonal
anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño del
tumor se midió cada semana, y a la conclusión del estudio se
extrajeron los tumores y se pesaron.
El efecto de diversas cantidades del anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento
de los tumores de NEG 55 en ratones se muestra en las Figuras 4 y 5.
La Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug ó 100
\mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF de
A4.6.1, empezando una semana después de la inoculación de células
NEG 55, tenía una velocidad de crecimiento tumoral sustancialmente
reducida en comparación con ratones tratados, bien con el
anticuerpo irrelevante, bien con PBS. La Figura 5 muestra que cinco
semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño
de los tumores en los ratones tratados con anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente del 50% (en
el caso de los ratones tratados con dosis de 25 \mug de
anticuerpo) al 85% (en el caso de los ratones tratados con dosis de
100 \mug de anticuerpo) inferior al tamaño de los tumores en
ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con el anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento
de tumores SK-LMS-1 en ratones se
muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de
las células SK-LMS-1, el tamaño
promedio de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente un 75%
inferior que el tamaño de los tumores en ratones tratados con el
anticuerpo irrelevante o PBS.
El efecto del tratamiento con el anticuerpo
monoclonal anti-hVEGF de A4.6.1 sobre el crecimiento
de tumores A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas
después de la inoculación de las células A673, el tamaño promedio
de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 era aproximadamente del 60%
(en el caso de ratones tratados con dosis de 10 \mug de
anticuerpo) hasta más del 90% (en el caso de ratones tratados con
dosis de 50-400 \mug de anticuerpo) inferior al
tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo
irrelevante o PBS.
Se sembraron células de glioblastoma humano
NEG55 o células de rabdomiosarcoma A673 a una densidad de 7 \times
10^{3} células/pocillo en placas multipocillos (12
pocillos/placa), en medio F12/DMEM que contenía un 10% de suero
fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos. A continuación, se
añadió el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 a los
cultivos de células hasta una concentración final de
0-20,0 \mug de anticuerpo/ml. Transcurridos cinco
días, se disociaron las células que crecían en los pocillos mediante
exposición a tripsina, y se contaron en un contador Coulter.
Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de
esos estudios. Como es evidente, el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 no tienen ningún efecto
significativo sobre el crecimiento de las células NEG55 o A673 en
cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1. no es citotóxico, y sugiere
con fuerza que los efectos antitumorales del anticuerpo observados
se deben a su inhibición de la neovascularización mediada por
VEGF.
La quimiotaxis de las células endoteliales y de
otras células, incluyendo monocitos y linfocitos, juega un papel
importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. La migración
de células endoteliales y la proliferación acompañan la
angiogénesis que ocurre en la sinovia reumatoide. El tejido
vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago articular.
Para determinar si los antagonistas del hVEGF
interfieren con este proceso, ensayamos el efecto del anticuerpo
anti-hVEGF de A4.6.1 sobre la quimiotaxis de las
células endoteliales, estimulada por el fluido sinovial procedente
de pacientes con artritis reumatoide. Como control, también
ensayamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF de
A4.6.1 sobre la quimiotaxis de las células endoteliales, estimulada
por fluido sinovial procedente de pacientes con osteoartritis (la
angiogénesis que ocurre en la artritis reumatoide no ocurre en la
osteoartritis).
La quimiotaxis de las células endoteliales se
ensayo usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con
procedimientos establecidos. Thompson, et al., Cancer Res.
51:2670 (1991); Phillips, et al., Proc. Exp. Biol.
Med. 197:458 (1991). Aproximadamente 10^{4} células
endoteliales de la vena umbilical humana se dejaron adherir a
filtros recubiertos con gelatina (0,8 micras de tamaño de poro) en
microcámaras multipocillo de 48 pocillos, en medio de cultivo que
contenía un 0,1% de suero fetal bovino. Transcurridas
aproximadamente dos horas, se invirtieron las cámaras, y se
añadieron a los pocillos las muestras de ensayo (fluido sinovial de
la artritis reumatoide, fluido sinovial de la osteoartritis, FGF
básico (bFGF) (hasta una concentración de 1 \mug/ml), o PBS) y
anticuerpo anti-hVEGF de A4.6.1 (hasta una
concentración final de 109 \mug/ml). Transcurridas de dos a cuatro
horas, las células que habían migrado se tiñeron y contaron.
La Figura 10 muestra los resultados promediados
de estos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada
"Fluido sinovial", y los mostrados al pie de página para los
controles, son el número promedio de células endoteliales que
migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS sólo. Los
valores en la columna marcada "Fluido sinovial + mAB VEGF" son
el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia
de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF de
A4.6.1 añadido. Los valores en la columna marcada "% de
supresión" indican el porcentaje de reducción, en la migración
de células endoteliales inducida por el fluido sinovial, que
resulta de la adición del anticuerpo anti-hVEGF.
Como se indica, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió
significativamente la capacidad del fluido sinovial de la artritis
reumatoide (53,40 de promedio de porcentaje de inhibición), pero no
la del fluido sinovial de la osteoartritis (13,64 de promedio de
porcentaje de inhibición), para inducir la migración de las células
endoteliales.
Claims (18)
1. Utilización de un antagonista del hVEGF,
el cual es un receptor del hVEGF aislado, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de tumores.
2. Utilización según la reivindicación 1,
en la cual se suprimen los dominios transmembrana y citoplasmático
del receptor.
3. Utilización según la reivindicación 2,
en la cual el receptor del hVEGF aislado consiste en el dominio
extracelular de un receptor del hVEGF.
4. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la cual el receptor del hVEGF es el
receptor flt.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la cual el receptor del hVEGF es el
receptor KDR.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la cual el antagonista del hVEGF
se usa en una cantidad suficiente para reducir el tamaño de un
tumor.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la cual el tumor es un tumor
maligno sólido.
8. Utilización según la reivindicación 6 o
la reivindicación 7, en las cuales el antagonista del hVEGF reduce
el tamaño del tumor mediante inhibición de la neovascularización
mediada por el VEGF.
9. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en las cuales el receptor del hVEGF
está fusionado a un polipéptido portador.
10. Utilización según la reivindicación 9,
en la cual el polipéptido portador es un polipéptido de
inmunoglobulina.
11. Utilización según la reivindicación 10,
en la cual la inmunoglobulina es la IgG.
12. Utilización según la reivindicación 11,
en la cual el antagonista del hVEGF es una proteína de fusión
flt-IgG.
13. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la cual el antagonista del hVEGF
está acoplado a una porción citotóxica.
14. Utilización según la reivindicación 13,
en la cual la porción citotóxica es una proteína citotóxica.
15. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la cual el receptor del hVEGF está
conjugado con un polímero no proteico.
16. Utilización según la reivindicación 14,
en la cual el polímero es polietilenglicol.
17. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la cual el medicamento está
formulado de manera que permite que sea administrado en serie o en
combinación con otro agente para el tratamiento del cáncer.
18. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la cual el medicamento está
formulado de manera que permite que sea administrado en serie o en
combinación con tratamientos radiológicos.
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