PT1631313E - Terapêutica de combinação para distúrbios de células b - Google Patents

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PT1631313E
PT1631313E PT47543210T PT04754321T PT1631313E PT 1631313 E PT1631313 E PT 1631313E PT 47543210 T PT47543210 T PT 47543210T PT 04754321 T PT04754321 T PT 04754321T PT 1631313 E PT1631313 E PT 1631313E
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Qian Gong
Flavius Martin
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Description

DESCRIÇÃO TERAPÊUTICA DE COMBINAÇÃO PARA DISTÚRBIOS DE CÉLULAS B Campo da invenção A invenção refere-se a novas terapêuticas de combinação para o tratamento de tumores malignos de células B assim como distúrbios autoimunes.
Antecedentes da invenção
Os linfócitos são uma de várias populações de glóbulos brancos; reconhecem especificamente e respondem a antigénio exógeno. As três classes principais de linfócitos são linfócitos B (células B), linfócitos T (células T) e células citoliticas naturais (NK) . Os linfócitos B são as células responsáveis da produção de anticorpos e proporcionam imunidade humoral. Os linfócitos B maduram dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação a antigénio em sua superfície celular. Quando uma célula B naive encontra-se pela primeira vez com o antigénio para o que seu anticorpo ligado a membrana é específico, a célula começa a se dividir rapidamente e sua descendência se diferencia em células B de memória e células efetoras denominadas "células plasmáticas". As células B de memória têm uma esperança de vida mais larga e continuam expressando um anticorpo ligado a membrana com a mesma especificidade que a célula parental original. As células plasmáticas não produzem anticorpos ligados a membrana mas que produzem em seu lugar uma forma secretada do anticorpo. Os anticorpos secretados são as moléculas efetoras principais da imunidade humoral. 0 antigénio CD20 (também denominado antigénio de diferenciação restringido a linfócitos B humano, Bp35) é uma proteína transmembrana hidrófoba com uma massa molecular de cerca de 35 kD localizada em linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989); e Einfeld et al. EMBO J. 7(3) : 711-717 (1988)) . 0 antigénio também é expresso em mais de 90 % de linfomas não de Hodgkin (NHL) de células B (Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), mas não se encontra em células madre hematopoiéticas, células pró-B, células plasmáticas normais ou outros tecidos normais (Tedder et al. J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). Acredita-se que CD20 regula uma etapa ou etapas precoce no processo de ativação para o inicio e diferenciação do ciclo celular (Tedder et al., mencionado anteriormente) e possivelmente atue como um canal de ião de cálcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).
Dada a expressão de CD20 em linfomas de células B, este antigénio tem sido um alvo terapêutico útil para tratar os ditos linfomas. Há mais de 300.000 pessoas nos Estados Unidos com NHL de células B e são diagnosticados a cada ano mais de 56, 000 novos casos. Por exemplo, o anticorpo rituximab (RITUXAN®) que é um anticorpo monoclonal humano/murino quimérico modificado por engenharia genética dirigido contra o antigénio CD20 humano (disponível no mercado de Genentech, Inc., South San Francisco, California, Estados Unidos) é utilizada para o tratamento de pacientes com linfoma não de Hodgkin de células B, CD20 positivo, que reincide ou refratário de grau baixo ou folicular. Rituximab é o anticorpo denominado "C2B8" na Patente dos Estados Unidos N° 5.736.137 apresentada em 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) . O mecanismo in vitro de estudos de ação ha demostrado que RITUXAN® se liga ao complemento humano e lisa linhas celulares B linfoides por meio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83(2): 435-445 (1994)). Adicionalmente, tem atividade significativa em ensaios para citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Os estudos pré-clínicos in vivo foi mostrado que RITUXAN® depleta as células B do sangue periférico, gânglios linfáticos e medula óssea de macacos cynomolgus, supostamente por meio de processos mediados por célula e complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83(2): 435-445 (1994)). Outros anticorpos anti-CD20 indicados para o tratamento de NHL incluem o anticorpo murino Zevalin™ que se liga ao radioisótopo. 0
Itrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Bexxar™ que é outro anticorpo completamente murino conjugado com 1-131 (Corixa, WA). BLyS (também conhecido como BAFF, TALL-1, THANK, TNFSF13B ou zTNF4) é um membro da superfamília do ligando TNF1 que é essencial para a sobrevivência e maduração das células B. A sobre-expressão de BLyS em ratinhos transgénicos leva a hiperplasia de células B e desenvolvimento de doença autoimune grave (Mackay, et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710; Gross, et al. (2000) Nature 404, 995-999; Khare, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97,3370-33752-4). Os níveis de BLyS estão elevados em pacientes humanos com uma diversidade de distúrbios autoimunes, tais como lupus eritematoso sistémico, artrite reumatoide e síndrome de Sjogren (Cheema, G. S, et al., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319; Groom, J., et al, (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68; Zhang, J., et al., (2001) J.
Immunol. 166, 6-10) . Além disso, os níveis de BLyS estão correlacionados com a gravidade da doença, o que sugere que BLyS pode desempenhar um papel direto na patogénese destas doenças. BLyS age nas células B se ligando com três membros da superfamília do recetor de TNF, TACI, BCMA e BR3 (também conhecido como BAFF-R) (Gross, et al., mencionado anteriormente; 8. Thompson, J. S., et al., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et al., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552; Yan, M., et al., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41; Schiemann, B., et al., (2001) Science 293, 2111-2114) . Dos três, somente BR3 é específico para BLyS; os outros dois também se ligam ao membro da família de TNF relacionado, APRIL. A comparação dos fenótipos de BLyS e ratinhos com anulação do recetor ou mutantes indica que a sinalização através de BR3 media nas funções de sobrevivência de células B de BLyS (Thompson, et al., mencionado anteriormente; Yan, (2002), mencionado anteriormente; Schiemann, mencionado anteriormente). Ao contrário, TACI parece agir como um recetor inibidor (Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643), enquanto que o papel de BCMA não está claro (Schiemann, mencionado anteriormente) . BR3 é uma proteína transmembrana de tipo III de 184 resíduos expressada na superfície de células B (Thompson, et al. , mencionado anteriormente; Yan, (2002), mencionado anteriormente). A região intracelular não porta nenhuma similaridade de sequência com domínios estruturais conhecidos ou motivos de interação proteína-proteína. Não obstante, a sinalização induzida por BLyS através de BR3 resulta no processamento do fator de transcrição NF-B2/pl00 a p52 (Claudio, E, et al., (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965; Kayagaki, N. , et a 1. , (2002) Immunity 10,515-524) . O domínio extracelular (ECD) de BR3 também é divergente. Os membros da família de TNFR são caracterizados habitualmente pela presença de múltiplos domínios ricos em cisteína (CRD) em sua região extracelular; cada CRD está composto tipicamente de ~40 resíduos estabilizados por seis cisteinas em três ligações dissulfureto. Os membros convencionais desta família realizam contactos com o ligando através de dois CRD que interagem com duas zonas distintas na superfície do ligando (revisado em Bodmer, J.-L., et al., (2002) Trends Biochem. Sei. 27, 19-26) . No entanto, o ECD de BR3 contém somente quatro resíduos de cisteína, capazes de formar um CRD parcial como máximo, surgindo a questão de como um recetor tão pequeno transmite ligação de ligando de alta afinidade.
Previamente foi mostrado que o domínio de ligação de BLyS de BR3 reside dentro uma região central de 26 resíduos (Kayagaki, et al., mencionado anteriormente) . Seis resíduos de BR3, quando são estruturados dentro um péptido em grampo β (bhpBR3), foram suficientes para conferir ligação a BLyS e bloquear a sinalização mediada por BR3. Outros apresentaram polipéptidos que foram propostos que interagem com BLyS (por exemplo, documentos WO 02/24909, WO 03/035846, WO 02/16312, W002/02641).
Sumário da invenção A invenção proporciona um método para depletar células B de uma população mista de células de acordo com a reivindicação 1. Este método é útil por exemplo, num ensaio in vitro comercial para depletar eficaz e seletivamente células B de uma população mista de células, pondo em contacto as células B com um antagonista de BLyS e um anticorpo anti-CD20. Outra forma de realização do método precedente de depleção de células B é depletar especificamente certos subconjuntos de células B tais como células B de um centro germinal e células B de zona marginal. As células B de centro germinal reveladas no presente documento podem estar no baço e placas de Peyer. É revelado no presente documento um método para depletar todos os subconjuntos de células B in vitro ou in vivo pondo em contacto as células B com um antagonista de BLyS e um anticorpo de ligação a CD20. A invenção também proporciona um método para depletar todas as populações de células B no baço administrando a um mamífero, um antagonista de BLyS e anticorpo anti-CD20 em quantidades eficazes para depletar todas as populações de células B. Numa forma de realização especifica, o método é eficaz para depletar as células B de zona marginal e centro germinal no baço, gânglio linfático e placas de Peyer. É revelado no presente documento um método para tratar uma neoplasia de células B ou tumor maligno caracterizado por células B que expressam CD20, que compreende administrar a um paciente que sofre a neoplasia ou o tumor maligno, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20 e um antagonista de BLyS. 0 anticorpo de ligação a CD20 e antagonista de BLyS podem ser administrados simultaneamente. 0 anticorpo de ligação a CD20 e antagonista de BLyS podem ser administrados sequencialmente. 0 antagonista de BLyS pode ser administrado antes do anticorpo de ligação a CD20. A neoplasia de células B pode ser linfoma não de Hodgkin (NHL) , NHL linfocítico pequeno (SL), doença de Hodgkin de linfócitos predominantes (LPHD), linfomas de células de centro folicular (FCC), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL) e leucemia por tricoleucitos. Neste método de tratamento, BR3-Fc e Rituxan são administrados em dosagens reveladas na secção de Dosagem. 0 antagonista de BLyS e o anticorpo de CD20 podem ser administrados juntamente com quimioterapia. É revelado no presente documento um método para aliviar um distúrbio autoimune regulado por células B que compreende administrar a um paciente que sofre o distúrbio, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20 e de um antagonista de BLyS. 0 distúrbio autoimune pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), doença de Wegener, doença inflamatória intestinal, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) , trombocitopenia autoimune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculite, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren e glomerulonefrite. Quando o distúrbio autoimune é artrite reumatoide ou lupus eritematoso sistémico, o antagonista de BLyS e o anticorpo de ligação a CD20 podem ser administrados juntamente com terapêutica utilizando um fármaco selecionado de fármacos anti-inflamatórios não esteroides (ΑΙΝΕ), glucocorticoides, prednisona e fármaco antirreumático modificador de doença (ARME).
Em qualquer dos métodos de tratamento ou alívio de um distúrbio em que se administra anticorpo de ligação a CD20 e antagonista de BLyS a um paciente, o anticorpo de ligação a CD20 e o antagonista de BLyS podem ser administrados simultânea ou sequencialmente. 0 antagonista de BLyS pode ser administrado antes que o anticorpo de ligação a CD20.
Uma composição que compreende um anticorpo de ligação a CD20 e um antagonista de BLyS também é revelado no presente documento. É revelado no presente documento um artigo de fabrico que compreende anticorpo de ligação a CD20, um antagonista de BLyS, e uma etiqueta, em que a etiqueta indica que a composição é para tratar uma neoplasia de células B ou um distúrbio autoimune regulado por células B. 0 anticorpo anti-CD20 pode incluir anticorpo quimérico e humanizado. As formas de realização especificas do anticorpo anti-CD20 incluem rituximab (RITUXAN®) , m2H7 (2H7 murino), hu2H7 (2H7 humanizado) e todas suas variantes funcionais, hu2H7.vl6 (v significa versão), v31, v96, vll4, vll5, que têm as sequências de aminoácidos. hu2H7.vl6 intacto tem a sequência de cadeia L madura de SEQ ID N°: 15 e cadeia H de SEQ ID N°: 16. 0 antagonista de BLyS, pode ser uma imunoadesina. Em formas de realização especificas, a imunoadesina é selecionada a partir do grupo que consiste em imunoadesina BR3 que compreende o domínio extracelular de BR3, imunoadesina TACI que compreende o domínio extracelular de TACI, e imunoadesina BCMA que compreende o domínio extracelular de BCMA. Em outras formas de realização, o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BLyS, em particular, um anticorpo anti-BLyS que se liga a BLyS dentro de uma região de BLyS que compreende os resíduos 162-275. Em outra forma de realização, o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BR3 incluindo um que se liga a BR3 numa região que compreende resíduos 23-38 de BR3 humano. As posições de aminoácidos de BR3 humano indicadas nas reivindicações são de acordo com a numeração de sequências em BR3 humano ou BR3 humano alternativo revelado no presente documento baixo a definição de "BR3".
Em formas de realização específicas o antagonista de BLyS é selecionado a partir do grupo que consiste num polipéptido de 17 unidades que tem a sequência de ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ou ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9) assim como formas PEGiladas destes polipéptidos de 17 unidades: um polipéptido que tem a sequência de MLPOCKWDLUKQWYCDPLOSGSÂTGGSGSTASSGSGSÁTHMLPOCKWDLLIKQWVCD PLGdGGG\T>KTHTCPFC.PAPELLGGPSWLFPPKPKDTLIv4iSaTFEVTCVtrW0VSíffiDPE\rKFNWY VDGVEVHNAKiriPREEQYNSTYlRWSVLTVLHQDWLNGKBYKGKVSNKAIPAPJEKTISKAKGQP REPQ\dTIJJPSRDtLTKNQVSLTCLVKt3FÍTSDL\VEWESNGQPENNYKTTP?VLD{;r>GSFELYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID MO. 10); imunoadesina hBR3-Fc que tem a sequência de MSM_.LILALVG.AAVAS'rRSGPRSLRGRI>^\PAFTPO,?FAECFDLLVEHCVACGLLRTPRPKPAGAsSS PAPRTAi.QPQESQVTDKAABYB.CPPCPAPBLLGGPSVPI.tEPKPKDTLMISRTPEVTCWVAVSHE 0PEVKFm?Y\ÍX3VE^GlNA&TKPT^EtArKSTYRWSVLTi!LHODWT,NGKEYKCKVSNlCAtPAf,I EK^SKAKOQPREPQVYTtPPSREEMTKNQVStTCLVKCjFYPSPiAWWESNGQPENNYKTTPpVL DSIXSSEPXYSKLWBIBRWQQGKVl^CSVMímAn^líYlOKStSLSPGK; (SEQXD NO. 2),
Em qualquer dos métodos precedentes da invenção, numa forma de realização o antagonista de BLyS e o anticorpo anti-CD20 agem de forma sinérgica para depletar as células B Breve descrição das figuras
As Figuras 1A-1B mostram uma sequência de polinucleótido que codifica um TACI humano de sequência nativa (SEQ ID N°: _) e sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: _) . A Figura 2 mostra uma sequência de polinucleótido que codifica um BCMA humano de sequência nativa (SEQ ID N°: _) e sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: _) . A Figura 3 mostra uma sequência de polinucleótido que codifica um BLyS humano de sequência nativa (SEQ ID N° : _) e sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: _).
As Figuras 4A-4B mostram uma sequência de polinucleótido que codifica um APRIL humano de sequência nativa (SEQ ID N° : _) e sua sequência de aminoácidos potencial (SEQ ID N° : _) . A Figura 5A mostra uma sequência de polinucleótido (os codões de inicio e terminação estão sublinhados) que codifica TACI humanos de sequência nativa (SEQ ID N°: _) e a Figura 5B mostra sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: _). A Figura 6A mostra uma sequência de polinucleótido (os codões de inicio e terminação estão sublinhados) que codifica um BR3 humano de sequência nativa (SEQ ID N° : _) e a Figura 6B mostra sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N° : ; a Figura 6C mostra uma sequência de polinucleót ido (os codões de inicio e terminação estão sublinhados) que codifica BR3 murino (SEQ ID N°: _), e a Figura 9A mostra sua sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: _) .
As Figuras 7A-7B mostram métodos exemplares para calcular a % de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada "Proteína de Comparação" com a sequência de aminoácidos designada "PRO". Para fins do presente documento, a sequência "PRO" pode ser as sequências TACI, BCMA, TALL-1, APRIL, TACI ou BR3 indicadas nas Figuras no presente documento. A Figura 8 mostra um alinhamento de duas sequências de aminoácidos para o recetor TACI, denominado "hTACI (265)" (SEQ ID N° : _) , que acredita-se que é uma variante de splice, e "hTACI", também indicado nas Figuras 1A-1B (SEQ ID N°: _). A Figura 9 mostra um alinhamento de sequências de BR3 humano (SEQ ID N° : _) e murino (SEQ ID N° : _) com aminoácidos indicados por letra e aminoácidos conservados indicados por um sinal mais abaixo. A Figura 10 mostra a sequência de aminoácidos de CD20 humana que mostra regiões transmembrana (enquadradas) e extracelulares (sublinadas) preditas. Os domínios potenciais são 1-63: Citoplasmático: 64-84: Transmembrana: 85-105: Transmembrana; 106-120: Citoplasmático; 121-141: Transmembrana; 142-188: Extracelular; 189-209: Transmembrana; 210-297: Citoplasmático; 81-167: ligação dissulfureto. A Figura 11 mostra a sequência de nucleótidos para CD20 humano. A Figura 12 é um alinhamento de sequências que compara as sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve (VL) de 2H7 murino (SEQ ID N° _) , variante de 2H7 vl6 humanizada (SEQ ID N° _), e um subgrupo de cadeia leve kappa humana I (SEQ ID N° _) . As CDR de VL de 2H7 e hu2H7 . vl6 são as seguintes: CDR1 (SEQ ID N°_) , CDR2 (SEQ ID N°_) e CDR3 (SEQ ID N°_). A FIG. 13 é um alinhamento de sequências que compara as sequências VH de de 2H7 murino (SEQ ID N° _) , variante de 2H7 vl6 humanizada (SEQ ID N° _) , e a sequência consenso humana do subgrupo de cadeia pesada III (SEQ ID N° _) . As CDR de VH de 2H7 e hu2H7.vl6 são as seguintes: CDR1 (SEQ ID N°_), CDR2 (SEQ ID N°_) e CDR3 (SEQ ID N°_).
Na FIG. 12 e na FIG. 13, as CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeia estão incluída entre parênteses, flanqueadas pelas regiões marco conservadas, FR1-FR4, como se indica. Os asteriscos entre duas filas de sequências indicam as posições que são diferentes entre as duas sequências. A numeração de resíduos é de acordo com Rabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), com inserções mostradas como a, b, c, d e e. A Figura 14 mostra a expressão do transgene de CD20 humano em células B220+ de ratinho (células B) de ratinhos hCD20 BAC Tg+. A Figura 15 mostra a expressão de CD20 durante a maduração de células B em ratinhos hCD20 BAC Tg. Nas Figuras 15-19, a linha vermelha mostra o controlo negativo, a coloração de células de parceiros de camada transgene negativos (Tg-) com um mAb anti-hCD20. A linha verde mostra a coloração com respeito a CD20 humano em ratinhos Tg+. Os ratinhos Tg+ referem-se a ratinhos transgénicos hC20 BAC. A Figura 16 mostra representações de FACS que demonstram a expressão de CD20 humano nas células B de diferentes estágios de maduração/diferenciação (maduro, pre-B e B imaturo, pro-B e B progenitor) em medula óssea de ratinho
Tg+ . A Figura 17 mostra representações de FACS que demonstram a expressão de CD20 humano em células B esplénicas de ratinho Tg+. As células foram selecionadas em B220+ para obter células B. IgM e CD21 permitem a delimitação nos diversos subconjuntos de células B de T2/folicular, zona marginal e TI. A Figura 18 mostra representações de FACS que demonstram a expressão de CD20 humano em gânglios linfáticos mesentéricos de ratinho Tg+ (LN) . A Figura 19 mostra representações de FACS que demonstram a expressão de CD20 humano em placas de Peyer de ratinho Tg+. As células foram selecionadas com respeito a B220+. 0 marcador de CD38 distingue as células B maduras das de centro germinal. A Figura 20 perfila estudos sobre os efeitos do mAb anti-hCD20 em ratinhos CD20 humano Tg+. Foi injetado aos ratinhos 1,0 mg [equivalente a 50 mg/kg] de anticorpo anti-CD20 no dia 0 (seta preta acima da linha horizontal) e as células foram analisadas nos dias indicados por setas vermelhas abaixo da linha horizontal. Foram realizadas análises de FACS em sangue periférico, baço, gânglio linfático, medula óssea, e placas de Peyer. Foram controlados os níveis em soro de mAb anti-hCD20. A Figura 21 mostra representações de FACS que demonstram a depleção de células B de sangue periférico com mAb anti-hCD20. O painel esquerdo mostra o controlo de IgG, isto é, animais tratados com anticorpo de isotipo coincidente, não específico. A Figura 22 mostra representações de FACS que demonstram a depleção de células B de LN periféricas maduras por mAb anti-hCD20 no painel direito. O painel esquerdo mostra o controlo de IgG, isto é, animais tratados com anticorpo de isotipo coincidente, não específico. CD21+CD23+ seleciona todas as células B. A Figura 23 mostra representações de FACS que demonstram a depleção de células B T2 esplénicas, mas não células B de zona marginal, por mAb anti-hCD20. A Figura 24 mostra representações de FACS que demonstram a depleção de células B maduras em recirculação, mas não células imaturas/pre-B ou pro-B por mAb anti-hCD20. 0 vermelho representa ratinhos tratados com IgG enquanto que o verde representa tratados com mAb anti-hCD20 que expressam o hCD20 . Os ratinhos tratados com IgG (vermelho) conservaram células B maduras que expressavam hCD20, enquanto que mAb anti-hCD20 depletou as células portadoras de hCD20. A expressão de CD20 humano foi controlada com respeito a deteção de CD20 tanto não ligado como ligado a Ab. A Figura 25 mostra representações de FACS que demonstram a resistência das células B do centro germinal de placas de Peyer a mAb anti-hCD20. 0 painel esquerdo mostra células dos ratinhos tratados com IgG de controlo. 0 painel direito mostra células dos ratinhos Tg+ tratados com mAb anti-CD20. A Figura 26 mostra representações de FACS que demonstram a depleção e a recuperação de células B em sangue periférico depois do tratamento dos ratinhos Tg+ com mAb anti-hCD20. Os painéis da fila superior mostram coloração de células de ratinhos tratados com mAb de controlo. Foi administrado aos ratinhos anticorpo no dia 1. Com o tempo, as células B precursoras que não expressam hCD20 se desenvolvem a células B maduras CD20+ (veja-se coloração na semana 6 e 14). A Figura 27 mostra representações de FACS que demonstram a resistência de células B de centro germinal esplénico a tratamento com mAb anti-CD20 a curto prazo (injeção individual). No dia 8 depois da imunização de glóbulos vermelhos de ovelha para induzir a formação de centros germinais, foi tratado um grupo de ratinhos com o mAb m2H7 para CD20 humano. 0 conjunto de ratinhos de controlo foi tratado com anticorpo de controlo de isotipo mIgG2a. As células do baço dos ratinhos foram analisadas no dia 12. PNA (aglutinina de amendoim) cora o centro germinal. Não foi detetada depleção de células B de centro germinal com tratamento anti-CD20. A Figura 28 mostra representações de FACS que demonstram que as células B de zona marginal (MZ) e BI não depletadas conferem proteção a antigénios independentes de T. Nos 3 painéis à direita, as células do baço foram coradas com respeito ao polissacárido-fosfatidil colina de estreptococos (o antigénio TI) . CD138 é um marcador para células plasmáticas. A Figura 29 mostra os efeitos biológicos distintos da combinação de um antagonista de BLyS, BR3-Fc, e mAb anti-CD20, m2H7, tratamento num modelo animal como é descrito no Exemplo 4. Foi realizada análise de FACS em células B do baço, sangue, gânglio linfático (selecionadas em CD21+CD23+) . A terapêutica de combinação claramente produziu um efeito sinérgico na depleção de células B, e especialmente células B de zona marginal, T2 e foliculares no baço. A Figura 30 mostra os efeitos sinérgicos na depleção de células B da combinação de mAb anti-hCD20 e BR3-Fc nos ratinhos CD20 Tg+, como é descrito no Exemplo 4. Os ratinhos foram tratados com IgG2a de controlo, BAFFR/BR3-Fc (100 μρ/^^ηϊιο IP diário durante 12 dias), mAb anti-hCD20 (100 μρ/^^ηΐιο IP o dia 9) ou a combinação de BAFFR/BR3-Fc e mAb anti-hCD20 (mesma dosagem como grupos de tratamento individuais). Foram isolados esplenócitos B220+ no dia 13 e foram corados com respeito a CD21 e CD23. N = 5 ratinhos/grupo. A Figura 31 mostra a quantificação da depleção de células B do baço totais B220+ (todos os subconjuntos de MZ + FO + TI + T2) , células B de zona marginal (MZ) e foliculares (FO) de ratinhos hCD20 Tg+ como é descrito no Exemplo 4 e a Fig. 30 exceto que os ratinhos foram tratados com doses individuais de 0,1 mg de IgG2a de controlo, BAFFR/BR3-Fc ou mAb anti-hCD20 . Os esplenócitos foram analisados no dia 4. N = 5 ratinhos/grupo.
As Figuras 32A-C mostram a sequência de aminoácidos de 17 unidades selecionadas de bibliotecas de apresentação de fagos para ligação de BLyS de alta afinidade.
Descrição detalhada das formas de realização preferidas
Embora o tratamento de MAb anti-CD20 deplete certos subconjuntos de células B, foi observado previamente que são conservadas as células B de zona marginal, células B de centro germinal e células plasmáticas. pelo contrário, o bloqueio das sinais de sobrevivência de células B com BR3-Fc também depleta células B ou modula os números de células B, mas em diferente magnitude. Acredita-se que BR3 afeta à sobrevivência de todas as células B. Descobriu-se a partir das experiências descritas no presente documento que a administração de uma combinação de anticorpo anti-CD20 com um antagonista de BLyS produziu resultados surpreendentemente sinérgicos em depleção de células B in vivo. A combinação de anticorpo anti-CD20 e terapêuticas dirigidas contra a rota de BLyS proporciona um novo método para tratar doenças mediadas por células B incluindo tumores malignos baseados em células B e distúrbios autoimunes regulados por células B. A terapêutica de combinação de anticorpo anti-CD20 com antagonista de BLyS pode oferecer alternativas eficazes e menos tóxicas aos tratamentos existentes para certas doenças, por exemplo, leucemia linfocitica crónica (CLL) e linfoma linfocitico pequeno (SLL).
Uma "doença autoimune" no presente documento é uma doença ou distúrbio não maligno que surge de e se dirige contra os próprios (auto) antigénios e/ou tecidos do indivíduo.
Como é utilizada no presente documento, "depleção de células B" refere-se a uma redução nos níveis de células B num animal ou ser humano depois de tratamento farmacológico ou de anticorpos, em comparação com o nível antes do tratamento. Os níveis de células B podem ser medidos utilizando ensaios bem conhecidos tais como obter uma contagem de sangue completo, por coloração de análise de FACS para marcadores de células B conhecidos, e por métodos tais como os descritos nos Exemplos Experimentais. A depleção de células B pode ser parcial ou completa. Numa forma de realização, a depleção de células B que expressam CD20 é de pelo menos 25 %. Num paciente que recebe um fármaco que depleta células B, as células B geralmente são depletadas durante o tempo em que o fármaco está em circulação no corpo do paciente e o tempo de recuperação de células B. 0 antigénio "CD20" é uma fosfoproteína transmembrana não glicosilada com uma massa molecular de cerca de 35 kD que se encontra na superfície de mais de 90% das células B de sangue periférico ou órgãos linfoides. CD20 é expresso durante o desenvolvimento de células pré-B e permanece até a diferenciação de células plasmáticas; não é encontrado em células estaminais humanas, células progenitoras linfoides ou células plasmáticas normais. CD20 está presente tanto em células B normais como em células B malignas. Outros nomes para CD20 na bibliografia incluem "antigénio de diferenciação restringido a linfócitos B" e "Bp35". O antigénio CD20 que é descrito, por exemplo, em Clark e Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149 (1989) e Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19) : 11282-11287 (1989) . O anticorpo de ligação a CD20 e anticorpo anti-CD20 são utilizados de forma permutável no presente documento e abrangem todos os anticorpos que se ligam a CD20 com suficiente afinidade de modo que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico na direção a uma célula que expressa o antigénio, e não reage de forma cruzada significativamente com outras proteínas tais como uma proteína de controlo negativo nos ensaios descritos posteriormente. Também são contemplados anticorpos biespecíficos em que um braço do anticorpo se liga a CD20. Também estão abarcados pela presente definição de anticorpo de ligação a CD20 fragmentos funcionais dos anticorpos precedentes. 0 anticorpo de ligação a CD20 se ligará a CD20 com uma Kd de < 10 nM. Em formas de realização preferidas, a ligação é uma Kd de < 7,5 nM, mais preferentemente < 5 nM, ainda mais preferentemente entre 1-5 nM, mais preferentemente < 1 nM.
Os exemplos de anticorpos que se ligam ao antigénio CD20 incluem: "C2B8" que é denominado agora "Rituximab" ("RITUXAN®") (Patente dos Estados Unidos N° 5.736.137); o anticorpo murino 2B8 marcado com itrio-[90] designado "Y2B8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (Patente dos Estados Unidos N° 5.736.137); IgG2a murino "Bi", também denominado "Tositumomab" (Beckman Coulter) opcionalmente marcado com 131I para gerar o anticorpo "131I-B1" (iodo 1131 tositumomab, BEXXAR™) (Patente dos Estados Unidos N° 5.595.721); anticorpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69(2) : 584-591 (1987) e variantes do mesmo incluindo "com pensos marco conservados" ou 1F5 humanizado (documento W003/002607, Leung, S.); depósito de ATCC HB-96450); 2H7 murino e anticorpo 2H7 quimérico (Patente dos Estados Unidos N° 5.677.180); 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab, Dinamarca); AME-133 (Applied Molecular Evolution); anticorpo A20 ou variantes do mesmo tais como o anticorpo A20 quimérico humanizado (cA20, hA20, respetivamente) (documento US 2003/0219433, Immunomedics); e anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl ou NU-B2 disponíveis do International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al. , em: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)).
Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" no presente documento referem-se ao anticorpo monoclonal humano/murino quimérico obtido por engenharia genética dirigido contra o antigénio CD20 e designado "C2B8" na Patente dos Estados Unidos N° 5.736.137, incluindo fragmentos do mesmo que conservam a capacidade para se ligar a CD20.
Numa forma de realização específica, os anticorpos anti-CD20 se ligam a CD20 humano e de primata. Em formas de realização específicas, os anticorpos que se ligam a CD20 são humanizados ou quiméricos. Os anticorpos que se ligam a CD20 incluem rituximab (RITUXAN®) , m2H7 (2H7 murino), hu2H7 (2H7 humanizado) e todas sus variantes funcionais, incluindo sem limitação, hu2H7.vl6 (v significa versão) , v31, v73, v75, assim como variantes deficientes em fucose. As sequências de alguns dos anticorpos de variante hu2H7 são proporcionadas a seguir, sendo as sequências N-terminal em negrita a sequência líder que se retira no polipéptido maduro: hu2H7.vl6 cadeia L [232 aa] (SEQ ID N° 3)
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS SSVSYMHWYQQKPGK APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC hu2H7.vl6 cadeia H [471 aa] (SEQ ID N° 4)
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWY
YSNSYWYFDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHHAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK hu2H7.v31 cadeia H [471 aa] SEQ ID N° 11:
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRIjSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNAT YRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAP IAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK A cadeia L de v31 é a mesma que a de vl6 anterior, isto é, SEQ ID N° 3.
Unicamente para os fins do presente documento, "2H7v.l6 humanizado" refere-se a um anticorpo intacto ou fragmento de anticorpo que compreende a sequência de cadeia leve variável:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIICR (SEQ ID N°: 13); e sequência de cadeia variável:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKF
KGRFnSVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N°: 14).
Quando o anticorpo 2H7v.l6 humanizado é um anticorpo intacto, preferentemente compreende a sequência de aminoácidos de cadeia leve vl6:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG
TDFT^SSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTK\raiKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL
NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N° 15); e sequência de aminoácidos de cadeia pesada vl6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFfSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKF
KGRFnSVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGP
SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°: 16). A região V de todas as outras variantes baseadas na versão 16 terão as sequências de aminoácidos de vl6 exceto nas posições de substituições de aminoácidos que se indicam no quadro a seguir. A menos que seja indicado de outro modo, as variantes 2H7 terão a mesma cadeia L que a de vl6.
Uma variante do mAb 2H7 humanizado precedente é 2H7v.31 que tem a mesma sequência de cadeia L que SEQ ID N° : 15 anterior, com a sequência de aminoácidos de cadeia H:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTS YNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARWY YSNSYWYFDWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVWHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGKVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°: 17) 0 anticorpo murino anti-CD20 humano, m2H7, tem a sequência VH:
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWYYSNSYWYFDVWGTGTTVTV S (SEQ ID N°: 23) E sequência VL:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELK (SEQ ID N°: 24) A menos que seja indicado, as sequências reveladas no presente documento do 2H7v.l6 humanizado e variantes do mesmo são do polipéptido maduro, isto é, sem a sequência líder.
As patentes e publicações de patente que referem-se aos anticorpos de CD20 incluem as Patentes de Estados Unidos N° 5.776.456, 5.736.137, 5.843.439, 6.399.061 e 6 . 682.734, assim como os pedidos de Patente dos Estados Unidos N° US 2 0 02/01972 55A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 Al, US 2003/0095963 Al, US 2003/0147885 Al (Anderson et al.); Patente dos Estados Unidos N° 6.455.043B e documento WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); documentos WOOO/27428 (Grillo-López e
White); WO00/27433 (Grillo-López e Leonard); WOOO/44788 (Braslawsky et al.); W001/10462 (Rastetter, W.); W001/10461 (Rastetter e White); W001/10460 (White e Grillo-Lopez); US2001/0018041A1, US2003/0180292A1, WOOl/34194 (Hanna e Hariharan); Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0006404 e documento W002/04021 (Hanna e Hariharan); Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0012665 AI e documento WOO 1/74388 (Hanna, N. ) ; Pedido dos Estados Unidos N° US 2002/0058029 AI (Hanna, N.); Pedido dos Estados Unidos N° 2003/0103971 AI (Hariharan e Hanna); Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0009444A1, e documento W001/80884 (Grillo-López, A.); documento WOOl/97858 (White, C.); Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0128488A1 e documento W002/34790 (Reft, M.); documentos W002/060955 (Braslawsky et ai.); WO2/096948 (Braslawsky et al.); WO02/079255 (Reft e Davies); Patente dos Estados Unidos N° 6.171.586B1, e documento W098/56418 (Lam et al.); documentos W098/58964 (Raju, S.); W099/22764 (Raju, S.); W099/51642, Patente dos Estados Unidos N° 6.194.551B1, Patente dos Estados Unidos N° 6.242.195B1, Patente dos Estados Unidos N° 6.528.624B1 e Patente dos Estados Unidos N° 6.538.124 (Idusogie et al.); documentos WO00/42072 (Presta, L.); WOOO/67796 (Curd et al.); W001/03734 (Grillo-López et al.); Pedido dos Estados Unidos N° US 2002/0004587A1 e documento WO01/77342 (Miller e Presta); Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0197256 (Grewal, I.); Pedido dos Estados Unidos N° US 2003/0157108 Al (Presta, L.); Patentes de Estados Unidos N° 6.565.827B1, 6.090.365B1, 6.287.537B1, 6.015.542, 5.843.398 e 5.595.721, (Kaminski et al.); Patentes de Estados Unidos N° 5.500.362, 5.677.180, 5.721.108, 6.120.767, 6.652.852B1 (Robinson et al.); Patente dos Estados Unidos N° 6.410.391B1 (Raubitschek et al.) ; Patente dos Estados Unidos N° 6.224.866B e documento WO00/20864 (Barbera-Guillem, E.); documentos WOOl/13945 (Barbera-Guillem, E.); WOOO/67795 (Goldenberg); Pedido dos Estados Unidos N° US 2003/0133930 Al e documento WOOO/74718 (Goldenberg e Hansen); documentos WOOO/76542 (Golay et al.); WO01/72333 (Wolin e Rosenblatt); Patente dos Estados Unidos N° 6.368.596B 1 (Ghetie et al.); Patente dos Estados Unidos N° 6.306.393 e Pedido dos Estados Unidos N° US2002/0041847 Al,
(Goldenberg, D.); Pedido dos Estados Unidos N° US2003/0026801A1 (Weiner e Hartmann); documento W002/102312 (Engleman, E.); Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2003/0068664 (Albitar et al.); documento W003/002607 (Leung, S.); documentos WO 03/049694, US2002/0009427A1, e US 2003/0185796 Al (Wolin et al.); W003/061694 (Sing e Siegall); US 2003/0219818 Al (Bohen et al.); US 2003/0219433 Al e WO 03/068821 (Hansen et al.); US2003/0219818A1 (Bohen et al.); US2002/0136719A1 (Shenoy et al.); W02004/032828 (Wahl et al.) . Veja-se também Patente dos Estados Unidos N° 5.849.898 e pedido EP N° 330.191 (Seed et al.); Patente dos Estados Unidos N°
4.861.579 e documentos EP332.865A2 (Meyer e Weiss); USP
4.861.579 (Meyer et al.); W095/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 Al (Hansen et al.) .
Os anticorpos de CD20 podem ser anticorpos nus ou conjugados com um composto citotóxico tal como um radioisótopo ou uma toxina. Os ditos anticorpos incluem o anticorpo Zevalin™ que se liga ao radioisótopo, Itrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) e Bexxar™ que se conjuga com 1-131 (Corixa, WA) . As variantes de 2H7 humanizadas incluem que têm substituições de aminoácidos na FR e variantes de maduração de afinidade com mudanças nas CDR enxertadas. Os aminoácidos substituídos na CDR ou FR não se limitam aos presentes no anticorpo dador ou aceitador. Em outras formas de realização, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem além disso mudanças em resíduos de aminoácidos na região Fc que levam à função efectora melhorada incluindo função CDC e/ou ADCC potenciada e destruição de células B (também denominada no presente documento depleção de células B). Em particular, foram identificados três mutações para melhorar a atividade CDC e ADCC: S298A/E333A/K334A (também denominado no presente documento um mutante ou variante de triple Ala; a numeração na região Fc é de acordo com o sistema de numeração de EU; Rabat et al., mencionado anteriormente) como foi descrito (Idusogie et al., mencionado anteriormente (2001); Shields et al., mencionado anteriormente).
Outros anticorpos anti-CD20 da invenção incluem aqueles que têm as mudanças específicos que melhoram a estabilidade. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CD20 quimérico tem regiões V murinas e região C humana. Um dos ditos anticorpos anti-CD20 quimérico específico é Rituxan® (Rituximab®; Genentech, Inc.). Rituximab e hu2H7 pode mediar na lise de células B tanto por meio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) como por meio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) . São descritos variantes de anticorpo com sequências de aminoácidos de região Fc alterada e capacidade de ligação a Clq aumentada ou reduzida na Patente dos Estados Unidos N° 6.194.551B1 e documento W099/51642. Veja-se, também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) . O documento WO00/42072 (Presta) descreve variantes polipeptidicas com ligação melhorada ou reduzida a FcR: Veja-se, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) . O local de glicosilação N em IgG está em Asn297 no domínio CH2 . São incluídos no presente documento anticorpos de ligação a CD20 humanizados que têm uma região Fc, nos quais cerca do 80-100 % (e preferentemente cerca de 90-99 %) do anticorpo na composição compreende uma estrutura de hidratos de carbono central madura que não possui fucose, ligada à região Fc da glicoproteína. Os ditos anticorpos mostram melhora na ligação com FcyRIIIA(F158), que não é tão eficaz como FcyRIIIA (V158) na interação com IgG humano. O termo "anticorpo" é utilizada no sentido mais amplo e abrange especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpos. De acordo com algumas formas de realização, um polipéptido se fusiona numa estrutura de anticorpo, por exemplo, na região variável ou numa CDR de modo que o anticorpo possa se ligar a e inibir a ligação de BLyS com BR3 ou a sinalização de BLyS. Os anticorpos que compreendem um polipéptido da presente invenção podem ser quiméricos, humanizados ou humanos. Os anticorpos que compreendem um polipéptido podem ser um fragmento de anticorpo. Os ditos anticorpos e métodos para gerá-los são descritos em mais detalhe posteriormente. Como alternativa, um anticorpo da presente invenção pode ser produzido imunizando um animal com um polipéptido. Portanto, contempla-se um anticorpo dirigido contra um polipéptido revelado no presente documento. A expressão "anticorpo monoclonal" como é utilizada no presente documento refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de origem natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, se dirigindo contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal se dirige contra um único determinante no antigénio. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque são sintetizados pela cultura de hibridoma, que não está contaminado por outras imunoglobulinas. 0 modificador "monoclonal" indica como o carácter do anticorpo que é obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser interpretada que requer a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para utilizar de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser preparados por meio de métodos de ADN recombinante (veja-se, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al. , J. Mol. Biol. , 222: 581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga de sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o resíduo da cadeia ou as cadeias são idênticas ou homólogas a sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos dos ditos anticorpos, desde que mostram a atividade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). São conhecidos na técnica métodos para preparar anticorpos quiméricos.
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação a antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais são substituídos resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recetor por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como um ratinho, rato ou coelho, que têm a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura conservada (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não estão nem no anticorpo recetor nem nas sequências de CDR ou estrutura conservadas importadas. Estas modificações são realizadas para refinar adicionalmente e maximizar o rendimento do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. 0 número destas substituições de aminoácidos na FR são tipicamente não mais de 6 na cadeia H, e na cadeia L, não mais de 3. 0 anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja-se Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992) . 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo PREMATIZED em que a região de ligação a antigénio do anticorpo deriva de um anticorpo produzido, por exemplo, imunizando macacos com o antigénio de interesse. São conhecidos na técnica métodos para preparar anticorpos humanizados.
Também podem ser produzidos anticorpos humanos utilizando diversas técnicas conhecidas neste campo, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991) . As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos . Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al. , J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).
Os "fragmentos funcionais" dos anticorpos de ligação a CD20 da invenção são os fragmentos que conservam a ligação com CD20 substancialmente com a mesma afinidade que a molécula de cadeia completa intacta da que derivam e são capazes de depletar células B como é medido por ensaios in vitro ou in vivo tais como os descritos no presente documento.
As "funções efetoras" do anticorpo referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Os exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação com Clq e citotoxicidade dependente de complemento; ligação com o recetor de Fc; citotoxicidade mediada por células independente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos recetores de superfície celular (por exemplo, recetor de células B) ; e ativação de células B. A "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na que a Ig secretada ligada a recetores de Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo células Citolíticas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo portadora de antigénio e posteriormente destruam a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são requeridas absolutamente para a dita destruição. As células primárias para mediar em ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRI11. A expressão de FcR em células hematopoiéticas se resume no Quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente dos Estados Unidos 5.500.362 ou 5.821,337. As células efetoras úteis para os ditos ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Citolíticas Naturais (NK) . Como alternativa, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como o revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) . A "citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo em presença de complemento. A ativação da rota clássica do complemento se inicia pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Clq) com anticorpos (da subclasse apropriada) que se ligam a seu antigénio afim. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo, como é descrito em Gazzano-Santoro et ai. , J. Immunol. Methods 202 : 163 (1996),
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas ou outros solutos proteicos ou não proteicos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95 % em peso do anticorpo como é determinado pelo método de Lowry, e mais preferentemente mais de 99 % em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N terminal ou interna por meio do utilização de um sequenciador de copa giratória, ou (3) até sua homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomasie, preferentemente, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Habitualmente, no entanto, será preparado anticorpo isolado por pelo menos uma etapa de purificação.
As expressões "BLyS", "polipéptido BLyS", "TALL-1" ou "polipéptido TALL-1", "BAFF" quando são utilizados no presente documento abrangem "polipéptidos de BLyS de sequência nativa" e "variantes de BLyS". "BLyS" é uma designação que se da aos polipéptidos que estão codificados por qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas a seguir:
Sequência de BLyS humana (Fig. 3; SEQ ID N° _) 1 mddstereqs rltsclkkre emklkecvsi lprkespsvr sskdgkllaa tlllallscc 61 ltvvsfyqva alqgdlaslr aelqghhaek lpagagapka gleeapavta glkifeppap 121 gegnssqnsr nkravqgpee tvtqdclqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee 181 kenkilvket gyffiygqvl ytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl 241 pnnscysagi akleegdelq laiprenaqi sldgdvtffg alkll
Sequência de BLyS de ratinho (SEQ ID N° _) 1 mdesaktlpp pclcfcsekg edmkvgydpi tpqkeegawf gicrdgrlla atlllalls 61 sftamslyql aalqadlmnl rmelqsyrgs atpaaagape ltagvklltp aaprphnssr 121 ghmrrafqg peeteqdvdl sappapclpg crhsqhddng mnlrniiqdc lqliadsdtp 181 tirkgtytfv pwllsfkrgn aleekenkiv vrqtgyffiy sqvlytdpif amghviqrkk 241 vhvfgdelsl vtlfrciqnm pktlpnnscy sagiarleeg deiqlaipre naqismgdd 301 tffgalkll e na Figura 3 e homólogos e fragmentos e variantes dos mesmos, que têm a atividade biológica do BLyS de sequência nativa. Uma atividade biológica de BLyS pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em promoção da sobrevivência de células B, promoção da maduração de células B e ligação com BR3. As variantes de BLyS terão preferentemente pelo menos 80 % ou qualquer número inteiro sucessivo até 100 %, incluindo, mais preferentemente, pelo menos 90 %, e ainda mais preferentemente, pelo menos 95 % de identidade de sequência aminoácidos com uma sequência nativa de um polipéptido BLyS. Um polipéptido BLyS de "sequência nativa" compreende um polipéptido que tem a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido BLyS correspondente derivado da natureza. Por exemplo, BLyS existe numa forma solúvel depois de clivagem da superfície celular por proteases de tipo furina. Os ditos polipéptidos BLyS de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. A expressão "polipéptido BLyS de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas ou secretadas de origem natural (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de origem natural (por exemplo, formas de splice alternativo) e variantes alélicas de origem natural do polipéptido. O termo "BLyS" inclui os polipéptidos descritos em Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65: 680 (1999); N° de referência de GenBank AF136293; documento W098/18921 publicado em 7 de maio de 1998; documento EP 869.180 publicado em 7 de outubro de 1998; documento W098/27114 publicado em 25 de junho de 1998; documento W099/12964 publicado em 18 de março de 1999; documento WO99/33980 publicado em 8 de julho de 1999; Moore et al., Science, 285: 260-263 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189: 1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274: 15978-15981 (1999). A expressão "antagonista de BLyS" como é utilizada no presente documento é utilizada em seu sentido mais amplo, e inclui qualquer molécula que (1) se ligue a um polipéptido do BLyS de sequência nativa ou se ligue a um polipéptido BR3 de sequência nativa para bloquear parcial ou completamente a interação de BR3 com o polipéptido BLyS, e (2) bloqueie, iniba ou neutralize parcial ou completamente a sinalização de BLyS de sequência nativa. A sinalização do polipéptido BLyS de sequência nativa promove, entre outras coisas, a sobrevivência de células B e maduração de células B. A inibição, bloqueio ou neutralização da sinalização de BLyS resulta, entre outras coisas, uma redução do número de células B. Um antagonista de BLyS de acordo com a presente invenção bloqueará, inibirá ou neutralizará parcial ou completamente uma ou mais atividades biológicas de um polipéptido BLyS, in vitro ou in vivo. Numa forma de realização, um BLyS biologicamente ativo potência qualquer um ou uma combinação dos seguintes acontecimentos in vitro ou in vivo: uma sobrevivência aumentada de células B, um nível aumentado de IgG e/ou IgM, um número aumentado de células plasmáticas e processamento de NF-Kb2/100 a p52 NF-Kb em células B plasmáticas (por exemplo, Batten, M et al., (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465; Moore, et al., (1999) Science 285: 260-263; Kayagaki, et al., (2002) 10: 515-524) . São descritos no presente documento vários ensaios úteis para ensaiar antagonistas do BLyS.
Como foi mencionado anteriormente, um antagonista de BLyS pode agir de uma maneira direta ou indireta para bloquear, inibir ou neutralizar parcial ou completamente a sinalização de BLyS, in vitro ou in vivo. Por exemplo, o antagonista de BLyS pode se ligar diretamente com BLyS. Por exemplo, são contemplados os anticorpos anti-BLyS que se ligam dentro de uma região de BLyS humano que compreende os resíduos de 162-275 e/ou um resíduo adjacente de um resíduo selecionado a partir do grupo que consiste em 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 e 265 de BLyS humano de modo que o anticorpo impeça estericamente a ligação de BLyS com BR3. Em outro exemplo, um agente de ligação direto é um polipéptido que compreende o domínio extracelular de um recetor de BLyS tal como TACI, BR3 e BCMA. Em outro exemplo, os antagonistas de BLyS incluem os polipéptidos que têm uma sequência da de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32, como é descrito no presente documento. Como alternativa, o antagonista de BLyS pode se ligar a um domínio extracelular de um BR3 de sequência nativa em sua região de ligação a BLyS para bloquear, inibir ou neutralizar parcial ou completamente a ligação de BLyS com BR3 in vitro, in situ ou in vivo. Por exemplo, o dito antagonista indireto é um anticorpo anti-BR3 que se liga numa região de BR3 que compreende os resíduos 23-38 de BR3 humano ou uma região adjacente de esses resíduos de modo que a ligação de BR3 humano com BLyS esteja impedida estericamente.
Em algumas formas de realização, um antagonista de BLyS inclui anticorpos anti-BLyS, imunoadesinas e moléculas pequenas. Numa forma de realização adicional, a imunoadesina compreende uma região de ligação a BLyS de um recetor de BLyS (por exemplo, um domínio extracelular de BR3, BCMA ou TACI). Numa forma de realização adicional mais, a imunoadesina é BR3-Fc, ou polipéptidos que têm uma sequência da de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°
7) , ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID NO 8) , ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9) ou sequências enumeradas na FIG. 32, opcionalmente, fusionadas ou conjugadas com uma parte Fc de uma imunoglobulina.
De acordo com uma forma de realização o antagonista de BLyS se liga a um polipéptido BLyS ou um polipéptido BR3 com uma afinidade de ligação de 100 nM ou menos. De acordo com outra forma de realização, o antagonista de BLyS se liga a um polipéptido BLyS ou um polipéptido BR3 com uma afinidade de ligação de 10 nM ou menos. De acordo com mais outra forma de realização, o antagonista de BLyS se liga a um polipéptido BLyS ou um polipéptido BR3 com uma afinidade de ligação de 1 nM ou menos.
As expressões "BR3", "polipéptido BR3" ou "recetor BR3" quando são utilizados no presente documento abrangem "polipéptidos BR3 de sequência nativa" e "variantes de BR3" (que são definidos adicionalmente no presente documento). "BR3" é uma designação dada aos polipéptidos que compreende qualquer uma das sequências polinucleotidicas e homólogos das mesmas: (a) sequência de BR3 humana (SEQ ID N°:_)
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ 61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD 121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG 181 PEQQ (b) sequência de BR3 humana alternativa (SEQ ID N°:_)
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGAAS SPAPRTALQP 61 QESVGAGAGE AALPLPGLLF GAPALLGLAL VLALVLVGLV SWRRRQRRLR GASSAEAPDG 121 DKDAPEPLDK VIILSPGISD ATAPAWPPPG EDPGTTPPGH SVPVPATELG STELVTTKTA
181 GPEQQ (c) sequência de BR3 murina (SEQ ID N°:_)
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPDTGHTS SLEPGTALQP 61 QEGSALRPDV ALLVGAPALL GLILALTLVG LVSLVSWRWR QQLRTASPDT SEGVQQESLE 121 NVFVPSSETP HASAPTWPPL KEDADSALFR HSVPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ (d) sequência de BR3 de rato (SEQ ID N°:_)
1 MGVRRLRVRS RRSRDSPVST QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FYTPETRHAS SLEPGTALQP 61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALL GLVLALTLVG LVSLVGWRWR QQRRTASLDT SEGVQQESLE 121 NVFVPPSETL HASAPNWPPF KEDADNILSC HSIPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ e variantes ou fragmentos das mesmas. Os polipéptidos BR3 podem ser isolados de uma diversidade de fontes, tais como de tipos de tecido humanos ou de outra fonte, ou ser preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo BR3, inclui os polipéptidos BR3 descritos nos documentos WO 02/24909 e WO 03/14294 .
Um polipéptido BR3 de "sequência nativa" compreende um polipéptido que tem a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido BR3 correspondente derivado da natureza. Os ditos polipéptidos BR3 de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. A expressão "polipéptido BR3 de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas, solúveis ou secretadas de origem natural (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de origem natural (por exemplo, formas de splice alternativo) e variantes alélicas de origem natural do polipéptido. Os polipéptidos BR3 da invenção incluem o polipéptido BR3 que compreende ou consiste na sequência contígua dos resíduos de aminoácidos 1 a 184 de um BR3 humano.
Um "domínio extracelular" ou "ECD" de BR3 refere-se a uma forma do polipéptido BR3 que está essencialmente sem os domínios transmembrana e citoplasmático. As formas ECD de BR3 incluem que compreendem um qualquer dos aminoácidos 1 a 77, 2 a 62, 2-71, 1-61 e 2-63 de BR3.
Mini-BR3 é uma região central de 26 resíduos do domínio de ligação a BLyS de BR3: TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR (SEQ ID:_). "Variante de BR3" significa um polipéptido BR3 que tem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um BR3 de comprimento completo ou ECD de BR3 de sequência nativa e se liga a um polipéptido BLyS de sequência nativa. Opcionalmente, a variante de BR3 inclui um único domínio rico em cisterna. Os ditos polipéptidos variantes de BR3 incluem, por exemplo, polipéptidos BR3 nos quais são adicionados, ou suprimam, um ou mais resíduos de aminoácidos, na extremidade N e/ou C terminal, assim como dentro de um ou mais domínios internos, da sequência de aminoácidos de comprimento completa. Também são contemplados fragmentos de ECD de BR3 que se ligam a um polipéptido BLyS de sequência nativa. Habitualmente, um polipéptido variante de BR3 terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 81 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 82 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 83 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 84 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 85 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 86 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 87 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 88 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 8 9 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 91 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 92 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 93 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 94 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 96 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 97 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 98 % de identidade de sequência de aminoácidos e ainda mais preferentemente pelo menos cerca de 99 % de identidade sequência de aminoácidos com um polipéptido BR3 humano ou um fragmento específico do mesmo. Os polipéptidos variantes de BR3 não abrangem a sequência de polipéptido BR3 nativa. Habitualmente, os polipéptidos variantes de BR3 são pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente de pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.
As expressões "TACI" ou "polipéptido TACI" ou "recetor TACI" quando são utilizados no presente documento abrangem "polipéptidos TACI de sequência nativa" e "variantes de TACI" (que são definidos adicionalmente no presente documento). "TACI" é uma designação dada aos polipéptidos que compreendem as sequências de aminoácidos das Figuras 1A-1B, aminoácidos 1-246 da Figura 5B e as sequências de aminoácidos da Figura 8, polipéptidos que estão codificados por moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de polinucleótido mostrada nas Figuras 1A-1B e 5A e homólogos, variantes e fragmentos das mesmas, moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência mostrada nas Figuras 1A-1B e 5A e variantes das mesmas assim como fragmentos dos anteriores. Os polipéptidos TACI da invenção podem ser isolados de uma diversidade de fontes, tais como de tipos tissulares humanos ou de outra fonte, ou ser preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos.
Um polipéptido TACI de "sequência nativa" compreende um polipéptido que tem a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido TACI correspondente derivado da natureza. Os ditos polipéptidos TACI de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. A expressão "polipéptido TACI de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas, solúveis ou secretadas de origem natural (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de origem natural (por exemplo, formas de splice alternativo) e variantes alélicas de origem natural do polipéptido. Os polipéptidos TACI incluem mas sem limitação os polipéptidos descritos em von Bulow et al., mencionado anteriormente e documento W098/39361 publicado em 11 de setembro de 1998, a variante de splice (denominada "hTACI(265)" anteriormente e mostrada na Figura 8, compreendendo o polipéptido TACI a sequência contígua dos resíduos de aminoácidos 1-293 da Figura 8).
