PL207501B1 - Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA - Google Patents

Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA

Info

Publication number
PL207501B1
PL207501B1 PL354661A PL35466100A PL207501B1 PL 207501 B1 PL207501 B1 PL 207501B1 PL 354661 A PL354661 A PL 354661A PL 35466100 A PL35466100 A PL 35466100A PL 207501 B1 PL207501 B1 PL 207501B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
baff
cells
polypeptide
seq
mice
Prior art date
Application number
PL354661A
Other languages
English (en)
Other versions
PL354661A1 (pl
Inventor
Fabienne Mackay
Jeffrey Browning
Christine Ambrose
Jurg Tschopp
Pascal Schneider
Jeffrey Thompson
Original Assignee
Apotech R & D Sa
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27386828&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL207501(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Apotech R & D Sa, Biogen Idec Inc filed Critical Apotech R & D Sa
Publication of PL354661A1 publication Critical patent/PL354661A1/pl
Publication of PL207501B1 publication Critical patent/PL207501B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA. BMCA, znany również jako BAFF-R, jest receptorem z rodziny TNF. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy użycia receptora BAFF (czynnika aktywującego limfocyty B, należącego do rodziny czynników martwicy nowotworów - TNF) oraz czynników blokujących jego działanie, do pobudzania lub hamowania ekspresji limfocytów B oraz immunoglobin. Receptor ten może być zastosowany jako czynnik przeciwrakowy i immunoregulacyjny, a także jako element w leczeniu chorób immunosupresyjnych, takich jak AIDS. Dodatkowo, receptor oraz czynniki blokujące jego działanie mogą odgrywać pewną rolę w rozwoju nadciśnienia i związanych z nim schorzeń. Ponadto, komórki transfekowane genem tego receptora mogą być wykorzystane w terapii genowej w celu leczenia nowotworów, białaczek, chorób autoimmunologicznych lub dziedzicznych chorób genetycznych związanych z funkcjonowaniem limfocytów B. Czynniki blokujące, takie jak warianty rekombinacyjne lub przeciwciała specyficzne wobec receptora, mają również zastosowania immunoregulacyjne. Przewidywane jest również zastosowanie receptora BAFF jako stymulatora limfocytów B w chorobach leczonych immunosupresyjnie, np. w przypadku pobudzania produkcji limfocytów B u pacjentów poddanych przeszczepowi organów (np. przeszczepowi szpiku kostnego) lub u pacjentów poddanych terapii przeciwrakowej. Podobnie, przewidywane jest wykorzystanie receptora BAFF jako adiuwanta i/lub jednego z kilku czynników pobudzających w celu podwyższenia i/lub przywrócenia poziomu limfocytów B do poziomu odpowiadającego w przybliżeniu normie. W celu zahamowania postępu chorób wywołanych nieprawidłowym funkcjonowaniem limfocytów B mogą być także wykorzystane rozpuszczalne formy receptora BAFF, blokujące funkcje limfocytów B.
Rodzina TNF składa się z ligandów i specyficznych wobec nich receptorów, określanych jako ligandy z rodziny TNF oraz receptory z rodziny TNF (Bazzoni i Beutler, 1996). Rodzina ta bierze udział w regulacji systemu immunologicznego, a prawdopodobnie takż e innych nie immunologicznych systemów. Regulacja ta zachodzi często na najwyższym poziomie systemu, co sprawia, że sygnał reprezentowany przez element z rodziny TNF może spowodować wystąpienie licznych kolejnych zdarzeń zależnych od TNF. TNF może zainicjować ogólną obronną odpowiedź zapalną organizmu wobec obcej inwazji, co obejmuje zmiany w prezentowaniu cząsteczek adhezyjnych biorących udział w transporcie komórek, produkcję chemokin w celu skierowania odpowiednich komórek do odpowiednich przedziałów, oraz pobudzenie różnych komórek efektorowych. Regulacja tych szlaków ma oczywiste znaczenie kliniczne.
Uważa się, że indukcja rozmaitych odpowiedzi komórkowych przez cytokiny z rodziny TNF jest inicjowana poprzez ich przyłączenie się do specyficznych receptorów komórkowych. Zidentyfikowano co najmniej dwa różne receptory TNF o wielkości około 55 kDa (TNFR1) i 75 kDa (TNFR2) [Hohman i wsp., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989) oraz Brockhaus i wsp., PNAS, 87: 3127-3131 (1990)]. Zidentyfikowano liczne polimorfizmy sprzężone z obydwoma genami receptorów TNF. Obydwa białka TNFR wykazują schemat budowy typowy dla receptorów powierzchniowych komórki, obejmujący domenę zewnątrzkomórkową, błonową i wewnątrzkomórkową. Zewnątrzkomórkowa część białek TNFR typu 1 i 2 zawiera sekwencję powtórzoną złożoną z czterech domen bogatych w cysteiny (CRD). Podobne powtórzenia sekwencji CRD występują u kilku innych białek powierzchniowych, między innymi u receptora czynnika wzrostu nerwów p75 i antygenu CD40 limfocytów B.
Receptory są wyśmienitym narzędziem służącym do badania szlaków biochemicznych, gdyż można je łatwo wykorzystać do produkcji immunoglobulinowych białek fuzyjnych. Powstałe w ten sposób dimerowe rozpuszczalne formy receptora są dobrymi inhibitorami reakcji wywoływanych przez wydzielone lub związane na powierzchni komórek ligandy. Poprzez związanie z ligandami receptory te zapobiegają ich oddziaływaniu z receptorami komórkowymi, zdolnymi do przekazania sygnału. Białka fuzyjne receptor-Ig sanie tylko użyteczne w doświadczalnym zakresie badań, lecz znajdują również zastosowanie kliniczne, co w przypadku TNFR-Ig dotyczy leczenia choroby zapalnej jelit, zapalenia stawów, oraz ostrego zespołu klinicznego towarzyszącego podawaniu OKT3 (Eason i wsp., 1996; Feldmann i wsp., 1996, van Dulleman i wsp., 1995). Można spodziewać się, że badanie zjawisk wywoływanych przez sygnały przekazywane przez rodzinę receptorów TNF będzie miało szerokie zastosowanie w leczeniu chorób immunologicznych, a także szerokiej gamy chorób człowieka, których patologiczne następstwa związane są z udziałem systemu immunologicznego. Rozpuszczalna postać opisanego niedawno receptora o nazwie osteoprotegerin może zahamować utratę masy kostnej, z czego wynika, ż e zjawiska kontrolowane przez receptory z rodziny TNF nie muszą być koniecznie
PL 207 501 B1 ograniczane do regulacji systemu immunologicznego. Przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi mogą zablokować wiązanie liganda, co również wiąże się z klinicznymi zastosowaniami. Przeciwciała takie są często „długowieczne”, co może być ich zaletą w porównaniu z wykazującymi krótszy okres półtrwania we krwi rozpuszczalnymi białkami fuzyjnymi receptor-Ig.
Choć największe zastosowanie terapeutyczne omawianych receptorów dotyczy hamowania regulowanych przez nie szlaków, początkowo największe nadzieje wiązano z aktywacją receptorów TNF (Aggarwal i Natarajan, 1996). Aktywacja receptorów TNF może doprowadzić do śmierci wybranej komórki docelowej, dlatego też zastosowanie tej metody do leczenia nowotworów było, i wciąż jest, bardzo atrakcyjne (Eggermont i wsp., 1996). Receptor może być aktywowany albo poprzez podanie liganda, tj. poprzez wykorzystanie naturalnego szlaku, albo też poprzez zastosowanie przeciwciał zdolnych do sprzęgania sąsiadujących receptorów, co wiąże się z silnym działaniem agonistycznym. Zastosowanie przeciwciał byłoby bardzo korzystne w onkologii, gdyż mogą być one utrzymywane we krwi przez dłuższy czas, podczas gdy ligandy wykazują na ogół krótszy okres półtrwania we krwi. Ponieważ liczne receptory wyrażane są swoiście w nowotworach, a także sygnalizują śmierć lub różnicowanie komórek nowotworowych, przeciwciała agonistyczne mogłyby być dobrą bronią w leczeniu raka. Podobnie, receptory z rodziny TNF kontrolują wiele korzystnych zjawisk immunologicznych, co dotyczy np. reakcji zapalnych u biorcy, produkcji przeciwciał itp., z czego wynika, że agonistyczne przeciwciała mogą mieć pozytywny efekt także w przypadku innych, nie mających związku z nowotworem zastosowań.
Paradoksalnie, zahamowanie szlaku również może mieć korzystny efekt w przypadku leczenia nowotworów. Przykładowo, ligand Fas jest wyrażany przez niektóre nowotwory, co prowadzić może do śmierci Fas-dodatnich limfocytów, a w konsekwencji do ułatwienia obrony nowotworu przed systemem immunologicznym. W tym przypadku, zahamowanie systemu Fas mogłoby pozwolić systemowi immunologicznemu na reakcję wobec nowotworu przy wykorzystaniu tej właśnie drogi dostępu (Green i Wade, 1977).
Twórcy wynalazku zidentyfikowali klon cDNA kodujący polipeptyd, oznaczony w niniejszym wniosku jako „BAFF-R” lub jako „BCMA”, który wiąże się z czynnikiem martwicy nowotworów BAFF, aktywującym limfocyty B i należącym do rodziny TNF. BAFF jest tym samym czynnikiem, który został uprzednio opisany w WO/9912964.
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd BCMA obejmujący sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% identyczną do sekwencji odpowiadającej aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1, przeciwciało skierowane przeciwko Id. Sekw. Nr: 1 lub polipeptyd BCMA obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 8 do 41 z Id. Sekw. Nr: 1 do zastosowania jako lek.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wyżej wymienionych czynników do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia immunologicznego, zaburzenia limfoproliferacyjnego limfocytów B lub stanów zapalnych u ssaka.
Korzystnie, polipeptyd stosowany według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją odpowiadającą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1, a korzystniej obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadają cą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1.
Korzystnie, polipeptyd stosowany według wynalazku obejmuje ponadto domenę Fc immunoglobuliny, korzystniej immunoglobuliny IgG, a najkorzystniej ludzkiej immunoglobuliny IgG.
Również korzystnie, lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku hamuje wzrost limfocytów B u ssaka, hamuje wytwarzanie immunoglobuliny u ssaka i/lub hamuje u ssaka wzrost limfocytów B indukowanych przez komórki dendrytyczne.
Korzystniej, leczonym ssakiem jest człowiek.
Polipeptyd stosowany według wynalazku korzystnie nie obejmuje domeny transbłonowej i/lub jest rozpuszczalny.
Szczególnie korzystne jest zastosowanie polipeptydu obejmującego polipeptyd BCMA składający się zasadniczo z:
(a) sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją odpowiadającą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1 lub (b) sekwencji aminokwasowej odpowiadającej aminokwasom 8 do 41 z Id. Sekw. Nr: 1.
Wynalazek dostarcza zatem sposobów wykorzystania BAFF-R. Do sposobów tych zalicza się metody hamowania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych przez komórki dendrytyczne, lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych, przy użyciu polipeptydu
PL 207 501 B1
BAFF-R. Niniejszym opisano również sposoby pobudzania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych przez komórki dendrytyczne lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych przy użyciu polipeptydu BAFF-R, a także sposoby wielotorowego pobudzania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych przez komórki dendrytyczne, lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych z zastosowaniem polipeptydu BAFF-R oraz przeciwciała anty-T, liganda CD40, lub liganda anty-CD40.
Niniejszym opisano również sposoby wykorzystania BAFF-R w leczeniu chorób autoimmunologicznych, nadciśnienia, chorób sercowo-naczyniowych, chorób nerek, chorób limfoproliferacyjnych B-komórkowych, chorób immunosupresyjnych, w transplantacji narządów, oraz AIDS. Stosowane niniejszym czynniki są użyteczne do leczenia, powstrzymywania lub zmiany odpowiedzi immunologicznej obejmującej szlak sygnałowy pomiędzy BAFF-R i jego ligandem oraz do powstrzymywania stanu zapalnego poprzez podawanie przeciwciała skierowanego przeciwko BAFF-R lub jego epitopowi.
Opisane powyżej sposoby są korzystnie realizowane poprzez podawanie skutecznej terapeutycznie ilości polipeptydu BAFF-R, lub cząsteczki chimerowej składającej się z polipeptydu BAFF-R połączonego z heterologiczną sekwencją aminokwasową albo też homologa przeciwciała anty-BAFF-R.
Niniejszym opisano również kompozycje farmaceutyczne zawierających polipeptyd BAFF-R oraz dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę.
Opisane niniejszym cząsteczki chimero we składają się z polipeptydu BAFF-R połączonego z heterologicznym polipeptydem lub sekwencją aminokwasową . Przykł adem takiej cząsteczki chimerowej jest BAFF-R połączony z regionem Fc immunoglobuliny lub epitopową sekwencją znacznikową.
Wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała wiążącego się specyficznie do polipeptydu BAFF-R. Przeciwciało to może być ewentualnie przeciwciałem monoklonalnym.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydową (Id. Sekw. Nr: 2) cDNA ludzkiego BAFF-R (BCMA) oraz odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 2). Potencjalny start translacji w pozycji 219 lub 228 sekwencji nukleotydowej; domena bogata w cysteiny (CRD) w pozycji 240-341 Id. Sekw. Nr: 2 (aminokwasy 8-41 w Id. Sekw. Nr: 1); potencjalny region błonowy w pozycji 375-459 Id. Sekw. Nr: 2.
Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową plazmidu pJST538, kodującego BAFF-R-Fc (Id. Sekw. Nr: 4), oraz odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. Nr: 3): nukleotydy 1-69, mysia sekwencja sygnałowa IgG-kappa; nukleotydy 70-222, BAFF-R (jego nukleotydy 1-153); nukleotydy 223-906, ludzka IgG.
Figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydową plazmidu pJST535, kodującego ludzki BAFF-R o pełnej długości oraz odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową.
Figura 4 przedstawia porównanie struktury TNF-R55 oraz BAFF-R.
Figura 5 przedstawia komórki 293EBNA transfekowane (a) CH269 (1,0 g) lub (b) plazmidem pJST535 (0,1 pg), kodującym BAFF-R o pełnej długości, a następnie barwione flag-hBAFF (0,5 ng/ml) przy użyciu metody płytkowej.
Figura 6(a) przedstawia obraz FACS prezentujący komórki 293EBNA transfekowane plazmidem pJST535 i barwione jak następuje: brak liganda (czarny histogram), 1 μg/ml flag-hCD40L (kolor różowy) lub flag-hBAFF (kolor zielony). Wszystkie próbki barwiono przy użyciu przeciwciała anty-flag M2, a następnie przeciwciała skierowanego przeciwko mysiej IgG, według opisu z przykładu 2.
Figura 6(b) przedstawia histogramy FACS wraz ze statystyką dotyczącą eksperymentu. Wykonano następujące barwienia: (1) nie barwione, (2) tylko 7AAD, (3) tylko drugi etap i 7AAD, (4) 9 μg/ml flag-hBAFF, (5) 3 pg/ml flag-hBAFF, (6) 1 μg/mi flag-hBAFF, (7) 0,33 pg/ml flag-hBAFF, (8) 0,11 pg/ml flag-hBAFF, (9) 1 pg/ml flag-hCD40.
Figura7 przedstawia wyniki immunoprecypitacji dla BAFF-R, według opisu z przykładu 4. Standardy masy cząsteczkowej (w kDa) oznaczono po lewej stronie rysunku. Ścieżki: (1) 12,5 ng flaghTWEAK, (2) 12,5 ng flag-hBAFF, (3) immunoprecypitacja flag-hBAFF przy użyciu 0,5 ml pożywki pohodowlanej z BAFF-R-Fc, (4) immunoprecypitacja flag-hTWEAK przy użyciu 0,5 ml pożywki pohodowlanej z BAFF-R-Fc, (5) immunoprecypitacja bez użycia liganda przy użyciu 0,5 ml pożywki pohodowlanej z BAFF-R-Fc, (6) immunoprecypitacja flag-hBAFF przy użyciu 0,5 ml pożywki pohodowlanej pochodzącej z nie transfekowanych komórek 293EBNA, (7) immunoprecypitacja flag-hTWEAK przy użyciu 0,5 ml pożywki pohodowlanej pochodzącej z nie transfekowanych komórek 293EBNA.
PL 207 501 B1
Figura 8 przedstawia wykres dla wyników testu proliferacyjnego dla limfocytów śledzionowych, obrazujący zależność między zliczeniami na minutę (CPM) wbudowanymi przez komórki mysich limfocytów śledzionowych a ilością dodanego ludzkiego BAFF ^g/ml).
Figura 9 przedstawia wykres dla wyników testu blokowania BAFF, analizującego wiązanie BAFF przez komórki Raji. Wykres przedstawia zależność między odczytami MFI (średnia intensywność fluorescencji) a ilością dodanego R:hIgGl (ng/ml).
Figura 10(a) przedstawia wykres dla wyników analizy FACS obrazujący zależność między ekspresją IgM i CDI u myszy Baff Tg, które otrzymały h-Ig (środkowy panel) lub hBCMA-Ig (dolny panel) oraz u kontrolnych osobników typu dzikiego z równoległego miotu, które otrzymały zastrzyki PBS (górny panel), jak opisano w przykładzie 11.
Figura 10(b) przedstawia wykres dla wyników analizy FACS obrazujący zależność między ekspresją CD21 i IgM u IgD-pozytwnej populacji myszy Baff Tg, które otrzymały h-Ig (środkowy panel) lub hBCMA-Ig (dolny panel) oraz u kontrolnych osobników typu dzikiego z równoległego miotu, które otrzymały zastrzyki PBS (górny panel), jak opisano w przykładzie 11.
Figura 10(c) przedstawia wykres dla wyników analizy FACS obrazujący zależność między ekspresją CD21 i IgM u IgD-negatywnej populacji myszy Baff Tg, które otrzymały h-Ig (środkowy panel) lub hBCMA-Ig (dolny panel) oraz u kontrolnych osobników typu dzikiego z równoległego miotu, które otrzymały zastrzyki PBS (górny panel), jak opisano w przykładzie 11.
Figura 11 przedstawia ciężar śledziony dla wszystkich grup myszy Baff Tg (podany jako ciężar w mg ± odchylenie standardowe).
Figura 12 przedstawia wykres obrazujący zależność między białkomoczem (mg/dL) i liczbą iniekcji dla myszy Baff Tg poddawanych działaniu PBS, hig lub hBCMA-Ig oraz dla osobników kontrolnych z równoległego miotu.
Figura 13 przedstawia wykres obrazujący wartości średniej ogólnej dla ciśnienia tętniczego u myszy Baff Tg i u kontrolnych myszy typu dzikiego.
Figura 14 przedstawia wykres obrazujący wartości średniego ciśnienia tętniczego u poszczególnych myszy Baff Tg i u kontrolnych myszy typu dzikiego.
Figura 15 przedstawia wykres kolumnowy obrazujący procentowy udział myszy SNFl, u których zaobserwowano ciężkie zapalenie nerek, po podaniu BAFF-R-Ig (BCMA-Ig), HuIgG lub PBS.
Figura 16 przedstawia wykres obrazujący całkowitą liczbę (w milionach) komórek dendrytycznych CD11c+ dla myszy poddanych działaniu (in vivo) 20 μg BCMA-Ig, 50 μg BCMA-Ig, HuIgG lub PBS. Egzaminowano następujące populacje komórek dendrytycznych CD11c+: (1) CD8a+CD4-, (2) CD8a+CD4- oraz (3) CD8a-CD4+.
Szczegółowy opis
I. Definicje
Użyte tu terminy „BFF-R” i „BCMA” obejmują natywne sekwencje BAFF-R oraz wariantów BAFF-R (zdefiniowanych w dalszej części). BAFF-R może być izolowany z rozmaitych źródeł, takich jak tkanki ludzkie lub mysie, lub inne źródła tkanek, lub też może być uzyskany przy użyciu metod rekombinacyjnych lub syntetycznych.
Termin „natywny BAFF-R” odnosi się do peptydu posiadającego taką samą sekwencję aminokwasową, jak BAFF-R uzyskany z natury. Takie natywne białka BAFF-R mogą być izolowane z naturalnych źródeł, łub produkowane przy użyciu metod rekombinacyjnych lub syntetycznych. Naturalnie występujące skrócone lub wydzielone formy BAFF-R (np. rozpuszczalne formy zawierające przykładowo sekwencję domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występujące warianty białka (np. produkty alternatywnej obróbki RN A) oraz naturalnie występujące warianty alleliczne BAFF-R. W jednym z zastosowań wynalazku, natywny BAFF-R jest dojrzałym polipeptydem BAFF-R o sekwencji pełnej długości, zawierającym aminokwasy 1-184 Id. Sekw. Nr: 1 lub też fragmentem tej sekwencji.
„Domena zewnątrzkomórkowa BAFF-R” lub „BAFF-R ECD” odnosi się do postaci BAFF-R, która zasadniczo nie posiada błonowej i cytoplazmatycznej domeny BAFF-R. Zazwyczaj, domena zewnątrzkomórkowa BAFF-R będzie miała mniej niż 1% tych domen, a zalecane jest mniej niż 0,5% domeny błonowej i cytoplazmatycznej. Możliwe warianty BAFF-R ECD obejmować mogą np. aminokwasy 8-41, 4-51, lub też 1-53 Id. Sekw. Nr: 1. W korzystnej postaci wykonania niniejszego wynalazku, BAFF-R ECD zawiera aminokwasy 1-51 Id. Sekw. Nr: 1. Będzie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie, że identyfikacja domeny błonowej polipeptydu BAFF-R opisanego w niniejszym wynalazku opiera się na zastosowaniu rutynowych kryteriów przyjmowanych przy identyfikacji tego typu domen hydrofobowych. Precyzyjne określenia granic domeny błonowej mogą się różnić między sobą, ale zwy6
PL 207 501 B1 kle nie odstępują bardzo (nie więcej niż 5 aminokwasów) od przyjętych tutaj wartości (w przypadku obu końców domeny). Zgodnie z tym, BAFF-R ECD może np. zawierać aminokwasy 8-41 Id. Sekw. Nr: 1.
Termin „wariant BAFF-R” oznacza aktywny BAFF-R (wg definicji podanej poniżej), którego stopień identyczności sekwencji wobec sekwencji natywnego BAFF-R o pełnej długości (Id. Sekw. Nr: 1) lub sekwencji BAFF-R ECD, wynosi przynajmniej 80%. Takie warianty BAFF-R obejmują np. polipeptydy BAFF-R, do których dodano lub usunięto jeden lub więcej aminokwasów na karboksylowym końcu Id. Sekw. Nr: 1. Zazwyczaj, stopień identyczności sekwencji wariantu BAFF-R wobec sekwencji aminokwasowej nr 1 wynosił będzie przynajmniej 80 lub 85%, przy czym zaleca się, by liczba ta wynosiła przynajmniej 90% lub nawet przynajmniej 95%.
Termin „stopień (%) identyczności sekwencji aminokwasowej” w odniesieniu do przedstawianych tutaj sekwencji BAFF-R oznacza procentowy udział reszt aminokwasowych, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji BAFF-R, po przeprowadzeniu liniowego dopasowania rozpatrywanych sekwencji i wprowadzeniu ewentualnych przerw w celu osiągnięcia maksymalnego stopnia identyczności, jednak bez uwzględniania jakichkolwiek konserwatywnych podstawień aminokwasowych. Liniowe dopasowanie w celu określenia stopnia identyczności sekwencji aminokwasowej można wykonać stosując metody znane specjalistom z tej dziedziny, np. wykorzystując publicznie dostępne programy komputerowe takie jak BLAST, ALIGN lub Megalign (DNASTAR). W celu otrzymania maksymalnego stopnia identyczności w odniesieniu do całego zakresu porównywanych sekwencji, wybrać należy odpowiednie parametry dla procesu porównywania, włącznie z odpowiednimi algorytmami, które mogą być ocenione przez specjalistów z tej dziedziny.
Termin „oznaczony epitopem”, użyty w niniejszym wynalazku, odnosi się do chimery polipeptydowej zawierającej sekwencję BAFF-R lub sekwencję jego domeny, do której przyłączony jest „znacznik polipeptydowy”. Taki znacznik polipeptydowy posiada wystarczającą liczbę reszt aminokwasowych, aby utworzyć epitop, przeciwko któremu można uzyskać przeciwciała lub też, który może być identyfikowany przez jakiś inny czynnik. Znacznik ten jest jednak wystarczająco krótki, żeby nie kolidować z aktywnością BAFF-R. Jest również zalecane, aby znacznik polipeptydowy miał unikalną sekwencję, tak aby skierowane przeciwko niemu przeciwciało nie reagowało krzyżowo z innymi epitopami. Używane znaczniki polipeptydowe mają na ogół przynajmniej 6 reszt aminokwasowych, a przeciętnie zawierają od 8 do 50 aminokwasów (najkorzystniej 10-20 aminokwasów).
Termin „wyizolowany” w odniesieniu do rozmaitych opisanych tu polipeptydów oznacza polipeptyd, który został zidentyfikowany i oddzielony od składnika jego naturalnego środowiska. Składniki zanieczyszczające, pochodzące z jego naturalnego środowiska, stanowią materiał, który zazwyczaj wpływa negatywnie na możliwość diagnostycznego lub leczniczego wykorzystania tego polipeptydu i zawierać może enzymy, hormony i inne białkowe i niebiałkowe składniki rozpuszczalne. W zalecanych zastosowaniach, polipeptyd jest oczyszczany (1) do poziomu wystarczającego dla odczytania przynajmniej 15 reszt z N-końcowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej przy użyciu sekwantora obrotowego lub (2) do homogeniczności ocenianej na podstawie elektroforezy SDS-PAGE, w warunkach redukujących lub nie redukujących oraz barwienia błękitem Coomasssie lub, korzystniej, srebrem. Wyizolowany polipeptyd to także polipeptyd in situ wewnątrz zrekombinowanych komórek, gdyż w tym przypadku brakuje przynajmniej jednego składnika naturalnego ś rodowiska dla BAFF-R. Zazwyczaj jednak, wyizolowany polipeptyd jest przygotowywany przy wykorzystaniu przynajmniej jednego etapu oczyszczania.
Termin „przeciwciało” używany jest w najszerszym zakresie i odnosi się głównie do pojedynczych monoklonalnych przeciwciał przeciwko BAFF-R (włączając w to przeciwciała agonistyczne, antagonistyczne i neutralizujące) oraz mieszaniny przeciwciał anty-BAFF-R o wieloepitopowej swoistości. Termin „przeciwciało monoklonalne” odnosi się w tym wypadku do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tzn., że poszczególne przeciwciała składają ce się na tę populację są identyczne, za wyjątkiem ewentualnych naturalnie występujących mutacji, które mogą być obecne w niewielkiej ilości.
Termin „oczyszczony preparat” lub „zasadniczo czysty preparat” polipeptydu, używany w niniejszym wynalazku, oznacza polipeptyd, który został oddzielony od innych białek, lipidów i kwasów nukleinowych, z którymi naturalnie występuje.
Korzystnie, polipeptyd powinien być oczyszczony także od innych substancji, np. przeciwciał, matryc itp., wykorzystywanych w procesie jego oczyszczania.
Terminy „leczenie” i „terapia” użyte są tutaj w odniesieniu do terapii leczniczej, profilaktycznej lub zapobiegawczej.
PL 207 501 B1
Terminy „peptydy”, „białka” oraz „polipeptydy” używane są zamiennie.
Termin „aktywny biologicznie”, w użytym tu znaczeniu, odnosi się do aktywności in vivo lub in vitro, która może być obserwowana bezpośrednio lub pośrednio. Aktywne biologicznie fragmenty BAFF-R mogą np. mieć 70% homologii (pod względem sekwencji aminokwasowej) z miejscem aktywnym receptora, korzystnie - przynajmniej 70%, jeszcze korzystniej - przynajmniej 80%, a najkorzystniej - przynajmniej 90% homologii. Identyczność lub homologia względem receptora jest tutaj zdefiniowana jako procentowy udział reszt aminokwasowych rozpatrywanej sekwencji, które są identyczne z resztami BAFF-R w Id. Sekw. Nr: 1 lub które są identyczne z określoną porcją reszt aminokwasowych w Id. Sekw. Nr: 1.
Termin „ssak” jest tu używany w odniesieniu do jakiegokolwiek zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając w to ludzi, krowy, konie, psy, myszy i koty. W zalecanym zastosowaniu, ssakiem tym jest człowiek.
Wykonywanie niniejszego wynalazku obejmować będzie, o ile nie jest inaczej zaznaczone, konwencjonalne techniki biologii komórki, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, oraz immunobiologii, które to techniki znane są specjalistom z tych dziedzin. Techniki te omówione są w piśmiennictwie z tego zakresu.
Dalsze szczegółowe odniesienia dotyczyć będą korzystnych zastosowań wynalazku. Wynalazek ten dotyczy wykorzystania BAFF-R i związanych z BAFF-R cząsteczek do wywierania efektu na wzrost i dojrzewanie limfocytów B oraz wydzielanie immunoglobulin. Wynalazek odnosi się do wykorzystania BAFF-R i związanych z BAFF-R cząsteczek do wywoływania odpowiedzi systemu immunologicznego, koniecznych w przypadku niektórych chorób immunologicznych. Ponadto, niniejszym opisano także leczenie raka i chorób immunologicznych przy użyciu BAFF-R lub genu pokrewnego do BAFF-R, poprzez zastosowanie metod terapii genowej.
BAFF-R i jego homologi wytwarzane przez organizm gospodarza transformowanego przy użyciu sekwencji stosowanej w rozwiązaniach według wynalazku, jak również natywny BAFF-R oczyszczony przy użyciu specjalistycznych metod lub wytworzony w oparciu o znaną sekwencję aminokwasową, są użyteczne w ramach rozmaitych metod stosowanych w celach przeciwrakowych, przeciwnowotworowych lub immunoregulacyjnych. Są także użyteczne w przypadku terapii oraz metod wykorzystywanych w przypadku innych chorób.
Niniejszym opisano także wykorzystanie polipeptydu kodowanego przez wyizolowany kwas nukleinowy kodujący BAFF-R w terapii „antysensowej”. W przypadku tu opisanym, leczenie „antysensowe” odnosi się do podawania lub wytwarzania in situ oligonukleotydów lub ich pochodnych, które specyficznie hybrydyzują w warunkach komórkowych z komórkowym mRNA i/lub DNA kodującymi interesujący nas ligand, tak aby zahamować ekspresję kodowanego białka, tj. aby zahamować transkrypcję i/lub translację. Wiązanie może odbywać się na drodze konwencjonalnej komplementarności par zasad, lub, jak np. w przypadku przyłączania się do dupleksu DNA, poprzez specyficzne oddziaływania w szerokim rowku podwójnej helisy. Zasadniczo, terapia „antysensowa” odnosi si ę do grupy technik używanych przez specjalistów z tej dziedziny, i obejmuje wszystkie terapie, które polegają na specyficznym wiązaniu się sekwencji oligonukleotydowej.
Konstrukt antysensowy może być dostarczany np. jako plazmid ekspresyjny, który podczas transkrypcji w komórce produkuje RNA komplementarny przynajmniej do części komórkowego mRNA kodującego ligand BAFF. Alternatywnie, konstrukt antysensowy może być sondą oligonukleotydową wytworzoną ex vivo. Zaleca się, aby takie sondy oligonukleotydowe były modyfikowanymi oligonukleotydami, które są oporne na endogenne nukleazy, i w związku z tym stabilne in vivo. Przykładowe cząsteczki kwasu nukleinowego, które mogąc być wykorzystane jako sondy oligonukleotydowe, to amidofosforanowe, tiofoforanowe i metylofosfonianowe analogi DNA (patrz np. 5 176 996, 5 264 564 oraz 5 256 775). Ponadto, ogólne metody konstruowania oligomerów wykorzystywanych w terapii antysensowej są omówione w pracach Van Der Krola i wsp. (1988) Biotechniques 6: 958-976; oraz Steina i wsp. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668, które użyto tu jako odnośniki.
BAFF-R jest członkiem rodziny receptorów TNF, co omówiono powyżej. Białko to, jego fragmenty i homologi, mają szerokie zastosowanie lecznicze i diagnostyczne.
Polipeptydy stosowane w rozwiązaniach według wynalazku oddziałują specyficznie z BAFF-R, polipeptydem opisanym uprzednio w W099/12964. Jednakże, peptydy oraz metody ujawnione w niniejszym wynalazku umożliwiają identyfikację cząsteczek, które specyficznie oddziałują z BAFF-R lub jego fragmentami.
PL 207 501 B1
Możliwe jest wykorzystanie peptydów będących pochodnymi BAFF-R, które mają zdolność wiązania BAFF. Fragmenty BAFF-R mogą być wytwarzane na różne sposoby, np. poprzez rekombinację, PCR, trawienie proteolityczne lub syntezę chemiczną. Wewnętrzne lub końcowe fragmenty polipeptydu można otrzymywać poprzez usuwanie jednego lub więcej nukleotydów z jednego lub z obu końców sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd. Ekspresja zmutowanego DNA prowadzi do otrzymania fragmentów polipeptydu.
Cząsteczki chimerowe mogą być również wytwarzane przy użyciu metod znanym specjalistom z tej dziedziny. Niniejszym rozważane jest użycie cząsteczki chimerowej zawierającej polipeptyd BAFF-R (lub jego wariant) oraz heterologiczną sekwencję aminokwasową, taką jak domenę IgG Fc immunoglobuliny. Korzystne jest, jeżeli cząsteczki chimerowe są rozpuszczalne i zawierają rozpuszczalny polipeptyd BAFF-R.
Fragmenty polipeptydów mogą być również chemicznie syntetyzowane przy użyciu znanych specjalistycznych metod, takich jak konwencjonalna metoda Merrifielda z wykorzystaniem stałych nośników (f-moc lub t-boc). Przykładowo, peptydy oraz sekwencje DNA można w sposób arbitralny podzielić na fragmenty o żądanej długości niezachodzące za siebie lub też na fragmenty zachodzące za siebie o wymaganej długości. Metody takie opisano szczegółowo poniżej.
Otrzymywanie rozpuszczalnych postaci BAFF-R
Rozpuszczalne formy BAFF-R mogą często wydajnie przekazywać sygnał i dlatego mogą być podawane jako leki, które naśladują naturalną formę błonową. Możliwe jest, że BAFF-R, objęty niniejszym wynalazkiem, jest w sposób naturalny wydzielany jako rozpuszczalna cytokina. Jeśli jednak tak się nie dzieje, możliwe jest takie przearanżowanie genu aby doprowadzić do sekrecji. Aby otrzymać rozpuszczalną wydzieloną postać BAFF-R, można na poziomie DNA usunąć N-końcowe regiony błonowe, oraz niektóre porcje domeny zewnątrzkomórkowej, i zastąpić je sekwencjami liderowymi typu I, lub alternatywnie sekwencjami liderowymi typu II, tak aby pozwolić na wydajne cięcie proteolityczne w wybranym systemie ekspresyjnym. Specjaliści mogą tak modyfikować objętość sekwencji pozostawionej w sekrecyjnym wektorze ekspresyjnym, aby zoptymizować zarówno wiązanie liganda, jak i wydajność wydzielania. Przykładowo, konstrukty zawierające całą domenę zewnątrzkomórkowa, czyli pozbawione jedynie N-końca, będą prowadziły do otrzymania białka zawierającego aminokwasy 1-51. Kontynuując tego typu analizę można doprowadzić do otrzymania optymalnej długości sekwencji.
Rozpuszczalny polipeptyd BAFF-R może być: wyizolowanym natywnym polipeptydem BAFF-R zawierającym aminokwasy 1-51 Id. Sekw. Nr: 1 lub fragment tego odcinka; wyizolowanym polipeptydem BAFF-R o stopniu identyczności z natywnym polipeptydem BAFF-R zawierającym aminokwasy 1-51 Id. Sekw. Nr: 1 (lub fragment tego odcinka) wynoszącym przynajmniej 80% (a korzystniej 90%); lub też wyizolowanym polipeptydem BAFF-R zawierającym aminokwasy 8-41 Id. Sekw. Nr: 1 lub fragment tego odcinka.
Wytwarzanie przeciwciał reaktywnych wobec BAFF-R
Wynalazek wykorzystuje również przeciwciała oddziałujące swoiście z BAFF-R lub jego koreceptorami. Surowice odpornościowe skierowane przeciwko białku/peptydowi lub przeciwciała monoklonalne mogą być uzyskane standardowymi metodami (przykładowo, patrz: Antibodies: A Laboratory Manual ed. By Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ssak, taki jak mysz, chomik lub królik, może być immunizowany przy użyciu immunogennej postaci peptydu. Techniki uzyskiwania immunogenności przez białko lub peptyd obejmują technikę sprzężenia (połączenia) z nośnikiem oraz inne specjalistyczne techniki.
Immunogenny fragment BAFF-R lub jego koreceptora, może zostać podany w obecności adiuwanta. Przebieg immunizacji może być monitorowany poprzez rejestrowanie miana przeciwciała w osoczu lub surowicy. Do oceny poziomu przeciwciała przy użyciu immunogenu, jako antygenu, można zastosować standardowy test ELISA lub inny test immunologiczny.
W korzystnym zastosowaniu, przeciwciała są swoiste wobec determinant antygenowych BAFF-R lub jego koreceptorów, np. wobec determinant antygenowych polipeptydu odpowiadającego Id. Sekw. Nr: 1, lub też ludzkiego lub zwierzęcego homologa (np. o stopniu homologiczności 70, 80, lub 90%, a najkorzystniej przynajmniej 95%). Przeciwciał a skierowane przeciwko BAFF-R lub też przeciwko jego koreceptorowi, nie wykazują znaczącej reakcji krzyżowej (tj. reagują swoiście) z białkiem, którego stopień homologiczności w stosunku do Id. Sekw. Nr: 1 wynosi np. mniej niż 80% lub korzystnie mniej niż 90%, a najkorzystniej mniej niż 95%. „Brak znaczącej reakcji krzyżowej” rozumie się w tym przypadku jako sytuację, w której powinowactwo przeciwciała wobec niehomologicznego białka wynosi
PL 207 501 B1 mniej niż 10%, korzystniej mniej niż 5%, a jeszcze bardziej korzystnie mniej niż 1%, w porównaniu do powinowactwa względem białka o Id. Sekw. Nr: 1.
Użyty tu termin „przeciwciało” ma w zamiarze autorów obejmować także jego fragmenty, które również oddziałują swoiście z BAFF-R lub jego koreceptorami. Fragmenty przeciwciał można otrzymać przy użyciu konwencjonalnych technik, a ich przydatność może być oceniana w ten sam sposób, jak to opisano powyżej dla całych przeciwciał. Przykładowo, fragmenty F(ab')2 można otrzymywać poddając przeciwciało działaniu pepsyny. Powstały fragment F(ab')2 można pozbawić mostków dwusiarczkowych, tak aby otrzymać fragmenty Fab'. Przeciwciała objęte niniejszym wynalazkiem obejmują ponadto swoiste pod względem biologicznym chimery cząsteczkowe wiążące BAFF-R lub jego koreceptory. Tak więc, zarówno monoklonalne i poliklonalne przeciwciała skierowane przeciwko BAFF-R lub jego koreceptorom, jak i fragmenty przeciwciał, takie jak Fab' oraz F(ab')2, mogą zostać wykorzystane do blokowania akcji BAFF-R i jego odpowiednich koreceptorów.
Rozmaite formy przeciwciał mogą także być uzyskane przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349: 23-299 (1991)). Przykładowo, można wytwarzać przeciwciała chimerowe, w których domena wiążąca antygen, pochodząca z przeciwciała zwierzęcia, połączona zostanie ze stałą domeną przeciwciała ludzkiego (np. Cabilly i wsp., US nr 4 816 567). Przeciwciała chimerowe mogą zmniejszać odpowiedź immunologiczną, wywoływaną przez przeciwciała pochodzenia zwierzęcego stosowane w leczeniu człowieka.
Dodatkowo, można syntetyzować rekombinowane „przeciwciała humanizowane” rozpoznające BAFF-R i jego koreceptory. Przeciwciała humanizowane są chimerami składającymi się najczęściej z ludzkich sekwencji IgG, w obrębie których wstawiono regiony odpowiedzialne za swoiste wią zanie antygenu. Zwierzęta immunizowane są przy użyciu wybranego antygenu, następnie izoluje się skierowane przeciwko temu antygenowi przeciwciała i wyodrębnia się fragment sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialny za swoiste wiązanie antygenu. Te pochodzące od zwierzęcia regiony wiążące antygeny są następnie klonowane w odpowiedniej pozycji genów ludzkich przeciwciał, z których to genów usunięto uprzednio regiony wiążące antygen. Humanizowane przeciwciała minimalizują użycie heterologicznych (tj. pochodzących z innych gatunków) sekwencji w ludzkich przeciwciałach, a w związku z tym zmniejszają prawdopodobieństwo wywołania odpowiedzi immunologicznej u leczonej osoby.
Różne klasy rekombinowanych przeciwciał można również uzyskać tworząc chimerowe lub humanizowane przeciwciała zawierające zmienne domeny oraz stałe ludzkie domeny (CH1, CH2, CH3) pochodzące z różnych klas immunoglobin. Przykładowo, przeciwciała o zwiększonej wartościowości wiązania antygenu mogą być wytwarzane rekombinacyjnie drogą klonowania miejsca wiążącego antygen w wektorze niosącym ludzkie sekwencje dla regionu stałego. (Arulanandum i wsp., J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993), użyty tu jako odnośnik)
Dodatkowo, standardowe techniki rekombinacyjne mogą być wykorzystane do zmieniania powinowactwa rekombinowanych przeciwciał wobec antygenu poprzez zmianę reszt aminokwasowych w pobliż u miejsc wiązania antygenu.
Powinowactwo humanizowanych przeciwciał wobec antygenu można zwiększyć drogą mutagenezy opartej na molekularnym modelowaniu. (Queen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989), użyty tu jako odnośnik.)
Tworzenie analogów: wytwarzanie DNA i peptydów o zmienionej sekwencji
Analogi BAFF-R mogą różnić się od naturalnie występującego BAFF-R sekwencją aminokwasową lub też w inny sposób nie obejmujący różnic w sekwencji. Występować też mogą różnice obu tych rodzajów jednocześnie. Niesekwencyjne zmiany obejmują modyfikacje chemiczne BAFF-R, mogące zachodzić in vivo lub in vitro. Te niesekwencyjne modyfikacje obejmują między innymi zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji lub glikozylacji.
Korzystne analogi obejmują BAFF-R oraz jego biologicznie aktywne fragmenty, których sekwencja różni się od Id. Sekw. Nr: 1 przynajmniej jednym konserwatywnym podstawieniem aminokwasowym, lub przynajmniej jednym niekonserwatywnym podstawieniem, delecją lub insercją w sekwencji nukleotydowej, które nie prowadzą do utraty aktywności wobec liganda BAFF. Konserwatywne podstawienia obejmują zwykle podstawienia jednego aminokwasu na drugi, posiadający podobne właściwości, np. podstawienia w obrębie następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna.
PL 207 501 B1
Zastosowania
Gen BAFF-R o pełnej długości (Id. Sekw. Nr: 2) lub jego fragment, mogą być zastosowane jako sondy hybrydyzacyjne do przeszukiwania bibliotek cDNA, np. w celu wyizolowania jeszcze innych genów, które posiadają pożądany stopień identyczności z sekwencją BAFF-R (Id. Sekw. Nr: 2). Sekwencję nukleotydową, kodującą BAFF-R, można również wykorzystać do skonstruowania sond hybrydyzacyjnych używanych do mapowania genu kodującego BAFF-R oraz do analizy genetycznej osób cierpiących na choroby genetyczne. Można zaprojektować testy przesiewowe mające na celu znalezienie związków zdolnych do naśladowania aktywności biologicznej BAFF-R. Takie testy przesiewowe obejmować powinny testy o dużej przepustowości, stosowane przy przesiewie bibliotek chemicznych, co czyniłoby je użytecznymi przy identyfikowaniu potencjalnych małocząsteczkowych leków. Takimi małocząsteczkowymi lekami mogą być syntetyczne związki organiczne lub nieorganiczne. Kwasy nukleinowe kodujące BAFF-R lub jego zmodyfikowane postacie, mogą być także wykorzystane przy tworzeniu transgenicznych zwierząt lub też zwierząt z mutacją typu „knock-out”, które z kolei mogą znaleźć zastosowanie w procesie tworzenia i przesiewania odczynników o znaczeniu terapeutycznym.
