EA004635B1 - Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент - Google Patents

Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент Download PDF

Info

Publication number
EA004635B1
EA004635B1 EA200200261A EA200200261A EA004635B1 EA 004635 B1 EA004635 B1 EA 004635B1 EA 200200261 A EA200200261 A EA 200200261A EA 200200261 A EA200200261 A EA 200200261A EA 004635 B1 EA004635 B1 EA 004635B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fragment
polypeptide
baff
amino acid
bcma
Prior art date
Application number
EA200200261A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200200261A1 (ru
Inventor
Фабьенн МакКэй
Джеффри Браунинг
Кристин Амброуз
Юрг Чопп
Паскаль Шнайдер
Джеффри Томпсон
Original Assignee
Байоджен, Инк.
Апотек Р Энд Д С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27386828&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA004635(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Байоджен, Инк., Апотек Р Энд Д С.А. filed Critical Байоджен, Инк.
Publication of EA200200261A1 publication Critical patent/EA200200261A1/ru
Publication of EA004635B1 publication Critical patent/EA004635B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Описан новый рецептор BAFF-R, принадлежащий к семейству TNF. Описаны также химерные молекулы и антитела против BAFF-R и способы их использования.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к использованию рецептора для ВАРЕ, фактора активации β-клеток, принадлежащего к семейству факторов некроза опухоли (ΤΝΕ), и к его блокирующим агентам для стимуляции или ингибирования экспрессии В-клеток и иммуноглобулинов. Этот рецептор обладает противораковыми и иммунорегуляторными свойствами, а также используется для лечения иммуносупрессорных расстройств, таких как ВИЧ-инфекции. Кроме того, этот рецептор и его блокирующие агенты играют определенную роль в развитии гипертонии и родственных ей расстройств. Кроме того, клетки, трансфицированные геном указанного рецептора, могут быть использованы в генной терапии для лечения опухолей, лимфом, аутоиммунных болезней или наследственных генетических нарушений, в которых участвуют В-клетки. Блокирующие агенты, такие как рекомбинантные варианты или антитела, специфичные для указанного рецептора, применяются также в качестве иммунорегуляторных агентов. Рассматривается также использование рецептора для ВАЕЕ в качестве стимулятора Вклеток для лечения иммуносупрессорных заболеваний, включая, например, его использование для трансплантации органов пациентам (например, трансплантата костного мозга), а также для восстановления после лечения рака в целях стимуляции продуцирования В-клеток. Рассматривается также использование рецептора для ВАЕЕ в качестве адъюванта и/или костимулятора для усиления и/или восстановления Вклеточных уровней приблизительно до нормальных уровней. Растворимые формы указанного рецептора для ВАЕЕ, которые блокируют В-клеточную функцию, могут быть также использованы для ингибирования заболеваний, опосредованных В-клетками.
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к новому рецептору семейства Т№. Был идентифицирован новый рецептор ВАЕЕ-Я (или ВСМА).
Семейство Т№ состоит из пар лигандов и их специфических рецепторов, называемых лигандами семейства Т№ и рецепторами семейства Т№ (Ва/ζοηί & ВеиЙег, 1996). Указанное семейство участвует в регуляции иммунной системы и, возможно, других неиммуннологических систем. Данная регуляция часто происходит на уровне главного переключения, так, что передача сигнала членами семейства Т№ может приводить к большому числу последующих событий, наиболее характерных для Т№. Т№ может инициировать общий протективный воспалительный ответ организма на инвазию чужеродного агента, что приводит к изменению фетотипа адгезивных молекул, участвующих в транспорте клеток, к продуцированию хемокинов для направления специфических клеток в конкретные участки и к примированию различ ных эффекторных клеток. Таким образом, регуляция этих каскадов реакций может иметь клиническое применение.
Индуцирование различных клеточных ответов, опосредованных указанными цитокинами семейства Т№, очевидно инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Были идентифицированы по крайней мере два различных рецептора Т№, имеющие молекулярную массу приблизительно 55 кДа (Т№Я1) и 75 кДа (Т№Я2) [Нойтап е! а1., 1. Вю1. Сйет. 264: 14927-14934 (1989) & Вгоскйаик е! а1., ΓΝ^, 87:3127-3131 (1990)]. Широкий полиморфизм был ассоциирован с обоими генами рецептора Т№. Оба Т№И имеют общую типичную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточные, трансмембранные и внутриклеточные домены. Указанная внеклеточная часть Т№И типа 1 и типа 2 содержит повторяющийся мотив аминокислотной последовательности, состоящий из доменов, богатых четырьмя цистеинами (СЭЯ). Аналогичный повторяющийся мотив СЭЯ присутствует и в некоторых других белках клеточной поверхности, включая рецептор фактора роста нервной ткани, антагониста антигена С'Э40. присутствующего на В-клетках и т.п.
Благодаря своей способности легко превращаться в гибридные белки иммуноглобулинов рецепторы представляют собой мощный инструмент для выявления каскадов биологических реакций. Такие димерные растворимые формы рецепторов являются хорошими ингибиторами событий, опосредуемых либо секретированными, либо поверхностными лигандами. Путем связывания с этими лигандами они могут препятствовать взаимодействию лигандов с клеточно-ассоциированными рецепторами, которые могут передавать сигнал. Эти гибридные белки рецептор-1д являются ценными не только с экспериментальной точки зрения, но и в случае Т№-Я-1д, они могут быть успешно использованы клинически для лечения заболеваний кишечника, ревматоидного артрита и острого клинического синдрома, сопровождающего введение ОКТ3 (Еакоп е! а1., 1996; Ее1бшапп е! а1., 1996; уап Эи11ешеп е! а1., 1995). Можно ожидать, что манипуляции по отношению ко многим событиям, опосредованным передачей сигнала через рецепторы семейства Т№, будет иметь широкое применение для лечения иммунных болезней, а также широкого ряда заболеваний человека, которые имеют патологические осложнения, обусловленные нарушениями иммунной системы. Растворимая форма недавно открытого рецептора, остеопротегерина, может блокировать потерю массы костной ткани, а поэтому события, регулируемые передающим сигнал рецептором семейства Т№, не обязательно должны быть ограничены регуляцией иммунной системы. Антитела к этому рецептору могут блокировать связывание лиганда, а следовательно, они могут также иметь клиническое применение. Такие антитела часто являются долгоживущими и могут иметь некоторое преимущество по сравнению с гибридными белками рецептор-1д, которые имеют более короткое время полужизни в кровотоке.
Хотя ингибирование опосредованного рецептором каскада реакций представляет собой наиболее широко распространенное терапевтическое применение этих рецепторов, однако, сначала, такое применение состояло в активации рецепторов ΤΝΤ, что указывало на перспективность его клинического применения (Аддат\та1 & №-11ага)ап. 1996). Активация рецепторов ΤΝΕ может инициировать клеточную гибель, а поэтому их применение для лечения опухолей является еще более привлекательным (Еддегшои1 е! а1., 1996). Этот рецептор может быть активирован либо путем введения лиганда, т. е., лиганда, участвующего в каскаде природных реакций, либо определенных антител, которые могут перекрестно реагировать с данным рецептором и также являются сильными агонистами. Эти антитела имеют определенное преимущество в онкологии, поскольку они могут существовать в кровотоке в течение продолжительного периода времени, тогда как лиганды имеют обычно короткое время полужизни в кровотоке. Поскольку многие из этих рецепторов могут быть экспрессированы более селективно в опухолях, или они могут только передавать сигнал гибели или дифференцировки клеток в опухоли, то антитела-агонисты могут быть хорошим оружием в борьбе против рака. Аналогичным образом, многие позитивные иммунологические события опосредуются рецепторами ΤΝΕ, например, воспалительные реакции хозяина, продуцирование антител и т.п., а поэтому антителаагонисты могут обладать благоприятным действием в других не-онкологических применениях.
Парадоксально, но ингибирование метаболического пути может оказаться клинически эффективным для лечения опухолей. Так, например, Раз-лиганд экспрессируется некоторыми опухолями и эта экспрессия может приводить к гибели Раз-положительных лимфоцитов, что, тем самым, позволяет опухоли ускользать от надзора иммунной системы. В этом случае ингибирование Рав-системы может затем давать возможность иммунной системе взаимодействовать с опухолью другими путями, доступ к которым в настоящее время представляется возможным (Сгеепе & ХУиге, 1997).
Краткое описание изобретения
Авторами настоящего изобретения был идентифицирован кДНК-клон, который кодирует полипептид, обозначенный в настоящей заявке ВАРР-Я или ВСМА, который связывается с фактором некроза опухоли, ВАРЕ, фактором активации В-клеток, принадлежащим к семейству факторов некроза опухоли (ΤΝΡ). ВАРЕ представляет собой ту же самую молекулу, опи санную ранее в ^0/9912964, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способам использования ВАРР-Я.
Указанными способами являются способы ингибирования роста В-клеток, индуцированного дендритными клетками роста и созревания Вклеток, или продуцирования иммуноглобулина у животных с использованием полипептида ВАРР-Я. Настоящее изобретение также включает способы стимуляции роста В-клеток, роста и созревания В-клеток, индуцированного дендритными клетками, или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАРР-Я, или ко-стимуляции роста В-клеток, роста и созревания В-клеток, индуцированного дендритными клетками, или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАРР-Я и антитела против Т, лиганда СЭ40 или лиганда против СИ40.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способам с использованием ВАРР-Я для лечения аутоиммунных болезней, гипертонии, сердечнососудистых расстройств, почечных заболеваний, лимфопролиферативных заболеваний, ассоциированных с В-клетками, иммуносупрессорных заболеваний, заболеваний, ассоциированных с трансплантацией органов и ВИЧ-инфекций. Настоящее изобретение также относится к способам использования агентов для нормализации, подавления или изменения иммунного ответа, участвующего в пути передачи сигнала между ВАРР-Я и его лигандом, и к способам ингибирования воспаления путем введения антитела против ВАРР-Я или его эпитопа.
Способы настоящего изобретения предпочтительно осуществляют путем введения терапевтически эффективного количества полипептида ВАРР-Я, химерной молекулы, содержащей полипептид ВАРР-Я, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, или гомолога антитела против ВАРР-Я.
В одном из вариантов своего осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид ВАРР-Я и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к химерным молекулам, содержащим полипептид ВАРР-Я, слитый с гетерологичной полипептидной или аминокислотной последовательностью. Примером такой химерной молекулы является ВАРРЯ, слитый с Рс-областью иммуноглобулина или последовательностью меченого эпитопа.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с полипеп тидом ВАЕЕ-К. Это антитело является, но не обязательно, моноклональным антителом.
Краткое описание графического материала
На фиг.1 показана последовательность нуклеиновой кислоты (8ЕО ГО N0:2) кДНК ВАРЕ-К (ВСМА) человека и выведенная из нее аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0:1). Возможный сайт инициации трансляции находится в любом из остатков нуклеиновой кислоты (нуклетидов) 219 или 228; богатый цистеином домен (СКЭ) находится в остатках нуклеиновой кислоты 240-341 8Е0 ГО N0:2 (аминокислотные остатки 8-41 8Е0 ГО N0:1); а возможная трансмембранная область находится в остатках нуклеиновой кислоты 375-459 8Е0 ГО N0:2.
На фиг. 2 показана последовательность нуклеиновой кислоты (8Е0 ГО N0:4) и выведенная из нее аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0:3) р18Т538, плазмиды, кодирующей ВАЕЕ-К-Ес: остатки нуклеиновой кислоты 1-69, мышиная сигнальная последовательность каппа-цепи 1дС; остатки нуклеиновой кислоты 70-222, ВАЕЕ-К (остатки нуклеиновой кислоты 1-153); остатки нуклеиновой кислоты 223-906, 1дО человека.
На фиг. 3 показана последовательность нуклеиновой кислоты р18Т535, плазмиды, кодирующей полноразмерный ВАЕЕ-К человека, и выведенная из нее аминокислотная последовательность.
На фиг. 4 показано сравнение структуры Т№-К55 и ВАЕЕ-К.
На фиг. 5 показаны клетки 293ЕВNА, трансфицированные либо (а) СН269 (1,0 мкг), либо (Ь) р18Т535 (0,1 мкг), плазмидой, экспрессирующей полноразмерный ВАЕЕ-К и окрашенной 0,5 мкг/мл Дад-ЬВАЕЕ в формате анализа на планшетах.
На фиг. 6(а) показано ЕАС8-перекрывание клеток 293ЕВNА, трансфицированных р18Т535 и окрашенных следующим образом: без лиганда (черная гистограмма), 1 мкг/мл Дад-йСП40Ь (розовая) или Дад-ЬВАЕЕ (зеленая). Затем все образцы окрашивали анти-Дад М2, а затем ослиным антителом против мышиных 1дО, как описано в способах в примере 2.
На фиг. 6(Ь) показаны ЕАС8-гистограммы со статистическими данными одного и того же эксперимента. Окрашивание осуществлялось следующим образом: (1) не окрашивали, (2) только 7ААЭ, (3) во 2-ой стадии и только 7ААЭ. (4) 9 мкг/мл Пад-ЕВАЕЕ, (5) 3 мкг/мл Пад-ЕВАЕЕ, (6) 1 мкг/мл Дад-ЬВАЕЕ, (7) 0,33 мкг/мл Пад-ЕВАЕЕ, (8) 0,11 мкг/мл Дад-ЬВАЕЕ, (9) Дад-йСП40Ь, 1 мкг/мл.
На фиг. 7 показана иммунопреципитация ВАЕЕ-К-Ес, как описано в способах в примере 4. Стандарты молекулярных масс в кДа помечены в левой части фигуры. Дорожки: (1) 12,5 нг Дад-йТ^ЕАК, (2) 12,5 нг Пад-ЕВАЕЕ, (3) иммунопреципитация Пад-11ВАЕЕ под действием 0,5 мл ВАЕЕ-К-Ес-кондиционированной среды, (4) иммунопреципитация Пад-11Т\УЕАК с использованием 0,5 мл ВАЕЕ-К-Ес-кондиционированной среды, (5) иммунопреципитация без лиганда с использованием 0,5 мл ВАЕЕ-К-Ескондиционированной среды, (6) иммунопреципитация Пад-ЕВАЕЕ с использованием 0,5 мл кондиционированной среды от нетрансфицированных 293ЕВNА, (7) иммунопреципитация Пад-11Т\УЕАК с использованием 0,5 мл кондиционированной среды от нетрансфицированных 293ЕВт.
На фиг. 8 показан график результатов анализа пролиферации спленоцитов, на котором представлены кривые, отражающие число импульсов в минуту (имп./мин), включенных в клетки мышиных спленоцитов, в зависимости от количества добавленного ВАЕЕ человека (мкг/мл).
На фиг. 9 показан график результатов анализа блокирования ВАЕЕ, в котором изучается связывание ВАЕЕ с Ка_) ί-клетками, и приведены кривые данных считывания МЕ1 (средней интенсивности флуоресценции), в зависимости от количества К:ЫдО1 (нг/мл).
На фиг. 10(а) показаны графики экспрессии 1дМ в зависимости от СЭ1 в ЕАС8-анализе ВаЕЕ-Тд-мышей, которым вводили 11-1д (средняя панель) или 11ВС.'МА-1д (нижняя панель), и однопометных контрольных мышей дикого типа, которым вводили РВ 8-инъекции (верхняя панель), как описано в примере 11.