Um "domínio extracelular" ou "ECD" de TACI refere-se a uma forma do polipéptido TACI que está essencialmente sem os domínios transmembrana e citoplasmático. As formas ECD do TACI incluem as descritas em von Bulow et al., mencionado anteriormente, documentos WO 98/39361, WO 00/40716, WO 01/85782, WO 01/87979, WO 01/81417, resíduos de aminoácidos 1-166 da Figura 1, resíduos de aminoácidos 1-165 da Figura 1, resíduos de aminoácidos 1-154 da Figura 1, resíduos de aminoácidos 1-114 da Figura 1, resíduos de aminoácidos 1-119 da Figura 5B, resíduos de aminoácidos 1-120 da Figura 5B, e resíduos de aminoácidos 1-126 da Figura 5B. A "variante TACI" significa um polipéptido TACI que tem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um TACI de comprimento completo ou ECD de TACI de sequência nativa e se liga a um polipéptido BlyS de sequência nativa. Os ditos polipéptidos variantes de TACI incluem, por exemplo, polipéptidos TACI nos que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou suprimidos, na extremidade N e/ou C terminal, assim como dentro de um ou mais domínios internos, da sequência de aminoácidos de comprimento completa. Também são contemplados fragmentos do ECD de TACI que se ligam a um polipéptido BlyS de sequência nativa. Habitualmente, um polipéptido variante de TACI terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 81 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 82 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 83 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 84 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 85 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 86 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 87 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 88 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 8 9 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 91 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 92 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 93 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 94 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 96 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 97 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 98 % de identidade de sequência de aminoácidos e ainda mais preferentemente pelo menos cerca de 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido TACI codificado por uma molécula de ácido nucleico mostrada na Figura IA ou um fragmento específico da mesma. Os polipéptidos variantes de TACI não abrangem a sequência do polipéptido TACI nativa. Habitualmente, os polipéptidos variantes de TACI são de pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente de pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.
As expressões "BCMA" ou "polipéptido BCMA" ou "recetor BCMA" quando são utilizados no presente documento abrangem "polipéptidos BCMA de sequência nativa" e "variantes de BCMA" (que são definidos adicionalmente no presente documento). "BCMA" é uma designação dada aos polipéptidos que estão codificados pelas moléculas de ácido nucleico que compreendem as sequências polinucleotídicas mostradas na Figura 2 e variantes das mesmas, moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência mostrada na Figura 2 e variantes das mesmas assim como fragmentos do anterior. Os polipéptidos BCMA da invenção podem ser isolados de uma diversidade de fontes, tais como de tipos tissulares humanos ou de outra fonte, ou ser preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos.
Um polipéptido BCMA de "sequência nativa" compreende um polipéptido que tem a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido BCMA correspondente derivado da natureza. Os ditos polipéptidos BCMA de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. A expressão "polipéptido BCMA de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas ou secretadas de origem natural (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de origem natural (por exemplo, formas de splice alternativo) e variantes alélicas de origem natural do polipéptido. Os polipéptidos BCMA da invenção incluem os polipéptidos descritos em Laabi et al. , EMBO J. , 11: 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22: 1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995); Madry et al., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998); e o polipéptido BCMA que compreende a sequência contígua dos resíduos de aminoácidos 1-184 da Fig. 2 (SEQ ID N° : 4) .
Um "domínio extracelular" ou "ECD" de BCMA refere-se a uma forma do polipéptido BCMA que está essencialmente sem os domínios transmembrana e citoplasmático. As formas ECD de TACI incluem as descritas em Laabi et al., EMBO J., 11: 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Re s ., 22: 1147-1154 (1994); Gras et al. , Int. Immunology, 7: 1093-1106 (1995) ; Madry et al., Int. Immunology, 10: 1693-1702 (1998), resíduos de aminoácidos 4-55 da Figura 2, resíduos de aminoácidos 1-48 da Figura 2, resíduos de aminoácidos 8-41 da Figura 2, resíduos de aminoácidos 4-51 da Figura 2 ou resíduos de aminoácidos 21-53 da Figura 2. "Variante BCMA" significa um polipéptido BCMA que tem pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um BCMA ou ECD de BCMA de sequência nativa e se liga a um polipéptido BlyS de sequência nativa. Os ditos polipéptidos variantes de BCMA incluem, por exemplo, polipéptidos BCMA nos que são adicionados, ou suprimen, um ou mais resíduos de aminoácidos, na extremidade N e/ou C terminal, assim como dentro de um ou mais domínios internos, da sequência de aminoácidos de comprimento completa. Também são contemplados fragmentos do ECD de BCMA que se ligam a um polipéptido BlyS de sequência nativa. Habitualmente, um polipéptido variante de BCMA terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 81 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 82 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 83 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 84 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 85 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 86 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 87 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 88 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 8 9 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 91 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 92 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 93 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 94 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 96 % de identidade de sequência de aminoácidos mais preferentemente pelo menos cerca de 97 % de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 98 % de identidade de sequência de aminoácidos e ainda mais preferentemente pelo menos cerca de 99 % de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido BCMA codificado por uma molécula de ácido nucleico mostrada na Figura 2 ou um fragmento especifico da mesma. Os polipéptidos variantes BCMA não abrangem a sequência do polipéptido BCMA nativa. Habitualmente, os polipéptidos variantes de BCMA são de pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, frequentemente de pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente de pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais. BAFF é expresso em baço, gânglios linfáticos, PBL, monócitos, macrófagos, DC, células T, K562, HL-60 e G361. APRIL é expresso debilmente em baço, pâncreas, cólon. APRIL é expresso em PBL e diversos tecidos e linhas celulares tumorais. BCMA é expresso em baço, gânglios linfáticos, timo, PBL, fígado, glândulas adrenais e células B. TACI é expresso em baço, timo, PBL, intestino delgado, células B e células T ativadas. BAFF-R é expresso em baço, gânglios linfáticos, timo, PBL, células B. BAFF-R é expresso em níveis baixos em células T em repouso (Mackay e Browning, julho de 2002, Nature Reviews, Immunology, 2: 465-475) .
Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de sus cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nova York (1975)): (1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P) , Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares sem carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (E), Asn (N), Gin (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)
Como alternativa, os resíduos de origem natural podem ser divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influem na orientação de cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Entende-se que a expressão substituição de aminoácidos "conservativa" como é utilizada dentro da presente invenção refere-se a substituições de aminoácidos que substituem aminoácidos funcionalmente equivalentes. As mudanças de aminoácidos conservatives resultam em mudanças silenciosas na sequência de aminoácidos do péptido resultante. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de uma polaridade similar agem como equivalentes funcionais e resultam em uma alteração silenciosa dentro da sequência de aminoácidos do péptido. Em geral, as substituições dentro um grupo podem ser consideradas conservativas com respeito à estrutura e função. No entanto, o perito na especialidade reconhecerá que o papel de um resíduo particular é determinado por seu contexto dentro da estrutura tridimensional da molécula na que aparece. Por exemplo, podem aparecer resíduos Cys em forma oxidada (dissulfureto), que é menos polar que a forma reduzida (tiol) . Aparte alifática longa da cadeia lateral Arg pode constituir uma característica crítica de seu papel funcional ou estrutural, e esta pode ser conservada melhor por substituição de um resíduo não polar, melhor que outro básico. Além disso, se reconhecerá que as cadeias laterais que contêm grupos aromáticos (Trp, Tyr e Phe) podem participar em interações iónico-aromático ou "catião-pi". Nesses casos, a substituição de uma destas cadeias laterais com um membro do grupo ácido ou polar sem carga pode ser conservativa com respeito a sua estrutura e função. Os resíduos tais como Pro, Gly e Cys (forma dissulfureto) podem ter efeitos diretos na conformação de cadeia principal, e com frequência podem não ser substituídos sem distorções estruturais. A "percentagem de identidade de sequência de aminoácidos (%)" com respeito às sequências polipeptídicas de ligando ou recetor identificadas no presente documento é definido como o percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em a dita sequência de ligando ou recetor identificada no presente documento, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se for necessário para conseguir o percentagem de identidade de sequência máximo, e sem levar em consideração nenhuma substituição conservativa como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para a finalidade de determinar o percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser realizada de diversas maneiras que estão dentro da experiencia da técnica, por exemplo, utilizando software informático disponível publicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para conseguir o alinhamento máximo sobre o comprimento completo das sequências que são comparados. Para fins do presente documento, no entanto, são obtidos valores de % de identidade de sequência de aminoácidos como é descrito posteriormente utilizando o programa informático de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado no quadro posterior. 0 programa informático de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na quadro posterior foi presentado com a documentação de utilizador na Oficina de Direitos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, na que está registado sob o N° de Registro de Direitos de Autor de Estados Unidos TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte proporcionado no quadro posterior. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são expostas pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões numa proteína que são localizações preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese de exploração de alanina" como é descrito em Cunningham e Wells Science, 244: 1081-1085 (1989) . Identifica-se um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos com carga tais como arg, asp, his, lys e glu) e são substituídos por um aminoácido neutro ou com carga negativa (mais preferentemente alanina ou polialanina) para afetar à interação dos aminoácidos com um alvo de ligação. As localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são refinam depois introduzindo mais ou outras variantes em, ou para, os locais de substituição. Portanto, embora o local para introduzir uma variação de sequência de aminoácidos esteja predeterminado, não é necessário determinar a natureza da mutação em si mesma. Por exemplo, para analisar o rendimento de uma mutação num local dado, realiza-se mutagénese de exploração de alanina ou aleatória no codão ou região alvo e as variantes expressadas são exploradas com respeito à atividade desejada. A expressão "ângulo dihédrico" refere-se à rotação em torno a uma ligação. Veja-se, por exemplo, Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, NY. 0 termo "fi" é um ângulo dihédrico que indica uma rotação ao redor da ligação N-Ca de um aminoácido. Veja-se, por exemplo Creighton, T.E., (1993) Protein: Structures and Molecular Properties, 2a ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, NY.
As voltas beta de tipo I são descritos em Hutchinson, E. G. e Thornton, J. M. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216.
Uma "proteína de fusão" e um "polipéptido de fusão" refere-se a um polipéptido que tem dois partes ligadas covalentemente entre si, em que cada uma das duas partes é um polipéptido que tem uma propriedade diferente. A propriedade pode ser uma propriedade biológica, tal como atividade in vitro ou in vivo. A propriedade pode ser também uma propriedade química ou física simples, tal como ligação com uma molécula alvo, catálise de uma reação, etc. As duas partes podem se ligar diretamente por um único ligação peptídico ou através de um ligante peptídico que contém um ou mais resíduos de aminoácidos. Em geral, as duas partes e o ligante estarão em grelha de leitura entre si.
Um "conjugado" refere-se a qualquer molécula híbrida, incluindo proteínas de fusão e assim como moléculas que contêm tanto partes de aminoácidos ou proteínas como partes não proteicas. Os conjugados podem ser sintetizados por meio de uma diversidade de técnicas conhecidas neste campo, incluindo, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, síntese de fase sólida, síntese de fase em solução, técnicas sintéticas de química orgânica ou uma combinação dessas técnicas. A escolha de síntese dependerá da molécula particular a gerar. Por exemplo, uma molécula híbrida de natureza não completamente "proteica" pode ser sintetizada por uma combinação de técnicas recombinantes e técnicas de fase em solução.
Como é utilizada no presente documento, o termo "imunoadesina" designa moléculas de tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é distinta do local de reconhecimento e ligação do antigénio de um anticorpo (isto é, é "heteróloga"), e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma sequência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o local de ligação de um recetor ou um ligando. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. Por exemplo, são imunoadesinas úteis de acordo com a presente invenção polipéptidos que compreendem as partes de ligação a BLyS de um recetor de BLyS sem as sequências transmembrana ou citoplasmática do recetor de BLyS. Numa forma de realização, o domínio extracelular de BR3, TACI ou BCMA se fusiona com um domínio constante de uma sequência de imunoglobulina. Por exemplo, uma imunoadesina BR3-Fc de ratinho e imunoadesina BR3-Fc humana podem ser representadas pelas fórmulas: mBR3-Fc (SEQ ID N°: 1) :
MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTS
SLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLUTLTPKVTCWVDIS
KDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSEL
PIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPEEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDF
FPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHH
TEKSLSHSPGK hBR3-h!gGl Fc (SEQ ID N°: 2)
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASS
PAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carbocuona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tais como calusterona, próprionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamine; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2', 2''-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE , Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tais como cisplatino e carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores. Também são incluídos nesta definição agentes antihormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal em tumores tais como anti-estrógenos incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazois inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos anteriores . A expressão "agente citotóxico" como é utilizada no presente documento refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou provoca a destruição de células. Se pretende que o termo inclua isótopos radioativos (por exemplo At211, I131, I125, Y90, Re185, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e fragmentos dos mesmos tais como enzimas nucleoliticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriano, fúngico, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e os diversos agentes antitumorais ou antineoplásicos revelados posteriormente. Outros agentes citotóxicos são descritos posteriormente.
Um "agente inibidor do crescimento" quando é utilizada no presente documento refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerosa que expressa CD20, in vitro ou in vivo. Portanto, ο agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células que expressam PSCA na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num lugar distinto da fase S), tais como agentes que induzem a detenção em G1 e detenção em fase M. Os bloqueadores de fase M clássico incluem os derivados da vinca (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topoisomerase II tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido e bleomicina. Os agentes que detêm em G1 também se estendem até detenção em fase S, por exemplo, agentes alquilantes de ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode ser encontrada mais informação em The Molecular Base of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente p. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos antineoplásicos derivados do teixo. 0 docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). 0 paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dimeros de tubulina e estabilizam microtúbulos evitando a despolimerização, o que resulta na inibição da mitose em células. 0 termo "mamífero" refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de granja, e animais de zoológico, desportivos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, o mamífero no presente documento é um ser humano. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou um fármaco antagonista eficaz para "aliviar" ou "tratar" uma doença ou distúrbio num indivíduo ou mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, desacelerar em algum grau e preferentemente deter) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (isto é, desacelerar em algum grau e preferentemente deter) a metástase tumoral; inibir, em algum grau o crescimento tumoral; e/ou aliviar em algum grau um ou mais dos sintomas associados com o cancro. Veja-se a definição de "tratado" posterior. Na medida em que o fármaco pode evitar o crescimento e/ou destruir células cancerosas existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico.
Os anticorpos anti-CD20 da invenção podem ser produzidos por transfeção transitória ou estável de células hospedeiras eucariotas tais como células CHO. "Veículos" como é utilizada no presente documento incluem veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero que é exposto aos mesmos às dosagens e concentrações utilizadas.
Com frequência o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução de pH tamponado aquosa. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptido de baixa massa molecular (menor de cerca de 10 resíduos) ; proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcares tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN™, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. 1. Antagonistas de BLyS polipeptídicos
Os polipéptidos úteis como antagonistas de BLyS incluem, por exemplo, o polipéptido denominado TALL-1 12-3 como SEQ ID N° : 123 no documento WO 02/092620, a sequência de aminoácidos proporcionada aqui:
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGG
GVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N° 10)
Este polipéptido se liga a BLyS e inibe a ligação de BR3 com BLyS.
Em algumas formas de realização, os péptidos de 17 unidades são solúveis (preferentemente não ligados a membrana) e podem ser utilizado como sequências centrais ou ser combinadas ou ser conjugados de outro modo com uma diversidade de estruturas como é descrito posteriormente. Alguns aminoácidos no polipéptido de 17 unidades foram selecionados aleatoriamente e foram rastreados com respeito a substituições conservativas e não conservativas. Como entende-se por um perito habitual na especialidade e é descrito no presente documento, podem ser conseguidas adições e substituições de maneira limitada sem alterar a ligação de BLyS do péptido de 17 unidades resultante e construções que incluem o péptido de 17 unidades resultante. É proporcionado a seguir e nos exemplos orientação com respeito a substituições permitidas que produzem função de ligação a BLyS. Em algumas formas de realização, os resíduos implicados em relações de afinidade de ligação ou estrutural estão conservados, o que significa que a identidade de aminoácido se conserva ou se realiza uma substituição conservativa como é descrito nas fórmulas e descrição posteriores.
Um antagonista do polipéptido de BLyS pode compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, uma sequência enumerada na FIG.32, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), e misturas dos mesmos.
Num aspeto da invenção, o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos de Fórmula I: X1-CN-X3-D-X5-L-X7-X8-X9-X1o-Xii-Xi2-CT-X14-Xi5-Xi6-Xi7 (Fórmula I) em que X7, X3, X5, X7, Xg, X9, X7o, Xu, X12r X14r Xis s X77 são qualquer aminoácido exceto cisteína; e em que X76 é um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em L, F, I e V; e em que o polipéptido não compreende uma cisteína a uma distância de sete resíduos de aminoácidos em direção N terminal de CN (cisteína N terminal) e C terminal de CT (cisteína C terminal) de Fórmula I.
Em algumas formas de realização, um polipéptido que compreende a sequência de Fórmula I tem CN e CT ligadas por ligações dissulfureto; X5LX7X8 que forma a conformação de uma estrutura de volta beta de tipo I com o centro do giro entre L e X7; e tem um valor positivo para o ângulo dihédrico fi de X8.
Em algumas formas de realização, X10 é selecionado a partir do grupo que consiste em W, F, V, L, I, E, M e um aminoácido não polar. Em algumas formas de realização Xio é W. Em algumas formas de realização, X3 é um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Μ, V, L, I, E, F, W e um aminoácido não polar. Em algumas formas de realização, X5 é selecionado a partir do grupo que consiste em V, L, P, S, I, A e R. Em algumas formas de realização, X7 é selecionado a partir do grupo que consiste em V, T, I e L. Em algumas formas de realização, X7 não é T ou I. Em algumas formas de realização, X8 é selecionado a partir do grupo que consiste em qualquer de R, K, G, N, H e um aminoácido D. Em algumas formas de realização, X9 é selecionado a partir do grupo que consiste em Η, K, A, R e Q. Em algumas formas de realização, Xn é I ou V. Em algumas formas de realização, X12 é selecionado a partir do grupo que consiste em P, A, D, E e S. Em algumas formas de realização, X16 é L.
Em formas de realização específicas, a sequência de Fórmula I é uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ IDN° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9) .
Em outro aspeto da invenção, o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos de Fórmula II: Xi-Cn-X3-D-X5-L-V-X8-X9-W-Xii-Xi2-Ct-Xi4-Xi5-L-Xi7 (Fórmula II) em que Xlr X3, X5, X8, X9, Xn, X72, X14, X15 e X77 são qualquer aminoácido exceto cisteína; e em que o polipéptido não compreende uma cisteína a uma distância de sete resíduos de aminoácidos em direção N terminal de CN (cisteína N terminal) e em direção C terminal de CT (cisteina C terminal) de Fórmula II.
Em algumas formas de realização, um polipéptido que compreende a sequência de Fórmula I tem CN e CT ligadas por ligações dissulfureto; X5LVX8 que forma a conformação de uma estrutura de volta beta de tipo I com o centro do giro entre L e X7; e tem um valor positivo para o ângulo dihédrico fi de X8.
Em algumas formas de realização de Fórmula II, X3 é um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Μ, A, V, L, I, E, F, W e um aminoácido não polar. Em algumas formas de realização de Fórmula II, X5 é selecionado a partir do grupo que consiste em V, L, P, S, I, A e R. Em algumas formas de realização de Fórmula II, X8 é selecionado a partir do grupo que consiste em R, K, G, N, H e um aminoácido D. Em algumas formas de realização de Fórmula II, X9 é selecionado a partir do grupo que consiste em Η, K, A, R e Q. Em algumas formas de realização de Fórmula II, Xn é selecionado a partir do grupo que consiste em I e V. Em algumas formas de realização de Fórmula II, X12 é selecionado a partir do grupo que consiste em P, A, D, E e S.
Em outros aspetos, o polipéptido compreende uma sequência selecionada de qualquer uma das sequências descritas na FIG. 32 .
Outro aspeto da invenção inclui um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos de Fórmula III: E-CN-F-D-X5-L-V-X8-X9-W-V-X12-CT-Xi4-Xi5-Xi6-Xi7 (Fórmula III) em que X5, X8, X9, X22, X24, X25 e X27 são qualquer aminoácido exceto cisteina; em que X26 é um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em L, F, I e V; em que o polipéptido não compreende uma cisteina a uma distância de sete resíduos de aminoácidos em direção N terminal de CN (cisteina N terminal) e C terminal de CT (cisteina C terminal) de Fórmula III; e em que CN e CT estão ligadas por ligações dissulfureto.
Em algumas formas de realização de Fórmula III, o polipéptido que compreende a sequência contígua de Fórmula III tem um ligação dissulfureto entre CN e CT e forma uma estrutura de volta beta de tipo I com o centro do giro entre L e V em X5LVX8; e tem um valor positivo para o ângulo dihédrico fi de X8.
Em algumas formas de realização de Fórmula III, X5, X8, X9, X12, X14, X15 e Xiv são selecionados a partir do grupo que consiste em L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D e G. Em algumas formas de realização de Fórmula III, X5 é L e X8 é R. Em algumas formas de realização de Fórmula III, X9 é selecionado a partir do grupo que consiste em Η, K, A, S, R e Q. Em algumas formas de realização de Fórmula III, Xi2 é selecionado a partir do grupo que consiste em P, A, D, E e S. Em algumas formas de realização de Fórmula III, X12 é P. Em algumas formas de realização de Fórmula III, Xi6 é L.
Em formas de realização especificas, a sequência de Fórmula III é selecionado a partir do grupo que consiste em ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8) e ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9).
Também se inclui um polipéptido que compreende uma sequência polipeptídica contígua selecionada a partir do grupo que consiste em ECFDLLVRAWVPCSVLK, ECFDLLVRHWVPCGLLR, ECFDLLVRRWVPCEMLG, ECFDLLVRSWVPCHMLR, e ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 5 a 9). A presente invenção também se refere a um polipéptido que compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências descritas na FIG. 32. Os polipéptidos que compreende qualquer uma das sequências descritas na FIG. 32 preferentemente ligam a cisteína da sequência por ligações dissulfureto. Em algumas formas de realização, a sequência entre o quinto e oitavo resíduos da sequência forma uma conformação de uma estrutura de volta beta de tipo I com o centro de giro entre L e X7 e o oitavo resíduo tem um valor positivo para o ângulo dihédrico fi.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos BLyS da presente invenção são sequências contíguas. A presente invenção também se refere a um polipéptido que compreende pelo menos 88 % de identidade de sequência com uma sequência polipeptídica de 17 unidades contígua selecionada a partir do grupo que consiste em: ECFDLLVRAWVPCSVLK, ECFDLLVRHWVPCGLLR, ECFDLLVRRWVPCEMLG, ECFDLLVRSWVPCHMLR e ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 5-9) . Em outras formas de realização a identidade de sequência é de pelo menos 64 %, e cada número inteiro sucessivo até 100 % depois de alinhar para proporcionar a homologia máxima. A homologia é reduzida para lacunas de sequência e sequências mais curtas que as 17 unidades da presente invenção depois de alinhar para proporcionar máxima homologia. Nem as extensões nem as inserções nem N nem C terminais deveriam ser interpretadas como redutoras da homologia.
De acordo com algumas formas de realização da presente invenção, o polipéptido é de menos de 50 aminoácidos de comprimento, menos de 25 aminoácidos de comprimento, ou é de 17 unidades.
Em algumas formas de realização, os polipéptidos da presente invenção compreendem sequências polipeptídicas adicionais N terminais, C terminais ou tanto N terminais como C terminais da sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32. As sequências polipeptídicas adicionais são heterólogas de um polipéptido BR3 de sequência nativa, e incluem, por exemplo, a parte Fc de imunoglobulinas.
Em outro aspeto da invenção, os polipéptidos antagonistas de BlyS compreendem pelo menos um e mais preferentemente, mais de um de um polipéptido que compreende uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N°
7) , ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9) , ou sequências enumeradas na FIG. 32. Os polipéptidos que se ligam entre si podem ter a mesma sequência ou têm sequências diferentes. Em algumas formas de realização, estes polipéptidos podem se ligar entre si, opcionalmente, por meio da utilização de um ligante. 0 ligante age como um espaçador e pode ser realizada de uma diversidade de compostos químicos. Em algumas formas de realização, o ligante é um polipéptido que tem de cerca de 1 a 50 aminoácidos, mais preferentemente de cerca de 1 a 30 aminoácidos. Os peritos na especialidade conhecem as sequências ligantes. Por exemplo, as sequências ligantes incluem GGGKGGGG e GGGNSSGG e similares. Em formas de realização específicas, os polipéptidos ligados entre si têm a mesma sequência e compreendem uma fórmula: PP1-L1-PP1-L2-PP1, na que PPl compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), e as sequências enumeradas na FIG. 32, e LI e L2 são sequências ligantes que são de sequência diferente.
Os antagonistas para a ligação de BLyS com BR3, tais como os polipéptidos descritos no presente documento, preferentemente se ligam a BLyS com uma afinidade igual ou maior que uma sequência de BR3 nativa, tal como ECD de BR3 de SEQ ID N° ou mini-BR3 de SEQ ID N° Em algumas formas de realização, os polipéptidos que têm uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32 têm uma afinidade de ligação por BLyS de cerca de 100 nM ou menos, preferentemente 10 nM ou menos, ou 1 nM ou menos. É proporcionado nos Exemplos um método para medir a afinidade de ligação.
Um método utilizado na presente invenção para encontrar antagonistas de BLyS envolve identificar, modificar e selecionar aleatoriamente de forma seletiva uma sequência central de 17 resíduos de BR3. São descritos adicionalmente posteriormente e nos exemplos técnicas específicas utilizadas. Em algumas formas de realização, o resíduo de cisteína N terminal (CN) na posição X2 e cisteína C terminal (CT) na posição X13 estão conservados e preferentemente formam uma ligação dissulfureto. Em algumas formas de realização, CN e CT estão separadas por 10 aminoácidos contíguos. Preferentemente, a sequência de 17 unidades não contém nenhum resíduo de cisteína distinto das posições X2 e X13. Adicionalmente, se a sequência de 17 unidades for incluída numa estrutura maior, as sequências que flanqueiam a sequência de 17 unidades preferentemente não incluirão nenhum resíduo de cisteína a uma distância de 7 aminoácidos de CN ou CT. X10 é substituído com qualquer aminoácido não polar exceto cisteína; por exemplo: W, F, V, L, I, E ou M. Em algumas formas de realização, X10 é W.
Em algumas formas de realização, o motivo D-X5-L-X7 está conservado devido a sua contribuição demonstrada à ligação de BLyS . Em algumas formas de realização, é formada uma volta beta localizada entre CN e CT entre X4 e X7. Em algumas formas de realização, o centro da volta beta se situa entre L-X7. Em algumas formas de realização, a estrutura dos péptidos de 17 unidades da presente invenção é geralmente de duas cadeias beta ligadas por uma volta beta de tipo I, que forma um grampo beta ligado por uma ligação dissulfureto entre CN e CT. Adicionalmente, em algumas formas de realização, o resíduo Xs adota um valor positivo para o ângulo dihédrico fi de X8 para acomodar a volta beta de tipo I na estrutura em grampo beta. A informação estrutural adicional indica que D em X4 e L em X6 estão internados na interface de BLyS-BR3 do complexo BLyS-BR3. Em algumas formas de realização, estes resíduos estão conservados. O resíduo em X7 também está internado na interface BLyS-BR3. Em algumas formas de realização, X7 pode ser selecionados a partir do grupo que consiste em V, T, I e L. Em algumas formas de realização, X7 é preferentemente V. Em algumas formas de realização, o motivo de X4 a X7 é DLLV.
Em algumas formas de realização, o comprimento da região de ligação do antagonista de BLyS é de 17 aminoácidos. Em algumas formas de realização, o antagonista de BLyS polipeptídico é de 17 aminoácidos. Em algumas formas de realização, há quatro aminoácidos, X14-X17, depois de CT na extremidade C terminal. Em algumas formas de realização, X16 forma um contacto hidrófobo com BLyS quando a sequência de 17 unidades está ligada e conservada. Em algumas formas de realização X46 é L. 2. Polinucleótidos, vetores, células hospedeiras
De acordo com algumas formas de realização, os polipéptidos antagonistas de BLyS são selecionados a partir do grupo que consiste em: péptidos de 17 unidades descritos no presente documento, polipéptidos que incorporam um ou mais péptidos de 17 unidades como regiões centrais, e formas modificadas covalentemente dos péptidos e polipéptidos de 17 unidades (por exemplo, imunoadesinas, polipéptidos marcados, polipéptidos protegidos, polipéptidos conjugados, proteínas de fusão, etc.). São descritas no presente documento diversas técnicas que são utilizadas para realizar estas formas de polipéptidos. São conhecidos na técnica métodos para marcar polipéptidos e conjugar moléculas com polipéptidos.
Podem ser preparadas composições da invenção utilizando técnicas recombinantes conhecidas neste campo. A descrição posterior refere-se a métodos para produzir os ditos polipéptidos cultivando células hospedeiras transformadas ou transfetadas com um vetor que contém o ácido nucleico codificante e recuperando o polipéptido da cultura celular. (Veja-se, por exemplo, Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach et al. , PCR Primeiro: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)) . 0 ácido nucleico (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) que codifica o polipéptido desejado pode ser inserido num vetor replicável para clonagem posterior (amplificação do ADN) ou para expressão. Estão disponíveis publicamente diversos vetores. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição, cada um dos quais é descrito posteriormente. São conhecidos na técnica sequências de sinal opcionais, originais de replicação, genes marcadores, elementos potenciadores e sequências de terminação da transcrição que podem ser utilizadas e são descritos em mais detalhe no documento W097/25428.
Os vetores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operativamente com a sequência de ácido nucleico codificante. Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a jusante (5' ) do codão de início de um gene estrutural (geralmente a uma distância de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e tradução de uma sequência de ácido nucleico particular, com a qual estão ligados operativamente. Os ditos promotores tipicamente estão em duas classes, induzíveis e constitutivos. Os promotores induzíveis são promotores que iniciam os níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob seu controlo em resposta a alguma mudança nas condições de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança de temperatura. Neste momento é bem conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma diversidade de células hospedeiras potenciais. Estes promotores se ligam operativamente ao ADN codificante retirando o promotor do ADN fonte por digestão com enzimas de restrição e inserindo a sequência promotor isolada no vetor. A construção de vetores adequados que contêm um ou mais dos componentes anteriormente enumerados utiliza técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, adaptados e voltam a ligar na forma desejada para gerar os plasmídeos requeridos. Para análise para confirmar sequências corretas em plasmídeos construídos, as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar E. coli K12 estirpe 294 (ATCC 31,446) e os transformantes bem-sucedidos são selecionados por resistência a ampicilina ou tetraciclina quando seja apropriado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, são analisados por digestão com endonucleases de restrição e/ou são sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas neste campo. [Veja-se, por exemplo, Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)].
Podem ser utilizados vetores de expressão que proporcionam a expressão transitória em células de mamífero do ADN codificante. Em geral, a expressão transitória envolve a utilização de um vetor de expressão que é capaz de se replicar eficazmente numa célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vetor de expressão e, por sua vez, sintetize altos níveis de um polipéptido desejado codificado pelo vetor de expressão [Sambrook et al. mencionado anteriormente]. Os sistemas de expressão transitórios, que compreendem um vetor de expressão e uma célula hospedeira adequados, permitem a identificação positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, assim como para a rápida exploração dos ditos polipéptidos com respeito a propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas. São descritos outros métodos, vetores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese do polipéptido desejado em culturas de células de vertebrados recombinantes em Gething et al. , Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); documentos EP 117,060; e EP 117,058.
As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o ADN nos vetores do presente documento incluem células procariotas, de levedura, ou eucariotas superiores. Os procariotas adequados para esta finalidade incluem mas sem limitação eubactérias, tais como organismos Gram negativos ou
Gram positivos, por exemplo, Enterobactérias tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim como bacilos tais como B. subtilis e B. lichen!formis (por exemplo, B. lichen!formis 41P revelado no documento DD 266,710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Preferentemente, a célula hospedeira deveria secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas.
Além de procariotas, os micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores. As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptido glicosilado derivam de organismos multicelulares. São descritos adicionalmente exemplos de todas estas células hospedeiras no documento W097/25428.
As células hospedeiras são transfetadas e preferentemente são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem anteriormente descritos e são cultivadas em meios nutrientes modificados conforme for apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. A transfeção refere-se à captação de um vetor de expressão por uma célula hospedeira tanto se de facto é expresso alguma sequência codificante como se não. São conhecidos numerosos métodos de transfeção pelos peritos habituais na especialidade, por exemplo, CaP04 e eletroporação. A transfeção bem-sucedida geralmente é reconhecida quando aparece qualquer indicação da operação deste vetor dentro da célula hospedeira. A transformação significa introduzir ADN num organismo de modo que o ADN seja replicável, bem como um elemento extracromossómico ou por integração cromossómica. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação se realiza utilizando técnicas convencionais apropriadas para as ditas células. O tratamento com cálcio que utiliza cloreto de cálcio, como é descrito em Sambrook et al., mencionado anteriormente, ou eletroporação são utilizados geralmente para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciosas. A infeção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, como é descrito em Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) e documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Além disso, podem ser transfetadas plantas utilizando tratamento com ultrassom como é descrito no documento WO 91/00358 publicado em 10 de enero de 1991.
Para células de mamífero sem as ditas paredes celulares, pode ser utilizado o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) . Foram descrito aspetos gerais das transformações de sistemas hospedeiros de células de mamífero na Patente dos Estados Unidos N° 4.399.216. As transformações em levedura são levadas a cabo tipicamente de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76: 3829 (1979). No entanto, também podem ser utilizados outros métodos para introduzir ADN em células, tais como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, por exemplo, polivreno, poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
As células procariotas podem ser cultivadas em meios de cultura adequados como é descrito em geral em Sambrook et al., mencionado anteriormente. Os exemplos de meios de cultura disponíveis no mercado incluem F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qualquer dos ditos meios pode ser complementados conforme seja necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como gentamicina), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes a concentrações finais no intervalo micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Também pode ser incluído qualquer outro suplemento necessário a concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e resultará evidente para os peritos habituais na especialidade.
Em geral, podem ser encontrados princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células de mamífero em Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) .
Os polipéptidos expressados podem ser recuperados do meio de cultura como um polipéptido secretado, embora também possam ser recuperados de lisados de células hospedeiras quando sejam produzidos diretamente sem um sinal secretor. Se o polipéptido estiver ligado a membrana, pode ser libertado da membrana utilizando uma solução de detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou sua região extracelular pode ser libertada por clivagem enzimática.
Quando é produzido o polipéptido numa célula recombinante distinta de uma de origem humana, esta está livre de proteínas ou polipéptidos de origem humana. No entanto, é habitualmente necessário recuperar ou purificar o polipéptido de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes para obter preparações que são substancialmente homogéneas. Como uma primeira etapa, o meio de cultura ou lisado pode ser centrifugado para retirar os resíduos celulares em partículas. Os seguintes são procedimentos exemplares para procedimentos de purificação adequados: por fracionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e colunas de proteína A Sepharose para retirar contaminantes tais como IgG.
Apresentação de fagos
Polipéptidos da presente invenção selecionados a partir do grupo que consiste em: Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9) , e sequências enumeradas na FIG. 32, podem ser utilizados na apresentação de fagos. A utilizanção das técnicas de apresentação de fagos permite a geração de grandes bibliotecas de variantes proteicas que podem ser classificadas rapidamente com respeito às sequências que se ligam a uma molécula alvo com alta afinidade. São fusionados ácidos nucleicos que codificam polipéptidos variantes com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de revestimento virai, tal como a proteína do gene III ou a proteína do gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de apresentação de fagos monovalentes nos quais a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína ou o polipéptido se fusiona com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma parte da proteína do gene III (Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)). Num sistema de apresentação de fagos monovalente, a fusão génica é expressa a níveis baixos e também são expressas proteínas do gene III de tipo selvagem de modo que se conserva a infetividade das partículas. Foram revelados métodos para gerar bibliotecas de péptidos e rastrear essas bibliotecas em muitas patentes (por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.723.286, Patente dos Estados Unidos N° 5.432.018, Patente dos Estados Unidos N° 5.580.317, Patente dos
Estados Unidos N° 5.427.908 e Patente dos Estados Unidos N° 5.498.530) .
Em algumas formas de realização, a Fórmula I, Fórmula II ou Fórmula III são expressas como bibliotecas de péptidos em fagos. Os fagos que expressam a biblioteca de polipéptidos de Fórmula I, Fórmula II ou Fórmula III são submetidos depois a seleção com base na ligação com BLyS. Em algumas formas de realização, o processo de seleção envolve permitir que alguns fagos se liguem a BLyS biotinilado que se liga posteriormente a uma placa de neutravidina. Recuperam-se e se propagam fagos ligados às placas através da ligação com BLyS-biotina-neutravidina. Em algumas formas de realização, os fagos são submetidos a vários ciclos de seleção. Em algumas formas de realização, os fagos são incubados com BLyS-biotina, seguido da adição do BLyS não biotinilado como um agente de ligação competitivo. É proporcionada orientação adicional da utilização de apresentação de fagos no contexto da presente invenção nos exemplos.
Polipéptidos fusionados ou conjugados com polipéptidos heterólogos São contempladas, além disso, para utilização nos métodos do presente documento moléculas de imunoadesina que compreendem os polipéptidos revelados no presente documento. Em algumas formas de realização, a molécula compreende uma fusão de um polipéptido da presente invenção com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da imunoadesina, a dita fusão compreende de forma útil a região Fc de uma molécula IgG. Numa forma de realização adicional, a região Fc é de uma molécula IgGl humana. Em algumas formas de realização, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões dobradiça, CH2 e CH3, ou as regiões dobradiça CHI, CH2 e CH3 de uma molécula IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina, veja-se também a Patente dos Estados Unidos N° 5.428.130 concedida em 27 de junho de 1995 e Chamow et al.r TIBTECH, 14: 52-60 (1996). 0 projeto de imunoadesina mais simples e mais direto combina com frequência o domínio ou os domínios de ligação da adesina (por exemplo, polipéptido antagonista da presente invenção) com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, um polipéptido que compreende uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32 pode se ligar covalentemente a uma parte de Fc de uma imunoglobulina. Além disso, um ou mais destes polipéptidos podem se ligar a outro e se ligar a uma parte Fc de uma imunoglobulina.
Habitualmente, quando são preparadas as imunoadesinas, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação da adesina se fusionará na extremidade C terminal com o ácido nucleico que codifica a extremidade N terminal de uma sequência de domínio constante de imunoglobulina, no entanto, também são possíveis fusões N terminais.
Tipicamente, nas ditas fusões o polipéptido quimérico codificado conservará pelo menos os domínios dobradiça, CH2 e CH3 funcionalmente ativos da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Também são realizadas fusões com a extremidade C terminal da parte Fc de um domínio constante, ou imediatamente N terminal do CHI da cadeia pesada ou a região correspondente da cadeia leve. 0 local preciso em que se realiza a fusão não é crítico; locais particulares são bem conhecidos e podem ser selecionados para otimizar a atividade biológica, secreção ou características de ligação da imunoadesina.
Numa forma de realização preferida, a sequência de adesina se fusiona com a extremidade N terminal da região Fc de imunoglobulina G1 (IgGl). É possível fusionar a região constante de cadeia pesada completa com a sequência de adesina. No entanto, mais preferentemente, é utilizada na fusão uma sequência que começa na região dobradiça justo a jusante do local de clivagem de papaína que define IgG Fc quimicamente (isto é o resíduo 216, considerando que o primeiro resíduo da região constante de cadeia pesada é 114), ou locais análogos de outras imunoglobulinas. Numa forma de realização particularmente preferida, a sequência de aminoácidos de adesina se fusiona com (a) a região dobradiça e CH2 e CH3 ou (b) os domínios CHI, dobradiça, CH2 e CH3, de uma cadeia pesada de IgG.
Para imunoadesinas biespecificas, as imunoadesinas são montadas como multímeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrámeros. Geralmente, estas imunoglobulinas reunidas terão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural de quatro cadeias é a forma na qual existem IgG, IgD e IgE. Uma unidade de quatro cadeias se repete nas imunoglobulinas de maior massa molecular; IgM geralmente existe como um pentámero de quatro unidades básicas mantidas juntas por ligações dissulfureto. Também podem existir globulina IgA, e ocasionalmente globulina IgG em forma multimérica no soro. No caso do multímero, cada uma das quatro unidades podem ser iguais ou diferentes. São apresentados num diagrama esquemático a seguir diversas imunoadesinas reunidas exemplares dentro do alcance do presente documento: (a) ACL-ACL; (b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, ou VLCL-ACH); (C) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, OU VLCL-VHCH) (d) ACL-VHCH-(ACH, or ACL-VHCH, ou VLCL-ACH); (e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH, ou VLCL-ACH); e (f) (A-E)n-(VLCL-VHCH)2, em que cada A representa polipéptidos idênticos ou diferentes que compreendem uma sequência de aminoácidos de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6) , ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32 ou combinações das mesmas; VL é um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH é um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; n é um número inteiro maior de 1; E designa o resíduo de um agente de reticulação covalente.
Para maior brevidade, as estruturas anteriores somente mostram caracteristicas chave; não indicam domínios de ligação (J) ou outros das imunoglobulinas, nem são mostradas ligações dissulfureto. No entanto, quando são requeridos os ditos domínios para a atividade de ligação, serão construídos para que estejam presentes nas localizações ordinárias que ocupam nas moléculas de imunoglobulina.
Como alternativa, as sequências de adesina podem ser inseridas entre as sequências de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina, de modo que se obtenha uma imunoglobulina que compreende uma cadeia pesada quimérica. Nesta forma de realização, as sequências de adesina são fusionados com a extremidade 3' de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, entre a dobradiça e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3 . Foram apresentadas construções similares em Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28: 1027-1037 (1991).
Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não seja requerida nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina poderia estar presente associada covalentemente a um polipéptido de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina-adesina, ou fusionado diretamente com a adesina. No primeiro caso, tipicamente se coexpressa ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina com o ADN que codifica a proteína de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina-adesina. Após a secreção, a cadeia pesada híbrida e a cadeia leve serão associados covalentemente para proporcionar uma estrutura de tipo imunoglobulina que compreende dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina com ligações dissulfureto. São revelados métodos adequados para a preparação das ditas estruturas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 4.816.567, concedida em 28 de março de 1989.
As imunoadesinas são construídas mais convenientemente fusionando a sequência de ADNc que codifica a parte de adesina em fase com uma sequência de ADNc de imunoglobulina. No entanto, também pode ser utilizada fusão com fragmentos de imunoglobulina genómicos (veja-se, por exemplo, Aruffo et al. , Cell, 61: 1303-1313 (1990); e Stamenkovic et al., Cell, 66: 1133-1144 (1991)) . Este último tipo de fusão requer a presença de sequências reguladoras Ig para sua expressão. Podem ser isolados ADNc que codificam regiões constantes de cadeia pesada de IgG com base em sequências publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de linfócitos de baço ou sangue periférico, por hibridação ou por técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) . Os ADNc que codificam a "adesina" e as partes de imunoglobulina da imunoadesina são inseridas em tándem num vetor de plasmídeo que dirige a expressão eficaz nas células hospedeiras elegidas.
Também são contemplados pela invenção formas de zíper de leucina destas moléculas. O "zíper de leucina" é uma expressão na técnica utilizada para fazer referência a uma sequência rica em leucina que potência, promove ou leva a dimerização ou trimerização de seu compaheiro de fusão (por exemplo, a sequência ou molécula com a que se fusiona ou se liga o zíper de leucina). Foram descritos na técnica diversos polipéptidos de zíper de leucina. Veja-se, por exemplo, Landschulz et al., Science, 240: 1759 (1988); Patente dos Estados Unidos 5.716.805; documento WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344: 1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341: 24 (1989). Os peritos na especialidade apreciarão que uma sequência de zíper de leucina pode se fusionar na extremidade 5' ou 3' do polipéptido da presente invenção.
Os polipéptidos revelados no presente documento também podem ser modificados de maneira que formam moléculas quiméricas fusionando o polipéptido com outra sequência de aminoácidos ou polipeptídica heteróloga. De acordo com algumas formas de realização, a dita sequência de aminoácidos ou polipeptídica heteróloga é uma que age para oligomerizar a molécula quimérica. Em algumas formas de realização, a dita molécula quimérica compreende uma fusão de polipéptido com um polipéptido marcador que proporciona um epitopo com o qual o anticorpo anti-marcador pode se ligar seletivamente. 0 epitopo marcador se coloca geralmente na extremidade carboxilo ou amino terminal do polipéptido. A presença das ditas formas marcadas com epitopo do polipéptido pode ser detetada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Além disso, a provisão do marcador epitópico permite ao polipéptido ser purificado facilmente por meio de purificação de afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador epitópico. São bem conhecidos na técnica diversos polipéptidos marcadores e seus respetivos anticorpos. Os exemplos incluem marcadores de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipéptido de marcador de HA da gripe e seu anticorpo 12CA5 [Field et ai., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 dos mesmos [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; e o marcador de glicoproteína D (gD) do vírus do Herpes Simples e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag [Hopp et al. , BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; o péptido epitópico KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido epitópico de tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína 10 do gene T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
Construção de conjugados de Péptido-Polímero
Em algumas formas de realização a estratégia para a conjugação de um polímero, (por exemplo, PEGilação) de péptidos sintéticos consiste em combinar, por meio da formação de um ligação conjugado em solução, um péptido e um resíduo de PEG, que portam, cada um, uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa para o outro. Os péptidos podem ser preparados facilmente com síntese de fase sólida convencional. Os péptidos se "pré-ativam" com um grupo funcional apropriado num local especifico. Os precursores são purificados e são caracterizadas completamente antes de reagir com o resíduo de PEG. A ligação do péptido com PEG habitualmente ocorre em fase aquosa e pode ser controlada facilmente por meio de HPLC analítica de fase inversa. Os péptidos PEGilados podem ser purificados facilmente por HPLC preparativa e ser caracterizado por HPLC analítica, análise de aminoácidos e espetrometria de massas de dessorção por laser. a. Locais reagentes a péptidos.
Em algumas formas de realização, um péptido é ligado covalentemente por meio de um ou mais dos resíduos de aminoácidos do péptido com um grupo reativo terminal no polímero, dependendo principalmente das condições de reação, a massa molecular do polímero, etc. 0 polímero com o grupo ou os grupos reagentes se designa no presente documento como polímero ativado. 0 grupo reativo reage seletivamente com grupos amino livres ou outros grupos reagentes no péptido. Os locais reagentes potenciais incluem: grupo amino N terminal, grupos amino épsilon em resíduos de lisina, assim como outros grupos amino, imino, carboxilo, sulfidrilo, hidroxilo e outros hidrófilos. Será entendido, no entanto, que o tipo e quantidade do grupo reativo escolhido, assim como o tipo de polímero utilizado, para obter resultados óptimos, dependerá do péptido particular utilizado para evitar que o grupo reativo reaja com demasiados grupos particularmente ativos no péptido. Em algumas formas de realização, um resíduo reativo (por exemplo, lisina (K), um aminoácido modificado, não natural ou outra molécula pequena) pode ser substituído numa posição adequada para conjugação.
Em algumas formas de realização, o péptido compreende a sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32 têm um grupo reativo terminal. Em algumas formas de realização, o péptido compreende pelo menos um e mais preferentemente, mais de um de um polipéptido que compreende uma sequência de Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N° 5) , ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N° 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N° 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N° 8), ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N° 9), ou sequências enumeradas na FIG. 32. Os polipéptidos que se ligam entre si podem ter a mesma sequência ou ter diferentes sequências e um grupo reativo terminal. Em algumas formas de realização, estes polipéptidos podem se ligar entre si, opcionalmente, por meio da utilização de um ligante.
Embora pode ser produzido conjugação em qualquer aminoácido reativo no polipéptido, em algumas formas de realização, o aminoácido reativo é lisina, que se liga ao grupo reativo do polímero ativado por meio de seu grupo amino épsilon livre, ou ácido glutámico ou aspártico, que se liga ao polímero por meio de uma ligação amida. Em algumas formas de realização, os aminoácidos reagentes do péptido não são resíduos de cisteína nas posições X2 e X22. 0 grau de conjugação de polímeros com cada péptido variará dependendo do número de locais reagentes no péptido, a massa molecular, a hidrofilicidade e outras características do polímero, e os locais de derivatização de péptidos particulares selecionados. Em algumas formas de realização, o conjugado tem uma relação molar final de 1 a 10 moléculas de polímero por cada molécula peptídica, mas também são contemplados números maiores de moléculas de polímeros ligadas aos péptidos da invenção. Em algumas formas de realização, cada conjugado contém uma molécula polimérica. A quantidade desejada de derivatização é conseguida facilmente utilizando uma matriz experimental na qual o tempo, a temperatura e outras condições de reação são variadas para mudar o grau de substituição, depois do qual é determinado o nível de substituição polimérica dos conjugados por cromatografia de exclusão por tamanho ou outros meios conhecidos na técnica. b. Polímeros ativados
Em algumas formas de realização, o polímero contém somente um único grupo que é reativo. Isto ajuda a evitar a reticulação de moléculas proteicas. No entanto, está dentro do alcance do presente documento maximizar as condições de reação para reduzir a reticulação, ou para purificar os produtos de reação por meio de filtração em gel ou cromatografia de permuta iónica para recuperar derivados substancialmente homogéneos. Em outras formas de realização, o polímero contém dois ou mais grupos reagentes para a finalidade de ligar múltiplos péptidos com a cadeia principal polimérica. De novo, pode ser utilizada filtração em gel ou cromatografia de permuta iónica para recuperar o derivado desejado numa forma substancialmente homogénea. Em algumas formas de realização, o polímero é ligado covalentemente diretamente com o péptido sem a utilização de um agente de reticulação multifuncional (habitualmente bifuncional). Em algumas formas de realização, há uma relação molar 1:1 de cadeia de PEG e péptido. A reação de modificação covalente pode ocorrer por qualquer método apropriado utilizado em geral para fazer reagir materiais biologicamente ativos com polímeros inertes, preferentemente a cerca de pH 5-9, mais preferentemente 7-9 dos grupos reagentes no péptido são grupos de lisina. Geralmente, o processo envolve preparar um polímero ativado (o polímero que tem tipicamente pelo menos um grupo hidroxilo terminal para ativar), preparar um substrato ativo a partir deste polímero, e fazer reagir a seguir o péptido com o substrato ativo para produzir o péptido adequado para formulação. A reação de modificação anterior pode ser realizada por vários métodos, que podem implicar uma ou mais etapas. Os exemplos de agentes de modificação que podem ser utilizados para produzir o polímero ativado numa reação de uma etapa incluem cloreto do ácido cianúrico (2,4,6-ticloro-S-triazina) e fluoreto de ácido cianúrico.
Em algumas formas de realização, a reação de modificação ocorre em duas etapas na quais o polímero é feito reagir em primeiro lugar com um anidrido ácido tal como anidrido succínico ou glutárico para formar um ácido carboxílico, e o ácido carboxílico é feito reagir depois com um composto capaz de reagir com o ácido carboxílico para formar um polímero ativado com um grupo éster reativo que é capaz de reagir com o péptido. Os exemplos dos ditos compostos incluem ΛΤ-hidroxisuccinimida, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzeno sulfónico, e similares, e preferentemente é utilizada ΛΤ-hidroxisuccinimida ou ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzeno sulfónico. Por exemplo, pode ser feito reagir PEG monometil substituído a temperaturas elevadas, preferentemente cerca de 100-110 °C durante quatro horas, com anidrido glutárico. O monometil PEG-ácido glutárico produzido deste modo é feito reagir depois com ΛΤ-hidroxisuccinimida em presença de um reagente de carbodiimida tal como diciclohexil ou isopropil carbodiimida para produzir o polímero ativo, metoxipolietileno glicolil-AT-succinimidil glutarato, que depois pode ser feito reagir com o GH. Este método é descrito em detalhe em Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984) . Em outro exemplo, o PEG monometil substituído pode ser feito reagir com anidrido glutárico seguido de reação com ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzeno sulfónico (HNSA) em presença de diciclohexil carbodiimida para produzir o polímero ativado. HNSA é descrito em Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical
Co., Rockford 111., 1981), p. 97-100, e em Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) intitulado "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications."
Em algumas formas de realização, consegue-se ligação covalente com grupos amino por químicas conhecidas baseadas no cloreto cianúrico, carbonilo diimidazol, grupos reagentes aldeído (PEG alcóxido mais dietil acetal de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético, ou cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, succinimidil ésteres ativados, ditiocarbonato PEG ativado, 2,4,5-triclorofenilcloroformiato ou PEG ativado por P-nitrofenilcloroformiato) . Os grupos carboxilo se derivatizan acoplando PEG-amina utilizando carbodiimida. Os grupos sulfhidrilo se derivatizan acoplando com PEG maleimido substituído (por exemplo alcoxi-PEG amina mais sulfosuccinimidil-4- (iV-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxi lato) como é descrito no documento WO 97/10847 publicado em 27 de março de 1997, ou PEG-maleimida disponível no mercado de Nektar Technologies, San Carlos, CA (antiguamente Shearwater Polymers, Inc.). Como alternativa, podem ser acoplados grupos amino livres no péptido (por exemplo grupos amino épsilon em resíduos de lisina) com PEG ΛΤ-hidroxisuccinimidil substituído (PEG-NHS disponível de Nektar Technologies) ; ou pode ser tiolado com 2-imino-tiolano (reativo de Traut) e depois ser acoplado com derivados que contêm maleimida de PEG como é descrito em Pedley et al. , Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994) .
Muitos polímeros inertes, incluindo mas sem limitação PEG, são adequados para utilização em produtos farmacêuticos. Veja-se, por exemplo, Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980) . Em algumas formas de realização da invenção, é utilizado um polímero não proteico. O polímero não proteico é tipicamente um polímero sintético hidrófilo, isto é, um polímero que não se encontra de outra maneira na natureza.
No entanto, também são úteis polímeros que existem na natureza e são produzidos por métodos recombinantes ou in vitro, assim como polímeros que são isolados de fontes nativas. Os polímeros de polivinilo hidrófilo ficam dentro do alcance da presente invenção, por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. São particularmente úteis os polialquileno éteres tais como polietilenoglicol (PEG); polioxialquilenos tais como polioxietileno, polioxipropileno e copolímeros em bloco de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros, polissacáridos ramificados ou não ramificados que compreendem os monómeros de sacáridos D-manose, D e L-galactosa, fucose, fructose, D-xilose, L-arabinose, D-ácido glucurónico, ácido siálico, D-ácido galacturónico, D-ácido manurónico (por exemplo, ácido polimanurónico ou ácido algínico), D-glicosemina, D-galactosamina, D-glicose e ácido neuramínico incluindo homopolissacáridos e heteropolissacáridos tais como lactose, amilopectina, amido, amido de hidroxietilo, amilase, dextrano sulfato, dextrano, dextrinas, glicogénio ou a subunidade de polissacáridos de mucopolissacáridos ácidos, por exemplo, ácido hialurónico; polímeros de álcoois de açúcares tais como polissorbitol e polimanitol; heparina ou heparon. Não é necessário que o polímero antes da conjugação seja, mas preferentemente é, solúvel em água, mas o conjugado final é preferentemente solúvel em água. Preferentemente, o conjugado mostra uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 0,01 mg/ml e mais preferentemente pelo menos cerca de 0,1 mg/ml, e ainda mais preferentemente pelo menos cerca de 1 mg/ml. Além disso, o polímero não deveria ser altamente imunogénico na forma conjugada, nem deveria possuir viscosidade que seja incompatível com a infusão intravenosa, injeção ou inalação se for pretendido administrar o conjugado pelas ditas vias. A massa molecular do polímero pode variar até cerca de 100.000 D, e preferentemente é de pelo menos cerca de 500 D, ou pelo menos cerca de 1.000 D, ou pelo menos cerca de 5.000 D. Em algumas formas de realização, o PEG ou outro polímero tem uma massa molecular no intervalo de 5000 a 20.000 D. A massa molecular escolhida pode depender do tamanho efetivo do conjugado para conseguir, a natureza (por exemplo, estrutura, tal como linear ou ramificada) do polímero, e do grau de derivatização, isto é, o número de moléculas poliméricas por péptido, e o local ou os locais de ligação a polímero no péptido. Em algumas formas de realização, podem ser utilizado PEG ramificado para induzir um grande aumento no tamanho efetivo dos péptidos. Podem ser utilizados PEG ou outros conjugados poliméricos para aumentar a semivida, aumentar a solubilidade, estabilizar contra o ataque proteolítico e reduzir a imunogenicidade.
Estão disponíveis polímeros PEG funcionalizados para modificar os péptidos da invenção de Nektar Technologies de San Carlos, CA (antigamente Shearwater Polymers, Inc.). Os ditos derivados de PEG disponíveis no mercado incluem, mas sem limitação, amino-PEG, PEG aminoácido ésteres, química de PEG-AT-hidroxisuccinimida (NHS) , PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEG-ácido propiónico, PEG aminoácidos, PEG succinimidil succinato, PEG succinimidil propionato, succinimidil éster de PEG carboximetilado, succinimidil carbonato de PEG, succinimidil ésteres de aminoácido PEG, PEG-xicarbonilimidazol, PEG-nitrofenil carbonato, PEG trêsilato, PEG-glicidil éter, PEG-aldeído, PEG vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-ortopiridil-dissulfureto, PEG heterofuncionais, derivados de PEG vinilo, PEG silanos, e PEG fosfólidos. As condições de reação para acoplar estes derivados de PEG variarão dependendo da proteína, o grau desejado de PEGilação, e o derivado de PEG utilizado. Alguns fatores implicados na escolha de derivados de PEG incluem: o ponto de ligação desejado (tal como grupos R de lisina ou cisteína), estabilidade hidrolítica e reatividade dos derivados, estabilidade, toxicidade e antigenicidade da ligação, conveniência para análise, etc. Estão disponíveis do fabricante instruções especificas para a utilização de qualquer derivado particular. c. Caracterização de conjugados.
Os conjugados podem ser caracterizados por SDS-PAGE, filtração em gel, RMN, mapeo triptico, cromatografia líquida-espectrometria de massas, e ensaios biológicos in vitro. Por exemplo, o alcance da conjugação de PEG pode ser amostrado por SDS-PAGE e filtração em gel, e depois ser analisado por RMN, que tem um pico de ressonância especifico para os hidrogénios de metileno de PEG. 0 número de grupos de PEG em cada molécula pode ser calculado a partir do espectro de RMN ou espectrometria de massas. A eletroforese em gel de poliacrilamida em SDS a 10 % é processada apropriadamente em Tris-HCl a 10 mM pH 8,0, NaCl a 100 mM como tampão de eluição. Para demostrar quais resíduo está PEGilado, pode ser realizada mapeamento triptico. Portanto, os péptidos PEGilados são digeridos com tripsina à relação de proteína/enzima de 100 a 1 em mg a 37 °C durante 4 horas em acetato de sódio a 100 mM, Tris-HCl a 10 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, pH 8,3 e são acidificados a pH <4 para deter a digestão antes de separar em HPLC Nucleosilo C-18 (4,6 mm x 150 Mm, 5 mu., 100 A) . O cromatograma se compara com o do material de partida não PEGilado. Cada pico pode ser analisado depois por espectrometria de massas para verificar o tamanho do fragmento no pico. O fragmento ou os fragmentos que portavam os grupos PEG não eram retidos habitualmente na coluna de HPLC depois da injeção e desaparecem da cromatografia. A dita desaparição da cromatografia é um indício de PEGilação nesse fragmento particular que deveria conter pelo menos um resíduo de lisina. Podem depois ser testados péptidos PEGilados com respeito a sua capacidade para se ligar ao BLyS por métodos convencionais. Em algumas formas de realização, os conjugados são purificados por cromatografia de permuta iónica, (por exemplo, HPLC de permuta iónica). A química de muitos dos PEG ativados eletrofilicamente resulta numa redução da carga de grupo amino do produto PEGilado. Portanto, cromatografia de permuta iónica de alta resolução pode ser utilizada para separar as proteínas livres e conjugadas, e para resolver espécies com diferentes níveis de PEGilação. De facto, a resolução de diferentes espécies (por exemplo, que contêm um ou dois resíduos de PEG) também é possível devido à diferença nas propriedades iónicas dos aminoácidos que não reagiram. Numa forma de realização, espécies são resolvidas com diferentes níveis de PEGilação de acordo com os métodos descritos no documento WO 96/34015 (Pedido Internacional N° PCT/US96/05550 publicada em 31 de outubro de 1996). São purificadas espécies heterólogas dos conjugados entre si da mesma maneira.
Em algumas formas de realização, PEG-N-hidroxisuccinimida (NHS) reage com uma amina primária (por exemplo, lisinas e a extremidade N terminal). Em algumas formas de realização, PEG-NHS reage com uma lisina (K) C terminal do polipéptido. Em algumas formas de realização, o resíduo de lisina é adicionado à extremidade C terminal do polipéptido de 17 unidades, enquanto que em outras formas de realização, X17 é substituído com lisina. Em algumas formas de realização, o polímero reage com a extremidade N terminal. Numa forma de realização preferida, o conjugado é gerado utilizando os métodos de derivatização e purificação descritos nos Exemplos posteriores. É revelado no presente documento qualquer dos conjugados anteriormente descritos formados por suas partes componentes, isto é, um ou mais péptidos ligados covalentemente com uma ou mais moléculas poliméricas, sem nenhuma matéria exógena na estrutura molecular covalente do conjugado.
Produção de anticorpos
Os métodos e artigos de fabrico revelados no presente documento utilizam, ou incorporam, um anticorpo que se liga a CD20. Em consequência, serão descritos aqui e nos Exemplos métodos para gerar os ditos anticorpos. O CD20 para utilizar para a produção de, ou rastreio com respeito a, anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do antigénio ou uma parte do mesmo, que contém o epitopo desejado. A sequência de CD20 é conhecida, veja-se a Figura 10 e a Figura 11. São descritas clonagem e as sequências para CD20 humano em pelo menos as seguintes referências: Stamenkovic I., Seed B., J. Exp. Med. 167, 1975-1980, 1988. "Analyse of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B 1, Bp35), a type III integral membrane protein."; Tedder T.F., Streuli M., Schlossman S.F., Saito H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-212, 1988. "Isolation and structure of a cDNA encoding the BI (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes"; Tedder T.F., Klejman G., Schlossman S.F., Saito H., J. Immunol. 142, 2560-2568, 1989. "Structure of the gene encoding the human B lymphocyte differentiation antigen CD20 (Bl)"; Einfeld D.A., Brown J.P., Valentine M.A., Clark E.A., Ledbetter J.A., EMBO J. 7, 711-717, 1988.: "Molecular cloning of the human B cell CD20 recetor predicts a hydrophobic protein with multiple transmembrane domain". Os fragmentos peptidicos do dominio extracelular (ECD) podem ser utilizados como imunógenos. Com base nestas sequências e delimitações de dominio conhecidas, um perito na especialidade pode expressar o polipéptido CD20 e fragmentos do mesmo para utilização para produzir anticorpos .
Para gerar anticorpos para o CD20 humano, os resíduos de aminoácidos de domínio extracelular 142-188 e os fragmentos peptidicos de 6 ou mais resíduos de comprimento podem ser utilizados como imunógenos para induzir anticorpos em roedores incluindo ratinhos, hámsteres e ratos, em coelho, cabra ou outro animal adequado. O polipéptido CD20 solúvel ou fragmentos imunogénicos do mesmo pode ser expressado em células hospedeiras adequadas tais como bactérias ou células eucariotas. Numa forma de realização, são produzidos CD20 de comprimento completo solubilizados em detergente humanos e murinos em E. coli (veja-se Exemplos posteriores) e são utilizados para imunizar e rastrear com respeito a hibridomas que produzem anticorpos anti-CD20.
Como alternativa, ou adicionalmente, podem ser utilizados células B ou linhas celulares que expressam CD20 em sua superfície celular para gerar, e/ou rastrear com respeito a, anticorpos. Uma das ditas linhas celulares é a linha celular de linfoblastoide humano SB (N° de referência ATCC ATCC CCL 120, de ATCC, Rockville, Md). Os anticorpos são gerados para CD20 para o tratamento de seres humanos. Outras formas de CD20 úteis para gerar anticorpos resultarão evidentes para os peritos na especialidade.
Também pode ser utilizada metodologia de apresentação de fagos para produzir anticorpo de ligação a CD20.
Os anticorpos que se ligam a CD20 podem ser quiméricos, humanizados ou humanos. Os ditos anticorpos e métodos para serem gerados são descritos em mais detalhe posteriormente. (i) Anticorpos policlonais São induzidos preferentemente anticorpos policlonais em animais por múltiplos injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que seja imunogénica na espécie para imunizar, por exemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugação por meio de resíduos de cisteína), W-hidroxisuccinimida (por meio de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, na que R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados combinando, por exemplo, 100 μρ ou 5 μρ da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respetivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais.
De sete a 14 dias depois são recolhidas amostras sanguíneas dos animais e o soro é testado com respeito ao título de anticorpos. Os animais são reforçados até que o título seja estabilizado. Preferentemente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou por meio de um reagente de reticulação diferente. Também podem ser preparados conjugados em cultura celular recombinante como fusões proteicas. Além disso, são utilizados convenientemente agentes de agregação tais como alúmen para potenciar a resposta imunitária. (ii) Anticorpos monoclonais São obtidos anticorpos monoclonais de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de origem natural que podem estar presentes em quantidades menores. Portanto, o modificador "monoclonal" indica como o carácter do anticorpo que não está numa mistura de anticorpos discretos.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando o método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al. , Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (Patente dos Estados Unidos N° 4,816,567).
No método de hibridoma, é imunizado um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hámster, como foi descrito anteriormente no presente documento para induzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se liguem especificamente com a proteína utilizada para imunização. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fusionados depois com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas deste modo são semeadas e deixadas a crescer num meio de cultura adequado que preferentemente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais, não fusionadas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT) , o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma preferidas são as que são fusionadas eficazmente, apoiam a produção a alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Centro de Distribuição de Células do Instituto Salk, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis da Coleção Americana de Cultura Celular, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Também foram descritas linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). O meio de cultura em que crescem as células de hibridoma é testado com respeito à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferentemente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinado por imunoprecipitação ou por ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Depois de serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por meio de métodos convencionais (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)) . Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de liquido ascitico num animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones também são separados convenientemente do meio de cultura, liquido ascitico ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais é isolado facilmente e é sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos) . As células de hibridoma agem como uma fonte preferida do dito ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que depois são transfetadas a células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hámster Chino (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Pliickthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992) .
Numa forma de realização adicional, podem ser isolados anticorpos ou fragmentos de anticorpo das bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al. , Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al. , J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respetivamente, utilizando bibliotecas de fagos. As publicações posteriores descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo nM) por redistribuição de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), assim como infeção combinatória e recombinação In vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Portanto, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificante de domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos em lugar das sequências murinas homólogas (Patente dos Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou ligando covalentemente à sequência codificante de imunoglobulina toda ou uma parte da sequência codificante para um polipéptido não de imunoglobulina.
Tipicamente os ditos polipéptidos não de imunoglobulina substituem aos domínios constantes de um anticorpo, ou substituem aos domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antigénio que tem especificidade por um antigénio e outro local de combinação de antigénio que tem especificidade por um antigénio diferente. (iii) Anticorpos humanizados
Foram descritos na técnica métodos para humanizar anticorpos não humanos. Preferentemente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são denominados com frequência resíduos "importados", que são recolhidos tipicamente de um domínio variável "importado". A humanização pode ser realizada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al.r Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo com sequências de região hipervariável as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Em consequência, os ditos anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente dos Estados Unidos N° 4.816.567) nos quais substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para utilizar na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências de domínio variável humanas. A sequência humana que está mais próxima da do roedor é aceita depois como a região estrutura conservada humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutura conservada particular derivada da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura conservada pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)). É mais importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para conseguir este objetivo, de acordo com um método preferido, são preparados anticorpos humanizados por um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Estão disponíveis habitualmente modelos de imunoglobulina tridimensionais e os peritos na especialidade estão familiarizados com eles. Estão disponíveis programas informáticos que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influem na capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antigénio. Desta maneira, podem ser selecionados e ser combinados resíduos de FR das sequências recetoras e importadas de modo que se consiga a caracteristica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo antigénio ou os antigénios alvo. Em geral, os resíduos de região hipervariável estão envolvidos diretamente e mais substancialmente na modificação da ligação a antigénio. (iv) Anticorpos humanos
Como uma alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, é possível agora produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, após sua imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos em ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene de região de ligação de cadeia pesada do anticorpo (JH) em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série de genes de imunoglobulina de linha germinal humana nos ditos ratinhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após sua exposição a antigénio. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al. , Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patentes de Estados Unidos N° 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.
Como alternativa, pode ser utilizada tecnologia de apresentação de fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo In vitro, a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, são clonados genes de domínio V de anticorpo em fase num gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e são apresentados como fragmentos de anticorpos funcionais na superfície da partícula de fago. Devido a que a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que mostra essas propriedades. Portanto, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A apresentação em fagos pode ser realizada numa diversidade de formatos; para sua revisão veja-se, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Podem ser utilizadas várias fontes de segmentos de genes V para apresentação em fagos. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados e anticorpos para uma série diversa de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas em Marks et al., J. Mol. Biol 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Veja-se também, Patentes de Estados Unidos N° 5.565.332 e 5.573.905.
Também podem ser gerados anticorpos humanos por células B ativadas in vitro (veja-se Patentes de Estados Unidos N° 5.567.610 e 5.229.275). (v) Fragmentos de anticorpo
Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolitica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et ai., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e
Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem ser produzidos agora diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos analisadas anteriormente. Como alternativa, podem ser recuperados diretamente fragmentos Fab'-SH de E. coli e ser acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al. , Bi o/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, podem ser isolados fragmentos F(ab')2 diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos resultarão evidentes para o perito na especialidade. Em outras formas de realização, o anticorpo escolhido é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv) . Veja-se o documento WO 93/16185; Patente dos Estados Unidos N° 5.571.894; e Patente dos Estados Unidos N° 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como é descrito na Patente dos Estados Unidos 5.641.870, por exemplo. Os ditos fragmentos lineares podem ser monoespecificos ou biespecificos. (vi) Anticorpos biespecificos
Os anticorpos biespecificos são anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecificos exemplares podem se ligar a dois epítopos diferentes do marcador de superfície de células B. Outros dos ditos anticorpos podem se ligar a um primeiro marcador de células B e além disso se ligar a um segundo marcador de superfície de células B. Como alternativa, pode ser combinado um braço de ligação a marcador anti-células B com um braço que se ligue com uma molécula desencadeante num leucócito tal como uma molécula recetora de células T (por exemplo, CD2 ou CD3) ou recetores de Fc para IgG (FcyR) , tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) para centrar os mecanismos de defensa celular nas células B. Os anticorpos biespecificos também podem ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para a célula B. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a marcadores de células B e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, sapurina, anti-interferão, alcaloide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopos radioativos). Podem ser preparados anticorpos biespecificos como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecificos F(ab')2)· São conhecidos na técnica métodos para preparar anticorpos biespecif icos . A produção tradicional de anticorpos biespecif icos de comprimento completo baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, nos que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al. , Nature, 305: 537-539 (1983)). Devido à classificação aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas, (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que se realiza habitualmente por etapas de cromatografia de afinidade, é incómoda, e os rendimentos do produto são baixos. São revelados procedimentos similares no documento WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655-3659 (1991) .
De acordo com uma abordagem diferente, são fusionados domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de anticorpo-antigénio) com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão está preferentemente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões dobradiça, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) que contenha o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões: ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridas em vetores de expressão separados, e são co-transfetadas num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em formas de realização nas que relações desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É possível, no entanto, inserir as sequências codificantes para duas ou as três cadeias polipeptídicas num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em relações iguais resulta em altos rendimentos ou quando as relações não são de importância particular.
Numa forma de realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos estão compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina híbrido (que proporciona uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecifico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina não desejadas, já que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente a metade da molécula biespecifica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é revelada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos, veja-se, por exemplo, Suresh et al. , Methods in Enzymology, 121: 210 (1986) . De acordo com outra abordagem descrita na Patente dos Estados
Unidos N° 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada tecnicamente para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, são substituídas uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). São criadas "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à cadeia ou as cadeias laterais grandes na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais de aminoácidos grandes com outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais não desejados tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado com avidina, o outro com biotina. Foi proposto que os ditos anticorpos, por exemplo, dirigem células do sistema imune a células não desejadas (Patente dos Estados Unidos N° 4.676.980), e para o tratamento de infeção por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089) . Podem ser preparados anticorpos heteroconjugados utilizando qualquer método de reticulação conveniente. São bem conhecidos na técnica agentes de reticulação adequados e são revelados na Patente dos Estados Unidos N° 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.
Também foram descritas técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo na bibliografia. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos biespecíficos utilizando ligação química. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que são clivados de forma proteolítica anticorpos intactos para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos em presença do agente formador de complexo com ditiol arsenita de sódio para estabilizar ditiois vizinhos e evitar a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são convertidos depois a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é reconvertido depois ao Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. 0 progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al. , J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi secretado por separado de E. coli e foi submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecifico formado desta maneira foi capaz de se ligar a células que sobre-expressavam o recetor de ErbB2 e células T humanas normais, assim como de desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.
Também foram descritas diversas técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpo biespecificos diretamente de cultura celular recombinante. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando zípers de leucina. Kostelny et al. , J. Immunol., 148(5) : 1547-1553 (1992) . Os péptidos de zípers de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados com as partes Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região dobradiça para formar monómeros e depois foram oxidados de novo para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizados para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita em Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado com um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Em consequência, obriga-se aos domínios VH e VL de um fragmento a se emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando desta maneira dois locais de ligação a antigénio. Também foi indicada outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecif icos por meio do utilização dímeros de Fv de cadeia simples (sFv) . Veja-se Gruber et al. , J. Immunol., 152:5368 (1994) . São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos . Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) . São contemplados uma modificação ou modificações de sequências de aminoácidos de antagonistas e anticorpos proteicos ou peptidicos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo ou antagonista de ligação a CD20. São preparadas variantes de sequências de aminoácidos do antagonista introduzindo mudanças de nucleicos apropriados no ácido nucleico antagonista, ou por síntese peptídica. As ditas modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos do antagonista. Realiza-se qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para chegar à construção final, desde que a construção final possua as caracteristicas desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar processos póstraducionais do antagonista, tais como cambiar o número ou posição de locais de glicosilação.
Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do antagonista que são localizações preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese de rastreio de alanina" como é descrito em Cunningham e Wells Science, 244: 1081-1085 (1989) . Aqui, se identifica um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos com carga tais como arg, asp, his, lys e glu) e são substituídos por um aminoácido com carga negativa ou neutro (mais preferentemente alanina ou polialanina) para afetar à interação dos aminoácidos com o antigénio. As localizações de aminoácidos que demonstrem sensibilidade funcional às substituições são refinadas depois introduzindo variantes adicionais ou outras em, ou para, os locais de substituição. Portanto, embora o local para introduzir uma variação de sequências de aminoácidos esteja predeterminado, não é necessário que a natureza da mutação em si mesma esteja predeterminada. Por exemplo, para analisar o rendimento de uma mutação num dado local, se realiza mutagénese de rastreio de ala ou aleatória no codão ou região alvo e as variantes de antagonistas expressadas são rastreadas com respeito à atividade desejada.
As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxilo terminais que variam de comprimento de um resíduo a polipéptidos que contêm cem ou mais resíduos, assim como inserções intrasequência de resíduos de aminoácidos individuais ou múltiplos. Os exemplos de inserções terminais incluem um antagonista com um resíduo metionilo N terminal ou o antagonista fusionado com um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula antagonista incluem a fusão com a extremidade N ou C terminal do antagonista de uma enzima, ou um polipéptido que aumenta a semivida em soro do antagonista.
Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula antagonista substituída por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição de antagonistas de anticorpos incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. São mostradas substituições conservativas no Quadro 1 sob o cabeçalho de "substituições preferidas". Se as ditas substituições resultarem em um mudança na atividade biológica, então podem ser introduzidas mais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplares" no Quadro 1, ou como é descrito adicionalmente posteriormente em referência a classes de aminoácidos e os produtos rastreados.
Quadro 1_
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições
Preferidas
Ala (A)__Vai; Leu; lie__Vai_
Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C)__Ser; Ala__Ser_
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu
Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Vai; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T)__Vai; Ser__Ser_
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (E) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Vai (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu São conseguidas modificações substanciais nas propriedades biológicas do antagonista selecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal polipeptidica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em lâmina ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de origem natural são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influem na orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservativas envolverão permutar um membro de um destas classes por outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do antagonista também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar a reticulação aberrante. Ao contrário, podem ser adicionada uma ligação ou ligações de cisteína ao antagonista para melhorar sua estabilidade (particularmente quando o antagonista é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental. Em geral, a variante ou as variantes resultantes selecionadas para desenvolvimento adicional terão propriedades biológicas melhoradas em relação com o anticorpo parental do que são gerados . Um modo conveniente para gerar as ditas variantes de substituição é a maduração de afinidade utilizando apresentação de fagos. Brevemente, são mutados vários locais de região hipervariável (por exemplo, 6-7 locais) para gerar todas as possíveis substituições de amino em cada local. As variantes de anticorpo geradas deste modo são apresentadas de uma maneira monovalente de partículas de fagos filamentosos como fusões com o produto do gene III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas em fagos são rastreados depois com respeito a sua atividade biológica (por exemplo afinidade de ligação) como é revelado no presente documento. Para identificar locais de região hipervariável candidatos para modificação, pode ser realizada mutagénese de rastreio de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente à ligação de antigénio. Como alternativa, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Os ditos resíduos de contacto e resíduos adjacentes são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Uma vez que são geradas as ditas variantes, o painel de variantes é submetido a rastreio como foi descrito no presente documento e podem ser selecionados anticorpos com propriedades superiores num ou mais ensaios relevantes para desenvolvimento posterior.
Outro tipo de variante de aminoácido do antagonista altera o padrão de glicosilação original do antagonista. Por alterar entende-se suprimir um ou mais resíduos de hidratos de carbono encontrados no antagonista e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no antagonista. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à ligação do resíduo de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptidicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, nas quais X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática do resíduo de hidrato de carbono com a cadeia lateral de asparagina. Portanto, a presença de uma destas sequências tripeptidicas num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação ligada ao refere-se à ligação de um dos açúcares JV-acetilgalactosamina, galactose ou xilose com um hidroxiaminoácido, mais habitualmente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao antagonista consegue-se convenientemente alterando a sequência de aminoácidos de modo que contenha uma ou mais das sequências tripeptidicas anteriormente descritas (para locais de glicosilação ligados a N) . A alteração também pode ser realizada por meio da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do antagonista (para locais de glicosilação ligados a 0) . São preparadas moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos do antagonista por uma diversidade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitação, isolamento de uma fonte natural (em o caso de variantes de sequência de aminoácidos de origem natural) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida), mutagénese por PCR e mutagénese por cassete de uma versão variante ou não variante previamente preparada do antagonista.
Pode ser desejável modificar o antagonista da invenção com respeito à função efetora, por exemplo, para potenciar a citotoxicidade mediada por células dependente de antigénio (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do antagonista. Isto pode ser conseguido introduzindo uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc de um anticorpo antagonista. Como alternativa ou adicionalmente, podem ser introduzidos um resíduo ou resíduos de cisteína na região Fc, permitindo desta maneira a formação de ligações dissulfureto intercadeia nesta região. 0 anticorpo homodimérico gerado desta maneira pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou destruição celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Veja-se, Caron et al. , J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992) . Também podem ser preparados anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral potenciada utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais como são descritos em Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993) . Como alternativa, pode ser obtido por engenharia genética um anticorpo que tem regiões Fc duplas e pode ter, portanto, lise do complemento e capacidades de ADCC potenciadas. Veja-se Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
Para aumentar a semivida em soro do antagonista, pode ser incorporado um epitopo de ligação a recetor de recuperação no antagonista (especialmente um fragmento de anticorpo) como é descrito na Patente dos Estados Unidos 5,739,277, por exemplo. Como é utilizada no presente documento, a expressão "epitopo de ligação a recetor de recuperação" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável por aumentar a semivida em soro in vivo da molécula de IgG.
Ensaios
As concentrações de células B periféricas são determinadas por um método de FACS que recuenta a células CD3-/CD40+. A percentagem de células B CD3-CD40+ de linfócitos totais em amostras pode ser obtida pela seguinte estratégia de seleção. A população de linfócitos é marcada no diagrama de dispersão de dispersão frontal/dispersão lateral para definir a Região 1 (Rl) . Utilizando acontecimentos em Rl, são apresentados os gráficos de pontos de intensidade de fluorescência para os marcadores de CD40 e CD3. São utilizados controlos de isotipos marcados com fluorescência para determinar os pontos de corte respetivos para a positividade para CD40 e CD3.
Análise de FACS São lavadas meio milhão de células e são ressuspensas em 100 μΐ de tampão FACS, que é solução salina tamponada com fosfato com BSA a 1 %, que contém 5 μΐ de anticorpo de coloração ou de controlo. Todos os anticorpos de coloração, incluindo controlos de isotipo, são obtidos de PharMingen, San Diego, CA. É avaliada a expressão de CD20 humano corando com Rituxan® juntamente com anticorpo secundário anti-IgGl humano conjugado com FITC. É realizada análise de FACS utilizando FACScan e Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Todos os linfócitos são definidos nas dispersões de luz frontal e lateral, enquanto que todos os linfócitos B são definidos com a expressão de B220 na superfície celular. É avaliada a depleção de células B e sua recuperação analisando contagens de células B periféricas e análise de células B hCD20+ por FACS no baço, gânglio linfático e medula óssea diariamente durante a primeira semana depois da injeção e a seguir semanalmente. São controlados os níveis em soro do anticorpo variante 2H7 injetado.
Formulações farmacêuticas
As formulações terapêuticas dos anticorpos de ligação a CD20 usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando um anticorpo que tem o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), em forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os recetores às dosagens e concentrações utilizadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametonio; cloreto de benzalconio, cloreto de benzetonio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metilo ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixa massa molecular (de menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como olivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trehasol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo complexos de Zn-proteina); e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). São descritas formulações de anticorpo anti-CD20 exemplares no documento W098/56418. Outra formulação é uma formulação multidose liquida que compreende o anticorpo anti-CD20 a 40 mg/ml, acetato 25 mM, trealose a 150 mM, álcool benzilico a 0,9 %, polisorbato 20 a 0,02 %, a pH 5,0 que tem um período de validade mínimo de dois anos de armazenamento a 2-8 °C. Outra formulação anti-CD20 de interesse compreende anticorpo 10 mg/ml em cloreto de sódio a 9, 0 mg/ml, citrato de sódio dihidrato a 7,35 mg/ml, polisorbato 80 a 0,7 mg/ml e Água Estéril para injeção, pH 6,5. Mais outra formulação farmacêutica aquosa compreende acetato de sódio a 10-30 mM de cerca de pH 4,8 a cerca de pH 5,5, preferentemente a pH 5,5, polisorbato como um tensioativo numa quantidade de cerca de 0, 01-0, 1 % v/v, trealose numa quantidade de cerca de 2-10 % p/v, e álcool benzilico como um conservante (documento U.S. 6.171.586). São descritas formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea no documento W097/04801. As ditas formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado até uma concentração de proteína alta e a formulação reconstituída pode ser administrado por via subcutânea ao mamífero para tratar no presente documento.
Uma formulação para as variantes de 2H7 humanizadas é o anticorpo a 12-14 mg/ml em histidina a 10 mM, sacarose a 6 %, polisorbato 20 a 0,02 %, pH 5,8. Numa forma de realização específica, são formuladas variantes de 2H7 e em particular 2H7.vl6 a 20 mg/ml de anticorpo em sulfato de histidina 10 mM, sacarose a 60 mg/ml, polisorbato 20 a 0,2 mg/ml e Água Estéril para Injeção, a pH 5,8. A formulação do presente documento também pode conter mais de um composto ativo conforme seja necessário para a indicação particular que se trate, preferentemente as que têm atividades complementares que não se afetam de forma adversa entre si. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um agente citotóxico, agente quimioterápico, citocina ou agente imunossupresor (por exemplo, um que age em células T, tais como ciclospurina ou um anticorpo que se liga a células T, por exemplo, um que se liga a LFA-1) . A quantidade eficaz dos ditos outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou tratamento, e outros fatores analisados anteriormente. Estes são utilizados em geral nas mesmas dosagens e com vias de administração como é descrito no presente documento ou de cerca de 1 a 99 % das dosagens utilizadas até o momento.
Os princípios ativos também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respetivamente, em sistemas de fornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. As ditas técnicas são reveladas em Remington' s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contêm o antagonista, cujas matrizes estão em forma de artigos moldados, por exemplo películas ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidas (Patente dos Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de L-ácido glutámico e etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações para utilizar para administração in vivo devem ser estéreis. Isto consegue-se facilmente por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Tratamento de doença
Doenças
Os anticorpos de ligação a CD20 e antagonistas de BLyS revelados no presente documento são úteis para tratar tumores malignos de células B e distúrbios autoimunes regulados por células B.
As doenças autoimunes reguladas por células B incluem artrite (artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriásica), psoríase, dermatite incluindo dermatite atópica; urticária autoimune crónica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia sistémica e esclerose, respostas associadas a doença inflamatória intestinal (Eli) (doença de Crohn, colite ulcerosa), síndrome de dificuldade respiratória, síndrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), meningite, rinite alérgica, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições patológicas alérgicas, eczema, asma, condições patológicas que implicam a infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus (incluindo nefrite, não renal, discoide, alopecia), diabetes de aparição juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, Anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica imunitária incluindo anemia hemolítica autoimune (AHAI), anemia perniciosa, aplasia de glóbulos vermelhos pura (AGRP), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que implicam diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, sindrome de lesão de múltiplos órgãos, miastenia grave, doenças mediadas por complexo de antigénio-anticorpo, doença de membrana basal anti-glomerular, sindrome de anticorpo anti-fosfolipidico, neurite alérgica, doença de Behcet, sindrome de Castleman, Sindrome de Goodpasture, Sindrome Miasténico de Lambert-Eaton, Sindrome de Reynaud, sindrome de Sjogren, sindrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplantes de órgãos sólidos (incluindo pré-tratamento para títulos de anticorpos altamente reagentes ao painel, depósito de IgA em tecidos, etc.), doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD), penfigoide bulhoso, pénfigo (todos incluindo vulgar, foliáceo), poliendocrinopatias autoimunes, doença de Reiter, sindrome da pessoa rígida, arterite de células gigantes, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e o ovário incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotiroidismo primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tiroidite autoimune, tiroidite crónica (Tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Graves, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular) , diabetes de Tipo I também denominada diabetes mellitus insulino dependente (IDDM) e sindrome de Sheehan; hepatite autoimune, neumonite intersticial Linfoide (VIH), bronquiolite obliterante (sem transplante) contr NSIP, Sindrome de Guillain-Barre, Vasculite de Vasos Grandes (incluindo
Polimialgia Reumática e Arterite de Células Gigantes (de Takayasu)), Vasculite de Vasos Medianos (incluindo Doença de Kawasaki e Poliarterite Nodosa), espondilite anquilosante, Doença de Berger (nefropatia de IgA), Glomerulonefrite de Progressão Rápida, cirrose biliar primária, espru Celíaco (enteropatia de glúten), crioglobulinemia, ALS, doença das artérias coronárias.
As neoplasias de células B incluem doença de Hodgkin CD2O-positiva incluindo doença de Hodgkin com linfócitos predominantes (LPHD); linfoma não de Hodgkin (NHL), linfomas de células do centro folicular (FCC); leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia de tricoleucitos . 0 linfoma não de Hodgkin inclui linfoma não de Hodgkin folicular/de grau baixo (NHL) , NHL linfocítico pequeno (SL), NHL folicular/de grau intermediário, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de grau alto, NHL linfoblástico de grau alto, NHL de células não clivadas pequenas de grau alto, NHL de doença voluminosa, linfoma linfocítico plasmacitoide, linfoma de células do manto, linfoma relacionado com SIDA e macroglobulinemia de Waldenstrom. Também se contempla o tratamento de recaídas destes cancros. LPHD é um tipo de doença de Hodgkin que tende a recair frequentemente apesar do tratamento com radiação ou quimioterapia e se caracteriza por células malignas CD20 positivas. CLL é um de quatro tipos principais de leucemia. Um cancro de células B maduras denominadas linfócitos, CLL se manifesta por acúmulo progressivo de células em sangue, medula óssea e tecidos linfáticos. 0 linfoma indolente é uma doença incurável, de crescimento de lento na qual o paciente médio sobrevive entre seis e 10 anos depois de numerosos períodos de remissão e recaída.
Os antagonistas de BLyS e anticorpos de ligação a CD20 podem ser utilizados para tratar linfoma não de Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin com linfócitos predominantes (LPHD), leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma linfocítico pequeno (SLL) que é um tipo de linfoma não de Hodgkin (NHL), artrite reumatoide e artrite reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico (SLE), incluindo nefrite lúpica, doença de Wegener, doença inflamatória intestinal, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia autoimune, esclerose múltipla, psoriase, nefropatia de IgA, polineuropatias IgM, miastenia grave, vasculite, diabetes mellitus, sindrome de Reynaud, sindrome de Sjogren e glomerulonefrite. 0 nível desejado de depleção de células B dependerá da doença. Para o tratamento de um cancro CD20 positivo, pode ser desejável maximizar a depleção das células B que são o alvo dos anticorpos anti-CD20 da invenção. Portanto, para o tratamento de uma neoplasia de células B CD20 positiva, é desejável que a depleção de células B seja suficiente para evitar pelo menos a progressão da doença que pode ser avaliada pelo médico perito na especialidade, por exemplo, controlando o crescimento tumoral (tamanho), proliferação do tipo de célula cancerosa, metástase, outros sinais e sintomas do cancro particular. Preferentemente, a depleção de células B é suficiente para evitar a progressão de doença durante pelo menos 2 meses, mais preferentemente 3 meses, ainda mais preferentemente 4 meses, mais preferentemente 5 meses, ainda mais preferentemente 6 meses ou mais. Em formas de realização ainda mais preferidas, a depleção de células B é suficiente para aumentar o tempo em remissão em pelo menos 6 meses, mais preferentemente 9 meses, mais preferentemente um ano, mais preferentemente 2 anos, mais preferentemente 3 anos, ainda mais preferentemente 5 anos ou mais. Numa forma de realização mais preferida, a depleção de células B é suficiente para curar a doença. Em formas de realização preferidas, a depleção de células B num paciente de cancro é pelo menos cerca de 75 % e mais preferentemente, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e inclusive 100 % do nível da avaliação inicial antes do tratamento.
Para o tratamento de uma doença autoimune, pode ser desejável modular o alcance da depleção de células B dependendo da doença e/ou a gravidade da condição patológica no paciente individual, ajustando a dosagem do anticorpo de ligação a CD20. Portanto, a depleção de células B pode ser, mas não é necessário que seja completa. Por outro lado, pode ser desejada a depleção de células B total no tratamento inicial mas em tratamentos posteriores, a dosagem pode ser ajustada para conseguir somente a depleção parcial. Numa forma de realização, a depleção de células B é de pelo menos 20 %, isto é, 80 % ou menos de células B CD20 positivas permanecem em comparação com o nível de avaliação inicial antes do tratamento. Em outras formas de realização, a depleção de células B é de 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou mais. Preferentemente, a depleção de células B é suficiente para deter a progressão da doença, mais preferentemente para aliviar as sinais e sintomas da doença particular em tratamento, ainda mais preferentemente para curar a doença.
As publicações com respeito à terapêutica com Rituximab incluem: Perotta e Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Resumo N° 3360 Blood 10(1) (parte 1-2): p. 88B (1998); Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4) : 952-957 (2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 Abril, 2001); Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61 833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9) : S370 (2001); Leandro et al. "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1): 2673-2677 (2002); Edwards e Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rheumatology 40: 205-211 (2001) ; Edwards et al. "B lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem. Soc. Trans. 30(4): 824-828 (2002); Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S 197 (2002); Levine e Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. "Efficacy of seletive B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; 24-29 oct; Nova Orleans, A 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; 24-29 oct; Nova Orleans, A 2002.
Para aplicações terapêuticas, as composições de anticorpo anti-CD20 e antagonista de BLyS podem ser utilizado em terapêutica de combinação com, por exemplo, agentes quimioterápicos, hormonas, antiangiógenos, compostos radiomarcados ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Os métodos de tratamento precedente podem ser administrados juntamente com outras formas de terapêutica convencional, consecutivamente com, pré ou pós-terapêutica convencional. O anticorpo anti-CD20 e antagonista de BLyS serão administrados com uma dose terapeuticamente eficaz de agente quimioterápico. Em outra forma de realização, o anticorpo anti-CD20 e antagonista de BLyS são administrados juntamente com quimioterapia para potenciar a atividade e eficácia do agente quimioterápico. O Physicians' Desk Reference (PDR) revela dosagens e agentes quimioterápicos que foram utilizados no tratamento de diversos cancros. O regime de dosagem e dosagens destes fármacos quimioterápicos anteriormente mencionados que são terapeuticamente eficazes dependerão do cancro particular que se trate, o alcance da doença e outros fatores com os quais está familiarizado o médico perito na especialidade e podem ser determinadas pelo médico.
Um paciente é aliviado ou tratado com sucesso de uma neoplasia de células B ou doenças autoimunes reguladas por células B pelos presentes métodos da invenção se houver uma melhora mensurável nos sintomas ou outros critérios aplicáveis depois da administração das composições da invenção em comparação com antes do tratamento. 0 efeito do tratamento pode resultar evidente num intervalo de 3-10 semanas depois da administração das composições da invenção. Os critérios aplicáveis para cada doença serão bem conhecidos pelo médico perito na especialidade apropriada. Por exemplo, o médico pode controlar ao paciente tratado com respeito a testes clínicos, ou serológicos, de doença tais como marcadores serológicos de doença, contagem de sangue completo incluindo contagem de células B, e níveis de imunoglobulina em soro. Os níveis em soro de IgG e IgM são reduzidos em ratinhos tratados com BR3-Fc. Espera-se que os pacientes humanos que respondem ao tratamento com BR3-Fc ou anticorpo anti-CD20 ou ambos mostrem de forma similar uma redução nos níveis de IgG e IgM em soro. O paciente pode amostrar redução observável e/ou mensurável em ou em ausência de um ou mais dos seguintes: redução do número de células cancerosas ou ausência das células cancerosas; redução do tamanho tumoral; inibição (isto é, retardamento em certo grau e preferentemente detenção) da infiltração de células cancerosas em órgãos; inibição (isto é, retardamento em algum grau e preferentemente detenção) de metástase tumoral; inibição, em algum grau, do crescimento tumoral; e/ou alivio em algum grau, de um ou mais dos sintomas associados com o cancro especifico; redução da morbilidade e mortalidade, e melhora de problemas da qualidade de vida. Preferentemente, depois da administração das composições da invenção, a melhora é de pelo menos 20 % sobre a avaliação inicial para um sintoma particular ou critério tomado antes do tratamento pelos métodos da invenção, mais preferentemente, 25-30 %, ainda mais preferentemente 30-35 %, mais preferentemente 40 % e superior.
Os parâmetros para avaliar a eficácia ou sucesso do tratamento da neoplasia serão conhecidos pelo médico perito na doença apropriada. Em geral, o médico perito buscará a redução dos sinais e sintomas da doença especifica. Os parâmetros podem incluir a média do tempo até progressão da doença, tempo em remissão e doença estável. Para neoplasias de células B, os critérios mensuráveis podem incluir, por exemplo, tempo até progressão da doença, um aumento da duração de sobrevivência geral e/ou sem progressão. No caso de leucemia, pode ser realizada uma biópsia de medula óssea para determinar o grau de remissão. A remissão completa pode ser definida como as células de leucemia que compõem menos de 5 por cento de todas as células encontradas na medula óssea de um paciente 30 dias depois do tratamento.
As referências seguintes descrevem linfomas e CLL, seus diagnósticos, tratamento e procedimentos médicos convencionais para medir a eficácia do tratamento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Filadélfia, 1998; van Besien K e Cabanillas, F: Clinicai Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Cap. 70, pp 1293-1338, em: Hematology, Basic
Principles and Practice, 3a ed. Hoffman et al. (editores). Churchill Livingstone, Filadélfia, 2000; e Rai, K e Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Cap. 72, pp 1350-1362, em: Hematology, Basic Principles and Practise, 3a ed. Hoffman et al. (editores). Churchill Livingstone, Filadélfia, 2000.
Os parâmetros para avaliar a eficácia ou o sucesso do tratamento de uma doença autoimune ou relacionada com a autoimunidade serão conhecidos pelo médico perito na doença apropriada. Em geral, o médico perito buscará a redução dos sinais e sintomas da doença especifica. Os seguintes são exemplos. A artrite reumatoide (AR) é um distúrbio autoimune de etiologia desconhecida. A maioria dos pacientes com AR sofrem uma evolução crónica da doença que, inclusive com terapêutica, pode resultar em destruição progressiva das articulações, deformidade, incapacidade e inclusive morte prematura. Os objetivos da terapêutica de AR são prevenir ou controlar o dano às articulações; prevenir a perda de função e reduzir a dor. A terapêutica inicial de AR envolve habitualmente a administração de um ou mais dos seguintes fármacos: fármacos anti-inflamatórios não esteroides (ΑΙΝΕ), glicocorticoides (por meio de injeção nas articulações) e prednisona de dose baixa. Veja-se "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (fevereiro, 2002) . A maioria dos pacientes com AR de novo diagnóstico começam a terapêutica de fármaco antirreumático modificador de doença (ARMD) num período de 3 meses desde o diagnóstico. São ARMD habitualmente utilizados em AR a hidroxicloroquina, sulfasalizina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab (mais metotrexato oral e subcutâneo), azatioprina, D-penicilamina, Oro (oral), Oro (intramuscular), minociclina, ciclospurina, imunoadsorção de proteína A Estafilocócica.
Devido a que o corpo produz fator de necrose tumoral alfa (TNFCC) durante a AR, foram utilizados inibidores de TNFCC para terapêutica dessa doença. Etanercept (ENBREL®) é um fármaco injetável aprovado em Estados Unidos para a terapêutica de AR ativa. Etanercept se liga a TNFCC e age para retirar a maioria de TNFCC das articulações e o sangue, evitando desta maneira que TNFCC promove a inflamação e outros sintomas de artrite reumatoide. O Etanercept é uma proteína de fusão de "imunoadesina" que consiste na parte de ligação a ligando extracelular do recetor do fator de necrose tumoral (TNFR) de 75 kD (p75) humano ligado com a parte Fc de um IgGl humano. Infliximab, que se vende com o nome comercial REMICADE®, é um fármaco supressor imune prescrito para tratar a AR e doença de Crohn. Infliximab é um anticorpo monoclonal quimérico que se liga a TNFCC e reduz a inflamação no corpo se dirigindo a e se ligando a TNFOC que produz inflamação.
Adalimumab (HUMIRA™, Abbott Laboratories), previamente conhecido como D2E7, é um anticorpo monoclonal humano que se liga a TNFOC e está aprovado para reduzir as sinais e sintomas e inibir a progressão de dano estrutural em adultos com AR de moderada a gravemente ativa que tiveram uma resposta insuficiente a um ou mais ARMD modificadores de doença tradicionais. 0 tratamento da artrite reumatoide administrando um anticorpo anti-CD20 e um antagonista de BLyS pode ser preformado juntamente com terapêutica com um ou mais dos fármacos anteriormente mencionados para AR.
Para artrite reumatoide, por exemplo, as medições para o progresso no tratamento podem incluir o número de articulações inchadas e dolorosas e a duração da rigidez matutina. Os pacientes podem ser examinados com respeito a quanto foram erosionadas as articulações nas mãos e nos pés utilizando raios X e um sistema de pontuação conhecido como a pontuação de Sharp. Outro sistema de pontuação baseia-se nos critérios do Colégio de Reumatologia Americano para avaliar a resposta a terapêuticas.
Um método para avaliar a eficácia do tratamento em AR baseia-se nos critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ACR), que mede a percentagem de melhora em articulações dolorosas e inflamadas, entre outras coisas. 0 paciente com AR pode ser pontuado a, por exemplo, ACR 20 (20 por cento de melhora) em comparação com sem tratamento de anticorpos (por exemplo, avaliação inicial antes do tratamento) ou tratamento com placebo. Outras maneiras de avaliar a eficácia do tratamento com anticorpos incluem a pontuação de raios X tais como a pontuação de raios X de Sharp utilizada para pontuar o dano estrutural tal como erosão óssea e estreitamento do espaço das articulações. Os pacientes também podem ser avaliados com respeito à prevenção de ou melhora na incapacidade com base na pontuação do Questionário de Avaliação de Saúde [HAQ], pontuação AIMS, SF-36 em períodos de tempo durante ou depois do tratamento. Os critérios de ACR 20 podem incluir 20 % de melhora tanto na contagem de articulações dolorosas como na contagem de articulações inflamadas mais uma melhora do 20 % em pelo menos 3 de 5 medidas adicionais: 1. avaliação da dor do paciente por escala visual analógica (VAS), 2. avaliação global do paciente de atividade de doença (VAS), 3. avaliação global do médico da atividade de doença (VAS), 4. incapacidade auto-alaviada pelo paciente medida pelo
Questionário de Avaliação de Saúde, e 5. pacientes que reagem em fase aguda, CRP ou ESR. O ACR 50 e 70 são definidos de forma análoga. Preferentemente, administra-se ao paciente uma quantidade de um anticorpo de ligação a CD20 da invenção eficaz para conseguir pelo menos uma pontuação de ACR 20, preferentemente pelo menos ACR 30, mais preferentemente pelo menos ACR50, ainda mais preferentemente pelo menos ACR70, mais preferentemente pelo menos ACR 75 e superior. A artrite psoriásica tem características radiográficas únicas e definidas. Para a artrite psoriásica, pode ser avaliada a erosão das articulações e estreitamento do espaço das articulações também pela pontuação de Sharp. Os anticorpos de ligação a CD20 humanizados revelados no presente documento podem ser utilizados para prevenir o dano das articulações assim como reduzir os sinais de doença e sintomas do distúrbio.
Mais outro aspeto da invenção é um método para tratar Lupus ou SLE administrando ao paciente que sofre SLE, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20 humanizado da invenção. As pontuações de SLEDAI proporcionam uma quantificação numérica da atividade da doença. O SLEDAI é um índice ponderado de 24 parâmetros clínicos e de laboratório que se sabe que estão correlacionados com a atividade de doença, com um intervalo numérico de 0-103. Veja-se Bryan Gescuk e John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" em Current Opinion in Rheumatology 2002, 14: 515-521. Acredita-se que os anticorpos para ADN de cadeia dupla provocam brotes renais e outras manifestações de lupus. Os pacientes que são submetidos a tratamento com anticorpos podem ser controlados com respeito ao tempo até brote renal, que é definido como um aumento significativo, reproduzível, da creatinina em soro, proteína em urina ou sangue na urina. Como alternativa ou além disso, os pacientes podem ser controlada com respeito aos níveis de anticorpos antinucleares e anticorpos para ADN de cadeia dupla. Os tratamentos para SLE incluem corticosteroides de alta dose e/ou ciclofosfamida (HDCC).
As espondiloartropatias são um grupo de distúrbios das articulações, que incluem espondilite anquilosante, artrite psoriásica e doença de Crohn. O sucesso do tratamento pode ser determinado por ferramentas de medição de avaliação global pelo paciente e o médico validadas.
Para lupus eritematoso sistémico, os pacientes podem ser controlada com respeito a níveis de anticorpos antinucleares e anticorpos para ADN de cadeia dupla. São utilizadas diversas medicações para tratar a psoríase; o tratamento difere diretamente em relação com a gravidade da doença. Os pacientes com uma forma mais leve de psoriase tipicamente utilizam tratamentos, tais como esteroides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol e tazaroteno, para controlar a doença enquanto que os pacientes com psoriase moderada e grave têm mais probabilidades de emplear terapêuticas sistémicas (metotrexato, retinoides, ciclospurina, PUVA e UVB). Também são utilizados alcatrões. Estas terapêuticas têm uma combinação de preocupações de segurança, regimes que consomem tempo ou processos de tratamento inconvenientes. Além disso, alguns requerem equipamento caro e espaço dedicado no ambiente de oficina. As medicações sistémicas podem produzir graves efeitos secundários, incluindo hipertensão, hiperlipidemia, supressão de medula óssea, doença hepática, doença renal e distúrbio gastrointestinal. Além disso, a utilização de fototerapia pode aumentar a incidência de cancros cutâneos. Além da inconveniência e incomodidade associada com a utilização de terapêuticas tópicas, a fototerapia e os tratamentos sistémicos requerem a passagem dos pacientes por etapas com terapêutica e sem terapêutica e o controlo da exposição no tempo de vida devido a seus efeitos secundários. A eficácia do tratamento para psoriase é avaliada controlando as mudanças nos sinais clínicas e sintomas da doença incluindo mudanças na Avaliação Global do Médico (PGA) e as pontuações do índice de Área e Gravidade de Psoriase (PASI), Avaliação dos Sintomas de Psoriase (PSA), em comparação com a condição de avaliação inicial. 0 paciente pode ser avaliado periodicamente durante todo o tratamento na escala analógica visual utilizada para indicar o grau de prurido experimentado em pontos de tempo específicos.
Dosagem
Dependendo da indicação para tratar e os fatores relevantes para a dosagem com os que estaria familiarizado um médico perito no campo, os antagonistas de BLyS e anticorpos de ligação a CD20 da invenção serão administrados a uma dosagem que é eficaz para o tratamento de esa indicação minimizando ao mesmo tempo a toxicidade e os efeitos secundários. Para o tratamento de pacientes que sofrem de neoplasia de células B tais como linfoma não de Hodgkin numa forma de realização específica, os anticorpos anti-CD20 da invenção serão administrados a um paciente humano num intervalo de dosagem de 1 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal, preferentemente a 2,5 mg/kg até 10 mg/kg. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-CD20 é administrado a uma dosagem de 10 mg/kg ou 375 mg/m2. Para o tratamento de NHL, um regime de dosagem seria administrar 375 mg/m2 de anticorpo anti-CD20 a cada duas semanas para 2-4 dose, ou uma dose da composição de anticorpo na primeira semana de tratamento, seguido de um intervalo de 2 semanas, depois é administrada uma segunda dose da mesma quantidade de anticorpo. Em geral, os pacientes com NHL recebem o dito tratamento uma vez durante ao ano mas após a reaparição do linfoma, o dito tratamento pode ser repetido. No tratamento de NHL, o anticorpo anti-CD20 mais terapêutica com antagonista de BLyS podem ser combinadas com quimioterapia tal como com CHOP. Em outra forma de realização, para o tratamento de neoplasias de células B tais como CLL ou SLL, os pacientes podem receber quatro doses semanais de Rituxan a 375 mg/m2 depois ou antes da administração com BR3-Fc com CLL recidivante. Para CLL, o tratamento com o anticorpo anti-CD20 e antagonistas de BLyS pode ser combinadas com quimioterapia, por exemplo, com fludarabina e citoxan.
Para o tratamento de artrite reumatoide, numa forma de realizaçao, Rituxan que e um anticorpo quimérico e administrada a 500 mg por dose a cada duas semanas para um total de 2 dose. Um anticorpo anti-CD20 humanizado, por exemplo, hu2H7v.l6 ou qualquer variante de hu 2H7 como é revelado no presente documento, pode ser administrado a menos de 500 mg por dose tal como entre cerca de 200-500 mg por dose, entre cerca de 250 mg-450 mg, ou 300-400 mg por dose, para 2-4 dose a cada duas semanas ou cada 3 semanas.
Pode ser administrado Br3-Fc a um intervalo de dosagem de 0,5 mg/kg a 10 mg/kg, preferentemente de 1 mg/kg a 5 mg/kg, mais preferentemente, de 1,5 mg/kg a 2,5 mg/kg. Numa forma de realização, é administrada BR3-Fc a 5 mg/kg cada dois dias do dia 1 ao dia 12 de tratamento. Também se contempla a dosagem a cerca de 2-5 mg/kg cada 2-3 dias para um total de 2-5 dose.
Os métodos de tratamento compreendem uma combinação de administração simultânea e sequencial do anticorpo anti-CD20 e o antagonista de BLyS (ambos denominados no presente documento fármacos). Em administração sequencial, os fármacos podem ser administrados em qualquer ordem, isto é, antagonista de BLyS em primeiro lugar seguido de anticorpo anti-CD20. O paciente se trata com um fármaco e se controla com respeito a eficácia antes do tratamento com o fármaco. Por exemplo, se o antagonista de BLyS produz uma resposta parcial, o tratamento pode ser seguido do anticorpo anti-CD20 para conseguir uma resposta completa, e vice-versa. 0 BR3-Fc que é uma imunoadesina tem uma metade mais curta em comparação com um anticorpo anti-CD20 de comprimento completo. Para o tratamento de doenças autoimunes tais como artrite reumatoide, se o anticorpo anti-CD20 for Rituxan e o antagonista do BLyS for BR3-Fc, numa forma de realização preferida, o paciente que o necessite recebe BR3-Fc antes do tratamento com Rituxan. Como alternativa, pode ser administrado inicialmente ao paciente ambos os fármacos e a dosagem posterior pode ser com somente um ou o outro fármaco.
Para acondicionar ao paciente para que tolere os fármacos e/ou reduza o surgimento de efeitos adversos tais como sintomas relacionados com infusão que surgem das administrações inicial e posterior do composto terapêutico, pode ser administrado ao mamífero que o necessite uma dose de acondicionamento primeira ou inicial de um ou ambos fármacos e ser administrado depois pelo menos uma segunda dose terapeuticamente eficaz de um ou ambos fármacos em que a segunda e qualquer dose posterior são maiores que a primeira dose. A primeira dose serve para acondicionar ao mamífero para que tolere a segunda dose terapêutica mais alta. Desta maneira, o mamífero pode tolerar doses maiores do composto terapêutico do que poderia ser administrado inicialmente. Uma "dose de acondicionamento" é uma dose que atenua ou reduz a frequência ou a gravidade dos efeitos secundários adversos da primeira dose com a administração de um composto terapêutico. A dose de acondicionamento pode ser uma dose terapêutica, uma dose subterapêutica, uma dose sintomática ou uma dose sub-sintomática. Uma dose terapêutica é uma dose que mostra um efeito terapêutico no paciente e uma dose subterapêutica é uma dose que não mostra um efeito terapêutico no paciente tratado. Uma dose sintomática é uma dose que induz pelo menos um efeito adverso na administração e uma dose sub-sintomát ica é uma dose que não induz um efeito adverso. Alguns efeitos adversos são febre, cefaleia, náuseas, vómitos, dificuldades na respiração, mialgia e escalafrios.
Via de administração
Os antagonistas de BLyS e os anticorpos anti-CD20 são administrados a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como uma embolada ou por infusão continua durante um período de tempo, por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, intra-articular, intrasinovial, intratecal ou inhalação. 0 anticorpo anti-CD20 será administrado em geral por administração intravenosa ou subcutânea. Os fármacos podem ser administrados pela mesma ou diferente via.
Artigos de fabrico e kits É revelado no presente documento um artigo de fabrico que compreende um antagonista de BLyS e um anticorpo anti-CD20 útil para o tratamento de um tumor maligno baseado em células B ou um distúrbio autoimune regulado por células B revelado anteriormente. Numa forma de realização específica, o artigo de fabrico contém o BR3-Fc de SEQ ID 2, e o anticorpo hu2H7v.l6, para o tratamento de linfoma não de Hodgkin. 0 artigo de fabrico compreende pelo menos um recipiente e uma etiqueta ou prospecto em ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, viais, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma diversidade de materiais, tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição da invenção que é eficaz para o tratamento da condição patológica e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um vial que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um anticorpo de ligação a CD20 da invenção tal como Rituxan™ ou hu2H7v.l6, e o outro agente ativo é um antagonista de BLyS tal como BR3-Fc. A etiqueta ou o prospecto indicam que a composição é utilizada para tratar a condição patológica particular, por exemplo, linfoma não de Hodgkin ou artrite reumatoide. A etiqueta ou o prospecto compreenderão além disso instruções para administrar a composição ao paciente. Adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender além disso um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir além disso outros materiais desejáveis desde um ponto de vista comercial e de utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Também são proporcionados kits que são úteis para diversos fins, por exemplo, para ensaios de destruição de células B. Como com o artigo de fabrico, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou prospecto em ou associado com o recipiente. 0 recipiente contém uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-CD20 e um antagonista de BLyS da invenção. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controlo. A etiqueta ou o prospecto podem proporcionar uma descrição da composição assim como instruções para a utilização pretendido in vitro ou de diagnóstico.
Exemplos experimentais
Exemplo 1
Desenvolvimento de anticorpos monoclonais para CD20
Foram hiperimunizados seis ratinhos Balb/c, três ratos Lewis (Charles River Laboratories, Hollister, CA) e três hámsteres arménios (Cytogen Research and Development, Inc., Boston, MA) com células 293 humanas infetadas por adenovirus que expressavam de forma transitória CD20 murino (Genentech, Inc. , South San Francisco, CA) , em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Foram administrados reforços pré-fusão, consistentes em células murinas que expressavam níveis endógenos de CD20 e mCD20 recombinante purificado expressado em E. coli (Genentech, Inc., South San Francisco, CA), três dias antes da fusão. As células B de todos os animais foram fusionadas com células de mieloma de ratinho (X63.Ag8,653; Colecção Americana de Cultura Celular, Manassas, VA) utilizando um protocolo modificado análogo a um previamente descrito (Kohler e Milstein, 1975; Hongo et al., 1995) . Depois de 10-14 dias, os sobrenadantes das fusões de ratinho e hámster foram recolhidos e foram rastreados com respeito a produção de anticorpo anti-CD20 murino e anti-CD20 humano por ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) direto. O rastreio de ELISA de mCD20 identificou 59 hibridomas positivos da fusão de hámster (2 com reação cruzada com hCD20) e 1 hibridoma positivo da fusão de ratinho (que reage de forma cruzada com hCD20) . São injetatos clones positivos, que mostram a maior imunoligação depois de subclonar por diluição limitante, em ratinhos sensibilizados com Pristano (Freund e Blair, 1982) para a produção in vivo de Mab ou são cultivadas in vitro. O liquido ascitico e/ou os sobrenadantes são agrupados e são purificados por cromatografia de afinidade (cromatografia liquida de proteínas rápida [FPLC] de Pharmacia; Pharmacia; Uppsala, Suécia) como foi descrito previamente (Hongo et al., 1995) ou utilizando uma versão modificada do protocolo previamente descrito. As preparações de anticorpos purificados são esterilizadas por filtração (tamanho de poro de 0,2 μιη, Nalgene, Rochester NY) e são armazenadas a 4 °C em PBS. ELISA direto para a avaliação de soros imunes
Foram revestidas placas de microtitulação (NUNC) com 100 μΐ/poço de CD20 murino ou humano (1 μρ/ιηΐ; Genentech, Inc., South San Francisco, CA) em tampão de carbonato 0,05 M, pH 9,6. As placas revestidas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem ELISA (PBS/ Tween 20 0,05 %) e foram bloqueadas durante pelo menos 1 h com PBS que continha albumina de soro bovina 0,5 % e Tween 20 0, 05 % (PBS/BSA/T20) . Depois foi retirado o tampão de bloqueio e foram adicionados 100 μΐ de amostras diluídas e controlos e foram incubadas durante lha temperatura ambiente.
As placas foram lavadas depois e foi adicionado conjugado anti-IgG específico de espécie conjugado com peroxidase de rábano rusticano (Sigma, St. Louis, MO ou ICN Cappel, Durham, NC) (100 μΐ/poço) e foram incubadas durante lha temperatura ambiente. As placas foram lavadas e foram incubadas com substrato de tetrametilbenzidina (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) durante 5-10 minutos seguido da adição de Solução de Terminação (100 μΐ/poço; BioFX Laboratories). As placas foram eluidas depois utilizando um leitor de placas automático (EL808, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT).
Referências:
Hongo, J.S., Mora-Worms, M., Lucas, C. e Fendly, B.M.: Development and characterization of murine monoclonal antibodies to the latency-associated peptide of transforming growth fator βΐ. Hybridoma 1995; 14: 253-260.
Kohler, G. e Milstein, C. : Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497.
Freund YR e Blair PB: Depression of natural killer ativity and mitogen responsiveness in mice treated with pristane. J Immunol 1982; 129: 2826-2830.
Exemplo 2
Humanização de anticorpo monoclonal murino anti-CD20 2H7 A humanização do anticorpo murino anti-CD20 humano, 2H7 (também denominado no presente documento m2H7, m por murino), foi levada a cabo numa série de etapas de mutagénese dirigida. Os resíduos de CDR de 2H7 foram identificados comparando a sequência de aminoácidos dos domínios variáveis de 2H7 murinos (revelados no documento U.S. 5.846.818) com as sequências de anticorpos conhecidos (Rabat et al. , Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . As regiões CDR para as cadeias pesada e leve foram definidas com base na hipervariabilidade de sequência (Rabat et al. , mencionado anteriormente) e são mostradas na Fig. 12 e Fig. 13, respetivamente. Utilizando oligonucleótidos sintéticos (Quadro 2), foi utilizada mutagénese dirigida (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 488-492 (1985)) para introduzir as seis regiões CDR de 2H7 murino numa estrutura conservada de Fab humano completo correspondente a uma sequência consenso VKI, VHIII (VL kappa subgrupo I, VH subgrupo III) contido no plasmídeo pVX4 . 0 fagémido pVX4 foi utilizado para mutagénese assim como para expressão de F (ab) em E. coli. Com base no fagémido pb0720, um derivado de pB0475 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)), pVX4 contém um fragmento de ADN que codifica um anticorpo de cadeia leve K subgrupo I consenso humanizada (VLKI-CL) e uma cadeia pesada subgrupo III consenso humanizada (VHIII-CH1) anti-IFN-OC (interferão a) . pVX4 também tem um promotor de fosfatase alcalina e sequência Shine-Dalgarno ambos derivados de outro plasmídeo baseado em pUC119 previamente descrito, pAK2 (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 (1992)). Foi introduzido um único local de restrição Spel entre o ADN que codifica as cadeia leve e pesada de F (ab) . Os primeiros 23 aminoácidos nas cadeias tanto pesada como leve anti-IFN-OC são a sequência de sinal de secreção Stll (Chang et al., Gene 55: 189-196 (1987)).
Para construir a versão com permuta de CDR de 2H7 (2H7 . v2) , foi realizada mutagénese dirigida num molde que contém desoxiuridina de pVX4; as seis CDR de anti-IFN-OC foram permutadas às CDR de 2H7 murino. A molécula resultante é denominada 2H7 humanizada versão 2 (2H7.v2), ou a "versão com permuta de CDR" de 2H7; tem os resíduos de CDR m2H7 com os resíduos de FR humanos consenso mostrados nas Figuras 12 e 13. Foi utilizado 2H7.v2 humanizado para humanização adicional. O Quadro 2 mostra a sequência oligonucleotídica utilizada para criar cada uma das CDR de 2H7 murino (m2H7) na cadeia H e L. Por exemplo, o oligonucleót ido de CDR-H1 foi utilizado para recrear a CDR1 de cadeia H de m2H7. CDR-H1, CDRH2 e CDR-H3 referem-se às CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia H, respetivamente; de forma similar, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 referem-se a cada uma das CDR de cadeia L. As substituições em CDR-H2 foram realizados em duas etapas com dois oligonucleótidos, CDR-H2A e CDR-H2B.
Quadro 2. Sequências oligonucleotidicas utilizadas para construção da permuta de CDR de CDR de 2H7 murino numa estrutura conservada humano em pVX4. Os resíduos permutados por cada oligonucleótido estão sublinhados.
Com base numa comparação de sequências dos resíduos de estrutura conservada de 2H7 murino com a estrutura conservada consenso VKI, VHIII humano (Figuras 12 e 13) e anticorpos previamente humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289 (1992)), foram introduzidas várias mutações de estrutura conservada na construção de Fab 2H7.v2 por mutagénese dirigida. Estas mutações resultam em uma mudança de certos resíduos de estrutura conservado consenso humano aos encontrados na estrutura conservada 2H7 murino, em locais que poderiam afetar às conformações de CDR ou contactos de antigénio. A versão 3 continha VH(R71V, N73K), a versão 4 continha VH(R71V), a versão 5 continha VH(R71V, N73K) e Vl(L46P) , e a versão 6 continha VH(R71V, N73K) e Vl(L46P, L47W) .
Foram expressas versões de Fab humanizadas e quiméricas do anticorpo m2H7 em E. coli e foram purificados da seguinte maneira. Foram transformados plasmídeos na estirpe de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) para preparação de ADN de cadeia dupla e simples. Para cada variante, foram sequenciadas completamente as cadeias tanto leve como pesada utilizando o método de didesoxinucleótido (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Os plasmídeos foram transformados na estirpe de E. coli 16C9, um derivado de MM294, foram semeadas em placas LB que continha carbenicilina 5 μg/ml e foi selecionada uma única colónia para expressão proteica. A única colónia foi cultivada em 5 ml de LB-carbenicilina 100 μρ/ιηΐ durante 5-8 h a 37 °C. Foi adicionado a cultura de 5 ml a 500 ml de AP5-carbenicilina 100 μρ/ιηΐ e foi permitido que crescesse durante 16 h num balão de agitação com defletores de 4 1 a 37 °C. O meio AP5 consiste em: 1,5 g de glicose, 11,0 de Hycase SF, 0, 6 g de extrato de levedura (certificado) , 0, 19 g de MgS04 anidrido, 1,07 g de NH4C1, 3,73 g de KC1, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina a 1 M, pH 7,4, a 1 1 de água e depois foi esterilizado por filtração através de um filtro Sealkeen de 0,1 μιη.
As células foram recolhidas por centrifugação num frasco de centrífuga de 1 1 (Nalgene) a 3000 x g e foi retirado o sobrenadante. Depois de congelar durante 1 h, o sedimento foi ressuspenso em 25 ml de MES a 10 mM-EDTA a 10 mM frio, pH 5,0 (tampão A). Foram adicionados 250 μΐ de PMSF a 0,1 M (Sigma) para inibir a proteólise e foram adicionados 3,5 ml de lisozima de gema de ovo de galinha a 10 mg/ml de reserva (Sigma) para ajudar à lise da parede celular bacteriana. Depois de agitar suavemente em gelo durante 1 h, a amostra foi centrifugada a 40.000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi levado a 50 ml com tampão A e foi carregado numa coluna de DEAE de 2 ml equilibrada com tampão A. O fluxo continuo foi aplicado depois a uma coluna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (0,5 ml de volume de leito) equilibrada com tampão A. A coluna foi lavada com 10 ml de tampão A e foi eluída com 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, em 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Depois foi mudado o tampão de F (ab) a PBS utilizando um Centricon-30 (Amicon) e foi concentrado até um volume final de 0,5 ml. Foram processados géis de SDS-PAGE de todos os F(ab) para garantir a pureza e a massa molecular de cada variante foi verificada por espectrometria de massas de eletropulverização.
Foram construídos plasmídeos para expressão de IgG de comprimento completo subclonando os domínios VL e VH de Fab quimérico assim como Fab humanizado de anticorpos hu2H7 em vetores pRK previamente descritos para expressão em células de mamífero (Gorman et al., DNAProt. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)). Brevemente, cada construção de Fab foi digerido com EcoRV e BlpI para excisar um fragmento VL, que foi clonar nos locais EcoRV/BlpI do plasmídeo pDRl para expressão da cadeia leve completa (domínios VL-CL) . Adicionalmente, cada construção Fab foi digerida com PvuII e ApaI para excisar um fragmento VH, que foi clonado nos locais PvuII/Apal do plasmídeo pDR2 para expressão da cadeia pesada completa (domínios VH-CHi-CH2-CH3) . Para cada variante de IgG, foram realizados transfeções transitórias cotransfetando um plasmídeo de expressão de cadeia leve e um plasmídeo de expressão de cadeia pesada numa linha celular de rim embrionária humana transformada com adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gene. Virol., 36: 59-74, (1977)). Brevemente, as células 293 foram divididas no dia antes da transfeção, e foram semeadas em placas em meio que continha soro. Ao dia seguinte, foi adicionado ADN de cadeia dupla preparado como precipitado de fosfato de cálcio, seguido de ADN pAdVAntage™ (Promega, Madison, WI), e as células foram incubadas durante a noite a 37 °C. As células foram cultivadas em meio sem soro e foram recolhidas depois de 4 dias. Os anticorpos foram purificados de sobrenadantes de cultura utilizando proteína A-Sepharose CL-4B, depois foi permutado o tampão a succinato de sódio a 10 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0, e foi concentrado utilizando um Centricon-10 (Amicon). As concentrações de proteína foram determinadas por análise de aminoácidos quantitativa.
Exemplo 3
Este exemplo descreve a geração de ratinhos transgénicos (Tg) para BAC CD20 humano e experiências para estudar os efeitos do anticorpo anti-CD20 ou antagonista de BLyS somente nos ratinhos hCD20+.
Os ratinhos transgénicos para CD20 humano são gerados a partir de ADN de BAC CD20 humano (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os ratinhos foram rastreados com base na análise de FACS da expressão de CD20 humano. Como pode ser visto a partir das representações de FACS na Figura 14, os ratinhos hemizigotos (Tg+/-) e homozigotos (Tg+/+) para o transgene expressam CD20 em sus células B B220+. A Figura 15 mostra a expressão de diversos marcadores de superfície celular (CD43, IgM, IgD) durante a diferenciação e maduração de células B. Nos ratinhos Tg+, hCD20 é expresso em células B imaturas e pré-B e principalmente em células B maduras. Os ratinhos Tg+ foram rastreados com respeito a expressão de CD20 humano nas células B da medula óssea, baço, LN mesentérico e placas de Peyer; os resultados são mostrados nas Figuras 16-19. A seleção das células em B220 e CD43 permite a delimitação nas diversas populações de células B. Os ratinhos Tg+ foram tratados depois com mAb anti-CD20 (1 mg total = 50 mg/kg, equivalente a 3,5 mg para um homem de 70 kg) para ver os efeitos nas células B como se perfila no esquema na Figura 20. Foram realizadas análises de FACS em sangue periférico, baço, gânglio linfático, medula óssea e placas de Peyer. Foram controlados os níveis de soro de mAb anti-CD20. Em ratinhos, a depleção de células B é produzida num período de 3-4 dias de tratamento com anticorpo anti-CD20. Sem desejar ficar ligado a nenhuma teoria, a morte de células B parece estar mediada por ADCC ou apoptose ou ambas. O tratamento de ratinhos Tg+ com mAb anti-CD20 (m2H7) somente resulta na depleção de células B em sangue periférico, células B de gânglio linfático periférico maduras, células B T2 e foliculares no baço (veja-se Figuras 21-24) . No entanto, observou-se que certos subconjuntos de células B são resistentes à destruição por anticorpo anti-CD20 apesar de níveis muito altos, provavelmente de saturação do anticorpo na superfície celular. Estas células B resistentes são as células B de zona marginal no baço (Fig. 23) , e as células B do centro germinal tanto nas placas de Peyer (Fig. 25) como no baço (Fig. 27). Num experiência (Fig. 27), foi injetado a ratinhos uma primeira dose de mAb anti-CD20 a 100 μρ no dia 1, seguido de uma segunda dose de 100 μρ no dia 3 (é provável que uma única dose a 50 μρ seja suficiente para saturar as células B); foram depletadas as células B foliculares/T2 mas se mostrou que as células B do centro germinal das placas de Peyer estavam ligadas com mAb anti-CD20 mas eram resistentes a sua destruição. A recuperação de células B depois do tratamento com anticorpos anti-CD20 foi seguida. No dia 1 foi administrado aos ratinhos anticorpo. A Figura 26 mostra que no dia 6 depois do tratamento com anticorpos, as células B no sangue periférico não eram detetáveis. À semana 6, depois da eliminação do anticorpo, as células hCD20+ começaram a ser detetadas e na semana 14, as células B pareciam ter se recuperado até níveis normais. A recuperação surge de células B precursoras que não expressam CD20 que se desenvolvem a células B CD20+ maduras. A Figura 27 mostra representações de FACS que demonstram a resistência de células B de centro germinal esplénico a tratamento com mAb anti-CD20 a curto prazo (injeção individual) . Os ratinhos foram desimunizados ou imunizados com glóbulos vermelhos de ovelha (SRBC) por injeção intraperitoneal no dia 1 para induzir centros germinais no baço. Os centros germinais aparecem no dia 7. No dia 8, foi tratado um grupo de ratinhos com o mAb m2H7 para CD20 humano. O conjunto de ratinhos de controlo foi tratado com anticorpo de controlo de isotipo mIgG2a. As células do baço dos ratinhos foram analisadas no dia 12. PNA (aglutinina de amendoim) cora o centro germinal. Não foram vistas células do centro germinal detetáveis nos baços de ratinhos não imunizados com SRBC enquanto que os baços de ratinhos imunizados mostram células com coloração de PNA a 0,3 % . Embora as células B f oliculares/T2 sejam depletadas com tratamento de anticorpos anti-CD20, as células B do centro germinal no baço são resistentes ao anticorpo. A seguir, foi determinado se após a depleção de células B, os ratinhos eram capazes de desenvolver resposta imunitária independente de T. Os ratinhos foram tratados com m2H7 ou anticorpo de controlo de isotipo mIgG2a o dia 0. Os dias 3-7, se produziu depleção de células B. Ao dia 7, foi injetado aos ratinhos i.v. Streptococcus pneumonia IV para induzir uma resposta ao polissacárido. Uma resposta independente de células T foi montada no dia 11. Os resultados mostrados na Figura 28 demostraram que o tratamento com anti-CD20 (2H7 ou Rituxan) não afetava à resposta de células B da zona marginal e centros germinais do baço, isto é, as células B MZ e Bl não depletadas conferem proteção a antigénios independentes de T. Estes dados demonstram que alguns aspetos das respostas de células B independentes de T especificamente de imunidade humoral (neste caso) são conservadas apesar do tratamento com mAb anti-CD20.
Exemplo 4
Este exemplo demonstra a sinergia entre tratamentos com mAb anti-CD20 e antagonista de BLyS para a modulação/a depleção de células B. BAFF/BLyS/TALL-1 (membro da superfamília de TNF) desempenha um papel importante na sobrevivência e maduração de células B imaturas T2, FO e MZ e potência a sobrevivência competitiva de células B autorreativas (S. Mandala et al., Science 296, 346-9 (2002); F. Mackay, P. Schneider, P. Rennert, J. Browning, Annu Rev Immunol 21, 231-64 (2003); P. A. Moore et al., Science 285, 260-3 (1999)). A sobre-expressão de uma forma solúvel de BAFF/BLyS/TALL-1 em ratinhos resulta em hiperplasia de células B, hipergammaglobulinemia e sindrome de tipo lupus auto imune (S . A. Marsters et a 1. , CurrBiol 10, 785-8 (2000)) . Ao contrário, o tratamento de ratinhos propensos a lupus com uma proteína de fusão de BAFFR/BR3-Fc, que neutraliza BAFF/BLyS, resulta em serologias autoimunes, patologia renal e mortalidade melhoradas (R. Lesley et ai., Immunity 20, 441-53 (2004)) .
Materiais e métodos:
Nos Exemplos Experimentais, o BR3-Fc ou BAFFR/BR3-Fc utilizado é hBR3-Fc de SEQ ID N° 2. Para a experiência mostrada na Fig. 29, os ratinhos FVB que expressavam um cromossoma artificial bacteriana que codificava CD20 humano (designados ratinhos hCD20+) foram tratados com injeções intraperitoneais de mAb anti-CD20 (injeção individual de 100 microgramas o Dia 9) , BR3-Fc (100 microgramas cada dois dias do Dia 1 ao 12) , ou a combinação de mAb anti-CD20 e BR3-Fc. Cada grupo consistiu em 4 ratinhos. Dois dias depois da última injeção, os ratinhos foram sacrificados e foram analisados com respeito a células B hCD20+. Análise de FACS de baço, sangue, gânglio linfático e placas de Peyer Foram analisadas com respeito a marcadores de células B (CD21+CD23+) .
Para a experiência mostrada na Fig. 30, foram tratados ratinhos Tg+ hCD20 com IgG2a de controlo, BAFFR/BR3-Fc (100 μg/ratinho IP diariamente durante 12 dias) , mAb anti-hCD20 (100 μg/ratinho IP o dia 9) ou a combinação de BAFFRBR3-Fc e mAb anti-hCD20 (mesma dosagem que os grupos de tratamento individuais). Foram isolados esplenócitos B220+ o dia 13 e foram coradas com respeito a CD21 e CD23. N = 5 ratinhos/grupo. A Figura 30 mostra os efeitos sinérgicos na depleção de células B da combinação de mAb anti-CD20 e BR3-Fc nos ratinhos Tg+ CD20 humanos. A Figura 31 mostra a quantificação da depleção de células B de baço totais B220+, células B de zona marginal (MZ) e foliculares (FO) de ratinhos Tg+ hCD20. Os ratinhos foram tratados com doses individuais de 0,1 mg de IgG2a de controlo, BAFF/BR3-Fc ou mAb anti-hCD20. Os esplenócitos foram analisados no dia 4. N = 5 ratinhos/grupo.
Resultados:
Estes resultados são mostrados na Fig. 29, Fig. 30 e Fig. 31. 1. A terapêutica com mAb anti-CD20 depleta >99 % das células B em circulação maduras na sangue e os gânglios linfáticos. 2 . BR3-Fc reduz as células B em circulação maduras no sangue e os gânglios linfáticos. 3. A terapêutica com mAb anti-CD20 depleta as células B T2 e foliculares, mas não as células B de zona marginal no baço. 4 . BR3-Fc reduz as células B T2/foliculares e de zona marginal no baço. 5. A combinação de mAb anti-CD20 e BR3-Fc age de forma sinérgica para depletar todas as populações de células B no baço. 0 tratamento de ratinhos hCD20+ com BAFFR/BR3-Fc durante ~2 semanas resultou em uma redução notável nas células B MZ e T2/F0 (Fig. 30, painel 3). O tratamento combinado de BAFFR/BR3-Fc e mAb anti-hCD20, surpreendentemente, resultou na depleção de todos os subconjuntos de células B esplénicos (Fig. 30, painel 4). Para rastrear adicionalmente a sinergia potencial da neutralização de BAFF e mAb anti-hCD20, foi quantificado o alcance da perda de células B quatro dias depois do tratamento com doses individuais de mAb anti-hCD20 e BAFFR/BR3-Fc. Embora o tratamento com doses individuais de mAb anti-hCD20 ou BAFFR/BR3-Fc resultou em uma perda de -40-50 % de células B MZ e uma perda de -33-70 % de células B FO, a combinação de mAb anti-hCD20 e BAFFR/BR3-Fc resultou em uma perda de >90 % de células B MZ e FO (Fig. 31). Portanto, os fatores de sobrevivência também desempenham um papel importante na determinação da suscetibilidade a depleção de células B mediada por mAb anti-hCD20.
Exemplo 5
Produção de antagonistas de BlyS
Produção de BLyS82-285
Foi clonado um fragmento de ADN que codificava BAFF humano (resíduos 82-285) no vetor de expressão pET15b (Novagen), criando uma fusão com um marcador His N-terminal seguido de um local de clivagem de trombina. Foram deixadas crecer culturas de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) até fase semilogarítmica a 37 °C em meio LB com carbenicilina 50 mg/1 e depois foram arrefecidos a 16 °C antes da indução com IPTG 1,0 mM. As células foram recolhidos por centrifugação depois de 12 h de crescimento adicional e foram armazenados a -80 °C. O sedimento celular foi ressuspenso em Tris a 50 mM, pH 8,0, e NaCl a 500 mM e foi sonicado em gelo. Depois de centrifugação, o sobrenadante foi carregado numa coluna de agarose de Ni-NTA (Qiagen). A coluna foi lavada com Tris 50 a mM, pH 8,0, NaCl a 500 mM e imidazol a 20 mM e depois foi eluido com um gradiente por etapas no mesmo tampão com idimidazol 250 mM. As frações que continham BAFF foram agrupadas, foi adicionada trombina, e a mostra foi submetida a diálise durante a noite frente a Tris a 20 mM, pH 8,0 e CaCÍ2 a 5 mM a 4 °C. A proteína foi purificada adicionalmente numa coluna monoQ (Pharmacia) e finalmente numa coluna de exclusão por tamanho S-200 em Tris a 20 mM, NaCl a 150 mM e MgCl2 a 5 mM. A proteína de BLyS resultante foi utilizada como é descrito posteriormente.
Produção de domínio extracelular BR3 O domínio extracelular de BR3 humano (resíduos 1 a 61) foi subclonado no vetor de expressão pET32a (Novagen), criando uma fusão com um marcador de tiorredoxina N-terminal (TRX)-His seguido de um local de enteroquinase protease. Foram deixadas crescer células E. coli BL21 (DE3) (Novagen) a 30 °C e foi induzida a expressão proteica com IPTG. Foi purificada TRX-BR3 sobre uma coluna de Ni-NTA (Qiagen) , foi eluido com um gradiente de imidazol, e foi clivado com enteroquinase (Novagen). Depois foi purificada BR3 sobre uma coluna de S-Sepharose, foi redrobada durante a noite em PBS, pH 7,8, em presença de glutation oxidado a 3 mM e reduzido a 1 mM, foi submetida a diálise contra PBS, foi repurificada sobre uma coluna de MonoS, foi concentrada e foi submetida a diálise em PBS. Síntese peptidica
MiniBR3 foi sintetizada como uma amida C terminal num sintetizador peptídico Pioneer (PE Biosystems) utilizando química de Fmoc convencional. Os tiois de cadeia lateral das cisteínas 19 e 32 foram protegidos como derivados de acetamidometilo (Acm) estáveis contra ácido trifluoroacético (TFA) . Os péptidos foram clivados da resina por tratamento com triisopropil silano a 5 % em TFA durante 1,5-4 h a temperatura ambiente. Depois da retirada de TFA por evaporação rotatória, os péptidos foram precipitados por meio da adição de etil éter, depois foram purificados por meio de HPLC de fase inversa (acetonitrilo/H20/TFA 0,1 %) . A identidade dos péptidos foi confirmada por espectrometria de massas por eletropulverização. Depois da liofilização, o péptido oxidado foi purificado por HPLC. As frações de HPLC que continham miniBR3 reduzido foram ajustados a um pH de ~ 9 com NH4OH; o dissulfureto entre as cisteinas 24 e 35 formou-se depois por adição de um pequeno excesso de K3Fe(CN)6, e o péptido oxidado foi purificado por meio de HPLC. Os grupos de Acm foram retirados (com formação conjunta do segundo dissulfureto) por tratamento do eluato de HPLC com um pequeno excesso de I2 durante ~ 4 h. O progresso da oxidação foi controlado por meio de HPLC analítica, e o produto final foi purificado de novo por meio de HPLC. MiniBR3 foi biotinilado na extremidade amino terminal na resina por meio de reação com um excesso molar 10 vezes de sulfo-NHS-biotina (Pierce Chemical, Co.). O miniBR3 biotinilado foi clivado depois da resina e foi purificado como foi descrito anteriormente para o miniBR3 não biotinilado.
Os seguintes péptidos ECFDLLVRHWVACGLLR (BLyS0027) (SEQ ID N° : 9), ECFDLLVRHWVPCGLLR (BLyS0048) (SEQ ID N° : 6) e ECFDLLVRAWVPCSVLK (BLyS0051) (SEQ ID N° : 5) foram sintetizados em geral da seguinte maneira. Os péptidos foram sintetizados num sistema sintetizador peptídico Rainin Symphony utilizando resina de amida Rink e um excesso triplo de aminoácido protegido por 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) ativado com hexafluorofosfato de 2-(liT-benzotriazon-l-il)-1, 1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) em presença de um excesso quíntuplo de diisopropiletilamina (DIPEA). Os aminoácidos foram acoplados duas vezes em cada posição antes de desproteger com uma solução a 20 % de piperidina em dimetilformamida (DMF) e passava ao seguinte resíduo. Foram realizados lavadgens entre as etapas de acoplamento utilizando dimetilacetamida (DMA). Depois do acoplamento do aminoácido final no péptido e sua desproteção com piperidina a 20 % em DMF, os péptidos foram acilados em sua extremidade amino terminal utilizando 3 equivalentes de anidrido acético e 5 equivalentes de DIPEA em DMA. Como alternativa, a extremidade amino terminal foi modificada por meio de acilação com 5-carboxifluoresceína, com (+)-biotina, ou por meio da reação com outro fluoróforo ou molécula indicadora. O péptido foi clivado depois da resina por meio de tratamento com uma solução de ácido trifluoroacético a 95 % (TFA) que continha 2,5 % de água e 2,5 % de triisopropilsilano durante 90 minutos. Os voláteis foram retirados sob pressão reduzida, foi adicionado dietil éter e os sólidos foram retirados por filtragem. O precipitado resultante foi lavado de novo com dietil éter e foram descartados os produtos orgânicos combinados. Os sólidos lavados foram lavados depois sucessivamente com ácido acético, uma mistura 1:1 de ácido acético e acetonitrilo, uma mistura 1:1:1 de ácido acético, acetonitrilo e água, uma mistura 1:1:8 de ácido acético, acetonitrilo e água e finalmente com água. Os lavados combinados foram liofilizados e os péptidos brutos resultantes foram purificados utilizando cromatografia líquida de alto rendimento de fase inversa C18 utilizando um gradiente de 10 % a 70 % de 30 minutos de acetonitrilo em água com ácido trifluoroacético a 0,1 % em cada solvente a uma taxa de fluxo de 15 mililitros por minuto. As frações que continham o péptido desejado foram oxidadas por meio da adição de uma solução saturada de iodo em ácido acético até que a solução permaneceu corada. Esta solução foi liofilizada depois. Finalmente, o péptido oxidado bruto liofilizado foi purificado uma segunda vez em condições idênticas e as frações que continham o péptido desejado foram liofilizadas. Alguns dos péptidos foram sintetizados em condições idênticas exceto que a síntese foi realizada num sintetizador automático PerSeptive Pioneer utilizando um excesso quádruplo de aminoácidos, acoplando somente uma vez por cada resíduo.