Niniejszym opisano sposoby pobudzania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych poprzez komórki dendrytyczne, lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych przy użyciu polipeptydu BAFF-R, a także sposoby wielotorowego pobudzania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych poprzez komórki dendrytyczne lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych przy użyciu polipeptydu BAFF-R oraz przeciwciała anty-T, liganda CD40 lub liganda anty-CD40. Uwzględnione są też metody hamowania wzrostu limfocytów B, wzrostu i dojrzewania limfocytów B indukowanych poprzez komórki dendrytyczne, lub też wytwarzania immunoglobulin zwierzęcych przy użyciu polipeptydu BAFF-R.
Niniejszym opisano sposoby wykorzystania BAFF-R w leczeniu chorób autoimmunologicznych, nadciśnienia, chorób sercowo-naczyniowych, chorób nerek, chorób limfoproliferacyjnych B-komórkowych, chorób immunosupresyjnych, transplantacji narządów oraz AIDS. Niniejszym opisano również metody wykorzystywania czynników do leczenia, powstrzymywania, lub zmiany odpowiedzi immunologicznej obejmującej szlak sygnałowy pomiędzy BAFF-R i jego ligandem.
Ujawniono niniejszym kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd BAFF-R oraz akceptowalną farmakologicznie zaróbkę. Nośniki odpowiednie dla polipeptydu BAFF-R oraz procedury ich przygotowania, opisane są w „Remington' Pharmaceutical Science”, 16 wyd., 1980, Mack Publishing Co., pod edycją Oslo i wsp. Zazwyczaj, kompozycja zawiera odpowiednią ilość soli, akceptowanej w tego typu zastosowaniach farmakologicznych, potrzebnej dla zapewnienia izotoniczności.
Przykłady nośników obejmują bufory, takie jak sól fizjologiczna, płyn Ringera oraz roztwór dekstranu. Zaleca się, aby odczyn pH mieścił się w granicach między 5 i 8, a korzystniej między 7,4 a 7,8. Inne nośniki obejmują preparaty o opóźnionym uwalnianiu, takie jak półprzepuszczalne matryce zbudowane ze stałych hydrofobowych polimerów, które mogą mieć różną formę, np. liposomy, błony powlekające lub mikrocząsteczki. Jest oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny, że pewne nośniki mogą być korzystniejsze w zależności od np. drogi podawania lub stężenia podawanego polipeptydu BAFF-R.
Podawanie preparatu odbywać się może drogą iniekcji (np. dożylnej, dootrzewnowej, podskórnej, domięśniowej) lub przy użyciu innych metod, jak np. wlew, zapewniający dostarczenie efektywnej formy preparatu do krwi.
Stosowanie rozwiązań według wynalazku będzie obejmować, o ile nie jest to inaczej zaznaczone, konwencjonalne techniki biologii komórki, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, chemii białek oraz immunologii, które znane są specjalistom z tych dziedzin. Techniki te omówione są w specjalistycznym piś miennictwie. Dla przykł adu, patrz: Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2 wyd. (wyd.: Sambrook, Fritsch i Maniatis), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, tomy I i II (wyd.: D. N. Glover), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (wyd.: M. J. Gait), 1984; US Patent No 4 683 195 (Mullis i wsp.); Nucleic Acid Hybridization (wyd.: B. D. Hames i S. J. Higgins), 1984; Methods in Enzymology, tomy 154 i 155 (wyd.: Wu i wsp.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (wyd.: J. H. Miller i M.P. Calos), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (wyd.: Mayer i Walker), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experimental Immunology, tomy I-IV (wyd.: D. M. Weir i C. C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Przykłady, podane poniżej w celu zilustrowania niniejszego wynalazku, nie powinny być traktowane jako wprowadzające jakiekolwiek ograniczenia.
PL 207 501 B1
Przykłady
P r z y k ł a d 1. Wykrywanie reakcji przyłączania BAFF do BAFF-R przy użyciu testu płytkowego
W przykł adzie tym opisano przyłączanie się BAFF do komórek stransfekowanych BAFF-R, analizowane przy użyciu testu płytkowego.
Ludzki BAFF-R o pełnej długości uzyskano przy użyciu BJAB poIyA+RNA, stosując zestaw do preamplifikacji SuperscriptII (Stratagene) w celu otrzymania matrycy cDNA, a następnie amplifikując DNA przy użyciu polimerazy Pful i starterów komplementarnych do odcinków 5' i 3' sekwencji kodującej BAFF-R. Produkt PCR sklonowano do plazmidu CH269, wywodzącego się od pCEP4 (Invitrogen). Otrzymany klon nazwano pJST535. Komórki nerki ludzkiego zarodka, posiadające gen EBNA-1 (linia komórkowa 293EBNA), umieszczono w sześciostudzienkowych płytkach pokrytych fibronektyną i transfekowano plazmidem pJST535 w róż nych rozcień czeniach lub CH269 (jako negatywną kontrolą), przy użyciu lipofektaminy (Life Technologies). Po upływie 48 godzin od transfekcji, stransfekowane komórki analizowano pod względem zdolności do wiązania rozpuszczalnego flag-hBAFF(aminokwasy L83-L285) w następujący sposób. Wszystkie etapy inkubacji przeprowadzano w temperaturze pokojowej. Po odessaniu pożywki ze studzienek, płukano komórki w buforze BHA (20 mM HEPES pH 7,0, 0,05 mg/ml BSA, 0,1% NaNa) i inkubowano z 0,5 μg/ml FLAG-hBAFF w PBS zawierającym 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 oraz 0,1% NaN3. Po 1 godzinie inkubacji usunięto roztwór BAFF i przepłukano limfocyty buforem BHA. Następnie inkubowano komórki przez 30 minut w roztworze PBS zawierającym monoklonalne przeciwciało anty-FLAG M2 (Sigma) w stężeniu 1 μg/ml. Następnie odessano roztwór i przepłukano limfocyty buforem BHA. W celu obniżenia tła pochodzącego od endogennej alkalicznej fosfatazy, inkubowano komórki przez 15 minut w 2,5 mM roztworze levamisolu (Vector Laboratories) rozcieńczonego w 100 mM NaCl, 100 mM TRIS-Cl pH 9,5 oraz 5 mM MgCl2. Po usunięciu roztworu inhibitora, inkubowano komórki w roztworze soli „fast red” i fosforanu naftylowego (Pierce) w celu przeprowadzenia barwnej detekcji. Wyniki barwienia obserwowano i fotografowano przy użyciu małego powiększenia mikroskopowego.
Odkładanie się czerwonego barwnika obserwowano w przypadku wszystkich studzienek transfekowanych plazmidem pJST535, wyrażającym BAFF-R. Sygnał obniżał się wraz ze zmniejszaniem się ilości plazmidu użytego do transfekcji. Nie zaobserwowano zabarwienia w przypadku komórek stransfekowanych kontrolnym plazmidem ekspresyjnym CH269. Podobnie, nie zaobserwowano zabarwienia w przypadku którychkolwiek stransfekowanych komórek, jeśli wykluczono z protokołu FLAG-BAFF lub gdy flag-BAFF został zastąpiony innym ligandem z rodziny TNF, a mianowicie ligandem LIGHT ze znacznikiem FLAG. Dlatego też wydaje się, że barwienie komórek transfekowanych BAFF-R przy użyciu BAFF ma swoisty charakter.
P r z y k ł a d 2. Przyłączanie się BAFF do BAFF-R, analizowane przy zastosowaniu FACS
Przykład ten opisuje detekcję przyłączania się BAFF do komórek stransfekowanych BAFF-R, przeprowadzanej przy użyciu FACS.
Komórki 293EBNA zostały stransfekowane plazmidem pJST535 kodującym BAFF-R o pełnej długości, przy użyciu FuGene6 (Boeliringer Mannheim). Po upływie 24 lub 48 godzin od transfekcji, usuwano komórki z płytek przy pomocy 5 mM EDTA w PBS i zliczano je. Komórki płukano dwukrotnie buforem FACS (PBS zawierający 10% płodową surowicę bydlęcą, 0,1% NaN3 oraz 10 μg/ml hIgG (Jackson ImmunoResearch), a następnie 2,5 x 105 komórek inkubowano przez 1 godzinę na lodzie w buforze FACS zawierającym FLAG-hBAFF w stężeniach w zakresie od 9 μg/ml do 0,037 μg/ml. Komórki płukano następnie buforem FACS i inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem anty-FLAG M2 w stężeniu 5 μg/ml przez 30 minut na łodzie. Komórki ponownie płukano buforem FACS i inkubowano przez 30 minut na lodzie w roztworze zawierającym 10 μg/ml 7-AAD oraz ośle przeciwciało F(ab')2 (w rozcieńczeniu 1:100) skierowane przeciwko mysiemu IgG i skoniugowane z R-fikoerytryną. Po przepłukaniu limfocytów buforem FACS, zawieszono je w buforze FACS zawierającym 1% paraformaldehyd. Następnie przeprowadzano analizę FACS, w której odrzucano komórki pozytywne pod względem 7-AAD (martwe).
Wyniki analizy FACS wykazują, że frakcja komórek stransfekowanych BAFF-R jest zdolna do wiązania BAFF. Przy stężeniu BAFF wynoszącym 9 μg/ml, około 28% komórek wiązało BAFF, dając w efekcie średnią intensywność fluorescencji (MFI) wynoszącą 366. Używając jedynie oślego przeciwciała drugorzędowego wyznakowanego fikoerytryną, nie uzyskano znaczącego przesunięcia spektrum. Tylko 1,3% komórek miało MFI sięgającą 23,5 przy średniej dla wszystkich komórek wynoszącej 5,5. Sygnał, odpowiadający komórkom stransfekowanym BAFF-R, malał w miarę obniżania się ilości BAFF. Przy 100 ng/ml, 8,7% komórek osiągało MFI o wartości 78,9.
PL 207 501 B1
P r z y k ł a d 3. Analiza oddziaływań BAFF/BAFF-R przy użyciu FACS i markera GFP
W tym przykładzie opisano zdolność BAFF do wią zania komórek kotransfekowanych BAFF-R i plazmidem reporterowym GFP.
Komórki 293EBNA transfekowano plazmidem pJST535 oraz plazmidem reporterowym GFP, według opisu z przykładu 2. Plazmid reporterowy koduje cząsteczkę GFP. Stosując kotransfekcję obu plazmidów, analizowano udział procentowy komórek zdolnych do wiązania BAFF. Komórki usuwano z pł ytek i poddawano procesowi wią zania BAFF i detekcji, jak opisano w przykł adzie 2. Ponownie, włączono 7-AAD w celu odrzucenia martwych komórek. Próbki analizowano metodą FACS, a wyniki przedstawiono na wykresach. Górny prawy kwadrant reprezentuje komórki, które związały BAFF (są więc pozytywne pod względem fikoerytryny) i jednocześnie wykazują ekspresję GFP.
Choć nie wszystkie komórki stransfekowane GFP wydają się wiązać BAFF, to jednak znaczna frakcja komórek zajmuje prawy górny kwadrant, w porównaniu z wynikiem kontroli. 33% stransfekowanych komórek znajduje się w prawym górnym kwadrancie, gdy tymczasem analogiczny wynik dla eksperymentu kontrolnego wynosi 8%. Możliwe jest, że aby BAFF wiązał się z komórką wymagany jest pewien poziom ekspresji BAFF-R. Jest również możliwe, że do uzyskania wiązania o wysokim powinowactwie, wymagana jest obecność koreceptora i że brak tego receptora może być czynnikiem limitującym w przypadku komórek 293EBNA.
P r z y k ł a d 4. Immunoprecypitacja flag-hBAFF przy użyciu białka fuzyjnego BAFF-R-Fc
Przykład ten opisuje swoiste oddziaływanie pomiędzy flag-hBAFF i BAFF-R-Fc, cząsteczką składającej się z domeny bogatej w cysteinę (CRD) receptora BAFF-R, która połączona została z domeną Fc ludzkiej immunoglobuliny IgGl.
Domenę CRD białka BAFF-R uzyskano poprzez RT-PCR przy użyciu BJAB polyA + RNA, jak w przykładzie 1, wykorzystując w roli startera 3' oligonukleotyd komplementarny do nukleotydów 132-152 sekwencji kodującej hBAFF-R. Otrzymany w efekcie produkt PCR sklonowano w plazmidzie CH269 między mysią sekwencją sygnałową IgG-kappa a sekwencją dla domeny Fc ludzkiego IgG.
Konstrukt ten nazwano pJST535. Konstrukty pJST535 oraz CH269 użyto do transfekcji komórek 293EBNA przy zastosowaniu lipofektaminy. Po upływie 20 godzin od transfekcji pobierano pożywkę pohodowlaną, a komórki rozpuszczano w roztworze zawierającym 20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5% NP40 i 0,5% kwas deoksycholowy, pozbywając się martwych szczątków komórek poprzez wirowanie. Niewielkie ilości pożywki pohodowlanej oraz ekstraktu komórkowego mieszano z taką samą ilością zatężonego dwukrotnie buforu redukującego z SDS, a następnie gotowano i poddawano elektroforezie SDS-PAGE oraz transferowi typu Western. W celu potwierdzenia ekspresji, filtr sondowano sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) mysim przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiej IgG (w rozcieńczeniu 1:3000), co przeprowadzano w temperaturze pokojowej w zawiesinie 5% odtłuszczonego mleka w proszku w TBST przez 30 minut. Następnie płukano filtr w TBST, wywoływano przy użyciu zestawu ECL (Amersham), po czym przeprowadzano ekspozycję z filmem.
Immunoprecypitacje przeprowadzano inkubując 25 ng flag-hBAFF lub flag-hTWEAK z 0,5 ml pożywki pohodowlanej, pochodzącej od komórek 293EBNA, transfekowanych plazmidem pJST535 lub CH269, w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z delikatnym obracaniem, po czym dodawano 30 μΐ koniugatu sefarozy z białkiem A (Pharmacia) i kontynuowano obracanie przez noc. Koniugaty sefarozy i białka A płukano dwukrotnie przy użyciu PBS i zawieszano w redukującym buforze do próbek z SDS (dwukrotnie zatężonym). Po SDS-PAGE i transferze typu Western, filtry inkubowano przez 1 godzinę z przeciwciałem monoklonalnym anty-flag M2 (Sigma) (5 μg/ml) w 5% zawiesinie odtłuszczonego mleka w proszku w TBST, w temperaturze pokojowej. Potem płukano filtry w TBST i inkubowano 30 minut z kozim przeciwciałem przeciwko mysiej IgG, sprzężonym z HRP (Jackson Immunoresearch) (w rozcieńczeniu 1:3000), w 5% zawiesinie odtłuszczonego mleka w proszku w TBST, w temperaturze pokojowej. Następnie wywoływano filtry przy użyciu zestawu ECL (Amersham) i przeprowadzano ekspozycję z filmem światłoczułym.