На фиг. 10(Ь) показаны графики экспрессии СГО21 в зависимости от 1дМ в ЕАС8-анализе на выявление (по дискриминационным окнам) 1дЭ-положительных популяций для ВаЕЕ-Тдмышей, которым вводили 11-1д (средняя панель) или 11ВСМА-1д (нижняя панель), и для однопометных контрольных мышей дикого типа, которым вводили РВ8-инъекции (верхняя панель), как описано в примере 11.
На фиг. 10(с) показаны графики экспрессии СГО21 в зависимости от 1дМ в ЕАС8-анализе на выявление (по дискриминационным окнам) 1дЭ-отрицательных популяций для ВаЕЕ-Тдмышей, которым вводили 11-1д (средняя панель) или ЬВСМА-1д (нижняя панель) и для однопометных контрольных мышей дикого типа, которым вводили РВ8-инъекции (верхняя панель), как описано в примере 11.
На фиг. 11 показаны массы селезенок для всех групп ВаЕЕ-Тд-мышей (выражены как масса в мг +/- стандартное отклонение).
На фиг. 12 показан график зависимости протеинурии (мг/дл) от числа инъекций для ВаЕЕ-Тд-мышей, обработанных РВ8, Ыд, ЬВСМА-1д и для однопометных контрольных мышей.
На фиг. 13 показан график среднего артериального давления (мм рт.ст.) у ВаЕЕ-Тд-мышей и у контрольных мышей дикого типа.
Ί
На фиг. 14 показан график значений артериального давления (мм рт.ст.) у отдельных Вай-Тд-мышей и у контрольных мышей дикого типа.
На фиг. 15 показана гистограмма процентного отношения мышей 8ΝΒ1, которые обнаруживали тяжелый нефрит после обработки ВАРР-ВПд (ВСМА-1д), Ни1д6 или РВ8.
На фиг.16 показан график общего числа клеток СО 11с + ОС (в миллионах) у мышей, обработанных ίη νίνο 20 мкг ВСМА-1д, 50 мкг ВСМА-1д, Ни1д6 или РВ8. Были оценены клеточные популяции СП 11 с + ОС: (1) ί.Ό8ο-ί.Ό4-. (2) СЭ8а+СЭ4 и (3) СО8а-СП4+.
Подробное описание
1. Определения
Термины ВАРР-В и ВСМА, используемые в настоящем описании, охватывают нативную последовательность ВАРР-В и варианты ВАРР-В (которые будут подробно определены ниже). ВАРР-В может быть выделен из ряда источников, таких, например, как некоторые типы тканей мыши или человека, или из других источников, либо он может быть получен рекомбинантными методами или методами синтеза.
Нативная последовательность ВАРР-В включает в себя полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и ВАРР-В, происходящий из природных источников. Такая нативная последовательность ВАРРВ может быть выделена из природных источников, либо она может быть продуцирована рекомбинантными методами или методами синтеза. Существуют природные усеченные или секретированные формы ВАРР-В (например, растворимые формы, содержащие, например, последовательность внеклеточного домена), природные варианты (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты ВАРР-В. В одном из вариантов осуществления изобретения нативная последовательность ВАРР-В представляет собой зрелую или полноразмерную нативную последовательность полипептида ВАРР-В, содержащую аминокислоты 1-184 последовательность 8ЕО ΙΌ N0:1 или ее фрагмент.
Внеклеточный домен ВАРР-В или ВАРР-В-ЕСО означает форму ВАРР-В, которая в основном не содержит трансмембранных и цитоплазматических доменов ВАРР-В. Обычно внеклеточный домен ВАРР-В имеет менее, чем 1% из таких трансмембранных и цитоплазматических доменов, а предпочтительно менее, чем 0,5% таких доменов. ВАРР-В-ЕСО содержит, но не обязательно, аминокислотные остатки 8-41 8Е0 ΙΌ N0:1 или аминокислотные остатки 4-51 8Е0 ΙΌ N0:1 или аминокислотные остатки 1-53 8Е0 ΙΌ N0:1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ВАРР-В-ЕСО содержит аминокислотные остатки 1-51 8Е0 ΙΌ N0:1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ВАРР-В-ЕСО содержит аминокислотные остатки 1-50 8Е0 ΙΌ N0:1. Следует отметить, что трансмембранный домен, идентифицированный для полипептида ВАРР-В настоящего изобретения, идентифицируют в соответствии с критериями, обычно используемыми для идентификации гидрофобного домена такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут варьироваться, но, по всей вероятности, не более, чем по 5 аминокислотам на любом конце домена, конкретно упомянутого в настоящем описании. В соответствии в этим, ВАРР-В-ЕСО может, но не обязательно, включать в себя аминокислоты 8-41 (8ЕО ΙΌ N0:1).
Вариант ВАРР-В означает активный ВАРР-В, определяемый ниже и имеющий по меньшей мере примерно 80%-ную идентичность аминокислотной последовательности с ВАРР-В, имеющим выведенную аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0:1 для полноразмерной нативной последовательности ВАРР-В или с последовательностью ВАРР-ВЕС.П. Такими вариантами ВАРР-В являются, например, полипептиды ВАРР-В, в которых на конце или С-конце последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 добавлены или делетированы один или несколько аминокислотных остатков. Обычно вариант ВАРР-В имеет по меньшей мере примерно 80%-ную или 85%-ную, более предпочтительно - по меньшей мере примерно 90%ную, и даже более предпочтительно - по меньшей мере примерно 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности по отношению к последовательностям ВАРР-В, идентифицированным в настоящем изобретении, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которая является идентичной аминокислотным остаткам в последовательности ВАРР-В, после сопоставления первичных последовательностей и введения пробелов, если это необходимо для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не принимая во внимание какиелибо консервативные замены, сделанные в процессе идентификации последовательностей. Сопоставление первичных последовательностей в целях определения процента индентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, известными специалистам, например, с использованием широко доступного программного обеспечения, такого как ВЬА§Т, А^ЮN или Медайдп (^NА§ТАВ). Каждый специалист может определить соответствующие параметры для проведения сопоставительного анализа, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального сопоставления по всей длине сравниваемых последовательностей.
Используемый здесь термин меченый эпитоп относится к химерному полипептиду, содержащему ВАРР-В или последовательность его домена, слитую с полипептидной меткой. Полипептидная метка имеет достаточное число остатков для получения эпитопа, против которого может быть продуцировано антитело или который может быть идентифицирован какимлибо другим агентом, но при этом достаточно коротким, таким, чтобы он не препятствовал активности ВАРР-В. Полипептидная метка предпочтительно также должна быть абсолютно уникальной, так, чтобы антитело в основном не вступало в перекрестную реакцию с другими эпитопами. Подходящие полипетпидные метки в основном имеют по меньшей мере 6 аминокислотных остатков, а обычно от приблизительно 8 до 50 аминокислотных остатков (предпочтительно, примерно от 10 до 20 остатков).
Термин выделенный, используемый для описания различных упомянутых здесь полипептидов, относится к полипептиду, который был идентифицирован и выделен и/или восстановлен из компонента его природного окружения. Примесными компонентами его природного окружения являются материалы, которые обычно препятствуют диагностическому или терапевтическому применению данного полипептида и которыми могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или не-белковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный полипептид может быть очищен (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или предпочтительно серебрянного красителя. Выделенным полипептидом является полипептид ίη кйи в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения ВАРР-В в них не присутствует. Однако обычно выделенный полипептид может быть получен по меньшей мере за одну стадию очистки.
Термин антитело используется в самом широком смысле и конкретно включает в себя моноклональные антитела против В АРР-В (включая антитела-агонисты, антителаантагонисты и нейтрализующие антитела) и композиции антител против ВАРР-В с полиэпитопной специфичностью. Используемый здесь термин моноклональное антитело означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах.
Используемый здесь термин очищенный препарат или в основном чистый препарат полипептида означает полипептид, который был выделен из других белков, липидов и нуклеиновых кислот, являющихся его природным окружением. Предпочтительно, указанный полипептид также выделяют из других веществ, например, антител, матриксов и т.п., которые используют для его очистки.
Используемые здесь термины лечение, курс лечения и терапия означают лечебную терапию, профилактическую терапию и превентивную терапию.
Используемые здесь термины пептиды, белки и полипептиды являются взаимозаменяемыми.
Используемый здесь термин биологически активный относится к ίη νίνο или ίη νίίτοактивности, которая может быть осуществлена непосредственно или опосредованно. Биологически активные фрагменты ВАРР-В могут иметь, например, 70% аминокислотную гомологию, более предпочтительно по меньшей мере 80%, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере 90%-гомологию с активным сайтом рецептора. Идентичность или гомология по отношению к рецептору определена здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которая идентична остаткам ВАРР-В в 8ЕО ΙΌ N0:1 или которая идентична определенной области аминокислотных остатков в 8ЕО ΙΌ N0:1.
Используемый здесь термин млекопитающее означает любое животное, классифицированное как млекопитающее, включая человека, коров, лошадей, собак, мышей и кошек. В предпочтительном варианте осуществления изобретения таким млекопитающим является человек.
Для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы, если это не оговорено особо, стандартные методы клеточной биологии, клеточного культивирования, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам. Указанные методы описаны в литературе.
Далее приводится подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к использованию ВАРР-В и родственных ВАРР-В молекул для эффективного роста и созревания В-клеток и секреции иммуноглобулина. Настоящее изобретение также относится к использованию ВАРР-В и родственных ВАРР-В молекул для вырабатывания эффективных ответов иммунной системы, необходимых при расстройствах, связанных с иммунными нарушениями. Кроме того, настоящее изобретение относится к лечению рака и иммунных расстройств посредством использова ния гена ВАЕЕ-В или родственного ВЛЕЕ-В методами генной терапии.
ВАЕЕ-В и его гомологи, продуцированные хозяевами, трансформированными последовательностями настоящего изобретения, а также нативный ВАЕЕ-В, очищенный известными методами или продуцированный из известных аминокислотных последовательностей, могут быть использованы в ряде методов противоракового, противоопухолевого и иммунорегуляторного применения. Они также могут быть использованы в терапии и в методах, направленных на лечение других болезней.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к использованию полипептида, кодируемого выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей ВАЕЕ-В, в антисмысловой терапии. Используемый здесь термин антисмысловая терапия относится к введению или генерированию ίη кйи олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизуются в клеточных условиях с клеточной мРНК и/или ДНК, кодирующей нужный лиганд, в целях ингибирования экспрессии кодированного белка, т.е. ингибирования транскрипции и/или трансляции. Связывание может происходить по комплементарным стандартным парам оснований или, например, в случае связывания с ДНК-дуплексами, посредством специфических взаимодействий в большой бороздке двойной спирали. В общих чертах, антисмысловая терапия относится к ряду методов, обычно используемых специалистами, и включает в себя любую терапию, которая основана на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями.
Антисмысловая конструкция настоящего изобретения может быть доставлена, например, в виде экспрессирующей плазмиды, которая, при ее транскрибировании в клетке, продуцирует РНК, комплементарную по меньшей мере части клеточной мРНК, кодирующей ВАЕЕлиганд. Альтернативно, антисмысловая конструкция может представлять собой олигонуклеотидный зонд, генерируемый ех νίνο. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно представляют собой модифицированные олигонуклеотиды, которые являются резистентными к эндогенным нуклеазам и, таким образом, являются стабильными ίη νίνο. Примерами нуклеиновокислотных молекул, используемых в качестве антисмысловых олигонуклеотидов, являются фосфорамидаты, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см., например, 5176996, 5264564 и 5256775). Кроме того, общие подходы для конструирования олигомеров, используемых в антисмысловой терапии, были описаны, например, Уап Эег Кго1 е! а1., (1998) Вю1ес1шк|иек 6:958-976; и 81еш е! а1. (1998) Сапсег Век. 48:2659-2668, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
ВАЕЕ-В согласно изобретению, обсуждаемый выше, является членом семейства рецепторов ΤΝΤ. Указанный белок, его фрагменты и гомологи могут иметь широкое терапевтическое и диагностическое применение.
Полипептиды согласно изобретению специфически взаимодействуют с ВАЕЕ, полипептидом, ранее описанным в заявке \УО99/12964, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Однако описанные здесь пептиды и методы позволяют идентифицировать молекулы, которые специфически взаимодействуют с ВАЕЕ-В или с его фрагментами.
В некоторых своих вариантах заявленное изобретение относится к способам использования пептидов, происходящих от ВАЕЕ-В, способных связываться с ВАЕЕ. Фрагменты ВАЕЕВ могут быть продуцированы несколькими способами, например, рекомбинантно, с помощью ПЦР, путем протеолитического расщепления или химического синтеза. Внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть генерированы путем удаления одного или нескольких нуклеотидов от одного конца или от обоих концов нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид. Экспрессия мутагенизированной ДНК приводит к продуцированию полипептидных фрагментов.
Химерные молекулы, используемые в настоящем изобретении, могут быть также продуцированы известными методами. В настоящем изобретении рассматривается использование химерных молекул, содержащих полипептид ВАЕЕ-В (или его вариант), слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, такой как домен 1дО-Ес иммуноглобулина. Указанные химерные молекулы предпочтительно являются растворимыми и содержат растворимый полипептид ВАЕЕ-В. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная химерная молекула содержит аминокислотные остатки 1-50 8ЕО ГО N0:1, слитые с Есдоменом.
Полипептидные фрагменты могут быть также химически синтезированы известными методами, такими как стандартный твердофазный синтез с использованием £-шос- или ΐ-Ьосхимии Мерифильда. Так, например, пептиды и ДНК-последовательности согласно изобретению могут быть произвольно разделены на фрагменты нужной длины без перекрывания фрагментов, либо они могут быть разделены на перекрывающиеся фрагменты нужной длины. Такие методы более подробно описаны ниже.
Генерирование растворимых форм ВАГГ-К
Растворимые формы ВАЕЕ-В часто могут эффективно передавать сигнал, а поэтому они могут быть введены в качестве лекарственного средства, которое в данном случае имитирует природную мембранную форму. Предполагается, что заявленный здесь ВАЕЕ-В секретируется в природе как растворимый цитокин, однако если это не имеет место, этот ген можно снова сконструировать для усиления секреции. Для создания растворимой секретированной формы ВАРР-К необходимо удалить - на уровне ДНК Ν-концевые трансмембранные области и определенную часть области-стебля и заменить их лидерной последовательностью типа I или лидерной последовательностью альтернативного типа II, которая обеспечивает эффективное протеолитическое расщепление в выбранной экспрессионной системе. Каждый специалист может варьировать количество области-стебля, присутствующего в секреторной экспрессионной конструкции в целях оптимизации как свойств связывания лиганда, так и эффективности эскпрессии. Так, например, конструкции, содержащие все возможные длины стебля, т.е. Ν-концевые усечения, могут быть получены так, чтобы продуцировались белки от аминокислоты 1 до аминокислоты 51. В результате анализов такого типа должна быть установлена оптимальная длина последовательности стебля.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения растворимый полипептид ВАРР-К представляет собой выделенный полипептид с нативной последовательностью ВАРРК, содержащий аминокислотные остатки 1-51 8ЕО ΙΌ N0:1 или его фрагмент; выделенный полипептид ВАРР-К, имеющий по крайней мере 80%-ную (а более предпочтительно, 90%-ную) идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида ВАРР-К, содержащий аминокислотные остатки 1-51 8Е0 ΙΌ N0:1, или его фрагмент; выделенный полипептид ВАРР-К с нативной последовательностью, содержащий аминокислотные остатки 1-50 8Е0 ΙΌ N0:1 или его фрагмент; или выделенный полипептид ВАРРК, содержащий аминокислотные остатки 8-41 8Е0 ΙΌ N0:1 или его фрагмент.