Exemplo 6
Apresentação em fagos de cadeias de 17 unidades
Construção de bibliotecas. Foi utilizado um fagémido que codifica a sequência de sinal de secreção de STII ("ss STII"), um ligante (GGGSGGG, SEQ ID N°:_), e uma sequência que codifica os resíduos C terminais da proteína menor III do fago M13 (por exemplo, resíduos 267-421) (a seguir no presente documento, "cP3") como um molde para a construção de bibliotecas. Foram construídas duas bibliotecas utilizando técnicas de mutagénese de Kunkel e oligonucleótidos que introduziram um fragmento correspondente aos resíduos 23-39 de BR3 humano com uma mutação C32W também conhecida como "C32W de 17 unidades", e adicionalmente mutações codificadas dentro da região C32W de 17 unidades. Especificamente, a biblioteca 1 codificava codões de substituição nos resíduos numerados 31, 34 e 36-39 (codão de substituição: NNS = qualquer codão), e a biblioteca 2 codificava os resíduos de codões de substituição 27, 30, 31, 34 e 36-39 (codão de substituição: VNC = codifica os aminoácidos L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D e G) . Nos codões de substituição: N é 25 % A, 25 % C, 25 % G, 25 % T; S é 50 % G/50 % C; V é 33 % G/33 % A/33 % C; e C é 100 % C. A Biblioteca 1 codificava 1,1 x 109 membros e a Biblioteca 2 codificava 4,3 x 10 membros.
Classificação de bibliotecas. O fago foi submetido a quatro ciclos de seleção. Em geral, a entrada de fagos por cada ciclo foi de 1014 fagos para o Io ciclo (classificação de fase sólida) e 3 x 1012 fagos para ciclos adicionais (classificação de fase em solução).
Escolha de fagos. O primeiro ciclo de seleção foi um método de classificação de fase sólida. Imunoplacas Maxisorp (96 poços) foram revestidas com BLyS82-285 preparado como foi descrito anteriormente (100 μΐ a 2 μg/ml em tampão de carbonato 50 mM (pH 9, 6) ) durante a noite a 4 °C. Os poços foram bloqueados depois durante uma hora com BSA a 0,2 % (p/v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram lavados 3-5 vezes com PBS, Tween20 a 0,05 %. Foram adicionados aos poços partículas de fagos (100 μΐ/poço em tampão de ELISA (PBS/BSA a 0,5 %/Tween20 a 0,05%)) . Depois de duas horas, os poços foram lavados várias vezes com PBS, Tween20 a 0, 05 %. Os fagos ligados aos poços foram eluídos com HC1 a 0,1 N durante 10 min a TA. Os fagos eluídos foram neutralizados adicionando 1/20 do volume de Tris a 2 M pH 11,0.
Para titular os fagos, foram infetados XL-1 em fase logarítmica (DO 600 nm ~0,3) com fago eluído a 37 °C durante 30 minutos, a seguir, as células infetadas foram eluídas em série em incrementos de 10 vezes em 2YT. Foram semeadas em placas alíquotas de 10 μΐ das células infetadas por cada placa de carbenicilina. Foram obtidos ~108 fagos de cada biblioteca do primeiro ciclo de seleção.
Para propagar os fagos, foram utilizados fagos eluídos para infetar XL-1 em fase logarítmica (DO 600 nm ~ 0,3) a 37 °C durante 30 minutos . Foram adicionados fagos auxiliares, K07, e carbenicilina à infeção a uma concentração final de 1 x 1010 ufp/ml de K07 e carbenicilina 50 μρ/ιηΐ a 37 °C durante outros 30 minutos. A cultura deixou-se crescer em meio 2YT com carbenicilina 50 μρ/ιηΐ e kanamicina 25 μρ/ιηΐ até volumes finais de 25 ml a 37 °C durante a noite.
Os fagos foram purificados sedimentando por centrifugação as células a 10000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido. Foi adicionado PEG 20 %/NaCl 2,5 M a 1/5 do volume de sobrenadante, foi misturado e foi permitido que reposara a temperatura ambiente durante 5 minutos. Os fagos foram sedimentados por centrifugação a 10000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de fagos foi centrifugado de novo durante 5 minutos a 5000 rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 0,7 ml de PBS e se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos para eliminar os resíduos. A DO do sedimento de fagos resuspendidos se leyó a 268 nm.
Os ciclos de seleção de segundo a quarto utilizando métodos de clasificação em solução. Para o segundo ciclo, foram revestidas placas de 96 poços Maxisorp Nunc com neutravidina 5 μρ/ιηΐ (Pierce) a 4 °C durante a noite, a seguir, a placa foi bloqueada com Superblock 200 μΐ/ml (Pierce) em PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionado Tween20 a cada poço para uma concentração final de 0,2 % (v/p) e foi bloqueada durante outros 30 minutos a temperatura ambiente. Os fagos amplificados, purificados do primeiro ciclo de seleção foram incubados com BLyS biotinilado a 50 nM (concentração final) em 150 μΐ de tampão que continha Superblock a 0,5 % e Tween20 a 0,1 % durante lha temperatura ambiente. As misturas foram eluídas depois 5-10X com PBS/Tween a 0,05 % e foram aplicados a 100 μΐ/poço à placa de revestimento de neutravidina. A placa foi agitada suavemente durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir que os fagos ligados a BLyS biotinilados foram capturados nos poços. Os poços foram lavados depois com PBS/Tween 0,05 % várias vezes. Foram eluidos fagos ligados com HC1 a 0,1 N durante 10 min, foram neutralizados, titulados e propagados e purificados como foi descrito anteriormente. Foram obtidos ~3 x 106 fagos de cada biblioteca do segundo ciclo de seleção. O terceiro ciclo de seleção foi similar ao segundo ciclo, exceto que foi incubado uma concentração de BLyS biotinilado 2 nM com o fago antes da diluição e adição a cada poço. Os fagos ligados foram eluídas com HC1 0,1 N durante 10 min, foram neutralizados, titulados e propagados como foi descrito anteriormente. Foram obtidos ~104 fagos de cada biblioteca do terceiro ciclo de seleção.
A segui os fagos do terceiro ciclo de seleção foram submetidos a dois métodos de seleção diferentes no quarto ciclo. O método 4a foi similar aos segundo e terceiro ciclos de seleção exceto que o fago foi incubado em presença de BLyS biotinilado a 0,5 nM durante 1 h a temperatura ambiente. A mistura foi incubada depois durante 15 minutos adicionais a temperatura ambiente em presença de um excesso de 1000 vezes (500 nM) de BLyS não biotinilado antes da diluição e adição aos poços revestidos. O método 4b também foi similar aos segundo e terceiro ciclos de seleção exceto que foi incubado BLyS 0,2 nM com o fago antes da diluição e adição a cada poço. Os fagos ligados de cada seleção de ciclo quatro foram eluidos com HC1 0,1 N durante 10 min, foram neutralizados, titulados e propagados como foi descrito anteriormente. Foram obtidos ~103 fagos para cada biblioteca de cada um dos quartos ciclos (4a e 4b) de seleção.
Análise de clones. Depois do quarto ciclo de seleção, foram cultivadas clones individuais num formato de 96 poços em 400 μΐ de meio 2YT complementado com carbenicilina e fago auxiliar K07. Os sobrenadantes destas culturas foram utilizados em ELISA de fagos. Para ELISA de fagos, foram revestidas placas de 96 poços Nunc Maxisorp durante a noite a 4 °C com 100 μΐ de uma solução a 2 μρ/ιηΐ de BLyS em tampão de carbonato, pH 9,6. A placa foi lavada com PBS e foi bloqueada com BSA a 0,5 % em PBS durante duas horas. O sobrenadante de fagos foi diluído 1:4 em tampão de ligação de ELISA (PBS, BSA a 0,5 %, Tween20 a 0,05 %) em ausência ou presença de BLyS 50 nM e foi incubado durante lha TA. Foram transferidos depois 100 μΐ dos sobrenadantes de fago diluídos às placas revestidas e foi permitido que se agitassem suavemente para capturar fagos durante 20 minutos. As placas foram lavadas depois com PBS/Tween20 ao 0,05 % várias vezes. Depois foram transferidos 100 μΐ por poço de anticorpo anti-M13 conjugado com HRP em PBS/Tween20 ao 0,05 % (1:5000) às placas e foram incubadas durante 20 min. Depois de lavar com PBS/Tween 0,05 % seguido de PBS, a placa foi incubado 5 min com 100 μΐ de solução de substrato de PBS / que continha OPD a 0,8 mg/ml (Sigma) e H202 a 0,01 %. A reação foi detida com 100 μΐ/poço de H3P04 a 1 M e a placa foi lida a 490 nm. Os clones testados foram sequenciados depois como foi descrito previamente (Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., e Sidhu, S. S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97, 8950-8954). As sequências de qualidade aceitável foram traduzidas e alinhadas. As sequências de aminoácidos de 17 unidades são mostradas na FIG. 32.
Foram analisados adicionalmente catorze clones num ensaio de ligação de BLyS para determinar seu valor de CI50. Os clones 2 e 7 tiveram um maior número de irmãos (clones com uma sequência idêntica) no quarto ciclo. De acordo com o ensaio de ELISA de fagos, inibiu-se em grande medida a ligação dos clones 13, 19, 22, 26, 32, 39 e 44 com a placa por BLyS 50 nM (FIG. 11) . A ligação dos clones 35, 45, 68, 82 e 90 também se inibiu em grande medida no ensaio de ELISA de fagos (FIG. 11) . Foram utilizados sobrenadantes de fagos destes 14 clones para infetar XL-1 de fase logarítmica que foram propagados e foram purificados como foi descrito anteriormente.
Para normalizar com respeito a apresentação e rendimento de fagos e determinar a diluição apropriada de fagos para medição de CI50, foram incubadas diluições em série de fagos purificados de cada clone em tampão de ligação de ELISA (PBS, BSA a 0,5 %, Tween20 a 0,05 %) durante lha temperatura ambiente. Foram transferidos 100 μΐ de cada diluição a placas revestidas com BLyS e foi permitido que fossem agitados suavemente para capturar fagos durante 20 minutos como foi descrito anteriormente. Os fagos ligados foram detetados por anticorpo anti-M13 conjugado com HRP, seguido de reação de substrato 0PD/H202, foi inativado e foi lido a 490 nm como foi descrito anteriormente. Por este processo, foi determinado a diluição de cada clone que produzia -1 D.O. a 490 nm e foi utilizado no ensaio de CI50.
Para determinar o valor de CI50 de cada um dos 14 clones, placas de 96 poços Nunc Maxisorp durante a noite a 4 °C com foram revestidas 100 μΐ de uma solução a 2 μρ/ιηΐ de BLyS em tampão de carbonato, pH 9, 6, e foi lavado e bloqueado como foi descrito anteriormente. Uma diluição de fagos amplificados, purificados para cada um dos 14 clones foi incubada em presença de uma série de concentrações de BLyS que variavam de 0,003-1000 nM em 130 μΐ de tampão de ligação de ELISA (PBS, BSA a 0,5 %, Tween20 a 0,05 %) durante lha temperatura ambiente. Foram transferidos 100 μΐ de cada uma destas séries de concentrações a placas revestidas com BLyS e foram capturadas, foram lavadas, foram detetados com anticorpo anti-M13 conjugado com HRP e foram processados como foi descrito anteriormente. Os valores de CI50 foram determinados por um ajuste de quatro parâmetros do sinal ELISA para cada um dos 14 clones. Os valores de CI50 variaram de 0,4 (clone 44) a 11 nM (clone 22). ELISA de deslocamento competitivo. Foram sintetizados as seguintes cadeias de 17 unidades, Ac-ECFDLLVRHWVACGLLR-NH2 (SEQ ID N°:_) ("BLyS0027"), Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2 (SEQ ID N° :_) ("BLyS00 4 8") , Ac-ECFDLLVRAWVPCSVLK-NH, (SEQ ID N° :_) ("BLyS0051") como foi descrito anteriormente. Placas de 96 poços Nunc Maxisorp durante a noite a 4 °C com foram revestidas 100 μΐ de uma solução 2 μρ/ιηΐ de BLyS em tampão de carbonato, pH 9,6. A placa foi lavada com PBS e foi bloqueada com leite magro a 1 % em PBS. Foram preparadas diluições em série do ECD de BR3 (resíduos 1-61) e os péptidos de 17 unidades anteriores em PBS/Tween20 a 0,05 % que continham miniBR3 biotinilado 3 ng/ml. Depois de lavar com PBS/Tween a 0,05 %, foram transferidos 100 μΐ/poço de cada diluição e foram incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. A placa foi lavada com PBS/Tween a 0, 05 % e foi incubada durante 15 min com 100 μΐ/poço de Estreptavidina-PDO a 0,1 U/ml (Boehringer Mannheim) em PBS/Tween a 0,05 %. Depois de lavar com PBS/Tween 0,05% seguido de PBS, a placa foi incubada durante 5 min com 100 μΐ de solução de substrato PBS que continha OPD a 0,8 mg/ml (Sigma) e H202 a 0,01 %. A reação foi detida com 100 μΐ/poço de H3P04 1 M e a placa foi lida a 490 nm. Foram determinados os valores CI50 por um ajuste de quatro parâmetros do sinal de ELISA de deslocamento competitivo. As concentrações de soluções madre iniciais de miniBR3 e domínio extracelular de BR3 foram determinados por análise de aminoácidos quantitativo.
Os valores de CI50 foram determinados para ECD de BR3, BLyS0027, BLyS0048 e BLyS0051 utilizando este ensaio. Todos os péptidos de 17 unidades tiveram maior afinidade para BLyS que o ECD de BR3 de 62 unidades.
Exemplo 4
Conjugados de péptido-PEG
Produção de BLyS82-285 e síntese peptidica. Como foi descrito no Exemplo 5 anterior.
Conjugação de polímeros com péptidos. São gerados péptidos de 17 unidades PEGilados utilizando PEG lineares modificados com química de ΛΤ-hidroxisuccinimida (NHS) para reagir com aminas primárias (lisinas e extremidade N terminal) . Todos os reagentes PEG-NHS (PEG-SPA) foram obtidos de Nektar Therapeutics, San Carlos, CA e foram armazenados com azoto a -70 °C. O péptido foi dissolvido a 1 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) . A alíquotas de 0,4 ml da solução peptidica foram adicionados 2KPEG-SPA, 5KPEG-SPA, ou 20KPEG-SPA sólidos. Foi adicionado suficiente sólido para obter uma relação molar 3 :1 de PEG-SPA e péptido. Estas soluções foram incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora e depois foi analisado o progresso da reação por meio de HPLC analítica de fase inversa numa parte de 50 μΐ da solução. A adição e incubação de PEG foi repetida 2 vezes até que foi modificado todo o péptido. Os péptidos PEGilados foram testados com respeito a ligação com BlyS sem purificação adicional. A relação de PEGrpéptido no produto conjugado purificado é de cerca de 1:1. ELISA de deslocamento competitivo. Foi sintetizada uma cadeia de 17 unidades Ac-ECFDLLVRHWVPCGLLR-NH2 (SEQ ID N° :_) ("blys0048") como foi descrito anteriormente. Foi sintetizada ECFDLLVRHWVPCGLL K (blys0095) (SEQ ID N°:_) e foi acoplado a cada um dos PEG-NHS de 2K, 5K e 20K como foi descrito anteriormente. Foram revestidas placas de 96 poços Nunc
Maxisorp durante a noite a 4 °C com 100 μΐ de uma solução 2 μρ/ιηΐ de BLyS em tampão de carbonato, pH 9,6. A placa foi lavada com PBS e foi bloqueada com leite magro a 1 % em PBS. Foram preparadas diluições em série de mini-BR3 (SEQ ID) e o péptido de 17 unidades anterior e conjugado de PEG-péptido em PBS/Tween 20 a 0,05 % que continha miniBR3 biotinilado a 3 ng/ml. Depois de lavar com PBS/Tween a 0, 05 %, foram transferidos 100 μΐ/poço de cada diluição e foram incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. A placa foi lavada com PBS/Tween a 0,05 % e foram incubados durante 15 min com 100 μΐ/poço de Estreptavidina-PDO a 0,1 U/ml (Boehringer Mannheim) em PBS/Tween a 0,05 %. Depois de lavar com PBS/Tween a 0,05 % seguido de PBS, a placa foi incubada durante 5 min com 100 μΐ de solução de substrato de PBS que continha OPD a 0,8 mg/ml (Sigma) e H2C>2 a 0,01 % . A reação foi detida com 100 μΐ/poço de H3PO4 a 1 M e a placa foi lida a 490 nm. Os valores de CI50 foram determinados por um ajuste de quatro parâmetros do sinal de ELISA de deslocamento competitivo . A equação é : y = ml + (m2-ml) / (1+mO/m4) Λιη3, na qual ml é a absorbância a concentração de competidor infinita, m2 é a absorbância sem competidor adicionado, m3 é o declive da curva cerca do ponto médio, m4 é o valor de CI50 e mO é a concentração do competidor, péptido neste caso. A concentração de miniBR3 biotinilado foi de cerca de 10 pM. A concentração de solução madre inicial de miniBR3 foi determinado por análise de aminoácidos quantitativo.
Resultados O ajuste de quatro parâmetros dos sinais de ELISA de deslocamento competitivo proporcionou valores de CI50 para: blys0095 de 19 nM, blys0048 de 14 nM e conjugado blysO095-2kPEG de 43 nM, e conjugado blys0095-5kPEG de 51 nM utilizando este ensaio. De forma similar, o ajuste dos sinais de ELISA de deslocamento competitivo para um experiência separado proporcionou valores de CI50 para conjugado de blys0095-20kPEG de 99 nM e blys0048 de 15 nM.
Os conjugados de péptido de 17 unidades-PEG (2k, 5k e 20 k) demostraram capacidade de ligação para BLyS. A conjugação de PEG comblys0095 não reduziu significativamente su afinidade de ligação em comparação compéptidos não conjugados similares.
Conclusão
As experiências do presente documento demostraram resultados surpreendentes porque a combinação de mAb anti-CD20 e BR3-Fc resultou em grande sinergia na depleção de todos os subconjuntos de células B.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 5736137 A, Anderson [0004] [0025] [0026] [0036] • WO 0224909 A [0007] [0055] • WO 03035846 A [0007] • WO 0216312 A [0007] • WO 0202641 A [0007] • US 5595721 A [0025] • WO 03002607 A [0025] [0036] • US 5677180 A [0025] [0036] • US 20030219433 A [0025] • US 5776456 A [0036] • US 5843439 A [0036] • US 6399061 B [0036] • US 6682734 B [0036] • US 20020197255 AI [0036] • US 20030021781 AI [0036] • US 20030082172 AI [0036] • US 20030095963 AI [0036] • US 20030147885 Al, Anderson [0036] • US 6455043 B [0036] • WO 0009160 A, Grillo-Lopez, A. [0036] • WO 0027428 A, Grillo-Lopez and White [0036] • WO 0027433 A, Grillo-Lopez and Leonard [0036] • WO 0044788 A, Braslawsky [0036] • WO 0110462 A, Rastetter, W. [0036] • WO 0110461 A, Rastetter and White [0036] • WO 0110460 A, White and Grillo-Lopez [0036] • US 20010018041 AI [0036] • US 20030180292 AI [0036] • WO 0134194 A, Hanna and Hariharan [0036] • US 20020006404 A [0036] • WO 0204021 A, Hanna and Hariharan [0036] • US 20020012665 A1 [0036] • WO 0174388 A, Hanna, N. [0036] • US 20020058029 A1 [0036] • US 20030103971 Al, Hariharan and Hanna [0036] • US 20020009444 Al [0036] • WO 0180884 A, Grillo-Lopez, A. [0036] • WO 0197858 A, White, C. [0036] • US 20020128488 Al [0036] • WO 0234790 A, Reff, M. [0036] • WO 02060955 A, Braslawsky [0036] • WO 2096948 A, Braslawsky [0036] • WO 02079255 A, Reff and Davies [0036] • US 6171586 B1 [0036] • WO 9856418 A, Lam [0036] [0213] • WO 9858964 A, Raju, S. [0036] • WO 9922764 A, Raju, S. [0036] • WO 9951642 A [0036] [0038] • US 6194551 B1 [0036] [0038] • US 6242195 B1 [0036] • US 6528624 B1 [0036] • US 6538124 B, Idusogie [0036] • WO 0042072 A, Presta, L. [0036] [0039] • WO 0067796 A, Curd [0036] • WO 0103734 A, Grillo-Lopez [0036] • US 20020004587 Al [0036] • WO 0177342 A, Miller and Presta [0036] • US 20020197256 A, Grewal, I. [0036] • US 20030157108 Al, Presta, L. [0036] • US 6565827 B1 [0036] • US 6090365 B1 [0036] • US 6287537 BI [0036] • US 6015542 BI [0036] • US 5843398 BI [0036] • US 5595721 Bl, Kaminski [0036] • US 5500362 A [0036] [0047] • US 5721108 A [0036] • US 6120767 A [0036] • US 6652852 Bl, Robinson [0036] • US 6410391 Bl, Raubitschek [0036] • US 6224866 B [0036] • WO 0020864 A, Barbera-Guillem, E. [0036] • WO 0113945 A, Barbera-Guillem, E. [0036] • WO 0067795 A, Goldenberg [0036] • US 20030133930 A1 [0036] • WO 0074718 A, Goldenberg and Hansen [0036] • WO 0076542 A, Golay [0036] • WO 0172333 A, Wolin and Rosenblatt [0036] • US 6368596 Bl, Ghetie [0036] • US 6306393 B [0036] • US 20020041847 Al, Goldenberg, D. [0036] • US 20030026801 Al, Weiner and Hartmann [0036] • WO 02102312 A, Engleman, E. [0036] • US 20030068664 A, Albitar [0036] • WO 03049694 A [0036] • US 20020009427 Al [0036] • US 20030185796 Al, Wolin [0036] • WO 03061694 A, Sing and Siegall [0036] • US 20030219818 Al, Bohen [0036] • US 20030219433 Al [0036] • WO 03068821 A, Hansen [0036] • US 20020136719 Al, Shenoy [0036] • WO 2004032828 A, Wahl [0036] • US 5849898 A [0036] • EP 330191 A, Seed [0036] • US 4861579 A [0036] • EP 332865 A2, Meyer and Weiss [0036] • US P4861579 A, Meyer [0036] • WO 9503770 A, Bhat [0036] • US 4816567 A [0042] [0043] [0140] [0170] [0180] [0182] • US 5821337 A [0047] • WO 9818921 A [0050] • EP 869180 A [0050] • WO 9827114 A [0050] • WO 9912964 A [0050] • WO 9933980 A [0050] • WO 0314294 A [0055] • WO 9839361 A [0061] [0062] • WO 0040716 A [0062] • WO 0185782 A [0062] • WO 0187979 A [0062] • WO 0181417 A [0062] • WO 02092620 A [0087] • WO 9725428 A [0113] [0119] • EP 117060 A [0117] • EP 117058 A [0117] • DD 266710 [0118] • WO 8905859 A [0122] • WO 9100358 A [0122] • US 4399216 A [0123] • US 5723286 A [0129] • US 5432018 A [0129] • US 5580717 A [0129] • US 5427908 A [0129] • US 5498530 A [0129] • US 5428130 A [0131] • US 5716805 A [0142] • WO 9410308 A [0142] • WO 9710847 A [0152] • WO 9634015 A [0158] • US 9605550 W [0158] • US 5591669 A [0185] • US 5589369 A [0185] • US 5545807 A [0185] • US 5565332 A [0186] • US 5573905 A [0186] • US 5567610 A [0187] • US 5229275 A [0187] • WO 9316185 A [0188] • US 5571894 A [0188] • US 5587458 A [0188] • US 5641870 A [0188] • WO 9308829 A [0190] • WO 9404690 A [0192] • US 5731168 A [0192] • US 4676980 A [0193] • WO 9100360 A [0193] • WO 92200373 A [0193] • EP 03089 A [0193] • US 5739277 A [0208] • US 6171586 B [0213] • WO 9704801 A [0213] • US 3773919 A [0217] • US 5846818 A [0255]
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Lisboa, 26 de Maio de 2015

Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para depletar células B de uma população mista de células in vitro que compreende por em contacto a população mista de células com um antagonista de BLyS e um anticorpo de ligação a CD20, em que o antagonista de BLyS é selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo anti-BLyS, em que o anticorpo anti-BLyS bloqueia parcial ou completamente a interação de BR3 com um polipéptido de BLyS; um anticorpo anti-BR3; uma imunoadesina de BR3; ou um polipéptido que tem a sequência de SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9 ou SEQ ID N°: 10.
  2. 2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que as células B para depleção são células B de zona marginal ou células B de centro germinal.
  3. 3. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de BLyS é uma imunoadesina de BR3.
  4. 4. O método de acordo com a reivindicação 3, em que a imunoadesina de BR3 é hBR3-Fc de SEQ ID N°: 2.
  5. 5. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BLyS.
  6. 6. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BR3.
  7. 7. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo de ligação a CD20 é rituximab.
  8. 8. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo de ligação a CD20 é um anticorpo humanizado.
  9. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo de ligação a CD20 é um anticorpo humanizado que é hu2H7v.l6 que tem a sequência de cadeia leve e pesada de SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 16, respetivamente.
  10. 10. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de BLyS e o anticorpo de ligação a CD20 produzem um efeito sinérgico para depletar as células B.
  11. 11. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo de ligação a CD20 é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos anti-CD20 humanos, ibritumomab tiuxetan, iodo 1131 tositumomab, tositumomab/iodo 1131 tositumomab, m2H7, hu2H7, Tositumomab, 1 F5, ch2H7, AME-133, A20, A20 quimérico, A20 humanizado, L27, G28-2, 93-1 B3, B-Cl, e NU-B2.
  12. 12. Um antagonista de BLyS e um anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização num método para depletar células B de uma população mista de células, em que o antagonista de BLyS é selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo anti-BLyS, em que o anticorpo anti-BLyS bloqueia parcial ou completamente a interação de BR3 com um polipéptido de BLyS; um anticorpo anti-BR3; uma imunoadesina de BR3; ou um polipéptido que tem a sequência de SEQ ID N° : 5, SEQ ID N° : 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9 ou SEQ ID N°: 10; e em que o método compreende administrar o antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação com um mamífero que o necessite.
  13. 13. O antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que as células B para depleção são células B de zona marginal ou células B de centro germinal.
  14. 14. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo de ligação a CD20 e antagonista de BLyS são para administração simultaneamente.
  15. 15. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo de ligação a CD20 e antagonista de BLyS com para administração sequencialmente.
  16. 16. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o antagonista de BLyS é para administração antes do anticorpo de ligação a CD20.
  17. 17. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o antagonista de BLyS é uma imunoadesina de BR3.
  18. 18. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a imunoadesina de BR3 é hBR3-Fc de SEQ ID N°: 2.
  19. 19. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BLyS.
  20. 20. O antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o antagonista de BLyS é um anticorpo anti-BR3.
  21. 21. O antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo de ligação a CD20 é um anticorpo quimérico que compreende as regiões variáveis de um anticorpo murino fusionado com as regiões constantes de um anticorpo humano.
  22. 22. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o anticorpo quimérico é rituximab.
  23. 23. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo de ligação a CD20 é um anticorpo humanizado.
  24. 24. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo de ligação a CD20 é um anticorpo humanizado que é hu2H7v.l6 que tem a sequência de cadeia leve e pesada de SEQ ID N°: 15 e SEQ ID N°: 16, respetivamente.
  25. 25. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o antagonista de BLys o anticorpo de ligação a CD20 produzem um efeito sinérgico para depletar as células B.
  26. 26. 0 antagonista de BLyS e anticorpo de ligação a CD20 em combinação para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o anticorpo anti-CD20 é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos anti-CD20 humanos, ibritumomab tiuxetan, iodo 1131 tositumomab, tositumomab/iodo 1131 tositumomab, m2H7, hu2H7, Tositumomab, 1 F5, ch2H7, AME-133, A20, A20 quimérico, A20 humanizado, L27, G28-2, 93-1 B3, B-Cl e NU-B2 . Lisboa, 26 de Maio de 2015
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