EA012567B1 - Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с интерлейкин-18-индуцибельным цитокином, названным фактором, индуцирующим фактор некроза опухоли альфа (ТАIF), или интерлейкином-32 (IL-32). В частности, настоящее изобретение включает композиции для лечения и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака, частично, с помощью регуляции экспрессии фактора некроза опухоли альфа.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с интерлейкин- 18- индуцибельным цитокином, названным фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа (ΤΑΙΕ), или интерлейкин-32 (1Ь-32). В частности, настоящее изобретение включает композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака, частично, регуляцией экспрессии фактора некроза опухоли-альфа.

Предпосылки создания изобретения

Ревматоидный артрит (ΚΑ, РА) представляет собой обычный хронический воспалительный артрит, который поражает около 1% взрослого населения во всём мире, преимущественно женщин, и пик начала заболевания приходится на четвёртое десятилетие жизни (См., Епе81еш, КЕеита1о1б АгШпОк. ίη 8с1еиΐίίίο Атепсаи Мебкше, 2000; и Сойеи, 8у81етю Аи101ттиш1у, в Раи1 (еб.) Еиибатеи1а1 1ттиио1о§у, ЫрршсоИ-Кауеи РиЬйкйегк: РЫ1абе1рЫа, рр. 1067-1088, 1999). Сильное воспаление наблюдается в синовиальных суставах с инфильтрацией синовиальной мембраны мононуклеарными фагоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами, что вызывает значительную боль в суставах. Кроме того, у больных РА (НА) обычно наблюдается утрата хряща и кости вокруг суставов, что ведёт к потере подвижности.

Хотя причина РА точно не определена, различные признаки заболевания указывают на аутоиммунный компонент в этиологии РА. В частности, цитокины, продуцируемые макрофагами и фибробластами, в большом количестве экспрессируются в ревматоидных суставах (РпеЦеш е! а1., 1. 1ттиио1, 144: 3347, 1994). По-видимому, фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α, ΤΝΡα) и интерлейкин-1 (1Ь-1) являются основными патогенными факторами, так как они оба могут индуцировать пролиферацию синовиоцитов, коллагенез и высвобождение простагландина, тогда как сверхэкспрессия может индуцировать артрит у животных моделей (Рйейеш, кирга, 2000). 1Ь-18 также присутствует в РА суставах и может непосредственно активировать макрофаги для продуцирования провоспалительных цитокинов (Сгабе е1 а1, 1 С1ш 1иуе§1, 104: 1393, 1999).

Современная терапия РА направлена на обезболивание, контроль воспаления и изменение течения болезни. В настоящее время часто выбираются (одобряются) более активные способы лечения, причём РА больным требуется быстрый переход от нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС) к реагенту второй линии, такому как метотрексат. К сожалению, один метотрексат не обеспечивает адекватного контроля РА у большинства больных, что заставляет врачей выбирать либо дополнительную терапию, либо ряд единичных агентов (Рйейеш, кирга, 2000), например, лефлюномид, сульфасалазин или ингибитор ФНО (ΤΝΡ). Ингибиторы ФНО (ΤΝΡ), которые с определённым успехом применялись для лечения НР, включают ФНО-реактивные моноклональные антитела (инфликсимаб/КЕМ1САОЕ и адалимумаб/НиМГКА) и гибридный (слитый) белок растворимый ФНО (ΤΝΡ)- рецептор/ иммуноглобулин (этанерцепт/ΕΝΒΚΕΕ). Однако желательно дать клиницистам дополнительные лекарственные средства для самостоятельного использования или применения в виде коктейлей для того, чтобы остановить развитие этого изнурительного заболевания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, связанным с интерлейкин- 18- индуцибельным цитокином, названным фактор индукции фактора некроза опухоли- альфа (ГАГР), или интерлейкин-32 (1Ь-32). В частности, настоящее изобретение включает композиции и способы лечения аутоиммунных заболеваний и рака, частично, регуляцией экспрессии фактора некроза опухоли- альфа.

Настоящее изобретение охватывает очищенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность по меньшей мере на 80% идентичную 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 15, причём эта последовательность кодирует интерлейкин-32 (1Ь-32) и эта последовательность содержит экзон 3 и экзон 4 1Ь-32 практически прилегающие друг к другу (в тесной ассоциации). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения 1Ь32 представляет собой: альфа изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7; бета изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8; или дельта изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10. В других вариантах изобретения в последовательности отсутствует интрон 4 ΙΕ-32, хотя в особенно предпочтительных вариантах изобретения последовательность по меньшей мере на 90% идентична 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 15. Также охватываются очищенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3, 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6. В некоторых вариантах изобретения последовательность функционально связана с гетерологичным промотором.

В предпочтительных вариантах изобретения последовательность нуклеиновой кислоты помещена в вектор. Кроме того, охватываются клетки- хозяева, содержащие вектор.

Помимо этого, настоящее изобретение охватывает очищенные белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность по меньшей мере на 80% идентичную 8ЕЦ Ш ΝΟ: 15, отличающуюся тем, что эта последовательность кодирует интерлейкин-32 (ΙΕ-32), и тем, что она содержит экзон 3 и экзон 4 ΙΕ-32, практически прилегающие друг к другу (в тесной ассоциации). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения ΙΕ-32 представляет собой: альфа изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7; бета изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8; или дельта изоформу, содержащую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10. В других вариантах

- 1 012567 изобретения 1Ь-32 не является гамма изоформой, тогда как в предпочтительных вариантах изобретения 1Ь-32 не содержит аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ Ш N0: 14. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения 1Ь-32 представляет собой рекомбинантный белок, экспрессируемый в клетке, выбранной из группы, состоящей из бактериальной клетки, клетки дрожжей, клетки насекомого и клетки млекопитающего. В подгруппе этих вариантов изобретения рекомбинантный белок является гибридным (химерным) белком.

Также настоящее изобретение охватывает антитела, которые связываются с 1Ь-32. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения антитело является моноклональным антителом, тогда как в другие варианты изобретения включён ЕаЬ фрагмент моноклонального антитела. В некоторых вариантах изобретения моноклональное антитело (тАЬ) выбирают, но без ограничения, из 32-4 и 32-9. Клетки гибридомы, которые продуцируют 32-4 тАЬ, депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 Ишуегайу Вои1сгагб. МапаББаБ, Уйщша 20110-2209. Аналогично, клетки гибридомы, которые продуцируют 32-4 тАЬ, депонированы в АТСС. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения моноклональное антитело выбирают, но без ограничения, из химерного моноклонального антитела, гуманизированного моноклонального антитела, человеческого моноклонального антитела. В подгруппе вариантов изобретения моноклональное антитело ингибирует индуцированное 1Ь-32 продуцирование ΤΝΕα (ФНО-α) в клетках-мишенях, ингибирует индуцированную 1Ь- 32 деградацию в клетке- мишени и/или ингибирует индуцированное 1Ь-32 фосфорилирование р38 МАРК в клетке- мишени.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы индукции продуцирования ΤΝΕ1, заключающиеся в контактировании по меньшей мере одной клетки с белком ЕЬ-32 в условиях, пригодных для индуцирования ΤΝΕα продукции. В предпочтительных вариантах изобретения белок 1Ь-32 выбирают из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В некоторых вариантах изобретения по меньшей мере одна клетка представляет собой лейкоцит, тогда как в подгруппе этих вариантов изобретения лейкоцит выбирают из группы, состоящей из моноцитов и макрофагов.

Также настоящим изобретением охватываются способы лечения субъекта, включающие: предоставление субъекта и антитела, которое связывает 1Ь-32; и введение антитела субъекту. В предпочтительных вариантах изобретения 1Ь-32 выбирают из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В особенно предпочтительных вариантах изобретения у субъекта наблюдается аутоиммунное заболевание, у субъекта подозревают аутоиммунное заболевание или субъект является лицом с повышенным риском аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах изобретения аутоиммунное заболевание выбирают, но без ограничения, из рассеянного склероза, тяжёлой псевдопаралитической миастении, аутоиммунной нейропатии, аутоиммунного увеита, болезни Крона, язвенного колита, первичного билиарного цирроза печени, аутоиммунного гепатита, аутоиммунной гемолитической анемии, пернициозной анемии, аутоиммунной тромбоцитопении, сахарного диабета типа I, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, аутоиммунного оофорита и орхита, височного артериита, антифосфолипидного синдрома, васкулитидов, болезни Бехчета, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, спондилоартропатии, синдрома Шегрена, псориаза, герпетиформного дерматита, обыкновенной пузырчатки и витилиго. Настоящее изобретение включает антитела, выбранные, но без ограничения, из человеческого моноклонального антитела и гуманизированного мышиного моноклонального антитела.

В предпочтительных вариантах изобретения введение осуществляют в условиях, пригодных для облегчения по меньшей мере одного симптома аутоиммунного заболевания.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы скрининга на ингибиторы Ш-32, включающие: создание белка Ш-32 и по меньшей мере одного лекарства-кандидата (предполагаемого лекарства); и анализ действия лекарства-кандидата (предполагаемого лекарства) по меньшей мере на одну активность белка Ш-32. В некоторых вариантах изобретения белок Ш-32 является рекомбинантным белком, выбранным из группы, состоящей из альфа изоформы, бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В предпочтительных вариантах изобретения предполагаемое лекарство (лекарство-кандидат) выбирают, но без ограничения, из 1Ь-32-реактивного моноклонального антитела и доминант-негативного 1Ь-32 варианта. В особенно предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере одна активность белка Ш-32 представляет собой позитивную регуляцию экспрессии ΤΝΕ;ι.

Также данным изобретением охватываются способы лечения субъекта, включающие: предоставление субъекта и белка Ш-32; и введение белка Ш-32 субъекту. В предпочтительных вариантах изобретения белок Ш-32 представляет собой рекомбинантный белок, выбранный из группы, состоящей из альфа изоформы. бета изоформы, гамма изоформы и дельта изоформы. В особенно предпочтительных вариантах изобретения у субъекта наблюдается рак, у субъекта подозревают рак или субъект является лицом с повышенным риском заболевания раком.

Настоящее изобретение также охватывает способы и наборы для измерения концентрации Ш-32 в сыворотке субъекта, включающие предоставление сывороток субъекта и Ш-32- реактивного антитела, и

- 2 012567 скрининг сывороток с помощью антитела в условиях, пригодных для количественного определения 1Ь32. В некоторых вариантах изобретения субъектом является больной аутоиммунным заболеванием, тогда как в других вариантах изобретения субъект находится в состоянии сепсиса. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения скрининг выполняют с помощью электрохемилюминесцентного анализа, тогда как в других вариантах изобретения его осуществляют твердофазным иммуноферментным анализом. 1Ь-реактивное антитело в некоторых вариантах изобретения выбирают, но без ограничения, из поликлонального кроличьего антитела против человеческого Ш-32 и моноклонального мышиного антитела против человеческого Ш-32.

Описание фигур

На фиг. 1 показана экспрессия и активность функциональной цепи ΙΕ-18Ββ в клетках А549 рака лёгких. На фиг. 1А приводятся результаты К.Т-РСК. анализа экспрессии ΙΕ-18Κ.β в трансфецированных и дикого типа клетках А549. На фиг. 1В и С графически показана секреция 1Ь-6 и 1Ь-8, соответственно, в ответ на стимуляцию 1Б-18 (50 нг/мл) в трансфецированных, но не дикого типа, клетках А549 через 16 ч (N=7). На фиг. 1Ό показана индукция экспрессии РНК ΝΚ4 (Ш-32) в трансфецированных клетках в присутствии и в отсутствие Ш-18.

На фиг. 2 графически изображена индукция экспрессии ΤΝΡα при обработке макрофагальных клеток мышей Вате 264.7 рекомбинантным 1Ь-32а (ΤΆΙΡ) в присутствии полимиксина В. На фиг. 2А показан уровень рекомбинантного 1Ь-32а во фракциях, полученных ионообменной хроматографией, коррелирующий с уровнями ΤΝΡα, секретированного обработанными клетками. Фракции, полученные ионообменной хроматографией, показаны после 10% 8Б8-РАСЕ с последующим окрашиванием Кумасси синим. На фиг. 2В показано, что рекомбинантный 1Ь-32а, экспрессированный в бактериях, индуцирует экспрессию ΤΝΡα в зависимости от дозы. На фиг. 2С показано, что рекомбинантный 1Ь-32а, экспрессированный в клетках млекопитающих, также индуцирует экспрессию ΤΝΡα. Количество рекомбинантного 1Ь-32а оценивают иммуноблоттингом.

На фиг. 3 показано выравнивание последовательностей (даётся сравнительный анализ первичных последовательностей) ДНК с открытой рамкой считывания четырёх вариантов сплайсинга Ш-32 (1Ь-32а раскрывается как 8ЕО ΙΌ N0:3, ΙΕ-32β раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0:4, 1Ь-32у раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0:5 и 1Б-325 раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0:6). Выравнивание осуществляют с помощью программы С1и81а1^ (доступной на веб-сайте узла 8те155 ЕМВпе!) и корректируют вручную. Муг и 01у указывают на возможные сайты N миристоилирования или ^гликозилирования, соответственно.

На фиг. 4 приводится сравнение первичных последовательностей (выравнивание) четырёх вариантов сплайсинга человеческого Ш-32 (фиг. 4А) (ΙΕ-32α, раскрываемый как 8Е0 ΙΌ N0:7, ΙΕ-32β, раскрываемый как 8Е0 ΙΌ N0:8, ΙΕ-32γ, раскрываемый как 8Е0 ΙΌ N0:9, и ΙΕ-325, раскрываемый как 8Е0 ΙΌ N0:10), а также выравнивание белковых последовательностей ΙΕ-32β некоторых видов млекопитающих (человеческая последовательность раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0:8, последовательность белка лошади раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0:16 и последовательность бычьего белка раскрывается как 8Е0 ΙΌ N0: 17). Выравнивание осуществляют с помощью программы, доступной на веб- сайте узла 8\νί55 ЕМВие!, и корректируют вручную.

На фиг. 5 изображена структура человеческого гена Ш-32 на хромосоме 16р13.3, экзоны изображены в виде заштрихованных прямоугольников. Числа над и под схематическим изображением гена Ш-32 показывают восемь экзонов, тогда как геномный фрагмент 5 п.о. раскрывается в данном описании как 8Е0 ΙΌ N0: 11. Также показан сплайсинг четырёх вариантов Ш-32 (α, β, γ и δ).

На фиг. 6 показано, что τΙΕ-32 индуцирует провоспалительные цитокины как в макрофагальных клетках (Вате), так и в моноцитах (ТНР-1). На фиг. 6А показано, что τΙΕ-32α, продуцированный Е. сой, индуцирует секрецию как ΜΙΡ-2, так и ΤΜΕα в зависимости от дозы. Концентрации показаны по оси абсцисс в единицах/мл. На фиг. 6В показано, что как вариант Ш-32а (10 Ед/мл), так и вариант ΙΕ-32β (10 Ед/мл) активирует макрофагальные клетки мышей Вате 264.7. На фиг. 6С дано графическое изображение человеческого и мышиного ΤΉΡα, индуцированного ΙΕ-32β из различных источников. Клетки Вате и РМА-дифференцированные-ТНР-1 клетки обрабатывают с помощью 1 Ед/мл Ап)ои65 и Со5-78 или 2 Ед/мл С.'057-Τ. ΙΕ-32α, продуцированный Е. сой, и ΙΕ-32β, продуцированный клетками млекопитающих, индуцируют экспрессию Τ^Εα в РМА- дифференцированных ТНР-1 в зависимости от дозы. На фиг. 6Е показано, что концентрации Е. сой τΙΕ-32α (20 Ед/мл) или τΙΕ-32β млекопитающих (Ан]ои65, 10 Ед/мл) индуцируют секрецию Ш-8 в недифференцированных клетках ТНР-1.

На фиг. 7 показано, что активности Е. сой τΙΕ-32α и τΙΕ-32β млекопитающих нейтрализуются при обработке антителом Еай против Ш-32 (32-4) (среднее ± 8ЕМ из трёх отдельных экспериментов). На фиг. 7 А показано зависящее от дозы уменьшение секреции Τ^Εα клетками Вате, культивированными в присутствии Е. сой τΙΕ-32α (3 Ед/мл) и Еай против Ш-32. На фиг. 7В показано, что секреция тΤNΡα, индуцированная с помощью τΙΕ-32β млекопитающих (Со57-8) (2 Ед/мл), ингибируется под действием Еай против Ш-32 (40 нг/мл).

На фиг. 8 изображена эндогенная экспрессия Ш-32 как на уровне мРНК, так и на уровне белка. На

- 3 012567 фиг. 8А показана экспрессия мРНК 1Ь-32 в различных человеческих тканях, определённая Нозернблоттингом. Цифры слева указывают на размер мРНК. На фиг. 8В показано, что растворимый 1Ь-32 присутствует в супернатантах клеточных культур, как определено Вестерн- блоттингом. Стабильный клон Α549-Κβ стимулируют в течение 48 ч в присутствии 1Ь-18 (50 нг/мл) или 1Ь-1 β (10 нг/мл), как указано, в отсутствие РС8. Супернатанты собирают и гибридизуют с зондом-очищенным аффинной хроматографией антителом против 1Ь-32а.

На фиг. 9 показано детектирование 1Ь-32 в клеточных лизатах. Показано продуцирование 1Ь-32 клетками \УЫ1 (фиг. 9А), клетками А549-КР (фиг. 9В) и клетками А549-\УТ (фиг. 9С) при стимуляции с помощью ΙΡΝγ (100 Ед/мл), ΣΠ-18 (50 нг/мл) или 1Ь-1 β (10 нг/мл). Данные представляют один из четырёх независимых экспериментов. Экспрессию 1Ь-32 при транзиторной трансфекции клеток Со§7 с помощью кДНК 1Ь-32а и ΙΕ-32β обнаруживают в супернатантах клеточных культур (рисунок Ό) и клеточных лизатах (рисунок Е) иммуноблоттингом. На рисунке Р даётся сравнение определяемой методом ЕСЬ концентрации 1Ь-32 в супернатантах и лизатах. Данные представляют собой среднее ± 8ЕМ из пяти отдельных (независимых) экспериментов.

На фиг. 10 показаны данные определения эндогенного 1Ь-32, полученные методом электрохемилюминесценции (ЕСЬ). На фиг. 10А 1Ь-32 детектируют методом ЕСЬ в тех же образцах, которые используют для иммуноблоттинга на фиг. 9В. На фиг. 10В 1Ь-32 детектируют в супернатанте человеческой клеточной линии ΝΚ после обработки с помощью 1Ь-12, ΙΠ-18 или 1Ь-12, 1Ь+18. Данные представляют собой среднее + 8ЕМ из 4 независимых экспериментов. На фиг. 10С индуцированный с помощью СопА 1Ь32 обнаруживают как в супернатанте, так и в лизате человеческих РВМС (Ν = 7).

На фиг. 11 изображены индуцированная 1Ь-32а деградация 1кВ (фиг. 10А) и фосфорилирование р38 МАРК (фиг. 10В)после обработки с помощью 1Ь-32а (20 Ед/мл) макрофагальных клеток мышей Кате 264.7. Для нормализации мембрану гибридизуют с антителом козы против актина или с кроличьим антителом против р38 МАРК.

На фиг. 12 показаны аминокислотные последовательности лошадиного 1Ь-32а (8ЕЦ ΙΌ N0:18) и ΙΕ-32β (8Е0 ΙΌ N0:16) на фиг. 12А и С, соответственно, а также последовательности кДНК лошадиного 1Ь-32а (8Е0 ΙΌ N0:19) и ΙΕ-32β (8Е0 ΙΌ N0:20) на фиг. 12В и Ό, соответственно.

На фиг. 13 показаны аминокислотные последовательности бычьего ΙΌ-32β (8Е0 ΙΌ N0:17) и ΙΌ-32γ (8Е0 ΙΌ N0:22) на фиг. 13А и С, соответственно, а также последовательности кДНК бычьего ΙΌ-32β (8Е0 ΙΌ N0:21) и ΙΌ-32γ (8Е0 ΙΌ N0:23) на фиг. 13В и Ό, соответственно.

На фиг. 14 представлены аминокислотная (8Е0 ΙΌ N0:24) и кДНК (8Е0 ΙΌ N0:25) последовательности бычьего ΙΌ-32α на фиг. 14А и В, соответственно. Также представлены аминокислотная (8Е0 ΙΌ N0:26) и кДНК (8Е0 ΙΌ N0:27) последовательности ΙΌ-32α свиньи на фиг. 14С и Ό, соответственно.

Определения

Для того, чтобы было легче понять настоящее изобретение, ниже даётся ряд терминов и выражений:

Термин ген относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, КДНК), которая содержит кодирующие последовательности, необходимые для продуцирования полипептида, или предшественника, или РНК (например, тРНК, δίΡΗΚ, рРНК и т.д.). Полипептид может кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или любым участком кодирующей последовательности, пока сохраняется заданная активность или функциональные свойства (например, ферментативная активность, связывание лиганда, сигнальная трансдукция) полноразмерной последовательности или фрагмента. Термин также охватывает кодирующую область структурного гена и последовательностей, локализованных по соседству (рядом) с кодирующей областью как на 5', так и на 3' конце, так что ген соответствует длине полноразмерной мРНК. Последовательности, которые расположены 5' от кодирующего участка и которые присутствуют на мРНК, называются 5' нетранслируемые последовательности. Последовательности, которые расположены 3' от кодирующего участка и которые присутствуют на мРНК, называются 3' нетранслируемые последовательности. Термин ген охватывает как кДНК, так и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, которая может прерываться некодирующими последовательностями, называемыми нитронами или мешающими (ш!егуешпд) областями, или мешающими последовательностями. Интроны удаляются или вырезаются при сплайсинге из ядерного или первичного транскрипта и, следовательно, отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). Функцией мРНК в ходе трансляции является определение порядка аминокислот в образующемся полипептиде.

В частности, термины ген ΤΑΙΡ и ген ΙΕ-32 относятся к полноразмерной нуклеотидной последовательности ΙΕ-32. Однако предполагается также, что этот термин охватывает фрагменты нуклеотидной последовательности ΙΕ-32, а также другие домены (например, функциональные домены) внутри полноразмерной нуклеотидной последовательности ΙΕ-32. Кроме того, термины ген ΙΕ-32, нуклеотидная последовательность ΙΕ-32 и полинуклеотидная последовательность ΙΕ-32 охватывают последовательности ДНК, кДНК и РНК.

Термин плазмида по данному описанию относится к малому независимо реплицирующему участ

- 4 012567 ку ДНК. Аналогично, термин голая плазмида относится к плазмидной ДНК, не содержащей постороннего материала, обычно применяемого для того, чтобы повлиять на трансфекцию. Применяемое в данном описании выражение голая плазмида относится к плазмиде, практически не содержащей фосфата кальция, ΌΕΑΕ- декстрана, липосом и/или полиаминов.

Применяемый в данном описании термин очищенная относится к молекулам (полинуклеотидов или полипептидов), которые выделяются из естественного окружения, изолируются или отделяются. Практически чистые молекулы по меньшей мере на 50% свободны, предпочтительно по меньшей мере на 75% свободны и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободны от других компонентов, с которыми они ассоциированы в естественных условиях.

Термин рекомбинантная ДНК относится к молекуле ДНК, которая состоит из сегментов ДНК, соединённых вместе методами молекулярной биологии. Аналогично, термин рекомбинантный белок относится к молекуле белка, которая экспрессируется при использовании рекомбинантной ДНК.

Термин гибридный (химерный, слитый) белок по данному описанию относится к белку, образованному экспрессией гибридного гена, полученного при объединении двух генных последовательностей. Обычно это выполняют, клонируя кДНК в экспрессирующий вектор в рамке считывания с существующим геном. Партнёр по слиянию может вести себя как маркерный (репортёрный) ген (например, вда1), может обеспечивать средством для изоляции (например, С8Т) или может повышать период полужизни белка ίη νίνο (например, 1дС Те).

Системы пригодные для продуцирования рекомбинантных белков, включают, но без исключения, прокариотическую систему (например, ЕксйепсЫа сой), дрожжевую систему (например, 8ассаготусе§ ссгст'Ыас). систему насекомых (например, бакуловирус), систему млекопитающих (например, яичников китайского хомячка), растительную систему (например, сафлор красильный) и бесклеточную систему (например, кроличий ретикулоцит).

Применяемый в данном описании термин кодирующий участок (область) относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют аминокислотные последовательности, обнаруживаемые в образующемся полипептиде в результате трансляции молекулы мРНК. Кодирующий участок связывается в клетках эукариот на 5' конце (стороне) с помощью нуклеотидного триплета АТС, который кодирует инициирующий метионин, и на стороне 3' с помощью одного из трёх триплетов, которые определяют стоп- кодоны (т.е. ТАА, ТАС и ТСА).

Если аминокислотная последовательность перечисляется (излагается) в данном описании в отношении молекулы природного белка, не предполагается, что термин аминокислотная последовательность и подобные термины, такие как полипептид или белок ограничивают аминокислотную последовательность полной, нативной аминокислотной последовательностью, ассоциированной с молекулой перечисленных белков.

Термин дикого типа относится к гену или генному продукту, который имеет признаки этого гена или генного продукта, выделенного из природного источника. Ген дикого типа представляет собой такой ген, который наиболее часто наблюдают в популяции и поэтому его произвольно обозначают как нормальная или дикого типа форма гена.

Применяемые в данном описании термины мутант, полиморфизм и вариант в отношении гена или генного продукта относятся к изменениям последовательности и/или функциональных качеств (т.е.различных признаков, характеристик) по сравнению с геном дикого типа или с исходным генным продуктом. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения термин мутант относится к гену или генному продукту, который в результате мутации отличается от исходного гена или генного продукта. Как отмечается, природные и индуцированные мутанты можно выделить; их определяют по тому, что они имеют изменённые признаки по сравнению с геном дикого типа или с исходным генным продуктом. Кроме того, мутантные гены можно искусственно (например, с помощью сайт- направленного мутагенеза) или синтетически получать в лаборатории.

Термины интерлейкин-32, 1Ь-32, ТА1Е, фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа, ΝΚ4 и транскрипт 4 природных киллерных клеток по данному описанию относятся к человеческому гену 1Й-32 (например, Ното 8ар1еп8 8ЕЦ ГО N0:11) и к его генным продуктам (например, изоформы альфа, бета, гамма и дельта дикого типа и их варианты). Варианты Ш-32, которые отличаются от последовательностей ГО-32 дикого типа менее, чем в 20% остатков (предпочтительно, в 10% или менее, более предпочтительно, в 5% или менее, и наиболее предпочтительно в 1% или менее), также пригодны для применения в способах и композициях по настоящему изобретению (настоящее изобретение включает, но без ограничения, генный продукт, соответствующий фрагменту мышиной кДНК, раскрываемому как 8ЕЦ ГО N0:12). Напротив, термины ΝΚ4, ТА1Т и ГО-32 по данному описанию не относятся к внутреннему фрагменту фактора роста гепатоцитов (НСТ), обозначенный НСЕ/ΝΚΤ (или также просто ΝΚ4, что означает Ν-концевая шпилька и последующие четыре домена кг1пд1е), который является специфическим антагонистом НСТ (Эа1е е1 а1., ЕЕВ8 йен 420:1-6, 1997).

Термин гибридизация применяется в данном описании к спариванию (объединению) комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и степень (прочность) гибридизации (т.е. прочность ассоциации между нуклеиновыми кислотами) оказывают влияние такие факторы, как степень комплемен

- 5 012567 тарности между нуклеиновыми кислотами, жёсткость условий, Т_т образовавшегося гибрида и отношение С:С в нуклеиновых кислотах.

Применяемый в данном описании термин Т_т относится к температуре плавления. Температура плавления - это такая температура, при которой популяция молекул двухнитевой нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной в одиночные нити. Уравнение для расчёта Т_т нуклеиновых кислот общеизвестно в уровне техники. Как указывается в стандартных ссылочных материалах, элементарную оценку величины Т_т можно определить по уравнению: Т_т = 81.5 + 0.41 (% С + С), , когда нуклеиновая кислота находится в водном растворе в 1 М ЫаС1 (См., например, Либегаои апб Уоиид, ΟιιαηΙίΙαΙίνο ЕШет ΗνόπάίζαΙίοη ίη ШсШс Лаб ΗνόπάίζαΙίοη. 1985). Другие ссылочные материалы включают более усовершенствованные расчёты, которые при расчёте Тт учитывают структурные характеристики и характеристики последовательности.

Применяемый в данном описании термин жёсткость, жёсткие относится к условиям - температуре, ионной силе и присутствию других соединений, таких как органические растворители, в которых проводят гибридизацию нуклеиновых кислот. Специалисты в данной области техники понимают, что жёсткие условия могут меняться при изменении описанных показателей (параметров) либо в отдельности, либо вместе. В очень жёстких условиях (условиях высокой жёсткости) спаривание (объединение) нуклеотидных оснований происходит только между нуклеотидными фрагментами с высокой частотой встречаемости последовательностей комплементарных оснований (например, в очень жёстких условиях гибридизация может происходить между гомологами с идентичностью, примерно, 85-100%, предпочтительно, примерно 70-100%). В умеренно жёстких условиях спаривание нуклеотидных оснований происходит между нуклеиновыми кислотами с промежуточной частотой встречаемости оснований с комплементарными последовательностями (например, гибридизация в умеренных условиях может происходить между гомологами с идентичностью около 50-70%). Следовательно, условия со слабой или низкой жёсткостью часто требуются для нуклеиновых кислот, полученных из генетически отличных организмов, так как в этом случае частота встречаемости комплементарных последовательностей обычно ниже.

Термины условия с высокой жёсткостью или жёсткие условия в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л №С1, 6,9 г/л №1Н₂РО₄ Н₂О и 1,85г/ЕПТЛ, рН доводят до 7,4 с помощью ΝαΟΗ), 0,5% 8Ό8, 5Х реагента Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 0,1Х 88РЕ, 1,0% 8Ό8 при 42°С, когда используют зонд протяжённостью около 500 нуклеотидов.

Умеренно жёсткие условия, условия средней жёсткости в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л ЫаС1, 6,9 г/л ΝαΗ₂ΡΟ₄ Н₂О и 1,85г/ЕПТЛ, рН доводят до 7,4 с помощью ЫаОН), 0,5% 8Ό8, 5Х реагента Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 1,0Х 88РЕ, 1,0% 8Ό8 при 42°С, когда используют зонд протяжённостью около 500 нуклеотидов.

Условия с низкой жёсткостью, нежёсткие условия в применении к гибридизации нуклеиновых кислот представляют собой условия, эквивалентные условиям связывания или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х 88РЕ (43,8 г/л ЫаС1, 6,9 г/л ЫаН₂РО₄ Н₂О и 1,85 г/ЕОТЛ, рН доводят до 7,4 с помощью ЫаОН), 0,1% 8Ό8, 5Х реагента Денхардта [раствор Денхардта 50Х содержит на 500 мл: 5 г фиколла (Туре 400, Рйатташа), 5 г В8А (Фракция V; 81дта)] и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося, с последующим отмыванием в растворе, содержащем 5Х 88РЕ, 0,1% 8Ό8 при 42°С, когда используют зонд протяжённостью около 500 нуклеотидов.

Применяемый в данном описании термин Нозерн-блоттинг относится к методам переноса денатурированной РНК на твёрдую подложку (твёрдый носитель) для использования в последующем гибридизационном анализе. Тотальную РНК или полиА-обогащённую РНК обычно подвергают электрофорезу на агарозном геле, переносят на мембрану и гибридизуют с меченным радиоактивной меткой фрагментом ДНК или РНК для обнаружения специфичных последовательностей РНК. Нозерн-блоттинг обычно применяют в технике (См., например, Тйотак, Ргос №111 Асаб 8с1 И8Л 77^л 5201-5205, 1980; и Ли8иЬе1 е1 а1. (еб§.) СштеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойи \УПеу & 8ои§, 1ис., Νονν Уотк, 1994).

Термин Саузерн- блоттинг по данному описанию относится к методам переноса денатурированной ДНК, фракционированной с помощью электрофореза в агарозном геле, на твёрдую подложку (твёрдый носитель) для использования в последующем гибридизационном анализе. Эти методы обычно включают расщепление геномной ДНК подходящей рестриктазой перед агарозным гель- электрофорезом, перенос ДНК на мембрану и инкубацию с меченным радиоактивной меткой фрагментом ДНК или РНК для обнаружения специфических последовательностей ДНК. Саузерн-блоттинг обычно применяют в технике (См., например, 1 Мо1 Вю1 98л 503-517, 1975; и Ли8иЬе1 е1 а1., см. выше, 1994).

Применяемый в данном описании термин полимеразная цепная реакция (ПЦР, РСК) относится к способу повышения концентрации сегмента целевой последовательности в смеси ДНК без клонирования или очистки (См., например, патенты США 4683195, 4684202 и 4965188). Этот способ амплификации

- 6 012567 целевой последовательности заключается во введении большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, содержащую заданную целевую последовательность, с последующим проведением последовательных термальных циклов в присутствии ДНК полимеразы. Два праймера комплементарны соответствующим нитям двухнитевой целевой последовательности. Для воздействия на амплификацию смесь денатурируют и затем праймеры отжигают с их комплементарными последовательностями с целевой молекулой. После отжига праймеры удлиняют с помощью полимеразы таким образом, чтобы образовать новую пару комплементарных нитей. Стадии денатурации, отжига праймеров и удлинение с помощью полимеразы можно повторять много раз (т.е. денатурация, аннелирование (отжиг) и удлинение составляют один цикл), чтобы получить высокую концентрацию амплифицированного сегмента заданной целевой последовательности. Протяжённость амплифицированного сегмента заданной целевой последовательности определяют по положениям праймеров относительно друг друга, и, следовательно, эта протяжённость (длина) представляет собой контролируемый параметр. Из-за повторяемости процесса метод называется полимеразной цепной реакцией (далее в данном описании ПЦР, РСК.). Так как заданные амплифицированные сегменты целевой последовательности становятся преимущественными последовательностями (с точки зрения концентрации) в смеси, именно они являются ПЦР амплифицированными последовательностями. Когда матрица представляет собой РНК, перед циклами амплификации проводят стадию обратной транскрипции (КТ). Поэтому этот вариант называют КТ- РСК, КТПЦР.

Термин антитело относится к поликлональным и моноклональным антителам. Затем поликлональные антитела, которые образуются в организме животного в результате иммунологической реакции против представляющего интерес белка или его фрагмента, можно легко выделить из крови общеизвестными методами и очистить, например, хроматографией. Моноклональные антитела можно также получать известными методами (См., например, \УйИег апй Μίΐδίοίη. №11игс. 349, 293-299, 1991). Применяемый в данном описании термин антитело охватывает полученные методом рекомбинантной ДНК и модифицированные антитела и их антиген-связывающие фрагменты, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, полифункциональные антитела, биспецифические или олигоспецифические антитела, одноцепочечные (однонитевые) антитела и фрагменты Р(аЬ) и Р(аЬ)₂. Термин реактивное (реакционноспособное) в отношении антитела указывает, что это антитело способно связываться с представляющим интерес антигеном. Например, 1Ь-32-реактивное (реактивное в отношении 1Ь-32) антитело представляет собой антитело, которое связывается с 1Ь-32 или с фрагментом 1Ь-32.

Термин доминант-негативный мутант относится к молекулам, у которых отсутствует активность дикого типа, но которые эффективно конкурируют с молекулами дикого типа за субстраты, рецепторы и т.д., и тем самым ингибируют активность молекул дикого типа. В предпочтительных вариантах изобретения термин 1Ь-32 доминант-негативный мутант относится к мутантному белку 1Ь-32, который конкурирует с белком 1Ь-32 дикого типа за 1Ь-32 рецепторы, но который не может индуцировать дальнейшие эффекты, такие как расщепление (деградацию) 1кВ, фосфорилирование р38 МАРК и продуцирование ΤΝΡα (ФНОа). Подходящие доминант-негативные 1Ь-32 варианты можно выбирать из библиотек произвольных мутантов 1Ь-32 или можно создавать осознанно (рационально), как описано в системе ΤΝΡ (81еей е! ай, 8с1епсе, 301: 1895-1898, 2003).

Термин участок, часть в применении к нуклеотидной последовательности относится к фрагментам этой последовательности протяжённостью от 10 нуклеотидов до полноразмерной (полной) нуклеотидной последовательности минус один нуклеотид.

Применяемый в данном описании термин биологически активный относится к молекуле, имеющей структурные, регуляторные и/или биохимические функции молекулы 1Й-32 дикого типа. В некоторых примерах биологически активная молекула является гомологом молекулы 1Й-32 млекопитающих, тогда как в других примерах биологически активная молекула представляет собой участок молекулы 1Ь32 млекопитающих. Другие биологически активные молекулы, которые находят применение в композициях и способах по настоящему изобретению, включают, но без ограничения мутантные (например, варианты по меньшей мере с одной делецией, инсерцией или заменой) молекулы 1Й-32 млекопитающих. Биологическую активность определяют, например, измеряя индукцию ΤΝΡα ίη νίίτο, как написано в экспериментальных примерах.

Применяемый в данном описании термин животное относится к любому представителю животного мира, который включает живые существа с клетками, отличающиеся от растительных клеток отсутствием клеточных стенок и хлорофилла и способности спонтанного движения. Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся прежде всего к позвоночным (позвоночным или хордовым) представителям животного мира.

Термины пациент (больной) и субъект относятся к млекопитающему (человеку или животному), кандидату на получение медицинского лечения.

Термин контрольный относится к субъектам или образцам, с которыми сравнивают опытные субъекты или образцы. Например, применение контрольных субъектов или образцов делает возможным определение эффективности и методик эксперимента. В некоторых вариантах изобретения термин кон

- 7 012567 трольный субъект относится к животным, которые получают мнимое (суррогатное) лечение (например, один РВБ или обычный кроличий 1дС в физиологическом солевом растворе).

Термины образец и проба применяются в самом широком смысле. С одной стороны, предполагается, что они включают пробу или культуру. С другой стороны, предполагается, что они включают как биологические образцы, так и образцы сред. Эти термины охватывают все типы образцов, взятые у человека и животных, включая, но без ограничения, жидкости в организме, такие как моча, кровь, фекалии, ликвор, семенная жидкость, слюна и раневые экссудаты, а также плотные ткани. Однако эти примеры не рассматриваются как ограничивающие типы образцов, применимые в данном изобретении.

Термин лейкоцит по данному описанию относится к клеткам, называемым белыми кровяными тельцами, которые помогают организму бороться с инфекциями и другими заболеваниями, и включают, например, гранулоциты (например, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), мононуклеарные фагоциты и лимфоциты (например, В клетки, Т клетки, природные (натуральные, естественные) киллерные клетки).

Применяемый в данном описании термин моноцит относится к мононуклеарному фагоциту в кровотоке, который позже перемещается в ткань и дифференцирует в макрофаг. Термин макрофаг относится к относительно долго живущим фагоцитарным клеткам тканей млекопитающих, образованным из моноцитов крови. Макрофаги из различных частей тела обладают заметно отличающимися свойствами. Основными типами являются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, тканевые макрофаги (гистиоциты), клетки Купфера (береговая клетка печени) и остеокласты. Макрофаги играют важную роль в киллинге клеток некоторых бактерий, простейших и опухолей, в высвобождении субстанций, которые стимулируют другие клетки иммунной системы и презентируют процессированный антиген Т лимфоцитам.

Термин воспаление по данному описанию относится к ответу ткани на травму, характеризующемуся повышенным кровотоком и попаданием лейкоцитов в ткани, вызывая опухание, покраснение, повышенную температуру и боль.

Применяемый в данном описании термин симптом относится к любому субъективному признаку заболевания или состояния пациента (например, изменение состояния пациента является показателем определённого телесного или умственного состояния).

Например, фраза симптомы воспаления в контексте воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ) по данному описанию включает, но без ограничения, симптомы, такие как абдоминальная боль, диарея, ректальное кровотечение, потеря в весе, лихорадка, потеря аппетита и другие, более серьёзные, осложнения, такие как обезвоживание, анемия и нарушение питания. Некоторые такие симптомы поддаются количественному анализу (например, потеря в весе, жар (лихорадка), анемия и т.д.). Некоторые симптомы легко определить по анализу крови (например, анемия) или с помощью теста, который обнаруживает наличие крови (ректальное кровотечение).

Аналогично, выражение в условиях, при которых уменьшаются симптомы в контексте ΙΒΌ относится к любой степени качественного или количественного уменьшения обнаруживаемых симптомов ΙΒΌ, включая, но без ограничения, детектируемое воздействие на скорость исцеления (например, скорость увеличения веса) или уменьшения, по меньшей мере, одного из следующих симптомов: абдоминальная боль, диарея, ректальное кровотечение, потеря в весе, жар (лихорадка), потеря аппетита, обезвоживание, анемия, вздутие (живота), фиброз, воспалённый кишечник и нарушение питания.

Термин аутоиммунное заболевание включает, но без ограничения, следующие заболевания: рассеянный склероз, тяжёлая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунные нейропатии (такие как болезнь Гийена- Баре), аутоиммунный увеит, болезнь Крона, язвенный колит, первичный цирроз печени, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная гемолитическая анемия, злокачественная анемия, аутоиммунная тромбоцитопения, сахарный диабет типа I, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, аутоиммунный оофорит и орхит, височный артериит, антифосфолипидный синдром (АФС), васкулитиды (такие как гранулёматоз Вегенера), болезнь Бехчета, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия, полимиозит, дерматомиозит, спондилоартропатия (такие как анкилозирующий спондилит), синдром Шегрена, псориаз, герпетиформный миозит, обыкновенная пузырчатка и витилиго.

Применяемый в данном описании термины ревматоидный артрит и РА относятся к хроническому воспалительному заболеванию, при котором происходит разрушение суставов. РА рассматривается как аутоиммунное нарушение, при котором в суставах образуются иммунные комплексы и возбуждают воспалительный ответ (гиперчувствительность, опосредованная комплексами). Также встречается клеточно-опосредованная (тип IV) гиперчувствительность, которая вызывает аккумуляцию макрофагов и приводит к разрушению синовиальной выстилки.

Термины ΙΒΌ и воспалительное заболевание кишечника по данному описанию являются общими терминами, которые охватывают несколько болезненных процессов, наиболее часто, язвенный колит и болезнь Крона.

Применяемый в данном описании термин болезнь Крона относится к аутоиммунному заболеванию желудочно-кишечного тракта. Обычные симптомы включают периодические абдоминальные боли, жар (лихорадку), тошноту, рвоту, потерю в весе и диарею, которая бывает иногда геморрагической.

Термины соединение и лекарство-кандидат, предполагаемое (возможное) лекарство относятся

- 8 012567 к любому химическому или биологическому объекту (например, включая фармацевтические препараты, лекарственные вещества и т. п.), которые можно использовать для лечения или предупреждения заболевания, расстройства, слабости или нарушения телесной функции. Соединения включают как известные, так и потенциальные терапевтические соединения. Определить соединение как терапевтическое можно скринингом, например, применяя методы скрининга по настоящему изобретению. Известное терапевтическое соединение относится к терапевтическому соединению, которое, как было показано (например, в испытаниях на животных или в предыдущем опыте применения на людях), эффективны для такого лечения или предупреждения.

Применяемый в данном описании термин агонист относится к молекулам или соединениям, которые имитируют действие нативного или природного (естественного, натурального) соединения. Агонисты могут быть гомологичны этим природным соединениям в том, что касается конформации, заряда или других характеристик. Так, агонисты могут узнаваться рецепторами, экспрессируемыми на клеточных поверхностях. Это узнавание может привести к физиологическим и/или биологическим изменениям внутри клетки, так что клетка реагирует на присутствие агониста таким же образом, как если бы присутствовало природное соединение. Агонисты могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются или взаимодействуют с белком (белками), связывающим^) 1Б-32.

Применяемые в данном описании термины антагонист и ингибитор относятся к молекулам или соединениям, которые ингибируют действие нативного или природного (натурального, естественного) соединения. Антагонисты могут быть или могут не быть гомологичными этим природным соединениям в том, что касается конформации, заряда или других характеристик. Так, антагонисты могут узнаваться теми же самыми, которые узнаются агонистами, или другими рецепторами, антагонисты могут обладать аллостерическими эффектами, которые предупреждают действие агониста (например, предупреждают связывание нативного ГБ-32 с рецепторами ГБ-32). В отличие от агонистов, соединения- антагонисты не вызывают физиологических и/или биохимических изменений в клетке, так чтобы клетка реагировала на присутствие антагониста таким же образом, как если бы присутствовало природное соединение. Антагонисты и ингибиторы могут включать белки, нуклеиновые кислоты, углеводы или любые другие молекулы, которые связываются или взаимодействуют с белком (белками), связывающим(и) ГБ32, или которые предупреждают образование функциональных мультимеров ГБ-32.

Применяемый в данном описании термин модулирует (регулирует) относится к изменению биологической активности. Модуляция может представлять собой повышение или понижение активности белка, изменение характеристик связывания или любое другое изменение биологических, функциональных или иммунологических свойств, связанных с активностью белка или другой представляющей интерес структуры.

Описание изобретения

Интерлейкин- 18 (ГБ-18) представляет собой полифункциональный цитокин, играющий роль как в во врождённом, так и в приобретённом иммунных ответах. Действие ГБ-18 изучали в широком спектре Τ111 или Τ112 родственных аутоиммунных заболеваний (Окатига е! а1, №а!иге, 378: 88-91, 1995, №акап1БЫ е! а1, Су!окте Сго\\111 Рас!ог Неу, 12: 53-72, 2001; и Окатига е! а1, Абу 1ттипо1, 70: 281-312, 1998). 1Б-1 и ГБ-18 принадлежат к семейству ГБ-1, имеют общее структурное свойство, требуют для процессирования каспазу-1 (Вахап е! а1, №а!иге, 379: 591, 1996; и Си е! а1, 8с1епсе, 275: 206-209, 1997). 1Б-18 также включает сходные пути передачи сигнала, включая рекрутинг ГБ-1- рецептор-ассоциированных киназ (1НАК), образование комплексов ГНАК с фактором-6, ассоциированным с рецептором фактора некроза опухоли (ΤΝΕ) и активация каскада 1кВа/№Е- кВ (Корта е! а1, ВюсНет ВюрйуБ Нсб Соттип, 244: 183-186, 1998; Ма!Бито!о е! а1, Вюсйет ВюрйуБ НеБ Соттип, 234: 454-457, 1997; и НоЬшбоп е! а1, Гттипбу, 7: 571-581, 1997). Полагают, что члены семейства ГБ-1 играют патологическую роль в аутоиммунных и воспалительных заболеваниях, так как блокада активностей ГБ-1 и ГБ-18 уменьшает тяжесть заболевания у больных ревматоидным артритом и системным воспалением (Агепб, Абу 1ттипо1, 54: 167-227, 1993; Όίпаге11о, В1ооб, 87: 2095-2147, 1996; №о\зск е! а1., Гттцпбу, 10: 127-136, 1999; и Вапба е! а1., I 1ттипо1, 170: 2100-2105, 2003). Однако существует трудность в изучении 1Ь-18-индуцибельных генов, так как только несколько (малое число) клеточных линий отвечают на ГБ-18, например, человеческие ΝΚ и КС-1 клеточные линии. Кроме того, хотя эти клеточные линии отвечают на ГБ-18, они требуют костимулирующих факторов, таких как 1Ь-2 или ГБ-15, соответственно, чтобы проявилась ответная реакция на ГВ18 (АНп е! а1., Лттипо1, 159: 2125-2131, 1997; 0111Бик| е! а1, Апбсапсег НеБ, 17: 3253-3258, 1997; БттегуБ е! а1., Лттипо1, 165: 1847-1853,2000; и НобЫпо е! а1,. Лттипо1„ 162: 51-59, 1999). Необходимость в костимулирующих факторах мешает независимой оценке ГБ-18 индукции генной экспрессии.

ГБ-18 имеет две известные рецепторные цепи, лигандсвязывающую 1Ь-18На цепь и цепь сигнальной трансдукции ΙΒ-18Ηβ. Обе цепи рецептора ГБ-18 относятся к семейству ГБ-1 рецептора и состоят из трёх 1д- подобных доменов во внеклеточной области (Ка!о е! а1, №11 §!гис! Вю1, 10: 966-971, 2003; и Уатато!о е! а1., Вюсйет ВюрйуБ НеБ Соттип, 317: 181-186, 2004). Дополнительным компонентом, участвующим в ГБ-18 регуляции, является ГБ-18- связывающий белок (ГБ-18ВР). ГБ-18ВР не является частью

- 9 012567 сигнального комплекса 1Ь-18, но скорее антагонистичен 1Ь-18 активности (К1т е! а1, Ргос №111 Асаб 8с1 И8А, 97: 1190-1195, 2000; и Копск е! а1, 1ттипйу, 10: 127-136, 1999). 1Ь-18ВР представляет собой секретированную рецептороподобную молекулу, состоящую из единственного 1д- подобного домена. 1Ь-18ВР имеет общую гомологию с вирусными белками и нейтрализует биологические активности человеческого ГО-18 (Хапд апб Мокк, У1го1оду, 257: 297-302,. 1999; Кеабтд апб 8тйй, б Уйо1, 77: 9960-9968, 2003; Ек!еЬап апб Ви11ег, У1го1оду, 323: 197-207, 2004; и Ек!еЬап е! а1, б Сеп У1го1, 85: 1291-1299, 2004).

В отсутствие костимуляторов неиммунные клетки не отвечают на 6ГО-18 вследствие малой экспрессии или отсутствия экспрессии цепи ΙΕ-18Κβ (Тйотаккеп е! а1, б 1п1егГегоп Су!окте Кек, 18: 1077-1088, 1998: и Сйапбгакекаг е! а1, Вюсйет Вюрйук Кек Соттип, 303: 1152-1158, 2003). Следовательно, было необходимо генерировать стабильный клон, экспрессирующий цепь ΙΕ-18Κβ, так как этот рецепторный компонент требуется для передачи сигнала ГО-18 (Тйотаккеп е! а1, кирга, 1998; и К1т е! а1, Лттипо1, 166: 148-154, 2001). Устойчивую экспрессию цепи ΙΕ-28Κβ осуществляют в человеческой клетке А549 рака лёгких (А549-Кв), что делает эти клетки чувствительными к 1ГО-18 даже в отсутствие костимуляции. Устойчивый клон Λ549-Εβ используют для идентификации 1ГО-18- индуцибельных генов методом шюгоаггау (или микрочип) анализа. Мюгоаггау анализ, описанный в примере 1, выявил 1ГО-18 индукцию цитокиноподобной молекулы, которая была описана 12 лет назад как транскрипт 4 природной киллерной клетки, или просто ΝΚ4 (ЭаЫ е! а1., б 1шшцпо1, 148: 597-603, 1992). Следует заметить, что термин ΝΚ4 в настоящее время используют для описания варианта фактора роста гепатоцитов (Майш е! а1., б Се11 Рйукю1, 192: 268-275, 2002). Гомология последовательностей между вариантом фактора роста гепатоцитов и транскриптом ΝΚ4/ΙΕ-32 отсутствует. Позднее сообщалось о повышенной экспрессии ΝΚ4 в РВМС пациентов, получающих высокие дозы ГО-12 для лечения злокачественной меланомы (РапеШ е! а1., Сепоте Вю1, 3(7): КЕ8ЕАКСН0035, 2002), но функция ΝΚ4 оставалась неизвестной до разработки настоящего изобретения.

Как подробно описано в экспериментальных примерах, новый воспалительный цитокин, названный интерлейкин-32 (ГО-32) или фактор индукции фактора некроза опухоли-альфа (ТАГЕ) определён методом тюгоаггау анализа клеток А549-Кв. Кроме того, выявлена генная структура, паттерн экспрессии и функция ГО-32. До разработки настоящего изобретения единственная изоформа №-32 (ТАIΕγ/NΚ4) была описана как транскрипт лимфоцита с неизвестной функцией (ЭаЫ е! а1., б 1шшцпо1, 148: 597-603, 1992), который транскрибируется на человеческой хромосоме 16р13.3 в локусе семейной средиземноморской лихорадки или непосредственно рядом с этим локусом (Вето! е! а1, Сепотюк, 50: 147-160, 1998). Как показано в данном описании, хотя отсутствует гомология последовательностей ГО-32 и известных семейств цитокинов, это, несомненно, цитокин ввиду его способности индуцировать секрецию ТУа и передавать сигнал классическими путями известных провоспалительных цитокинов. Кроме того, предполагают, что ГО-32 является членом семейства ГО-1 цитокинов (Сйауиг е! а1., №!иге, 386: 619-623, 1997; СеггеШ е! а1, 8с1епсе, 256: 97-100, 1992, и Кшба е! а1., 8с1епсе, 267: 2000-2003, 1995), вследствие сходства в регуляции ГО-32 и отсутствия чёткого сигнального пептида. Кроме того, как и ГО-1 и 1ГО-18, ГО-32 секретируется прежде всего стимулированными клетками. Как впервые показано в данном описании, ГО-32 включает сигнальные пути провоспалительных цитокинов, ΝΕκβ И р38 МАРК, тем самым индуцируя продуцирование провоспалительного цитокина, Т№а. Аналогично, 1ГО-1 β, 1ГО-18 и БР8 индуцируют экспрессию ГО32 и, в отличие от первоначального описания ΝΚ4 в активированных ΝΚ или Т-клетках, экспрессия ГО32 наблюдается повсеместно в различных органах. Паттерн экспрессии ГО-32 напоминает паттерн экспрессии ЕС-15, который также продуцируется в совершенно различных тканях. Этим он отличается от ГО2, который продуцируется исключительно активированными Т-клетками (ВатГогб е! а1, Ргос №111 Асаб 8с1 И8А, 93: 2897-2902, 1996: и СгаЬк!ет е! а1., 8с1епсе, 264: 965-968, 1994).

Индукция ΈΝΕα при использовании ГО-32 указывает на то, что этот цитокин играет важную роль в патологии аутоиммунных/воспалительных заболеваний. Высокий уровень ГО-32, наблюдаемый в кровотоке некоторых больных с сепсисом (по сравнению с уровнем ГО-32, наблюдаемым в сыворотке здоровых индивидуумов), также до настоящего изобретения не был установлен (подтверждён документально). Поэтому блокирование ГО-32 активности рассматривается как высокоэффективный терапевтический подход в различных аутоиммунных заболеваниях, аналогичный успешным способам блокирования Т№а (Όηνίκ е! а1., Апп Кйет Όίκ, 598ирр1 1:141- 3, 2000; и 8йапайап апб 8! С1ап, С1т 1шшипо1, 103: 231-242, 2002). Также полагают, что композиции на основе ГО-32 найдут применение при лечении рака и других заболеваний, в которых существенной (благотворной) является индукция гибели клеток или апоптоз, включающий продуцирование Т№а.

Кроме того, полагают, что макрофагальная клеточная линия мышей Кает 264.7 экспрессирует ГО-32 рецептор, который активируется при связывании с помощью ГО-32 (функция внеклеточного ГО-32). Однако также полагают, что ГО-32 также имеет внутриклеточную функцию, так как ГО-32 также обнаруживают в клеточных лизатах. Поэтому полагают, что ГО-32 активен как внутриклеточный, так и как внеклеточный белок, аналогично ЕС-1 (81етепкоп е! а1, Ргос №ι11 Асаб 8а И8А, 94: 508-513, 1997) и группе- 1 с высокой подвижностью (^апд е! а1, 8аепсе, 285: 248-251, 1999).

Секреция ГО-32 в отсутствие чёткого сигнального пептида является признаком нескольких семейств

- 10 012567 цитокинов (СеггеШ е! а1, 8с1епсе, 256: 97-100, 1992; КшЕа е! а1., 8с1епсе. 267: 2000-2003, 1995; и Сйауиг е! а1., №11иге. 386: 619-623, 1997). Аналогично !Ш-1 β и ГЪ-18, Ш-32 секретируется в виде растворимого белка в клеточных культуральных средах стимулированных первичных клеток, а также клеточных линий. На основании первичного анализа последовательностей Ш-32 не имеет потенциальных сайтов расщепления каспазой-1, и хотя были обнаружены новые варианты, полученные в результате сплайсинга, ни один из них не содержит типичного гидрофобного сигнального пептида на №конце.

Существование Ш-32 во множестве видов является доказательством эволюционно консервативной последовательности, которая, как полагают, имеет важную функцию в регуляции воспаления. Меньшее количество изоформ Ш-32 идентифицировано в других видах млекопитающих, хотя этот результат может отражать относительную недостаточность Е8Τ для этих видов. Аналогично, тщательный поиск гомолога мышиного Ш-32 был неудачен. Однако, возможно, предполагаемый ген мышиного Ш-32 имеет очень низкую гомологию с человеческим геном, а последовательности гомологов лошадиного и бычьего Ш-32 только на 31.8 - 28.1% идентичны последовательности человеческого Ш-32.

Некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения описаны в нижеприведённых разделах: (Ι) Ш-32 Полинуклеотиды; (ΙΙ) Ш-32 Полипептиды; (ΙΙΙ) Ш-32 Антитела; (Ιν) Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды, полипептиды или антитела Ш-32; и (V) Способы идентификации ингибиторов Ш-32.

Ι. Ш-32 Полинуклеотиды

Настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие Ш-32 белки, гомологи, варианты и мутанты (например, 8ЕО ΙΌ N0: 3, 4, 6). В некоторых вариантах настоящее изобретение охватывает полинуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться с 8Е0 ΙΌ N0: 3, 4, 6 в очень жёстких условиях, пока полинуклеотидная последовательность, способная гибридизоваться, кодирует белок, который сохраняет ΤΗΡα- индуцирующую активность природного Ш-32 гена. В некоторых вариантах изобретения белок, который сохраняет ΤNΡα-индуцирующую активность природного Ш-32, на 80% гомологичен дикого типа Ш-32, предпочтительно на 90% гомологичен дикого типа Ш-32, более предпочтительно, на 95%, и наиболее предпочтительно на 99% гомологичен дикого типа Ш-32. В особенно предпочтительных вариантах изобретения белок, который сохраняет биологическую активность Ш-32, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую непрерывную аминокислотную последовательность ^КАВΜΗ^АIЕВЕΥ^КΜ^NАЕ86В6^V (8Е0 ΙΌ N0: 13), и которая на 99% гомологична Ш-32 дикого типа (ΙΕ-32α, ΙΕ-32β, ΙΕ-32γ, ΙΕ-32δ). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения нуклеотидная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0: 14. В подгруппе этих вариантов изобретения нуклеотидная последовательность содержит последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0: 15 (экзон 3, прилегающий к экзону 4). В предпочтительных вариантах изобретения условия гибридизации основаны на температуре (Τ^ комплекса связывания нуклеиновой кислоты, а определённая жёсткость обеспечивается, как описано выше в разделе Определения.

В других вариантах настоящего изобретения охватываются аллели Ш-32. В предпочтительных вариантах изобретения аллели появляются в результате мутации (т.е. изменения нуклеотидной последовательности) и обычно продуцируют изменённые РНК или полипептиды, структура или функция которых может, или не может, быть изменена. Любой данный ген может не иметь ни одной аллельной формы, может иметь одну аллельную форму или много аллельных форм. Обычные мутационные изменения, которые приводят к аллелям, приписывают, как правило, делециям, добавлениям или заменам нуклеиновых кислот. Каждый из этих типов изменений может происходить один или в комбинации с другими и с частотой один или более раз в данной последовательности.

В других вариантах настоящего изобретения можно создать нуклеотидные последовательности по данному изобретению, чтобы изменить Ш-32 кодирующую последовательность для различных целей (по разным причинам), включая, но без ограничения, изменения, которые модифицируют клонирование, процессирование и/или экспрессию генного продукта. Например, мутации можно вводить, используя общеизвестные в технике методы (например, сайт-направленный мутагенез для инсерции новых сайтов рестрикции, для изменения паттерна гликозилирования, для изменения предпочтения кодонов и т.д.).

Можно получать модифицированный пептид, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, изменена, например, с помощью замены, делеции или добавления. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения эти модификации не меняют заметно ΤNΡα-индуцирующую активность модифицированного Ш-32 (например, Ш-32 агонисты), тогда как в других предпочтительных вариантах изобретения эти модификации приводят к утрате ΤNΡα-индуцирующей активности модифицированного Ш-32 (например, Ш-32 антагонисты). Другими словами, любую данную конструкцию можно оценивать, чтобы определить, является ли она членом рода модифицированных или вариантов Ш-32 по настоящему изобретению, что определяется скорее функционально, нежели структурно. В предпочтительных вариантах изобретения активность варианта или мутанта Ш-32 оценивают методами, описанными в примере 2 (индукция ΤNΡα).

Кроме того, как описано выше, вариантные формы Ш-32 также рассматриваются как эквивалентные

- 11 012567 тем пептидным и ДНК молекулам, которые представлены более подробно в данном описании. Например, полагают, что изолированная замена лейцина на изолейцин или Валин, аспартат на глутамат, треонин на серин, или аналогичная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту (т. е. консервативные мутации) не оказывает значительного эффекта на биологическую активность результирующей молекулы. Соответственно, некоторые варианты настоящего изобретения охватывают варианты 1Ь-32 по данному описанию, содержащие семейство аминокислот, родственных по своим боковым цепям. Генетически кодированные аминокислоты можно разделить на четыре семейства: (1) кислые (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда вместе классифицируют как ароматические аминокислоты. Аналогично набор (популяцию, спектр) аминокислот можно поделить на группы (1)кислые (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин), (3) алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), причём серин и треонин можно объединить в отдельную группу как алифатические- гидроксильные; (4) ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); (5) амидные (аспарагин, глутамин); и (6) серосодержащие (цистеин и метионин) (например, 8йуег ей., ВюсбетщГгу. 17- 21, 2^й ей, V Н Егеетап аий Со., 1981). Приводит ли изменение в аминокислотной последовательности к функциональному гомологу, можно легко определить, оценивая способность вариантного пептида функционировать таким же образом, как белок дикого типа. Пептиды, имеющее более одной замены, можно таким же образом легко протестировать.

Реже вариант включает неконсервативные изменения (например, замену глицина на триптофан). Аналогичные минорные варианты включают также аминокислотные делеции или инсерции, или и те и другие. Руководством для определения, какие аминокислотные остатки можно заменить, ввести или удалить не нарушив биологическую активность, могут служить компьютерные программы (например, программа ΕΆΖΆΚΟΕΝΕ, ΌΝΆ8ΤΆΚ. 1пс., Майкоп, XVI).

II. 1Ь-32 Полипептиды

В других вариантах настоящее изобретение охватывает ГЕ-32 полинуклеотидные последовательности, которые кодируют ΣΕ-32 полипептидные последовательности. Ш-32 полипептиды (например, 8ΕΟ ГО N0: 7, 8, 10) описаны на фиг. 4. Другие варианты настоящего изобретения включают фрагменты, гибридные (слитые) белки или функциональные эквиваленты этих Ш-32 белков. В других вариантах настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, соответствующие этим различным гомологам и мутантам Ш-32, можно использовать для генерирования рекомбинантных молекул ДНК, которые направляют экспрессию гомологов и мутантов Ш-32 в соответствующие клетки- хозяева. В некоторых вариантах настоящего изобретения полипептид может быть природным очищенным продуктом, в других вариантах изобретения он может быть продуктом химического синтеза, а в других вариантах изобретения он может быть получен методами рекомбинантной ДНК с применением прокариотического или эукариотического хозяина (например, с применением бактериальных клеток, клеток дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих в культуре). В некоторых вариантах изобретения, в зависимости от хозяина, применяемого в методе рекомбинантной ДНК, полипептид по настоящему изобретению может быть гликозилированным или может быть негликозилированным. В других вариантах изобретения полипептиды по изобретению могут также включать начальный метиониновый аминокислотный остаток.

В одном варианте настоящего изобретения, вследствие собственной (внутренней, имманентной) вырожденности генетического кода, последовательности ДНК, отличные от полинуклеотидных последовательностей 8Ε0 ГО N0: 3, 4 и 6, которые кодируют практически такие же или функционально эквивалентные аминокислотные последовательности, могут использоваться для клонирования и экспрессии Ш32.

А. Векторы для продуцирования Ш-32

Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно применять для продуцирования полипептидов методами рекомбинантной ДНК. Так например, полинуклеотид может быть включён в любой из векторов экспрессии для экспрессии полипептида. В некоторых вариантах настоящего изобретения векторы включают, но без ограничения, хромосомные, нехромосомные и синтетические ДНК последовательности (например, производные 8ν40, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК; бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, образованные комбинациями плазмид и фаговой ДНК, и вирусная ДНК, например, вируса коровьей оспы, аденовируса, вируса оспы птиц и болезни Ауески). Полагают, что любой вектор можно использовать, пока он остаётся реплицируемым и жизнеспособным в организме хозяина.

В частности, некоторые варианты настоящего изобретения включают рекомбинантные конструкции, содержащие одну или более последовательностей, так широко представленных выше (например, 8Ε0 ГО N0: 3, 4 и 6). В некоторых вариантах настоящего изобретения конструкции содержат вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор, в который включена последовательность по изобретению, в прямой или обратной ориентации. В других вариантах изобретения гетерологичную структурную последовательность собирают в подходящей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения соответствующие ДНК последовательности вводят в вектор различными методами. Как правило, последовательность ДНК известными в технике

- 12 012567 методами вводят в соответствующий(щие) сайт(ы) расщепления рестритазами.

Специалистам в данной области техники известно большое число подходящих векторов. Такие векторы включают, но без ограничения, следующие векторы: 1) Бактериальные - рОЕ70. рЦЕ60. рЦЕ-9 (О1адеп), рВ8, ρΌ10, рйадекспр!, ρ§ίΧ174, рЫиекспр! 8К, рВ8К8, ρNΗ8Α, ρNΗ16Α, ρNΗ18Α, ρNΗ46Α (81га1адепе); р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, рОВ540, рШТ5 (Рйагтааа); и 2) Эукариотические - ρ\V^NЕ0. р8У2САТ, р0С44, ΡΧΤ1, р8С (81га!адепе), р8УК3, рВРУ, рМ8С, р8УЪ (РБагтас1а). Любую другую плазмиду или любой другой вектор можно использовать, пока они являются реплицируемыми и жизнеспособными в хозяине. В некоторых предпочтительных вариантах настоящего изобретения экспрессирующие векторы млекопитающих содержат ориджин репликации, промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайты полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В других вариантах изобретения для создания требующихся нетранскрибируемых элементов можно использовать последовательности ДНК, полученной при сплайсинге 8У40, и сайты полиаденилирования.

B. Клетки-хозяева для продуцирования ΙΕ-32

В другом варианте настоящее изобретение охватывает клетки-хозяева, содержащие вышеописанные конструкции. В некоторых вариантах настоящего изобретения клеткой- хозяином является клетка высших эукариот (например, клетка млекопитающих или насекомых). В других вариантах настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка низших эукариот (например, клетка дрожжей). В других вариантах настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка прокариот (например, бактериальная клетка). Конкретные примеры клеток- хозяев включают, но без ограничения, ЕксйепсШа сой, 8а1топе11а 1урЫтигшт, ВасШик киЬйШ и различные виды клеток рода Ркеийотопак, 81гер1отопа§, 81гер1отусе5 и 81арйу1ососси5, а также Зассйаготусек сегМЦае, 8сЫхо5ассЕаготусе5 ротЬе, клетки ЭгокорЕйа 82, клетки 8ройор1ега 8£9, клетки яичников китайского хомячка (СНО), линии С08-7 фибробласт печени обезьян, С127, 3Т3, 293, 293Т, НеЬа и ВНК клеточные линии.

Для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью, можно обычным образом использовать конструкции в клетках-хозяевах. В некоторых вариантах изобретения введение конструкции в клетку-хозяина можно выполнять трансфекцией с применением фосфата кальция, трансфекцией, опосредованной ОЕАЕ- декстраном, или электропорацией. Или же, в некоторых вариантах изобретения полипептиды ΙΕ-32 продуцируют в обычных пептидных синтезаторах.

C. Очистка Ш-32

Настоящее изобретение также охватывает способы выделения и очистки Ш-32 от культур рекомбинантных клеток, включая, но без ограничения, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракция кислотой, аноно- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, хроматография с гидрофобным взаимодействием, аффинная хроматография, хроматография на гидроксилапатите и лектин- аффинная хроматография. В других вариантах настоящего изобретения для завершения конфигурации зрелого белка при необходимости можно использовать стадии рефолдинга белка. В других вариантах настоящего изобретения на стадиях конечной очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Далее настоящее изобретение включает полинуклеотиды, имеющие кодирующую последовательность, слитую в рамке считывания с маркерной последовательностью, что позволяет очищать полипептид по настоящему изобретению. Неограничивающим примером маркерной последовательности является гексагистидиновый хвост, который может обеспечиваться вектором, предпочтительно, вектором рОЕ9, что позволяет очищать полипептид, слитый с маркером, в случае бактериального хозяина, или, например, маркерная последовательность может быть гемагглютининовой меткой (НА), когда используют клетку хозяина- млекопитающего (например, клетки С08-7).

Ό. Гибридные (химерные, слитые) белки Ш- 32

Настоящее изобретение также охватывает гибридные белки, включающие весь Ш-32 или его часть. Соответственно, в некоторых вариантах настоящего изобретения последовательности, кодирующие полипептид, могут вводиться как часть гибридного гена, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую другой (отличный) полипептид. Предполагается, что этот тип системы экспрессии найдёт применение в условиях, когда желательно получить иммуногенный фрагмент белка ΙΕ-32.

Помимо применения гибридных белков для повышения иммуногенности, хорошо известно, что гибридные белки могут также облегчать экспрессию белков, таких как белок ЕЬ-32 по данному изобретению. Поэтому в некоторых вариантах настоящего изобретения Ш-32 может генерироваться в виде глутатион-8-трансферазы (т.е. С8Т-гибридного белка). Предполагают, что С8Т-гибридные белки способствуют легкой очистке Ш-32, так, как с применением матриц на основе производных глутатиона. В другом варианте настоящего изобретения гибридный ген, кодирующий очистку лидерной последовательности, такой как последовательность сайта расщепления поли-(Н18)/энтерокиназа на №конце заданного участка Ш-32, может способствовать очистке экспрессированного гибридного белка Ш-32 аффинной хроматографией с применением смолы №²⁺ металл. Ещё в одном варианте настоящего изобретения очищенную лидерную последовательность можно затем удалять обработкой энтерокиназой.

- 13 012567

Е. Варианты ΙΕ-32

Другие варианты настоящего изобретения включают мутантные или вариантные формы ΙΕ-32. Структуру пептида, имеющего активность ΙΕ-32, можно модифицировать для таких целей, как повышение терапевтической или профилактической эффективности или стабильности (например, ех у1уо время хранения, и/или резистентность к протеолитическому расщеплению 1и У1уо). Такие модифицированные пептиды рассматриваются как функциональные эквиваленты пептидов, имеющие активность белков ΙΕ32 по данному описанию. Модифицированный пептид с изменённой аминокислотной последовательностью можно получать, например, заменой, делецией или добавлением аминокислот. В некоторых вариантах изобретения предпочтительные ΙΕ-32 варианты включают агонисты ΙΕ-32 (например, варианты ΙΕ32, которые обладают ΤΝΡα-индуцирующей активностью), тогда как другие предпочтительные варианты ΙΕ-32 включают антагонисты ΙΕ-32 (например, варианты ΙΕ-32, которые не обладают ΤΝΡαиндуцирующей активностью и которые ингибируют ΤΝΡα- индуцирующую активность белков ΙΕ-32 дикого типа).

ΙΙΙ. Антитела ΙΕ-32

Можно получать антитела для того, чтобы способствовать обнаружению белков ΙΕ-32. Антитела можно получать, используя различные иммуногены. В одном варианте изобретения иммуноген для генерирования антител, распознающих (узнающих) ΙΕ-32, представляет собой ΙΕ-32 пептид. Такие антитела включают, но без ограничения, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, фрагменты ЕаЬ и библиотеки экспрессии ЕаЬ.

Для получения поликлональных антител против ΙΕ-32 можно использовать различные методики, известные в уровне техники. Для продуцирования антитела различных животных-хозяев, включая, но без ограничения, кроликов, мышей, крыс, овец, коз и т.д., можно иммунизировать, инъецируя пептид, соответствующий ΙΕ-32 эпитопу. В предпочтительном варианте изобретения пептид конъюгирован с иммуногенным носителем (например, дифтерийный анатоксин, альбумин бычьей сыворотки или гемоцианин лимфы улитки). Для повышения иммунологического ответа можно добавлять различные адъюванты, в зависимости от вида хозяина, включая, но без ограничения, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, поверхностно-активные полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и потенциально применимые адъюванты человеческого происхождения, такие как ВасШе Са1тей- Оцепи).

Предполагается, что для получения моноклональных антител против ΙΕ-32 найдёт применение по настоящему изобретению любой метод, который обеспечивает получение молекул антитела с использованием непрерывных клеточных линий в культуре (См., например, Наг1оте аиб Ьаие, АийЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Маииа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ). Эти методы включают, но без ограничения, метод гибридом (Кбй1ег аиб Мйк1ет, №11иге 256: 495-497, 1975), а также метод триом, метод человеческих В-клеточных гибридом (См., например, КохЬог е! а1., Ьттиио1 Шбау, 4: 72, 1983) и метод ЕВУ-гибридом для получения человеческих моноклональных антител (Со1е е! а1., в Моиос1оиа1 АибЬобу аиб Саисег Гегару, А1аи Н. Ыкк, Шс., 77- 96, 1985).

Кроме того, полагают, что методы, описанные для получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) найдёт применение при получении Ш-32 специфических одноцепочечных антител. Ещё в одном варианте изобретения используются методы, описанные для создания библиотек экспрессии ЕаЬ (Нике е! а1., 8с1еисе, 246: 1275-1281, 1989), обеспечивающие быструю и простую идентификацию моноклональных ЕаЬ фрагментов с заданной специфичностью в отношении Ш-32.

Полагают, что любой метод, пригодный для продуцирования фрагментов антител, найдёт применение при получении фрагментов антител, которые содержат идиотип (антигенсвязывающую область) молекулы антитела. Например, такие фрагменты включают, но без ограничения: фрагмент Е(аЬ')2, который можно получать расщеплением молекулы антитела под действием пепсина; фрагменты ЕаЬ', который можно получать восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента Е(аЬ')2, и фрагменты ЕаЬ, которые можно получать, обрабатывая молекулу антитела папаином и восстановителем.

При получении антител рассматривается, что скрининг на заданное антитело проводится известными в уровне техники методами (например, такими как радиоиммуноанализ, ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвич-иммуноанализы, иммунорадиометрические анализы, реакции диффузии-осаждения в геле, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы 1и кйи (например, с применением коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), Вестерн-блоттинг, реакции осаждения (преципитации), реакции агглютинации (например, реакции агглютинации в геле, реакции гемагглютинации и т. д.), реакции фиксации комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, анализы на протеин А и иммуноэлектрофорез и т.д.

В одном варианте изобретения связывание антитела определяют, детектируя метку на первичном антителе. В другом варианте изобретения первичное антитело обнаруживают, детектируя связывание вторичного антитела или реагента с первичным антителом. Ещё в одном варианте изобретения вторичное антитело является меченым. В уровне техники известно много способов детектирования связывания иммуноанализом, и они входят в объём настоящего изобретения. Как общеизвестно в уровне техники,

- 14 012567 иммуногенный пептид не должен содержать молекулу носителя, применяемого по любому протоколу иммунизации. Например, если пептид конъюгирован с КЬН, при скрининге он может быть конъюгирован с В8А или использоваться непосредственно.

Вышеуказанные антитела можно использовать в способах, известных в уровне техники, относящихся к локализации и структуре 1Ь-32 (например, для Вестерн-блоттинга), к измерению их уровней в соответствующих биологических образцах и т.д. Антитела можно использовать для детектирования 1Ь32 в биологическом образце индивидуума. Биологический образец может быть биологической жидкостью, такой как, но без ограничения, кровь, сыворотка, плазма, интерстициальная жидкость, моча, ликвор и т.п., содержащая клетки.

Биологические образцы можно затем проверять непосредственно на присутствие человеческого 1Ь32 при использовании подходящего метода (например, ЕЫ8А или радиоиммуноанализа) и формата (например, микролунки, тест-полоски и т.д.). Или же, белки в образце можно разделять по размеру (например, электрофорезом на акриламидном геле (РАСЕ), в присутствии или в отсутствие додецилсульфата натрия (8Ό8), и в присутствии 1Ь-32, детектируемого иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг).

Методы иммуноблоттинга обычно более эффективны для антител, полученных против пептида, соответствующего эпитопу белка, и, следовательно, особенно подходят для настоящего изобретения.

Особенно предпочтительные варианты настоящего изобретения содержат Ш-32 антитела для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Считают, что 1Ь-32-реактивные антитела, которые нейтрализуют ТИБа-индуцирующую активность Ш-32, ослабляют, по меньшей мере, один симптом заболевания РА (КА), и в особенно предпочтительных вариантах изобретения замедляют развитие заболевания РА. Дополнительные указания, относящиеся к получению и применению терапевтических антител, которые, как полагают, применимы к системе 1Б-32, имеются в патентах США 6277969 и 6448380 (оба вводятся в данное описание в качестве ссылки), относящихся к терапевтическим ТИР- реактивным антителам.

IV. Фармацевтические композиции, содержащие 1Б-32 нуклеиновые кислоты, пептиды или антитела

Помимо этого, настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, которые могут содержать целую Ш-32 полинуклеотидную последовательность или её участки, Ш-32 полипептиды, ингибиторы или антагонисты Ш-32 биоактивности, включая антитела, одни или в комбинации по меньшей мере с одним отличным агентом, таким как стабилизатор, они могут вводится в любом стерильном биосовместимом фармацевтическом носителе, включая, но без ограничения, физиологический солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу и воду.

Способы по настоящему изобретению находят применение при лечении аутоиммунных заболеваний и рака. Пептиды можно вводить пациенту внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический солевой раствор. Можно использовать стандартные способы внутриклеточной доставки пептидов (например, доставка в липосомах). Такие способы хорошо известны рядовому специалисту в данной области техники. Препараты по данному изобретению применимы для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное, внутримышечное и интраперитонеальное. Используя генную терапию можно также осуществить внутриклеточное введение полипептида.

Как хорошо известно в медицине, доза для любого пациента зависит от многих факторов, включая габариты пациента, площадь поверхности тела, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и взаимодействие с другими, одновременно принимаемыми, лекарствами.

Соответственно, в некоторых вариантах настоящего изобретения Ш-32 нуклеотидную и Ш-32 аминокислотную последовательности можно вводить пациенту самостоятельно или в комбинации с другими нуклеотидными последовательностями, лекарствами или гормонами, или в фармацевтических композициях, в которых они смешаны с эксципиентом(ами) или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В одном варианте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным. В другом варианте настоящего изобретения Ш-32 полинуклеотидные последовательности или Ш-32 аминокислотные последовательности Ш-32 можно вводить самостоятельно (одни) индивидууму, подвергающемуся заболеванию или страдающему от него.

В других вариантах фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно приготовить, используя фармацевтически приемлемые носители, общеизвестные в уровне техники, в лекарственных формах, пригодных для орального применения. Такие носители позволяют готовить фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, кашиц, суспензий и т.п., для орального или назального приёма пациентами, проходящими лечение.

Фармацевтические композиции, пригодные для применения по данному изобретению, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Например, эффективное количество Ш-32 может представлять собой такое количество, которое индуцирует продуцирование ΤΝΡα. Определение эффективных количеств является компетенцией специалистов в данной области техники, особенно в свете представленной в данном описании информации (раскрытия).

- 15 012567

Для любого соединения, применяемого в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу можно сначала оценить, используя анализы в клеточных культурах. Затем, предпочтительно, дозу можно проверить на животных моделях (предпочтительно, на мышиных моделях) для достижения нужного интервала концентраций в кровотоке, который регулирует уровни ΤΝΡα.

Терапевтически эффективная доза относится к такому количеству 1Ь-32, которое улучшает по меньшей мере один симптом болезненного состояния (например, рака), или к такому количеству 1Ь-32 антитела или антагониста, которое улучшает, по меньшей мере, болезненное состояние (например, аутоиммунное заболевание, такое как ревматоидный артрит). Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить стандартными фармацевтическими методами в клеточных культурах или на экспериментальных животных (ЬО₅₀, доза, смертельная для 50% популяции; и ΕΌ₅₀, доза, терапевтически эффективная у 50% популяции). Отношение смертельной (токсической) дозы к дозе, вызывающей терапевтический эффект, у 50% популяции называется терапевтическим индексом, и его можно выразить отношением ΕΌ₅₀/ΕΌ₅₀. Предпочтительными являются соединения с большим терапевтическим индексом. Данные, полученные в анализах клеточных культур и дополнительных исследованиях на животных, можно использовать при определении интервала доз для применения на людях. Дозировка таких соединений лежит, предпочтительно, в интервале концентраций в кровотоке, которая включает ΕΌ₅₀ с малой токсичностью или в отсутствие токсичности. Дозировка в этом интервале меняется в зависимости от применяемой лекарственной формы, восприимчивости пациента и способа введения. Количества в нормальной (обычной) дозе могут варьироваться от 0.1 до 1000000 микрограмм, вплоть до общей дозы около 1 г, в зависимости от способа введения.

V. Скрининг лекарств с применением 1Ь-32

Настоящее изобретение охватывает способы и композиции, применяющие 1Ь- 32 в качестве мишени для скрининга лекарств, которые могут изменять ответ провоспалительных цитокинов (например, продуцирование ΤΝΡα).

Метод скрининга лекарств обеспечивает высокопроизводительный скрининг на соединения, обладающие подходящей аффинностью связывания с пептидами 1Ь-32, и подробно описан в Международной заявке XVО 84/03564, вводимой в данное описание в качестве ссылки. Коротко говоря, большое число различных малых тестируемых пептидных соединений синтезируют на твёрдом субстрате, таком как пластиковые штифты (штырьки), или на другой поверхности. Затем пептидные тестируемые соединения реагируют с 1Ь-32 пептидами и отмываются. Затем связанные 1Ь-32 пептиды детектируют хорошо известными в технике способами.

В другом методе используются 1Ь-32 антитела, полученные как обсуждалось выше. Такие антитела, способные специфически связываться с 1Ь-32, конкурируют с тестируемым соединением за связывание с 1Ь-32. Таким образом, антитела можно использовать для обнаружения любого пептида, который имеет одну или более антигенных детерминант, общих с 1Ь-32 пептидом.

В настоящем изобретении рассматриваются многие другие способы скрининга соединений. Приведённые ниже примеры представлены только для иллюстрации ряда подходящих методов. Рядовой специалист поймёт, что можно использовать множество других методов скрининга.

В частности, в настоящем изобретении рассматривается применение клеточных линий, трансфецированных с помощью 1Ь-32 или его вариантов или мутантов, для скрининга соединений на активность, и, в частности, для высокопроизводительного скрининга соединений из комбинаторных библиотек (например, библиотек, содержащих более 10⁴ соединений). Клеточные линии по настоящему изобретению можно использовать в различных методах скрининга. В некоторых вариантах изобретения клетки можно использовать в анализах вторичных мессенджеров, которые контролируют сигнальную трансдукцию после активации рецепторов клеточной поверхности. В других вариантах изобретения клетки можно использовать в анализах репортёрных (маркерных) генов, которые мониторируют клеточные ответы на уровне транскрипции/трансляции.

В анализах вторичных мессенджеров клетки-хозяева предпочтительно трансфецируют, как описано выше, с помощью векторов, кодирующих 1Ь-32 или его варианты или мутанты. Затем клетки-хозяева обрабатывают соединением или множеством соединений (например, из комбинаторной библиотеки) и анализируют на наличие или отсутствие ответа. Полагают, что, по меньшей мере, несколько соединений из комбинаторной библиотеки могут служить в качестве агонистов, антагонистов, активаторов или ингибиторов белка или белков, кодируемых векторами. Также рассматривают, что, по меньшей мере, некоторые из соединений в комбинаторной библиотеке может служить в качестве агонистов, антагонистов, активаторов или ингибиторов белка, действующего до или после (апстрим или даунстрим) белка, кодируемого вектором, в направлении сигнальной трансдукции.

Клетки также применимы в анализах репортёрных (маркерных) генов. Анализы репортёрных генов включают применение клеток-хозяев, трансфецированных векторами, кодирующими нуклеиновую кислоту, содержащую элементы контроля транскрипции целевого гена (т.е. гена, который контролирует биологическую экспрессию и функцию мишени заболевания), соединённого с последовательностью, кодирующей репортёрный (маркерный) ген. Следовательно, активация целевого гена приводит к активации

- 16 012567 генного продукта репортёрного гена.

Экспериментальная часть

Нижеприведённые примеры даются для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные варианты и аспекты настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.

В приведённой ниже экспериментальной части применяются следующие сокращения: ед (эквиваленты); М (полярность); мкМ (микромолярность); N (нормальность); моль (моли); ммоль (миллимоли); нмоль (наномоли); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); нг (нанограммы); л (литры); мл (миллилитры); мкл (микролитры); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); °С (градусы Цельсия); Ед (И) (единицы), мЕд (тИ) (миллиединицы); мин (минуты); с (секунды); % (проценты); кЬ, тыс. н.о. (тысяча нуклеиновых оснований); п.о. (пара оснований); ПЦР, РСК (полимеразная цепная реакция).

Кроме того, применяют следующие клетки и биоанализы. Человеческую ΝΚ клеточную линию получают от Όγ. Ншъ Κ1^ηде^таη (Кикй Мебюа1 Сейег, СЫсадо, 1Ь) и культивируют в среде КРМ11640, содержащей 10% ЕС8, 1Ь-2 (50 пг/мл) и 1Б-15 (200 пг/мл) (РергсЯеск Коску Н111, N1). Макрофагальные клетки мышей Кает 264,7, человеческие клетки А549 рака лёгких, печёночные клетки Сок7 обезьян, Αη_)ои65 (субклон линии 293 Т человеческих фибробластов), человеческие эпителиальные клетки \УБ11 и человеческую моноцитарную ТНР клеточную линию получают из американской коллекции типовых культур (АТСС) и хранят в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Биоанализы проводят в 96- луночных планшетах.

Коротко говоря, клетки Кает (РергсЯеск клетки А549-КР (2 х 10⁵/мл, 0.1 мл/лунка) и человеческие ΝΚ клетки (5 х 10⁵/мл, 0.1 мл/лунка) засевают в 96-луночных планшетах и культивируют до тех пор, пока не произойдёт адгезия к планшетам. При анализах в клетках Кает использованную среду удаляют и клетки стимулируют свежей средой (0.2 мл), содержащей различные концентрации г1Ь-32 в присутствии 5 мкг/мл полимиксина В (ВебГогб ЬаЬогаФбек, ВебГогб, ОН). При анализах в клетках А549-КД использованную среду удаляют и клетки стимулируют свежей средой (0.2 мл), содержащей 1Б-18 (полученный как описано К1т е1 а1., ί Iттиηο1, 166: 148-154, 2001). При анализах в клетках ΝΚ клетки стимулируют с помощью 1Б-12 (Рерго1ес11) или 1Б-18, или обоих цитокинов. Клетки ТНР (5 х 10⁵/мл, 0.1 мл/лунка) засевают в 96- луночные планшеты в отсутствие ЕС8, а затем стимулируют с помощью г1Ь-32 из различных источников. Для анализа дифференцировки ТНР-1 под действием форбол-12-миристат-3 ацетата (РМА) клетки ТНР-1 (0,25 х 10⁵/мл, 0,1 мл/лунка) засевают в 24^х- луночные планшеты, а затем стимулируют с помощью 100 нг/мл РМА (81дта, 8ΐ Бонк МО) в течение 48 ч, отмывают в среде, не содержащей ЕС8, и клетки обрабатывают г1Ь-32. Планшеты помещают в инкубатор для клеточных культур на 16-20 ч, а затем культуральные супернатанты собирают для измерения цитокинов.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют из остаточных лейкоцитов после тромбоцитофереза здоровых доноров, используя Нкорас.|ие (81дта), как утверждено СотЬтеб Со1огабо Iηνе8ί^даί^οηа1 Кеу1еет Воагб. РВМС (1,5 х 10⁷) засевают в 6-луночные планшеты в 3 мл КРМ1, содержащей 10% ЕС8, а затем стимулируют с помощью 20 мкг Сои А (81дта). Планшеты помещают в инкубатор для клеточных культур на 60 ч, после чего культуральный супернатант и клеточный лизат собирают для измерения ЕЬ-32.

1Б-32 оценивают в единицах биологической активности, так как существуют различия в уровнях активности между г1Ь-32, продуцированным Е. со11, и г1Ь-32, продуцированным клетками млекопитающих, и так как существуют различия в уровнях активности между различными партиями. Одна единица 1Б-32 определяется как количество 1Ь-32, которое индуцирует 2-кратную индукцию человеческого или мышиного ТКРа в РМА-дифференцированных клетках ТНР-1 и мышиных Кает клетках, соответственно, в описанных выше условиях анализа. Приблизительная концентрация 1 единицы г1Ь-32, продуцированного Е. сой, составляет 20 нг/мл, тогда как приблизительная концентрация 1 единицы г1Ь-32 млекопитающих составляет 0,1 нг/мл (как найдено методами ЕСЬ и Вестерн-блоттинга).

Пример 1. Идентификация 1Б-18 индуцибельных генов, включающих ΝΚ4/ΙΕ-32

Дикого типа человеческие клетки А549 рака лёгких (А549- ^Т) экспрессируют ББ-18Ка, но не 1Б18Ρβ. Поэтому, чтобы экспрессировать функциональный ББ-18 рецептор в клетках А549, клетки А549 трансфецируют с использованием вектора, экспрессирующего цепь ББ-18Кв. Коротко говоря, человеческие клетки рака лёгких А549 (3 х 10⁵ на лунку) засевают в 6-луночные планшеты за день до трансфекции. Затем клетки отмывают, используя 2 мл среды Орб-МЕМ (Iην^ΐ^οдеη, СагкЬаб, СА) и инкубируют в течение 25 мин в 1 мл свежей среды. Раствор смеси для трансфекции для каждой лунки готовят, смешивая 5 мкл липофектамина 2000 в 100 мкл Орб-МЕМ с последующей инкубацией в течение 5 мин под колпаком тканевой культуры. После этого добавляют 2 мкг плазмидной ДНК, рТАРСЕТ/1ш1Б- 18Ρβ (К1т е1 а1., ί Iттиηο1, 166: 148-154, 2001), а затем инкубируют в течение 20 мин. Раствор смеси для трансфекции добавляют в лунки и планшет инкубируют ещё в течение 4 ч при 37°С. Трансфекцию заканчивают, добавляя в каждую лунку 2 мл клеточной культуральной среды, содержащей 10% ЕС8. На следующий день клетки обрабатывают трипсином и переносят в плашку 15 см. После адгезии клеток к

- 17 012567 плашке культуральную среду заменяют свежей средой, содержащей 800 мкг/мл неомицина (О418, Ιπνί!годеи). Среду для селекции каждые три дня заменяют свежей средой до появления индивидуальных колоний (~ 10-14 дней). Небольшие бумажные кружочки 3 мм в окружности стерилизуют, смачивают трипсином, а затем используют для отбора отдельных колоний. Колонии переносят в 24-луночный планшет, содержащий в каждой лунке 1 мл среды для селекции. Индивидуальные колонии выращивают до тех пор, пока не получат 10 клеток, а затем каждый клон проверяют на экспрессию трансфецированного гена с помощью КТ- РСК, а также биоанализов, с помощью которых измеряют ЙБ-б и ЙБ-8 в клеточной культуральной среде после ЙБ-18 стимуляции в течение 24 ч. По показаниям как КТ-РСК, так и биоанализа, три клона являются позитивными. Для получения единичного клона готовят культуры в ограничивающем разведении.

Как показано на фиг. 1, 1А, клетки А549, трансфецированные с помощью конструкции ΙΕ-18Κβ (Α549-Κβ) (К1т е! а1., 1 1ттиио1, 1бб: 148-154, 2001), экспрессируют как цепь 1Ь-18Ка, так и цепь 1Ь18Κβ, что определяется с помощью КТ-РСК. Стабильный клон (А549-Кв)тестируют на индукцию 1Ь-8 после стимуляции под действием ΙΠ-18 (100 нг/мл) в течение 1б ч. После экспрессии ΙΕ-18Εβ в клетках А549 клетки Α549-Εβ отвечают на ЙБ-18 в отсутствие костимулятора, продуцируя 1Ь-б и 1Ь-8, тогда как родительская клеточная линия А549 (А549-АТ) по-прежнему не отвечают на ЙБ-18 (См. фиг. 1, рисунки В и С, N=7).

Затем клетки Α549-Ρ.β используют для изучения экспрессии 1Ь-18-индуцибельного гена методом т1сгоаггау (или с помощью микрочипов). Коротко говоря, клетки Α549-Ρ.β засевают по 2 х 10^б в девятисантиметровые плашки за день до эксперимента. Затем клетки стимулируют с помощью ΙΠ-18 (50 нг/мл) в течение б ч, после чего обработанные и контрольные клетки собирают. Тотальную РНК выделяют с помощью Тп-Кеадеи! и очищают с применением набора КЫеаку (О|адеи. Уа1еис1а, СА). Тотальную РНК используют затем для тютоатгау анализа в соответствии с инструкциями от АПутейлх. Тотальную РНК превращают в кДНК первого тяжа (нити), используя ^ирегаспр! II КТ Ц^йтодеи). кДНК второй нити синтезируют, используя Т4 ДНК-полимеразу Ι. После синтеза второй нити реакционную смесь очищают с помощью набора, снабжённого ОеиеСЫр. Проводят синтез кРНК для получения меченой биотином кРНК, используя набор для мечения транскрипта РНК. Перед гибридизацией биотинилированную кРНК фрагментируют. Образцы гибридизуют с АПутейтх СеиеСЫр НО- Ш33 и данные анализируют в лаборатории микрочипов (тютоатгау соге) Медицинского Центра Университета Колорадо.

Данные, полученные с помощью микрочипов, показывают, что ΙΠ-18 индуцирует гены цитокинов, включая ЙБ-б и ГБ-8. Некоторые хемокины, включая интерферон-β2 и ΙΠ-1β, экспрессия которых, как было известно ранее, является ЙБ-18- индуцибельной, входят в группу, в которой наблюдается повышенная экспрессия, более чем в 3 раза (1од основания 2), в ответ на обработку ЙБ-18 (см. табл. 1, в которой приведены данные двух независимых экспериментов). Интересно отметить, что степень индукции под действием транскрипта 4 природных киллерных клеток (ΝΚ4) также очень высока (5,3-кратная). Ген М<4первоначально описан как продукт активированных ΝΚ или Т-клеток (Ла111 е! а1., 1 Iттиио1, 148: 597-б03, 1992), хотя об этом гене не собрано никаких функциональных данных. Экспрессию мРНК ΝΚ4 изучают методом КТ-РСК, используя ту же самую тотальную РНК, которую используют в исследовании методом иисгоаггау (микрочипа). Первый тяж кДНК синтезируют, приблизительно, из 1 мкг тотальной РНК, используя ^црегаспр! ΙΙ от ^йтодеи (СатНЬаб, СА). Реакцию ПЦР (РСК) проводят при 94°С в течение 45 с, 70°С в течение 2 мин, 59°С в течение 1 мин, 30 циклов со смысловым праймером 5'СТОТСССОАОТСТООАСТТТ-3' (8ЕО ΙΌ N0: 1) и антисмысловым праймером 5'ОСаООТООТООТСАОТАТС-3' (8Е0 ΙΌ N0: 2). ΝΚ4 транскрипт детектируют в ΙΠ-18, обработанном клетками А549-^, но не в нестимулированных клетках А549-^ (См. фиг. 1, 1Ό).

- 18 012567

Таблица 1. Ш- 18 индуцибельные гены, идентифицированные методом тюгоаггау (микрочипа)

Νο. в СепВапк	Кратность увеличения	Название гена
М28130	8.6	Интерлейкин- 8 (1Ь- 8)
Ό64197	8.0	Хемокин ехойик- 1
Х04430	7.7	Интерферон- β2 (1Ь- 6)
И81234	5.8	Хемокин- аЗ (СКА- 3)
И37518	5.3	Лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с ΤΝΡ (ТКА1Ь)
АВ007872	5.3	ΤΝΕα- индуцирующий фактор (ΤΑΙΡ, ΝΚ4)
Х54489	5.0	Активность, стимулирующая рост меланому (МС8А)
М3 6821	4.6	СКО-γ
Х03656	4.0	Гранулоцитарный колиниестимулирующий фактор (О- С8Е)
Ζ70276	3.7	Фактор роста фибробластов 12
М36820	3.2	ΟΚΟ-β
Х04500	3.5	Проинтерлейкин- 1β
104513	3.1	Основной фактор роста фибробластов (ЬРОГ)

Также изучают экспрессию ΝΚ4 в клеточной линии ΝΚ92 (НокЫпо е! а1., 1 Iттиηо1, 162: 51-59, 1999). Ген ΝΚ 4 конститутивно и с высокими уровнями экспрессируется в этой клеточной линии при выдерживании в кондиционированной среде, содержащей как №-2, так и Ш-15. Полагают, что Ш-2 в кондиционированной среде способствует высокому уровню экспрессии гена ΝΚ4, наблюдаемому в клеточной линии ΝΚ92.

Пример 2. Индукция ΤΝΕ;ι с помощью №<4/Ш- 32

Для определения функции этого мало описанного генного продукта кДНК ΝΚ4 (см. фиг. 3, Ш-32«) клонируют из клеток ΝΚ92 (Иаб1 е! а1., кирга, 1992) в рСЕМТ-Еаку (Рготеда) для секвенирования, а затем инсерт переносят в рРК0ЕХ/Н(а (ЧпуЦгодеп) для экспрессии в Е. соб, или в рТЛКСЕТ (Рготеда) для экспрессии в клетках млекопитающих. Рекомбинантный ΝΚ4 экспрессируют в Е. соб и очищают на колонке для аффинной хроматографии ΤΛΕ0Ν (Iηνй^одеη), вводя метку (хвост) Н1к⁶ на Ν- конце рекомбинантных белков. Очищенный аффинной хроматографией на колонке ΤΑΕ0Ν белок хроматографируют эксклюзионной хроматографией по размеру (8ирегйех 75, АК/ГАЕРЬС) и расщепляют с помощью вируса гравировки табака (Шубю^еи) в течение 16 ч при 4°С для удаления Н1к⁶ хвоста. Отщеплённый рекомбинантный белок диализуют в фосфатном буфере (20 мМ, рН 9). Этот материал затем подвергают ионообменной хроматографии (НГГгарРЕЕ, АК/ГАЕРЬС). Рекомбинантный ΝΚ4 белок, очищенный последовательной трёхстадийной хроматографией (аффинная хроматография с Нщ-меткой, эксклюзионная хроматография по размеру частиц и ионообменная хроматография) выходит в виде гомогенной полосы около 20 кДа в 10% геле δΌδ-РАОЕ, затем окрашенном кумасси синим (см. фиг. 2, 2А).

Трижды очищенный рекомбинантный белок ΝΚ4 испытывают на биологическую активность, измеряя секрецию ΤΝΕα макрофагальными клетками мышей Кате 264,7 в присутствии полимиксина В (100 Ед/мл). Мышиные макрофагальные клетки Кате 264,7 отвечают на рекомбинантный ΝΚ4 и продуцированием большого количества ΤΝΕα, совпадающего с пиками (максимумами) белковых фракций, вымываемых с ионообменной колонки (см., фиг. 2, 2А). В связи с распознаванием вновь открытой биологической активности ΝΚ4 молекула была переименована и названа Ш-32/ΤΝΕα- индуцирующий фактор (ΤΑΣΕ). Как показано на фиг. 2, 2В, ΕΕ-32α индуцирует значительные количества ΤΝΕα при таких низких концентрациях Ш-32« как 400 пг/мл (27 пикомолей в расчёте на вычисленную молекулярную массу Ш-32, равную 14,8 кДа), и повышает продуцирование ΤΝΕα в зависимости от дозы. Общеизвестно, что ΤΝΕι обладает многими воспалительными свойствами, которые являются причиной многочисленных воспалительных и аутоиммунных заболеваний (ВеиИег е! а1., В1оой Се11к МоГОщ, 24:216-230, 1998).

Рекомбинантный ΕΕ-32α также продуцируется клетками млекопитающих транзиторной трансфекцией клеток Сок-7 (8 х 10⁶) с помощью экспрессирующего вектора рΤΑК6ΕΤ/I^-32 методом с применением ИЕАЕ-декстрана (8отраугас е! а1., Ргос №111 Асай 8с1 И8А, 78: 7575-7578, 1981). Как показано на фиг. 2, 2С, рекомбинантный ЕЕ-32а (100 пг/мл), полученный из концентрированного супернатанта кле

- 19 012567 ток, трансфецированных с помощью 1Ь-32а, индуцирует продуцирование ΤΝΕα, тогда как концентрированный супернатант мнимо (суррогатных) трансфецированных клеток не индуцирует продуцирование ΤΝΕα. Концентрацию рекомбинантного 1Ь-32а в супернатантах Соб-7 определяют методом ЕСЬ и иммуноблоттингом. Кроме того, найдено, что 1Ь-32а, продуцированный клетками млекопитающих, обладает более высокой ΤΝΕα- индуцирующей активностью, чем 1Ь-32а, полученный в бактериальных клетках.

Пример 3. Идентификация геномной структуры и вариантов сплайсинга ГБ-32

Анализируют структура гена ГБ-32 и его локализацию в геноме человека. ГБ-32 также клонируют методом ΗΤ-РСН при использовании человеческой клеточной линии ΝΚ92, культивированной в присутствии ГБ-2 (50 пг/мл) и ГБ-15 (200 пг/мл). Для этой цели используют следующие праймеры: смысловой 5'СТОТССССАС ΤСΤССАСΤΤΤ-3' (8ЕБ) II) Ν0: 1), и антисмысловой 5'-ССαССΤССΤССΤСАСΤАΤС- 3' (8ЕЦ ГО Ν0: 2). Как показано на фиг. 3 и 5, три варианта сплайсинга ГБ-32 (^-32α, раскрываемый как 8ЕБ) ГО Ν0: 3 и Νο. в СЕNВАNΚ АУ495331, ГБ-323, раскрываемый как 8ЕБ) Ш Ν0: 4 и Νο. в СЕNВАNΚ АУ495332, и ГБ-328, раскрываемый как 8ЕЦ ГО Ν0: 5 и Νο. в СЕNВАNΚ АУ495333) идентифицируют при использовании РНК клеток ΝΚ92, тогда как в другом варианте сплайсинга (ГБ-32у, раскрываемый как 8ЕЦ ГО Ν0: 6 и Νο. в СЕNВАNΚ ВК004065) сообщалось ранее как о ΝΚ4 транскрипте (Νο. в СЕ№ ВАNΚ: ΝΜ 004221). Таким образом, ГБ-32 экспрессируется, по меньшей мере, в виде четырёх вариантов вследствие альтернативного сплайсинга мРНК.

Для того, чтобы определить, что ген ГБ-32 расположен на хромосоме 16р13.3, используют В1аБ! программу с веб-сайта NСВГ. Около 5 тыс. н.о. из последовательности, охватывающий ген ГБ-32 (представлена как 8ЕЦ ГО Ν0: 11 и Νο. в СЕNВАNΚ АУ495334), идентифицируют на участке в 180 тыс. н.о. последовательности человеческой хромосомы 16 (Νο. в СЕNВАNΚ АС108134). При сравнении последовательностей вариантов сплайсинга с геномной последовательностью найдено, что ген ГБ-32 содержит восемь малых экзонов, причём второй и третий экзоны содержат стартовые кодоны АΤС. ГБ-32у содержит дополнительные 46 аминокислот на своём Ν-конце (8ЕЦ Ш Ν0: 14) вследствие отсутствия сплайсинга между экзонами 3 и 4. Однако в ГБ-325 второй экзон отсутствует, это приводит к тому, что стартовый кодон АΤС используется в третьем экзоне, вместо кодона АΤС во втором экзоне. ГБ-32α является самым распространённым кДНК клоном, поэтому эта изоформа используется во многих экспериментах по данному описании. ГБ-32а имеет делецию 57 аминокислотных остатков на С- конце вследствие сплайсинга между экзонами 7 и 8, что является отличием от других вариантов, которые содержат единственный большой экзон, кодирующий их С-концы. Анализ ГБ-32 аминокислотных последовательностей показывает присутствие трёх потенциальных сайтов Ν-миристоилирования и один потенциальный сайт Νгликозилирования (см. фиг. 4А).

Программу В1аБ! используют для поиска базы данных NСВГ для гомологов ГБ-32. Таким способом идентифицируют клоны экспрессируемых ярлыков последовательности (меток экспрессируемой последовательности) (Ξ8Τ) ГБ-32 лошадиного, бычьего, овцы и свиньи. Последовательность лошадиного белка ГБ-323 (Νο. в СЕNВАNΚ СЭ469554 и В1961524) имеет высокую степень гомологии с человеческой последовательностью (идентичность 31,8%), далее идут последовательность бычьего белка (Νο. в СЕ№ ВАNΚ СК834399 и СК832489), белка овцы (Νο. в СЕNВАNΚ СО202364) и свиньи (Νο. в СЕNВАNΚ СВ287292). Выравнивание последовательностей человеческого, лошадиного и бычьего ГБ-323 показано на фиг. 4В). В частности, изоформа А овцы и свиней идентифицирована у лошадей, а изоформы В и С идентифицированы у коров. Последовательности лошадиного ГБ-323 и бычьего ГБ-32у, каждую, объединяют из двух Ξ8Τ клонов, а открытые рамки считывания выводят из объединённой последовательности.

Пример 4. Анализ экспрессии ГБ-32

Экспрессию ГБ-32 в различных человеческих тканях изучают методом Нозерн-блоттинга. Коротко говоря, инсерты кДНК ГБ-32 и актина вырезают из плазмидных векторов с помощью подходящих рестриктаз, фракционируют по размеру и очищают с помощью набора СепеС1еап ГГ (О- ВГО депе, СаткЬаб, СА). кДНК метят с помощью 323-бСТР (ΝΓΝ БГТе 8с1епсе, Воб!оп, МА), используя случайное примирование с помощью фермента Клёнова (№\ν Епд1апб Вю1аЬБ, Веует1у, МА). Мембрану, содержащую человеческую поли(А)⁺ РНК из различных тканей (человеческие МΤN Блот ГГ), инкубируют с зондами кДНК, связывание детектируют методом авторадиографии. Как показано на фиг. 8А, транскрипт ГБ-32 протяжённостью 1,2 тыс.п.о. обнаруживают в большинстве тканей, причём более высокие, по сравнению с другими типами клеток, уровни ГБ-32 наблюдаются в иммунных клетках. Высокая экспрессия мРНК ГБ32 в иммунных тканях вызвана не разной нагрузкой, что показано с повторной гибридизацией блота с фрагментом актина.

Эндогенную экспрессию ГБ-32 также детектируют на уровне белка. Коротко говоря, клетки А549Н3 засевают при плотности 10⁶ клеток/лунка в 6-луночные планшеты. После иммобилизации клеток на планшетах культуральную среду Е12К удаляют и заменяют бессывороточной средой, которая в некоторых лунках содержит ГБ 18 (50 нг/мл), ГБ-13 (100 нг/мл) или БР8 (500 нг/мл). Через 48 ч супернатанты собирают и концентрируют в 10 раз в центрифужных патронах для ультрафильтрации СеШпсоп. Как показано на фиг. 8В, иммуноблоттингом с очищенным аффинной хроматографией кроличьим поликло

- 20 012567 нальным антителом против человеческого ГБ-3 2α обнаруживают продукты протяжённостью около 32 кДа, соответствующие эндогенному ГБ-32. Полагают, что разница между молекулярной массой тГБ-32 из Е со11 и эндогенного 1Ь-32 вызвана посттрансляционной модификацией эндогенной молекулы, так как анализ аминокислотной последовательности показывает присутствие потенциальных Ν-связанных сайтов гликозилирования и миристоилирования. 1Ь-32 секретируют в клеточной культуральной среде клеток, обработанных ГБ-18 (100 нг/мл), ΙΕ-1β (100 нг/мл) или БР8 (500 нг/мл), но не в среде нестимулированных клеток (контроль). 1Ь-32 детектируют в среде клеточных культур в виде секретированной молекулы, хотя 1Ь-32 не содержит типичного гидрофобного сигнального пептида на Ν-конце. ГБ-18 индуцирует более высокую степень экспрессии 1Ь-32, чем ЕС-1 β и БР8.

Также наблюдают полосу 60 кДа (не показана), которую рассматривают как димеризованную форму 1Ь-32. Подобно мономеру полоса 60 кДа обнаруживается в супернатантах обработанных клеток, но отсутствует в супернатантах нестимулированных клеток.

Также изучают индукцию 1Ь-32 в человеческих эпителиальных клетках νίδΐτ обработанных ΙΡΝγ, так как клетки νίδΐι обычно используют для антивирусных анализов и для оценки других биологических активностей ΙΡΝγ. Для продуцирования 1Ь-32 клетки νίδΗ, А549- νΤ и А549- Кв засевают при плотности 5 х 10⁴ клеток/лунка в 6-луночные планшеты и затем стимулируют с помощью ΙΡΝγ (100 Ед./мл), ГБ18 (50 нг/мл) или ГБ-1 β (10 нг/мл). Очищенные аффинной хроматографией кроличьи антитела против ГБ32α используют для обнаружения ГБ-32 в клеточной культуральной среде методом иммуноблоттинга. Конъюгированные с пероксидазой вторичные антитела Дасккоп ГттипоКекеатсй БаЬотаГопек, ’№е§Г Сго^'е, РА) используют для проявления блотов, используя повышенную хемилюминесценцию (ΝΕΝ БГТе 8с1епсе). Для детектирования ГБ-32 с помощью электрохемилюминесценции (ЕСБ) аликвоту очищенного аффинной хроматографией антитела против ГБ-32 метят биотином, а другую аликвоту метят рутением в соответствии с инструкциями производителя (Гдеп, СаййегаЬитд, ΜΌ). Меченные биотином и рутением антитела используют для построения стандартной кривой с применением рекомбинантного ГБ-32а. Для измерения различных цитокинов в клеточных культуральных средах и в сывороточных образцах используют метод жидкофазной ЕСБ. Показатели электрохемилюминесценции определяют на анализаторе Оидеп (Гдеп).

Как показано на фиг. 9А, ГБ-32 индуцируется в клеточных лизатах человеческих эпителиальных клеток в зависимости от времени, уменьшаясь после 46 ч, тогда как в нестимулированных клетках ГБ-32 не индуцируется. Аналогично, ГБ-18 и ГБ-1 β повышают экспрессию эндогенного ГБ-32 в лизатах клеток А549-Кв в зависимости от времени (фиг. 9В), тогда как в клетках Α549-νΤ (фиг. 9С) ГБ-32 только индуцируется под действием ГБ-Щ. Кроме того, также наблюдается, что ГЕ^ индуцирует ГБ-32 в лизатах клеток А549- νΤ (данные не показаны).

Чтобы определить, действительно ли рекомбинантные белки, экспрессированные при использовании кДНК ГБ-32а и β в клетках млекопитающих, сравнимы с эндогенным ГБ-32, клетки Со§7 транзиторно трансфецируют с помощью кДНК ГБ-32а и β. Как показано на фиг. 9Ό и 9Е. Как показано на фиг. 9Ό и 9Е, рекомбинантный ГБ-32а и !Γ-32β присутствует как в культуральных средах, так и в лизатах трансфецированных клеток, что определено иммуноблоттингом. Размер молекул рекомбинантного ГБ-32 млекопитающих в иммуноблотах идентичен размеру молекул эндогенного ГБ-32 показан на фиг. 8В. ЕСБ анализ показывает аналогичное распределение ГБ-32а и ΕΕ-32β в культуральных средах и лизатах, хотя !Ε-32β, по-видимому, секретируется более эффективно по сравнению с ГБ-32а, который преимущественно ассоциирован с клетками. Поликлональное антитело против человеческого ГБ-32 очищают аффинной хроматографией на колонке, содержащей ГБ-3 2α, иммобилизованный на агарозных гранулах (АГП-де1 15). Конъюгированные с пероксидазой вторичные антитела против кроличьего иммуноглобулина получают от Гасккоп ГттипоКекеатсй. Так как антитела против человеческого ГБ-32 специфично узнают эндогенный ГБ-32, уровень ГБ-32 в человеческой сыворотке (здоровых индивидуумов и пациентов с сепсисом) измеряют методом БСБ. Хотя ГБ-32 обнаружен в сыворотке здоровых людей (5 из 42 образцов), уровни ГБ-32 ниже 70 пг/мл. Напротив, средние уровни ГБ-32 в сыворотке больных с сепсисом в 35 раз выше, чем в сыворотке здоровых людей. В первый раз в ходе разработки настоящего изобретения показано, что ГБ-32 является воспалительным цитокином, продуцируемым (прямо или косвенно) в ответ на бактериальную инфекцию. Кроме того, ГБ-32 обнаруживается у больных активным ревматоидным артритом, это указывает на то, что он также играет роль в аутоиммунитете.

Для изучения регуляции продуцирования ГБ-32 уровни ГБ-32 измеряют в клеточных культуральных средах различных клеточных линий, а также человеческих РВС. ГБ-32 обнаружен в клеточной культуральной среде клеток А549 после стимуляции с помощью ГБ-18 или ГБ-1 β, но не в контрольной среде (фиг. 1А). Так как ген ΝΚ (ГБ-32) выделяют из ΝΚ клеток, активированных с помощью ГБ-2, человеческую ΝΚ клеточную линию стимулируют комбинацией ГБ-12 плюс ГБ-18. Как показано на фиг. 10В, наблюдается заметная индукция ГБ-32 с помощью ГБ-12 или ГБ-18 в ΝΚ клетках, и, по-видимому, действие комбинации этих двух цитокинов является аддитивным. Для сравнения, когда эта клеточная линия стимулируется с помощью либо ГБ-12 или ГБ-18, наблюдается слабая индукция ГЕ№у, или не наблюдается

- 21 012567 индукции вообще, тогда как продуцирование ΙΡΝγ при использовании комбинации 1Ь-12 плюс 1Ь-18 является в высшей степени синергическим (К1т е( ай, I. Вю1. Сйет, 277: 10998-11003, 2002). Индукцию Ш32 (под действием ΙΡΝγ) изучают стимуляцией ΝΚ клеток с помощью 1Ь-12 и 1Ь-18 в присутствии нейтрализующего антитела против ΙΡΝ. Эта комбинация не оказывает действия на индукцию 1Ь-32 (данные не показаны). Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) содержат в основном В-клетки с небольшим количеством моноцитов и В-клеток. Свежеприготовленные РВМС стимулируют с использованием ЬР8 или СопА и супернатанты и лизаты собирают и анализируют концентрацию 1Ь-32. У пациентов старше 60 лет в супернатантах или лизатах РВМС, стимулированных ЬР8, отсутствуют детектируемые количества 1Ь-32 (данные не показаны). Однако СопА постоянно индуцирует 1Ь-32, который обнаруживается в супернатантах и лизатах. Как показано на фиг. 10С, лизаты содержат больше 1Ь-32, чем супернатанты.

Пример 5. Идентификация 1Ь- 32- реактивных путей сигнальной трансдукции

В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия цитокина 1Ь-32 на молекулы ингибиторов сигнальной трансдукции каппа В (1кВ) и р38 митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Коротко говоря, мышиные КА XV 264,7 макрофагальные клетки стимулируют с помощью 1Ь-32а (50 нг/мл) в присутствии 5 мкг/мл полимиксина В (ВебГогб ЬаЬ, ВебГогб. ОН) указанный период времени (в минутах). Клетки лизируют буфером для лизиса киназ (Нап е( а1., I ΒίοΙ Сйет, 277: 47167-47174, 2002). Клеточные материалы разделяют в 10% 8Э8- РАСЕ геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем блокируют с помощью 3% В8А. Мембрану гибридизуют с кроличьим антителом против 1кВ и нормализуют антителом козы против актина (8ап(а Сгих Вю(есйио1оду, 8аШа Сгих, СА). Как показано на фиг. 11 А, 1Ь-32а индуцирует расщепление 1кВ в зависимости от времени, начиная через 15 мин после обработки и достигая максимального уровня через 45 мин, с последующим извлечением через 90 мин.

Мембрану также гибридизуют с кроличьим антителом против фосфо- р38 МАРК и нормализуют кроличьим антителом против р38 МАРК (Се11 81дпа1шд, Вечег1у, МА). Как показано на фиг. 10В, фосфор38 МАРК резко увеличивался через 5 мин после стимуляции с помощью 1Ь-32, а затем уменьшался в течение от 15 до 30 мин. Интересно отметить, что второе повышение фосфорилирования р38 МАРК наблюдается через 45 мин, затем оно снижается более медленно.

Пример 6. Идентификация 1Ь-32-связывающих белков

Рекомбинантный 1Ь-32а (или ΙΕ-32β, 1Ь-325 и ΙΕ-32γ) экспрессируют в Е сой и очищают в трёх последовательных стадиях, как описано в примере 2. Около 5 мг очищенного ΙΕ-32α иммобилизуют на агарозных гранулах АГП-де1 15 (Вю-Каб ЬаЬогаЮпек, Негси1е§, СА). На Ш^а-аффинную колонку подают различные источники потенциальных рецепторов (например, человеческую сыворотку или лизаты клеток, которые секретируют ΤΝΡα в ответ на ΙΕ-32α, таких как клетки Кает 264,7). ΙΕ-32α аффинную колонку интенсивно отмывают, а затем рецептор ΙΕ-32 элюируют буфером для элюции (например, 50 мМ лимонной кислоты, 100 мМ №С1, рН 2,5). Элюированные фракции сразу же нейтрализуют 2 М трис основанием. Белки, связывающиеся с ΙΕ-32, выделенные таким образом, далее характеризуют химическим анализом (например, анализом пептидной последовательности расщеплением по Эдману и/или массспектроскопией) и биоанализом (например, очищенный или рекомбинантный рецептор тестируют на их способность блокировать ЕЬ-32а-индуцированную секрецию ΤΝΡα клетками Кает 264,7). Предполагают, что аутентичные связывающие ΙΕ-32 белки способны ингибировать биологические активности ΙΕ-32 (аналогично тому, что наблюдается с ТМРВР). Также предполагают, что другие типы аутентичных связывающих ΙΕ-32 белков способны повышать биологические активности ΙΕ-32 (аналогично тому, что наблюдается ΙΕ-6 лигандсвязывающей цепью).

Пример 7. Терапевтическое действие ΙΕ-32-антител и ΙΕ-32-ингибиторов на мышиных моделях артрита

В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия ΙΕ-32антител и антагонистов ΙΕ-32 (например, растворимых рецепторов ΙΕ-32, доминант- негативных вариантов ΙΕ-32, малых молекул ингибиторов и т.д.) в качестве терапевтических веществ для лечения коллагениндуцированного артрита (СЬА) у мышей. Коротко говоря, СЧА вызывают у 8-1-недельных мышей ЭВА/1.1 (Часккоп ЬаЬогаФпек, Ваг НагЬог, МЕ) интрадермальной (внутрикожной) инъекцией типа ΙΙ бычьего коллагена (СП), известного в уровне техники (Вапба е( а1., АййгйВ Кйеит, 46: 3065, 2002). Каждой мыши вводят инъекции 100 мкл, содержащие 200 мкг СП и 200 мкг инактивированных МусоЬас(епит (иЬегси1о818 (ЭгГсо, ЭеКой, ΜΙ) в неполном адъюванте Фрейнда в дни 0 и 21. Между днём 21 и днём 42 мышам дают одно из трёх лекарств в виде и.п. (интраперитонеальных) инъекций каждые три дня: 2 мг/мышь обычного кроличьего ЦС; 2 мг/мышь нейтрализующего кроличьего антитела против ΙΕ-32, полученного с применением Н1Тгар Рго(ет С НР (Атегайат Рйагташа Вю(есй АВ, Ирр8а1а, 8ете6еп); и 2 мг/мышь рекомбинантного ΙΕ-32 антагониста (например, гибридизованного белка рецептор ΙΕ-32-Ι^1 Рс или доминант- негативного варианта ΙΕ-32). Мышей (5 в каждой группе и 5 необработанных мышей) умерщвляют на день 42 цервикальной дислокацией под анестезией.

Активность клинического заболевания СЧА оценивают каждый день между 21-42 днями слепым ме

- 22 012567 тодом по трёхточечной шкале для каждой лапы; 0 = нормальный сустав; 1 = слабое воспаление и краснота; 2 = тяжёлая форма эритемы и опухание всей лапы, не дающее возможности ею пользоваться; и 3= деформированная лапа или сустав, с анкилозом, ригидностью сустава и утратой функции. При общей оценке активности клинического заболевания учитывают все четыре лапы, максимальная оценка для каждого животного 12. После умерщвления обе передние и правую заднюю лапы удаляют хирургическим путём на день 42, фиксируют в 10% забуференном формалине, готовя тканевые препараты, и проводят гистологический анализ, известный в уровне техники (ВепЕе1е е! а1., АПйпШ Вйеит, 43: 2648, 2000). Опытный исследователь (несмотря на обработку) оценит гистологические показания в лапах, коленях и лодыжках. Данные выражают в виде средних оценок воспаления, паннуса, поражения хрящей и поражения костей, а также в общей оценке в баллах от 0 до 5.

Используя опубликованные методы (ВапЕа е! а1, Лттипо1, 170: 2100-2105, 2003), определяют различные иммунные характеристики, включая, но без ограничения: СП-специфическую пролиферацию клетками селезёнки и лимфатических узлов, продуцирование антител против коллагена, СПиндуцированную секрецию цитокинов клетками селезёнки (например, используя ЕЫ8А ΤNΡα, ГЕ^, Ш1β, [Ш-1 Ва и ЕЬ-10), и стационарные уровни мРНК цитокинов в суставах (например, ΤΜΕα, ΙΕ^, ΙΕ-1β, Ш-1Ва, Ш-6, ЕШ-18, МШ, ΤΚΕβ, ΕΤρ, Τ6Ρβ1, Τ6Ρβ2). Некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения содержат антитело против Ш-32 (Ш-32 антитело) или Ш-32 антагонист, которые снижают оценки в баллах активности клинического заболевания и гистологические оценки поражения суставов по меньшей мере на 50% (более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Другие предпочтительные варианты изобретения содержат Ш-32 антитело или Ш-32 антагонист, которые снижают СП-индуцированную пролиферацию лимфоцитов и/или сывороточные уровни связывающих коллаген антител против Ι§Ο по меньшей мере на 50% (более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Особенно предпочтительные варианты изобретения содержат Ш-32 антитело или Ш-32 антагонист, которые снижают и стационарные уровни мРНК ΤNΡα, ΙΕ^ и/или ЕШ-1 β в изолированных суставах по меньшей мере на 50% (более предпочтительно по меньшей мере на 75% и, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%). Важно, что предпочтительные варианты изобретения, включающие Ш-32 антитела или Ш-32 антагонисты по данному описанию, как полагают, найдут применение в лечении людей, больных ревматоидным артритом, с применением методов, аналогичных методам, применяемым для введения ΤNΡреактивных антител (инфликсимаб/ВЕМШАБЕ и адалимумаб/НИМЖА) и гибридных белков рецептор растворимого 'ГКЕ/иммуноглобулин (этанерцепт/ЕХВВЕЕ).

Пример 8. Биологическая активность рекомбинантного Ш-32

Ш-32 индуцирует значительные количества ΤΜΕα и МЖ-2 и повышает продуцирование обоих цитокинов в зависимости от дозы (доза-эффект), как показано на фиг. 6. Затем биологическую активность ΙΕ-32α сравнивают с биологической активностью ΙΕ-32β, имеющим полный С-конец. ΙΕ-32β индуцирует уровни ΤΜΕα и МЕР-2 аналогично ΙΕ-32α в мышиной макрофагальной клеточной линии Вате (фиг. 6В). Хотя все эксперименты проводят в присутствии полимиксина В (5 мкг/мл), нельзя исключить возможность загрязнения (примеси) эндотоксином рекомбинантных белков, продуцированных в Е сой.

Рекомбинантный Ш-32 также продуцируют в системе млекопитающего для того, чтобы избежать примеси эндотоксина. τΙΕ-32β продуцируют при использовании трёх различных источников клеток млекопитающих, устойчивого клона Ан]ои65, устойчивого клона Со57 (Со57-8) и транзиторного трансфектанта Со57 (Со57-7). Транзиторно и устойчиво клонированные клетки культивируют в 0,5% ЕС8 в течение 4 дней, затем собирают. Так как максимальный выход τΙΕ-32β млекопитающего составляет только 1 нг/мл, а концентрация ΙΕ-32α ниже 100 пг/мл, каждый не содержащий эндотоксин τΙΕ-32β очищают на аффинной колонке, приготовленной иммобилизацией анти-I^-32β тАй на агарозных гранулах (АГП-Се1 Ηζ, Вю-ВаЕ) в присутствии азида натрия (0.2%) для предупреждения загрязнения микроорганизмами в процессе очистки. Очищенный τΙΕ-32β подвергают диализу против ВРМЕ содержащей пенициллин/стрептомицин (10 мкг/мл), в течение ночи при 4°С, а затем используют в биоанализе. Все три препарата τΙΕ-32β млекопитающих индуцируют ЧТОх в человеческих РМА- дифференцированных ТНР-1 клетках и мышиных клетках Вате, соответственно (фиг. 6). τΙΕ-32β Е сой и τΙΕ-32β млекопитающих повышают продуцирование ΤΜΕα продукта в РМА-дифференцированных ТНР-1 клетках в зависимости от дозы (фиг. 6). Кроме того, препараты, содержащие высокую дозу (йЧдй цш!) τΙΕ-32β Е сой и τΙΕ-32β млекопитающих клона Ан]ои65, индуцируют человеческий Ш-8 в недифференцированных- ТНР-1 клетках, тогда как суррогатные (мнимые) Ан]ои65 трансфектанты не индуцируют их (фиг. 6Е).

Пример 9. Продуцирование нейтрализующего Еай фрагмента моноклонального антитела против Ш-32

Пятимесячную самку мыши Ва1й/с иммунизируют с помощью 20 мкг антигена τΙΕ-32β, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (8щта). В дни 14 и 21 мыши внутривенно и интраперитонеально инъецируют антиген, эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (8щта). После трёх инъекций мышь умерщвляют, селезёнку асептически удаляют и спленоциты готовят для слияния. Коротко говоря, 1 х 10⁷ спленоцитов и 1 х 10⁶ N8-1 клеток мышиной миеломы (АТСС) сливают при использовании эти

- 23 012567 ленгликоля (Носйе Аррйеб 8с1еисе. МхитароШ, ΙΝ). Слитые клетки ресуспендируют при плотности 1 х 10⁶ клеток/мл в средах для роста гибридом с 10% ЕС8 и НАГ и засевают в 96-луночные планшеты. Через 2 недели культуральные супернатанты гибридом титруют непрямым методом ЕЫ8А. Классы и подклассы моноклональных антител определяют, используя набор для изотипирования мышиных моноклональных антител IММυNΟ- ΤΥРЕ (ΒΌ Вюкаеисе, 8аи О|е§о. СА) в соответствии с инструкциями производителя.

Около 1 х 10⁶ клеток двух гибридом 32-4 ЦдС₁) и 32-9 (Ι§Οι) инъецируют интраперитонеально 8недельной самке мыши Ва1Ь/с. Через неделю асцитную жидкость отбирают стерильной гиподермической иглой. Антитела из супернатантов асцитной жидкости очищают на колонке с протеином А сефарозой (Вю- Наб) и элюируют 0.1 М глицином-НС1, рН 2,7. Элюированные тАЬ диализуют против РВ8 и очищенные антитела концентрируют в центрифужных патронах для ультрафильтрации (УМ-50, ЬгГе δαеисек, Апп АгЬог, МЦ. Концентрацию очищенного антитела определяют, измеряя оптическую плотность при 280 нм.

Так как аффинно очищенное моноклональное антитело (32-4) против ΓΙΌ-32β индуцирует высокий фоновый уровень тЕИЕа, получают ЕаЬ фрагмент этого моноклонального антитела (тАЬ). Коротко говоря, фрагменты ЕаЬ очищенного анти- ΙΕ-32 тАЬ (32-4) получают инкубацией с иммобилизированным пепсином (РШНСЕ, НоскГогб, ΙΌ) при 37°С в течение 4 ч. Фрагменты Ес и остаточные нерасщеплённые тАЬк удаляют, используя протеин С сефарозу (Атегкйат Вюкаеисек, Иррка1а, 8\\'ебег1). Фрагмент ЕаЬ диализуют против РВ8 в течение ночи при 4°С и подвергают δΌδ-РАСЕ для подтверждения полноты расщепления. Фоновый уровень резко уменьшается после удаления Ес фрагмента, что позволяет оценивать активность нейтрализации ΙΕ-32 антителом тАЬ против ΓΙΌ-32β. Как показано на фиг. 7А, ЕаЬ антитела тАЬ 32-4 (50 нг/мл) ингибирует биологическую активность Е. сой ЧЬ -32α более чем на 70%. Как показано на фиг. 7В, тот же самый ЕаЬ ингибирует биологическую активность аффинно очищенного Сок7-8 ΓΙΕ-32β более чем на 65%. Более высокие концентрации фрагмента ЕаЬ в этих анализах не ингибируют дополнительно продуцирование ΤΝΡα, индуцированное с помощью ΙΕ-32.

Пример 10. Терапевтическое действие антител против ΙΕ-32 и ингибиторов ΙΕ-32 на мышиной модели воспалительного заболевания кишечника

В данном примере приводится подробное описание экспериментов, проводимых для оценки действия антител против ΙΕ-32 и антагонистов ΙΕ-32 (например, растворимых рецепторов ΙΕ-32, доминантнегативных ΙΕ-32 вариантов, ингибиторов- малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для лечения колита у мышей, вызванного действием декстрана сульфата натрия (Όδδ).

Коротко говоря, колит вызывают у 8-10-недельных самок мышей С57ВБ/6 шюе ^исошс ЬаЬога1опек), вводя 2% (вес/объём) декстрана натрия сульфата (Όδδ, М\У 40000 от Ιί.’Ν ВгосйетюаН) с дня 0 до дня 7 в питьевой воде неограниченно (аб БЬйит), а затем возврвщаются к обычной, известной в уровне техники (Ыхакитаг е! а1., Си!, 50: 812-820, 2002). Мышей взвешивают каждый день, начиная с дня 0, и изменения в весе регистрируют вплоть до дня 13. Изменение веса каждой мыши в процентах вычисляют следующим образом: изменение веса в процентах = (вес в конкретный день - вес в день) /вес в день 0 х 100. Группы мышей обрабатывают: контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным антиЧЕ^ тАЬ (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным ΙΕ-32 антагонистом (например, гибридным белком ΙΕ-32 рецептор- ЦС1 Ес или доминант-негативным ΙΕ-32 вариантом при 50 мкг или 500 мкг), каждый в объёме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин РΒδ). Мышам инъецируют и.п. с дня 0 до дня 7. Мышей умерщвляют в дни 0, 2, 4, 6 или 8 после начала обработки Όδδ, анестезией и цервикальной дислокацией и ткани (например, толстую кишку, лимфатические узлы) извлекают и готовят для экстракции РНК, гистопатологии и анализа цитокинов методами, известными в уровне техники. Ожидают, что введение антагонистов ΙΌ-32 применимо для уменьшения воспаления при Όδδ-индуцированном колите у мышей и что нейтрализация ΙΌ-32 активности способствует уменьшению воспаления, обусловленного кишечными заболеваниями.

Пример 11. Терапевтическое действие антител против ΙΌ-32 и ингибиторов ΙΌ-32 на мышиной модели гепатита

В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия антител против ΙΌ-32 и антагонистов ЕЬ-32 (например, растворимых рецепторов ΙΌ-32, доминант- негативных ΙΌ32 вариантов, ингибиторов- малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для лечения поражения печени, вызванного ΕΕδ у мышей, примированных убитыми нагреванием Ргорю1Ьас1епит асиек (модель заболевания печени, опосредуемого Еак/ЕакЬ).

Коротко говоря, гепатит у 8-10-недельных самок мышей ВАЬВ/с (Сйаг1ек В1уег ЬаЬогаФпек) вызывают, вводя мышам 500 мкг/мышь Ιν убитых нагреванием Р. асиек (Н1Ь1 Бппипю- Сйет Некеагсй), и через 12 дней им вводят 50 мкг/кг ^Рδ Ιν, известного в уровне техники (Еадфош е1 а1., 1 Iшшиио1, 167: 5913-5920, 2001). Группы мышей обрабатывают: контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным анти- ΙΌ-32 тАЬ (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным ΙΌ-32 антагонистом (например, гибридным белком ΙΌ-32 рецептор- ЦС1 Ес или доминант-негативным ΙΌ-32 вариантом при 50 мкг или 500 мкг), каждый в объёме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин РΒδ). Мышей инъецируют и.п. либо

- 24 012567 во время введения Ρ. аспек, либо за 10 до заражения ЬР8. Проводят мониторинг мышей на выживаемость или умерщвляют, чтобы вырезать печень для гистологического исследования, измерения мРНК и хемокинов, и собирают кровь для определения сывороточного ΙΡ^γ и трансаминазы методами, известными в уровне техники. Полагают, что ΙΕ-32 антагонисты применимы для предупреждения ЬР8индуцированного поражения печени и экспрессии ΙΡ№ γ и Рак лиганда при введении за 10 мин до ЬР8 заражения р£ примированных Р.аспек мышей. Кроме того, полагают, что введение антагонистов ΙΕ-32 применимо для уменьшения вызванного Р. аспек образования гранулёмы, продуцирования макрофагально-воспалительного белка-1а и макрофагально-воспалительного белка-2, если их вводят в момент примирования с помощью Р. ас пек. Таким образом, полагают, что для пациентов с заболеваниями печени, такими как вызванный НСУ гепатит, аутоиммунный гепатит и первичный цирроз печени, будет благотворной схема лечения, включающая антагонист ΙΕ-32.

Пример 12. Терапевтическое действие антител против ΙΕ-32 и ингибиторов ΙΕ-32 на мышиной модели ишемической болезни

В данном примере подробно описаны эксперименты, проводимые для оценки действия антител против ΙΕ-32 и антагонистов ΙΕ-32 (например, растворимых рецепторов ΙΕ-32, доминант-негативных ΙΕ32 вариантов, ингибиторов-малых молекул и т.д.) как терапевтических средств для стимуляции неоваскуляризации тканей в ответ на ишемическое поражение.

Коротко говоря, самцов мышей С57ВЬ/61 подвергают хирургической операции для того, чтобы вызвать одностороннюю ишемию задней лапы методами, известными в уровне техники (Ма11а! е! а1., С1гс Кек, 91: 441-448, 2002). Лигатуру накладывают на бедренную артерию, 0,5 см проксимально к бифуркации сафенной и подколенной артерий, а затем помещают в обычные условия на 3-28 дней. Группы мышей обрабатывают контрольным белком (50 мкг или 500 мкг); мышиным анти- ΙΕ-32 тАЬ (50 мкг или 500 мкг); и рекомбинантным ΙΕ-32 антагонистом (например, гибридным белком ΙΕ-32 рецептор- Ι§Ο1 Рс или доминант- негативным ΙΕ-32 вариантом в дозе 50 мкг или 500 мкг), каждый в объёме 200 мкл на инъекцию (не содержащий эндотоксин РВ8). Мышей инъецируют и.п. в день 0 и день 7. Степень ангиогенеза количественно определяют в дни 3 и 10, измеряя плотность сосудов микроангиографией, а вызванные ишемией изменения васкуляризации мониторируют визуализацией перфузии с помощью лазерного Допплер- анализатора. Считают, что введение антагонистов ΙΕ-32 применимо для стимуляции неоваскуляризации тканей в ответ на ишемическое поражение.

Все публикации и патенты, указанные в вышеприведённом описании, вводятся в это описание в качестве ссылки. Различные модификации и варианты описанного способа и системы по данному изобретению, в объёме настоящего изобретения и соответствующие сущности настоящего изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области техники. Хотя изобретение описано на конкретных предпочтительных вариантах, следует понимать, что заявляемое изобретение неправильно ограничивать этими конкретными вариантами изобретения. На самом деле, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные для специалистов в области молекулярной биологии, генетике, иммунологии и родственных областях, входят в объём формулы изобретения.

- 25 012567

Перечень последовательностей <110> Дэе Риджентс оф дэе Юниверсити оф Колорадо, э боди корпорейт Ким, Су-Хайун

Динарелло, Чарлз, А.

Азам, Таниа <120> Способы регуляции фактора некроза опухоли альфа <130> итС 08870 <140 РСТ/Ч82004/037573 <141> 2004 11 12 <160 27 <170> ΡΐΙεηίΙη νβΓΕίοη 3.2 <210 1 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <400> 1 сРдРсссдад РсРддасРРР 20 <210 2 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая <4002 дсаааддрдд РддРсадРаР с <2103 <211>396 <212> ДНК <213> Ното зар1еп5 <400> 3

аРдРдсРРсс	сдааддрсср	сРсРдаРдас	аРдаадаадс	рдааддсссд	ааРдсассад	60
дсРаРадааа	даРРРРаРда	РааааРдсаа	ааРдсадааР	саддасдрдд	асаддрдард	120
рсдадссРдд	сададсРдда	ддасдасРРс	ааададддср	ассРддадас	адРддсддсР	180
РаРРаРдадд	адсадсассс	ададсРсасР	ссРсРасРРд	ааааадааад	адаРддаРРа	240
сддрдссдад	дсаасадаРс	сссРдРсссд	даРдРРдадд	аСсссдсаас	сдаддадссР	300
ддддададсР	РРРдРдасаа	дрссрасдда	дссссасддд	дддасаадда	ддадсРдаса	360
ссссадаадр	дсРсРдаасс	ссааРссРса	аааРда			396

<2104

- 26 012567 <211>567 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 4

аЕдЕдсЕЕсс	сдааддЕссЕ	сЕсЕдаЕдас	аЕдаадаадс	Едааддсссд	ааЕдсассад	60
дссаЕадааа	даЕЕЕЕаЕда	ЕааааЕдсаа	ааЕдсадааЕ	саддасдЕдд	асаддЕдаЕд	120
ЕсдадссЕдд	сададсЕдда	ддасдасЕЕс	ааададддсЕ	ассЕддадас	адЕддсддсЕ	180
ЕаЕЕаЕдадд	адсадсассс	ададсЕсасЕ	ссЕсЕасЕЕд	ааааадааад	адаЕддаЕЕа	240
сддЕдссдад	дсаасадаЕс	сссЕдЕсссд	даЕдЕЕдадд	аЕсссдсаас	сдаддадссЕ	300
ддддададсЕ	ЕЕЕдЕдасаа	ддЕсаЕдада	ЕддЕЕссадд	ссаЕдсЕдса	дсддсЕдсад	360
ассЕддЕддс	асддддЕЕсЕ	ддссЕдддЕд	ааддадаадд	ЕддЕддсссЕ	ддЕссаЕдса	420
дЕдсаддссс	ЕсЕддаааса	дЕЕссададЕ	ЕЕсЕдсЕдсЕ	сЕсЕдЕсада	дсЕсЕЕсаЕд	480
ЕссЕсЕЕ Есс	адЕссЕасдд	адссссасдд	ддддасаадд	аддадсЕдас	ассссадаад	540
ЕдсЕсЕдаас	сссааЕссЕс	ааааЕда				567

<210>5 <211>705 <212> ДНК <213> Ното зарЁепз <400> 5

аЕдЕдсЕЕсс	сдааддЕссЕ	сЕсЕдаЕдас	аЕдаадаадс	Едааддсссд	ааЕддЕааЕд	60
СЕССЕСССЕа	сЕЕсЕдсЕса	ддддЕЕдддд	дссЕдддЕсЕ	садсдЕдЕда	сасЕдаддас	120
асЕдЕдддас	ассЕдддасс	сЕддадддас	ааддаЕссдд	сссЕЕЕддЕд	ссаасЕсЕдс	180
сЕсЕсЕЕсаС	адсассаддс	саЕадааада	ЕЕЕЕаЕдаЕа	аааЕдсаааа	ЕдсадааЕса	240
ддасдЕддас	аддЕдаЕдЕс	дадссЕддса	дадсЕддадд	асдасЕЕсаа	ададддсЕас	300
сЕддадасад	ЕддсддсЕЕа	ЕЕаЕдаддад	садсасссад	адсЕсасЕсс	ЕсЕасЕЕдаа	360
ааадааадад	аЕддаЕЕасд	дЕдссдаддс	аасадаЕссс	сЕдЕсссдда	ЕдЕЕдаддаЕ	420
сссдсаассд	аддадссЕдд	ддададсЕЕЕ	ЕдЕдасаадд	ЕсаЕдадаЕд	дЕЕссаддсс	480
аЕдсЕдсадс	ддсЕдсадас	сЕддЕддсас	ддддЕЕсЕдд	ссЕдддЕдаа	ддадааддЕд	540
дЕддсссЕдд	ЕссаЕдсадЕ	дсаддсссЕс	ЕддааасадЕ	ЕссададЕЕЕ	сЕдсЕдсЕсЕ	600
сЕдЕсададс	ЕсЕЕсаЕдЕс	сЕсЕЕЕссад	ЕссЕасддад	ссссасдддд	ддасааддад	660
дадсЕдасас	сссадаадЕд	сЕсЕдаассс	сааЕссЕсаа	ааЕда		705

<210> <211> <212> <213>

6 537 ДНК Ното заргепз

<400>6 аЕдаадаадс Едааддсссд ааЕдсассад дссаЕадааа даЕЕЕЕаЕда ЕааааЕдсаа

- 27 012567

ааЬдсадааЬ	саддасдЬдд	асаддЬдаСд	ЬсдадссЬдд	сададсЬдда	ддасдасСЬс	120
ааададддсЬ	ассЬддадас	адСддсддсЬ	саььасдадд	адсадсассс	ададс^саст	180
ссЬсбасЬЬд	ааааадааад	адаЬддаЬЬа	сддСдссдад	дсаасадаЬс	сссЬдЬсссд	240
дабдьсдадд	аЬсссдсаас	сдаддадссб	ддддададсб	ЬЬЬдбдасаа	ддЬсаСдада	300
ЬддЬЬссадд	ссаЬдсбдса	дсддсЬдсад	ассЪдд^ддс	асддддЬЬсЬ	ддссЬдддЬд	360
ааддадаадд	ЬддЬддсссЬ	ддЬссаЬдса	дЬдсаддссс	бсЬддаааса	д^ЬссададС	420
ЬЬсЬдсЬдсЬ	сЪсЬд'Ьсада	дсбсСЬсаЬд	ЬссЬсЬЫзсс	ад1сс±асдд	адссссасдд	480
ддддасаадд	аддадсЬдас	ассссадаад	ЬдсЬсЬдаас	сссааЬссЬс	ааааЬда	537

<210> 7 <211> 131 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 7

МеС 1

Суз

РЬе

Рго

Ьуз 5

УаЬ

Ьеи Зег

Азр

Азр 10

Меб

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьуз 15

А1а

Агд

МеЬ

НЬз

С1п

А1а

Не

СЬи

Агд

РЬе

Туг

Азр

Ьуз

МеЬ

С1п

Азп

АЬа

20

25

30

61и

Зег

51у

Агд

61у

61п

УаЬ

МеЬ

Зег

Зег

Ьеи

А1а

СЬи

Ьеи

СЬи

Авр

35

40

45

Азр

РЬе

Ьуз

СЬи

61у

Туг

Ьеи

61и

ТЬг

Уа1

АЬа

А1а

Туг

Туг

61и

СЬи

50

55

60

С1п

НЬз

Рго

61и

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

Ьеи

61и

Ьуз

61и

Агд

Азр

СЬу

Ьеи

65

70

75

80

Агд

Суз

Агд

61 у

Азп

Агд

5ег

Рго

УаЬ

Рго

Азр

УаЬ

6Ьи

Азр

Рго

АЬа

85

90

95

ТЬг

61и

61и

Рго

С1у

СЬи

Зег

РЬе

Суз

Азр

Ьуз

Зег

Туг

СЬу

АЬа

Рго

100

105

но

Агд

С1у

Азр

Ьуз

61и

СЬи

Ьеи

ТЬг

Рго

61п

Ьуз

Суз

Зег

СЬи

Рго

С1п

115

120

125

Зег

Зег

Ьуз

130

<210> 1

3

<211> :

188

<212> !

ЕЕЛОК

<213> 1

Ното

зардепз

- 28 012567

<400>

0 РЬе

Рго Ьуз Уа1 5

Ьеи

Зег Азр

Азр 10

Мее

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьуз 15

А1а

МеЪ 1

Суз

Агд

Мее

Н1б

С1П

А1а

Не

61и

Агд

РЬе

Туг

Азр

Ьуз

Мее

61п

Азп

А1а

20

25

30

61и

Зег

С1у

Агд

С1у

С1п

Уа1

Мее

Зег

Зег

Ьеи

А1а

Б1и

Ьеи

(Ни

Азр

35

40

45

Азр

РЬе

Ьуз

С1и

61у

Туг

Ьеи

61и

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Туг

Туг

61и

61и

50

55

60

61п

Нхз

Рго

Б1и

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

Ьеи

61и

Ьуз

61и

Агд

Азр

Б1у

Ьеи

65

70

75

80

Агд

Суз

Агд

С1у

Азп

Агд

Зег

Рго

Уа1

Рго

Азр

Уа1

61и

Азр

Рго

А1а

85

90

95

ТЬг

61и

61и

Рго

С1у

61и

Зег

РЬе

Суз

Азр

Ьуз

Уа1

Мее

Агд

Тгр

РЬе

100

105

110

61п

А1а

Мее

Ьеи

61п

Агд

Ьеи

61п

ТЬг

Тгр

Тгр

ΗΪ3

61у

Уа1

Ьеи

А1а

115

120

125

Тгр

Уа1

Ьуз

С1и

Ьуз

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

Н13

А1а

Уа1

61п

А1а

Ьеи

130

135

140

Тгр

Ьуз

61п

РЬе

С1п

Зег

РЬе

Суз

Суз

Зег

Ьеи

Зег

61и

Ьеи

РЬе

Мее

145

150

155

160

Зег

Зег

РЬе

61п

Зег

Туг

61 у

А1а

Рго

Агд

61у

Азр

Ьуз

61и

61и

Ьеи

165

170

175

ТЬг

Рго

61п

Ьуз

Суз

Зег

С1и

Рго

61п

Зег

Зег

Ьуз

180

185

<210>

9

<211> :

234

<212> :

БЕЛОК

<213>

Ното

заргепз

<400>

9

Мее

Суз

РЬе

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

Зег

Азр

Азр

Мее

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

1

5

10

15

Агд

Мее

Уа1

Мее

Ьеи

Ьеи

Рго

ТЬг

Зег

А1а

61п

61у

Ьеи

С1у

А1а

Тгр

20

25

30

- 29 012567

Ча1

Зег

А1а 35

Суз

Азр ТЬг

СЬи Азр 40

ТЬг Уа1

СЬу

НЬз

Ьеи 45

61у

Рго

Тгр

Агд

Азр

Ьуз

Азр

Рго

А1а

Ьеи

Тгр

Суз

61п

Ьеи

Суз

Ьеи

Зег

Зег

С1п

50

55

60

ΗΪ3

61 п

А1а

Не

61и

Агд

РЬе

Туг

Азр

Ьуз

Ме1

61п

Азп

А1а

61и

Зег

65

70

75

80

61у

Агд

С1у

61п

Уа1

Ме!

Зег

Зег

Ьеи

А1а

СЬи

Ьеи

61и

Азр

Азр

РЬе

85

90

95

Ьуз

С1и

С1у

Туг

Ьеи

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

АЬа

Туг

Туг

61и

СЬи

61п

НЬз

100

105

110

Рго

61и

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

Ьеи

СЬи

Ьуз

С1и

Агд

Азр

СЬу

Ьеи

Агд

Суз

115

120

125

Агд

61у

Азп

Агд

Зег

Рго

УаЬ

Рго

Азр

УаЬ

СЬи

Азр

Рго

А1а

ТЬг

61и

130

135

140

С1и

Рго

С1у

61и

Зег

РЬе

Суз

Азр

Ьуз

УаЬ

Мее

Агд

Тгр

РЬе

61п

А1а

145

150

155

160

Мее

Ьеи

С1п

Агд

Ьеи

61п

ТЬг

Тгр

Тгр

НЬз

61у

УаЬ

Ьеи

А1а

Тгр

Уа1

165

170

175

Ьуз

61и

Ьуз

Уа1

Уа1

АЬа

Ьеи

УаЬ

Н1з

АЬа

Уа1

СЬп

А1а

Ьеи

Тгр

Ьуз

180

185

190

С1п

РЬе

61 п

Зег

РЬе

Суз

Суз

Зег

Ьеи

Зег

СЬи

Ьеи

РЬе

Мее

Зег

Зег

195

200

205

РЬе

61п

Зег

Туг

61у

АЬа

Рго

Агд

61у

Азр

Ьуз

61и

С1и

Ьеи

ТЬг

Рго

210

215

220

61п

Ьуз

Суз

Зег

61и

Рго

СЬп

Зег

Зег

Ьуз

225 230

<210>	10
<211>	178
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зарЬепз
<400>	10
МеЬ Ьуз	Ьуз	Ьеи Ьуз А1а Агд Мее
1		5

Азр Ьуз Мее 61п Азп. А1а 61и Зег

ΗΪ3	61 п 10	А1а	Не	СЬи	Агд	РЬе 15	Туг
61у	Агд	61у	С1п	УаЬ	Мее	Зег	Зег
25					30

- 30 012567

Ьеи А1а

С1и Ьеи 35

С1и

Азр

Азр

РЬе 40

Ьуз

С1и С1у

Туг

Ьеи 45

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

Туг

Туг

С1и

С1и

С1п

Ηί3

Рго

С1и

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

Ьеи

С1и

50

55

60

Ьуз

01 и

Агд

Азр

С1у

Ьеи

Агд

Суз

Агд

С1у

Азп

Агд

Зег

Рго

Уа1

Рго

65

70

75

80

Азр

Уа1

61и

Азр

Рго

А1а

ТЬг

С1и

С1и

Рго

С1у

С1и

Зег

РЬе

Суз

Азр

85

90

95

Ьуз

Уа1

Меь

Агд

Тгр

РЬе

С1п

А1а

Меь

Ьеи

С1п

Агд

Ьеи

С1п

ТЬг

Тгр

100

105

110

Тгр

Ηίδ

С1у

Уа1

Ьеи

А1а

Тгр

Уа1

Ьуз

С1и

Ьуз

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

115

120

125

Н13

А1а

Уа1

51п

А1а

Ьеи

Тгр

Ьуз

С1п

РЬе

С1П

Зег

РЬе

Суз

Суз

Зег

130

135

140

Ьеи

Зег

С1и

Ьеи

РЬе

МеЬ

Зег

Зег

РЬе

С1п

Зег

Туг

С1у

А1а

Рго

Агд

145

150

155

160

С1у

Азр

Ьуз

С1и

51и

Ьеи

ТЫ

Рго

С1п

Ьуз

Суз

Зег

С1и

Рго

61П

Зег

165

170

175

Зег Ьуз <210> 11 <211> 5000 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 11

дссЬадддЬд	дасссЬаЬЬЬ	сааЬаЬдасС	ддСдЬссЫЬ	ддааадддда	аадддддаса	60
дЬсасассса	ддсадаасдЬ	даЬдаадаЬд	аадаЬддсса	ЬсЬасааддд	саддадааас	120
сЬдаасадаа	ЬсссадсЬсс	дддсссЬсад	ааддасссса	сдсЬдсссас	аЬЬдассЬЬд	180
дассЬссадс	сЬдсадаЬсд	Ьдадддаада	дасдЬсЬЬсд	асСЬадддсс	ссЬЬдЬсдЬд	240
дЬасЫссЬЬ	адЬЬЬддссс	саддааасса	Ьсссаааддс	аадддсдьдд	ЬЬдЬдсЬсад	300
сЬдддддаад	ддддсЬдддд	дссдЬдадда	ддаддЬддда	ддсссадсса	ддсьддаддд	360
Ьсадаасссд	ьддадсьада	ададсссдЬа	ддддадсссс	аадаЬЬдсЬд	адассадЬда	420
ссЬЬсддссс	садаЬддссЬ	ЬдссЬЬддсс	садаадддЬс	адааддассь	ддЬсадссаа	480

- 31 012567

дсбсадасад	ссддсаддаб	дссМссасс	сбдсададдд	бссбабсббд	6сссасаддб	540
адаЬсСаса!	сассасбадс	сассссбсса	асдбдсасад	дссссбдссс	6сасддсдсс	600
ссбсббаддб	ссддсадббс	сЬдссб ссбб	сбдабссада	адбббсбсбд	дссбсбддад	660
ссддддсаса	ссбсабдсаа	ддасадддбс	саааЫссЫ	1д1ссЫдда	Ъсссас!Ьдд	720
сбдасдбсас	сббссбдбас	ссадддадИ	Сссссадсса	дсЬдЬсссда	дСсбддасбб	780
ЪсссЬсСдсс	ссбссссасб	сбсаддсбдд	ьддддсдддд	ааадсадссс	аЫссЬдддс	840
бсададасбс	ссассссадс	бсададддад	саддддссса	дссадддасд	дасссбсаб6	900
ссбсссаддд	ассссадасс	бсОдбссссс	ссдддбаадс	сбсеабсбсс	дгсЕд^сСсе	960
дбсбсбдОсб	сбдбсбсбдО	сбдЫЫСса	сдсасбсадс	ааддссбсс!	дсссбдадад	1020
аддсбссдсс	сасбассссс	сасбЫсссс	а!аааассад	сЬдадбаШ	дбдссаддаа	1080
дасбдсдбдс	адааддЬдас	бдСсбсадбд	дадсбдддбс	абсСсаддбд	дддадСГддд	1140
дбссссдаад	дбдаддассс	ЬсЬддддадд	адддСдсЫе	бсбдадасас	ШсЫЫсс	1200
Бсасассбдб	бссбсдссад	саддссЫдд	сбссЫдаас	ЬЫЬддссдс	сабдбдсбСс	1260
ссдааддЬда	дЬдададдсЬ	дсдбдбдсб1	ббдбдддсаб	дСсСдаааас	адассдбаад	1320
ддбдсдддбд	ссс1сад!а!	Ысссдадд!	дссбдбдбдб	садддсбсад	бсаддддсас	1380
ссадсддсад	даддасадсд	абддддсдад	адбдбсадбд	даддсдсЬдд	аддбсабабд	1440
ЬдЬсдддддс	дсСддадаас	ддсаддддсд	бддабдадад	ддадсасскд	Ьсссаддадс	1500
ссббсасадс	ссддааадсс	сддддсаддд	дбддддсадд	дсбсбдсбдд	ааасдасбсд	1560
дадаабдсбб	с1с!сададд	ссддсбсадс	ьдддьдддсс	саададсаад	дссбдбдбдд	1620
дбссЬддбдб	сЬсЫсс1сс	ЬЫссЪддд!	бсссбссдас	сксссаЬссЬ	сбассасбдс	1680
сссассдсаа	абдсбаддсс	сассасассс	бссадддадс	бсЫсддссб	дбдасаабад	1740
дддбббссаС	дабдиддссб	ддсГ.саддГ.-	саддасадсд	асссддадда	сасабддсбс	1800
ссдсабдбсд	дсасддГдсС	дсбббсассс	СддбСссбдд	дааабсаддс	бадсдддабд	1860
ддассабсдс	Ъдссбдааад	Ъдбдсадаса	дсбдсссбдс	ссадаабабд	бссссаддсс	1920
сбдсдсасбс	сдбдддбдас	бдбсассасб	сбабадеддд	ддааассадд	сабдбсассс	1980
ссдадасбад	дсссСЕдасд	Ъдддддсбса	дсддддассс	Ъдбддддбдс	сбсбддссбс	2040
Сдбддабдса	дссасдбдбс	Ъдсаддсадд	аабддсссдд	дассбдбддд	Ъсбдсабдбб	2100
ддсадбсддд	аададбддса	ддЫдбаддд	ЬддассЪасс	бддсасссса	аабаббаабс	2160
адсбсабсад	ададдааЬдд	скдсЬдЫас	сЫсксааМ	дбсаОдбссс	бааасабббб	2220
ί ЬссИддсс	аасбсбсасс	бдддассаба	дбддббдбдд	дааасссадс	бдадссадсс	2280
СдсСссадда	садбдбссаб	ссбсссдбдб	дбдбасабдд	дддддбдбдб	дбдбдсаддд	2340
аддасасссс	ддсссасдса	ддсссбдсьс	ссдьдаддад	дддбсассса	ддсссасдса	2400

- 32 012567

ддсссЁдсЁс	ЁЁдЁдаддад	дддЁсассЁа	ддсссасдса	ддсссЁдсЁс	ЁЁдЁдаддад	2460
дддЁсассЁа	ддсссасдса	ддсссЁдсЁс	ЁЁдЁдаддад	дддЁсассЁа	ддсссасдса	2520
ддсссЁдсЁс	ЁЁдЁдаддад	дддЁсассЁа	ддсссаЁдсЁ	ддсссЁдсЁс	ЁЁдддссЁдс	2580
ссадсЁдадс	сддсЁссЁда	дадаадсдсЁ	ЁЁСЁдадесд	ЁЁЁсдаддас	адсссЁддсс	2640
ддбсЁЁЁсса	ддсЁдЁдадд	ддсЁссЁддд	асЁдсЁдЁСЁ	ссЁСЁЁаЁсс	ЁдЁассЁСЁд	2700
ссаЁдЁдЁсЁ	сЁдЁдЁдЁдЁ	дЁдЁдЁдЁдЁ	дЁдЁдЁдЁдЁ	дЁдЁдЁдЁдЁ	аЁаааЁЁаЁс	2760
сЁддаддааа	ддЁЁааддЁд	асасаЁддад	асЁдадЁдЁс	ассдЁЁаЁЁЁ	ссдсаддЁсс	2В20
ЁсЁсЁдаЁда	саЁдаадаад	сЁдааддссс	дааЁддЁааЁ	дсЁссЁсссЁ	асЁЁСЁдсЁс	2380
аддддЁЁддд	ддссЁдддЁс	ЁсадсдЁдЁд	асасЁдадда	сасЁдЁддда	сассЁдддас	2940
ссЁддаддда	сааддаЁссд	дсссЁЁЁддЁ	дссаасЁсЁд	ССЁСЁСЁЁСЭ	садсассадд	3000
ссаЁадааад	аЁЁЁЁаЁдаЁ	ааааЁдсааа	аЁдсадааЁс	аддасдЁдда	саддЁдддЁд	3060
даЁЁЁссссЁ	саддсассад	дЁсасаЁдЁс	сссдссссса	ддсасЁссас	ссЁдЁдЁддд	3120
дсЁсадддЁд	адааддаЁда	ададддассс	асаддсЁссс	ЁсассссЁЁа	ссдЁдддсаа	3180
аЁдсМдсас	сЁдддЁддса	дЁдадЁдддс	дддЁддддда	ЁсЁддасдсс	сцддд^дасЁ	3240
дадддаддса	Ёссаадсссс	адддсЁссЁЁ	даддааасаа	саддддЁдсс	адасдЁддсс	3300
сдддссссЁд	дсЁдддссса	дЁЁсддддЁд	ЁдЁдддадсЁ	даддасЁсас	ЁдддсЁЁдад	3360
дасЁдасЁда	ЁдЁддддЁдс	ададдаддсЁ	ЁдддссЁдда	ассдадЁдсЁ	ЁЁдЁЁссЁаа	3420
саддЁдаЁдЁ	одадссЁддс	ададсЁддад	дЁдадссдЁд	дссЁсссссЁ	ссассаадсЁ	3480
ЁадЁсссСдд	дЁСЁЁаддсЁ	ссасаддаса	сЁдддЁСЁдд	дссссдддЁс	сссЁЁдддаа	3540
ЁсассЁддас	садЁдддддс	сасадЁддда	адддддсадд	саддадсадс	аЁдаассссс	3600
ЁдЁдсссЁсс	ЁсЁссссадд	асдасЁЁсаа	ададддсЁас	сЁддадасад	ЁддсддсЁЁа	3660
ЁЁаЁдаддад	садсасссад	ЁдадЁаЁдас	асасссаЁсЁ	дддсассЁЁд	ССЁЁССЁЁСа	3720
ссЁсЁдсссЁ	дЁСЁЁЁЁСЁЁ	ЁСЁЁЁСЁЁЁС	ЁЁЁЁЁдЁбЁа	ЁЁЁдадасад	адЁсЁсдсТс	3780
ЁдЁсдсссад	дсЁддадЁдс	адЁддсаЁда	ЁСЁЁддсЁса	сЁдсаассЁс	саааЁСЁсдд	3840
дЁЁЁаадЁда	ЁЁсЁссЁдсс	ЁсадссЁдас	аадЁадЁЁдд	дасЁасаддс	асссдссасс	3900
асЁссаддсЁ	даЁЁЁЁЁЁЁЁ	дЁдЁдЁдЁЁЁ	ЁЁадЁадада	ссаддЁЁЁса	ссаЁдЁЁЁдс	3960
саддсЁддЁс	ЁЁдаасЁссЁ	аассЁЁдЁдЁ	ЁссдЁсЁдсс	ЁЁддссЁссс	ааадЁдсЁда	4020
даЁЁасаддс	аЁдадссасс	дддсссадсс	аассссЁдсс	сЁдЁсЁЁдаЁ	дЁддЁдЁддд	4080
садддЁдЁдс	ссадссссЁд	адсЁЁддддб	ддадддсЁдд	дадЁдасадс	сЁадсЁддда	4140
ссЁдсссаЁд	дссЁсасЁсс	ЁсасасадЁд	дсасадсссЁ	сааддсасда	ЁдадддсссЁ	4200
дассЁддЁда	ссаадсадас	асасссаЁсс	ЁдЁсасЁдсс	аЁддаддЁда	аЁдсададда	4260
дддддасЁсЁ	дддаааадЁс	ссЁсЁЁдссс	асддддсЁдЁ	ддЁЁдддааа	ссаасассЁд	4320

- 33 012567

ЕдддссЬссд	1:с1сссаддд	Ьсаддаааад	дсЬдададдс	сЁдддСдСдд	ссадддссЬд	4380
дддсидасас	ссссассСас	адасссЬдаа	Сдд1;дс1:ссс	ассссасадд	адсссасЬсс	4440
ЬсЁасССдаа	ааадааадад	аЕддассасд	дбдссдаддс	аасадабссс	с(:д(:сссдда	4500
ЬдГСдадда!:	сссдсаассд	аддадсс(;дд	ддададсЕЫ:	Ъд(:дасаадд	ЬсаЪдадаЬд	4560
дЫссаддсс	аЬдсЬдсадс	ддсЬдсадас	сЕддЬддсас	ддддЪЬсЬдд	ссЬдддЕдаа	4620
ддадаадд1:д	д6ддссс(:дд	(:ссаЕдсад1:	дсаддсссЬс	Ьддааасад1:	ЬссададЕИ	4680
сбдсЬдс^сб	сЬдЬсададс	Ес££са£д£с	сЕсЬНссад	Ьсскасддад	ссссасдддд	4740
ддасааддад	дадс^дасас	сссадаадЕд	сьспдаассс	сааСссСсаа	аа£даада£а	4800
сСдасассас	сПСдсссСс	сссдЪсассд	сдсасссасс	сЕдассссЪс	ссСсадсед(:	4860
ссЕдЪдсссс	дсссЬс(:ссс	дсасасбсад	(:ссссс6дсс	ЬддсдЕЬссЬ	дссдсадс^с	4920
ЬдассЬддСд	сЬдЕсдсссТ	ддсаЬсЬГаа	(:аааасс(:дс	ЬЬаЬасЬЪсс	сбддсадддд	4980
адаЬассаСд	аСсдсддадд					5000
<210> 12 <211> 285 <212> ДНК <213> Миз	тизси1из
<400> 12 ассдСсасаС	(;дсссаасас	НдссЬасаа	а^сЪадаасЪ	с(: 1д1тдс	аасс^дссаа	60
сстссь (:1:(:(:	СдсНсссс!:	дС ϋΐΣ-Ь-Ы: с(: с	сСаддаадбд	ЬдСЪаадаса	д^ассссЕдЪ	120
аЕасТЕассЬ	ддсаддддад	аЬассаЬдаЬ	сасдааддЬд	дПСТсссад	ддсдаддсСЬ	180
аЬсса И. дса	сСссддаСдЕ	дсЕдассссЪ	дсдаЫШссс	сааабдсддд	ааасСсдас!:	240
дсаЬааНЪд	Ьдд(:ад(:ддд	ддас(:дсд(:(1	сссдс(:с1:сс	ссЬдд		285

<210>13 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Ното зараепз <400>13

Ьеи Ьуз А1а Агд Ме£ Я±з 01п А1а Не 61и Агд РЬе Туг Азр Ьуз Μβΐ 15 1015

С1п Азп А1а 61и Зег С1у Агд С1у С1п Уа1

2025

<210> <211> <212> <213>	14 46 БЕЛОК Ното зархепз
<400>	14

- 34 012567

Уа1 1

МеС

Деи

Ьеи

Рго 5

ТЬг

Зег

А1а С1п С1у Ьеи С1у 10

А1а

Тгр

Уа1 15

Зег

А1а

Суз

Азр

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

Уа1

С1у

Ηίβ

Ьеи

С1у

Рго

Тгр

Агд

Азр

20

25

30

Ьуз

Аар

Рго

А1а

Ьеи

Тгр

Суз

С1п

Ьеи

Суз

Ьеи

Зег

Зег

С1п

35

40

45

<210>15 <211> 108 <212> ДНК <213> Ногао зарЬепз <400>15 ссдааддСсс СсСсСдаСда саСдаадаад сСдааддссс дааСдсасса ддсСаСадаа60 адаССССаСд аСааааСдса аааСдсадаа СсаддасдСд дасаддСд108 <210> 16 <211>179 <212> БЕЛОК <213> Едииз саЬа11из <400>16

МеС 1

С1у Туг

Рго

Ьуз 5

ТЫ

Зег

Агд 61и Азр Азп 61и 10

Агд Тгр

Ьуз 15

11е

Агд

РЬе

Н13

Зег

ТЬг

Ьеи

Азр

Агд

Тгр

Ьеи

Азр

Азр

11е

61и

Уа1

61п

20

25

30

Зег

С1п

С1у

С1и

С1и

С1п

Уа1

Азр

Ьеи

61у

Ьеи

<31и

Азр

Ьеи

С1и

С1и

35

40

45

Ьуз

РЬе

Зег

61и

Азп

11е

Ьеи

Азр

А1а

Уа1

С1и

61и

Н13

Н1з

С1п

Ьуз

50

55

60

Азп

Азп

Зег

С1и

Зег

А1а

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

Азр

Уа1

Ьуз

Рго

Агд

Ьеи

65

70

75

80

Агд

Агд

Агд

А1а

61п

Ьуз

Зег

Зег

Уа1

Ьеи

Азп

Рго

61и

Рго

С1и

С1у

85

90

95

Рго

61 у

Не

Ьеи

61п

Уа1

<31и

А1а

Ьеи

С1и

А1а

Рго

С1и

Рго

С1и

61и

100

105

но

Зег

РЬе

Тгр

Уа1

Агд

А1а

Тгр

Агд

Зег

РЬе

МеС

С1у

Мес

Ьеи

С1п

Агд

115

120

125

Ьеи

Ьуз

61п

Агд

Тгр

61п

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

Тгр

Уа1

Агд

61и

Ьуз

Уа1

130

135

140

- 35 012567

А1а 145

А1а

С1у

Тгр

С1п

А1а 150

Ьеи Суз

Зег Уа1

А1а 155

С1п

Зег

Не

Азп

Зег 160

Уа1

Ьеи

С1и

5ег

РЬе

Суз

Бег

Туг

Мер

А1а

С1у

Ьеи

РЬе

Агд

Туг

В1з

165

170

175

Не

С1п

Уа1

<210>17 <211>170 <212> БЕЛОК <213> Вое Раигиг <400>17

Мер 1

Суз

РЬе А1а

Ьуз 5

61у Уа1

Рго

Туг

Азр 10

61п

А1а

Бег

Ьеи

Агд 15

8ег

Не

Мер

ΗΪ3

Ьуз

Агд

Уа1

Азр

Азр

РЬе

Суз

Азр

Ьуз

Мер

С1у

Азп

С1и

20

25

30

Рго

Й1и

С1и

А1а

61п

Мер

01и

А1а

А1а

Ьеи

Азр

С1и

ТЬг

01и

С1и

01у

35

40

45

Ьеи

Зег

С1и

Азр

Не

Суз

(Пи

РЬе

Не

С1и

Азр

Н1з

Не

С1п

01и

Азп

50

55

60

Ьеи

Рго

С1и

Зег

Ьеи

С1п

С1и

Бег

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

С1п

С1и

А1а

Агд

65

70

75

80

С1п

С1у

Уа1

Агд

Агд

Агд

11е

С1п

Агд

Рго

Зег

Уа1

Зег

А1а

Агд

Ьеи

85

90

95

61и

Уа1

61п

Азп

Рго

61и

С1и

Зег

Не

Тгр

А1а

Агд

А1а

Ьеи

61у

Агд

100

105

110

РЬе

<31п

Уа1

Не

Ьеи

С1п

Бег

Ьеи

61п

01п

Агд

Суз

Тгр

Азр

А1а

Ьеи

115

120

125

ТЬг

Тгр

Ьеи

Ахд

С1и

Ьуз

А1а

Уа1

ТЬг

РЬе

Ьеи

<31и

А1а

Не

Суз

Бег

130

135

140

νβΐ

Уа1

Ьу8

А1а

Уа1

Ьеи

51у

Уа1

Ьеи

ТЬг

Азр

РЬе

Суз

Бег

Бег

νβι

145

150

155

160

С1у

С1п

Ьеи

РЬе

С1у

Азп

Ьеи

11е

61п

Уа1

165

170

- 36 012567 <210> 18 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Еяииз саЬаНиз <400> 18

Мес 1

С1у

Туг

Рго

Ьуз 5

ТЬг

Зег Агд С1и

Азр Азп 10

С1и

Агд

Тгр

Ьуз 15

Не

Агд

РНе

Ηίε

Зег

ТЬг

Ьеи

Азр

Агд

Тгр

Ьеи

Азр

Азр

Не

61и

Уа1

61п

20

25

30

Зег

<31П

61у

С1и

С1и

С1п

УаЬ

Суз

61п

Суз

А1а

Рго

ТЬг

Рго

Суз

Зег

35

40

45

Агд

Азп

Ьеи

С1у

Е1у

Агд

Уа1

Уа1

ТЬг

МеС

ТЬг

МеС

Агд

Агд

Ьуз

Азп

50

55

60

Уа1

Рго

Рго

61П

Уа1

Азр

Ьеи

61у

Рго

Ьеи

ТЬг

Зег

Рго

РЬе

Зег

С1п

65

70

75

80

Агд

ТЬг

РЬе

Агд

Зег

Азр

Ьеи

Суз

Н1з

Ьеи

Рго

ТЬг

Ьеи

Азр

Ьеи

Зег

85

90

95

Ъеи

ТЬг

ТЬг

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьеи

Суз

ТЬг

А1а

Тгр

Рго

Рго

Суз

100

105

110

Рго

Рго

Суз

ТЬг

Зег

Суз

Зег

С1у

РЬе

Ьеи

Ьеи

С1п

Уа1

115

120

125

<210 19 <211> 482 <212> ДНК <213> Еяииз саЬа11из <400> 19

дсасдадсСс	дсдссдСдСд	сСдададдсс	сССддддсад	дсасадсссс	сддааСсесд	60
адсСдссаСд	ддсСасссса	адасдСссад	адаадасааС	даасдССдда	адаСссдаСС	120
СсасадсасС	ССадассддС	ддсссдаСда	СаСсдаадСС	сааСсссаад	дададдааса	180
ддСдСдьсад	СдЬдсСссса	сдсссСдссс	ссдСаассСс	дддддСсддд	СддСсасдаС	240
дасдабдадд	аддаадаасд	ЬдссассСса	ддСсдаСЬСа	ддсссССЬда	сдЬсссссЬЬ	300
ССсасадада	ассСЬсадаа	дЬдассЬССд	ссассСдссЬ	асссССдасс	СдЬссССдас	360
сассбсссСс	ассЬссЬСдс	ЬдСдсасадс	сЬддссассс	СдсссассаС	дсасЬСссСд	420
сЬсаддСССс	сСЬсСдсадд	СсСдасЬСдЬ	ддсСссадсд	саСаСдСсСС	ааСааадСЬд	480

Сд 482

- 37 012567 <210> 20 <211> 815 <212> ДНК <213> Едииз саЬаНиз <400> 20

с^дададдсс	сббддддсад	дсасадсссс	ЬддааЪссЬд	адсСдссайд	ддсЬасссса	60
адасдЬссад	адаадасаа£	даасдЪбдда	адаЬссдаС£	£сасадсас£	£Ладассдд£	120
ддсЪбдаеда	ЬаЬсдаадЪЬ	саа^сссаад	дададдааса	дд£сда£££а	ддссЪадаад	180
асс±ддадда	ааааГГсадб.	даааасаСЕс	ЬЕдасдссдЪ	ддаддадсас	саЬсадаада	240
асаасСсада	асссдсдссс	ЬСасССссСд	асдЬдаадсс	саддЪСасдС	сдсададсГс	300
адаадСсс1;с	ЬдЬссЕсаас	ссСдаассгд	адддЬссадд	даГссЬдсаа	д1СдаддсЬс	360
Сададдсасс	сдадссСдаа	дааадс^ССС	дддЬсададс	аГддадд'Ьсд		420
бдсСасадсд	асЪдаадсад	аддгддсадд	сбдбасбддс	сСддд^дсда	дадаадд'Ьдд	480
сОдсЬддс^д	дсаддсссЬа	^дсадтдсдд	сссадСссаЬ	ЬааЬадЪдСд	с^СдададЪЬ	540
бсбдсСссба	ГаОддсСддд	гхдсссаддг	ассасаСсса	ддИсЬадддд	дсссса1:ддд	600
дЬссаддадд	ддбадссаса	сс^бдсадсс	с^ббдасдЮ	ссссОШса	сададаассо	660
СсадаадЬда	ссСЬЬдссас	сСдсс^ассс	ЪЬдассЬдЪс	сЬОдассасс	ГсссЬсассД	720
ссг+дсЬдЪд	сасадссЪдд	ссасссбдсс	сассаЬдсас	ЬкссЪдс^са	ддЪЫссЪЬс	780
£дсаддГсЕд	асЪ^дГддсЬ	ссадсдсаЬа	дЬсЬЪ			815
<210> 21 <211> 724 <212> ДНК <213> Воз	Ъаигиз
<400> 21 сддаЪЪсссд	ддаЬдсбсад	сЪддадсЬсЬ	ддсЪдсадда	£с£садд1:сс	сЁ1:сдддадд	60
асссГаадсс	ассаСдСдсЬ	Ссдсбааддд	адЬсссабаЬ	дассаддс+С	сЪсбдаддЬс	120
са-ЬааСдсас	ааасдддСдд	а^да'ЬСГсЬд	6даСаада£д	ддааа£даас	садаадаадс	180
асадабддад	дсадсссЬад	аЬдадасдда	ддадддасГс	адсдаддаса	ЬсЁдЪдаа^С	240
са'ЬадаадаС	сасаШсаад	адаассМ:сс	сдаа^сссОд	саддадЪсса	дЬсссСбдс!:	300
гсаддаадса	сддсааддад	Сасдссдсад	ааТссадада	ссСЬсадГсС	сЬдсссдбсС	360
ддаддгссад	ааСссддаад	ададсаЬс^д	ддссададсс	ссддддаддг	Ьссаад^аа'Ь	420
СсСдсададб	с£ссадсадс	дд1дСЪддда	ЪдсдсЕсасс	6ддс(дсддд	адааддсдд-Ь	480
дассЪ1:ссЕд	даддссаЬсЬ	дсадЪдЬддЬ	дааддссд£с	ЪСдддадЬдс	ЬдасддаЬГС	540
сЬдсЬсс^сИ	д^ддддсадс	СсИСсддааа	ссЪса^ссад	дСсЬаддадс	сдсадд£ддЪ	600
ксГддаддаа	сЬссСссбса	СсЬаддаддс	сскдсассаС	ссссЪ1:ссса	дааассаЁсЪ	660
Гд1;даадсда	ссС^Сдсасб	сс£дс(.сасс	сЬСдасссаЪ	ссМ:£аасЕ.д	ссс^сассЕс	720

- 38 012567 <210> 22 <211> 218 <212> БЕЛОК <213> Воз Еаигиз <400> 22 сЕдЕ

724

МеЕ Суз 1

РЬе

ТЬг

Ьуз 5

Агд Азр Рго Агд Уа1 Ьеи 10

А1а

Зег

РЬе

Агд 15

Уа1

Ьеи

МеЕ

Уа1

Агд

Зег

Зег

РЬе

Рго

Агд

не

А1а

С1у

Уа1

Агд

С1и

А1а

20

25

30

Тгр

Уа1

Ьеи

Ьеи

С1у

б1и

А1а

Е1и

Азп

11е

Ьеи

А1а

Низ

Ьеи

С1у

Рго

35

40

45

5ег

Агд

Б1и

Ьуз

Азп

Агд

Азр

Зег

РЬе

ТЬг

Б1п

Уа1

Н1з

Ьеи

Суз

Зег

50

55

60

61п

Н1з

Азп

Ьеи

7а1

Азр

С1и

РЬе

РЬе

Азр

ТЬг

МеЕ

С1и

Азп

С1и

Рго

65

70

75

80

С1и

С1у

А1а

С1п

Мер

С1и

А1а

Уа1

Ьеи

А1а

51и

ТЬг

Ьуз

С1и

Ьуз

РЬе

85

90

95

Не

Ьуз

Азр

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

МеЕ

Азр

Азп

Низ

Не

С1п

С1и

Азп

Зег

100

105

110

Рго

С1и

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Е1и

Зег

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

С1п

С1и

А1а

Агд

С1п

115

120

125

С1и

Уа1

Агд

Суз

Агд

Не

С1п

Агд

Агд

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Зег

Ьеи

С1и

130

135

140

Уа1

С1п

Азп

Рго

51и

С1и

Зег

Не

Тгр

А1а

Агд

А1а

Ьеи

Агд

С1п

РЬе

145

150

155

160

Ьеи

С1у

Не

Ьеи

С1п

Зег

РЬе

Ьеи

Зег

61у

Суз

Агд

Азр

А1а

Ьеи

ТЬг

165

170

17 5

Тгр

Ьеи

Тгр

С1и

Ьуз

А1а

А1а

А1а

Суз

Ьеи

С1п

А1а

Не

Суз

Зег

А1а

180

185

190

Уа1

С1и

А1а

Ьеи

Тгр

С1и

Уа1

Ьеи

ТЬг

Азр

РЬе

Суз

Зег

РЬе

Уа1

С1у

195

200

205

Б1п

Ьеи

Ьеи

Суз

Агд

Зег

Ьеи

Не

С1п

Уа1

- 39 012567

210215 <210> 23 <211> 863 <212> ДНК <213> Воз Ьаигиз <400> 23

сдддассеса	дседдадсес	еддседсадд	аесесаддес	ссадсддсад	дасссеаадс	60
сассаедедс	еесасеаада	дадасссасд	едесседдсе	есееесаддд	едееааедде	120
аадаадсеса	ееессасдеа	еадседддде	есдддаддсс	едддееседс	едддедаадс	180
едадаасаее	седдсссасе	едддасссад	садддадаад	аассдадаее	сееееасеса	240
адессаесСс	едеесасадс	асаассееде	адаедааеее	еЬсдаЬасаа	еддааааеда	300
ассадаадда	дсасадаедд	аддсадессе	адсададасе	ааддадааае	СсаСсаадда	360
сдссеееааа	десаеддаеа	аесасаееса	ададаасаде	сссдааассс	едааддадес	420
садесссеед	сеесаддаад	сасддсаада	адеасдседс	адааессада	дасдсЪссде	480
сессассесе	сбддаддЬсс	адааессдда	адададсабс	едддссадад	ссседсддса	540
деесеедддс	аееседсада	дееесседес	сдддедЬсдд	даедсдсеса	сседдседед	600
ддадааддсс	дсддсседсс	еасаддссае	сЬдсадедсд	деддаддссс	еседддааде	660
дсесасддае	ееседсессе	еедеедддса	дсесееаедс	адаадссеса	ессаддесеа	720
ададссесас	аЬддеесЬдд	аддадсссса	ссесаеесад	ааддссседе	асдаедсссе	780
есссддааас	саСсеесСда	адсдассеее	асссесседс	есасссееда	сссаессеее	840
ааседсссес	сссесседес	сед				8 63

<210>24 <211>127 <212> БЕЛОК <213> Ονίε агЬез <400>24

МеГ 1

Суз

РЬе

А1а Агд 5

61у

Уа1

Рго ΗΪ3 Азр 10

С1п

А1а

Зег

Ьеи

Агд 15

Зег

Мее

Ьеи

НЬз

ТЬг

Тгр

Уа1

Азр

НЬз

Уа1

Суз

Азр

Ьуз

Мее

С1у

Азп

С1и

20

25

30

Рго

С1и

С1и

А1а

С1п

Мее

С1и

А1а

А1а

Ьеи

А1а

С1и

Мее

С1и

С1и

С1и

35

40

45

1еи

Зег

Ьуз

Азр

Уа1

Суз

С1и

Зег

Тгр

Ъуз

Не

ТЬг

РЬе

Ьуз

Агд

ТНг

50

55

60

РЬе

Рго

Азп

Рго

Суз

Агд

Зег

Рго

Уа1

Рго

Суз

РЬе

Агд

Ьуз

Агд

Зег

- 40 012567

65

70

75

80

Ьуз

Ьуз

Туг

АЬа

АЬа

61и

Зег

Агд

Азр

Рго

С1п

Зег

Ьеи

Рго

УаЬ

Тгр

85

90

95

Агд

ТЬг

Агд

Азп

Агд

Ьуз

Агд

А1а

Зег

С1у

Рго

61и

Рго

Суз

61у

61у

100

105

110

Зег

61и

Уа1

РЬе

Суз

СЬу

Уа1

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Уа1

А1а

МеЪ

Туг

115

120

125

<210> 25 <211> 811 <212> ДНК <213> ΟνΪΞ аг1ез <400> 25

сЬдсддЬасс	ддИссддаМ:	сссдддсдад	асадЪдсЪса	дседдадсЬс	ЬддсЬдсадд	60
аСсесадаЬс	ссадссддад	дасссеаа!с	сасса£д£дс	ЫсдсСаддд	дадесссаса	120
едассаддсе	ЬсЪсЪдадда	дсаЬдседса	сасс^дддЪд	даСсаЬдесе	дСдаеаада!	180
дддаааЬдаа	ссадаадаад	сасадабдда	ддсадсссСа	дсададаЬдд	аддаддаасе	240
садсаадда!	дЪсЪдЪдааЪ	саеддаадаЬ	сасаЪЪсаад	адаассСЬсс	сдааЬсссЬд	300
саддадЬсса	дЪсссМ:дс1:	Ьсаддаадсд	садсаадаад	ьасдссдсад	ааессадада	360
ссс1сад£с1:	с£дсс1:д1:с£	ддаддассад	ааассддаад	ададсаСсбд	ддссададсс	420
сРдсддсддЬ	£ссда.дд£££	еседсддаде	с^с^ддсадс	ддЬдердсда	ед£асЬдасс	480
еддсЬдсадд	адааддсддс	ддсседссЬд	даддссдСсИ	дсадСдсддГ	даадассаГс	540
еддддадЬдс	Ъдасдда^ЪЪ	седсессесе	дСддддсадс	есеесадааа	ссЬсаСссад	600
дСсбаддадс	сссадд1:сд£	есРСдаддаа	седс^ссеса	есеадааддс	сседсасаае	660
ссссЬессса	дааассаЪсЬ	ЬсЬдаадсда	ссЪЪЪасссЪ	ссбдеесасс	сЫсассаае	720
ссеееаасСд	сссСсасс^с	седее!дсад	ддасдасасс	асаасаесаа	дссаддЬГЬс	780
ссеЬсЬссаа	д^сЪдасссд	ЬсЬдЬсаддд	а			811

<210> 26 <211>141 <212> БЕЛОК <213> Зиз зсго£а <400>26

Мее Агд СЬу Уа1 Зег А1а ТЬг Агд ТЬг Ьеи Рго Ьуз А1а 61у Рго С1п

1015

Рго Агд Зег 61у Ьеи СЬу Ьеи Рго Ьеи Рго Агд Агд Уа1 Рго С1и Рго

2530

- 41 012567

Рго

Рго

Не 35

Рго

А1а

О1и Бег 5ег 40

Рго

Ьеи

Ьеи

Азп

С1и 45

Уа1

Агд

С1п

61у

Уа1

Агд

Зег

Агд

Уа1

Агд

Агд

Рго

Рго

<31 у

Н13

Азп

С1п

Рго

Н13

50

55

60

Туг

А1а

Ьеи

А1а

Уа1

Агд

61и

Рго

Агд

С1п

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Агд

11е

65

70

75

80

Ьеи

С1и

Ьеи

РЬе

С1и

61и

Меб

Ьеи

Ьуз

Агд

Ьеи

С1п

С1п

Агд

Тгр

Агд

85

90

95

С1у

А1а

Ьеи

А1а

Тгр

Уа1

С1п

С1и

Агд

А1а

А1а

А1а

Суз

РЬе

Агд

С1у

100

105

110

Ьеи

Суз

Агд

А1а

Ьеи

С1и

А1а

РЬе

Тгр

Зег

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

РЬе

Суз

115

120

125

Зег

Зег

Меб

С1у

Н13

А1а

РПе

61у

Зег

Уа1

11е

С1п

Уа1

130

135

140

<210> 27

Claims (24)

1. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность по меньшей мере на 80% идентичную 8ЕО ГО N0: 15, которая кодирует 1Ь-32 и содержит экзон 3, практически прилегающий к экзону 4, и экзон 7, практически прилегающий к экзону 8.

2. Нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что указанный 1Ь-32 представляет собой альфаизоформу, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7.

3. Нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что указанная последовательность по меньшей мере на 90% идентична 8Е0 ГО N0: 15.

4. Нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что указанная последовательность по меньшей мере на 95% идентична 8Е0 ГО N0: 15.

5. Нуклеиновая кислота по п.1, отличающаяся тем, что последовательность содержит 8Е0 ГО N0: 3.

6. Нуклеиновая кислота по пп.1-5, отличающаяся тем, что указанная последовательность функционально связана с гетерологичным промотором.

7. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6.

8. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.7.

9. Очищенный белок 1Ь-32, кодируемый нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-5.

10. Белок по п.9, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7.

- 42 012567

11. Белок по пп.9-10, отличающийся тем, что является рекомбинантным белком, экспрессированным в клетке, выбранной из группы, состоящей из бактериальной клетки, клетки дрожжей, клетки насекомого и клетки млекопитающего.

12. Белок по пп.9 и 10, отличающийся тем, что представляет собой слитый белок.

13. Изолированное антитело, связывающееся с белком по пп.9 и 10 и ингибирующее индуцированное с помощью ГБ-32 продуцирование ΤΝΡα клеткой-мишенью.

14. Антитело по п.13, отличающееся тем, что оно является моноклональным антителом.

15. Антитело по пп.13 и 14, отличающееся тем, что оно является человеческим антителом.

16. Антитело по пп.13 и 14, отличающееся тем, что оно является гуманизированным моноклональным антителом.

17. Фрагмент БаЬ моноклонального антитела по любому из пп.13-16.

18. Способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, обусловленного индукцией ГБ-32 фактора некроза опухоли альфа, имеющего подозрение на данное заболевание или имеющего повышенный риск данного заболевания, заключающийся во введении субъекту антитела по любому из пп.13-16 или БаЬ фрагмента по п.17.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанное заболевание является аутоиммунным.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание выбирают из группы, состоящей из рассеянного склероза, тяжёлой псевдопаралитической миастении, аутоиммунной нейропатии, аутоиммунного увеита, болезни Крона, язвенного колита, первичного билиарного цирроза печени, аутоиммунного гепатита, аутоиммунной гемолитической анемии, пернициозной анемии, аутоиммунной тромбоцитопении, сахарного диабета типа I, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, аутоиммунного оофорита и орхита, височного артериита, антифосфолипидного синдрома, васкулитидов, болезни Бехчета, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, склеродермии, полимиозита, дерматомиозита, спондилоартропатии, синдрома Шегрена, псориаза, герпетиформного дерматита, обыкновенной пузырчатки и витилиго.

21. Способ по пп.18-20, отличающийся тем, что указанное антитело выбирают из группы, состоящей из человеческого моноклонального антитела и гуманизированного моноклонального антитела.

22. Способ по пп.19-21, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют в условиях, пригодных для облегчения по меньшей мере одного симптома аутоиммунного заболевания.

23. Способ скрининга на ингибиторы 1Б-32, заключающийся в исследовании связывания веществакандидата с белком Ш-32, кодируемым нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-5.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что вещество-кандидат является антителом по пп.13-16 или его БаЬ-фрагментом по п.17.