Генерирование антител, реагирующих с ВАРР-К
Настоящее изобретение также относится к антителам, специфически реагирующим с заявленным ВАРР-К или с его ко-рецепторами. Антисыворотка или моноклональные антитела против белка/против пептида могут быть получены стандартными методами (см., например, Аи11Ьоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, еб. Ьу Наг1оте аиб Ьаие (Со1б 8рппд НагЬог Ргекк: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомяк или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой данного пептида. Методами сообщения иммуногенности белку или пептиду являются конъюгирование с носителями или другие методы, хорошо известные специалистам.
Иммуногенная часть ВАРР-К или его корецепторы могут быть введены в присутствии адъюванта. Ход иммунизации может быть прослежен путем детекции титров антител в плазме или сыворотке. Для оценки уровней антител могут быть предприняты стандартный метод
ЕЫ8А или другие иммуноанализы с использованием иммуногена в качестве антигена.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, рассматриваемые антитела являются иммуноспецифичными для антигенных детерминант ВАРР-К или его корецепторов, например, антигенных детерминант полипептида 8Е0 ΙΌ N0:1 или его близкородственного человеческого или не-человеческого гомолога (например, имеющего 70, 80 или 90%ную гомологию, а более предпочтительно по крайней мере 95 %-ную гомологию). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела против ВАРР-К или против ВАРР-ко-рецептора в основном не вступают в перекрестную реакцию (то есть реагируют специфически) с белком, который, например, менее, чем на 80% гомологичен 8Е0 ΙΌ N0:1; а предпочтительно, менее, чем на 90% гомологичен 8Е0 ΙΌ N0:1; а наиболее предпочтительно менее, чем на 95% гомологичен 8Е0 ΙΌ N0:1. Термин в основном не вступающий в перекрестную реакцию относится к антителу, имеющему аффинность связывания негомологичного белка, которая составляет менее, чем 10%, более предпочтительно - менее, чем 5%, и даже более предпочтительно - менее, чем 1% от аффинности связывания белка с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:1.
Используемый здесь термин антитело охватывает его фрагменты, которые также специфически реагируют с ВАРР-К или с его рецепторами. Антитела могут быть фрагментированы стандартными методами, и их фрагменты могут быть подвергнуты скринингу для выяснения возможности их использования в способе, описанном выше для целых антител. Так, например, Р(аЬ')2-фрагменты могут быть генерированы путем обработки антитела пепсином. Полученный Р(аЬ')2-фрагмент может быть обработан для восстановления дисульфидных мостиков с продуцированием РаЬ'-фрагментов. Кроме того, антитела настоящего изобретения содержат биоспецифические и химерные молекулы, обладающие активностью против ВАРР-К или против ВАРР-ко-рецептора. Так, например, моноклональные и поликлональные антитела (АЬ), направленные против ВАРР-К и их корецепторов, и фрагменты антител, такие как РаЬ' и Р(аЬ')2, могут быть использованы для блокирования действия ВАРР-К и его соответствующих ко-рецепторов.
Различные формы антител могут быть также получены стандартными методами рекомбинантных ДНК (АйНег & Мйк1ет, №1иге 349: 293-299 (1991), эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки). Так, например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антиген-связывающий домен, происходящий от антитела животного, присоединен к константному домену человека (например, СаЬШу е1 а1., патент США 4816567, который вводится в настоящее описание посредством ссылки). Химерные антитела могут снижать наблюдаемые иммуногенные ответы, вырабатываемые антителами животного, при их использовании в клинической терапии пациента.
Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела, которые распознают ВАГГ-К или его корецепторы. Гуманизированные антитела представляют собой химеры, включающие в себя главным образом последовательности 1§С человека, в которые были встроены области, ответственные за специфическое связывание с антигеном. Животных иммунизируют нужным антигеном, выделяют соответствующие антитела и удаляют часть последовательностей вариабельной области, ответственных за специфическое связывание с антигеном. Области связывания с антигеном, происходящие от животного, затем клонируют в соответствующее положение генов антитела человека, в которых были делетированы области связывания с антигеном. Гуманизированные антитела позволяют минимизировать использование гетерологичных (например, межвидовых) последовательностей в антителах человека, и тем самым снижают вероятность вырабатывания иммунного ответа у индивидуумов, проходящих курс лечения.
Конструирование рекомбинантных антител различных классов может быть также осуществлено путем продуцирования химерных или гуманизированных антител, содержащих вариабельные домены и константные домены человека (СН1, СН2, СН3), выделенные из иммуноглобулинов различных классов. Так, например, антитела с повышенными валентностями антиген-связывающего центра могут быть рекомбинантно продуцированы путем клонирования антиген-связывающего центра в векторы, несущие константные области цепи антитела человека (Аги1апапбат с1 а1., 1. Ехр. Меб., 177:1439-1450 (1993), эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки).
Кроме того, для изменения аффинностей связывания рекомбинантных антител с их антигенами могут быть использованы стандартные методы рекомбинантных ДНК путем модификации аминокислотных остатков, находящихся вблизи от антиген-связывающих центров. Аффинность связывания гуманизированного антитела с антигеном может быть увеличена посредством мутагенеза на основе молекулярного моделирования. (Оиееи е1 а1., Ргос. Νηί1. Асаб. 8с1. 86:10029-33 (1989), эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Генерирование аналогов. Продуцирование модифицированных ДНК и пептидных последовательностей.
Аналоги ВАГГ-К могут отличаться от природного ВАГГ-К по своим аминокислотным последовательностям или по присутствию или осутствию тех или иных последовательностей, или по тому или другому признаку. Модификации, не относящиеся к последовательностям, включают в себя ίη νίνο или ίη νίίτο химическую дериватизацию ВАГГ-К. Модификациями, не относящимися к последовательностям, являются, но не ограничиваются ими, изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании, карбоксилировании или гликозилировании.
Предпочтительными аналогами являются ВАЕГ-К или его биологически активные фрагменты, последовательности которых отличаются от последовательности 8ЕО ГО N0:1 благодаря одной или нескольким заменам консервативных аминокислот, либо благодаря одной или нескольким заменам, делециям или вставкам неконсервативных аминокислот, которые не разрушают активность ВАГГ-лиганда. Консервативными заменами обычно являются замены одной аминокислоты на другую с аналогичными свойствами, например, замены внутри следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.
Применения
Полноразмерный ген ВАЕГ-К (8Е0 ГО N0:2) или его части могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов для библиотеки кДНК в целях выделения, например, других генов, которые имеют нужную последовательность, идентичную последовательности ВАГГ-К, описанной в 8Е0 ГО N0:2. Нуклеотидные последовательности, кодирующие ВАГГ-К, могут быть также использованы для конструирования гибридизационных зондов для картирования гена, кодирующего ВАГГ-К, и для генетического анализа индивидуумов с генетическими нарушениями. Скринирующие анализы могут быть разработаны для обнаружения основных соединений, имитирующих биологическую активность ВАГГ-К. Такими скринирующими анализами являются анализы, применимые для высокопроизводительного скрининга химических библиотек, что делает их особенно подходящими для идентификации небольших молекул-кандидатов на лекарственное средство. Указанными небольшими молекулами являются синтетические органические или неорганические соединения. Нуклеиновые кислоты, кодирующие ВАГГ-К или его модифицированные формы, могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных или нокаут-животных, которые, в свою очередь, могут быть использованы для разработки и скрининга терапевтически эффективных реагентов.
Как описано в настоящей заявке, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способам стимуляции роста В-клеток, роста и созревания В-клеток, индуцированных дендритными клетками, или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАЕЕ-Я, или ко-стимуляции роста В-клеток, роста и созревания В-клеток, индуцированных дендритными клетками, или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАЕЕ-Я и антитела против антигена Т, лиганда СЭ40 или антиСО40-лиганда. Подходящими являются также способы ингибирования роста В-клеток, роста и созревания В-клеток, индуцированных дендритными клетками, или продуцирования иммуноглобулина у животного с использованием полипептида ВАЕЕ-Я.
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способам использования ВАЕЕ-Я для лечения аутоиммунных болезней, гипертонии, сердечнососудистых расстройств, почечных заболеваний, лимфопролиферативных заболеваний, ассоциированных с В-клетками, иммуносупрессорных заболеваний, нарушений при трансплантации органов, воспалений и ВИЧ-инфекций. Подходящими также являются методы использования агентов для лечения, подавления или модификации иммунного ответа, участвующего в пути передачи сигнала между ВАЕЕ-Я и его лигандом.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид ВАЕЕ-Я и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители для полипептида ВАЕЕ-Я и их композиции описаны, например, в Яетшд!оп'к РЬагтасеибса1 8с1епсек, 16'1' еб., 1980, Маск РиЬПкйтд Со., еббеб Ьу Ок1о е! а1. Обычно для приготовления изотонической композиции используют соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли. Примерами такого носителя являются буферы, такие как физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН данного раствора предпочтительно составляет примерно от 5 до 8, а более предпочтительно - примерно от 7,4 до 7,8. Кроме того, могут быть использованы носители для приготовления препаратов пролонгированного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, где указанные матрицы могут быть изготовлены в виде изделия определенной формы, например, в виде липосом, пленок или микрочастиц. Для каждого специалиста очевидно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимого полипептида ВАЕЕ-Я.
Введение может быть осуществлено посредством инъекции (например, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной) или другими методами, такими как инфузия, которая обеспечивает доставку лекарственного препарата в кровоток в эффективной форме.
Для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы, если это не оговорено особо, стандартные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам. Указанные методы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб еббюп. (8атЬгоок, Еп!ксй апб Матабк, ебк.). Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1989; ΌΝΛ С1ошпд, Уо1итек I апб II (Ό.Ν. С1оуег, еб), 1985; ОЬдопцс1ео!1бе 8уп!йек1к, (М.1. Саб, еб.), 1984; и.8. Ра!еп! №. 4,683.195 (МцШк е! а1.,); №с1ек Ас1б НуЬ^^б^ζаί^оη (ВГО. Натек апб 8.1. Шддшк, ебк.), 1984; ТгапкспрЬоп апб Тгапк1абоп (В.И. Натек апб 8.1. Шддтк, ебк.), 1984; Си1!иге оГ Ашта1 Се11к (Я.1. Егекйпеу, еб). А1ап Я. Ыкк, 1пс., 1987; ЬптоЫГОеб Се11к апб Еηζутек, 1ЯЬ Ргекк, 1986; А Ргас!1са1 Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошпд (В. РегЬа1), 1984; Ме!йобк т Еηζуто1оду, Уо1итек 154 апб 155 (\Уи е! а1., ебк), Асабетю Ргекк, №\ν Уогк; Сепе ТгапкГег Уес!огк Гог МаттаНап Се11к (ЕН. МШег апб М.Р. Са1ок, ебк.), 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу; 1ттипосйет1са1 Ме!йобк т Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб \Уа1кег ебк.), Асабетк Ргекк, Ьопбоп, 1987; НапбЬоок оГ Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек IIV (ОМ. XV ей апб С.С. В1аск™е11, ебк.), 1986; Машри1абпд 1Ье Мойке ЕтЬгуо, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1986.
Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.
Примеры
Пример 1. Детекция связывания ВАЕЕ с ВАЕЕ-Я с использованием анализа на планшетах.
В этом примере описано связывание ВАЕЕ с ВАЕЕ-Я-трансфицированными клетками с использованием анализа на планшетах.
Полноразмерный ВАЕЕ-Я человека генерировали из ро1уА + РНК В1АВ с использованием набора для предварительной амплификации 8ирегкспр!П (ЫГе Тесйпо1од1ек) в целях генерирования кДНК-матрицы и амплифицировали посредством РГи1 с использованием праймеров, комплементарных 5'- и 3'-кодирующим последовательностям ВАЕЕ-Я. ПЦР-продукт был клонирован в СН269, производное рСЕР4 (I пу1!годеп). Полученный клон обозначали р18Т535. Эмбриональные клетки почек человека, содержащие ген ЕВNΛ-1 (293ЕВNΛ), высевали в 6луночные планшеты, сенсибилизированные фибронектином, и трансфицировали липофектамином (ЫГе Тесйпо1од1ек) с использованием либо р18Т535 при различных разведениях, либо СН2 69 в качестве фонового контроля. Через 48 ч после трансфекции трансфицированные клетки анализировали на их способность к связыванию с растворимым Пад-ЬВАЕЕ (аминокислоты Ь83-Ь825) следующим образом. Все инкубации проводили при комнатной температуре. Кондиционированные среды отсасывали из лунок, и клетки промывали буфером ВНА (20 мМ НЕРЕ8, рН 7,0, 0,5 мг/мл В8А, 0,1 % ΝϋΝ3) и инкубировали в присутствии 0,5 мкг/мл РЬАСЬВАРР, разведенном в РВ8, содержащем 1 мМ МдСЕ, 1 мМ СаС12 и 0,1% ΝαΝ3. После инкубирования в течение 1 ч раствор ВАРР удаляли, и клетки промывали ВНА. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин в растворе РВ8, содержащем 1 мкг/мл моноклонального антитела против РЬАС, М2 (81дта). Этот раствор отсасывали, и клетки промывали ВНА. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин в разведении 1:3000 конъюгированного с щелочной фосфатазой козьего Р(аЬ')2 против мышиного 1дС (1асквои 1ттииоЯе5еагск). Этот раствор отсасывали, и клетки промывали ВНА. Для снижения фонового окрашивания, вызываемого эндогенной щелочной фосфатазой, клетки инкубировали в течение 15 мин в 2,5 мМ левамизола (Уес!ог ЬаЬогакпев), разведенного в 100 мМ №С1, 100 мМ Трис-С1, рН 9,5 и 5 мМ МдС12. Для хромогенной детекции щелочной фосфатазы, раствор ингибитора отсасывали, и клетки инкубировали с раствором быстрого красного и нафтолфосфата (Р1егсе). Окрашивание наблюдали и фотографировали на микроскопе низкой мощности.
Осаждение быстрого красного красителя наблюдали во всех лунках, трансфицированных ВАРР-Я-экспрессирующей плазмидой, ρ18Τ535. Частота сигнала, титрованного как количество плазмиды, трансфицированной в клетки, снижалась. При этом для клеток, трансфицированных контрольным экспрессирующим вектором, СН269, какого-либо окрашивания не наблюдалось. Не наблюдалось также окрашивания и на любых трансфицированных клетках, у которых, по схеме окрашивания, отсутствовали Дад11ВАЕЕ или в случае, когда Дад-ЬВАРР был заменен на другой лиганд, член семейства ΤΝΕ, РЬАС-меченный ЫСНЯ Поэтому окрашивание ВАРР-Я-трансфицированных клеток ВАРР является специфическим.
Пример 2. Связывание ВАРР с ВАРР-Ятрансфицированными клетками в анализе РА8С.
В этом примере описана детекция связывания ВАРР с ВАРР-Я-трансфицированными клетками с использованием анализа РА8С.
Плазмиду, кодирующую полноразмерный ВАРР-Я, ρ18Τ535, трансфицировали в клетки 293ЕВNА с использованием РиСепеб (ВоеЬпидег МаииЫет). Через 24 или 48 ч после трансфекции клетки удаляли из планшетов с использованием 5 мМ Е^ΤА в РВ8 и подсчитывали. Эти клетки два раза промывали РА8Сбуфером (РВ8, содержащим 10% фетальную бычью сыворотку, 0,1% NаN3 и 10 мкг/мл ЫдС (1асквои 1ттииоЯе5еагск), а затем 2,5 х 105 клеток инкубировали в течение 1 ч на льду вместе с Дад-ЬВАРР, разведенным в РА8С-буфере при концентрациях в пределах от 9 мкг/мл до 0,037 мкг/мл. Эти клетки промывали РА8С-буфером и инкубировали с моноклональным антителом против РЬАС, М2, при концентрации 5 мкл/мл в течение 30 мин на льду. Эти клетки промывали РА8С-буфером и инкубировали в течение 30 мин на льду в растворе, содержащем разведенный 1:100 Я-фикоэритрин, конъюгированный с Р(аЬ')2-фрагментом ослиного антитела против мышиных 1дС и 10 мкг/мл 7-ААЭ. После промывки клеток РА8С-буфером их ресуспендировали в РА8С-буфере, содержащем 1% параформальдегида. В результате РА8С-анализа 7-ААЭположительные клетки (погибшие) были отсортированы.
Результаты РА8С-анализа показали, что фракция клеток, трансфицированных ВАРР-Я, способна связываться с ВАРР. При концентрации ВАРР 9 мкг/мл примерно 28% клеток связываются с ВАРР со средней интенсивностью флуоресценции (МР1) 366. При использовании одного РЕ-меченного ослиного антимышиного реагента значительного сдвига клеток не наблюдали. Только 1,3% клеток имели МР1=23,5, при этом среднее значение для всех клеток составляло 5,5. Сигнал от ВАРР-Ятрансфицированных клеток давал титры со снижающимися количествами ВАРР. При 100 нг/мл, 8,76% клеток имели МР1=78,9.
Пример 3. РА8С-анализы на ВАРР/ВАРРЯ-взаимодействие, включающие маркер СРР.
В этом примере описана способность ВАРР связываться с клетками, котрансфицированными ВАРР-Я и репортерной плазмидой СРР.
Клетки 293ЕВNА трансфицировали ρ18Τ535 и репортерной плазмидой СРР, как описано в примере 2. Репортерная плазмида кодирует заякоренную на мембране молекулу СРР. С использованием ко-трансфекции двух плазмид авторы настоящего изобретения проанализировали процент трансфицированных клеток, которые способны связываться с ВАРР. Эти клетки удаляли из планшетов и подвергали связыванию с ВАРР и детекции, как описано в примере 2. И снова, 7-ААЭ включали для того, чтобы выявить погибшие клетки. Образцы анализировали с помощью РА8С и строили кривые. Верхний правый квадрант представляет клетки со связанным ВАРР (фикоэритринположительные) и экспрессирующие СРР.
Хотя не все СРР-трансфицированные клетки обнаруживали связанный ВАРР, однако в верхнем правом квадранте присутствовала значительная фракция клеток по сравнению с контролем. В этом верхнем правом квадранте имелось тридцать три процента трансфицированных клеток, тогда как контроль давал 8 процентов. Возможно, что для определенного уровня экспрессии ВАРР-Я необходимо, чтобы ВАРР связывался с данными клетками. Возможно также, что для высокоаффинного взаи модействия нужен ко-рецептор, и что этот рецептор является ограничивающим на клетках 293ЕВт.
Пример 4. Иммунопреципитация ДадйВАРР с использованием гибрида ВАРР-В-Рс.
В этом примере описано специфическое взаимодействие Дад-йВАРР с ВАРР-В-Рс, молекулой, состоящей из цистеин-богатого домена (СВБ) ВАРР-В, образующего гибрид с Рсдоменом человеческого 1дС1.
СВБ ВАРР-В генерировали с помощью ОТ-ПЦР из ро1уА + РНК В1АВ. как описано в примере 1 с использованием 3'-олиго-праймера, комплементарного нуклеотидам 132-152 кодирующей последовательности йВАРР-В. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в СН269 ниже сигнальной последовательности каппацепи мышиного 1дС и выше Рс-части 1дС человека. Эту контрукцию обозначали р18Т538. Конструкцию р18Т538 или СН269 трансфицировали в клетки 293ЕВNА с помощью липофектамина. Кондиционированную среду и клеточные экстракты собирали через 20 часов после трансфекции. Клетки солюбилизировали в 20 мМ Триса, рН 7,5/50 мМ ЖС1/0,5% ΝΡ40/0,5% дезоксихолиновой кислоты и дебрис центрифугировали. Аликвоту кондиционированных сред и клеточных экстрактов объединяли с равным объемом 2х ДСН-редуцирующего буфера, кипятили и подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и вестерн-переносу. Для подтверждения экспрессии мембрану зондировали разведенным 1:3000 мышиным антителом против человеческих 1дС, конъюгированным с пероксидазой хрена (ПХ), в 5% обезжиренном сухом молоке в ТВ8Т при комнатной температуре в течение 30 мин, и промывали ТВ8Т. Блоты проявляли с использованием ЭХЛ (Атегкйат) и экспонировали с пленкой.
Иммунопреципитацию осуществляли путем инкубирования 25 нг Дад-йВАРР или ДадйТХУЕАК с 0,5 мл кондиционированной среды от клеток 293ЕВNА, трансфицированных либо р18Т538, либо СН269, при 4°С в течение 1 ч при помешивании, с последующим добавлением 30 мкл Белка А-Сефарозы (Рйагтааа) и непрерывным помешиванием в течение ночи. Гранулы Белка А-Сефарозы дважды промывали РВ8 и ресуспендировали в 2х ДСН-восстанавливающем буфере для образца. После электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-переноса, блоты инкубировали с 5 мкг/мл моноклонального антитела против Дад М2 (81дта), в 5%-ном обезжиренном сухом молоке в ТВ8Т при комнатной температуре в течение 1 ч. Блоты промывали ТВ8Т и инкубировали с разведенным 1:3000 козьим антителом против мышиных 1дС, конъюгированным с ПХ (басккоп 1ттипогекеагсй) , в 5% обезжиренном сухом молоке в ТВ8Т при комнатной температуре в течение 30 мин. Блоты проявляли с использованием ЭХЛ (Атегкйат) и экспонировали с пленкой.
После трансфекции р18Т538 в клетки 293ЕВNА экспрессию белка с молекулярной массой приблизительно 43 кДа определяли в клеточном экстракте и в кондиционированной среде путем Вестерн-блот-анализа с использованием мышиного античеловеческого 1дС (басккоп 1ттипогекеагсй), что указывало на то, что гибрид ВАРР-В-Рс был эффективно экспрессирован и секретирован.
При иммунопреципитациях полосу наблюдали только в результате инкубирования ВАРРВ-Рс и Р1ад-йВАРР. Эта полоса мигрировала вместе с непосредственно загруженным образцом Дад-йВАРР. Ни одна из других дорожек не продуцировала сигнал, что указывало на то, что слияние ВАРР-В-Рс с Дад-йВАРР является специфическим.
Пример 5. Генерирование растворимых форм рецептора.
Для получения ингибитора рецептора в целях его введения человеку необходима кДНКпоследовательность внеклеточного домена рецептора человека. Если мышиная форма является известной, библиотеки кДНК человека скринируют с использованием мышиной кДНКпоследовательности, и такие манипуляции являются рутинными для специалистов в этой области. С использованием кДНК-последовательности человека можно сконструировать олигонуклеотидные праймеры для ПЦРамплификации внеклеточного домена рецептора в отсутствии трансмембранных и внутриклеточных доменов. Обычно большинство аминокислот включают между последним дисульфидом, связанным с доменом ΊΝΕ, и трансмембранным доменом. Для оптимизации активности полученного растворимого рецептора количество областей стебля можно варьировать. Этот амплифицированный участок должен быть сконструирован так, чтобы он включал в себя подходящие сайты рестрикции, что позволило бы его клонировать в различные С-концевые 1дслитые химерные векторы. Альтернативно, у 3'конца можно встроить стоп-сигнал и получить растворимую форму рецептора, не прибегая к технике с использованием 1д-слитой химеры. Полученные векторы могут быть экспрессированы в большинстве систем, используемых в биотехнологии, включая дрожжи, клетки насекомых, бактериальные клетки и клетки млекопитающих, и такие примеры существуют для экспрессии всех типов экспрессии. При необходимости, для оптимизации или удаления взаимодействий между РсВ и комплементом, различные домены Рс человека могут быть связаны. Альтернативно, мутированные формы этих Рс-доменов могут быть использованы для селективного удаления взаимодействий между РсВ или комплементом, или для присоединения Ν-связанных сахаров к домену Рс, что имеет некоторые преимущества.
Пример 6. Генерирование антителагонистов и антител-антагонистов.
Вышеописанные растворимые формы рецепторов могут быть использованы для иммунизации мышей и для получения моноклональных антител стандартными методами. Полученные тАЬк, которые идентифицируются методами ЕЫ8А, могут быть затем скринированы на их агонистическую активность либо как растворимые антитела, либо как антитела, иммобилизованные на пластиковой подложке, в различных клеточных анализах ίη νίΐτο. Часто гибель клеточной линии НТ29 представляет собой удобную систему, которая является чувствительной к передаче сигнала через множество рецепторов ΤΝΓ. Если эта линия не имеет нужного рецептора, то полноразмерный рецептор может быть стабильно трансфицирован в клеточную линию НТ29, что позволило бы в данном случае проводить анализ на цитотоксичность. Альтернативно, указанные клетки могут быть использованы в аппарате Су!окепког, с тем, чтобы определить, может ли активация данного рецептора выявить изменение рН, указывающее на событие передачи сигнала. Рецепторы семейства ΤΝΓ передают сигнал в таком формате достаточно хорошо, и этот способ не требует знания о действительных биологических событиях, запускаемых данным рецептором. Для клинического применения тАЬк-агонисты должны быть гуманизированными. Эта процедура может быть также использована для определения тАЬк-антагонистов. Такие тАЬк должны быть определены по отсутствию агонистической активности и по способности ингибировать взаимодействие рецептора с лигандом, прослеживаемой с помощью ЕБ18А, метода классического связывания или метода В1Асоге. И наконец, индуцирование секреции хемокина различными клетками в ответ на антитело-агонист может быть положено в основу скринирующего анализа.
Пример 7. Скрининг ингибиторов взаимодействия рецептор-лиганд.
С использованием слитого белка рецептор-1д можно подвергнуть скринингу любые комбинаторные библиотеки на предмет определения молекул, которые могут непосредственно связываться с рецептором. Эти молекулы затем могут быть протестированы в форматированном ЕБ18А-анализе с использованием слитого белка рецептор-1д и растворимой формы лиганда на их способность ингибировать взаимодействие рецептора с лигандом. Указанный ЕЫ8А может быть использован непосредственно для скрининга библиотек различных природных продуктов, например, на присутствие ингибирующих соединений. Этот рецептор может быть трансфицирован в клеточную линию, такую как линия НТ29 для разработки биологического анализа (в данном случае цитотоксичности), кото рый может быть затем положен в основу скринирующего анализа.
Пример 8. ВАЕЕ-В-1д6 приводит к снижению числа В-клеток у нормальных мышей.
8-Недельных самок мышей ВАЕВ/с закупали в лаборатории Джексона (ТЕе 1асккоп ЬаЬога!оту) (Ваг НагЬог, МЕ). Мышам (3 на группу) внутрибрюшинно (ί.ρ.) вводили либо РВ8, либо 400 мкг человеческого гибридного белка ВАЕЕ-В-Еи1д61 (ЕВАЕЕ-В-1д) (поставляемого Тегека СасЕего, Вюдеп), либо 400 мкг очищенного человеческого 1дС (Ни1дС) (8апбо/, Ваке1, 8\\'Ц/ег1апб) на дни -8, -5, -1 и +2. Мышам вводили 100 мкл 10% овечьих эритроцитов (8ВВС) (Со1отабо 8етит Сотрапу, Оепуег, СО) на день 0.
После умерщвления кровь посредством сердечной пункции собирали в пробирки, содержащие ЕЭТ, и эритроциты подвергали лизису в гипотоническом буфере. Кровь также собирали без ЕЭТА для получения сыворотки. Из селезенки и мезентериальных лимфоузлов (МЛУ) приготавливали суспензии из одиночных клеток, и эритроциты лизировали в гипотоническом буфере. Проточную цитометрию осуществляли с использованием РЕ-конъюгированного антитела против СО45В/В220, антитела против синдекана/СО138 и антитела против В7.2 и Е1ТС-конъюгированного антитела против 1дМ и антитела против СО45В/В220. Все тАЬк закупали у фирмы РЕатттдеп (8ап П1едо, СА). Вкратце, Ес-рецепторы блокировали 10 мкг/мл Ес В1оск (Ркатттдеп) в течение 15 мин на льду, а затем добавляли РЕ- и ФИТС-конъюгированные моноклональные антитела (тАЬ) и инкубировали на льду в течение 20-30 мин. Клетки промывали 1 х и суспендировали в 0,5% параформальдегиде. Данные клеточной флуоресценции определяли на проточном цитометре ЕАС8Са11Ьиг™ (ВесЮп Оюкткоп, 8ап 1оке, СА) и анализировали с использованием программного обеспечения СЕБЕ-Оией'1™ (ВесЮп Оккткоп).
После обработки ЕВАЕЕ-В-1д наблюдалось приблизительно 50% снижение числа В-клеток в периферической крови и в рассматриваемых периферических лимфоидных органах.
В220 |дМ-В -клетки, по оценкам, составляли 23,4% и 21,5% клеток в РВ8обработанных и Ни1дС-обработанных мышах, соответственно, тогда как эта популяция у ЕВАЕЕ-В-1д-обработанных мышей была представлена только 9,9%-ми клеток. Очевидно, что число клеток плазмы (синдекан/СО138+) слегка уменьшалось, составляя 5,7% и 4,8% в крови РВ8-обработанных и Ни1д6-обработанных мышей, соответственно, тогда как у ЕВАЕЕ-В-1добработанных мышей оно составляло 3,9%. Молекула В7.2 была активирована на 3,1% и 4,5% В220+-клеток у РВ8-обработанных и Ни1д6обработанных мышей, соответственно, а у йВАРР-ВПд-обработанных мышей она была активирована на 1,9% клеток.
В селезенке число В220Ь1дЬ-В-клеток заметно снижалось у кВАРР-ВЧд-обработанных мышей и составляло 18,8%, тогда как у РВ8обработанных и Н^дО-обработанных мышей оно составляло 36,7% и 40%, соответственно. Спад наблюдался у обеих IдМЬ18Ь и [дМ|о“субпопуляций (см. табл. 8А) . Каких-либо изменений в новообразованном В-клеточном компартменте в селезенке, В220Iο'“[дМι^Iι. не наблюдалось (данные не приводятся). Число клеток плазмы (синдекан/СО138+) слегка уменьшалось и составляло 3,3% и 3,4% в селезенке РВ8-обработанных и НШдС-обработанных мышей, соответственно, тогда как у йВАРР-ВЧд-обработанных мышей оно составляло 2,4%.
В МЛУ наблюдалось снижение числа В220+-В-клеток, которое составляло 14,1% у йВАРР-ВЧд-обработанных мышей, тогда как у РВ8-обработанных и НШдС-обработанных мышей оно составляло 26,7% и 35,8%, соответственно. Данные систематизированы в табл. 8 А.
Таблица 8А. Популяция В-клеток у НВАГГ-К-Тд-, РВ8- и НиТдО-обработанных мышей1
Кровь В220Ь1дЬ Ь'.М '' Синдекан В7./В2201°”
РВ8 23,4 ±5,7 5,7 ±1,5 3,1 ±0,5
Ни^О 21,5±4,5 4,8 ±0,9 4,5 ±1,0
ЬВАРГ-ВЛд 9,9 ±1,8 3,9 ±0,6 1,9 ±0,5
Селезенка В220ь‘дЬ АМ В2201°” μ\Γ Синдекан
РВ8 27,8 ±1,6 11,9 ± 1,6 3,3 ±0,8
НШцО 30,5± 2 11,8 ±1,0 3,4 ±0,7
ЬВАРГ-ВЛд 10,6 ±0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ±0,2
В220+
РВ8 26,7
Ни1дО 35,8 ± 3,3
ЬВАРР-К-Цй 14,1 ±5,9
1 Мышей обрабатывали как описано в разделе Материалы и методы, и данные приведены как процент ± стандартное отклонение
Сниженный процент В7.2+-В-клеток из числа клеток крови и плазмы в крови и селезенке йВАРР-ВЧд-обработанных мышей после иммунизации 8ВВС дает основание предположить, что имеет место ингибирование активации и/или созревания В-клеток, и потенциально повышенная элиминация активированных Вклеток. Очень небольшой процент антигенспецифических В-клеток должен быть активирован и они должны реагировать на любой антиген, в данном случае на 8ВВС. Поскольку НВ АРР-В^-обработка приводит к такому резкому снижению процента В-клеток во всех оцениваемых тканях, ~50%, то очевидно, что активность йВАРР-ВЧд также направлена на покоящиеся зрелые В-клетки.
Поэтому предполагается, что слитый белок ВАРР-В может быть использован в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения В-клеточно-опосредованных заболеваний. Указанными заболеваниями являются аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка, тяжелая миастения, аутоим мунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, синдром антифосфолипидных антител, болезнь Шага, болезнь Грэйвса, гранулематоз Вегенера, узелковый полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Данный терапевтический агент также используется для лечения расстройств, связанных с клетками плазмы, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрёма, болезнь тяжелых цепей, первичный или иммуноцитоассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МГНЭ). Онкологическими мишенями являются В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы.
Пример 9. Блокирование ВАРР-индуцированной пролиферации В-клеток ίη νίΐτο с использованием растворимого ВАРР-В.
В этом примере авторами изобретения было показано, что растворимый гибридный белок ВАРР-В:ЫдО1 способен блокировать ВАРРиндуцированную пролиферацию В-клеток в мышиных спленоцитах.
Спленоциты мышей Ва1Ь/С (5 х 105 клеток/мл) выделяли и культивировали в 96луночном планшете в 100 мкл ВРМI (Ьйе ТесНпо1од1ек), в которую были добавлены 10% фетальная телячья сыворотка (1ВН), 2 мМ глутамин, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Ьйе ТесЬпо1од1ек). Затем добавляли различные количества ВАРР человека, 10 мкг/мл человеческого ВАРР-В:ЫдО1 или человеческого Ιβ, а также 10 мкг/мл антимышиной поверхностной тяжелой μ-цепи (1асккоп ^тцпо Векеагск). После выдерживания в культуре в течение 48 ч при 37°С клетки подвергали импульсному мечению 1 мкКи/лунку [метил-3Н]тимидина (Пироп! в течение 24 ч и собирали с использованием коллектора клеток Тот!ес (0гапде, СТ). Радиоактивность измеряли на жидком сцинтилляционном счетчике Ве!ар1а!е (РНагтас1а Вю!ес11).
На фиг. 8 показаны результаты анализа пролиферации спленоцитов. На этой фигуре показано число импульсов в минуту (имп./мин.), включенных в клетки спленоцитов мышей, в зависимости от количества добавленного реагента ВАРР. Уровень анти^-антитела или слитого белка, либо контрольного ЫдС поддерживался постоянным при 10 мкг/мл. Заштрихованные квадраты означают уровень пролиферации, индуцированный лишь ВАРР. Заштрихованные кружки означают пролиферацию клеток с использованием ВАРР и анти^-антитела. Кривая с незаштрихованными треугольниками означает ингибирование, наблюдаемое при добавлении ВАРР-В:ЫдО1ВАРР с анти^-антителом + ВАРР-В:ЫдО1. Незаштрихованный ромб означает ингибирование, наблюдаемое с использованием контрольного Ιμ человека.
Добавление ВАРЕ вместе с анти-μантителом приводит к пролиферации спленоцитов мышей ίη νίΐτο. Уровень 3Н-тимидина, включенного в эти клетки, значительно превышает уровень, полученный при добавлении к спленоцитам либо только ВАРЕ, либо только анти^-антитела. Обработка спленоцитов только ВАЕЕ приводит лишь к включению 3Нтимидина в очень высоких концентрациях. Добавление только анти-μ-антитела не приводит к пролиферации. При добавлении к спленоцитам 10 мкг/мл контрольного человеческого 1д с увеличивающимися количествами ВАРЕ и 10 мкг/мл анти-μ-антитела происходит умеренное снижение уровня пролиферации. В противоположность этому, в данном анализе при введении 10 мкг/мл человеческого гибридного белка ВАРЕ-К:ЫдО1 при тех же условиях, уровень пролиферации снижался до уровня, наблюдаемого в случае обработки лишь одним ВАРЕ. Это указывает на то, что гибридный белок ВАРРК:ЫдО1 обладает способностью к ингибированию пролиферации спленоцитов, индуцированных ВАРЕ и анти^-антителом.
Пример 10. Блокирование связывания ВАРЕ с КаД-клетками с использованием ВАРЕК:Ы§С1.
В этом примере описано предварительное инкубирование ВАРР со слитым белком ВАРРК:ЫдО1, приводящее к снижению связывания ВАРЕ с В-клеточной линией лимфомы КаД.
В этом ЕАС8-анализе 200 нг/мл ЕЬАОмеченного человеческого ВАРР предварительно инкубировали либо с человеческим ВАРРК:ЫдО1, либо с человеческим ЬТвК:ЫдО1, при двукратных разведениях в пределах от 20 мкг/мл до 39 нг/мл, либо без слитого белка, в течение 30 мин на льду. Инкубирование проводили в ЕАС8-буфере, содержащем РВ8 без Са2+ или Мд24 с добавлением 10% ЕС8 (1КН) и 0,05%-ного азида натрия. После предварительного инкубирования смесь ВАРР-слитый белок добавляли к 5 х 106 КаД-клеток(АТСС)/мл. Это инкубирование проводили в течение 30 мин на льду, а затем, клетки промывали 2 мл ЕАС8буфера при 4°С. Для детекции связанного ВАРЕ к клеткам добавляли 5 мкг/мл антитела М2 против ЕЬАО (81дта) и инкубировали в течение 30 мин на льду. Полученные клетки снова промывали, как описано выше, а затем инкубировали при разведении 1:100 с РЕ-конъюгированным ослиным антителом против мышиных 1д (1асккоп 1ттипо КезеагсД) в течение 30 мин на льду. После повторной промывки ЕАС8-буфером эти клетки фиксировали с использованием 1% параформальдегида и считывали на ЕАС8® (Весΐοη И1ск1п8оп & Со.).
На фиг. 9 показаны результаты анализа на блокирование ВАРР. На этой фигуре показаны данные считывания МЕ1 (средней интенсивности флуоресценции), полученные в результате проведения ЕАС8®-анализа, указывающего на связывание ВАРЕ с КаД-клетками. Заштрихованные квадраты соответстуют данным, полученным при предварительном инкубировании ВАРЕ-К:ЫдО1 с ВАРЕ перед связыванием с этими клетками. Кружки показывают кривую, полученную после добавления неспецифического слитого человеческого белка ЬТвК:ЫдО1 к ВАРР. На оси х представлено количество слитого белка, добавленного к 200 нг/мл ВАРР перед инкубированием с клетками.
Если слитый белок не был предварительно инкубирован с человеческим ВАРР, то средняя интенсивность флуоресценции (МЕ1) образца составляла 80. Если человеческий ЬТвК:ЫдО1 предварительно инкубировали с ВАРР, даже при 20 мкг/мл, то детекция связывания ВАРР с клетками КаД не изменялась. Однако если человеческий ВАРЕ-К:ЫдО1 предварительно инкубировали с ВАРЕ, то МЕ1 значительно снижалась до 2-25 даже при 625 нг/мл слитого белка. Фоновое значение МЕ1 в данном эксперименте составляло 7. Таким образом, ВАРЕ-К:ЫдО1 является очень эффективным для блокирования связывания ВАРЕ с клетками КаД.
Пример 11. ВАРЕ-К-1дО способствует ослаблению аутоиммунных расстройств типа красной волчанки у трансгенных мышей.
В этом примере описано действие ВАРР-К, направленное на снижение пула периферических В-клеток и ингибирование развития спленомегалии и нефрита.
В данном эксперименте использовали пятимесячных трансгенных (Тд) ВАРЕ-мышей (С57ВБ/6) и пометы соответствующего возраста. ВАРЕ-Тд-мыши обнаруживали лимфатические расстройства и их аутоиммунный фенотип был аналогичен таковому при системной красной волчанке (Маскау е1 а1., 1999). Этот фенотип соответствовал популяциям с повышенным числом периферических В-клеток, включая переходные клетки 1 (Т1) и 2 (Т2), зрелые клетки (М), клетки маргинальной зоны (М2) и клетки СЭ1'/ 1дМЬ1дЬ-В-клетки.
Мышам внутрибрюшинно вводили РВ8, 400 мг очищенного человеческого 1дО (Ыд) (Запбох, Вазе1, 8\\'Цхег1апб)(3/группу) или 400 мкг слитого белка ВАРЕ-К-йи1дО1 (ЬВСМА1д)(2/группу), происходящего из СНО, в дни 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, а на 40-й день мышей умерщвляли.
Сразу после умерщвления определяли вес селезенки, и после лизиса эритроцитов в гипотоническом буфере приготавливали суспензию из одиночных клеток. Проточную цитометрию осуществляли с использованием ФИТС-конъюгированного антитела против СИ21/СИ35, РЕконъюгированного антитела против 1дИ и против СИ1, конъюгированного с цитохромом антитела против СИ45К/В220 и конъюгированного с биотином антитела против 1дМ. Все тАЬз закупали у фирмы РБагтШдеи (8аи О|едо, СА). Вкратце, Рс-рецепторы блокировали 10 мкг/мл Рс В1оск (РЬагш1идеи) в течение 10 мин на льду, затем добавляли биотин-конъюгированные тАЬ в течение 30 мин на льду, клетки промывали 1х, а затем добавляли РЕ- и ФИТС-, цитохромконъюгированные тАЬ, стрептавидин-АРС и 10 мкг/мл Рс-В1оск. Эти клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, клетки промывали 1 х и суспендировали в 0,5% параформальдегиде. Данные клеточной флуоресценции определяли на проточном цитометре РАС8 СаБЬиг™ (ВесШи ЭккШкои, 8аи 1оке, СА) и анализировали с использованием программного обеспечения СЕБЕ-Оиек!'™ (Весйи Эккткои).
Присутствие белков в мышиной моче измеряли с использованием полос реагента Ми1БкБх 10 86 для анализов мочи (Вауег Согр., П1адиокБск ЭМкюи).
Результаты представлены ниже в табл. 11А и 11В.
Таблица 11 А. Анализ спленоцитов 3-месячных мышей
Всего клеток на селезенку (х106)
Т1 Т2 ΜΖ Зрелый
ВаГГ-Тд-мышей
816Е23 9,4 18 9 91
816Е33 14 30 19 170
816Е99 14 24 19 150
Среднее 13+/2,6 24+/-6 16+/5,7 140+/-41
Контрольные пометы
816Е2 5,3 5,8 3,1 73
816Е4 2,4 3,7 1,9 44
Среднее 3,9+/-2 4,8+/-1,5 2,4+/-1 59+/-20
Спленоциты 3-месячных ВаГГ-Тд-мышей (и=3) и пометов соответствующего возраста (и=2) выделяли и подвергали РАС8-анализу как описано в разделе Материалы и методы. Клетки Т1, Т2, М и ΜΖ определяли по экспрессии нижеследующих поверхностных маркеров (Ш: высокий, 1о: низкий, 1и1: промежуточный):
Т1: Ι§Ό-, ^Μ^11, С1221
ΜΖ: Ι§Ό-, Ι§Μ“, С1221
Т2: Ι§Ό+, Ι§ΜΗ1, С122Г Μ: Ι§Ό+, Ι)Μ , СЭ21
Таблица 11 В. Анализ спленоцитов 10-месячных мышей
Всего клеток на селезенку (х106)
Т1 Т2 ΜΖ Зрелый
ВаГГ-Тд-мышей
802-39 13 100 34 630
823-3-11 7,5 43 6,6 200
823-3-13 3,1 50 15 180
Среднее 7,9+/-4,9 64+/-30 19+/-10 340+/-250
Контрольные пометы
823-3-22 0,7 6,5 1,4 56
802-64 0,28 5,4 1,3 38
823-14-13 0,45 3,4 0,16 38
Среднее 0,48+/-0,21 5,1 +/-1,5 0,95+/-0,65 44+/-10
10-месячных ВаГГ-Тд-мышей (п=3) и пометы соответствующего возраста (п=3) подвергали РАС8-анализу как описано в табл. 11.
После введения БВАРР-КЛд ВаГГ-Тдмышам популяции клеток Т1, Т2, М, ΜΖ и С^1Ь1д17IдΜЫдЬ-В-клеток в селезенке значительно снижались по сравнению с популяциями РВ8- и Ыд-обработанных ВаГГ-Тд-мышей, и общее число Т1, Т2, М, ΜΖ и (ΌΓ'/^ΧΓ'-Η клеток снижалось до уровня, аналогичного уровню клеток у РВ8-обработанных контрольных пометов, или до меньшего уровня (фиг. 10а, 10Ь, 10с).
ВАРР-КЧд-обработка ВаГГ-Тд-мышей приводила к ослаблению ВаГГ-опосредованного аутоиммунного заболевания, о чем свидетельствовало наблюдение того факта, что ВАРР-Кобработанные мыши имели селезенку нормального размера, тогда как контрольные ВаГГ-Тдмыши обнаруживали спленомегалию (фиг. 11). Кроме того, у ВАРР-КЧд-обработанных мышей подавлялось развитие протеинурии как показателя почечной дисфункции, тогда как у контрольных ВаГГ-Тд-мышей развивался нефрит, как было определено по возрастающим уровням протеинурии (фиг. 12).