Po transfekcji komórek 293EBNA plazmidem pJSF535 i analizie typu Westen-blot przy użyciu mysiego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej IgG (Jackson Immunoresearch) wykrywano ekspresję białka o wielkości około 43 kDa, zarówno w ekstrakcie komórkowym, jak i w pożywce pohodowlanej, co wskazywało na to, że białko fuzyjne BAFF-R-Fc było aktywnie wyrażane i wydalane.
Po przeprowadzeniu immunoprecypitacji obserwowano obecność prążka jedynie wtedy, gdy inkubowano BAFF-R-Fc z flag-hBAFF. Prążek ten migrował podobnie jak w przypadku bezpośrednio nałożonej próbki flag-hBAFF. Nie zaobserwowano podobnego sygnału w żadnej innej ścieżce, co świadczyło o tym, że oddziaływanie między BAFF-R-Fc a flag-hBAFF ma charakter swoisty.
PL 207 501 B1
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie rozpuszczalnych postaci receptora
Aby otrzymać inhibitor receptorowy, mający zastosowanie u człowieka, należy dysponować sekwencją cDNA domeny zewnątrzkomórkowej ludzkiego receptora. Gdy znana jest postać mysia, przeszukuje się biblioteki ludzkiego cDNA używając sekwencji mysiego cDNA, co należy do rutynowego postępowania w tej dziedzinie. Dysponując sekwencją ludzkiego cDNA można zaprojektować startery oligonukleotydowe w celu powielenia techniką PCR domeny zewnątrzkomórkowej receptora, bez domen błonowych i wewnątrzkomórkowych. Zazwyczaj, próbuje się włączyć większość aminokwasów z regionu pomiędzy ostatnią domeną TNF, „spiętą” mostkiem dwusiarczkowym a domeną błonową. Długość tego odcinka można zmieniać w celu polepszenia właściwości powstałego w ten sposób rozpuszczalnego receptora. Taki powielony fragment można modyfikować, włączając odpowiednie miejsca restrykcyjne pozwalające na jego klonowanie do rozmaitych wektorów służących do tworzenia chimer zawierających C-końcowy fragment immunoglobuliny. Alternatywnie, można wprowadzić sygnał zakończenia translacji w końcu 3', otrzymując rozpuszczalną postać receptora bez tworzenia chimery z Ig. Uzyskane wektory można wyrażać w większości systemów wykorzystywanych w biotechnologii, włączając w to drożdże, komórki owadów, bakterie, oraz komórki ssacze, przy czym dla każdej z tych grup znane są odpowiednie przykłady. Różne domeny Fc mogą być przyłączane w celu optymalizacji lub eliminacji oddziaływań FcR oraz komplementu, o ile jest to wymagane. Alternatywnie, można wykorzystać zmutowane formy domen Fc w celu selektywnego usunięcia oddziaływań FcR oraz komplementu, lub też przyłączania N-sprzężonych cukrów do domeny Fc, co może przynieść pewne korzyści.
P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie agonistycznych i antagonistycznych przeciwciał
Opisane powyżej rozpuszczalne formy receptora można wykorzystać do immunizacji myszy oraz do produkowania monoklonalnych przeciwciał konwencjonalnymi metodami. Otrzymane przeciwciała, identyfikowane metodą ELISA, mogą być dalej przesiewane w kierunku identyfikacji ich agonistycznej aktywności, przy użyciu rozpuszczalnych przeciwciał lub też stosując rozmaite metody komórkowe z wykorzystaniem przeciwciał immobilizowanych na plastiku. Jednym z wygodnych systemów do badania szlaków sygnałowych obejmujących wiele receptorów TNF, jest system oparty na śmierci komórek z linii HT29. Jeśli linia ta nie posiada rozpatrywanego receptora, można wprowadzić go metodą stabilnej transfekcji, co umożliwia wykonanie dalszych analiz cytotoksyczności. Alternatywnie, komórki takie można badać przy użyciu aparatu Cytosensor, w celu ocenienia, czy aktywacja receptora może wywołać zmianę pH, co wskazywałoby na zajście procesu sygnałowego. Receptory z rodziny TNF działają bardzo dobrze w tym systemie, a metoda ta nie wymaga znajomości szczegółowych zdarzeń biologicznych wywołanych przez receptor. Agonistyczne przeciwciała monoklonalne mogą być „humanizowane” dla zastosowań klinicznych. Podobną procedurę można także wykorzystać do identyfikacji antagonistycznych przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała takie byłyby identyfikowane na podstawie braku aktywności agonistycznej, oraz zdolności do hamowania oddziaływań receptor-ligand, co byłoby monitorowane przy użyciu metody ELISA, klasycznych metod analizy przyłączania, lub też metod biosensorowych (BIAcore). Ponadto, można stosować również testy przesiewowe wykorzystujące indukcję wydzielania przez niektóre komórki chemokin w odpowiedzi na agonistyczne przeciwciało.
P r z y k ł a d 7. Poszukiwanie inhibitorów oddziaływań receptor-ligand
Przy użyciu białka fuzyjnego receptor-Ig można przeszukiwać złożone biblioteki w celu znalezienia cząsteczek łączących się bezpośrednio z receptorem. Cząsteczki te mogą być analizowane w teście typu ELISA, wykorzystującym białka fuzyjne receptor-Ig lub rozpuszczalne formy liganda, w celu oceny zdolności blokowania oddziaływań między receptorem a ligandem. Test ten można wykorzystać bezpośrednio do przesiewania rozmaitych bibliotek produktów naturalnych itp., w celu znalezienia związków inhibitorowych. Można również stworzyć system przesiewowy w oparciu o test biologiczny (w tym przypadku analizę cytotoksyczności) wykonywany na komórkach linii HT29, transfekowanych receptorem.
P r z y k ł a d 8. BAFF-R-IgG wywołuje redukcję liczby limfocytów B u zdrowych myszy
Ośmiotygodniowe samice szczepu myszy BALB/c zakupiono w Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Myszy podzielono na grupy (3 w każdej grupie) które otrzymywały dootrzewnowe (w dniach -8, -5, -1 i +2) wyłącznie PBS, lub też 400 pg ludzkiego białka fuzyjnego BAFF-R-huIgGl (hBAFF-R-Ig) (dostarczonego przez Teresę Cachero, Biogen), albo 400 pg oczyszczonej ludzkiej IgG (HuIgG) (Sandoz, Bazylea, Szwajcaria). W dniu 0 myszy otrzymały po 100 pl 10% SRBC (preparatu czerwonych krwinek owcy) (Colorado Serum Company, Denver, CO).
PL 207 501 B1
Po uśmierceniu myszy, pobierano krew (poprzez punkcję dosercową) do probówek zawierających EDTA i poddawano czerwone krwinki lizie w buforze hipotonicznym. Zbierano również krew bez EDTA w celu uzyskania surowicy. Ze śledziony oraz z krezkowych węzłów limfatycznych (MLN) przygotowywano zawiesiny komórkowe i przeprowadzano lizę czerwonych krwinek w buforze hipotonicznym. Wykonywano cytometrię przepływową używając sprzężonych z PE przeciwciał antyCD45RyB220, anty-syndekan/CD138 i anty-B7.2, oraz sprzężonych z FITC przeciwciał anty-IgM i anty-CD45R/B220. Wszystkie monoklonalne przeciwciała zakupiono w firmie Pharmigen (San Diego, CA). W skrócie, receptory Fc były blokowane na lodzie przez 15 minut przy użyciu 10 μg/ml Fc Block (Pharmingen), po czym dodawano monoklonalnych przeciwciał sprzężonych z PE lub FITC i inkubowano na lodzie przez 20-30 minut. Komórki płukano jeden raz i zawieszano w 0,5% roztworze paraformaldehydu. Pomiary fluorescencji komórek wykonywano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA), a wyniki analizowano używając oprogramowania CELLQuestTM (Becton Dickinson).
Po podaniu myszom hBAFF-R-Ig zaobserwowano redukcję liczby limfocytów B w krwi obwodowej oraz w obwodowych narządach limfoidalnych o około 50%. Limfocyty B 2220wysoki oraz IgMniski stanowiły 23,4% lub 21,5% komórek u myszy traktowanych odpowiednio PBS lub HuIgG, podczas gdy populacja ta stanowiła jedynie 9,9% komórek w przypadku myszy traktowanych hBAFF-R-Ig. Poziom komórek plazmatycznych (syndekan/CD138+) wydawał się być również lekko obniżony, gdyż w krwi myszy traktowanych PBS lub HuIgG stanowiły one odpowiednio 5,7% i 4,8%, w porównaniu do 3,9% u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig. Poziom cząsteczki B7.2 w limfocytach B220+ był podwyższony u myszy traktowanych PBS lub HuIgG, gdzie wynosił odpowiednio 3,1% i 4,5%, w porównaniu do 1,9% u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig.
W śledzionie, liczba limfocytów B B220wysoki była wyraźnie obniżona u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig, gdzie stanowiła 18,8%, w porównaniu do 36,7% oraz 40% dla myszy traktowanych odpowiednio PBS lub HuIgG. Spadek ten obserwowano zarówno w przypadku subpopulacji IgMwysoki, jak i IgMniski (patrz tabela 8A). Nie zaobserwowano zmian w nowo powstającej w śledzionie grupie limfocytów B B220niski IgMwysoki (wyniki nie przestawione). Poziom komórek plazmatycznych (syndekan/CD138+) wydawał się być lekko obniżony, gdyż w krwi myszy traktowanych PBS lub HuIgG stanowiły one odpowiednio 3,3% i 3,4%, w porównaniu do 2,4% u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig.
Liczba limfocytów B B220+ w MLN wykazywała spadek u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig, gdzie wynosiła 14,1%, w porównaniu do 26,7% i 35,8% u myszy traktowanych odpowiednio PBS i HuIgG. Wyniki podsumowano w tabeli 8A.
T a b e l a 8A
Populacje limfocytów B u myszy traktowanych hBAFF-R-Ig, PBS lub HuIgG1
Krew B220wysokiIgMniski Syndekan B7.2/B220niski
PBS 23,4 ± 5,7 5,7 ± 1,5 3,1 ± 0,5
HuIgG 21,5 ± 4,5 4,8 ± 0,9 4,5 ± 1,0
hBAFF-R-Ig 9,9 ± 1,8 3,9 ± 0,6 1,9 ± 0,5
Śledziona B220wysokiIgMniski B220wysokilgM+ Syndekan
PBS 27,8 ± 1,6 11,9 ± 1,6 3,3 ± 0,8
HuIgG 30,5 ± 2 11,8 ± 1,0 3,4 ± 0,7
hBAFF-R-Ig 10,6 ± 0,2 8,4 ± 0,2 2,4 ± 0,2
MLN B220+
PBS 26,7
HuIgG 35,8 ±3,3
hBAFF-R-Ig 14,1 ±5,9
1 Myszy były traktowane wedł ug opisu podanego w sekcji Materiały i Metody, a wyniki podane są w procentach ± odchylenie standardowe
PL 207 501 B1
Zmniejszony udział limfocytów B B7.2+ wśród krwinek i komórek plazmatycznych we krwi i w śledzionie myszy traktowanych hBAFF-R-Ig po immunizacji przy użyciu SRBC sugeruje, że mamy do czynienia z zahamowaniem aktywacji i/lub dojrzewania limfocytów B i potencjalnie zwiększoną eliminacją limfocytów B. Bardzo mała część limfocytów B swoistych wobec antygenu byłaby więc aktywowana i odpowiadałaby na jakikolwiek antygen, w tym przypadku SRBC. Ponieważ traktowanie hBAFF-R-Ig prowadziło do tak dramatycznego spadku (50%) procentowego udziału limfocytów B we wszystkich egzaminowanych tkankach, wydaje się, że hBAFF-R-Ig oddziaływał również na dojrzałe komórki w fazie spoczynku.
W związku z powyższym, rozważ a się wykorzystanie białek fuzyjnych BAFF-R jako środków terapeutycznych, mogących mieć zastosowanie kliniczne w chorobach związanych z funkcjonowaniem limfocytów B. Do chorób tych należą choroby będące autoimmunologicznymi ze swej natury, takie jak toczeń rumieniowaty układowy, miastenia, niedokrwistość hemolityczna autoimmunologiczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół antyfosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Graves-Basedowa, ziarniniak Wegenera, guzkowe zapalenie tętnic oraz gwałtownie postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek. Środek leczniczy mógłby mieć również zastosowanie w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, szpiczak plazmocytowy typu łańcucha ciężkiego, skrobiawica pierwotna i wtórna oraz monoklonalna gammaglobulinemia MGUS. Choroby onkologiczne, które mogą być objęte terapią, obejmują rozrost nowotworowy limfocytów B oraz różne typy białaczek i chłoniaków.
P r z y k ł a d 9. Blokowanie indukowanej przez BAFF proliferacji limfocytów B in vitro przy użyciu rozpuszczalnego BAFF-R
Przykład ten pokazuje, że rozpuszczalne białko fuzyjne BAFF-R:hIgGl jest zdolne zablokować indukowaną przez BAFF proliferację limfocytów B.
Mysie limfocyty śledzionowe (5 x 105 komórek/ml) izolowano z myszy Balb/c i hodowano na 96-studzienkowej płytce w 100 μΐ pożywki RPMI (Live Technologies) uzupełnionej 10% cielęcą surowicą płodową (JRH), 2 mM glutaminą, penicyliną (100 jednostek/ml) oraz streptomycyną (100 mg/ml) (Life Technologies). Następnie dodawano różne ilości ludzkiego BAFF, 10 μg/ml ludzkiego BAFF-R:hIgGl lub ludzkiej Ig, a także 10 μg/ml przeciwciała skierowanego przeciwko ciężkiemu łańcuchowi μ myszy (Jackson Immuno Research).
Po 48 godzinach hodowania w temperaturze 37°C dodawano radioktywną [3H] tymidynę (Dupont, NEN) w ilości 1 μCi/studzienkę, a po następnych 24 godzinach zbierano komórki przy użyciu automatycznego systemu Tomtec (Orange, CT). Radioaktywność mierzono w cieczowym liczniku scyntylacyjnym Betaplate (Pharmacia Biotech).
Figura 8 przedstawia wyniki analizy proliferacji limfocytów śledzionowych. Pokazana jest zależność między zliczeniami na minutę (CPM), wbudowanymi do komórek mysich limfocytów śledzionowych, a ilością dodanego ludzkiego BAFF.
Poziom przeciwciała anty-μ, białka fuzyjnego, a także kontrolnej IgG był stały i wynosił 10 μg/ml. Wypełnione kwadraty odpowiadają poziomowi proliferacji indukowanemu przez sam BAFF. Wypełnione kółka reprezentują poziom proliferacji komórek po użyciu BAFF i anty-μ.
Krzywa z pustymi kółkami odpowiada inhibicji zaobserwowanej po dodaniu BAFF oraz anty-μ i BAFF-R:hIgGl. Puste romby reprezentują inhibicję zaobserwowaną po użyciu kontrolnej ludzkiej Ig. Dodanie BAFF i anty-μ prowadziło do proliferacji mysich limfocytów śledzionowych in vitro. Poziom [3Hj-tymidyny wbudowanej do komórek jest znacznie wyższy, niż poziom uzyskany po dodaniu samego BAFF lub też anty-μ.
Dodanie samego BAFF do komórek prowadziło do wbudowywania [3H]-tymidyny jedynie przy bardzo wysokich stężeniach. Dodanie samego tylko anty-μ nie prowadziło do proliferacji. Gdy do limfocytów śledzionowych dodano 10 μg/ml kontrolnej ludzkiej IgG wraz ze wzrastającymi ilościami BAFF i 10 μg/ml anty-μ, zaobserwowano nieznaczny spadek poziomu proliferacji. W przeciwieństwie do tej sytuacji, po dodaniu w tych samych warunkach 10 μg/ml ludzkiego białka fuzyjnego BAFF-R:hIgGl, poziom proliferacji został zredukowany do wartości obserwowanej dla samego BAFF. To wskazuje na to, że białko fuzyjne BAFF-R:hIgGl jest zdolne do hamowania indukowanej przez BAFF i anty-μ proliferacji limfocytów śledzionowych.
P r z y k ł a d 10. Blokowanie wiązania BAFF przez komórki Raji przy użyciu BAFF-R: hIgGl
Przykład ten opisuje blokowanie wiązania BAFF przez nowotworową linię komórkową limfocytów B Raji, wskutek preinkubacji BAFF z białkiem fuzyjnym BAFF-R:hIgGl.
PL 207 501 B1
W ramach analizy FACS, 200 ng/ml ludzkiego BAFF, wyznakowanego znacznikiem FLAG, preinkubowano na lodzie przez 30 minut razem z ludzkim BAFF-R:hIgGl lub z ludzkim LTpR:hIgGl (w serii dwukrotnych rozcienczeń w zakresie od 20 μg/ml do 39 ng/ml) albo też bez żadnego białka fuzyjnego. Inkubację przeprowadzano w buforze FACS zawierającym PBS z Ca lub Mg oraz 10% FCS (JHR) i 0,05% azydek sodowy.
Po preinkubacji, dodawano mieszaninę zawierającą białko fuzyjne BAFF do komórek Raji (ATCC) (5 x 106/ml). Po 30 minutach inkubacji na lodzie płukano komórki używając 2 ml buforu FACS o temperaturze 4°C. W celu wykrycia związanego BAFF, dodawano do komórek 5 fig/ml przeciwciała anty-FLAG M2 (Sigma) i inkubowano przez 30 minut na lodzie.
Komórki ponownie płukano, jak powyżej, a następnie inkubowano ze sprzężonym z PE oślim przeciwciałem skierowanym przeciwko mysiej Ig (Jackson Immuno Research) (w rozcieńczeniu 1:100) przez 30 minut na lodzie.
Po ponownym przepłukaniu komórek buforem FACS utrwalano je w 1% paraformaldehydzie i analizowano przy użyciu aparatu FACS® (Becton Dickinson and Co.).
Figura 9 przedstawia wyniki analizy blokowania BAFF. Pokazano odczyty MFI (średnia intensywność fluorescencji) zebrane w czasie analizy FACS® podczas testowania wiązania BAFF przez komórki Raji. Wypełnione kwadraty dotyczą danych odpowiadających preinkubacji ludzkiego BAFF-R:hIgGl z BAFF. Kółka reprezentują krzywą odpowiadającą dodaniu niespecyficznego białka fuzyjnego LTpR:hIgGl do BAFF. Oś X reprezentuje ilość białka fuzyjnego dodanego do 200 ng/ml BAFF przed inkubacją z komórkami.
Gdy nie preinkubowano żadnego białka fuzyjnego z ludzkim BAFF, średnia intensywność fluorescencji (MFI) próbki wynosiła 80. Gdy preinkubowano BAFF z ludzkim LTpR:hIgGl, nawet przy stężeniu 20 μg/ml, nie wykryto zmian w wiązaniu BAFF przez komórki Raji. Jednak gdy preinkubowano BAFF z ludzkim BAFF-R:hIgGl, zaobserwowano istotny spadek MFI do poziomu 20-25, nawet przy stężeniu białka fuzyjnego wynoszącym 625 ng/ml. Wysokość sygnału tła dla MFI w tym eksperymencie wynosiła 7. Tak więc, BAFF-R:hIgGl wykazuje dużą skuteczność w blokowaniu wiązania BAFF przez komórki Raji.
P r z y k ł a d 11. BAFF-R:hIgGl spowalnia rozwój toczniopodobnych chorób autoimmunologicznych u transgenicznych myszy
Przykład ten opisuje wpływ BAFF-R-Ig na redukcję obwodowej puli limfocytów B oraz na inhibicję rozwoju splenomegalii i zapalenia nerek.
W eksperymencie wykorzystano pięciomiesięczne myszy (C57BL/6) transgeniczne (Tg) BAFF oraz dopasowane wiekowo osobniki kontrolne z równoległego miotu. Myszy BAFF Tg wykazują objawy choroby białaczkowej oraz autoimmunologiczny fenotyp podobny do tocznia rumieniowatego (Mackay i wsp., 1999). Fenotyp ten obejmuje wzrost populacji obwodowych limfocytów B, włączając w to limfocyty B fazy przejściowej 1 (T1), fazy przejściowej 2 (T2), dojrzałe (M), strefy brzegowej (MZ) oraz CDI wysoki/IgMwysoki.
W dniach 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32 i 35, myszy otrzymywały dootrzewnowo albo PBS, albo 400 mg oczyszczonej ludzkiej IgG (hIg) (Sandoz, Bazylea, Szwajcaria) (3/grupę), albo też 400 μg ludzkiego białka fuzyjnego BAFF-R-huIgGl (hBCMA-Ig) (2/grupę), a po 40 dniach były uśmiercane.
Tuż po uśmierceniu myszy ważono ich śledziony i przygotowywano zawiesiny komórkowe po zlizowaniu czerwonych krwinek w buforze hipotonicznym.
Cytometrię przepływową wykonywano przy użyciu przeciwciał anty-CD21/CD35 sprzężonych z FITC, anty-IgD i anty-CDl sprzężonych z PE, anty-CD45R/B220 sprzężonych z barwnikiem Cychrome oraz anty-IgM sprzężonych z biotyną.
Wszystkie przeciwciała pochodziły z firmy Pharmingen (San Diego, CA). W skrócie, receptory Fc blokowano przez 10 minut na lodzie przy użyciu 10 μg/ml Fc Block (Pharmingen), po czym dodawano sprzężone z biotyną przeciwciała i inkubowano na lodzie przez 30 minut.
Komórki płukano jeden raz, po czym dodawano przeciwciała sprzężone z FITC, PE i Cychrome, a także strepawidynę-APC i 10 μg/ml Fc Block. Następnie inkubowano komórki przez 30 minut na lodzie, płukano jeden raz i zawieszano w 0,5% paraformaldehydzie.
Fluorescencję komórek rejestrowano na cytometrze przepływowym FA-CSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) i analizowano przy użyciu oprogramowania CELLQuest (Becton Dickinson).
Obecność białek w moczu myszy mierzono przy użyciu pasków testowych Multistix 10 SG (Bayer Corp., Diagnostic Division).
Wyniki przedstawiono poniżej w tabelach 11A i 11B.
PL 207 501 B1
T a b e l a 11A
Analiza limfocytów śledzionowych trzymiesięcznych myszy Całkowita liczba komórek na śledzionę (x 106)
T1 T2 MZ Dojrzałe
Myszy BATF Tg
816E23 9,4 18 9 91
816E33 14 30 19 170
816E99 14 26 19 150
Średnia 13 ± 2,6 24 ± 6 16 ± 5,7 140 ± 41
Kontrole z równoległego miotu
816E2 5,3 5,8 3,1 73
816E4 2,4 3,7 1,9 44
Średnia 3,9 ± 2 4,8 ± 1,5 2,4 ± 1 59 ± 20
Izolowano śledziony trzymiesięcznych myszy Baff Tg (n = 3) oraz dopasowanych wiekowo osobników kontrolnych (n = 2) z równoległego miotu, po czym analizowano je metodą FACS, według opisu zawartego w Materiałach i Metodach. Komórki T1, T2, M i MZ były określane na podstawie następujących markerów powierzchniowych:
T1:lgD -, IgMwysoki, CD21niski
MZ:IgD-, IgMwysoki, CD21 T2:IgD +, IgMwysoki, CD21wysoki
M:IgD+, IgMniski CD21średni
T a b e l a 11B
Analiza limfocytów śledzionowych u dziesięciomiesięcznych myszy Całkowita liczba komórek na śledzionę (x 106)
T1 T2 MZ Dojrzałe
Myszy BAFF Tg
802-39 13 100 34 630
823-3-11 7,5 43 6,6 200
823-3-11 3,1 50 15 180
Średnia 7,9 ± 4,9 64 ± 30 19 ± 10 340 ± 250
Kontrole z równoległego miotu
823-3-22 0,7 6,5 1,4 56
802-64 0,28 5,4 1,3 38
823-14-13 0,45 3,4 0,16 38
Średnia 0,45 ± 0,21 5,1 ± 1,5 0,95 ± 0,65 59 ± 20
Przy użyciu techniki FACS analizowano dziesięciomiesięczne myszy Baff Tg (n = 3) oraz dopasowane wiekowo osobniki kontrolne z równoległego miotu (n = 3), wg opisu w tabeli 11A. Po podaniu BAFF-R-Ig myszom Baff Tg, ich populacje T1, T2, M, MZ oraz limfocyty B CDIwysoki/IgMwysoki w śledzionie uległy znacznemu zmniejszeniu, w porównaniu do myszy traktowanych PBS lub IgG. Ogólna liczba komórek T1, T2, M, MZ i CDIwysoki/IgMwysoki została obniżona do poziomu zbliżonego do osobników kontrolnych traktowanych PBS (fig. 10a, 10b, 10c).
Podawanie BAFF-R-IgG myszom Baff Tg prowadziło do osłabienia choroby autoimmunologicznej związanej z udziałem Baff, na co wskazywało zaobserwowanie faktu, że traktowane BAFF-R myszy miały śledziony o normalnych rozmiarach, podczas gdy kontrolne myszy Baff Tg wykazywały
PL 207 501 B1 splenomegalię (fig. 11). Dodatkowo, występowanie białkomoczu, będącego wskaźnikiem złego funkcjonowania nerek, było zahamowane u myszy traktowanych BAFF-R, podczas gdy u kontrolnych myszy Baff Tg wystąpiło zapalenie nerek, co oceniano na podstawie podwyższonego poziomu białka w moczu (fig. 12). U myszy transgenicznych Baff obserwuje się znacznie zwiększoną liczbę obwodowych limfocytów B, a dalsza analiza wykazała u nich powiększenie się głownie subpopulacji T1, T2 i MZ. Przejściowe fazy rozwoju limfocytów B (T1 i T2) związane są z występowaniem punktów kontrolnych, w czasie których dochodzi przypuszczalnie do eliminacji autoreakcyjnych komórek B. Liczba komórek CDIwysoki/IgMwysoki, które zazwyczaj lokalizują się w strefie brzegowej, była również bardzo podwyższona u myszy Baff Tg. Wykazano później, że ta ostatnia populacja limfocytów B jest głównym źródłem produkcji autoprzeciwciał u myszy NZB/NZW chorych na toczeń. Traktowanie myszy Baff Tg prowadziło do zmniejszenia populacji limfocytów B T1, T2, MZ i CDIwysoki do poziomu odpowiadającego osobnikom kontrolnym typu dzikiego.
BAFF-R-Ig redukował pulę obwodowych limfocytów B i hamował rozwój splenomegalii i zapalenia nerek. Dlatego też, oprócz przydatności w leczeniu układowego tocznia rumieniowatego z zapaleniem nerek, działanie BAFF-R-Ig może również znaleźć zastosowanie w tych chorobach limfocytów B, które są autoimmunologiczne ze swej natury, a więc takich jak miastenia, niedokrwistość hemolityczna autoimmunologiczna, samoistna plamica małopłytkowa, zespół antyfosfolipidowy, choroba Chagasa, choroba Graves-Basedowa, ziarniniak Wegenera, guzkowe zapalenie tętnic oraz gwałtownie postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek. Ten środek leczniczy może mieć również zastosowanie w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenstroma, szpiczak plazmocytowy typu łańcucha ciężkiego, skrobiawica pierwotna i wtórna oraz monoklonalna gammaglobulinemia MGUS. Choroby onkologiczne, które mogą być objęte terapią, obejmują rozrost nowotworowy limfocytów B, oraz różne typy białaczek i chłoniaków.
P r z y k ł a d 12. Średnie ciśnienie tętnicze u transgenicznych myszy BAFF
Doświadczenie to opisuje pomiar ciśnienia krwi u myszy transgenicznych BAFF. Obserwacja fenotypu transgenicznych myszy BAFF wskazywała na możliwość rozwoju nadciśnienia u tych myszy.
Opisane powyżej myszy Baff Tg były usypiane przy użyciu ketaminy. Odsłaniano lewą tętnicę szyjną poprzez nacięcie na szyi. Wsuwano cewnik do tętnicy szyjnej w celu zmierzenia ciśnienia krwi oraz częstotliwości uderzeń serca. Cewnik był podłączony do urządzenia przetwarzającego ciśnienie, a pomiary ciśnienia krwi przeprowadzano przy użyciu systemu rejestracji danych Gould (system rejestracji danych P-Ne-Mah oraz poligraf Gould). Na podstawie analizy krzywej pulsacji ciśnienia obliczano ciśnienie skurczowe, ciśnienie rozkurczowe, średnie ciśnienie oraz częstotliwość uderzeń serca. Użyto dwóch grup myszy: transgenicznych myszy BAFF (n = 8) oraz kontroli typu dzikiego (n = 9).
Figura 13 przedstawia wartości średniego ciśnienia tętniczego (MAP, w mm Hg) dla dwóch analizowanych grup. Jak widać, przeciętna wartość MAP dla transgenicznych myszy BAFF wynosiła 102 ± 8 mm Hg. W przypadku myszy kontrolnych wartość MAP wynosiła 92 ± 6 mm Hg. Tak więc, myszy BAFF wykazywały wzrost wartości MAP o 10 mm Hg w porównaniu do kontroli, chociaż wynik ten nie osiągnął poziomu istotności statystycznej (ANOVA).
Bardziej szczegółową analizę tych danych przedstawia fig. 14. Pokazane są tutaj wyniki dla poszczególnych osobników. U myszy kontrolnych typu dzikiego (BAFF-) obserwowano typowy dwumianowy rozkład wyników. Natomiast w przypadku myszy transgenicznych BAFF (BAFF+), wartości ciśnienia dla poszczególnych osobników rozkładały się jak gdyby na dwie grupy, z których jedna obejmowała zakres 120-130 mm Hg, a druga 80-90 mm Hg.
Jako populacja, myszy transgeniczne BAFF wykazywały skłonność do nadciśnienia, w porównaniu z grupą kontrolną myszy. Analiza indywidualnych wartości ciśnienia wskazuje, że u myszy transgenicznych BAFF występują dwie subpopulacje, z których jedna ma wysokie, a druga normalne ciśnienie krwi. Zgodnie z tym, podawanie rozpuszczalnego BAFF-R, białka fuzyjnego, lub też homologu przeciwciała, może zniwelować efekt nadciśnienia.
P r z y k ł a d 13. Podawanie BAFF-R-Ig chorym myszom SNF1 prowadzi do zwolnienia tempa rozwoju zapalenia nerek
21-tygodniowe samice podatnych na toczeń myszy (SWR x NZB)F1 (SNF1), wykazujące umiarkowane zapalenie nerek (białkomocz w zakresie 30-100 mg/dl) otrzymywały co tydzień 200 μg ludzkiego białka fuzyjnego BAFF-R-huIgGl (hBCMA-Ig) lub ludzką IgG (HuIgG) (Sandoz), lub też 200 μl PBS, przez okres 8 tygodni. Mocz każdej myszy monitorowano co tydzień w kierunku białkomoczu przy użyciu zestawu Albustix (Bayer Corp., Terrytown, NY). Białkomocz przekraczający 100 mg/dl traktowano jako odpowiadający ostremu zapaleniu nerek. BAFF-R-Ig uzyskiwano z przejściowo
PL 207 501 B1 stransfekowanych komórek EBNA 293. Pożywkę pozostającą po hodowli komórek 293 wykazujących nadekspresję hBCMA-Ig nakładano na kolumnę z białkiem A. Izolowane białko wypłukiwano stosując 25 mM fosforan, 100 mM NaCl pH 2,8 i następującą potem neutralizację przy użyciu 1/20 objętości 0,5 M NaPO4 pH 8,6. Frakcje wybrane w oparciu o wyniki OD280 poddawane były elektroforezie SDS-PAGE, w warunkach denaturujących lub nie denaturujących, w celu identyfikacji oczyszczonego białka.
Trzy tygodnie po zakończeniu podawania testowanych czynników, 50% myszy traktowanych BAFF-R-Ig wykazywało ostre zapalenie nerek, w porównaniu do 75% i 87,5% myszy, które otrzymywały odpowiednio HuIgG lub PBS (patrz fig. 15). Wyniki te demonstrują, że BCMA-Ig, rozpuszczalny receptor BAFF, może blokować rozwój choroby autoimmunologicznej związanej z nieprawidłowym funkcjonowaniem limfocytów B, takiej jak zapalenie nerek towarzyszące toczniowi, prowadząc w efekcie do zauważalnego opóźnienia rozwoju choroby.
P r z y k ł a d 14. Podawanie BAFF-R-Ig zdrowym myszom prowadzi do spadku liczby komórek dendrytycznych (DC) śledziony oraz nietypowej lokalizacji wewnątrz śledziony
Siedmiotygodniowym samicom myszy BALB/c (3/grupę) podawano dootrzewnowo, raz w tygodniu, 20 μg lub 50 μg ludzkiego BAFF-R-IgGl (hBCMA-Ig), lub też 50 μg ludzkiej IgG (HuIgG), albo 100 μl PBS, przez okres 4 tygodni. Białko fuzyjne hBCMA-Ig oczyszczano z supernatantu hodowlanego stabilnie stransfekowanej linii komórkowej CHO. Śledziony pobierano 8 dni po ostatniej iniekcji, po czym trawiono je przy użyciu kolagenazy (Sigma, nr kat. C-5138) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Przygotowywano zawiesinę komórkową, lizowano czerwone krwinki w buforze hipotonicznym i płukano komórki trzykrotnie w PBS. Limfocyty śledzionowe przygotowywano do analizy w cytometrze przepływowym barwiąc je przeciwciałem anty-CD11c sprzężonym z biotyną (a następnie streptawidyną-APC), przeciwciałem anty-CD8a sprzężoną z barwnikiem Cychrome, oraz przeciwciałem anty-CD4 sprzężonym z FITC, w celu oszacowania populacji komórek dendrytycznych.
W oddzielnym doświadczeniu, samicom myszy BALB/c (N = 3) podawano raz w tygodniu dootrzewnowo 100 μg hBCMA-Ig przez okres 4 tygodni, po czym pobierano śledziony i zamrażano je w OCT używając 2-metylobutanu schłodzonego w CO2. Zamrożony materiał cięto na skrawki, które utrwalano w acetonie. Skrawki inkubowano z przeciwciałem anty-CD11c sprzężonym z biotyną, a następnie ze streptawidyną-APC i substratem BCIP (Pierce) w celu wizualizacji komórek dendrytycznych, a ponadto także z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko MOMA-1, a następnie ze sprzężonym z HRP przeciwciałem przeciwko szczurzej IgG (Jackson ImmunoResearch) i substratem 3,3'-diaminobenzydyną (Sigma, St. Louis, MO, nr kat. D-1293), w celu wizualizacji metalofilnych makrofagów, a także z przeciwciałem anty-CD35 sprzężonym z biotyną, a następnie streptawidyną-APC i odpowiednim substratem (zestaw I do detekcji alkalicznej fosfatazy, Vector nr kat. SK-5100) w celu wizualizacji pęcherzykowatych komórek dendrytycznych (FDC). Myszy, którym podawano in vivo raz w tygodniu (przez 4 tygodnie) 20 μg lub 50 μg BCM-Ig wykazywały znaczący spadek (p < 0,05 w teście t Studenta) liczby komórek dendrytycznycłi CDI lc+, w porównaniu do kontroli traktowanych Hu-IgG lub PBS. Spadek ten był widoczny w przypadku wszystkich egzaminowanych populacji CD11c+ komórek dendrytycznych: CD8a-CD4-, CD8a+CD4- oraz CD8--CD4+ (fig. 16, tabela 14A).
T a b e l a 14A
Stosowanie BAFF-R-Ig prowadzi do redukcji liczby komórek dendrytycznych w śledzionie
PBS HuIgG BCMA-Ig 20 μg BCMA-Ig 50 μg
Średnia liczba komórek dendrytycznych CD11+ (x 106) ± OS
CD8a-CD4- 0,81 ± 0,15 0,49 ± 0,07 0,26 ± 0,04 0,35 ± 0,05
CD8a+CD4- 0,36 ± 0,02 0,35 ± 0,07 0,16 ± 0,02 0,2 ± 0,02
CD8a-CD4+ 0,92 ± 0,02 0,84 ± 0,015 0,4 ± 0,06 0,55 ± 0,04
Obserwowany spadek liczby śledzionowych komórek dendrytycznych, które odgrywają kluczową rolę w prezentacji antygenu, może wpływać na aktywację i dojrzewanie limfocytów B oraz odporność humoralną. Zamrożone skrawki śledziony myszy otrzymano wg opisu zawartego w Materiałach i Metodach. Myszy traktowane BCMA-Ig wykazywały nietypowy wzór lokalizacji komórek dendrytycznych po barwieniu przeciwciałem anty-CD11c. Komórki dendrytyczne są zazwyczaj obecne w regionie limfocytów T miazgi białej i wewnątrz strefy brzegowej, koncentrując się przy kanałach mostkowych strefy brzegowej. Jednakże, komórki dendrytyczne myszy traktowanych BCMA-Ig znajdowane były
PL 207 501 B1 wokół obwodu strefy brzegowej, a tylko niektóre zdolne były do dalszej migracji w obrębie miazgi białej (wyniki nie przedstawione). Dlatego też wydaje się, że zablokowanie oddziaływania BAFF/BAFF-R, przy użyciu rozpuszczalnego receptora BAFF, zaburza proces lokalizacji komórek dendrytycznych, co może wpływać na ich zdolność do funkcjonowania w roli komórek prezentujących antygen, wpływając pośrednio na aktywację, dojrzewanie i odporność humoralną limfocytów B. Ponadto, wykazano metodami immunochemicznymi, że w śledzionach myszy traktowanych BCMA-Ig brakowało pęcherzykowatych komórek dendrytycznych CD35+ (wyniki nie przedstawione). Ponieważ komórki dendrytyczne prezentują antygen limfocytom B w ośrodkach namnażania, brak tych komórek może wpływać zaburzające na strukturę tego ośrodka i dojrzewanie limfocytów B.
Jest oczywiste, że specjaliści z poszczególnych dziedzin mogą wprowadzać rozmaite modyfikacje i kombinacje polipeptydów i metod objętych tym wynalazkiem, nie odchodząc jednocześnie od ducha i przedmiotu tego wynalazku. Wynalazek ten obejmuje więc wszelkie jego modyfikacje, o ile objęte są one dołączonymi do wynalazku zastrzeżeniami lub odpowiednikami takich zastrzeżeń.

Claims (14)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. (a) Polipeptyd BCMA obejmujący sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% identyczną do sekwencji odpowiadającej aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1, (b) przeciwciało skierowane przeciwko Id. Sekw. Nr: 1, (c) polipeptyd BCMA obejmujący sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 8 do 41 z Id. Sekw. Nr: 1 do zastosowania jako lek.
  2. 2. Zastosowanie (a) polipeptydu BCMA obejmującego sekwencję aminokwasową co najmniej w 80% identyczną do sekwencji odpowiadającej aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1, (b) przeciwciała skierowane przeciwko Id. Sekw. Nr: 1 lub (c) polipeptydu BCMA obejmującego sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 8 do 41 z Id. Sekw. Nr: 1 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia immunologicznego, zaburzenia limfoproliferacyjnego limfocytów B lub stanów zapalnych u ssaka.
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją odpowiadającą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, znamienne tym, że polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową odpowiadającą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1.
  5. 5. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, albo 4, znamienne tym, że polipeptyd ponadto obejmuje domenę Fc immunoglobuliny.
  6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że immunoglobuliną jest IgG.
  7. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że immunoglobulina jest immunoglobuliną ludzką.
  8. 8. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 7, znamienne tym, że lek hamuje wzrost limfocytów B u ssaka.
  9. 9. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 7, znamienne tym, że lek hamuje wytwarzanie immunoglobuliny u ssaka.
  10. 10. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 7, znamienne tym, że lek hamuje u ssaka wzrost limfocytów B indukowanych przez komórki dendrytyczne.
  11. 11. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 10, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
  12. 12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 11, znamienne tym, że polipeptyd nie obejmuje domeny transbłonowej.
  13. 13. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 11, znamienne tym, że polipeptyd jest rozpuszczalny.
  14. 14. Zastosowanie według jednego z zastrz. 2 do 11, znamienne tym, że polipeptyd obejmuje polipeptyd BCMA składający się zasadniczo z:
    (a) sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 80% identyczna z sekwencją odpowiadającą aminokwasom 1 do 51 z Id. Sekw. Nr: 1 lub (b) sekwencji aminokwasowej odpowiadającej aminokwasom 8 do 41 z Id. Sekw. Nr: 1.
PL354661A 1999-08-17 2000-08-16 Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA PL207501B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14937899P 1999-08-17 1999-08-17
US18168400P 2000-02-11 2000-02-11
US18353600P 2000-02-18 2000-02-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL354661A1 PL354661A1 (pl) 2004-02-09
PL207501B1 true PL207501B1 (pl) 2010-12-31

Family

ID=27386828

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL391600A PL211786B1 (pl) 1999-08-17 2000-08-16 Zastosowanie przeciwciała oraz polipeptydu
PL354661A PL207501B1 (pl) 1999-08-17 2000-08-16 Zastosowanie polipeptydu BCMA oraz przeciwciała skierowanego przeciwko BCMA

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL391600A PL211786B1 (pl) 1999-08-17 2000-08-16 Zastosowanie przeciwciała oraz polipeptydu

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7083785B2 (pl)
EP (3) EP2314694A3 (pl)
JP (4) JP4787439B2 (pl)
KR (2) KR100897082B1 (pl)
CN (1) CN100447244C (pl)
AT (1) ATE360693T1 (pl)
AU (1) AU780240B2 (pl)
BG (1) BG106519A (pl)
BR (2) BR0013391A (pl)
CA (1) CA2383154C (pl)
CZ (1) CZ300364B6 (pl)
DE (1) DE60034579T3 (pl)
DK (1) DK1210425T4 (pl)
EA (1) EA004635B1 (pl)
EE (1) EE05673B1 (pl)
GE (1) GEP20053685B (pl)
HK (1) HK1043608B (pl)
HU (3) HU230583B1 (pl)
IL (3) IL148089A0 (pl)
IS (1) IS2955B (pl)
MX (1) MXPA02001665A (pl)
NO (2) NO331410B1 (pl)
NZ (1) NZ517782A (pl)
PL (2) PL211786B1 (pl)
RS (1) RS51157B (pl)
SK (2) SK288287B6 (pl)
TR (1) TR200201063T2 (pl)
UA (1) UA75049C2 (pl)
WO (1) WO2001012812A2 (pl)

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
WO2000068378A1 (en) 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
RS51157B (sr) 1999-08-17 2010-10-31 Biogen Idec Ma Inc. Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
ES2267593T3 (es) * 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7371388B1 (en) * 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
CA2408617A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
WO2002002641A1 (en) * 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
IL158920A0 (en) 2001-05-24 2004-05-12 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin fusion proteins
MXPA04001050A (es) * 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
WO2003072713A2 (en) * 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
CA2492447A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
WO2004094620A2 (en) * 2003-03-28 2004-11-04 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
BRPI0411276A (pt) * 2003-06-05 2006-08-01 Genentech Inc métodos de esgotamento de células b, método de tratamento de neoplasma de células b ou malignidade, método de alìvio de disfunção autoimunológica regulada por células b, composição e artigo industrializado
US20050163775A1 (en) * 2003-06-05 2005-07-28 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
CA2543093A1 (en) 2003-10-20 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. Therapeutic regimens for baff antagonists
WO2005075511A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
WO2006052493A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-18 Genentech, Inc. Polypeptides that bind baff and/or april
WO2006067210A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
DK1855711T3 (da) * 2005-01-28 2009-10-12 Biogen Idec Inc Anvendelse af BAFF til behandling af Th2-medierede tilstande
AR059025A1 (es) 2005-08-09 2008-03-12 Zymogenetics Inc Metodos para el tratamiento y prevencion de proliferacion de celulas anormales utilizando moleculas de fusion taci
EA016083B1 (ru) 2005-08-09 2012-02-28 Займоджинетикс, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ С ПОМОЩЬЮ СЛИТОЙ МОЛЕКУЛЫ TACI-Ig
JP5905184B2 (ja) * 2005-10-13 2016-04-20 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッドＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． 自己抗体陽性疾患を有する患者の処置に使用するための方法および組成物
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
JP6088723B2 (ja) 2005-11-23 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アッセイに関する組成物及び方法。
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
AU2007249223B2 (en) 2006-05-15 2012-08-02 Ares Trading S.A. Methods for treating autoimmune diseases using a TACI-Ig fusion molecule
NZ590057A (en) 2008-07-17 2012-08-31 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic antibodies that bind a BAFFR polypeptide
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
US20110014190A1 (en) * 2009-02-12 2011-01-20 Human Genome Sciences, Inc. Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance
NZ612647A (en) 2009-03-10 2015-03-27 Biogen Idec Inc Anti-bcma antibodies
CA2772929A1 (en) 2009-09-03 2011-03-11 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring rheumatoid arthritis
CN101781680B (zh) * 2009-10-19 2012-05-09 南通大学附属医院 测定对人baff-r基因启动子活性影响因素的方法
CN101781679B (zh) * 2009-10-19 2012-05-23 南通大学附属医院 人baff-r基因启动子活性的测定方法
WO2011108008A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Transgene Biotek Ltd. Antibody for targeted induction of apoptosis, cdc and adcc mediated killing of cancer cells, tbl-cln1
BR112013021725A2 (pt) 2011-02-28 2016-11-01 Genentech Inc marcadores biológicos e métodos para prever resposta aos antagonistas de células b
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
EP4338754A2 (en) * 2011-05-27 2024-03-20 Glaxo Group Limited Antigen binding proteins
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
MX2014009043A (es) 2012-01-31 2014-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-ige y sus metodos de uso.
US10435474B2 (en) 2013-12-24 2019-10-08 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
ES2959480T3 (es) 2014-02-07 2024-02-26 Univ Mcmaster Acoplador de células T - antígeno trifuncional y métodos y usos del mismo
ES2939760T3 (es) 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
CA2955386A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
ES2891332T3 (es) 2014-09-17 2022-01-27 Novartis Ag Direccionamiento a células citotóxicas con receptores quiméricos para la inmunoterapia adoptiva
PL3227432T3 (pl) 2014-12-05 2024-03-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeryczne receptory antygenowe ukierunkowane na antygen dojrzewania komórek b i ich zastosowania
KR20170108944A (ko) * 2014-12-05 2017-09-27 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 B-세포 성숙화 항원을 표적화하는 항체 및 사용 방법
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
BR112017019785B1 (pt) * 2015-04-13 2022-11-16 Pfizer Inc Anticorpo biespecífico, seu uso e composição farmacêutica
EP3757128A1 (en) 2015-04-13 2020-12-30 Pfizer Inc Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US20180298068A1 (en) 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
JP7118887B2 (ja) 2015-11-23 2022-08-16 ノバルティス アーゲー 最適化されたレンチウイルス移入ベクターおよびその使用
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
SG10202007836WA (en) 2016-02-17 2020-09-29 Seattle Genetics Inc Bcma antibodies and use of same to treat cancer and immunological disorders
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
US11136405B2 (en) * 2016-06-06 2021-10-05 Board Of Regents, The Unviersity Of Texas System BAFF-R antibodies and uses thereof
CN109641049B (zh) 2016-06-21 2023-07-07 特尼奥生物股份有限公司 Cd3结合抗体
BR112019004873A2 (pt) 2016-09-14 2019-06-11 Teneobio Inc anticorpos de ligação a cd3
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
AU2017382251A1 (en) 2016-12-21 2019-07-11 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3621981A2 (en) 2017-05-12 2020-03-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EP3652209A2 (en) 2017-07-11 2020-05-20 Compass Therapeutics LLC Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CA3078637A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Mcmaster University T cell-antigen coupler with y182t mutation and methods and uses thereof
CN111629749A (zh) 2017-10-18 2020-09-04 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
KR20200116077A (ko) 2017-11-01 2020-10-08 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 B 세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 암호화 폴리뉴클레오타이드
EP3703688A2 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
JP2021502979A (ja) 2017-11-15 2021-02-04 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体、ｃｄ１９ターゲティングキメラ抗原受容体及び併用療法
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019136432A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
MX2020012028A (es) 2018-05-11 2021-03-29 Crispr Therapeutics Ag Metodos y composiciones para tratar el cancer.
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
PE20210320A1 (es) 2018-06-01 2021-02-16 Novartis Ag Moleculas de union contra bcma y usos de las mismas
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
CA3100724A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag B-cell maturation antigen protein (bcma) chimeric antigen receptors and uses thereof
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
AU2019307928A1 (en) 2018-07-19 2021-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-BCMA x anti-CD3 antibodies and uses thereof
BR112021003305A2 (pt) 2018-08-31 2021-05-25 Novartis Ag métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
BR112021011874A2 (pt) 2018-12-20 2021-09-08 Novartis Ag Regime de dosagem e combinação farmacêutica compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
MX2021009763A (es) 2019-02-15 2021-09-08 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina -2,6-diona y usos de los mismos.
KR20210129672A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 치환된 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
CA3138633A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
CN114206927A (zh) 2019-06-14 2022-03-18 特尼奥生物股份有限公司 与cd22和cd3结合的多特异性重链抗体
JP2022539248A (ja) 2019-07-02 2022-09-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 組換えａｄ３５ベクター及び関連遺伝子治療改善
AU2020393912A1 (en) 2019-11-26 2022-06-09 Novartis Ag Chimeric antigen receptors binding BCMA and CD19 and uses thereof
CA3165399A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
JP2023515211A (ja) 2020-02-27 2023-04-12 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
MX2022010604A (es) 2020-02-27 2022-09-09 Novartis Ag Metodos de produccion de celulas que expresan receptores antigenicos quimericos.
JP2023526774A (ja) 2020-04-29 2023-06-23 テネオバイオ， インコーポレイテッド 重鎖定常領域が修飾された多重特異性重鎖抗体
IL298473A (en) 2020-06-11 2023-01-01 Novartis Ag zbtb32 inhibitors and uses thereof
BR112022026202A2 (pt) 2020-06-23 2023-01-17 Novartis Ag Regime de dosagem compreendendo derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
WO2023021477A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6541224B2 (en) 1996-03-14 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor delta polypeptides
DK0897390T3 (da) 1996-03-14 2004-03-08 Human Genome Sciences Inc Human tumornekrosefaktor-delta og -epsilon
DK0939804T4 (da) 1996-10-25 2011-07-18 Human Genome Sciences Inc Neutrokin-alpha
WO1998027114A2 (en) 1996-12-17 1998-06-25 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
ID23855A (id) 1997-04-16 2000-05-25 Amgen Inc Protein pengikat osteoprotegerin dan reseptor
IL133315A0 (en) 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
IL133316A0 (en) 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
WO1999011791A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 University Of Washington Tumor necrosis factor family receptors and ligands, encoding nucleic acids and related binding agents
PL339740A1 (en) 1997-09-12 2001-01-02 Biogen Kay - a novel immune system protein
EP1012179A2 (en) 1997-09-12 2000-06-28 Apotech R&D S.A. Cysteine rich receptors: trail
TR200000669T2 (tr) * 1997-09-12 2000-08-21 Apotech R & D Sa Büyüme etkinliğine sahip yeni bir protein-APRIL.
AU2093499A (en) 1997-12-30 1999-07-19 Chiron Corporation Members of tnf and tnfr families
US6297367B1 (en) * 1997-12-30 2001-10-02 Chiron Corporation Polynucleotide encoding TNFL1
EP0947556B1 (en) * 1998-04-01 2004-11-10 Solvay Solexis, Inc. Compatible blends of polyvinylidene fluoride and aromatic polyimide
AU1467000A (en) 1998-11-04 2000-05-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A novel tumor necrosis factor family member, drl, and related compositions and methods
GB9828628D0 (en) 1998-12-23 1999-02-17 Glaxo Group Ltd Novel ligand
US7833529B1 (en) * 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
IL144029A0 (en) † 1999-01-07 2002-04-21 Zymogenetics Inc Soluble receptor br43x2 and methods of using
US20060067933A1 (en) * 1999-01-07 2006-03-30 Gross Jane A Soluble receptor BR43x2 and methods of using
CA2360062A1 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biogen, Inc. Baff, inhibitors thereof and their use in the modulation of b-cell response
US6475986B1 (en) * 1999-02-02 2002-11-05 Research Development Foundation Uses of THANK, a TNF homologue that activates apoptosis
WO2000050633A1 (en) 1999-02-24 2000-08-31 The General Hospital Corporation Method for cloning signal transduction intermediates
AU3633000A (en) 1999-03-26 2000-10-16 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha binding proteins and methods based thereon
WO2000068378A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
RS51157B (sr) 1999-08-17 2010-10-31 Biogen Idec Ma Inc. Baff receptor (bcma), imunoregulatorni agens
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
WO2001058949A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Biogen, Inc. Heterologous polypeptide of the tnf family
ES2267593T3 (es) † 2000-02-16 2007-03-16 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-april y celulas hibridomas.
US20040013674A1 (en) 2001-04-27 2004-01-22 Christine Ambrose Taci as an anti-tumor agent
CA2408617A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 Amgen Inc. Methods and compositions of matter concerning april/g70, bcma, blys/agp-3, and taci
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1309718A4 (en) 2000-08-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc NEUTROKINE-ALPHA AND NEUTROKINE-ALPHA SPLICE VARIANT
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
EP1456347A4 (en) 2001-11-16 2006-08-02 Human Genome Sciences Inc ANTIBODIES BINDING TO BLYS ACCORDING TO AN IMMUNOSPECIFIC MODE
WO2003072713A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
US7083735B2 (en) 2003-09-03 2006-08-01 Laing David A High debris content strainer
EP4338754A2 (en) 2011-05-27 2024-03-20 Glaxo Group Limited Antigen binding proteins
FR3005792B1 (fr) 2013-05-16 2017-12-29 Parknplug Procede de gestion dynamique et previsionnel du rechargement electrique de batteries

Also Published As

Publication number Publication date
HK1043608B (zh) 2007-12-07
NZ517782A (en) 2004-01-30
US10494416B2 (en) 2019-12-03
US20020172674A1 (en) 2002-11-21
JP5379107B2 (ja) 2013-12-25
US9650430B2 (en) 2017-05-16
BG106519A (bg) 2003-04-30
HU227008B1 (en) 2010-04-28
UA75049C2 (uk) 2006-03-15
EE200200071A (et) 2003-04-15
CN1379815A (zh) 2002-11-13
EP2314694A3 (en) 2013-12-11
JP4787439B2 (ja) 2011-10-05
WO2001012812A2 (en) 2001-02-22
NO331410B1 (no) 2011-12-19
NO20020789D0 (no) 2002-02-18
HU230583B1 (hu) 2017-02-28
EE05673B1 (et) 2013-08-15
RS51157B (sr) 2010-10-31
MXPA02001665A (es) 2003-07-14
CZ2002579A3 (cs) 2002-05-15
HU227947B1 (en) 2012-06-28
EA200200261A1 (ru) 2002-08-29
US7691804B2 (en) 2010-04-06
DE60034579T2 (de) 2008-01-31
HU1000128D0 (en) 2010-05-28
BRPI0013391B1 (pt) 2018-09-11
CZ300364B6 (cs) 2009-04-29
AU780240B2 (en) 2005-03-10
PL211786B1 (pl) 2012-06-29
CA2383154A1 (en) 2001-02-22
DK1210425T4 (en) 2015-08-10
DE60034579T3 (de) 2015-11-12
BRPI0013391B8 (pt) 2021-05-25
US20120214687A1 (en) 2012-08-23
EP1806143A3 (en) 2007-07-18
KR20020084842A (ko) 2002-11-11
IL230961A (en) 2016-06-30
EP1806143B1 (en) 2016-06-15
GEP20053685B (en) 2005-12-12
DK1210425T3 (da) 2007-09-17
SK500172015A3 (pl) 2002-07-02
HUP0203084A2 (en) 2002-12-28
US20150139992A1 (en) 2015-05-21
US20020165156A1 (en) 2002-11-07
WO2001012812A3 (en) 2001-09-07
JP2003507364A (ja) 2003-02-25
HK1043608A1 (en) 2002-09-20
IL230961A0 (en) 2014-03-31
JP5904985B2 (ja) 2016-04-20
IL148089A (en) 2015-03-31
EP1210425A2 (en) 2002-06-05
US20100040627A1 (en) 2010-02-18
PL354661A1 (pl) 2004-02-09
AU6911200A (en) 2001-03-13
BR0013391A (pt) 2002-07-09
NO20111232A1 (no) 2011-09-12
SK288603B6 (sk) 2018-10-01
EP1806143A2 (en) 2007-07-11
YU10602A (sh) 2005-06-10
ATE360693T1 (de) 2007-05-15
IS6273A (is) 2002-02-15
US8828669B2 (en) 2014-09-09
SK2292002A3 (en) 2002-07-02
CA2383154C (en) 2013-04-30
EA004635B1 (ru) 2004-06-24
TR200201063T2 (tr) 2002-10-21
NO344346B1 (no) 2019-11-11
US7083785B2 (en) 2006-08-01
IS2955B (is) 2016-12-15
JP2014037434A (ja) 2014-02-27
NO20020789L (no) 2002-04-08
US20200095305A1 (en) 2020-03-26
JP2011063600A (ja) 2011-03-31
US20180273605A1 (en) 2018-09-27
EP2314694A2 (en) 2011-04-27
EP1210425B1 (en) 2007-04-25
JP2011116790A (ja) 2011-06-16
IL148089A0 (en) 2002-09-12
DE60034579D1 (de) 2007-06-06
SK288287B6 (sk) 2015-07-01
CN100447244C (zh) 2008-12-31
KR100897082B1 (ko) 2009-05-14
EP1210425B2 (en) 2015-06-17
KR20090016772A (ko) 2009-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10494416B2 (en) Methods of modulating immune responses using BCMA polypeptide
JP4880155B2 (ja) Ａｐｒｉｌレセプター（ｂｃｍａ）およびその使用
ZA200201201B (en) BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent.