ES2255027T3 - Antagonistas de factores de crecimiento de celulas endotheliales vasculares. - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista del hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad en un paciente humano, en donde el antagonista del hVEGF comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de un hVEGFr. 2 Uso acorde con la reivindicación 1, en donde el hVEGFr es el receptor flt o el receptor flk-1 (también denominado como KDR). 3. Uso acorde con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde los dominios transmembrana y citoplásmico del hVEGFr están suprimidos. 4. Uso acorde con cualquier reivindicación 1 precedente, en donde el antagonista del hVEGF es una proteína de fusión que comprende además un polímero o polipéptido que no es del hVEGFr. 5. Uso acorde con la reivindicación 4, en donde el polipéptido que no es del hVEGFr es una inmunoglobulina. 6. Uso acorde con la reivindicación 5, en donde el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con el dominio Fv de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina. 7. Uso acorde con la reivindicación 6, en donde el dominio Fv procede de una cadena pesada de inmunoglobulina. 8. Uso acorde con la reivindicación 7, en donde el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor está unido covalentemente al extremo amino-terminal del CH1, bisagra, CH2 de la cadena pesada. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el hVEGFr está conjugado a un polímero no proteico. 10. Uso acorde con la reivindicación 9, en donde el polímero no proteico es polietilenglicol.

Description

Antagonistas de factores de crecimiento de células endoteliales vasculares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de uso de los antagonistas del VEGF con propósitos terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Los dos principales componentes celulares de la vasculatura son las células endoteliales y las células del músculo liso. Las células endoteliales forman el recubrimiento de la superficie interna de todos los vasos sanguíneos, y constituyen una interfaz no trombogénica entre la sangre y el tejido. Además, las células endoteliales son un componente importante para el desarrollo de nuevos capilares y vasos sanguíneos. Por tanto, las células endoteliales proliferan durante la angiogénesis, o neovascularización, asociada con el crecimiento tumoral y la metástasis, y con una variedad de enfermedades o trastornos no neoplásicos.

Según se informa, varios polipéptidos, que ocurren de forma natural, inducen la proliferación de las células endoteliales. Entre esos polipéptidos se hallan los factores de crecimiento de fibroblastos básico y ácido (FGF), Burgess y Maciag, Annual Rev. Biochem., 58:575 (1989), el factor de crecimiento celular derivado de plaquetas (PD-ECGF), Ishikawa, et al., Nature, 338:557 (1989), y el factor de endotelial vascular (VEGF), Leung, et al., Science, 246:1306 (1989); Ferrara y Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851 (1989); Tischer, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165:1198 (1989); Ferrara, et al., Patente PCT con nº de publicación WO 90/13649 (publicada el 15 de noviembre de 1990).

El VEGF se identificó primero en medio condicionado por células foliculares o foliculoestrelladas de la pituitaria bovina. Los análisis bioquímicos indican que el VEGF bovino es una proteína dimérica con una masa molecular aparente de aproximadamente 45.000 daltones, y con una especificidad mitogénica aparente por las células endoteliales vasculares. El ADN que codificaba el VEGF bovino se aisló examinando una biblioteca de cADN preparada a partir de tales células, usando oligonucleótidos basados en la secuencia de aminoácidos amino-terminal de la proteína como sondas de hibridación.

El VEGF humano se obtuvo examinando primero una biblioteca de cADN preparada a partir de células humanas, usando el cADN del VEGF bovino como una sonda de hibridación. Un cADN identificado de ese modo codifica una proteína de 165-aminoácidos que tiene más del 95% de homología con el VEGF bovino, proteína que es conocida como VEGF humano (hVEGF). La actividad mitogénica del VEGF humano se confirmó expresando el cADN del VEGF humano en células huésped de mamífero. El medio condicionado por las células tratadas con el cADN del VEGF humano promovió la proliferación de las células endoteliales capilares, mientras que las células control no lo hicieron. Leung, et al., Science, 246:1306 (1989).

Se identificaron varios cADN en bibliotecas de cADN humanas que codifican isoformas de 121-, 189-, y 206-aminoácidos del hVEGF (denominadas también de forma conjunta como proteínas relacionadas con el hVEGF). La proteína de 121 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la supresión de los 44 aminoácidos entre los residuos 116 y 159 del hVEGF. La proteína de 189 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de la inserción de 24 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF, y aparentemente es idéntica al factor de permeabilidad vascular (hVPF). La proteína de 206 aminoácidos difiere del hVEGF a causa de una inserción de 44 aminoácidos en el residuo 116 del hVEGF. Houck, et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem., 47:221 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13:18 (1992); Keck, et al., Science, 246:1309 (1989); Connolly, et al., J. Biol. Chem., 264:20017 (1989); Keck, et al., Patente EPO Nº de publicación 0.370.989 (publicada el 30 de mayo de 1990).

El VEGF no sólo estimula la proliferación de las células endoteliales vasculares, sino que también induce la permeabilidad vascular y la angiogénesis. La angiogénesis, que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de endotelio preexistente, es un componente importante de una variedad de enfermedades y trastornos, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad.

Una revisión por D'Amore en Investigative Ophthalmology & Visual Science, 35(12):3974-3979 (1994) discute los posibles mecanismos de neovascularización retinal y coroidal.

Un resumen de Smith et al. en Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36(4):5871 (15 de marzo de 1995) descubre que el VEGF antisentido reduce la neovascularización retinal.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona el uso de un antagonista del hVEGF que comprende el dominio extracelular de un receptor de hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la AMD. El antagonista inhibe la actividad mitogénica, angiogénica, u otra actividad biológica del hVEGF, y, por tanto, es útil para el tratamiento de la AMD, la cual se caracteriza por una neovascularización excesiva no deseable.

Los antagonistas del VEGF podrían estar conjugados con un grupo citotóxico.

Si se desea, el antagonista del VEGF se coadministra, bien simultánea o secuencialmente, con uno o más antagonistas del VEGF o sustancias anti-angiogénicas.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos (anti-HGF) irrelevante, sobre la unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF al hVEGF.

La Figura 2 muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1 o B2.6.2), o de un anticuerpo anti-factor de crecimiento de hepatocitos (anti-HGF) irrelevante, sobre la actividad biológica del hVEGF en cultivos de células endoteliales capilares (ACE) del córtex adrenal bovino.

La Figura 3 muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF (A4.6.1, B2.6.2 o A2.6.1) sobre la unión del hVEGF a células ACE bovinas.

La Figura 4 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonales anti-hVEGF A4.6.1 sobre la velocidad de crecimiento del crecimiento de los tumores de NEG55 en ratones.

La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el tamaño de los tumores de NEG55 en ratones después de cinco semanas de tratamiento.

La Figura 6 muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores de SK-LMS-1 en ratones.

La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con diferentes dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el crecimiento de tumores de A673 en ratones.

La Figura 8 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 (VEGF Ab) sobre el crecimiento y supervivencia de células de glioblastoma NEG55 (G55) en cultivo.

La Figura 9 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento y supervivencia de células de rabdomiosarcoma A673 en cultivo.

La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de las células endoteliales humanas inducida por el fluido sinovial humano.

Descripción detallada de la invención

El término "hVEGF" tal como se usa en ésta, se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano de 165 aminoácidos, y a los factores de crecimiento de células endoteliales vasculares relacionados de 121, 189, y 206-aminoácidos, tal como describieron Leung, et al., Science, 246:1306 (1989), y Houck, et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con las formas alélicas y procesadas que ocurren de forma natural de estos factores de crecimiento.

La presente invención se refiere a antagonistas del hVEGF que son capaces de inhibir una o más de las actividades biológicas del hVEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los antagonistas del hVEGF actúan interfiriendo con la unión del hVEGF a un receptor celular, incapacitando o matando las células que han sido activadas por el hVEGF, o interfiriendo con la activación de la célula endotelial vascular después de la unión del hVEGF a un receptor celular. Por tanto, dentro del ámbito de la invención se halla incluido el receptor del hVEGF, y los fragmentos y variantes de la secuencia de aminoácidos del mismo, tal como se definen en las reivindicaciones, los cuales son capaces de unir el hVEGF.

El término "receptor del hVEGF" o "hVEGFr", tal como se usa en ésta, se refiere a un receptor celular para el hVEGF, ordinariamente un receptor de la superficie celular hallado sobre células endoteliales vasculares, así como a variantes del mismo que retienen la capacidad de unirse al hVEGF. Los receptores del hVEGF y las variantes del mismo que son antagonistas del hVEGF estarán en forma aislada, en vez de estar integrados en una membrana celular o fijados sobre una superficie celular, como pudiera ser el caso en la naturaleza. Un ejemplo de receptor del hVEGF es la quinasa de tirosina parecida a fms (flt), un receptor transmembrana en la familia de quinasas de tirosina. De Vries et al., Science, 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene, 5:519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con actividad quinasa de tirosina. El dominio extracelular está implicado en la unión del hVEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de la señal.

Otro ejemplo de un receptor del hVEGF es el receptor flk-1 (también denominado como KDR). Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene, 6:1677 (1991); Terman, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992).

La unión del hVEGF al receptor flt resulta en la formación de al menos dos complejos de peso molecular elevado, que tiene un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 daltones. Se cree que el complejo de 300.000 daltones es un dímero que comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de hVEGF.

Las variantes del hVEGFr que contienen el dominio extracelular se hallan incluidas en el ámbito de ésta. Los ejemplos representativos incluyen las formas truncadas de un receptor, en la cuales los dominios transmembrana y citoplásmico se suprimen del receptor, y las fusiones de proteínas en las que polímeros que no son del hVEGFr o polipéptidos se conjugan al hVEGFr, o, preferiblemente, formas truncadas del mismo. Un ejemplo de tal polipéptido que no es un hVEGF es una inmunoglobulina. En ese caso, por ejemplo, el dominio extracelular del hVEGFr es sustituido por el dominio Fv de una cadena ligera o (preferiblemente) pesada de inmunoglobulina, con el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor unido covalentemente al término amino del CH1, bisagra, CH2 u otro fragmento de la cadena pesada. Tales variantes se preparan de la misma forma que los inmunoadhesones conocidos. Ver, por ejemplo, Gascoigne, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84:2936 (1987); Capon, et al., Nature, 337:525 (1989); Aruffo, et al., Cell, 61:1303 (1990); Ashkenazi, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 88:10535 (1991); Bennett, et al., J. Biol. Chem., 266:23060 (1991). En otras realizaciones, el hVEGFr está conjugado con un polímero no proteico tal como el polietilenglicol (PEG) (ver, por ejemplo, Davis, et al., Patente estadounidense nº 4.179.337; Goodson, et al., BioTechnology, 8:343-346 (1990); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem., 252:3578 (1977); Abuchowski, et al., J. Biol. Chem., 252:3582 (1977)) o carbohidratos (ver, por ejemplo, Marshall, et al., Arch. Biochem. Biophys., 167:77 (1975)). Esto sirve para alargar la vida media biológica del hVEGFr y reduce la posibilidad de que el receptor sea inmunogénico en el mamífero al cual se administra. El hVEGFr se usa sustancialmente de la misma forma que los anticuerpos contra el hVEGF, tomando en consideración la afinidad del antagonista y su valencia para el hVEGF.

El dominio extracelular del receptor del hVEGF, bien por sí mismo o fusionado a un polipéptido de inmunoglobulina u otro polipéptido portador, es especialmente útil como un antagonista del hVEGF, gracias a su capacidad para secuestrar el hVEGF que está presente en un huésped pero que no está unido a los hVEGFr sobre la superficie de una célula.

El término "recombinante", usando en referencia al hVEGF, receptor del hVEGF, anticuerpos monoclonales, u otras proteínas, se refiere a proteínas que se producen mediante la expresión de ADN recombinante en una célula huésped. La célula huésped podría ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana tal como E. coli) o eucariota (por ejemplo, una levadura o una células de mamífero).

Conjugados con grupos citotóxicos

En algunas realizaciones es deseable proporcionar un grupo citotóxico conjugado con un hVEGFr. En estas realizaciones, la citotoxina sirve para incapacitar o matar células que están expresando o uniendo el hVEGF. El conjugado es dirigido hacia la célula por el dominio que es capaz de unirse al hVEGF.

Típicamente, la citotoxina es una citotoxina proteica, por ejemplo, la toxina de la difteria, ricina, o la toxina de Pseudomonas, aunque en el caso de ciertas clases de inmunoglobulinas, el dominio Fc del anticuerpo monoclonal podría servir por sí mismo para proporcionar una citotoxina (por ejemplo, en el caso de los anticuerpos IgG2, los cuales son capaces de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)). Sin embargo, no es necesario que la citotoxina sea proteica, y podría incluir agentes quimioterapéuticos usados hasta la fecha, por ejemplo, en el tratamiento de tumores.

Cuando la función directora es proporcionada por el hVEGFr, la porción citotóxica está sustituida sobre cualquier dominio del receptor que no participe en la unión del hVEGF; preferiblemente, la porción se sustituye en lugar de o sobre los dominios transmembrana y/o citoplásmico. El sitio óptimo de sustitución se determinará mediante experimentación rutinaria, y se halla dentro de la formación ordinaria.

Los conjugados que son fusión de proteínas se construyen fácilmente en cultivos de células recombinantes expresando un gen que codifica el conjugado. Alternativamente, los conjugados se construyen entrecruzando de forma covalente el grupo citotóxico con una cadena lateral de residuo aminoácido o carboxilo C-terminal del anticuerpo, usando procedimientos conocidos per se, tales como el intercambio de disulfuro, o el anclaje a través de un enlace tioéster usando, por ejemplo, iminotiotato y metil-4-mercaptobutirimadato.

Conjugados con otros grupos

Los hVEGFr que son antagonistas del hVEGF se conjugan también con sustancias que podrían no clasificarse fácilmente como citotoxinas por sus propios méritos, pero que aumentan la actividad de las composiciones en ésta. Por ejemplo, los hVEGFr capaces de unirse al hVEGF se fusionan con polipéptidos heterólogos, tales como secuencias virales, con receptores celulares, con citoquinas tales como el TNF, interferones, o interleuquinas, con polipéptidos que tienen actividad pro-coagulante, y con otros polipéptidos biológica o inmunológicamente activos. Tales fusiones se realizan fácilmente mediante procedimientos recombinantes. Típicamente, tales polipéptidos que no son de inmunoglobulina sustituyen el dominio transmembrana y/o intracelular de un hVEGFr.

Los dominios unidores del hVEGF en el hVEGFr se determinan mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los estudios con rayos X, los análisis de mutaciones, y los estudios de unión al anticuerpo. Las estrategias de mutaciones incluyen las técnicas de mutagénesis de saturación aleatoria acoplada con la selección de mutantes de escape, y la mutagénesis por inserción. Cunningham, et al., Science 244:1081-1085 (1989). Este procedimiento implica la identificación de regiones que contienen cadenas laterales de aminoácidos cargadas. Los residuos cargados en cada región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys y Glu) son remplazados (una región por molécula mutante) con Ala, y se ensaya la unión al receptor de los ligandos obtenidos, para verificar la importancia de la región concreta en la unión al receptor. Un potente procedimiento adicional para la localización de los dominios de unión al receptor es a través del uso de anticuerpos anti-hVEGF neutralizantes. Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992). Habitualmente se usa una combinación de éstos y similares procedimientos para localizar los dominios implicados en la unión al receptor.

Los fragmentos y las variantes de la secuencia de aminoácidos del hVEGF se preparan fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a un sitio del ADN que codifica el factor nativo. El ADN mutado se inserta en un vector de expresión apropiado, y a continuación se transfectan las células huéspedes con el vector recombinante. Las células huéspedes recombinantes se cultivan en medios de cultivo apropiados, y el fragmento deseado o la variante de la secuencia de aminoácidos expresados en las células huéspedes se recuperan entonces del cultivo de células recombinantes mediante procedimientos cromatográficos u otros procedimientos de purificación.

Alternativamente, los fragmentos y variantes de aminoácidos del hVEGF se preparan in vitro, por ejemplo, mediante proteolisis del hVEGF nativo, o mediante síntesis usando procedimientos estándares de síntesis de péptidos en fase sólida, tal como se describe en Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)), aunque podrían usarse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido, acoplando un \alpha-aminoácido protegido a una resina apropiada. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en el campo para la formación de enlaces peptídicos.

Usos terapéuticos

Para las aplicaciones terapéuticas, los antagonistas de la invención podrían administrarse a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquéllas que podrían administrarse a un humano intravenosamente como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un período de tiempo, mediante rutas intramusculares, subcutáneas, intraarticulares, intrasinoviales, intratecales, orales, tópicas, o de inhalación. Los antagonistas también se administran convenientemente mediante rutas intralesionales o perilesionales, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.

Tales formas de dosificación abarcan los portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen los intercambiadores de iones, la alúmina, el estearato de aluminio, la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina de suero humana, las sustancias tamponantes tales como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrólitos tales como el sulfato de protamina, el fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno potasio, el cloruro sódico, las sales de zinc, el sílica coloidal, el trisilicato de magnesio, la polivinilpirrolidona, sustancias basadas en la celulosa, y polietilenglicol. Los portadores para formas tópicas o basadas en gel del antagonista incluyen los polisacáridos, tales como la carboximetilcelulosa de sodio o la metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros del bloque polioxietilén-polioxipropilén, el polietilenglicol, y los alcoholes de ceras de madera. En todas las administraciones se usan convenientemente formas de almacenamiento convencionales. Tales formas incluyen, por ejemplo, las microcápsulas, las nanocápsulas, los liposomas, los parches, las formas para inhalación, los aerosoles nasales, y las tabletas sublinguales, y las preparaciones de liberación continua. El antagonista típicamente se formulará en tales vehículos en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación continua incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, matrices que se hallan en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como describen Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167 (1981) y Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982), o los poli(vinilalcohol), poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biolpolymers 22:547 (1983), el etilen-vinil-acetato no degradable (Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etilen-vinil acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más breves. Cuando los antagonistas polipeptídicos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período prolongado, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la humedad a 37ºC, resultando en la pérdida de actividad biológica y en posibles cambios en su inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tiodisulfuro, la estabilización podrían conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Las composiciones de liberación continua de antagonista del hVEGF incluyen también los hVEGFr antagonistas atrapados liposomalmente. Los liposomas que contienen los antagonistas se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos por Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); la patente estadounidense nº 4.485.045; la patente estadounidense nº 4.544.545. Ordinariamente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms), en los cuales el contenido en lípido es superior a aproximadamente el 30 mol. % de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la óptima terapia HRG. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente estadounidense nº 5.013.556.

Otro uso comprende la incorporación de un antagonista del hVEGF en artículos moldeados. Tales artículos pueden usarse para modular el crecimiento de las células endoteliales y la angiogénesis.

Para la prevención y tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada del antagonista dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, tal como se definió más arriba, la gravedad del curso de la enfermedad, de si los anticuerpos se administran con propósito preventivo o terapéutico, de la terapia previa, del historial clínico del paciente, y de la respuesta al antagonista, y del criterio del médico responsable. El antagonista se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

La degeneración macular asociada a la edad (AMD) es una causa principal de pérdida visual grave en la población anciana. La forma exudativa de la AMD se caracteriza por la neovascularización coroidal y el desprendimiento del epitelio retinal pigmentado. Puesto que la neovascularización coroidal está asociada con un empeoramiento dramático en la prognosis, se espera que los antagonistas del VEGF de la presente invención sean especialmente útiles para reducir la gravedad de la ADM.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de antagonistas es una dosis candidata inicial para su administración a un paciente, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Para administraciones repetidas a los largo de varios días o más, dependiendo de la condición, se repite el tratamiento hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. No obstante, podrían ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

De acuerdo con otra realización de la invención, la efectividad del antagonista para prevenir o tratar la enfermedad podría mejorarse administrando el antagonista en serie o en combinación con otro agentes que es efectivo para esos propósitos, tal como el factor de necrosis del tumor (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor de tejido, de la proteína C, o de la proteína S (ver Esmon, et al., Publicación de Patente PCT nº WO 91/01.753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (ver Hudziak et al., Publicación de Patente PCT nº WO 89/06.692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, los agentes alquilantes, los antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de los ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de la pirimidina, el 5-fluorouracilo, el cisplatino, los nucleósidos de purina, la aminas, los aminoácidos, los triazol nucleósidos, o los corticoesteroides. Tales otros agentes podrían estar presentes en la composición que se está administrando, o podrían administrarse separadamente.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo de ilustración, y no se pretende que limiten la invención en modo alguno.

Ejemplo 1

(Antecedente)

Preparación de anticuerpos monoclonales anti-hVEGF

Para obtener hVEGF conjugado con hemocianina de lapa con forma de agujero de cerradura (KLH) para la inmunización, se mezcló hVEGF recombinante (165 aminoácidos), Leung, et al., Science 246:1306 (1989), con KLH en una proporción de 4:1 en presencia de 0,05% de glutaraldehído, y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas, con agitación suave. A continuación se dializó la mezcla frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC, durante la noche.

Se inmunizaron ratones BALB/C cuatro veces cada dos semanas mediante inyecciones intraperitoneales de 5 mg de KLH, y se inmunizaron secundariamente (boosted) con la misma dosis de hVEGF conjugado con KLH cuatro días antes de la fusión celular.

Se fusionaron células del bazo, procedentes de ratones inmunizados, con células de mieloma P3X63Ag8U.1, Yelton, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1 (1978), usando polietilenglicol (PEG) al 35%, tal como se ha descrito. Yarmush, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 77:2899 (1980). Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT.

Los sobrenadantes procedentes de cultivos celulares de hibridomas se examinaron en busca de producción de anticuerpo anti-hVEGF mediante un ensayo ELISA usando placas de microvaloración recubiertas con hVEGF. El anticuerpo que estaba unido al hVEGF en cada uno de los pocillos se determinó usando inmunoglobulina IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina, y el sustrato cromogénico p-nitrofenilfosfato. Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las células de hibridoma identificadas de este modo como productoras de anticuerpos anti-hVEGF se subclonaron mediante dilución limitante, y se escogieron dos de esos clones, denominados A4.6.1 y B2.6.2, para ulteriores estudios.

Ejemplo 2

(Antecedente)

Caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF A. Especificidad por el antígeno

Las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Los anticuerpos monoclonales se añadieron a los pocillos de placas de microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF, FGF, HGF o factor de crecimiento epidérmico (EGF). El anticuerpo unido se detectó con inmunoglobulinas IgG de cabra anti-ratón conjugadas con peroxidasa. Los resultados de esos ensayos confirmaron que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al hVEGF, pero no detectablemente a ésos otros factores de crecimiento proteicos.

B. Mapeado del epítopo

Se usó un ELISA de unión competitiva para determinar si los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen al mismo o diferentes epítopos (sitios) en el hVEGF. Kim, et al., Infect. Immun. 57:944 (1989). Se añadieron anticuerpos monoclonales anti-hVEGF sin marcar (A4.6.1 o B2.6.2), o anticuerpo anti-HGF irrelevante (isotipo IgG1) a los pocillos de las placas de microvaloración que previamente se habían recubierto con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF biotinilados (BIO-A4.6.1 o BIO-B2.6.2) se añadieron a continuación. La proporción de anticuerpo biotinilado respecto anticuerpo sin marcar fue de 1:1000. La unión de los anticuerpos biotinilados se visualizó mediante la adición de avidina conjugada con peroxidasa, seguida por o-fenilenediamina dihidrocloruro y peróxido de hidrógeno. El color de la reacción, indicando la cantidad de anticuerpo biotinilado unido, se determinó midiendo la densidad óptica (O.D) a una longitud de onda de 495 nm.

Tal como se muestra en la Figura 1, en cada caso, la unión del anticuerpo anti-hVEGF biotinilado fue inhibida por el correspondiente anticuerpo sin marcar, pero no por los otros anticuerpos anti-hVEGF no marcados o por el anticuerpo anti-HGF. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se unen a diferentes epítopos del hVEGF.

C. Isotipado

Los isotipos de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante ELISA. Se añadieron muestras de medio de cultivo (sobrenadante), en los cuales estaban creciendo cada uno de los hibridomas, a los pocillos de placas de microvaloración que se habían recubierto previamente con hVEGF. Los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF capturados se incubaron con diferentes inmunoglobulinas de cabra anti-ratón, conjugadas con fosfatasa alcalina, y específicas para diferentes isotipos, y la unión de los anticuerpos conjugados a los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF se determinó mediante la adición de p-nitrofenilfosfato. El color de la reacción se midió a 405 nm con un lector de placas de ELISA.

Mediante ése procedimiento, se determinó que el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos por ambos hibridomas, A4.6.1 y B2.6.2, era el IgG1.

D. Afinidad de unión

Las afinidades por el hVEGF de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 se determinaron mediante un ensayo de unión competitiva. Se añadió una concentración predeterminada subóptima de anticuerpo monoclonal a muestras que contenían 20.000-40.000 c.p.m. de ^{125}I-hVEGF (1-2 ng) y varias cantidades conocidas de hVEGF sin marcar (1-1000 ng). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 100 \mul de antisuero de cabra anti Ig de ratón (Pel-Freez, Rogers, AR, EE.UU.), y las mezclas se incubaron otra hora a temperatura ambiente. Los complejos de anticuerpo y proteína unida (complejos immunes) se precipitaron mediante la adición de 500 \mul de polietilenglicol al 6% (PEG, peso molecular: 8000), a 40ºC, seguida por la centrifugación a 2000xg, durante 20 minutos, a 4ºC. La cantidad de ^{125}I-hVEGF unido al anticuerpo monoclonal anti-hVEGF en cada muestra se determinó contando el material precipitado en un contador gamma.

Las constantes de afinidad se calcularon a partir de los datos mediante análisis Scatchard. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 era de 1,2 x 10^{9} litros/mol. Se calculó que la afinidad del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma B2.6.2 era de 2,5 x 10^{9} litros/mol.

E. Inhibición de la actividad mitogénica del hVEGF

Se sembraron células endoteliales capilares (ACE) del córtex adrenal bovino, Ferrara, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:5773 (1987), a una densidad de 10^{4} células/ml en placas de 12 multipocillos, y se añadieron 2,5 ng/ml de hVEGF a cada pocillo en presencia o ausencia de varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 o B2.6.2, o un anticuerpo monoclonal anti-HGF irrelevante. Después de cultivarlas durante 5 días, las células en cada pocillo se contaron en un contador Coulter. Como control, se cultivaron células ACE en ausencia de hVEGF añadido.

Tal como se muestra en la Figura 2, ambos anticuerpos monoclonales anti-hVEGF inhibieron la capacidad del hVEGF añadido para apoyar el crecimiento o supervivencia de las células ACE bovinas. El anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la actividad mitogénica del hVEGF (más de aproximadamente el 90% de inhibición), mientras que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2 inhibió sólo parcialmente la actividad mitogénica del hVEGF.

F. Inhibición de la unión del hVEGF

Se sembraron células ACE bovina a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/0,5 ml/pocillo en placas de microvaloración de 24 pocillos, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, y 1 n/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico. Después de cultivarlas durante la noche, se lavaron las células una vez en tampón unidor (iguales volúmenes de DMEM y medio F21 más HEPES 25 mM y 1% de albúmina de suero bovino) a 4ºC.

Se preincubaron 12.000 c.p.m. de ^{125}I-hVEGF (aprox. 5 x 10^{4} c.p.m./ng/ml) durante 30 minutos con 5 \mug del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por los hibridomas A4.6.1, B2.6.2, o A2.6.1 (250 \mul de volumen total), y a continuación se añadieron las mezclas a las células ACE bovinas en las placas de microvaloración. Después de incubar las células durante 3 horas a 4ºC, se lavaron las células 3 veces con tampón unidor a 4ºC, se solubilizaron mediante la adición de 0,5 ml de NaOH 0,2 N, y se contaron en un contador gamma.

Tal como se muestra en la Figura 3 (superior), los anticuerpos monoclonales anti-hVEGF producidos por los hibridomas A4.6.1 y B2.6.2 inhibieron la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. Por contra, el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A2.6.1 no tenía un efecto evidente sobre la unión del hVEGF a las células ACE bovinas. De forma consistente con los resultados obtenidos en el ensayo de proliferación descrito más arriba, el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió la unión del hVEGF con mayor alcance que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma B2.6.2.

Tal como se muestra en la Figura 3 (inferior), el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma A4.6.1 inhibió completamente la unión del hVEGF a las células ACE bovinas en un proporción molar de 1:250 del hVEGF respecto el anticuerpo.

G. Reactividad cruzada con otras isoformas del VEGF

Para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 reacciona con las formas de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, se ensayó la capacidad del anticuerpo para inmunoprecipitar esos polipéptidos.

Se transfectaron células 293 humanas con vectores que comprendían la secuencia codificante de nucleótidos de los polipéptidos de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF, tal como se describió. Leung, et al., Science 246:1306 (1989). Dos días después de la transfección, se transfirieron las células a medio que carecía de cisteína y metionina. Se incubaron las células 30 minutos en cada medio, a continuación se añadieron al medio 100 \muCi/ml de cada una de ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína, y se incubaron las células otras dos horas. El marcaje se capturó transfiriendo las células a medio carente de suero e incubándolas durante tres horas. Se recolectaron los medios de cultivos de las células, y las células se lisaron incubándolas durante 30 minutos en tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,5% de deoxicolato, 0,1% de sodio dodecil sulfato (SDS), Tris 50 mM, pH 8,0). Los restos celulares se retiraron de los lisados mediante centrifugación a 200 xg durante 30 minutos.

Se incubaron 500 \mul de las muestras de medios de cultivo de las células y lisados de las células con 2 \mul del anticuerpo del hibridoma A4.6.1 (2,4 mg/ml) durante 1 hora, a 4ºC, y a continuación se incubaron con 5 \mul de inmunoglobulina IgG anti-ratón de conejo durante 1 hora, a 4ºC. Los complejos inmunes de hVEGF marcado con ^{35}S y anticuerpo monoclonal anti-hVEGF se precipitaron con proteína A-Sepharose (Pharmacia), entonces se sometieron a electroforesis el gel de poliacrilamida-SDS al 12% en condiciones reductoras. Se expuso el gel a una película de rayos X para el análisis mediante autorradiografía de las proteínas marcadas radiactivamente e inmunoprecipitadas.

Los resultados de ese análisis indicaron que el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF producido por el hibridoma A4.6.1 reaccionaba de forma cruzada con ambas, las formas de 121 y 189 aminoácidos del hVEGF.

Ejemplo 3 Preparación de la proteína de fusión receptor del hVEGF-IgG

Las secuencias de nucleótidos y codificante de aminoácido del receptor flt del hVEGF se descubren en Shibuya et al., Oncogene 5:519-524 (1990). La secuencia codificante del dominio extracelular del receptor flt del hVEGF se fusionó a la secuencia codificante de la cadena pesada de la IgG1 humana en un proceso de dos pasos.

Se usó la mutagénesis dirigida a un sitio para introducir un sitio de restricción BstBI en ADN que codificaba el flt en un sitio 5' respecto el codón para el aminoácido 759 del flt, y para convertir el único sitio de restricción BstEII en el plásmido pBSSK-FC, Bennet et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991), en un sitio BstBI. El plásmido modificado se digirió con con EcoRI y BsTBI, y el gran fragmento de ADN de plásmido resultante se ligó junto con un fragmento EcoRI-BstBI del ADN del flt que codificaba el dominio extracelular (aminoácidos 1-758) del receptor flt del hVEGF.

La construcción resultante se digirió con ClaI y NotI para generar un fragmento de aproximadamente 3,3 kb, el cual se insertó a continuación en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión en mamíferos pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8:1045 (1992)) mediante ligación. Los extremos del fragmento de 3,3 kb se modificaron, por ejemplo, mediante la adición de conectores, para obtener la inserción del fragmento en el vector en la orientación correcta para su expresión.

Se transfectaron células huésped de mamíferos (por ejemplo, las células CEN4 (Leung et al., ver más arriba)) con el plásmido pHEBO2, que contenía el inserto del flt, mediante electroporación. Las células transfectadas se cultivaron en medio que contenía aproximadamente un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, y antibióticos, y a aproximadamente el 75% de confluencia se transfirieron a medio carente de suero. El medio se condicionó durante 3-4 días antes de recogerlo, y la proteína de fusión flt-IgG se purifico a partir del medio condicionado mediante cromatografía sobre una matriz de proteína A-Sepharose, esencialmente tal como se describe en Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991).

Ejemplo 4

(Antecedente)

Inhibición del crecimiento del tumor con antagonistas del hVEGF

Se ensayó mediante ELISA la producción de hVEGF en varias líneas celulares tumorales creciendo en cultivo. Se halló que las líneas celulares tumorales de ovario, pulmón, colon, gástricas, de mama y de cerebro producían hVEGF. Tres líneas celulares que producen el hVEGF, la NEG 55 (línea celular de glioma humano, obtenida del Dr. M. Westphal, Departamento de Neurocirugía, University Hospital Eppendor, Hamburgo, Alemania, también denominada G55), la A-673 (línea celular de rabdomiosarcoma humano, obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU., 28052, como línea celular con nº de CRL 1598), y la SK-LMS-1 (línea celular de leiomiosarcoma, obtenida de la ATCC como la línea celular número HTB 88), se usaron para estudios adicionales.

Se inyectaron subcutáneamente de seis a diez ratones inmunodeprimidos (nude) (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts, EE.UU.) con 1-5 x 10^{6} células tumorales en 100-200 \mul de PBS. En diversos instantes, una vez se había establecido el crecimiento tumor, se inyectaron los ratones intraperitonealmente, una o dos veces por semana, con varias dosis de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1, un anticuerpo monoclonal anti-gp120 irrelevante (5B6), o PBS. El tamaño del tumor se midió cada semana, y a la conclusión del estudio los tumores se extrajeron y pesaron.

El efecto de varias cantidades del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de los tumores de NEG 55 en ratones se muestra en las Figuras 4 y 5. La Figura 4 muestra que los ratones tratados con 25 \mug ó 100 \mug de anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1, empezando una semana después de la inoculación de células NEG 55, tenían una tasa de crecimiento del tumor sustancialmente reducida en comparación con los ratones tratados, bien con el anticuerpo irrelevante o con PBS. La Figura 5 muestra que cinco semanas después de la inoculación de las células NEG 55, el tamaño de los tumores en los ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 eran aproximadamente del 50% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 25 \mug del anticuerpo) al 85% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 100 \mug del anticuerpo) menores que el tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o con PBS.

El efecto del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de los tumores de SK-LMS-1 en ratones se muestra en la Figura 6. Cinco semanas después de la inoculación de la células SK-LMS-1, el tamaño promedio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente un 75% inferior respecto los tamaños de los tumores en ratones tratados con anticuerpo irrelevante o PBS.

El efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A4.6.1 sobre el crecimiento de tumores de A673 en ratones se muestra en la Figura 7. Cuatro semanas después de la inoculación de las células A673, el tamaño promedio de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 era aproximadamente del 60% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 10 \mug del anticuerpo) a más del 90% (en el caso de los ratones tratados con dosis de 50-400 \mug del anticuerpo) inferiores al tamaño de los tumores en ratones tratados con el anticuerpo irrelevante o PBS.

Ejemplo 5

(Antecedente)

Análisis del efecto directo del anticuerpo anti-hVEGF sobre las células tumorales creciendo en cultivo

Las células de glioblastoma humano NEG55 o las células de rabdomiosarcoma A673 se sembraron a una densidad de 7 x 10^{3} células/ml en placas multipocillos (12 pocillos/placa), en medio F12/DMEM que contenían un 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 7y antibióticos. A continuación se añadió el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 a los cultivos celulares hasta una concentración final de 0-20,0 \mug de anticuerpo/ml. Transcurridos cinco días, las células que crecían en los pocillos se disociaron mediante exposición a tripsina, y se contaron en un contador Coulter.

Las Figuras 8 y 9 muestran los resultados de esos estudios. Como es evidente, el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no tuvo ningún efecto significativo sobre el crecimiento de las células NEG55 y A673 en cultivo. Estos resultados indican que el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 no es citotóxico, y sugieren con fuerza que los efectos antitumorales del anticuerpo observados se deben a su inhibición de la neovascularización mediada por el VEGF.

Ejemplo 6

(Antecedente)

Efecto del anticuerpo anti-hVEGF sobre la quimiotaxis de las células endoteliales

La quimiotaxis de las células endoteliales, y de otras células, incluyendo los monocitos y linfocitos, juega un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. La migración y proliferación de las células endoteliales acompañan la angiogénesis que ocurre en el sinovio reumatoide. El tejido vascularizado (pannus) invade y destruye el cartílago articular.

Para determinar si los antagonistas del hVEGF interfieren con este proceso, ensayamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de células endoteliales estimuladas, mediante fluido sinovial procedente de pacientes que tienen la artritis reumatoide. Como control, ensayamos el efecto del anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 sobre la quimiotaxis de células endoteliales estimuladas mediante fluido sinovial procedente de paciente que tienen osteoartritis (la angiogénesis que ocurre en la artritis reumatoide no ocurre en la osteoartritis).

La quimiotaxis de las células endoteliales se ensayó usando cámaras de Boyden modificadas de acuerdo con procedimientos establecidos. Thompson et al., Cancer Res. 51:2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197:458 (1991). Aproximadamente 10^{4} células endoteliales de la vena umbilical humana se dejaron adherir a filtros recubiertos de gelatina (tamaño de poro de 0,8 micrones), en microcámaras multipocillos de 48 pocillos, en medio de cultivo que contenía un 0,1% de suero fetal bovino. Transcurridas aproximadamente dos horas, se invirtieron las cámaras y se añadieron a los pocillos muestras de ensayo (fluido sinovial de artritis reumatoide, fluido sinovial de osteoartritis, FGF básico (bFGF) (hasta una concentración final de 1 \mug/ml), o PBS) y anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 (hasta una concentración final de 10 \mug/ml). Después de dos a cuatro horas, se tiñeron y contaron las células que habían migrado.

La Figura 10 muestra los resultados promedio de esos estudios. Los valores mostrados en la columna marcada "Fluido Sinovial", y los mostrados al final de la página para los controles, son el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial, bFGF, o PBS solo. Los valores en la columna marcada "Fluido Sinovial + mAB VEGF" son el número promedio de células endoteliales que migraron en presencia de fluido sinovial más anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1 añadido. Los valores en la columna marcada "% de Supresión" indican el porcentaje de reducción en la migración de células endoteliales, inducida por el fluido sinovial, que resulta de la adición del anticuerpo anti-hVEGF. Tal como se indica, el anticuerpo anti-hVEGF inhibió significativamente la capacidad del fluido sinovial de la artritis reumatoide (53,40 porcentaje promedio de inhibición), pero no la del fluido sinovial de la osteoartritis (13,64 porcentaje promedio de inhibición), para inducir la migración de células endoteliales.

Claims (10)

1. Uso de un antagonista del hVEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad en un paciente humano, en donde el antagonista del hVEGF comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de un hVEGFr.

2. Uso acorde con la reivindicación 1, en donde el hVEGFr es el receptor flt o el receptor flk-1 (también denominado como KDR).

3. Uso acorde con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde los dominios transmembrana y citoplásmico del hVEGFr están suprimidos.

4. Uso acorde con cualquier reivindicación 1 precedente, en donde el antagonista del hVEGF es una proteína de fusión que comprende además un polímero o polipéptido que no es del hVEGFr.

5. Uso acorde con la reivindicación 4, en donde el polipéptido que no es del hVEGFr es una inmunoglobulina.

6. Uso acorde con la reivindicación 5, en donde el dominio extracelular del hVEGFr se sustituye con el dominio Fv de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina.

7. Uso acorde con la reivindicación 6, en donde el dominio Fv procede de una cadena pesada de inmunoglobulina.

8. Uso acorde con la reivindicación 7, en donde el extremo C-terminal del dominio extracelular del receptor está unido covalentemente al extremo amino-terminal del C_{H}1, bisagra, C_{H}2 de la cadena pesada.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el hVEGFr está conjugado a un polímero no proteico.

10. Uso acorde con la reivindicación 9, en donde el polímero no proteico es polietilenglicol.