Мыши, трансгенные по ВаГГ, имели в значительной степени увеличенное число периферических В-клеток, и дополнительный анализ, проведенный авторами настоящего изобретения, выявил преимущественное увеличение субпополяций Т1, Т2, ΜΖ В-клеток у этих мышей. Переходная стадия развития В-клеток (Т1 и Т2) представляет собой контрольную стадию, на которой предположительно происходит элиминация аутореактивных В-клеток. У ВаГГ-Тдмышей было также значительно увеличено число С^1Ь1/IдΜЫдЬ-В-клеток, которые имеют тенденцию оставаться в маргинальной зоне. Было показано, что эта последняя популяция В-клеток представляет собой главный источник продуцирования аутоантител у NΖВ/NΖА-мышей с волчанкой. ВАРР-КЧд-обработка ВаГГ-Тд-мышей приводила к снижению популяций Т1, Т2, М, ΜΖ и СЭ1111 В-клеток до уровня, наблюдаемого в контрольных пометах дикого типа, или до меньшего уровня.
Действие ВАРР-КЧд направлено на снижение пула периферических В-клеток и ингибирование развития спленомегалии и нефрита. Поэтому, помимо его эффективности в лечении системной красной волчанки и волчаночного нефрита, действие ВАРР-КЧд также является эффективным для лечения В-клеточно-опосредованных заболеваний, которые по своей природе являются аутоиммунными, такие как тяжелая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, синдром антифосфолипидных антител, болезнь Шага, болезнь Грэйвса, гранулематоз Вегенера, узелковый полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Данный терапевтический агент также используется для лечения расстройств, связанных с клетками плазмы, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрёма, болезнь тяжелых цепей, первичный или иммуноцитоассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МГНЭ). Онкологическими мишенями являются В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы.
Пример 12. Среднее артериальное давление у трансгенных ВАГГ-мышей.
В этом эксперименте описано измерение кровяного давления у трансгенных ВАГГмышей. Наблюдения, сделанные во время оценки фенотипа трансгенных ВАГГ-мышей, указывали на вероятность гипертонии у этих мышей.
ВаГГ-Тд-мышей, описанных выше, анестезировали кетамином. Левую сонную артерию обнажали посредством надреза на шее. В эту сонную артерию вставляли катетер для измерения кровяного давления и частоты сердечных сокращений. Катетер подсоединяли к датчику давления, и кровяное давление измеряли с использованием системы сбора данных (Ро-№Ма1 Эа1а ΛαμιίδίΙίοη хуЧет апб Сои1б ро1удгарЬ). Исходя из формы зубцов пульсового давления, систолического давления, диастолического давления определяли среднее давление и частоту сердечных сокращений. При этом использовали две группы мышей: трансгенных ВАГГ-мышей (и=8) и контрольных мышей дикого типа (и=9).
На фиг. 13 представлено среднее артериальное давление (МАР в мм рт.ст.) для двух групп. Как показано, трансгенные ВАГГ-мыши имели среднее МАР 102 ± 8 мм рт.ст. Контрольные мыши имели среднее МАР 92 ± 6 мм рт.ст. Таким образом, у ВАГГ-мышей обнаруживалось увеличение МАР на 10 мм рт.ст. по сравнению с контролем, хотя это значение не является статистически значимым (ΛN0VΛ).
Более подробный анализ этих данных представлен на фиг. 14. На этой фигуре представлены результаты анализов, полученных от отдельных животных. У контрольных мышей дикого типа (ВАГГ-) распределение данных соответствует типичному биномиальному распределению. В противоположность этому, давление у трансгенных ВАГГ-мышей (ВАГГ+) было таким, как если бы они были подразделены на две группы, где одна группа имела давление в диапазоне 120-130 мм рт.ст., а другая группа имела давление в диапазоне 80-90 мм рт.ст.
Трансгенные ВАГГ-мыши как популяция имели тенденцию к гипертонии по сравнению с мышами негативного контроля. Анализ отдельных уровней артериального давления показал, что трансгенные ВАГГ-мыши разделялись на две субпопуляции, причем одна из них имела высокое кровяное давление, а другая имела нормальное кровяное давление. В соответствии с этим, введение растворимого ВАГГ-К, гибридного белка или гомолога антитела может ослаблять эффекты гипертонии.
Пример 13. ВАГГ-К-1д-обработка мышей 8ΝΡ] с установленным заболеванием замедляет прогрессирование болезни с развитием тяжелого нефрита.
Самкам мышей со склонностью к волчанке (8\УК х №В)Г1(8№1) , имеющим возраст 21 неделя и обнаруживающим умеренный нефрит (30-100 мг/дл протеинурии), вводили 1.р. 200 мкг гибридного белка человеческого ВАГГ-К1и.11дС (ЬВСМА-1д), человеческого 1д6 (Ни1д6) (8апбох) или 200 мкл РВ8 еженедельно в течение 8 недель. Мочу каждой мыши еженедельно анализировали на протеинурию с использованием А1ЬиШх (Вауег Согр., Тегг^'Ю^п, ΝΥ). Протеинурия свыше 100 мг/мл оценивалась как тяжелый нефрит. ВАГГ-К-1д был продуцирован во временно трансфицированных клетках ЕВNΛ 293. Кондиционированные среды от клеток 293, сверхэкспрессирующих 1ВСМА-1д, загружали на колонку с белком А. Белок элюировали 25 мМ фосфатом, 100 мМ №С1, рН 2,8, а затем нейтрализовали 1/20 объема 0,5М NаР04, рН 8,6. Фракции, отобранные, исходя из ОП280, подвергали электрофорезу в восстанавливающем и невосстанавливающем ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттингу для идентификации очищенного белка.
Через три недели после обработки было установлено, что тяжелый нефрит обнаруживался у 50% мышей, обработанных ВАГГ-К-Тд, и у 75% и 87,5% мышей, которым вводили Ни1дС и РВ8, соответственно (см. фиг. 15). Эти данные показали, что растворимый рецептор ВАГГ, ВСМА-1д, может блокировать опосредованные В-клетками аутоиммунные заболевания, такие как волчаночный нефрит, что приводит к заметному ослаблению прогрессирования данного заболевания.
Пример 14. ВАГГ-К-1д-Обработка нормальных мышей, приводящая к снижению числа дендритных клеток селезенки (ДКС) и их атипической локализации в селезенке.
7-Недельным самкам мышей ВАЬВ/с (3/группу) вводили 1.р. либо 20 мкг или 50 мкг человеческого ВАЕГ-К-Iд61 (ЬВСМА-1д) , либо 50 мкг 1д6 человека (Ни1д6) , либо 100 мкл РВ8 1х/неделю в течение 4 недель. Гибридный белок 1ВСМА-1д очищали из супернатантов культуры стабильно трансфицированной клеточной линии СНО. Через 8 дней после последней инъекции выделяли селезенки и расщепляли коллагеназой (81дта, сак# С-5138) в течение 1 ч при 37°С. Затем получали суспензию из одиночных клеток, эритроциты (КВС) лизировали в гипотоническом буфере, и клетки промывали 3х в РВ8. Спленоциты приготавливали для проточного цитометрического анализа путем окрашивания клеток биотинилированным антителом против СЭ11с, а затем стрептавидином-АРС, конъюгированным с цитохромом антителом против СЭ8а и Г1ТС-конъюгированным антителом против СЭ4 для оценки ДК-популяций.
В отдельном эксперименте самкам мышей ВАЬВ/с (N=3) 1.р. вводили 100 мкг 1ВСМА-1д 1х/неделю в течение 4 недель, после чего селезенки мгновенно замораживали в ОСТ с использованием 2-метилбутана, охлажденного на СО2. Криосрезы разрезали и фиксировали в ацетоне. Срезы инкубировали с биотинилированным ан тите лом против СО 11с, затем со стрептавидином-АР и субстратом ВС1Р (Р1егсе) для визуализации ДК, а после этого с тАЬ МОМА-1, а затем с ПХ-конъюгированным антителом против крысиных 1§С Цасккоп 1тпшпоЯс5сагс11) и субстратом 3,3'-диаминобензидина (81§та, 81.Ьош8 МО, са!.# 0-1293) для визуализации металлофильных макрофагов, и с биотинилированным антителом против СО35, затем со стрептавидинАР и субстратом (набор субстрата щелочной фосфатазы I, Уес!ог са!#8К-5100) для визуализации фолликулярных дендритных клеток (ФДК).
Мыши, обработанные ίη νίνο либо 20 мкг, либо 50 мкг ВСМА-1§ 1х/неделю в течение 4 недель, обнаруживали значимое уменьшение (р<0,05 по т-критерию Стьюдента) в СО 11с + ДК селезенки по сравнению с Ни1§С- и РВ8обработанными контролями. Это уменьшение было очевидным для всех оцениваемых СО 11с + ДК-популяций: СО8а-СО4-, СО8а+СО4-, и СО8а-СО4+ (фиг. 16, табл. 14А).
Таблица 14А. ВАЕЕ-В-1§-обработка приводит к снижению числа ДК селезенки
РВ8 Ни1§О 20 мкг ВСМА-1§ 50 мкг ВСМА-1§
среднее число СО 11 + 1)С3 (х106) ± 81)
СО8а-СО4- 0,81±0,15 0,49±0,07 0,26±0,04 0,35±0,05
СО8а+СО4- 0,36±0,02 0,35±0,07 0,16±0,02 0,2±0,02
СО8а-СО4+ 0,92±0,02 0,84±0,15 0,4±0,06 0,55±0,04
Это снижение числа ДК селезенки, которые являются критическими антигенпредставляющими клетками, может влиять на активацию В-клеток, их созревание и гуморальный иммунитет.
Замороженные срезы мышиной селезенки получали, как описано в разделе Материалы и Методы. ВСМА-1§-обработанные мыши обнаруживали атипический профиль ДК-хоминга при окрашивании антителом против СО 11с. ДК обычно локализуются в Т-клеточной области белой пульпы селезенки и в маргинальной зоне, концентрируясь в канальцах, образующих сетчатую структуру маргинальной зоны. Однако ДК у ВСМА-1§-обработанных мышей были обнаружены по всему периметру маргинальной зоны, и существует некоторая вероятность того, что они затем могут мигрировать в белую пульпу селезенки (данные не показаны). Поэтому блокирование взаимодействия ВАЕЕ/ВАЕЕ-В с растворимым рецептором ВАРЕ очевидно препятствует характеру хоминга ДК, что может повлиять на их способность функционировать в качестве антигенпредставляющих клеток, и, тем самым, повлиять на активацию В-клеток, их созревание и гуморальный иммунитет.
Кроме того, в селезенках ВСМА-1§обработанных мышей отсутствовали СОЗ 5+ РОС, как было определено с помощью иммуногистохимического анализа (данные не показаны). Поскольку РОС осуществляет презентацию антигена В-клеткам в зародышевых центрах (ЗЦ), отсутствие таких клеток может оказывать негативное влияние на структуру ЗЦ и аффинную зрелость В-клеток.
Каждому специалисту очевидно, что в полипептидах, композициях и в способах настоящего изобретения могут быть сделаны различные модификации и изменения, не выходящие за рамки существа или объема настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение охватывает внесенные в него модификации и изменения, при условии, что они не выходят за рамки объема прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.
Список последовательностей <110> МасКау, РаЫеппе
Вго1*п1пд, ЦеСЕгеу
АтЬгозе, СЬггзСхпе
ТзсЬорр, Лигд
ЗсНпехЗег, Разса1
ТЪотрзоп, Ое££геу
ВЬодеп, 1пс.
АроСесЬ Я&В З.А.
<120> Рецептор Вай(ВСМА), иммунорегуляторный агент
<130> А080РСТ
<140> РСТ/и500/22507
<141> 2000-08-16
<150> 60/149.378
<151> 1999-08-17
<150> 60/181,684
<151> 2000-02-11
<150> 60/183,536
<151> 2000-02-18
<160> 8
<170> Еэ5(8Е0 для версии №п<1ом 4.0
<210> 1
<211> 184
<212> рат
<213> Ното зархеп
<400> 1
Мес Ьеи <31п Мес А1а С1у 61п Суз Зег С1п Азп С1и Туг РЬе Азр Зег
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Н13 А1а Суз Не Рго Суз С1п Ьеи Агд Суз Зег Зег Азп ТИг
20 25 30
Рго Рго Ьеи ТЬг Суз С1п Агд Туг Суз Азп А1а Зег νβΐ ТЬг Азп Зег
35 40 45
νβΐ Ьуз С1у ТЬг Азп А1а Не Ьеи Тгр ТЬг Суз Ьеи С1у Ьеи Зег Ьеи
50 55 60
Не Не Зег Ьеи А1а 7а1 РЬе νβΐ Ьеи Мес РЬе Ьеи Ьеи Агд Ьуз Не
65 70 75 80
Зег Зег С1и Рго Ьеи Ьуз Азр С1и РЬе Ьуз Азп ТЬг О1у Зег О1у Ьеи
90 95 лиоирсс.схс
Ьеи С1у Мес А1а 100 Азп Не Азр Ьеи С1и Ьуз Зег Агд ТЬг С1у Азр С1и
105 но
Не Не Ьеи Рго Агд С1у Ьеи С1и Туг ТЬг Уа1 С1и С1и Суз ТЬг Суз
115 120 125
С1и Азр Суз Не Ьуз Зег Ьуз Рго Ьуз 7а1 Азр Зег Азр ΗΪ3 Суз РЬе
130 135 140
Рго Ьеи Рго А1а МеС О1и С1и С1у А1а ТЬг Не Ьеи Уа1 ТЬг ТЬг Ьуз
145 150 155 160
ТЬг Азп Азр Туг Суз Ьуз Зег Ьеи Рго А1а А1а Ьеи Зег А1а ТЬг С1и
165 170 175
Не С1и Ьуз Зег Не Зег А1а Агд
180 <210> 2
<211> 552 <212> ДНК <213> Ьогпо зархеп
<400> 2
аСдССдсада 60 Сдсаеасссс СддсСдддса дСдсСсссаа ааСдааСаСС ССдасадссе дССдсасдсС
дссаасссед аСдССсССсС ааСасСссСс сСсСаасаСд СсаддССаСС
120
дсаасдсаад СдСдассааС СсадСдааад даасдааЕдс дассссссдд асесдсссдд
180 дасСдадсСС 240 ааСааСССсС ССддсадССС СсдСдсСааС дСССССдсСа аддаадасаа
дсЕссдаасс 300 ассаааддас дадсссаааа асасаддаСс аддСсЕссСд ддсасддсСа
асаССдассС 360 ддаааададс аддассддсд асдааассас СсЕссдадад дссссдадса
сасддСддаа 420 даасдсассс дСдаадасСд саСсаададс ааассдаадд СсдасСсСда
ссаССдссСС 480 ссасСсссад сСаСддадда аддсдсаасс аССсСдСсас сасдаааасд
ааСдасСаСС 540 дсаададссС дссадссдсс ССдадСдсСа еддадасада даааЕсаасс
СссдсСаддС 552 аа
<210> 3 <211> 207 <212> РНТ <213> кото зархеп
<400> 3
МеЕ Азр Ткг Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Тгр νβΐ Рго С1у Зег
1 5 10 15
ТЬг С1у МеЕ Ьеи О1п МеЕ А1а С1у С1п Суз Зег С1п Азп 61и Туг Рке
20 25 30
Азр Зег Ьеи Азр Уа1 Ткг МеЕ Ьеи (31п МеЕ А1а О1у С1п Суз Зег С1п
35 40 45
Азп С1и Туг Рке Азр Зег Ьеи Ьеи Нхз А1а Суз Х1е Рго Суз 61п Ьеи
50 55 60
Агд Суз Зег Зег Азп Ткг Рго Рго Ьеи Ткг Суз Ьеи НХЗ А1а Суз Не
65 70 75 80
Рго Суз С1п Ьеи Агд Суз Зег Зег Азп Ткг Рго Рго Ьеи Ткг Суз <31п
85 90 95
Агд Туг Суз Азп А1а Зег Уа1 Ткг Азп Зег Уа1 Ьуз (Ну С1п Агд Туг
100 105 110
Суз Азп А1а Зег Уа1 Ткг Азп Зег νβΐ Ьуз С1у Уа1 Азр Ьуз Ткг НХЗ
115 120 125
Ткг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1
130 135 140
РЬе Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг Ьеи МеЕ Не Зег Агд Ткг
145 150 155 160
Рго О1и Уа1 ткг Суз Уа1 Уа1 νβΐ Азр Уа1 Зег Нхз С1и Азр Рго С1и
165 170 175
νβΐ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг νβΐ Азр С1у νβΐ (31и Уа1 НХЗ Азп А1а Ьуз
180 185 190
Ткг Ьуз Рго Агд С1и С1и 61η Туг Азп Зег Туг Уа1 Уа1 Зег Уа1
195 200 205
<210> 4 <211> 540 <212> ДНК <213> кото зархеп <400> 4 аЕддадасад асасасЕссЕ дЕЕаЕдддЕд сЕдсЕдсЕсЕ дддЕЕссадд ЕЕссасЕддЕ 60 дасдЕсасда ЕдЕЕдсадаЕ ддсЕдддсад ЕдсЕсссааа аЕдааЕаЕЕЕ ЕдасадЕЕЕд 120
ЕЕдсаЕдсЕЕ дсаЕассЕЕд ЕсаасЕЕсда ЕдЕЕсЕЕсЕа аЕасЕссЕсс ЕсЕаасаЕдЕ 180 садсдЕЕаЕЕ дЕааЕдсаад ЕдЕдассааЕ ЕсадЕдааад дадЕсдасаа аасЕсасаса 240
ЕдсссассдЕ дсссадсасс ЕдаасЕссЕд дддддассде садЕсЕЕссЕ сЕЕсссссса
300 ааасссаадд асасссЕсаЕ даЕсЕсссдд ассссЕдадд ЕсасаЕдсдЕ ддЕддЕддас
360 дЕдадссасд аадасссЕда ддЕсаадЕЕс аасЕддЕасд ЕддасддсдЕ ддаддЕдсаЕ
420 ааЕдссаада сааадссдсд ддаддадсад Еасаасадса сдкассдЕдЕ ддЕсадсдЕс
480 сЕсассдЕсс Едсассадда сЕддсЕдааЕ ддсааддадЕ асаадЕдсаа ддЕсЕссаас 540 <210> 5 <211> 140 <212> РНТ <213> кото зархеп <400> 5
Ьеи Ткг Уа1 Ьеи ΗΪ5 61п АЗр Тгр Ьеи АЗП 61у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз
1 5 10 15
Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег
20 25 30
Ьуз А1а Ьуз (31у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг Ткг Ьеи Рго Рго
35 40 45
Зег Агд Азр <31и Ьеи Ткг Ьуз Азп 61п Уа1 Зег Ьеи Ткг Суз Ьеи Уа1
50 55 60
Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Х1е А1а νβΐ 61и Тгр С1и Зег АЗП С1у
65 70 75 80
<31п Рго С1и Азп Азп Туг Ьу5 Ткг Ткг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр
85 90 95
С1у Зег РЬе Рке Ьуз Ьуз Ьеи Ткг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п
100 105 НО
С1у Азп Уа1 Рке Зег Суз Зег Уа1 МеЕ Нхз 61и А1а Ьеи Ηίε Азп НХЗ
115 120 125
Туг Ткг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз
130 135 140
<210> 6 <211> 369 <212> ДНК <213> Ьото зархеп
<400> 6 ааадсссЕсс садсссссаЕ сдадаааасс аЕсЕссааад ссааадддса дссссдадаа
60
ссасаддЕдЕ 120 асасссЕдсс сссаЕсссдд даЕдадсЕда ссаадаасса ддЕсадссЕд
ассЕдссЕдд 180 ЕсаааддсЕЕ сЕаЕсссадс дасаЕсдссд ЕддадЕддда дадсааЕддд
садссддада 240 асаасЕасаа дассасдссЕ сссдЕдЕЕдд асЕссдасдд СЕССЕЕСЕЕС
сЕсЕасадса 300 адсЕсассдС ддасаададс аддЕддсадс •.аддддаасдЕ сЕЕсЕсаЕдс
ЕссдЕдаЕдс 360 аЕдаддсЕсЕ дсасаассас Еасасдсада ададссЕсЕс ссЕдЕсЕссс
дддаааЕда 369
<210> 7 <211> 184 <212> РНТ <213> Ьото зархеп
<400> 7
МеЕ Ьеи 61п МеЕ А1а С1у 61п Суз Зег 61п Азп 61и Туг РЬе Азр Зег
1 5 10 15
Ьеи Ьеи Нх з А1а Суз 11е Рго Су5 (31п Ьеи Агд Суз Зег Зег Азп ТЬг
20 25 30
Рго Рго Ьеи ТЫ Суз (Нп Агд Туг Суз Азп А1а Зег Уа1 ТЬг Азп Зег
35 40 45
Уа1 Ьуз (Пу Ткг Азп А1а 11е Ьеи Тгр Ткг Суз Ьеи <31у Ьеи Зег Ьеи
50 55 60
11е 11е Зег Ьеи А1а Уа1 Рке Уа1 Ьеи МеЕ Рке Ьеи Ьеи Агд Ьуз 11е
65 70 75 80
Зег Зег С1и Рго Ьеи Ьуз Азр <31и Рке Ьуз Азп Ткг 61у Зег С1у Ьеи
85 90 95
Ьеи С1у МеЕ А1а Азп 11е Азр Ьеи С1и Ьуз Зег Агд ТЬг С1у Азр С1и
100 105 110
11е Не Ьеи Рго Агд (Пу Ьеи С1и Туг ТЬг Уа1 С1и С1и Суз ТЬг Суз
115 120 125
<31и Азр Суз 11е Ьуз Зег Ьуз Рго Ьуз Уа1 Азр Зег Азр Нхз Суз Рке
130 135 140
Рго Ьеи Рго А1а МеЕ С1и (Ии С1у А1а Ткг Не Ьеи Уа1 ТЬг Ткг Ьуз
145 150 155 160
Ткг Азп Азр Туг Суз Ьуз Зег Ьеи Рго А1а А1а Ьеи Зег А1а ТЬг С1и
165 170 175
11е С1и Ьуз Зег Не Зег А1а Агд
180 <210> 8 <211> 995 <212> ДНК <213> Ното Зархеп <400> 8 аадасЕсааа сЕЕадааасЕ асасадасад сссссдЕаад 120 адсЕдсЕсЕЕ дсЕдсаЕЕЕд 180 еэеесееесе дЕадсЕсссс 240 дсЕсссаааа ЕдааЕаЕЕЕЕ
300 дЕЕсЕЕсЕаа ЕасЕссЕссЕ 360 садЕдааадд аасдааЕдсд
420
ЕддсадЕЕЕС сдЕдсЕааЕд
480 адСЕЕааааа сасаддаЕса 540 ддасЕддЕда ЕдаааЕЕаЕЕ
600 дЕдаадасЕд саЕсаададс 660 сЕаЕддадда аддсдсаасс
720 сдссадссдс ЕЕЕдадЕдсЕ 780
ЕЕЕсдасЕсд адсадЕдсса 840
ЕсЕЕЕаддаЕ дасЕдЕаЕЕЕ 900 асЕсЕЕЕаЕд ЕЕадаЕаЕаЕ 960 сЕЕддЕЕсса ЕдаЕЕааадЕ 995
ЕдааЕЕадаЕ дЕддЕаЕЕса аасссасдаа дсаддсдаад сЕсЕддааЕЕ сЕЕдЕадада ЕдЕЕЕЕСЕЕЕ ЕЕдЕдаЕсаЕ дасадЕСЕдЕ ЕдсаЕдсЕЕд сЕаасаЕдЕс адсдЕЕаЕЕд аЕЕсЕсЕдда ссЕдЕЕЕддд ЕЕЕЕЕдсЕаа ддаадаЕаад ддЕсЕссЕдд дсаЕддсЕаа сЕЕссдадад дссЕсдадЕа ааассдаадд ЕсдасЕсЕда аЕЕсЕЕдЕса ссасдаааас асддадаЕад адаааЕсааЕ сЕЕЕаааааЕ сЕЕЕЕдЕсад ЕЕсадЕЕдсс даЕасадсЕЕ ЕЕсЕсЕаддЕ ЕасЕдЕЕддд СЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ССЕда ааЕссЕЕасд Сдссдсдаад ЕЕсаЕЕдЕЕс ЕсаасаЕЕсЕ ЕаЕЕасЕЕдЕ ссЕЕссаддс дЕЕдсадаЕд дсЕдддсадЕ саЕассЕЕдЕ саасЕЕсдаЕ ЕааЕдсаадЕ дЕдассааЕЕ асЕдадсЕЕа аеааЕЕЕсЕЕ сЕсЕдаасса СЕаааддасд саЕЕдассЕд даааададса сасддЕддаа дааЕдсассЕ ссаЕЕдсЕЕЕ ссасЕсссад дааЕдасЕаЕ Едсаададсс
ЕЕсЕдсЕадд ЕааЕЕаасса ааЕадаЕдаЕ дЕдЕсадаЕс ЕЕЕдЕссЕсЕ аасЕдЕддаа адсЕЕааЕдд ЕадааасЕЕс

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ ингибирования роста В-клеток у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбранное из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  2. 2. Способ ингибирования продукции иммуноглобулина у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбранное из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  3. 3. Способ ингибирования роста и созревания В-клеток, индуцированных дендритными клетками, у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбранное из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, включающей в себя полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  4. 4. Способ лечения аутоиммунного заболевания, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, выбранное из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  5. 5. Способ лечения гипертонии у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества ингибитора роста В-клеток, выбранного из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  6. 6. Способ лечения почечных заболеваний у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества ингибитора роста В-клеток, выбранного из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  7. 7. Способ лечения В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний у животного, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества ингибитора роста В-клеток, выбранного из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  8. 8. Способ по пп.1-7, где указанный полипептид ВСМА является растворимым.
  9. 9. Способ по п.8, где растворимый полипептид ВСМА содержит внеклеточный домен ВСМА.
  10. 10. Способ по п.9, где указанный внеклеточный домен ВСМА слит с иммуноглобулином.
  11. 11. Способ по пп.1-7, где указанный полипептид ВСМА выбран из группы, состоящей из
    a) выделенного полипептида ВСМА с нативной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 1-184 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагмента;
    b) выделенного полипептида ВСМА, имеющего по меньшей мере 80%-ную идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида ВСМА, содержащей аминокислотные остатки 1184 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, или его фрагмента;
    c) выделенного полипептида ВСМА, имеющего по меньшей мере 90%-ную идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида ВСМА, содержащей аминокислотные остатки 1184 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, или его фрагмента;
    б) выделенного полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 1-51 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, или его фрагмента; и
    е) выделенного полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 8-41 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, или его фрагмента.
  12. 12. Способ по пп.1-7, где указанным гомологом антитела против ВСМА является моноклональное антитело.
  13. 13. Способ по пп.1-7, где указанный гомолог антитела против ВСМА содержит ВСМАΙ§0.
  14. 14. Способ по пп.1-7, где указанным животным является млекопитающее.
  15. 15. Способ по п.14, где указанным млекопитающим является человек.
  16. 16. Способ нормализации, подавления или изменения иммунного ответа, участвующего в пути передачи сигнала между ВСМА и ВАРР, где указанный способ включает в себя стадию введения эффективного количества композиции, выбранной из группы, состоящей из (a) полипептида ВСМА или его фрагмента;
    (b) химерной молекулы, содержащей полипептид ВСМА или его фрагмент, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью; и (c) гомолога антитела против ВСМА.
  17. 17. Способ ингибирования воспаления, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества антитела против ВСМА или его активного фрагмента.
  18. 18. Способ ингибирования воспаления, включающий в себя стадию введения терапевтически эффективного количества антитела против ВСМА или его эпитопа.
  19. 19. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество выделенного полипептида ВСМА или его фрагмента и фармацевтически приемлемый носитель.
  20. 20. Фармацевтическая композиция по и. 19, где указанный выделенный полипептид ВСМА выбран из группы, состоящей из
    a) выделенной нативной последовательности полипептида ВСМА, содержащей аминокислотные остатки 1-184 последовательности 8Εζ) Ю N0:1, или ее фрагмента;
    b) выделенного полипептида ВСМА, имеющего по меньшей мере 80%-ную идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 1-184 последовательности §Εζ) Ю N0:1, или его фрагмента;
    c) выде ленного полипептида ВСМА, имеющего по меньшей мере 90%-ную идентичность аминокислотной последовательности с нативной последовательностью полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 1-184 последовательности §Εζ) Ю N0:1, или его фрагмента;
    б) выделенного полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 1-51 последовательности 8Е0 Ю N0:1, или его фрагмента; и
    е) выделенного полипептида ВСМА, содержащего аминокислотные остатки 8-41 последовательности 8Е0 Ю N0:1, или его фрагмента.
  21. 21. Фармацевтическая композиция по и. 19, где указанный фрагмент полипептида ВСМА содержит внеклеточный домен ВСМА, слитый с иммуноглобулином.
EA200200261A 1999-08-17 2000-08-16 Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент EA004635B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14937899P 1999-08-17 1999-08-17
US18168400P 2000-02-11 2000-02-11
US18353600P 2000-02-18 2000-02-18
PCT/US2000/022507 WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2000-08-16 Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200200261A1 EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
EA004635B1 true EA004635B1 (ru) 2004-06-24

Family

ID=27386828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200200261A EA004635B1 (ru) 1999-08-17 2000-08-16 Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7083785B2 (ru)
EP (3) EP1210425B2 (ru)
JP (4) JP4787439B2 (ru)
KR (2) KR20090016772A (ru)
CN (1) CN100447244C (ru)
AT (1) ATE360693T1 (ru)
AU (1) AU780240B2 (ru)
BG (1) BG106519A (ru)
BR (2) BRPI0013391B8 (ru)
CA (1) CA2383154C (ru)
CZ (1) CZ300364B6 (ru)
DE (1) DE60034579T3 (ru)
DK (1) DK1210425T4 (ru)
EA (1) EA004635B1 (ru)
EE (1) EE05673B1 (ru)
GE (1) GEP20053685B (ru)
HK (1) HK1043608B (ru)
HU (3) HU230583B1 (ru)
IL (3) IL148089A0 (ru)
IS (1) IS2955B (ru)
MX (1) MXPA02001665A (ru)
NO (2) NO331410B1 (ru)
NZ (1) NZ517782A (ru)
PL (2) PL207501B1 (ru)
RS (1) RS51157B (ru)
SK (2) SK288603B6 (ru)
TR (1) TR200201063T2 (ru)
UA (1) UA75049C2 (ru)
WO (1) WO2001012812A2 (ru)

Families Citing this family (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
AU4986700A (en) 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EA004635B1 (ru) * 1999-08-17 2004-06-24 Байоджен, Инк. Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
UA74798C2 (ru) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
ES2267593T3 (es) * 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
WO2001087977A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
US7879328B2 (en) * 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2001288301A1 (en) 2000-08-18 2002-03-04 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (ru) * 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
SI2116259T1 (sl) 2001-05-24 2012-11-30 Zymogenetics Inc Taci imunoglobulin fuzijski proteini
MXPA04001050A (es) * 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
MXPA05000940A (es) * 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
CA2520097C (en) * 2003-03-28 2014-10-07 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
PT1631313E (pt) * 2003-06-05 2015-07-02 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
US7850967B2 (en) 2003-10-20 2010-12-14 Biogen Idec Ma Inc. Method of treating a patient having an autoimmune disorder by administering an antibody that binds human BAFFR
WO2005075511A1 (en) * 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
WO2006052493A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Genentech, Inc. Polypeptides that bind baff and/or april
CA2590461A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
EP1855711B1 (en) * 2005-01-28 2009-06-17 Biogen Idec MA Inc. USE OF BAFF TO TREAT Th2-MEDIATED CONDITIONS
AU2006278227B2 (en) 2005-08-09 2011-10-20 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
CN101262876A (zh) 2005-08-09 2008-09-10 酶遗传学股份有限公司 用taci-ig融合分子治疗b细胞恶性肿瘤的方法
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
EP3037544A1 (en) * 2005-10-13 2016-06-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of systemic lupus erythematosus (sle) patients with autoantibody positive diseases
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
AR060935A1 (es) 2006-05-15 2008-07-23 Ares Trading Sa Metodos para tratar enfermedades autoinmunes utilizando una molecula de fusion taci- ig
HUE025778T2 (en) 2008-07-17 2016-05-30 Novartis Ag Preparations and methods for the use of therapeutic antibodies
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010093993A2 (en) * 2009-02-12 2010-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance
NZ612647A (en) 2009-03-10 2015-03-27 Biogen Idec Inc Anti-bcma antibodies
BR112012004777A2 (pt) 2009-09-03 2019-09-24 Genentech Inc métodos para tratar diagnósticar e monitorar artrite reumatoide
CN101781679B (zh) * 2009-10-19 2012-05-23 南通大学附属医院 人baff-r基因启动子活性的测定方法
CN101781680B (zh) * 2009-10-19 2012-05-09 南通大学附属医院 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
RU2013140975A (ru) 2011-02-28 2015-04-10 Дженентек, Инк. Биологические маркеры и способы прогнозирования восприимчивости к антагонистам в-клеток
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
KR101972446B1 (ko) * 2011-05-27 2019-04-25 글락소 그룹 리미티드 Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
TW201334789A (zh) 2012-01-31 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｉｇｅ抗體及其使用方法
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
CA2945486A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Mcmaster University Trifunctional t cell-antigen coupler and methods and uses thereof
ES2939760T3 (es) 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
RU2751660C2 (ru) 2014-07-21 2021-07-15 Новартис Аг Лечение злокачественного новообразования с использованием гуманизированного химерного антигенного рецептора против всма
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
CA2961636A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Boris ENGELS Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
CN113698497A (zh) 2014-12-05 2021-11-26 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途
SG11201704548PA (en) * 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies targeting b-cell maturation antigen and methods of use
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
TWI703159B (zh) 2015-04-13 2020-09-01 美商輝瑞股份有限公司 Bcma特異性治療性抗體及其用途
JP6921001B2 (ja) 2015-04-13 2021-08-18 ファイザー・インク Ｂ細胞成熟抗原を標的にするキメラ抗原受容体
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
WO2017091786A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Novartis Ag Optimized lentiviral transfer vectors and uses thereof
SG11201805451TA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CA3011900A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Seattle Genetics, Inc. Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017214170A2 (en) 2016-06-06 2017-12-14 City Of Hope Baff-r antibodies and uses thereof
EP3471773A4 (en) 2016-06-21 2020-07-08 Teneobio, Inc. ANTIBODIES BINDING CD3
JP7030109B2 (ja) 2016-09-14 2022-03-04 テネオバイオ， インコーポレイテッド Ｃｄ３結合抗体
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
WO2018119215A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Teneobio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
WO2018144535A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
IL270415B1 (en) 2017-05-12 2024-04-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EP3642237A2 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Teneobio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
TWI820031B (zh) 2017-07-11 2023-11-01 美商坎伯斯治療有限責任公司 結合人類cd137之促效劑抗體及其用途
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
EP3694997A4 (en) 2017-10-12 2021-06-30 Mcmaster University T-CELL ANTIGEN COUPLER WITH Y182T MUTATION, AND PROCEDURES AND USES THEREOF
US11999802B2 (en) 2017-10-18 2024-06-04 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US11066475B2 (en) 2017-11-01 2021-07-20 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen and encoding polynucleotides
MX2020004243A (es) 2017-11-01 2020-09-25 Juno Therapeutics Inc Receptores de anticuerpos y de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b.
JP2021502979A (ja) 2017-11-15 2021-02-04 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体、ｃｄ１９ターゲティングキメラ抗原受容体及び併用療法
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
EP3737408A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Novartis AG Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20200063100A1 (en) 2018-05-11 2020-02-27 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
PE20210320A1 (es) 2018-06-01 2021-02-16 Novartis Ag Moleculas de union contra bcma y usos de las mismas
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
CA3100724A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag B-cell maturation antigen protein (bcma) chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
WO2020018820A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. BISPECIFIC ANTI-BCMA x ANTI-CD3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
BR112021003305A2 (pt) 2018-08-31 2021-05-25 Novartis Ag métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CA3123511A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
US20220144807A1 (en) 2019-02-15 2022-05-12 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
MX2021010150A (es) 2019-02-25 2021-09-14 Novartis Ag Composiciones de particulas de silice mesoporosa para administracion viral.
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
EP3962535A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 CRISPR Therapeutics AG Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
AR119746A1 (es) 2019-06-14 2022-01-05 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN114729383A (zh) 2019-07-02 2022-07-08 弗莱德哈钦森癌症研究中心 重组ad35载体及相关基因疗法改进
MX2022006391A (es) 2019-11-26 2022-06-24 Novartis Ag Receptores de antigeno quimerico que se unen a bcma y cd19 y usos de los mismos.
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
AU2021225949A1 (en) 2020-02-27 2022-09-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
BR112022021690A2 (pt) 2020-04-29 2022-12-20 Teneobio Inc Anticorpos de cadeia pesada multispecíficos com regiões constantes de cadeia pesada modificadas
IL298473A (en) 2020-06-11 2023-01-01 Novartis Ag zbtb32 inhibitors and uses thereof
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
IL300489A (en) 2020-08-21 2023-04-01 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo production of CAR expressing cells
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
AR125468A1 (es) 2021-04-27 2023-07-19 Novartis Ag Sistema de producción de vectores virales
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
KR20240053675A (ko) 2021-08-11 2024-04-24 악소 바이오파마슈티컬 인코포레이티드 sBCMA 변이체 및 이의 FC 융합 단백질을 이용한 IgA, IgM 및/또는 IgG의 생산 감소 방법
CN117858901A (zh) 2021-08-20 2024-04-09 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
AU726486C (en) 1996-03-14 2004-02-05 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor delta and epsilon
KR20050004269A (ko) 1996-10-25 2005-01-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 뉴트로킨 알파
AU5705898A (en) 1996-12-17 1998-07-15 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
RO128635A2 (ro) 1997-04-16 2013-07-30 Amgen Inc. Anticorp sau fragment al acestuia care se leagă la opgbp şi utilizarea acestuia, utilizarea unei forme solubile de odar, şi metodă de identificare a unui compus care descreşte activitatea opgbp
AU743490B2 (en) 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
AU7608898A (en) 1997-06-06 1998-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ntn-2 member of tnf ligand family
AU9376498A (en) 1997-09-05 1999-03-22 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
CZ294615B6 (cs) * 1997-09-12 2005-02-16 Apotech R & D Sa Léčivo obsahující protilátky reaktivní s polypeptidovým ligandem APRIL pro léčení rakoviny
DE69837606T2 (de) 1997-09-12 2008-02-14 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Cystein-reiche rezeptoren-train
AU9315298A (en) * 1997-09-12 1999-03-29 Apotech S.A. Kay - a novel immune system protein
US6297367B1 (en) 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
DE69921718T2 (de) * 1998-04-01 2005-12-22 Solvay Solexis, Inc., Wilmington Verträgliche Mischungen aus Polyvinylidenfluorid und aromatischem Polyimid
AU1467000A (en) 1998-11-04 2000-05-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
EE05539B1 (et) † 1999-01-07 2012-04-16 Zymogenetics, Inc. Hbriidvalk, selle kasutamine, seda sisaldav antikeha v?i selle fragment ja selle kasutamine
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
IL144202A0 (en) * 1999-01-25 2002-05-23 Biogen Inc Baff, related blocking agents and their use in the stimulation and inhibition of b-cells and immunoglobulins in immune responses
US6475986B1 (en) 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
JP2002541779A (ja) 1999-02-24 2002-12-10 ザ ジュネラル ホスピタル コーポレーション シグナル伝達中間体のクローニング方法
WO2000058362A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
AU4986700A (en) * 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EA004635B1 (ru) * 1999-08-17 2004-06-24 Байоджен, Инк. Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
CA2897626C (en) 2000-02-11 2020-03-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
ES2267593T3 (es) † 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
WO2001087977A2 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2001288260A1 (en) 2000-08-15 2002-03-13 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
UA83458C2 (ru) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Выделенный полипептид baff-r (рецептор фактора активации в-клеток семейства tnf)
EP1456347A4 (en) 2001-11-16 2006-08-02 Human Genome Sciences Inc ANTIBODIES BINDING TO BLYS ACCORDING TO AN IMMUNOSPECIFIC MODE
WO2003072713A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
US7083735B2 (en) 2003-09-03 2006-08-01 Laing David A High debris content strainer
KR101972446B1 (ko) 2011-05-27 2019-04-25 글락소 그룹 리미티드 Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질
FR3005792B1 (fr) 2013-05-16 2017-12-29 Parknplug Procede de gestion dynamique et previsionnel du rechargement electrique de batteries

Also Published As

Publication number Publication date
NZ517782A (en) 2004-01-30
WO2001012812A3 (en) 2001-09-07
JP2014037434A (ja) 2014-02-27
US20020172674A1 (en) 2002-11-21
CZ300364B6 (cs) 2009-04-29
SK288603B6 (sk) 2018-10-01
UA75049C2 (ru) 2006-03-15
SK288287B6 (sk) 2015-07-01
NO20020789D0 (no) 2002-02-18
PL207501B1 (pl) 2010-12-31
US7691804B2 (en) 2010-04-06
EP1806143A3 (en) 2007-07-18
US20150139992A1 (en) 2015-05-21
DE60034579T3 (de) 2015-11-12
EP1210425B1 (en) 2007-04-25
MXPA02001665A (es) 2003-07-14
US8828669B2 (en) 2014-09-09
US7083785B2 (en) 2006-08-01
RS51157B (sr) 2010-10-31
AU780240B2 (en) 2005-03-10
EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
PL354661A1 (en) 2004-02-09
EP1806143B1 (en) 2016-06-15
AU6911200A (en) 2001-03-13
US20120214687A1 (en) 2012-08-23
HU227947B1 (en) 2012-06-28
US20100040627A1 (en) 2010-02-18
HU227008B1 (en) 2010-04-28
GEP20053685B (en) 2005-12-12
EP1210425A2 (en) 2002-06-05
JP5904985B2 (ja) 2016-04-20
HU230583B1 (hu) 2017-02-28
HK1043608A1 (en) 2002-09-20
IS6273A (is) 2002-02-15
IS2955B (is) 2016-12-15
JP2003507364A (ja) 2003-02-25
US9650430B2 (en) 2017-05-16
DK1210425T4 (en) 2015-08-10
KR20020084842A (ko) 2002-11-11
CN100447244C (zh) 2008-12-31
SK2292002A3 (en) 2002-07-02
US20200095305A1 (en) 2020-03-26
BG106519A (bg) 2003-04-30
KR20090016772A (ko) 2009-02-17
DE60034579T2 (de) 2008-01-31
JP4787439B2 (ja) 2011-10-05
YU10602A (sh) 2005-06-10
KR100897082B1 (ko) 2009-05-14
JP2011063600A (ja) 2011-03-31
DK1210425T3 (da) 2007-09-17
CA2383154A1 (en) 2001-02-22
EP1210425B2 (en) 2015-06-17
IL230961A0 (en) 2014-03-31
EE05673B1 (et) 2013-08-15
US10494416B2 (en) 2019-12-03
NO20111232A1 (no) 2011-09-12
BR0013391A (pt) 2002-07-09
US20180273605A1 (en) 2018-09-27
HK1043608B (zh) 2007-12-07
NO331410B1 (no) 2011-12-19
BRPI0013391B1 (pt) 2018-09-11
JP5379107B2 (ja) 2013-12-25
EE200200071A (et) 2003-04-15
US20020165156A1 (en) 2002-11-07
EP2314694A2 (en) 2011-04-27
IL230961A (en) 2016-06-30
CN1379815A (zh) 2002-11-13
EP2314694A3 (en) 2013-12-11
DE60034579D1 (de) 2007-06-06
IL148089A (en) 2015-03-31
IL148089A0 (en) 2002-09-12
ATE360693T1 (de) 2007-05-15
CA2383154C (en) 2013-04-30
HU1000128D0 (en) 2010-05-28
SK500172015A3 (ru) 2002-07-02
TR200201063T2 (tr) 2002-10-21
EP1806143A2 (en) 2007-07-11
WO2001012812A2 (en) 2001-02-22
PL211786B1 (pl) 2012-06-29
HUP0203084A2 (en) 2002-12-28
CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
BRPI0013391B8 (pt) 2021-05-25
JP2011116790A (ja) 2011-06-16
NO20020789L (no) 2002-04-08
NO344346B1 (no) 2019-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004635B1 (ru) Рецептор baff (bcma), иммунорегуляторный агент
KR100620334B1 (ko) 헤르페스 심플렉스 바이러스 유입 매개체에 대한 리간드및 사용 방법
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
EA005601B1 (ru) Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (april)
EA001200B1 (ru) Фармацевтическая композиция, способ лечения, способ ингибирования иммунного ответа
EP1012179A2 (en) Cysteine rich receptors: trail
EA012567B1 (ru) Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела
US7202029B2 (en) Nucleic acids encoding human TANGO 195
WO2009104388A1 (ja) 膠原病の予防・治療剤
ZA200201201B (en) BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent.
JP2003000271A (ja) 新規ポリぺプチド、新規ｄｎａ、新規抗体および新規遺伝子改変動物

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM