KR19980701950A - 분석, 리셉터 단백질 및 리간드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리셉터 단백질 티로신 키나아제 페밀리의 성장인자 리셉터, 대량으로 리셉터의 세포외 도메인의 제조, 리셉터에 대한 리간드, 리간드를 암호하는 핵산, 및 분석에서 리셉터와 리간드의 사용에 관한 것이다.

Description

분석, 리셉터 단백질 및 리간드

다세포 동물에서 세포 증식 및 분화는 정확한 일치 및 조절을 요구한다. 특히 세포 표면 리셉터에 시토킨 및 성장인자같은 세포외 신호분자의 결합은 이것이 달성되는 하나의 주요 메카니즘을 제공한다. 이런 리셉터들은 세포막에 퍼져 있으며, 이들의 세포내 부위에 고유 단백질 티로신 키나아제 도메인을 가지고 있는지 여부로 분류된다. 티로신 키나아제는 많은 세포내 단백질에서 티로신 잔기를 인산화함으로서 신호 전달에서 중요한 단계를 제공한다. 고유 단백질 티로신 키나아제를 가지는 리셉터는 리셉터 티로신 키나아제(RTK:성장인자 리셉터)로 공지되어 있다.

중합효소사슬반응(PCR)의 출현으로 이 페밀리의 많은 새 멤버가 이들의 촉매적 도메인내의 매우 보존된 구조적 요소를 거쳐서 동정되었다. 이런 리셉터는 공통의 세포질성 단백질 티로신 키나아제(PTK) 도메인을 공유할지라도, 이들은 이들의 세포외 도메인에 특징적인 구조적 요소를 가지고 있다. 이런 구조적 요소는 주어진 서브페밀리로 RTK를 분류하는데 사용될 수 있으며, PTK 페밀리내에 존재하는 구조적 다양성을 제시한다(Ullrich and Schlesinger, 1990).

세 개의 TRK가 연구되어 왔으며 각각 NYK(VEGFR2), tie2(tek) 및 RYK로 명명되었으며 PCR-기초로 한 기술을 사용하여 분리하였다(Wilks, 1989). 이런 리셉터의 세포외 도메인은 RTK에서 발견되는 다양한 배열의 구조적 특징을 나타내며 세 개의 특징적인 서브-페밀리로 분류된다. 태아 간 키나아제(flk-1) 또는 혈관 내피 성장인자 리셉터 2(VERFR2)라고 불리는 신경상피 티로신 키나아제(NYK)는 혈관 내피 성장인자(VEGF)의 리셉터이고 가능하게는 하나의 다른 인자에 대한 리셉터이며 7개의 Ig-유사 세포외 도메인을 가지는 클래스 Ⅲ RTK이다(Oelrichs et al, 1993; Terman et al, 1992). tie2는 이것이 세포외 부위가 두 개의 Ig-유사 도메인, 3개의 EGF 반복 및 3개의 피브로넥틴 타입 Ⅲ 반복의 배열로 구성되는 RTK의 페밀리에 속한다(Runting et al, 1993). RYK는 소위 루신-풍부한 반복을 가지는 오르펀 리셉터이지만 다른 동정할 수 있는 구조적 모티브가 결핍되어 있다(Hovens et al, 1992; Paul et al, 1992; Stacker et al, 1993).

혈관(내피)의 세포 배열은 혈액과 조직 사이의 중요한 접촉면이다. 조직 또는 기관이 스스로 혈액공급을 공급하기를 필요로 할 때, 혈관 발달(혈관생성작용)의 새 웨이브가 발생해야만 하며; 이것은 내피의 분열과 성장을 요구한다. 혈관발달을 보충할 수 있는 공지된 단백질중에서, 하나의 특별한 성장인자인 혈관 내피 성장인자(VEGF)가 논증적으로 혈관생성과정(angiogenesis)동안 내피세포의 분열에 대한 가장 중요한 자극중의 하나이다.

중요한 혈관생성작용은 다음과 같은 특별한 상황하에서 어른에서만 일어난다.

a) 월경주기동안, 배출되고 재확립되는 여성 자궁의 내막

b) 배 착상 및 발달,

c) 상처후의 조직 개조,

d) 종양 혈관생성과정으로 공지된 과정인 종양의 확립동안 보충되는 혈관,

e) 장님을 유도하는 당뇨병의 중요한 합병증인, 당뇨병 망막병증.

종양은 상당한 혈관없이 확립될 수 없기 때문에, 종양 혈관생성과정이 항암제의 발달동안 표적이 되어 왔다. 실제로, 종양 혈관생성의 과정은 모든 전이성 종양이 일반적으로 가지고 있는 것이다. 그러나 어른에서 정상적인 내피세포의 전환물은 더 짧아서 12-18개월이다. 따라서 항-혈관생성제는 어떤 종양 치료에서 중요한 부수품이었다.

VEGF에 대한 적어도 두 개의 리셉터가 혈관생성과정에 관련되어 있다고 생각되지만, NYK는 주요 신호 리셉터이다. 따라서, VEGF의 활성을 억제하기 위해서 리셉터에 결합할 수 있는 화합물은 넓은 범위의 치료적 용도를 가지고 있다. 혈관생성과정은 필수적으로 상기 언급된 상황에서만 관련되어 있기 때문에, 이런 억제제는 종래의 약물치료보다 중요한 부작용을 덜 일으키는 것같다.

비록 혈관생성과정을 억제하는 것으로 공지된 몇몇 약제가 존재하지만, 이런 공지된 억제제는 다른 리셉터상에 작용하거나 또는 다른 경로를 거쳐 작용한다. 억제제와 비-억제제 화합물 사이를 구별하기 위해서, 그리고 VEGF 리셉터의 억제의 특이성을 제시하기 위해서, 인비트로 분석 시스템이 성장인자 VEGF와 이것의 리셉터인 VEGFR2(NYK)를 기초로 하여 발달하였으며, 이것은 이런 두 분자의 상호작용의 억제제를 검출할 수 있다. 이런 시스템을 위한 두가지 사용법이 있다; 첫째, VEGF와 이것의 리셉터 사이의 상호작용 부위를 확립하는 것, 더욱 이 과정의 아고니스트 또는 억제제로서 작용할 수 있는 합리적인 약제 디자인을 가능하게 하는 것; 두 번째, 순수한 생성물 검색으로서 VEGF/VEGFR2 상호작용의 억제가 특별한 순수한 원료에서 억제제의 존재에 대한 증거가 될 것이다.

본 발명의 방법은 NYK 단백질의 분리된 세포외 도메인을 사용한다. 분리된 세포외 도메인의 제조를 위해 특히 편리한 방법이 기재된다. 그러나, 본 발명은 다른 방법으로 제조되는 분리된 NYK 세포외 도메인을 사용할 수 있다는 것이 분명히 이해될 것이다. 분리된 세포외 도메인을 제조하기 위해 여기에 기재된 방법은 편리함 다량의 단백질 제조를 허락한다. 리셉터는 보통 매우 적은 양으로만 나타낸다. 따라서 우리의 방법은 흥미있는 상호작용하는 리간드를 검출하기 위한 친화성 시약으로서 작용하며 또한 항체의 제조를 위한 면역원으로서 작용하는, 이런 리셉터의 세포외 도메인을 특이화하는 재조합 단백질의 제조를 허락한다. 리셉터의 세포외 도메인을 발현시킬 때 중요한 고려사항중의 하나는 다양한 구조적 모티프가 정확한 형태로 접혀진다는 것을 증명하는 것이다. 세포외 도메인/막투과 경계면에서 프레임내 정지 코돈을 간단히 도입하는 것과 같은 기술은, 만약 접혀진 리셉터를 인지하는 단일클론 항체가 발현되는 단백질의 정제를 위해 유용하다면 효과적으로 사용될 수 있다.

그러나 최근에, PCR 클로닝 기술의 출현은 완전한 cDNA 서열이 종종 어떤 단백질 데이타 또는 단일클론 항체를 이용할 수 있기 전에 잘 얻어짐을 나타냈다. 이것은 알카리성 포스파타제(Flanagan과 Leder, 1990), 면역글로불린의 Fc 부위(Fanslow et al, 1992), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(스미스와 Johnson, 1988), 및 FLAG^TM(U.S. 특허번호 4,703, 004; Hopp et al, 1992)와, T7-Tag^TM, HSV-Tag^TM과 S-Tag(Novagen)같은 합성 펩티드처럼, 흥미있는 단백질에 연결될 수 있으며, 친화성 시약을 이용할 수 있는 마커 펩티드 또는 폴리펩티드의 사용을 포함할 수 있다. 이런 마커들중에 몇몇은, 특히 바이오센서상에서 리간드에 대한 검색같은 이용에서, 이들이 자신의 결합 특이성을 가지는 불리함을 감수하며(예를 들어 Fc 부위), 도메인의 접힘을 방해할 수 있으며, 또는 입체적으로 가능한 리간드 결합부위를 숨길 수 있다. 더욱이, 이런 마커들중 몇몇은 단지 원핵세포 발현 시스템에서 발달해 왔으며, 이것은 해독후 변형이 활성을 위해 요구될 수도 있기 때문에 복잡한 리셉터의 발현에 대해서는 부적당할 수도 있다.

FLAG^TM펩티드 시스템은 재조합 박테리아 단백질에 대한 N-말단 마커로서 처음으로 기재되었다. 이것은 작은, 여덟 개의 아미노산 수용성 펩티드이며, 자연상태에서 친수성이며, 이것에 대한 일련의 단일클론 항체가 만들어졌으며, 이것은 상업적으로 구입할 수 있다. 이 펩티드는 융합 단백질의 외부로 위치되도록 디자인되었고 이것의 크기 때문에, 연구되고 있는 단백질의 접힘에 최소한의 간섭을 제공한다(Hopp et al, 1992). 비록 하나의 최근의 연구가 포유동물 발현 시스템(Gerard and Gerard, 1990)을 사용했을지라도, 지금까지 FLAG^TM마커를 가지고 한 연구의 대부분은 박테리아 발현 시스템(Hopp et al, 1992; Li et al, 1992: Su et al, 1992; Zhang et al, 1991)을 사용하였다.

상기 개요된 문제들중 몇몇을 경감시키는 기술이 여기에 기재되어 있다. 부위-특이적 돌연변이유발 접근이 리셉터의 리간드 결합 부위에 마커 펩티드의 프레임내 결합을 용이하게 하기 위해 세포외 및 예상되는 막투과 도메인의 결합부에서 제한 부위를 생성시키는데에 사용된다. 이런 연구에서 작은 FLAG^TM마커 펩티드와 CHO 세포 발현시스템이 대규모 단백질 제조를 위해 사용되어 왔다. 수용성 융합 단백질이 시판용 항- FLAG^TM친화성 겔과 프리 펩티드로 느린 용출을 사용하여 세포 상층액으로부터 정제되었다. 이런 접근은 포유동물 원료로부터 순수하고 기능적인 리셉터 세포외 도메인을 생성하였다. FLAG^TM이 특별히 여기에서 언급되었지만, 다른 작은 마커 펩티드가 동일한 부위-특이적 돌연변이유발과 프레임내 라이게이션 방법을 사용하여 사용될 수 있다는 것이 분명히 이해될 것이다. 몇몇 이런 펩티드에 대한 단일클론 항체를 상업적으로 구입할 수 있다.

단일 부위-특이적 돌연변이유발 단계를 사용하여, 우리는 FLAG^TM옥타펩티드를 암호하는 한쌍의 올리고누클레오티드 링커의 라이게이션을 가능하게 하는 리셉터 cDNA에서 제한효소 부위를 조작했다. 이것은 종종 5' 말단에서 높은 GC 함량 부위를 가지는 cDNA(1-3kb)의 큰 섹션상에서 PCR의 사용을 피한다. FLAG^TM옥타펩티드 마커는 세포외 도메인의 C-말단에 위치되기 때문에, 변형되지 않고, 리간드 결합에 종종 관련되는 부분인 리셉터의 N-말단 부위를 남겨 놓는다. 이런 접근은 세 개의 특징적인 서브페밀리:VEGFR2, tie2 및 RYK로부터 RTK를 가지는 FLAG^TM-융합 단백질을 제조하기 위해서 사용되었다. CHO 세포 발현 시스템에서 발현되는 재조합 융합 단백질은 항- FLAG^TM항체 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 단백질은 프리 FLAG^TM펩티드와의 경쟁에 의해 친화성 칼럼으로부터 용출되었으며, 이것은 잠재적으로 변성제에 대한 이들의 노출을 최소화하였다. 이 방법은 일반적으로 잘-특징화된 마커 펩티드를 사용하여 세포 표면 리셉터의 기능적 세포외 도메인을 발현하고 정제하는데에 이용할 수 있다. 이 방법은 특히 단일클론 항체 제조같은 연구, 면역학적 분석같은 분석, 바이오센서 실험 또는 기능적 물질을 요구하는 리간드 분리 연구에 유용하다.

본 발명은 리셉터 단백질 티로신 키나아제 페밀리의 성장 인자 리셉터, 다량으로 리셉터의 세포외 도메인 제조, 리셉터에 대한 리간드, 리간드를 암호하는 핵산 및 분석에서 리셉터와 리간드의 사용에 관한 것이다.

도 1은 BIAcore^TM을 사용하여 고정된 NYK-EX- FLAG^TM에 결합하는 VEGF의 분석결과를 나타낸다. 정제된 NYK-EX- FLAG^TM은 여기에 기술된 것처럼 CM5 센서 칩에 연결되었다. 그후 다음과 같은 용액이 NYK-EX- FLAG^TM에 대한 이들의 결합에 대해 분석되었다. VEGF를 함유한 CHO 세포 배지, tie2-EX- FLAG^TM을 함유한 CHO 세포 배지(대조구 1) 또는 완충액 단독(대조구 2). 도면은 초로 측정되는 실험의 시간상으로 상기 샘플의 주입후에 보여지는 상대적 반응 유닛(RU)을 나타나는 세 개의 센서 그램의 도면을 나타낸다. RU는 리간드 결합과 관련되는 바이오센서 칩의 표면에서 메스 변화와 관련된다. 지점 A는 시험 샘플의 첨가전에 베이스라인을 나타내고, B는 시험 샘플이 주입되는 지점, 지점 C는 샘플이 BIAcore^TM완충액으로 치환되는 주입 상의 마지막을 나타내며, 지점 D는 VEGF의 특이 결합 때문에 베이스라인에서의 전체적 변화를 나타낸다.

도 2는 IL-3와 에리트로포이어틴(Epo)에 대한 것과 같은 시토킨 리셉터, RTK 및 RTK-Epo 키메라에 의한 신호전달의 메카니즘을 나타낸다.

도 3은 단일클론 항체 4H3와 대조구 항체 4g8을 사용하여 BA/F3 세포의 표면에서 VEGFR2-EpoR 발현의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. 선은 항체 4H3로 염색된 대조구 세포주 115(---)와 4H3(―) 또는 대조구 항체 4g8(…)로 염색된 BAF/3-NYK-EpoR 세포주이다.

도 4는 NYK 리셉터 기능의 조절제의 아미노산 서열을 나타낸다. 해당 누클레오티드 서열은 본 분야에 숙련된 사람들에게 잘 공지되어 있을 것이다.

도 5는 FLAG^TM링커 올리고누클레오티드 서열을 나타낸다. 링커 서열은 프레임내 종결코돈을 포함하는 FLAG^TM옥타펩티드를 암호화한다. BglⅡ 양립할 수 있는 돌출부는 양쪽 끝에 존재하여 BglⅡ, BamHⅠ, BclⅠ, NdeⅡ 또는 XhoⅡ로 자른 DNA로 라이게이션을 허락한다. 내부의 ClaⅠ 부위는 라이게이션 반응에서 재조합체의 동정을 허락한다.

도 6은 성장인자 리셉터 세포외 도메인- FLAG^TM융합 단백질을 만드는데 사용되는 방법의 도식적 제시를 나타낸다. BglⅡ 또는 BamHⅠ으로 돌연변이 리셉터를 자른 후에, FLAG^TM링커 올리고누클레오티드를 함께 라이게이션하였고 세포외 도메인 서열을 가지는 프레임내 FLAG^TM서열을 함유한 재조합체를 선별하였다. 발현되는 FLAG^TM-융합 단백질의 능력은 먼저 COS 세포에서 일시적 발현으로 평가되었고 삽입체는 XbaⅠ을 사용하는 CHO 세포 발현벡터로 이동하였다.

도 7은 COS 세포로 구조체의 일시적 감염과 면역침전에 의한 검출결과를 보여준다. 패널(A)는 NYK-EX- FLAG^TM-CDM8; 패널(B)는 tie2-EX- FLAG^TM-CDM8을 나타내며 각각의 경우에 CDM8 단독이 대조구로서 사용된다. NYK-EX- FLAG^TM-CDM8(A), tie2-EX- FLAG^TM-CDM8(B) 및 CDM8 단독(A와 B)이 DEAE 덱스트란 방법에 의해 COS 세포로 감염시켰다. 세포를 16시간동안³⁵S-시스테인/메티오닌으로 생합성적으로 표지하였고 상층액을 M2-겔로 면역침전하였다. 세척된 구슬은 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 용출하였고 SDS-PAGE로 분석하였다. 겔은 건조한 후 표지된 단백질은 저장 인 스크린으로 노출하고 400시리즈 Phosphorimager 및 Imagequant v3.0 소프트웨어(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 분석함으로써 검출하였다.

도 8은 SDS-PAGE와 은염색에 의한 친화성-정제된 융합 단백질의 분석결과를 제시한다. (A) NYK-EX- FLAG^TM(25μg/ml FLAG^TM펩티드를 가지는 레인 1-5 용출액, 글리신-HCl, pH 3.0을 가지는 레인 6-8 용출액), (B) tie2-EX- FLAG^TM(25μg/ml FLAG^TM펩티드를 가지는 레인 1-3 용출액, 50μg/ml 펩티드를 가지는 레인 4와 5 및 레인 6-9 글리신-HCl, pH 3.0) 및 (C) RYK-EX- FLAG^TM(25μg/ml 프리 FLAG^TM펩티드로 용출된 레인 1-4, 레인 1=빈 볼륨)을 발현하는 CHO 세포주로부터 사용되는 조직 배양 상층액은 독립적인 M2-겔 친화성 칼럼상으로 통과시켰고 여기에 기재된 것처럼 세척하였다. 용출은 프리 FLAG^TM펩티드(25-50μg/ml), 또는 0.02% Tween 20을 함유한 0.1M 글리신 pH 3.0으로 수행하였다. 용출된 단백질은 환원된 조건하에서 SDS-PAGE로 분석하였고 은 염색으로 검출하였다. 분자량 마커가 나타나 있다.

도 9는 BIAcore^TM을 사용하여, 자연적 그리고 변성된 tie2-EX- FLAG^TM에 대한 단일클론 항체의 결합 분석 결과를 나타낸다.

다음의 설명은 세포외 도메인의 C-말단에 결합되는 마커 펩티드 FLAG^TM(Hopp et al, 1992)를 가지는 융합 단백질로서 CHO 세포에서 생성되고 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 NYK 단백질의 세포외 도메인을 사용한다. NYK-EX- FLAG^TM으로 나타내는 이런 융합 단백질의 제조는 실시예 7에서 9에 기술되어 있다. 그러나, 본 발명은 NYK-EX- FLAG^TM에 제한되지 않고 다른 방법에 의해 생성되는 NYK와 특히 이것의 세포외 도메인이 본 발명의 범위내에 있다는 것이 분명히 이해되어야만 한다.

발명의 개요

첫 번째 측면에서 본 발명은 리셉터 단백질 NYK 또는 이것의 유도체 또는 이것의 대응체를 상기 리셉터, 이것의 유도체 또는 이것의 대응체에 추정되는 리간드의 결합을 허락하는 적당한 조건하에서 상기 추정되는 리간드와 접촉시켜 결합이 일어나는지를 결정하는 것으로 이루어지는 리셉터 단백질 NYK에 결합할 수 있는 리간드 검출 방법을 제공한다.

추정되는 리간드는 자연 기원 또는 합성 기원의 NYK에 결합할 수 있는 것으로 예상되는 어떤 분자일 것이다. 합성 분자의 경우에 이런 것들은 조합 라이브러리의 것들을 포함하는 어떤 합성 분자일 수 있다. 자연 분자의 경우에, 본 발명은 우림지대의 식물 추출물과 산호 및 다른 해양 생물같은 해양 생명으로부터 추출물에 존재하는 화합물을 검색하는데에 특히 유용한 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 다른 수상 또는 육상 서식지로부터 식물 및 동물로부터 유래되는 화합물 검색에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 비교적 정제되지 않은 조성물 또는 추출물을 검색하기 위해 초기에 사용될 수 있으며 따라서 샘플에서 하나 이상의 추정되는 리간드를 검출하는 방법으로 확장된다. 이런 경우에서 하나 이상의 리간드를 함유하는 것으로 예상되는 샘플은 리셉터 단백질 NYK 또는 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체와 접촉된다. 상기 샘플은 상기 기재된 원료로부터 올 수 있지만 또한 암 조직 샘플, 혈청 샘플 등을 포함하는 환자로부터의 조직 샘플같은 생물학적 기원으로부터의 샘플을 포함한다.

리셉터 단백질 NYK 또는 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체라는 용어는 이것의 대립형질 변이체를 포함하여 자연적으로 일어나는 NYK 단백질, 변형된 자연적 NYK 및 합성 NYK를 말한다. 기능적 대응체라는 용어는 특별히 NYK 리셉터 기능을 보유하는 단백질을 말한다. 자연적 NYK 변형은 리셉터 기능을 함유하는 세포외 부분을 얻기 위해서 자연적 분자를 분해하는 것을 포함한다. 합성적으로 제조된 NYK가 또한 고찰되며 이것은 예를 들어 펩티드 합성으로 제조된 NYK를 포함한다. 비슷하게, 재조합 NYK는 이 용어의 범위안에서 포함되며 이것은 리셉터 활성을 보유하는 융합 단백질을 포함하여 재조합적으로 제조된 NYK를 말한다. 이 용어는 또한 세포의 표면상에 발현되는 NYK와 이것의 유도체 또는 기능적 대응체로 확장된다. 바람직하게 이런 NYK와 이것의 유도체 또는 기능적 대응체는 상기 세포에 나타나는 재조합 벡터에 의해 암호화된다.

상기 리셉터, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체에 상기 추정되는 리간드의 결합을 허락하는 적당한 조건하라는 용어는 적당한 기간의 시간, 적당한 pH, 온도 및 본 분야에 숙련된 사람들에게 잘 공지되어 있는 다른 매개변수같은 매개변수를 포함한다.

결합은 어떤 편리한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, NYK, NYK 유도체 또는 이것의 기능적 대응체, 또는 결합에 대해 조사되는 추정되는 리간드는 방사능 표지, 형광표지같은 검출 마커 또는 효소반응으로 검출할 수 있는 마커로 표지될 수 있다. 선택적으로 인 비트로 생물학적 분석은 결합에 의해 유도되는 기능을 조사하기 위해서 사용될 수 있다. 많은 적당한 검출 시스템이 본 분야에 공지되어 있다. 따라서 본 발명의 사용에 적당한 분석 시스템은 여기에 제한을 두지 않고 효소결합된 이뮤노소벤트 분석(ELISA)같은 면역학적 분석; 코팅된 마이크로적정 플레이트 또는 슬라이드를 사용하는 것들 또는 친화성 크로마토그래피같은 친화성-형 분석; 형광활성화된 세포분류; 바이오센서 분석; 및 생물학적 분석을 포함한다. 더욱이 결합을 검출하기 위해서, 결합의 정도는 하나 이상의 상기 기술에 의해 측정될 수 있다.

두 번째 측면으로 본 발명은 리셉터 단백질 NYK 또는 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체를 상기 리셉터에 리간드중 어느 것의 결합을 허락하는 적당한 조건하에서 상기 리간드를 함유하는 것으로 예상되는 생물학적 샘플과 접촉시켜 상기 리간드의 결합이 일어나는지를 결정하는 것으로 이루어지는 상기 방법의 생물학적 샘플에서 리셉터 단백질 NYK의 리간드 검출방법을 제공한다.

생물학적 샘플은 NYK의 리간드를 함유하는 것으로 예상되는 어떤 생물학적 샘플, 특히 복수(ascites), 혈청, 혈액 및 암 등의 고체조직같은 VEGF를 함유하는 것으로 예상되는 어떤 샘플일 수 있다. VEGF의 검출은 이 분자가 종양과 당뇨병 망막병증의 마커이기 때문에 중요하다.

리셉터 단백질 NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체와 결합을 허락하는 적당한 조건하라는 용어는 상기 제공되는 것처럼 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 방법은 또한 NYK에 NYK 리간드의 결합을 억제할 수 있는 시약의 검출로 확장된다.

따라서 세 번째 측면으로 본 발명은 상기 상호작용을 억제하는 것으로 예상되는 분자를 NYK 또는 이것의 유도체 또는 기능적 대응체를 공지된 리간드에 결합을 허락하는 적당한 조건하에서

(ⅰ) NYK 또는 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체와

(ⅱ) 공지된 NYK의 리간드에

접촉시켜 결합이 일어나는지를 결정하는 것으로 이루어지는 NYK와 리간드의 상호작용을 억제할 수 있는 분자검출방법을 제공한다.

NYK와 이것의 인 비보 리간드 사이의 상호작용의 억제는 혈관생성 억제 또는 혈관 투과성의 억제를 일으킨다.

리셉터 단백질 NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체와 결합을 허락하는 적당한 조건하라는 용어는 상기 제공된 것처럼 동일한 의미를 가진다.

NYK 리간드 상호작용의 억제제인 것으로 예상되는 분자는 이 상호작용의 길항물질인 어떤 분자일 것이다. 이런 분자는 상기 기재된 것들처럼 자연적 기원 또는 합성적 기원으로부터 유래될 수 있다. 이 방법은 특히 NYK 길항물질에 대한 식물 및 동물 추출물을 검색하는데 유용하다. 억제제인 것으로 예상되는 분자는 NYK 단백질의 어떤 부위에 결합하는 분자일 수 있지만, 필수적으로 리셉터 기능을 가지는 단백질의 리셉터 부위는 아니라는 것을 주시하는 것이 중요하다. 간접적으로 리셉터 기능을 억제하는 어떤 분자가 또한 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있다. 따라서 NYK 단백질, 이것의 대응체 또는 유체의 상태는 어느 정도로 본 발명의 방법에 의해 동정되는 억제제의 유형을 결정할 것이다.

결합의 결정은 상기 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 방법에 사용되는 NYK 유도체는 NYK의 세포외 부위로 구성되며, 더욱 바람직하게는 융합 단백질의 형태로 구성된다.

네 번째 측면으로 본 발명은 증가된 활성을 가지는 것으로 예상되는 분자를 상기 분자와 NYK 또는 이것의 유도체 또는 기능적 대응체의 결합을 허락하는 충분한 조건하에서

(ⅰ) 상기 NYK, 또는 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체에 접촉시켜 결합이 일어나는지를 결정하는 것과

(ⅱ) 상기 결정을 적당한 조건하에서 (ⅰ)과 자연적 리간드와 접촉하는 것으로 이루어지는 대조구에서 결합의 양과 비교하는 것으로 이루어지는 상기 방법의, NYK의 자연적 리간드와 비교하여 리셉터 단백질 NYK의 활성을 자극하는 증가된 능력을 가지는 분자검출방법을 제공한다.

NYK의 자연적 리간드와 비교하여 리셉터 단백질 NYK의 활성을 자극하는 증가된 능력을 가지는 분자라는 용어는 자연적 리간드에 비하여 리셉터상에서 증가된 효과를 일으킬 수 있는 어떤 분자를 말한다. 이런 증가된 효과는 보통 자연적 리간드인 VEGF보다 생물학적 분석에서 더 좋은 혈관생성반응을 일으키는 분자의 능력이라는 용어일 것이다. 선택적으로 증가된 능력은 혈관 투과성을 유도하는 능력에 관한 것일 수 있다. 이런 분자는 혈관생성작용이 상처치료등에서 요구되는 약학적 이용에서 유용하리라 기대된다. 분자는 일반적으로 단백질일 것이다. 바람직하게 분자는 증가된 혈관생성 활성을 가지는 야생형 VEGF의 돌연변이체이다.

다른 용어는 상기 제공된 것과 같은 뜻을 가진다.

다섯 번째 측면으로 본 발명은 NYK 또는 이것의 변이체를 함유하는 것으로 예상되는 샘플을 상기 NYK 또는 이것의 변이체와 상기 공지된 리간드 사이에 일어나는 결합을 허락하는 적당한 조건하에서 NYK의 공지된 리간드와 접촉시켜 결합이 일어나는지를 결정하는 것으로 이루어지는 샘플에서 리셉터 단백질 NYK 또는 이것의 변이체를 검출하는 방법을 제공한다.

이것의 변이체라는 용어는 자연스럽게 일어나는 NYK의 대립 유전자와 돌연변이체 및 합성적으로 제조된 NYK의 변이체를 말한다. 이런 변이체는 자연적 리셉터의 기능적 활성을 유지한다.

다른 용어는 상기 제공된 것과 동일한 의미를 가진다.

샘플은 상기 언급되는 것과 같은 어떤 샘플일 것이다.

공지된 리간드는 NYK의 어떤 리간드일 것이며 바람직하게는 항체, 더욱 바람직하게는 단일클론 항체이다.

결합결정 방법은 상기 기재된 것과 같은 어떤 방법일 것이다. 바람직한 구체예에서 공지된 리간드는 바이오센서 칩에 결합된다. 이것은 리셉터 또는 이것의 변이체에 대해 매우 민감한 분석을 제공한다.

여섯 번째 측면으로 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정되는 리간드, 억제제 및 아고니스트에 관한 것이다. 바람직하게 상기 리간드, 억제제 및 아고니스트는 분리된 제재의 형태이다. 이것은 이들이 자연적으로 또는 보통 발생하는 다른 화합물로부터 적어도 어느 정도로 정제되었고 또는 분리되었다는 것을 나타낸다.

특히 바람직한 측면으로 본 발명은 야생형 VEGF의 돌연변이체이며 직접적으로 리셉터에 결합하거나 또는 몇몇 다른 방법으로 리셉터 단백질 NYK의 활성을 억제 또는 자극할 수 있는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 돌연변이체가 모델이 되는 야생형 VEGF는 어떤 기원의 VEGF일 것이다. 바람직하게 VEGF는 인간, 쥐, 소, 양, 돼지, 말 기니피그 등같은 포유동물 기원이다. 다른 VEGF 스플라이스 변이체가 돌연변이체에 대한 기초로서 사용될 수 있다. 예를 들어 쥐 VEGF는 120, 164, 188 및 206 아미노산처럼 여러 아미노산 길이로 존재한다(Brier et al., 1992). 인간 VEGF는 또한 121, 165, 189 및 206 아미노산처럼 여러 아미노산 길이로 존재한다. 더욱이 VEGF의 상동체가 폭스 바이러스 orf에서 발견되었다(Lyttle et al, 1994). 이런 상동체가 또한 돌연변이체에 대한 기초로서 사용될 수 있다. 돌연변이체는 재조합 DNA 기술, 직접적인 펩티드 합성 또는 어떤 다른 편리한 기술에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게 돌연변이체는 쥐 야생형 VEGF의 시스테인-매듭 모티프의 대응체에서 아미노산 결실, 치환 또는 삽입으로 구성된다. 이런 아미노산 치환 또는 삽입은 자연적 아미노산 또는 합성 원료로부터의 아미노산일 수 있다.

바람직하게 돌연변이체는 리셉터 단백질 NYK의 억제제이며 야생형 VEGF의 V3 도메인에 해당하는 부위에서 하나 이상의 아미노산 치환으로 구성된다. 더욱 바람직하게 폴리펩티드는 마우스 VEGF에 해당하는 하나 이상의 다음과 같은 위치:73, 111, 117 및 109 내지 115에서 돌연변이로 구성된다. 더욱 바람직하게 폴리펩티드는 여기에 기재된 돌연변이체 K73S, H111G, G117V 또는 VEFG0이거나 또는 상기 돌연변이체와 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 이것의 변이체이다. 이런 돌연변이체의 변이체는 표준 보존적 아미노산 치환에 의해 제조될 수 있다. 이런 변이체를 제조하는 방법은 본 분야에 숙련된 사람들에게 공지되어 있을 것이다.

선택적으로 바람직하게 돌연변이체는 리셉터 단백질 NYK의 아고니스트이며 야생형 VEGF의 V3 부위에 해당하는 부위에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 야생형 VEGF의 절단된 형태로 구성된다. 더욱 바람직하게 아고니스트는 동일한 위치 또는 주변에 아미노산 치환을 가지는 야생형 마우스 VEGF에 해당하는 잔기 133 또는 부근을 말단화하는 절단된 단백질로 구성된다. 더욱 바람직하게 아고니스트는 여기에 기술된 것처럼 K106^*2 또는 돌연변이체와 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 유지하는 이것의 변이체로 구성된다.

일곱 번째 측면으로 본 발명은 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제와 함께 상기 기재된 발명의 방법에 의해 동정되는 리간드, 억제제 또는 아고니스트로 구성되는 약학적 조성물을 제공한다. 적당한 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제는 본 분야에 숙련된 사람들에게 공지되어 있을 것이다. 비슷하게 약학적 조성물 제조방법은 본 분야에 숙련된 사람들에게 공지되어 있을 것이다. 이런 조성물은 Remington Pharmaceutical Scienes, 17th Edition, Elsevier Publishing Co, Eton, Pennsylvania, USA 같은 표준 교재를 참고로 하여 제조될 수 있다.

여덟 번째 측면으로 본 발명은 리간드, NYK의 억제제 또는 아고니스트, NYK 유도체 또는 이것의 NYK 기능적 대응체인 단백질을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

핵산분자는 DNA 또는 RNA, 단일 또는 이중가닥, 선형 또는 공유결합으로 폐쇄된 환형일 수 있다. 이것은 자연적 또는 합성적 누클레오티드 염기로 구성될 수 있다. 본 분야에 숙련된 사람들은 유전 암호에서의 퇴화 때문에 몇몇 다른 코돈이 동일한 아미노산을 암호화하는데에 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

특히 바람직한 측면으로 본 발명은 직접적으로 리셉터를 결합시킴으로서 또는 몇몇 다른 방법에 의해서 리셉터 단백질 NYK의 활성을 억제 또는 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 바람직하게 암호화되는 폴리펩티드는 상기 기재된 것처럼 야생형 VEGF의 돌연변이체이다. 더욱 바람직하게 상기 핵산분자는 야생형 VEGF의 시스테인-매듭 모티프의 대응체에서 아미노산 결실, 치환 또는 삽입으로 구성되는 누클레오티드 서열로 구성된다.

바람직하게 상기 핵산은 리셉터 단백질 NYK의 억제자인 돌연변이체를 암호화하며 야생형 VEGF의 V3 도메인에 해당하는 부위에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열로 구성된다. 더욱 바람직하게 핵산 분자는 마우스 VEGF에 해당하는 하나 이상의 다음과 같은 위치:73, 111, 117 및 109 내지 115에서 돌연변이체를 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 더더욱 바람직하게 핵산분자는 K73S, H111G, G117V 또는 VEGF0 또는 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 이것의 변이체를 암호화한다.

선택적으로 바람직하게 핵산분자는 야생형 VEGF의 V3 부위에 해당하는 부위에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 야생형 VEGF의 절단된 형태인 리셉터 단백질 NYK의 아고니스트를 암호화한다. 더욱 바람직하게 핵산 분자는 동일한 위치 또는 주변에 아미노산 치환을 가지는 야생형 마우스 VEGF에 해당하는 잔기 133 또는 주변을 말단화하는 절단된 단백질을 암호화한다. 더더욱 바람직하게 핵산분자는 여기에 기술된 것처럼 K106^*2를 암호화하거나 또는 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하는 이것의 변이체를 암호화한다.

본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 측면에 대한 하나의 특히 빠르고 편리한 테스트 시스템은 BIAcore^TM(파마샤 바이오센서 AB, 웁살라, 스웨덴)같은 광학 바이오센서를 사용하는데, 이것은 센서칩에 고정되는 단백질 또는 펩티드의 사용을 가능하게 한다. 바이오센서 분석은 매우 간단하고 재사용이 가능하고 빠르지만 높은 특이성을 가지고 있다. 바이오센서 분석은 샘플의 매우 높은 산출량을 가능하게 하며 자동조작으로 조작할 수 있다. 따라서 NYK 단백질에 결합을 억제하는 능력 또는 VEGF의 아고니스트로서 활성에 대한 자연적 생성물의 검색에 적당하다. 그러나 넓은 다양한 구조의 시험 화합물이 이 방법을 사용하여 시험될 수 있음이 예상된다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 측면의 방법은 광학 바이오센서 칩에 NYK의 세포외 도메인을 고정시키는 단계와 고정된 NYK 단백질에 결합하는 리간드 화합물의 능력 또는 공지된 리간드의 결합을 억제하는 추정되는 억제제의 능력을 측정함으로써 결합을 검출하는 단계로 이루어진다.

선택적인 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 측면의 방법은 시토킨 리셉터와 함께 융합 단백질로서 NYK 세포외 도메인을 발현하는 세포를 NYK 세포외 도메인에 결합할 수 있는 리간드에 노출시키는 단계와 결합이 일어나는지 결정하는 단계로 이루어지는 생물학적 분석을 사용한다.

아홉 번째 측면에 따라서, 본 발명은 다음과 같은 단계:

a) 리셉터의 세포외와 예상되는 막투과 도메인의 결합부에서 제한부위를 가지는 단백질을 암호화하는 핵산을 생성하는 단계, 여기에서 제한 부위는 단계 B에서 제조되는 구조체에 특별한 것으로 선택되고,

b) 마커 펩티드와 프레임내 종결 코돈을 암호하며, 선택적으로 핵산의 3' 말단에 더욱 특징적인 제한부위를 가지는 a) 올리고누클레오티드 서열에 제조된 핵산을 연결시키는 단계,

c) 배양중의 포유동물 숙주 세포에 b)에서 제조된 구조체를 발현시키는 단계,

d) 마커 펩티드에 특이한 친화성 시약을 사용하여 상기 단백질을 분리시키는 단계, 및 선택적으로,

e) 추가된 정제 단계로 단백질을 종속시키는 단계로 이루어지는,

리셉터 단백질 티로신 키나아제의 세포외 도메인의 생물학적 활성을 가지는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

바람직하게 단계 d)는 정확한 구조체와 숙주 시스템에 따라 단백질의 정제를 얻는 다른 방법이 있겠지만 숙주세포로 콘디션된 배양배지를 정제에 종속시키는 것으로 구성된다.

바람직하게 마커 펩티드는 FLAG^TM이다; 그러나, 다른 작은 마커 펩티드가 본 분야에 공지되어 있다.

바람직하게 숙주 세포는 차이니스 헴스터 난(CHO) 세포이지만, 다양한 다른 편리한 숙주 세포가 또한 본 분야에 공지되어 있다. 바람직하게 친화성 정제 단계가 친화성 크로마토그래피, 더욱 바람직하게는 항- FLAG^TM친화성 겔 및 프리 FLAG^TM펩티드로 느린 용출을 사용하여 수행된다.

도메인의 결합부에서 제한 부위는 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하거나 또는 PCR 반응을 거쳐 도입될 수 있으며; 제한부위의 상태는 리셉터 cDNA의 특이서열에 달려 있지만, 편리하게 BglⅡ 또는 BamHⅠ 같은 제한효소에 대한 부위이다. 재조합 단백질의 선택에서 편리함을 위해, ClaⅠ 같은 특별한 제한부위가 마커 단백질을 암호화하는 올리고누클레오티드 3' 말단으로 삽입될 수 있다.

열 번째 측면에 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 제조되는 리셉터 단백질 티로신 키나아제의 세포외 도메인(세포외 PTK 도메인)을 제공한다. 바람직하게 리셉터 단백질 티로신 키나아제는 신경상피 티로신 키나아제(NYK), tie2, 및 RYK로 구성되는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게 리셉터 단백질 티로신 키나아제는 신경상피 티로신 키나아제이다.

열한번째 측면에 따라서 본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 의해 생성되는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

열두번째 측면에 따라서, 본 발명은 세포외 PTK 도메인에 대해 지시되는 단일클론 항체를 제공한다. 단일클론 항체 제조방법은 본 분야에서 일상적이다. 이런 단일클론 항체는 면역진단, 면역치료, 면역조직화학 및 면역학적 분석에 유용하다.

약학적으로 허용가능한 운반체와 함께 본 발명의 세포외 PTK 도메인 또는 이것의 단일클론 항체로 구성되는 조성물이 또한 본 발명의 범위내에 있다.

본 발명의 아홉번째 내지 열두번째 측면에서 PTK는 바람직하게 NYK, tie2, 및 RYK로 구성되는 군으로부터 선택되며, NYK가 가장 바람직하다.

여기에 사용되는 약어는 다음과 같다:

flk-1태아 간 키나아제-1

MAb단일클론 항체

MSK메티오닌 설폭사이드

NYK신경상피 티로신 키나아제

PCR중합효소 사슬 반응

RTK리셉터 티로신 키나아제

RYK티로신 키나아제에 관련된

tie2Ig-유사 도메인과 EGF 반복을 가지는 티로신 키나아제

VEGF혈관 내피 성장 인자

VEGFR2혈관 내피 성장 인자 리셉터 2.

본 발명은 이제 다음의 실시예와 도면만을 참고로 하여 자세히 설명될 것이다.

[실시예 1]

결합 시험

NYK-EX- FLAG^TM융합 단백질을 공지된 리간드인 혈관 상피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 능력에 대해 조사하였다(Millauer et al, 1993).

결합 연구는 CH5 센서칩(파마샤)에 고정된 단백질을 사용하여 광학 바이오센서(BIAcore^TM, 파마샤 바이오센서 AB, 웁살라, 스웨덴)상에서 수행하였다. NYK-EX- FLAG^TM의 고정은 이미 기재된 것처럼 표준 NSH/EDC 화학을 사용하여 수행하였다(Nice et al, 1994). NYK-EX- FLAG^TM의 약 15ng/mm²(15,000 RU)를 BIAcore^TM분석에 의해 결정되는 것처럼 바이오센서 칩에 결합하였다. 고정된 단백질의 완전성을 VEGF-pCDM8 감염된 CHO 세포, tie2-EX- FLAG^TM감염된 CHO 세포 및 완충액 단독으로 콘디션된 배지에 대한 BIAcore^TM반응을 비교하여 조사하였다. 각각 사이클 사이에서, 유도화된 센서 표면은 50mM 디에틸아미드, pH 12.0, 0.1% Triton X-100으로 재생하였다. 대조구 실험에서 이런 처리는 VEGF에 대한 고정된 리셉터의 결합 수용능에 효과를 가지고 있지 않음이 확립되었다.

도 1에 나타낸 센서그램은 NYK-EX- FLAG^TM으로 유도화된 센서칩을 A에서 D를 비교하면 CHO 세포 상층액을 함유하는 VEGF의 주입상으로 146 RU의 상대적 반응을 일으킴을 나타낸다. 대조구 CHO 세포 상층액으로부터의 신호를 다른 PTK 단백질을 발현하는 세포로부터의 신호와 비교함으로써, tie2-EX- FLAG^TM(대조구 1) 또는 완충액 단독(대조구 2)은 20 RU 이하였다. NYK-EX- FLAG^TM(t=100-520s, B-C)에 대한 VEGF 결합의 센서그램은 또한 특이 리간드의 결합과 일치한다. 이것을 이 기간상에서 증가를 보이지 않는 대조구 1과 2에서 보여지는 센서그램과 대조된다. 자연적 NYK와 tie2를 인지하는 단일클론 항체(1995년 2월 9일 출원된, 국제특허출원번호 PCT/US 95/01743에 기재됨)의 페널은 또한 바이오센서칩으로 각각 유도화된 NYK-EX- FLAG^TM과 tie2-EX- FLAG^TM에 대해 특이 반응을 얻었다.

표 1은 센서칩상에 고정된 NYK-EX- FLAG^TM에 각각 3B6, 3C8 및 4H3(1995년 2월 9일 출원된 국제출원 PCT/US 95/01727에 기재됨)로 나타낸 3개의 다른 단일클론 항체의 결합 결과를 제시한다. 10-20μg/ml 농도로 단일클론 항체를 함유한 콘디션된 배지를 센서칩에 이용하였고 그 상대적인 반응을 완충액 단독을 사용하여 제시된 것과 비교하였다. 센서칩은 이용 사이에 높은 pH 세척으로 재사용하였다.

[표 1]

센서칩에 고정된 NYK-EX- FLAG^TM에 항-NYK 단일클론 항체의 결합

각각 1e11, 3g1 및 4g8로 나타내는 tie2-EX-FLAG^TM으로 향하는 세 개의 다른 단일클론 항체를 센서칩상에 고정된 tie2-EX-FLAG^TM에 결합하는 능력에 대해 조사하였다.

항체 결합에서 tie2-EX-FLAG^TM의 변성 효과를 연구하기 위해서, tie2-EX-FLAG^TM을 BIAcore^TM상에서 동일한 농도에서 각각 세 개의 정제된 항체에 대한 반응이 왼쪽에 제시되어 있다. 결합된 항체는 높은 pH 세척으로 세척함으로써 제거하였고, 반응 유닛에서 담그기에 의해 제시되는 것처럼 항체 결합을 하였다. tie2-EX-FLAG^TM은 그후 구아니듐 히드로클로라이드와 2-머캡토에탄올을 사용하여 변성시킨 후 항체의 능력은 도 9의 오른쪽 칼럼에 제시된 것처럼 다시 조사하였다. 1e11 항체는 반응 유닛에서 증가를 나타나지 않음으로써 보여지는 것처럼 더 이상 tie2-EX-FLAG^TM의 변성후에 결합하지 않는다; 꼭대기 오른쪽 결과를 참조. 다른 두 개의 항체, 3g1과 4g8은 비록 tie2-EX-FLAG^TM의 형태가 변형되었지만, 이것은 여전히 칩에 부착된 채로 유지됨을 나타내는, 낮은 수치이기는 하나 tie2-EX-FLAG^TM의 변성후에 여전히 결합을 나타낸다.

C-말단에 FLAG^TM펩티드의 위치는 리셉터에 BIAcore^TM상에서의 실험 또는 MAb 제조에 역효과를 나타내지 않았다. 정제된 NYK-EX-FLAG^TM은 특별히 리간드 VEGF에 결합하였다. 또한, 알카리성 포스파타제-융합단백질로 하는 우리의 관찰과는 반대로 배지를 함유한 혈청으로부터 결합은 나타나지 않았다. 알칼리성 포스파타제 또는 면역글로불린의 Fc 부위같은 다른 마커와 비교하여 단백질 상호작용에서 FLAG^TM펩티드의 외관상 불활성은 이것이 거짓 양성반응을 피하기 때문에 이런 시스템을 바이오센서-기초한 이용에서 이상적으로 만든다.

[실시예 2]

혈청에서 VEGF의 검출

마우스는 피하로 1×10⁶C6 교세포종 세포 또는 1×10⁶U937 세포로 면역화하였고 종양이 대략 0.5-1.0cm³로 발달되도록 하였다. 이 지점에서 혈액 샘플을 동물로부터 채취하였고 후속적으로 혈청을 수집하였다. 혈청은 NYK-FLAG 유도화된 칩에 결합에 대해 분석하였고 존재하는 VEGF의 양은 재조합 인간 VEGF(Preprogen)을 사용하여 발생된 표준 곡선과 비교하여 계산하였다. 결과가 아래의 표 2에 제시되어 있다.

[표 2]

종양 생성 쥐의 혈청에서 VEGF의 검출

[실시예 3]

재조합 VEGF의 검출

재조합 VEGF(5μl)를 20mM 아세트산나트륨 pH 4.5/0.02% Tween 20에 재현탁한 후 표준 BIAcore 칩상에 고정하였다. 콘디션된 배지를 칩상으로 흘려보냈고 결합된 물질은 10mM HCl로 씻어냈다. 이 결과가 아래의 표 3에 제시되어 있다.

[표 3]

바이오센서 칩에 결합된 재조합 VEGF에 NYK 세포외 도메인 구조체의 결합

[실시예 4]

고정된 NYK-EX-FLAG에 결합하는 단일클론 항체 4H3와 3B6의 검출

VEGFR2의 세포외 도메인으로 향하는 단일클론 항체는 BIAcore상에 고정된 NYK-EX-FLAG를 검출하기 위해서 사용하였다. 항체(10μl/ml)를 칩에 이용하였고 상대적 반응을 결정하였다. 그 결과가 아래의 표 4에 제시되어 있다.

[표 4]

고정된 NYK-EX-FLAG에 항-VEGFR2 단일클론 항체의 결합

[실시예 5]

NYK-에리트로포이어틴 리셉터 융합 단백질을 사용한 NYK의 생물학적 분석

Pacifici와 Thomoson(1994)에 의한 최근의 연구는 FDCP-1과 BA/F3 같은 인자-의존적 세포주로 감염시켰을 때 대부분의 RTK는 리간드에 대해 중요한 증식반응을 생성하지 않음을 제시했다. 그러나, 만약 RTK의 세포외 도메인과 에리트로포이어틴 리셉터(EpoR)에 대하 시토킨 리셉터의 막투과 및 세포질 도메인으로 이루어진 키메라 분자를 사용한다면, 달성되는 증식의 수치는 야생형 리셉터에 의해 제공되는 것과 비슷했다. 이것은 리셉터 세포질 도메인의 총합이 발생되는 몇몇 증식 반응에 충분하다는 것을 내포한다. 이 기작이 도 2에 제시되어 있다.

부위 특이적 돌연변이를 사용한 EpoR 세포질 도메인에서 잠재적 돌연변이는 마우스 Epo 리셉터로 발표된 누클레오티드 서열(D'Andrea et al, 1989)의 866위치에서 BalⅡ 제한효소 부위를 제거하는 영향을 나타냈다. 그후 다른 BalⅡ 부위를 후속적으로 EpoR의 세포외 도메인과 추정되는 막투과 도메인의 결합으로 도입하였다. Epo 리셉터의 세포질 및 막투과 도메인은 그후 실시예 7에서 9에 기술된 BglⅡ 부위를 거쳐 NYK 리셉터의 세포외 도메인의 프레임내로 연결하였다. 삽입체는 그후 XbaⅠ을 거쳐 pBOS 발현 벡터로 서브클론하였다. 이 구조체를 pBOS-NYK/Epo로 명시하였다.

pBOS-NYK/Epo는 그후 네오마이신 저항 플라스미드를 가지는 인자-의존적 프리-B 세포주 BA/F3로 공감염시켰다. BA/F3 세포주는 성장을 위해 IL-3/GM-CSF의 존재에 의존적이며; 이런 인자의 제거는 24-48시간안에 빠를 세포 사멸의 결과를 일으킨다. 세포는 DMEM, 10% HI FCS, 50μg/ml 젠타마이신, 20μg/ml L-글루타민, 1.2mg/ml G418 성장배지에서 선발하였다. 7-14일후에 성장한 개개의 클론을 가려내어 액체 배지에서 확장하였다.

NYK/Epo 발현 콜로니는 다음과 같은 두가지 방법으로 선발하였다:

(ⅰ) 항-NYK MAb과³⁵S-Met/Cys-표지된 리셉터의 면역침전(1995년 2월 9일 출원된 계류중인 국제특허 출원번호 PCT/US 95/01743에 기재된 것처럼 제조됨)과 SDS-PAGE 분석;

(ⅱ) VEGF로 세포주의 자극

1000 NYK/EpO-BA/F3 세포 또는 비-발현 대조구 BA/F3 세포를 pCDM8-VEGF165로 감염된 COS 세포의 성장으로 콘디션된 10% 배지를 함유한 성장배지 15μl 부피에 재현탁했다. 세포의 자극은 대조구 집단과 비교하였을 때 2-14일 간격상으로 판단하였다.

세 개의 세포주는 표 5에 요약해 놓은 것처럼 VEGF에 대한 반응과 NYK-Epo 키메라를 발현시키는 반응에 대해서 나타냈고 유동 세포측정법으로 나타냈다(도 3). BA/F3 세포의 표면상에서 VEGFR2-EpoR 발현의 유동 세포측정 분석은 다음과 같이 수행하였다.

NYK-EpoR 구조체(BA/F3-NYK-EpoR#18)로 감염된 BA/F3 세포(5×10⁵) 또는 벡터(115)만으로 감염된 세포를 NYK 리셉터(PCT/US 95/01727에 기재된 4H3)의 세포외 도메인에 대한 단일클론 항체 또는 tie2 리셉터(PCT/US 95/01743)를 향하는 대조구 항체와 반응시켰다. 세척후에 세포는 염소 항-레트-FITC 항체와 배양하였고 후속적으로 세척한 후 세포는 FACScan^TM과 CellQuest^TM소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포측정으로 분석하였다. 그 결과가 도 3에 제시되어 있다. 선은 항체 4H3로 염색된 대조구 세포주 115(---)와 4HB(―) 또는 대조구 항체 4g8(…)로 염색된 BA/F3-NYK-EpoR 세포주이다.

이런 세포주는 또한 특히 NYK 리셉터의 세포의 도메인을 향하는 10-20μg/ml의 MAb과 배양하므로써 성장이 자극됨을 보여주었다. 이것은 세포 표면에서 리셉터의 교차결합의 결과이며, 이것은 리셉터의 리간드-유도된 다이머화를 모방한다.

이 분석은 따라서 특히 NYK 세포외 도메인과 이것의 리간드 VEGF의 상호작용을 검출하며 이런 상호작용을 조절하는 물질의 검출 및 평가 또는 이런 조절 물질의 억제자의 검출 및 평가에 대해 유용하다.

[표 5]

NYK-EpoR 감염된 BA/F3 세포의 자극

감염된 또는 감염되지 않은 BA/F3 세포는 WEHI3D 콘디션된 배지로부터 제거하였고 PBS로 3에서 4번 세척하였으며 5μg/ml의 VEGF165를 함유한 배지에 재현탁했다. 생장은 배양의 시각 검사로 VEGF에서 2 내지 4일 사이에 결정하였다.

[실시예 6]

돌연변이 VEGF의 검출

돌연변이체를 pCDNA-1 Amp 발현벡터에서 발생시켰다. 이것은 이미 기재된 기술로 올리고누클레오티드 직접적 돌연변이유발을 사용하여 발생시켰다. 돌연변이는 야생형 VEGF에서 단일 또는 다수 아미노산 치환으로 나타났다. 이런 돌연변이체를 위한 기초로서 사용되는 야생형 VEGF의 아미노산 서열은 야생형이 73위치에서 리신(K)을 가지는 것을 제외하고 도 4에 제시된 K73S의 서열과 동일하다. 야생형 리더 서열은 또한 도 4에 제시된 돌연변이체에서도 포함되었다. 돌연변이는 서열분석으로 증명하였다. 돌연변이체의 서열은 표 6에 제시되어 있다.

[표 6]

생성된 돌연변이체의 서열:밑줄은 돌연변이체에서 일어나는 아미노산 치환을 나타낸다.

구조체는 DEAE-덱스트란 방법으로 COS 세포로 감염시켰고 콘디션된 배지는 7일동안 후감염을 위해 수집하였다. 콘디션된 배지는 리셉터를 발현시키지 않는 BA/F3-NYK-EpoR 또는 BA/F3 세포의 존재하에서 이미 기재된 것처럼 생물학적 분석 완충액으로 10%까지 희석하였다. 48-72시간후에 분석은 증식의 양에 대해 평가하였고 0-비생존세포, 1=25% 이하의 웰을 덮음, 2=25-50% 웰을 덮음, 3=50-75% 웰을 덮음 및 4는 75% 이상의 웰을 덮음으로 기록하였다. VEGF 돌연변이체의 발현 수치는 VEGF에 대한 항혈청을 가진³⁵S-Met/Cys 표지된 COS 세포 콘디션된 배지의 면역침전 및 SDS-PAGE 분석으로 평가하였다. 그 결과가 표 7에 제시되어 있다.

[표 7]

VEGF 야생형 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 발생된 돌연변이형을 함유한 pCDM8 또는 pCDNA1-Amp로 감염된 COS 세포로부터 콘디션된 배지로 자극에 대한 NYK-EpoR 감염된 BA/F3 세포의 반응

상기 돌연변이체는 적당한 대조구와 함께 마일즈(Miles) 분석으로 혈관 투과성을 유도 또는 억제하는 능력에 대해 조사하였다. 이 분석은 푸른 염료를 동물에게 투여하여 동물의 혈관에 분포하게 한 다음 돌연변이체를 가지는 동물에게 피내로 주입하여 혈관 투과성에서의 효과를 관찰하는 것을 포함한다.

다음의 실시예는 상기 분석에서 사용하기 위한 재조합 리셉터의 제조와 관련된다.

시약

FLAG^TM옥타펩티드(목록번호 IB13025), M2-겔(IB13021) 및 프리 FLAG^TM펩티드(IB13070)에서 내부적 에피토프를 인지하는 정제된 M2 단일클론 항체는 International Biotechnologies, New Haven, CT로부터 얻었다.

VEGF(165 아미노산 형태)를 암호하는 cDNA 클론은 역전사되는 마우스 클론 mRNA로부터 PCR로 분리하였다. VEGF cDNA는 서열분석을 하였고 공지된 서열(Breier et al, 1992)과 동일함이 발견되었다. VEGF를 암호화하는 절편은 PEE6 벡터로 서브클론하였고 아래 기재된 것처럼 CHO 세포로 감염시켰다. 안정하게 감염된 CHO 세포로부터 상층액을 수집하였고 NYK-EX-FLAG^TM결합 연구를 위해 사용하였다(아래 참조). 이런 방법으로 생성된 VEGF의 생물학적 활성은 마일즈 혈관 투과성 분석(Miles and Miles, 1952)으로 평가하였고 VEGF가 기능적임이 발견되었다.

올리고누클레오티드

모든 올리고누클레오티드는 루드위그 인스티튜드 퍼 캔서 리서치와 더 월터 및 엘리자 홀 인스티튜트의 조인트 단백질 구조 레보레이토리에서 합성하였다. FLAG^TM링커 올리고누클레오티드는 BaglⅡ 점착성 말단에 해당하는 4개의 염기 돌출부(도 5)를 가지며, 35 누클레오티드에 상보적인 두 개의 39머로서 합성하였다. 올리고누클레오티드는 FLAG^TM옥타펩티드의 아미노산 서열, 프레임내 종결코돈 및 재조합체의 선발을 허락하는 ClaⅠ 제한효소 부위를 암호화한다. 올리고누클레오티드 링커는 이미 기재된 것처럼(Sambrook et al, 1989), 종래의 방법을 사용하여 폴리누클레오티드 키나아제로 인산화하였고 라이게이션전에 1시간동안 37℃에서 어니일링(annealing)하였다. BglⅡ 또는 BamHⅠ으로 도입되는 돌연변이유발 올리고누클레오티드(27-35머)는 소수성 플롯에 의해 확인되는 것처럼, 리셉터 세포외/막투과 보더에서 서열에 대해 만들어졌다.

[실시예 7]

부위-특이적 돌연변이유발 및 링커 서열의 라이게이션

NYK, tie2 및 RYK의 세포외 도메인을 분리하기 위해 발달된 단계를 도 6에 요약하였다. 부위 특이적 돌연변이유발은 프레임내 위치하는 올리고누클레오티드의 세트로 암호되는 FLAG^TM서열을 가능하게 하는 cDNA의 돌연변이 형태를 발생시켜 적당한 세포외 도메인-FLAG^TM융합 단백질을 생성하기 위해 사용하였다. 초기에, 부위-특이적 돌연변이유발은 돌연변이유발 올리고누클레오티드를 사용하여 세포외 및 막투과 부위의 보더에서 BaglⅡ 또는 BamHⅠ을 도입하기 위해서 성장인자 리셉터의 단일가닥 DNA상에서 수행하였다. BglⅡ 효소부위는 NYK 및 RYK cDNA로 도입하였고 BamHⅠ부위는 존재하는 BglⅡ 부위 때문에 tie2 cDNA로 도입하였다.

마우스 NYK/FLK-1/VEGFR2 리셉터, 마우스 tie2 리셉터 및 인간 RYK 리셉터를 암호하는 충분한 길이의 cDNA를 BstⅩⅠ 제한효소 부위와 BstⅩⅠ 링커를 사용하여 포유동물 발현벡터 pCDM8(인비트로겐)로 서브클론하였다. 단일 가락 UTP- 함유 DNA(Kunkel, 1985)를 생성하였고, 요구되는 제한효소 부위를 암호하는 NYK, tie2 및 RYK cDNA의 돌연변이체를 만들기 위한 주형으로서 사용하였다. 이들의 세포외 도메인과 막투과 도메인 경계부에 BglⅡ 또는 BamHⅠ 부위를 함유한 돌연변이 리셉터 cDNA(DNA STAR^TM소프트웨어를 사용하여 소수성 플롯(kyte와 Dolittle, 1982)에 의해 결정되는 것처럼)는 적당한 제한효소로 자른 뒤, 포스파타제로 처리한 후 FLAG^TM마커펩티드(IBI);

^5'GATCTGACTACAAGGACGACGACGATGACAAGTGAATCGATA^3'

(N)Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Term(C)

를 암호하는 올리고누클레오티드 링커 서열로 라이게이션하였다.

특별한 ClaⅠ부위를 올리고누클레오티드의 3'말단에 장치하였고, 재조합체는 ClaⅠ 제한효소 분해로 선발하였다. 모든 클론은 다른 돌연변이가 도입되지 않았음과 FLAG^TM서열이 정확한 방향으로 있는지를 증명하기 위해서 서열결정을 하였다. FLAG^TM융합 단백질을 각각 NYK-EX-FLAG, tie2-EX-FLAG^TM및 RYK-EX-FLAG^TM으로 명명하였다.

조금 인산화된 FLAG^TM링커 올리고누클레오티드(39머)는 자른 벡터 절편으로 쉽게 라이게이션하였고 재조합체는 내부의 ClaⅠ 부위의 사용으로 정확히 검출하였다.

[실시예 8]

세포 배양

COS 세포는 37℃와 5% CO₂에서 10% FCS와 50μg/ml 젠타마이신을 가지고 있는 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. COS 세포는 이미 기재된 것(Aruffo and Seed, 1987)처럼 DEAE 덱스트란 방법으로 감염시켰다. pEE6-NYK-EX-FLAG^TM, pEE6-tie2-EX-FLAG^TM및 pEE6-RYK-EX-FLAG^TM구조체는 칼슘 포스페이트 침전에 의해 CHO-K1 세포로 감염시켰고 10% 태아소혈청, 50μg/ml 젠타마이신, 비-필수적 아미노산, 피루브산 나트륨 및 25mM 메티오닌 설폭사이드(MSX)가 공급된 글라스고우(Glasgow) 변형된 이글(Eagle) 배지(L-글루타민, NaHCO₃없음, Cytosystems, Castle Hill, N.S.W.)에서 선발하였다. 단백질의 대량생산은 2mM 부티르산나트륨의 존재하에서 롤러 용기에서 Cytodex-3 구슬(파마샤, 웁살라, 스웨덴)상에서 세포를 배양함으로써 성취되었다. 세포는 이들이 약 80-90% 합류점에 달할 때까지 생장시켰다. 콘디션된 배지는 신선한 배지로 치환시키면서 매주 수집하였다. 상층액을 접종후 16-20일후에 롤러 용기로부터 수집하였고 프로테아제 억제제의 혼합물을 첨가하였다:0.02% NaN₃, 1mM PMSF, 0.2TIU/ml 아프로티닌, 10μg/ml 펩스데틴 및 0.5mM EDTA. 상층액은 직접적으로 사용하거나 사용전에 -70℃에 저장하였다.

구조체와 대조구는 COS 세포로 감염시켰고 3일의 후감염후에 융합 단백질에 대해 분석하였다. 세포의 생합성적 표지, N2-겔로 면역침전 및 SDS-PAGE 분석이 도 7에 제시된 것처럼 기대되는 크기의 생성물을 나타냈다. NYK-EX-FLAG^TM(도 7a)에 대한 120-130KD 범위와 tie2-EX-FLAG^TM에 대한 100-110KD 범위에서 확산 밴드가 특히 M2-겔로 면역침전하였다. 성숙 세포 표면 리셉터(Runting et al, 1993; Stacker et al, 1993)의 면역침전으로부터 예견되는 것처럼 N-결합된 글리코실화의 기여를 포함하는 NYK-EX-FLAG^TM, tie2-EX-FLAG^TM및 RYK-EX-FLAG^TM에 대해 예상되는 크기는 각각 125,000달톤, 95,000달톤 및 38,000달톤이었다.

COS 세포에서 이런 초기의 연구는 (ⅰ) FLAG^TM펩티드가 리셉터 세포외 도메인의 C-말단에서 발현될 수 있으며, (ⅱ) FLAG^TM-융합 단백질이 세포에 의해 분비되며 (ⅲ) FLAG^TM-융합 단백질이 M2 항체에 의해 효과적으로 인지될 수 있다는 것을 보여주었다.

구조체는 그후 CHO 세포 발현 벡터 pEE6로 서브클로닝하였고 CHO 세포에 감염시켰다. 안정하게 감염된 CHO 세포의 상층액은 면역침전후 생합성적 표지로 융합 단백질의 발현에 대해 검색하였다. 예상되는 크기의 융합 단백질을 생성하는 클론을 선별하였고 대규모 생성의 분비된 단백질을 얻었다. 25mM MSX에서 감염된 CHO 세포의 발현 수치가 충분했기 때문에 더 많은 양의 MSX에서 선별을 시도하지 않았다. CHO 세포는 롤러 용기에서 Cytodes-3 구슬상에서 생장시켰고 소비되는 조직배양 상층액 ml당 1μg의 융합 단백질 범위로 생성되었다.

[실시예 9]

융합 단백질의 정제

NYK-EX-FLAG^TM, tie2-EX-FLAG^TM및 RYK-EX-FLAG^TM은 M2(항-FLAG^TM) 겔(IBI)상에서 친화성 크로마토그래피를 사용하여 감염된 CHO 세포로 콘디션된 배지로부터 정제하였다. 분리된 칼럼은 각 리셉터 구조체를 위해 사용하였다. 상층액(100-200ml)을 M2-겔의 1-2ml 칼럼상으로 통과시킨후 후속적으로 10mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 0.02% Tween 20의 10부피; 50mM 트리에틸아민(TEA) pH 10.0, 150mM NaCl, 0.02% Tween 20의 10부피 및 다시 10mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl 0.02% Tween 20의 10부피로 세척하였다. 이 단계는 요구되는 수율 및 단백질의 순도에 따라 필요하지 않을 수도 있다. 결합된 물질은 100mM 글리신-HCl pH 3.0, 0.02% Tween(1/10부피의 1M Tris-HCl pH 8.6으로 중화됨) 또는 10mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 0.02% Tween 20에서 25-50μg/ml FLAG^TM펩티드(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)로 용출하였다. 칼럼은 1ml 분획으로 용출하였고 환원된 SDS-PAGE 샘플 완충액 10μl와 조합된 10μl 샘플은 SDS-PAGE로 분석하였고 단백질은 은 염색으로 검출하였다. 프리 펩티드를 씻어버린 뒤 친화성 수지는 다음 정제 사이클전에 결합된 펩티드를 제거하기 위해서 0.1M 글리신 pH 3.0으로 처리하였다. 센서칩이 결합과 프리 FLAG^TM펩티드의 소모동안, 융합 단백질은 μMonoQ PC 1.615 음이온 교환 칼럼(파마샤)상에서 Tris-프리 완충 시스템(Nice et al, 1994)에서 고성능 액체 크로마토그래피로 더욱 정제하여 NYK-EX-FLAG^TM, tie2-EX-FLAG^TM또는 RYK-EX-FLAG^TM에 해당하는 단일 균질한 종류를 얻었다.

감염된 CHO 세포로 콘디션된 배지로부터 융합 단백질의 정제를 위해 발달된 방법은 M2-항체 칼럼(CHO 세포 상층액 100ml당 2ml의 포장된 구슬)상에서 단일 면역 친화성 크로마토그래피 단계를 포함했다. 단백질은 과량의 프리 FLAG^TM펩티드로 칼럼으로부터 용출하였고 더욱 균질한 정제는 마이크로보어 음이온 교환 HPLC로 행하였다. 이것은 또한 과량의 프리 FLAG^TM펩티드의 제거를 가능하게 했다. 비-특이 단백질의 제거는 각각 pH 8과 pH 10의 완충액을 포함하는 두단계 세척 방법으로 성취하였다. 이런 과정이 도 8에 예시화되어 있으며 정제된 분획의 SDS-PAGE 분석으로 판단되는 것처럼 많은 대부분의 오염물질을 제거하는데에 충분하게 나타냈다. NYK-EX-FLAG^TM과 tie2-EX-FLAG^TM의 정제는 각각 120-130KD과 100-110KD 크기 범위의 주요 밴드를 얻었다(도 8a와 8b). RYK-EX-FLAG^TM의 정제 및 분석은 35-40KD로 예상되는 종류 이외에 다른 더 큰 분자량 단백질의 범위를 얻었다(도 8c). 이들은 모든 RYK-EX-FLAG^TM정제에서 변함없이 나타나며 융합 단백질의 올리고머화된 형태로 제시될 수 있다. 25-50g/ml의 FLAG^TM펩티드와의 경쟁은 0.1M 글리신-HCl pH 3.0으로 칼럼의 추가 용출은 어떤 융합 단백질도 거의 얻을 수 없었기 때문에 결합된 세포외 도메인-FLAG^TM을 제거하기에 충분했다(도 8a-c). 흥미롭게도, 낮은 pH로 용출은 FLAG^TM펩티드만을 가지고 하는 용출보다 샘플에서 더욱 오염되는 단백질을 얻었다. 도 8b(레인 6-9)는 펩티드 용출된 물질에서는 나타나지 않았던 낮은-pH 용출액에서 오염물질의 범위를 나타낸다. 우리는 FLAG^TM펩티드는 FLAG^TM-M2 상호작용만을 용출하는 능력에서 비교적 특이적이라는 것과 대부분의 다른 비-특이적 상호작용을 해리시키지 않음을 결론지었다. 우리는 pH 3.0의 처리후에 칼럼으로부터 용출되는 소량의 고분자량 물질, 추측컨대 면역글로불린을 검출하였다; 이것은 pH 8.0에서 펩티드로 용출되지 않았다. μmonoQ 칼럼상에서 M2-친화성 용출액의 분획은 효과적으로 프리 FLAG^TM펩티드를 제거하였고, 이것은 나중의 사용을 위해 재사이클될 수 있었다. 우리의 CHO 세포 콘디션된 배지로부터 HPLC 정제된 세포외 도메인의 전체 수율은 100ml당 80μg의 단백질의 순서로 계산되었다.

M2 친화성 칼럼으로부터 용출되는 물질이 자연적 형태인지를 증명하기 위하여, NYK-EX-FLAG^TM융합 단백질을 실시예 1에 기재된 것처럼 공지된 리간드, 혈관 내피 생장인자(VEGF)(Millauer et al, 1993)에 결합하는 능력에 대해 조사하였다.

본 연구에서 우리는 부위-특이적 돌연변이유발, FLAG^TM펩티드 시스템 및 CHO 세포 발현의 조합을 사용하여 리셉터 티로신 키나아제의 기능적 세포외 도메인을 분리하는 방법을 기재하였다. 이런 방법을 발달시키기 위한 우리의 필요는 세 개의 최근에 분리된 cDNA 클론에 의해 암호되는 단백질을 특징화하기 위한 시약의 완전한 결핍에 의해 처음으로 촉진되었다. 우리의 방법의 이점은 이것이 지명된 리셉터의 세포외와 예상되는 막투과 도메인의 결합부에서 FLAG^TM서열의 정확한 위치를 허락한다는 것이다. BglⅡ/BamHⅠ 제한효소 부위는 서로 이들의 적합성과 연구되고 있는 cDNA 클론에서 이들중 적어도 하나가 존재하지 않기 때문에 FLAG^TM서열을 도입하기 위해서 사용하였다. 더욱이 이 방법은 일반적인 어댑터 부위를 제공하기 때문에 리셉터 세포외 도메인은 흥미있는 다른 단백질에 결합될 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인은 분비되는 알카리성 포스파타제 또는 프레임내 적합한 제한 효소 부위가 통합되어 있는 어떤 다른 단백질 도메인을 가지는 융합 단백질의 발현을 위해 벡터 AP-tag-1(Flanagan and Leder, 1990)으로 라이게이션될 수 있다. 예를 들어, NYK 단백질의 세포외 도메인이 에리트로포이어틴 리셉터의 세포질 및 막투과 도메인에 결합되어 있는 융합 단백질은 동시에-출원된 출원서에 기재되어 있다.

pCDM8 벡터는 이것이 CHO 세포에서 일시적 발현 뿐만 아니라 부위-특이적 돌연변이유발에 대한 단일가닥 DNA를 생성하는데 사용될 수 있기 때문에, 우리 기술의 기본 벡터로서 사용하였다. 이것은 대규모 생성을 진행하기 전에 융합 단백질의 발현을 위한 구조체의 빠른 검사를 허락한다. 최종 구조체를 CHO 세포 발현 벡터 pEE6으로의 서브클로닝은 pCDM8과 pEE6 폴리링커에 존재하는 적합한 XbaⅠ 부위 때문에 또한 간단하다. 우리는 세포외와 막투과 도메인의 결합부에 필요한 제한효소 부위를 도입하기 위해서 부위-특이적 돌연변이유발을 사용했다. 이 기술은 특히 큰 절편을 생성하기를 시도할 때 또는 RTK(Kozak, 191)를 암호하는 cDNA의 5'부위에서 종종 일어나는 것처럼, 올리고누클레오티드 프라이머가 GC-풍부한 부위를 소유하는 서열로부터 유래될 때, PCR상에서 몇몇 이점을 가지고 있다. 선택적으로, PCR은 BalⅡ/BamHⅠ 부위를 암호하는 더 작은 절편을 생성하기 위해 사용될 수 있으며 그후 적당한 제한효소부위를 거쳐 세포외 도메인으로 라이게이션될 수 있다.

본 시스템의 중요한 이점은 FLAG^TM시스템 성분의 산업상 이용가능성과 10% 태아 소혈청을 함유한 출발 물질로부터 한단계 과정으로 비교적 순수한 융합 단백질 제조를 얻는데에 있어서의 효율성이다. 프리 FLAG^TM펩티드로 용출하는 능력은 또한 극도의 pH 또는 카오트로픽제에 대한 노출의 요구를 피함으로서 순수한 리셉터 세포외 도메인을 얻는 가능성을 최대화하는 중요한 이점이 있다. 우리는 이런 MAb이 인지를 위해 프리 FLAG^TMN-말단을 요구하기 때문에 느린 용출을 위해 M1 MAb의 2가 양이온-의존 상태를 사용할 수 없다; 따라서 M2 항체를 사용하였다. 느린 용출은 리간드 결합 부위의 완전성이 쉽게 측정될 수 없기 때문에 특징화되지 않은 리간드를 소유하는 리셉터를 다룰 때 중요하다.

C-말단에 FLAG^TM펩티드의 위치는 BIAcore^TM상에서 실험 또는 리셉터에 대한 MAb 제조에 역효과를 나타내지 않았다. 정제된 NYK-EX-FLAG^TM은 특히 리간드 VEGF에 결합했다. 또한, 알카리성 포스파타제-융합 단백질을 가지고 한 우리의 관찰과는 반대로, 배지를 함유한 혈청으로부터 결합은 나타나지 않았다. 알카리성 포스파타제 또는 면역글로불린의 Fc 부분 같은 다른 마커와 비교할 때, 단백질 상호작용에서 FLAG^TM펩티드의 외관상 불활성은 이것이 거짓 양성반응을 피하기 때문에, 이 시스템이 바이오센서-기초로 한 이용에 있어 이상적으로 만든다.

우리의 방법은 포유동물 발현 시스템을 사용하여 정제된, 기능적인 리셉터 세포외 도메인-FLAG^TM융합 단백질의 분리를 허락한다. 이런 시스템의 사용은 글리코실화와 단백질 접힘이 자연적 상태와 매우 비슷하다는 것을 뜻한다. 잘-특징화된 마커 펩티드의 결합은 시약이 융합 단백질의 정량을 담당하는 친화성 정제에 사용할 수 있음을 뜻하며, 이것은 더욱 연구를 용이하게 할 것이다. FLAG^TM펩티드의 크기와 C-말단 위치는 연구되고 있는 단백질상에 효과를 최소화함을 나타낸다. 다른 연구자는 비록 리셉터의 기능을 조사하는 연구가 수행되지 않았을 지라도 막에서 도폴로지를 나타내기 위해서 포유동물세포(COS-7)에서 FLAG^TM(N-말단)-인간 혈소판-활성화 리셉터 융합 단백질을 성공적으로 발현시켰다(Gerard and Gerard, 1990). 이것이 포유동물 발현 시스템에서 C-말단 마커로서 FLAG^TM펩티드의 첫 번째 보고이다. FLAG^TM은 바람직한 단백질의 N-말단에 결합되는 것으로 처음으로 디자인되었고, 이런 N-말단으로부터 준비된 분해를 허락하는 것과 같은 구조를 가진다(U.S. 특허번호 4,703,004).

이런 유형의 접근은 세포 표면 리셉터의 조사, 특히 연구자가 이런 리셉터의 동족 리간드를 분리하려고 할 때에 일반적으로 유용하다. 비록 FLAG^TM시스템 자체는 싼 것이 아니지만, 이것은 특히 MAb 친화성 칼럼의 발달비용과 편리하게 비교되며, 이것에 대해서 여전히 경쟁하는 용출 조건의 문제를 가지고 있다. 본 기술의 시간 규모는 세포외 도메인을 암호하는 클론이 분리로부터 정제된 융합 단백질 아미크로그램-밀리그램 정량을 가지기까지 약 2 내지 4개월이다.

본 발명이 명백화와 이해를 목적으로 다소 자세히 기재되었지만, 여기에 기재된 구체예와 방법에 대한 다양한 변형 및 변화가 본 명세서에 개시된 발명 개념의 범위로부터 벗어남이 없이 만들어질 수 있다는 것을 본 분야에 숙련된 사람에세 나타날 것이다.

여기에 지정된 참고문헌은 다음 페이지에 열거되어 있으며, 이런 참고문헌에 의해 여기에 통합되어 있다.

참고 문헌

Claims (33)

1. NYK 리셉터 단백질, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체를, 상기 리셉터, 이것의 유도체 또는 대응체와 추정되는 리간드의 결합을 허용하는 적당한 조건하에서 상기 추정되는 리간드와 접촉시키고 결합이 일어났는지를 결정하는 것으로 이루어지는 방법에 의해 검출된 리셉터 단백질 NYK에 결합할 수 있는 리간드.
2. 제1항의 제제와 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석액으로 이루어지는 약학적 조성물.
3. 리셉터 단백질 NYK와 이것의 리간드의 상호작용을 억제하는 것으로 예상되는 분자를,

   (ⅰ) NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체 및

   (ⅱ) NYK의 공지된 리간드와

   상기 공지된 리간드와 상기 NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체의 결합을 허용하는 적당한 조건하에서 접촉시키고 결합이 일어났는지를 결정하는 것으로 이루어지는 방법에 의해 검출된 리셉터 단백질 NYK와 이것의 리간드의 상호작용을 억제할 수 있는 분자.
4. 제3항의 제제와 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석액으로 이루어지는 약학적 조성물.
5. (ⅰ) 증가된 활성을 가지는 것으로 예상되는 분자를, 상기 분자와 NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체의 결합을 허용하는 적당한 조건하에서 상기 NYK, 이것의 유도체 또는 이것의 기능적 대응체와 접촉시키는 단계;

   (ⅱ) 결합이 일어났는지를 결정하는 단계; 및

   (ⅲ) 상기 결정을 적당한 조건하에서 (ⅰ)와 NYK의 고유 리간드를 접촉하는 것으로 이루어지는 대조구에서 결합하는 양과 비교하는 단계로 이루어지는 방법에 의해 검출된 NYK의 고유 리간드와 비교했을 때 리셉터 단백질 NYK의 활성을 자극하는데 증가된 능력을 가지는 분자.
6. 제5항의 제제와 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석액으로 이루어지는 약학적 조성물.
7. 야생형 VEGF의 돌연변이체이며 리셉터 단백질 NYK의 활성을 억제 또는 촉진할 수 있는 분리된 폴리펩티드.
8. 제7항에 있어서, 야생형 VEGF의 시스테인-매듭 모티프의 대응체에서 아미노산 결실 또는 치환으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
9. 제7항에 있어서, 야생형 VEGF의 V3 도메인에 해당하는 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
10. 제7항에 있어서, 마우스 VEGF에 해당하는 적어도 하나의 위치에서 돌연변이로 이루어지며, 상기 위치는 위치 73, 111, 117, 109, 110, 111, 112, 113, 114 및 115로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 제7항에 있어서, K73S, 811G, G117V, VEGF0 및 실제적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 이것의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
12. 제7항에 있어서, 리셉터 단백질 NYK의 아고니스트와 야생형 VEGF의 V3 영역에 해당하는 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 야생형 VEGF의 절단된 형태로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
13. 제12항에 있어서, 상기 절단은 야생형 마우스 VEGF에 해당하는 잔기 133 또는 주변 잔기에 나타나며, 여기에서 동일한 위치 또는 주변 위치에 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
14. 제7항의 폴리펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석액으로 이루어지는 약학적 조성물.
15. 리셉터 단백질 NYK의 활성을 억제 또는 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산분자.
16. 제15항에 있어서, 야생형 VEGF의 시스테인-매듭 모티프의 대응체에서 아미노산 결실 또는 삽입을 가지는 폴리펩티드를 암호하는 누클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분자.
17. 제15항에 있어서, 야생형 VEGF의 V3 도메인에 해당하는 영역에서 하나 이상의 치환을 가지는 폴리펩티드를 암호하는 누클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분자.
18. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 위치에서 돌연변이를 가지는 폴리펩티드를 암호하며, 상기 위치는 야생형 마우스 3VEGF에 해당하는 위치 111, 117, 109, 110, 111, 112, 113, 114 및 115로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분자.
19. 제18항에 있어서, K73S, H111G, G117V, VEGF0 및 실제적으로 그리고 동일한 생물학적 활성을 가지는 이것의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호하는 것을 특징으로 하는 분자.
20. 제15항에 있어서, 야생형 마우스 VEGF에 해당하는 잔기 133 또는 주변 잔기를 말단으로 하며 동일한 위치의 주변 위치에 아미노산 치환을 가지는 절단된 단백질을 암호하는 것을 특징으로 하는 분자.
21. tie2와 RYK로 구성되는 군으로부터 선택된 리셉터 단백질 티로시나제 키나아제의 세포외 도메인의 생물학적 활성을 가지는 재조합 단백질 제조방법에 있어서, 다음과 같은 단계,

    a) 리셉터의 세포외의 예상되는 막투과 도메인의 결합부에서 단백질을 암호하는 핵산에서 제한부위를 발생시키는 단계, 여기에서 제한부위는 구조체에 독특한 것으로 선택되고;

    b) 단계 a)에서 제조된 핵산을 마커 펩티드와 프레임내 정지코돈을 암호하는 올리고누클레오티드 서열에 라이게이션하는 단계;

    c) 단계 b)에서 제조된 구조체를 단백질을 얻기 위해 포유동물 숙주 세포배양에서 발현시키는 단계; 및

    d) 마커 펩티드에 특이한 친화성 시약을 사용하여 상기 단백질을 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 단백질이 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 단계 a)는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 중합효소 사슬 반응을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제21항에 있어서, 제한부위는 BglⅡ 또는 BamHⅠ인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제21항에 있어서, 단계 b)에서 도입되는 독특한 제한부위가 ClaⅠ인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제21항에 있어서, 마커 펩티드는 FLAG^TM인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제21항에 있어서, 마커 펩티드는 세포외 도메인의 C-말단으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제22항에 있어서, 정제는 항-FLAG^TM펩티드 친화성 겔과 유리 FLAG^TM펩티드로 느린 용출을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제21항에 있어서, 숙주세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제21항의 방법에 의해 제조되는 세포외 PTK 도메인.
31. 제30항의 세포외 PTK 도메인과 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석액으로 이루어지는 조성물.
32. 제21항의 방법에 의해 생성되는 분리된 핵산 분자.
33. 제30항의 세포외 PTK 도메인에 대해 지시되는 단일클론 항체.