DK175814B1 - Transformation af Trichoderma - Google Patents

Description

DK 175814 B1 j L/σΠ iGiciiQQ6nu6 Opfindelse cmycn Gt vGriiOrSySiGm iii ufLiy vød ΪΓαΠ5- formation af Trichoderma. en fremgangsmåde til ekspression og secernering af proteiner i Trichoderma Då et høit niveau, DNA-rekombinantvektorer oa

-I

transformerede T richoderma-stammer.

5

Filamentøse svampe er lavere eukaryoter, som er meget anvendte i C* bioteknologi ved fremstilling af forskellige fermenteringsprodukter. Svampe secernerer adskillige industrielt vigtige enzymer, såsom glucoamylase, pro-teaser, lactase, pektinaser og glucoseoxidase.

10

Filamentøse svampe har en række biotekniske fordele. De frembringer almindeligvis store mængder af proteiner, dyrkning i stor skala er ikke kompliceret, og separation af myceliet fra dyrkningsmediet efter fermenteringen er let.

15

Den mesofile, imperfekte svamp Trichoderma reesei (tidligere Trichoderma viridel (ref.1) producerer enzymer, som der er brug for ved udnyttelse af cellulosebiomasse, og er sandsynligvis den mest undersøgte af alle cellu-lase-producerende organismer.

20

Til hydrolyse af cellulose til glucose er der brug for 3 typer enzymaktivitet: Tilfældigt spaltende endoglucanaser (1,4-p-D-glucanglucanohydrolase, EC 3.2.1.4), som sædvanligvis angriber substituerede, opløselige substrater, og som ikke udviser nogen affinitet over for krystallinsk cellulose; cellobio- 25 hydrolase (1,4-p-D-glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), som er i stand til at nedbryde krystallinsk cellulose, men som ikke har nogen aktivitet mod de-rivatiseret cellulose, og β-glucosidase (β-D-glucosidglucohydrolase, EC 3.2.1.21), som angriber cellobiose og cello-oligosaccharider til frembringelse af glucose. Der er påvist synergistisk virkning mellem nogle af disse enzymer 30 (ref.2-4).

Svampecellulaser er blevet oprenset og karakteriseret, og det er blevet vist, at alle tre hovedtyper af enzymer forekommer i multiple former (ref.5).

DK 175814 B1 I

S To cellobiohydrolaser, som kan skelnes fra hinanden immunologisk, CBH I I

og CBH II, er blevet påvist i dyrkningsmediet fra T. reesei (referencerne 4, 6). I

Der er blevet omtalt 5 til 8 endoglucanaser, som kan skelnes fra hinanden I

elektroforetisk, hvoraf mange udviser varierende substratspecificiteter (refe- I

i 5 rencerne 7, 8, 9, 10). Karakterisering af to ekstracellulære β-glucosidaser er I

blevet rapporteret (ref. 11). I

Ved intensiv stammeudvikling under anvendelse af den direkte frem- I

gangsmåde med mutering og screening er det lykkedes at fremstille adskilli- I

10 ge højtydende T. reesei mutantstammer (referencerne 12-22). Den mængde I

ekstracellulær protein, som produceres af de bedste T. reesei mutanter, er så I

høj som 20-30 g/l dyrkningsmedium, hvilket er mere end 50% af det totale I

celleprotein. Hovedparten af det secernerede protein omfatter cellulaser, I

blandt hvilke CBH l-komponenten er den hyppigst forekommende, idet den I

15 repræsenterer op til 60% af de secernerede cellulaseproteiner. I

Genet for CBH I er blevet klonet af Shoemaker et al. (ref.23) og Teeri et I

al. (ref.24), og hele nukleotidsekvensen for genet er blevet publiceret (ref. I

23). Fra T. reesei er også genet for den vigtigste endoglucanase EG I blevet I

20 klonet og karakteriseret (ref.25, 26, 27). Andre isolerede cellulasegener er I

cbh2 (ref.28, 29) og eq13 (ref.30). I

Den molekylære biologi hos industrielt vigtige, filamentøse svampe er I

almindeligvis ikke velkendt. Dette skyldes tildels manglen på den seksuelle

25 reproduktionscyklus og/eller et genetisk transformationssystem. Der er for I

nyligt blevet udviklet transformationssystemer for Neurospora crassa (ref.31), I

A. nidulans (referencerne 32, 33, 34) og Æ niqer (reference 35) eller Tricho- I

derma (ref. 61), hvilke systemer generelt er baseret på komplementeringen I

af mutantværten ved hjælp af et respektivt funktionelt gen, som bæres af I

30 vektormolekylet. Blandt disse svampe er imidlertid kun A. niqer af industriel I

interesse for øjeblikket. I

| I

i I

DK 175814 B1 3

Wa/4 Ι/ΙηΑΛί{ΐΑΛΐ>ίηΛΐ t-*( irtl/Ιι u^APAr r!<T^ntrtn AcAArnilii IC i HoCCQH

V <\IUOsl11 ΐυυΐ 11 Ul UVUIII |/V -II miWW W W>W^\\/I « · «VKwt >iitiwv » o.wvwv .

Ascomvceter. subklasse Euascomvceter. Euascomvceter inddeles i 3 grupper, Plectomvceter. Pyrenomyceter og Discomvceter på basis af frugtlegemerne. De vigtigste slægter er Aspergillus og Penicillium (reference 49). Trl· 5 choderma klassificeres i stedet for som tilhørende imperfekte svampe. Imper-fekte svampe er en fælles kategori for svampe, som ikke har nogen seksuel reproduktion eller tydelig affinitet over for seksuelt reproducerende slægter, således som den meget karakteristiske Aspergillus har. Skønt det har været omtalt, at Trichoderma har et dårligt defineret seksuelt trin, idet den er en 10 imperfekt tilstand af den perfekte ascomycet Hypocrea (reference 50), er det klart, at slægterne Aspergillus og Trichoderma skal betragtes som taxono-misk meget forskellige. Det er også blevet vist, at argB-genet fra Aspergillus nidulans og pyr4-oenet fra Neurospora crassa ikke hybridiserer under ikke-stringente betingelser til de respektive Trichoderma-gener. hvilket støtter idé-15 en om, at Trichoderma evolutionsmæssigt er ganske forskellig fra andre Ascomvceter (Vanhanen. S., under forberedelse).

På grund af Trichoderma reesei's exceptionelle evne til at secernere proteiner i vækstmediet synes den at være et godt emne som en mulig vært 20 til produktion af proteiner. Genetiske undersøgelser af L. reesei har imidlertid indtil nu næsten udelukkende været rettet mod at forbedre svampens cellula-seproducerende egenskaber, og den eneste metode, der er blevet anvendt til at udvikle hypercellulotiske Trichoderma-stammer. har været traditionel mu-tagenisering og screening. Indtil nu har der ikke været udviklet transformati-25 onssystemer, der giver stabil transformation for Trichoderma.

Det vigtigste formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe Trichoderma reesei stabilt transformeret med et effektivt vært-vektorsystem til opnåelse af ekspression og secernering af heterologe proteiner i Tricho-30 derma på et højt niveau eller til forøgelse af produktionen af homologe proteiner.

I DK 175814 B1 I

I I

I I den foreliggende beskrivelse med krav betyder udtrykket "proteiner, I

I der er heterologe for Trichoderma". proteiner, som ikke naturligt produceres I

I af Trichoderma. hvorimod "proteiner, der er homologe for Trichoderma". be- I

I tyder proteiner, som Trichoderma selv producerer. I

I 5 I

I de svampetransformationssystemer, der først blev udviklet, nemlig i I

I Aspergillus og Neurospora. udføres transformation under anvendelse af pro- I

toplaster. Det transformerende DNA integreres sædvanligvis i værtsgenomet. I

For at tilvejebringe et selektionssystem til identificering af stabile transfor- I

I 10 manter skal vektorsystemet bære et funktionelt gen (en selektionsmarkør), I

I som enten komplementerer en tilsvarende mutation i værtsgenomet, eller I

I tilfører en aktivitet, sædvanligvis et enzym, der er nødvendigt for vækst af I

I den prototrope stamme på et bestemt vækstmedium. I

I 15 Den foreliggende opfindelse angår Trichoderma stammer stabilt trans- I

I formeret med et rekombinant DNA-kloningsvektorsystem. Når DNA- I

I kloningsvektorsystemet omfatter eri DNA-sekvens, der koder for et ønsket I

I proteinprodukt, vil transformation af Trichoderma med det foreliggende vek- I

I torsystem tilvejebringe ekspression og secernering af det ønskede protein på I

I 20 et højt niveau, når den transformerede mikroorganisme dyrkes i et egnet I

I dyrkningsmedium. I

I Ifølge et første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en TrF I

I choderma stamme stabilt transformeret med et vektorsystem omfattende: I

I 25 I

a) et gen, som koder for et ønsket proteinprodukt, I

b) funktioner, der letter genekspression, herunder DNA-sekvensen om- I

I : fattende promotorer/forstærkere, som er tilknyttet på funktionsdygtig I

I måde til styring af ekspression af det ønskede produkt, og I

I 30 c) en selektionsmarkør, der er i stand til at selektere stabile Tricho- I

I derma-transformanter. hvor selektionsmarkøren ikke er afledt fra ^ I

Neurospora crassa pyr-4-genet. I

DK 175814 B1 5

Ifølge et andet aspekt tilvejehringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til transformation af Trichoderma. ved hvilken fremgangsmåde en egnet Trichoderma-stamme transformeres med det foreliggende vektorsystem.

5

Ifølge et tredie aspekt for den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et protein i Trichoderma. hvilken fremgangsmåde omfatter, at Trichoderma transformeres med det foreliggende vektorsystem, at den transformerede stamme dyrkes i et egnet medium, og 10 at det udtrykte og secernerede produkt udvindes fra mediet.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes også en fremgangsmå-i de til produktion af et protein i Trichoderma. ved hvilken fremgangsmåde en

Trichoderma-stamme. som er transformeret med vektorsystemet, dyrkes i et 15 egnet dyrkningsmedie, og det udtrykte og secernerede protein udvindes fra dyrkningsmediet.

Det her anvendte udtryk "νθ^ο^είθηΤ' inkluderer en enkelt vektor eller et enkelt plasmid eller to eller flere vektorer eller plasmider, som tilsammen 20 indeholder den DNA-information, der skal integreres i værtsgeno met. Vektorerne eller plasmiderne kan være liniære eller lukkede, cirkulære molekyler.

Skønt man ikke på nuværende tidspunkt kender selvreplikerende plasmider i Trichoderma. dækker opfindelsen også sådanne selvreplikerende plasmider, hvis de skulle blive fundet på et senere tidspunkt.

25

Vektorsystemet omfatter DNA-sekvenser, som koder for funktioner, der letter genekspression, inklusive promotorer, forstærkere og transkriptionsini-tieringssteder såvel som terminatorer, en markør for selektion af transfor-manter og en DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein.

30

For at sikre secernering af det udtrykte produkt forsynes genet for det ønskede produkt fortrinsvis med et foranstillet område, som sikrer effektiv styring af det udtrykte produkt til cellens sekretoriske bane. Dette foranstille-

I DK 175814 B1 I

I 6 I

I de område, som kan være et naturligt forekommende signal- eller lederpeptid I

I eller dele heraf, spaltes sædvanligvis fra det ønskede produkt under seceme- I

I ringen, hvorefter det modne produkt kan isoleres fra dyrkningsmediet. I

I 5 Genet for det ønskede produkt kan opnås fra genomkloner eller cDNA- I

kloner. DNA-sekvenser kan også syntetiseres. · I

I Signal/leder-sekvensen kan hidrøre fra -signal/leder-sekvensen for det I

gen, der koder for ønskede protein, eller kan hidrøre fra gener for andre se- I

I 10 cernerede proteiner enten fra Trichoderma eller fra en hvilken som helst an- I

I den organisme. Eksempler på signal/ leder-sekvenser, som hidrører fra ge- I

ner, der koder for et protein, som secerneres af Trichoderma. er cbh1- I

I signalsekvensen eller egl1-signalsekvensen eller dele heraf. Signal/leder- I

sekvenser, der hidrører fra gener, som koder for secernerede proteiner, der I

I 15 er heterologe for Trichoderma. kan hidrøre fra gener for Asperoillus-amvlaser I

eller -glucoamylase. Der kan også anvendes syntetiske signal/leder- I

I sekvenser. I

I Promotoren kan være en hvilken som helst DNA-sekvens, som udviser I

I 20 transkriptionsaktivitet i Trichoderma. og kan hidrøre fra gener, som enten er I

H homologe eller heterologe for Trichoderma. Eksempler på promotorer, der I

I hidrører fra gener, som koder for proteiner, der er homologe for Trichoderma. I

I er cbh1-promotoren og eql1 -promotoren eller dele heraf. Et eksempel på en I

I promotor, der hidrører fra et gen for et protein, der er heterologt for Tricho- I

I 25 derma, er AsperoiHus-qlucoamvIasepromotoren. Transkriptionsterminatorer I

I kan hidrøre fra den samme kilde som promotorerne. Der kan også anvendes I

I syntetiske promotor- eller terminatorsekvenser. I

I Det skal forstås, og det er indlysende for en fagmand, at alle specifikt I

I 30 nævnte DNA-sekvenser kan modificeres ved ændring eller fjernelse af et par I

I baser, som ikke er essentielle for funktionen af det produkt, der kodes for. I

F.eks. kan DNA-sekvenser, som stort set ligner cbh1- eller egl1-signal- eller I

promotorsekvenser anvendes, så længe de udviser den tilsigtede funktion i I

DK 175814 B1 7

Tnchoderyna. Generne for de ene kode proteiner kor, også ændres, så længe det ikke har nogen ødelæggende virkning på proteinets aktivitet.

Der kan anvendes forskellige selektionsmarkører, f.eks. arqB (A. nidu-5 lans eller T. reesei), amdS ( A. nidulans) trp1 fra N. crassa eller trpC fra A. nidulans og pyr4 ( Neurospora crassa eller T. reesei).

Værtsstammen kan enten være en prototrof eller en auxotrof Tricho-derma-stamme afhængig af den selektionsmarkør, der anvendes ved trans-10 formationsproceduren. amdS-genet fra Æ nidulans kan som vist i den eksperimentelle del af beskrivelsen anvendes til transformation af prototrofe T. reesei stammer. T. reesei vokser dårligt på acetamid som den eneste nitrogenkilde, og væksten kan blive yderligere hæmmet ved tilsætning af CsCI til mediet. Vækst på acetamid som den eneste nitrogenkilde i nærværelse af CsCI 15 kan følgelig anvendes som et selektionsmedium til at identificere amdS+-transformanter.

Hvis der anvendes en selektionsmarkør, som komplementerer en tilsvarende mutation i værtsgenomet, skal der konstrueres auxotrofe Tricho-20 derma-mutanter. Auxotrofe Trichoderma-mutanter kan frembringes ved hjælp .

af kendte metoder til frembringelse af mutantstammer.

Auxotrofe Trichoderma-mutanter. som kræver uracil, tryptophan eller arginin for vækst, blev isoleret ved en filtreringsberigningsteknik som beskre-25 vet af Nevalainen (reference 36). Fra arginen-krævende auxotrofer blev mutanter, som er defekte i arqB-qenet, identificeret ved at anvende en serie af minimale plader suppleret med forskellige mellemprodukter i argininbiosynte-sen. Blandt uracilkrævende mutanter søgte man efter stammer, som var defekte i pyr4-genet, ved at måle orotidin-5'-phosphatdecarboxylaseaktivitet 30 (OMP-decaseaktivitet) i myceliepræparationer (ref. 37).

Mutanter, der har en trp1-gendefekt, kan karakteriseres ved manglen på PRA-isomerase-InGP-syntetaseaktivitet i deres mycelier (ref.39). trp1- I DK 175814 B1

I 8 I

I karakteren hos mutanter, der ikke udviser enzymaktivitet, kan bekræftes ved I

I f.eks. transformation og komplementering med N.crassa trp1-plasmid (ref. I

I 40) eller trpC-plasmidet fra A.nidulans (ref.34). I

I 5 Den anvendte transformationsteknik er den metode, der er tilpasset fra I

I metoderne til transformation af A. nidulans (referencerne 32, 33). Pro- I

I toplaster fremstilles ved kendte metoder ved at dyrke mycelium på agarpla- I

der og suspendere mycelium i en pufret opløsning af Novozym* 234.1 stedet I

for den traditionelle sucroseopløsning af NovozymR 234 kan en sorbitolop- I

H 10 løsning med fordel anvendes. Transformerende DNA tilsættes derefter til pro- I

toplastopløsningen, hvilket er beskrevet i yderligere detaljer i den eksperi- I

menteile del af beskrivelsen. Transformationen udføres sædvanligvis som en I

I cotransformation, ved hvilken et ikke-selekterbart plasmid cotransformeres i I

I J. reesei med høj frekvens under anvendelse af en selekterbar markør indsat I

15 i et andet plasmid (f.eks. amdS i p3SR2 eller arqB i pSal43). En stor del af I

transfonrianterne indeholder det ikke-selekterbare plasmid integreret i geno- I

! met, hvis der anvendes ækvimolære mængder af DNA til transformation. Når I

der anvendes en arqB' T. reesei stamme til transformation med ækvimolære I

mængder af plasmideme p3SR2 og pSal43, kan transfomnanter opnås på I

20 dobbeltselektionsmedium (minimalmedium, acetamid, CsCI). Alternativt kan I

der anvendes et enkelt plasmid til transformation, hvor også den selekterbare I

H markør indsættes. I

Transformanterne dyrkes derefter i et egnet medium. For at være i I

25 stand til at frembringe det ønskede produkt i et enkelt defineret medium kan I

der anvendes en glucoseinducerbar promotor. Når Trichoderma dyrkes på et I

medium indeholdende 1% glucose, er secerneringen af alle extracellulære I

proteiner, inklusiv proteaser, stærkt undertrykt. Når det gen, der koder for det I

ønskede enzym, sættes sammen med en promotor, der bliver stærkt udtrykt i I

H 30 glucoseholdigt medium, secerneres det ønskede enzym til vækstmediet. Ef- I

tersom andre proteiner ikke produceres under disse betingelser, er det øn- I

H skede protein hovedproteinet, som secerneres i mediet. I

DK 175814 Bi 9 ni. .. __....t'.i r:_____ — _ .i _i. __ ir.- j. x:i _i. j« : j i Ναι οναιιιμ^ιιιγν^ςίπσι ijcmc^o, οι uci iønor\ouo μιυιοιιι m dicuc i uci i fremkomne opløsning i en meget ren form. Om nødvendigt kan det let oprenses yderligere, eftersom det er næsten det eneste protein, der er til stede.

5 Den foreliggende opfindelse kan også anvendes til at modificere eller inaktivere et gen, der producerer en bestemt enzymaktivitet i værtsorganis· ' men. Som et eksempel kan cellulasenegative Trichoderma reesei stammer konstrueres. Denne mutagenisering er baseret på transformation af Trichoderma reesei med et plasmid, der bærer et defekt cellulasegen. Homolog 10 rekombination af plasmidet ved det kromosomale cellulaselocus bevirker ind føjelsesinaktivering af det endogene Trichoderma reesei cellulasegen. Det plasmid, der anvendes til transformation, indeholder kun en del af det cellula-sekodende område og producerer inaktivt protein. Der er ikke inkluderet 5-flankerende sekvenser. Der kan også indføres en mutation til skift af læse-15 ramme i det afkortede, kodende område. En selektionsmarkør ( arqB) eller en markør for screening ( lacZ) kan kobles til det plasmid, der anvendes til transformation. Efter rekombination vil markøren være anbragt mellem de to fremkomne defekte cellulasegener. Princippet for metoden er vist på fig. 1.

20 Den foreliggende opfindelse illustreres ved hjælp af produktionen af chymosin, og Trichoderma reesei endoglucanase I (EGI). Promotor-, signal-og leder- og terminatorsekvenser hidrører enten fra glucoamylasegenet fra Aspergillus niger eller fra Trichoderma reesei cbht-genet. Som selektionsmarkør blev amdS-qenet fra A. nidulans anvendt såvel som aroB-oenet fra Æ 25 nidulans.

DK 175814 B1 I

10 I

Materialer

Plasmider: I

p285: ATCC nr. 20681 I

pCAMG91: ref.59 . I

5 plC19R: ref.60 I

pSal43: ref.51 +54 I

p3SR2: ref.33 + 35 I

pDJB2: ref.38 I

PMC1817: ref.46 I

10 pTT01,pTT11: ref.28 I

pUC9, pUC13: ref.61 I

pUC18, pUC19: ref.58 I

pTZ19R: (Pharmacia) I

pAN5-41B: ref.62 I

E.coli stammerne JM101, JM103, JM109 og DHI (reference 51) blev anvendt I

som værter ved E.coli kloning. Trichoderma reesei-stammeme QM9414 I

(ATCC 26921) og RUT-C-30 (ATCC 56765) blev anvendt ved svampetrans- I

formation og ekspressionsundersøgelser. I

20 I

Trichoderma minimalmedium: I

Glucose 20 g

(NH4)2S04 5 g I

KH2P04 15 g I

25 MgS04 0,6 g I

CaCI2 0,6 g I

FeS04,7H20 5 mg I

MnS04, H20 1,56 mg I

ZnS04,7H20 1,4 mg I

30 CoCI2 2 mg /1H20 I

DK 175814 B1 11

Kori beskrivelse ai iemiinuéii.

Konstruktionsfigurerne er ikke angivet i de rigtige målforhold.

5 Fig.1 viser princippet for inaktivering af et kromosomalt cellulasegen.

Fig.2 viser konstruktionen af plasmid pMS4, der anvendes til indføjel-sesmutagenisering af det kromosomale T.reesei Cbh1-lokus. Positionen af en rammeskiftmutation frembragt ved inaktivering af EcoRI-10 genkendelsesstedet er markeret med stjerne.

Fig.3 viser konstruktionen af plasmid p285' proC.

Fig.4 viser konstruktionen af plasmiderne pMT648 og 15 pMT813.

15

Fig.5 viser konstruktionen af plasmid pMT837.

Fig.6 viser restriktionskortet for plasmid pR27.

20 Fig.7 viser restriktionskortet for plasmid pAMHIOO.

Fig.8 viser konstruktionen af plasmidet pAMH105.

Fig.9 viser konstruktionen af plasmiderne pAMH1103, pAMH1106 og 25 pAMH1101 ved sløjfe-mutagenisering under anvendelse af syntetiserede oligonukleotider OAMH1, OAMH2 og OAMH3.

Fig. 10 viser linkerne NOR 202, NOR 203, OAMH1, OAMH2 og OAMH3.

30 Fig. 11 viser restriktionskortene for plasmiderne pAMH102 og pAMH104.

Fig. 12 viser restriktionskortet for plasmidet pAMH1103 og konstruktionen af pAMH103.

DK 175814 B1 I

I I

Fig. 13 viser restriktionskortet for plasmidet pAMH1106 og konstruktio- I

I nen af pAMH106. I

5 Fig. 14 viser restriktionskortet for plasmidet pAMH1101 og konstruktio- I

I nen af pAMH101. I

B Fig. 15 viser konstruktionen af plasmid pAMH110. I

10 Fig. 16 viser konstruktionen af plasmidet pAMH111 anvendt til ekspres- I

B sionaf EG I under Cbh1-promotorfunktion. I

Fig. 17 viser ekspression af chymosin i T.reesei. Western blot, bane 1: I

oprenset prochymosinkontrol, inkluderer spor af pseudochymosin og chymo- I

B 15 sin. Bane 2: kultursupernatant fra dyrkning af stamme med pAMH102. Bane I

B 3: kontrolsupematant fra stamme uden plasmider. Bane 4: mycelie fra stam- I

B me med pAMH102. I

B Eksperimentel del I

B 20 I

B Eksempel 1 I

B Induktion, berigelse og isolering af auxotrofe T. reesei mutantstammer. I

B 25 Auxotrofe mutanter, der kræver uracil, tryptofan eller arginin for vækst, I

B blev isoleret under anvendelse af filtreringsberigelse som beskrevet af Neva- I

B lainen (ref.36). Det anvendte mutagene middel var UV-lys. Fra argininkræ- I

B vende auxotrofer identificeredes mutanter, der er defekte i araB-genet. ved at I

B anvende en serie af minimalplader tilført forskellige mellemprodukter i argi- I

B 30 ninbiosyntesen (ref.36). Mutanter, som kræver citrullin for vækst, betragtes I

B som mulige arqB~ -mutanter. arqB~ -karakteren hos isolerede mutanter blev I

B bekræftet ved at transformere dem til prototrofi under anvendelse af plasmi- I

B det pSal43 indeholdende Æ nidulans arqB-genet (eksempel 4). I

I - I

DK 175814 B1 13

Blandt uracilkrævende mutanter blev der søgt efter stammer, der var defekte i pyr4-qenet. Disse mutanters pyr4~-karakter blev bekræftet ved transformation med et plasmid, som indeholder N.crassa pyr4-qenet (ref.38) 5 (eksempel 4).

A Eksempel 2

Fremstilling af protoplaster.

10

Mycelium blev dyrket på cellofanskiver på kartoffeldextroseagarplader (Difco). Mycelium fra 5 cellofankulturer blev suspenderet i 15 ml af en 5 mg/ml opløsning af NovozymR 234 i 1,2 M sorbitol pufret ved pH 5,6 med 0,1 M kaliumphosphat. Blandingen blev inkuberet 1,5-2 timer ved 30°C. Pro-15 toplasteme blev separeret fra mycelierester ved filtrering gennem sintret glas (porøsitet 1), blev pelleteret i 5 minutter ved 4000 g og blev vasket to gange med 1,2 M sorbitol -10 mM Tris, HCI pH 7,5.

Der kan opnås en bedre oprensning af protoplaster ved at anvende en 20 metode beskrevet af Tilbum et al. (ref.33). 5 mg/ml opløsning af NovozymR 234 i 1,2 M MgS04 pufret ved pH 5,8 blev anvendt til protoplastdannelse.

Efter inkubering og filtrering blev protoplastsuspensionen centrifugeret ved 4000 g i 15 minutter med et lag ovenover med et lige så stort volumen 0,6 M sorbitol - 100 mM Tris, HCI, pH 7,0. Protoplasterne dannede et skarpt bånd 25 halvvejs nede i centrifugerøret. Protoplasterne blev suspenderet i 1 volumen 1,2 M sorbitol -10 mM Tris, HCI, pH 7,5, blev centrifugeret ned og vasket to gange i 1,2 M sorbitol - 10 mM Tris, HCI, pH 7,5. Protoplasterne blev suspenderet i 1,2 M sorbitol -10 mM CaCl2 - 10 mM Tris, HCI, pH 7,5 ved en koncentration på 5 x 10® - 5 x 107 protoplaster/ml.

30

Protoplastemes levedygtighed blev vurderet på Trichoderma minimalmedium med 1 M sorbitol som osmotisk stabilisator. Protoplasterne blev

DK 175814 B1 I

I 14 I

udpladet i 3% topagar. Regenerationsfrekvensen var 40-80% for stammen I

QM 9414 (ATCC 26921). I

Eksempel 3 - I

5 I

Transformation af T. reesei under anvendelse af Æ nidulans acetamidase I

H (amdS)-genet. I

Plasmid p3SR2 blev anvendt ved transformationen. Det indeholder A. I

10 nidulans DNA, som bærer hele acetamidasestrukturgenet amdS og dets re- I

gulatoriske område amdi (ref.41 og 33). I

I 20 μΙ (4-10 pg) transformerende DNA blev tilsat til 200 μΙ pro- I

I toplastopløsning. Der blev tilsat 50 μΙ 25% PEG 6000 - 50 mM CaCl2 - 10 I

15 mM Tris.HCI, pH 7,5, og blandingen blev inkuberet i 20 minutter på is. Der I

I blev tilsat 2 ml af PEG-opløsningen, og blandingen blev yderligere inkuberet I

5 minutter ved stuetemperatur. Der blev tilsat 4 ml 1,2 M sorbitol - 10 mM I

CaCl2 -10 mM Tris, HCI, pH 7,5, og protoplasteme blev udpladet i 3% topa- I

gar. Det selektive medium var Trichoderma minimalmedium med 10 mM ace- I

I 20 tamid som den eneste nitrogenkilde i stedet for (ΝΗ^εΟφ og det blev sup- I

pieret med 1M sorbitol som osmotisk stabilisator og 12,5 mM CsCI for at un- I

I dertrykke baggrundsvæksten. I

I Der blev opnået transformationsfrekvenser på fra 40 til 600 transforman- I

I ’ 25 ter pr. μς DNA for stammen QM 9414 (ATCC 26921). Den højeste frekvens I

I blev opnået, når DNA’et blev oprenset med to CsCI/ethidiumbromidcentri- I

I fugeringscyklusser. I

I Sporedannelse observeredes sjældent på det selektive medium, men I

I 30 transformanteme sporulerede normalt, når de blev overført til kartoffeldextro- I

I seagar. Deres evne til at vokse på acetamid varierede. Diameteren af koloni- I

I erne på det selektive medium lå i området fra 1 mm til 10-20 mm. I

DK 175814 B1 15 i ransformaniernes miioiiske siabiiiiei biev ui iuei søgi. 1C store iransfor-manter af varierende størrelse blev subdyrket på acetamid-CsCI-plader, spo-rulerede på kartoffeldextrose (PD) og blev genpladet på PD. For at udelukke heterogenitet på grund af heterokaryose blev individuelle kolonier, som frem-5 kom fra en spore, undersøgt for AmdS+-fænotype. En positiv klon fra hver oprindelig transformant blev udsat for successive udpladninger (5 vækstcyklusser) på ikke-selektivt medium, og fænotypen blev testet efter hver generation på det selektive medium. Af 10 undersøgte, store transformanter efter 1 cyklus på ikke-selektivt medium gav 6 ud af de 10 transformanter 100% 10 AmdS+-konidier, 3 gav 47-87% og 1 transformant gav ingen AmdS+-konidier. Dette resultat forblev det samme igennem 5 ikke-selektive vækstcyklusser, hvilket lader formode, at den oprindelige ustabile AmdS+-fænotype kan stabiliseres senere.

15 Fra 10 oprindelige små kolonier gav 3 sporer med varierende AmdS+-fænotypefrekvenser (94%, 44% og 5% af sporerne). De andre 7 kloner gav kun sporer, som var ude af stand til at vokse på acetamid). Interessant udviste alle de opnåede AmdS+-sporer kraftig vækst på acetamidplader, karakteristisk for storkolonitransformanter.

20

Tilstedeværelsen af plasmid-DNA'et i transformanteme blev analyseret ved Southern Blot af total DNA isoleret fra transformanter (ifølge Raeder og Broda, ref.43), skåret med Xhol eller Sall og ECoRI. Vektoren pUC18 og Sall - EcoRl-fragmentet indeholdende amdS-qenet fra plasmid p3SR2 blev an-25 vendt som prober. Det blev vist, at transformationen var sket ved rekombination på en række forskellige steder i Trichoderma genom-DNA'et, én til adskillige kopier pr. genom.

Eksempel 4 30

Transformation af T reesei med Æ nidulans plasmider.

I DK 175814 B1 I

I 16 I

Komplementering af auxotrofe mutanter i T reesei med heterologt DNA I

blev påvist. Plasmidet pSal43 indeholdende araB genet fra A. nidulans blev I

anvendt til at transformere T\ reesei arqB'-mutantstammer. Transformanter- I

ne blev selekteret på minimalmedium uden arginin. Transformationsfrekven- I

H 5 sen var omkring 300 (150-400) transformanter/pg DNA. I

” Kromosomalt DNA blev isoleret fra transformanteme og blev anvendt til I

Southern hybridiseringsforsøg for at bekræfte den korrekte integrering af I

plasmid-DNA i det kromosomale DNA fra T. reesei. Multiple tandem-kopier af I

10 pSal43 blev integreret i genomet. Southern hybridisering og dot plot hybridi- I

H sering viste, at i de analyserede transformanter varierede kopiantallet af argB I

I fra ca. 2 til over 100. Det blev vist, at ArgB+-transformanterne fænotypisk var I

; 100% stabile gennem mindst 3 generationer. Dette blev påvist ved successi- I

I J ve udpladninger af konidier fra 5 transformanter på komplet medium og der- I

I 15 efter undersøgelse af Arg+-fænotypen på minimalt medium (50-80 koloni- I

er/transformant). I

I Eksempel 5 I

I 20 Cotransformation af T.reesei med amdS- og arqB-plasmider. I

I Muligheden for at cotransformere Trichoderma med et ikke-selekterbart I

plasmid blev først vist med den arginin-auxotrofe mutant. I

I 25 ArqB~ T. reesii-stammen blev transformeret med lige store molære I

I mængder A.nidulans plasmid pSa!43 (argB) og plasmid p3SR2 (amdS), I

I transformanteme blev selekteret for Arg+-fænotypen og blev undersøgt for I

erhvervelse af amdS ved udstrygning på acetamid-CsCI-plader. Af ArgB- I

I transformanteme var 86% også AmdS+. Southern analyse af cotransforman- I

I 30 terne indikerede, at begge plasmider blev integreret i variable kopimængder I

I på adskillige steder i genomet (resultaterne ikke vist). I

17 DK 175814 B1

Duijueii seiekiiun μα ιϊιΐΜΐιιΐΰί aCeiamid-CsCriTiedium Γσ3ϋΐί6Γ6(ΪΞ i CS.

; 100 store Amd+Arg+-transformanter pr. pg DNA og en række små kolonier, som er karakteristiske for amdS-transformation.

5 Da stabiliteten af ArgB+-fænotypen af arqB amdS-cotransformanteme blev undersøgt, viste 3 ud af 5 sig at være 100% stabile, hvorimod de andre havde mistet ArgB+-karakteren i 7% eller 80% af det analyserede afkom. De samme individuelle kolonier havde også mistet AmdS+-fænotypen. Det vides ikke, om denne ustabilitet f.eks. skyldtes cointegrationen af arqB sammen 10 med amdS på dette kromosomale sted.

Plasmidet pAN5-41B, som indeholder E.coli lacZ-qenet koblet i fase til promotoren og det N-terminale, proteinkodende område af Æ nidulans glyce-raldehydphosphatdehydrogenasegenet (qpd) (ref.55) blev også anvendt til 15 cotransformation. Dette plasmid indeholder ydermere A.nidulans arqB-qenet og pBR322-sekvenser. Prototrof T.reesei (QM 9414) blev cotransformeret med plasmidet p3SR2 (amdS) og pAN5-41B, transformanter blev selekteret for Amd+-fænotype og blev screenet for β-gai-ekspression på acetamid-CsCI-plader indeholdende Xgal. Der kunne ikke påvises endogen T. reesei β-20 galactosidaseaktivitet, når glucose var til stede i mediet, og pH-værdien af Xgal-pladerne var neutral.

Efter 1-4 dages vækst var blå farve synlig. Når der blev anvendt et molforhold mellem plasmideme på 1,0/0,7 (p3SR2/pAN5-41 B) ved transformati-25 on, viste 13% af de store og 6% af de små Amd+-kloner β-galactosidase-aktivitet, med et molforhold på 1,0/2,6 opnåedes 39% henholdsvis 7% Xgal+-kloner. Tilstedeværelsen af begge plasmider i Amd+-transformanter, som udviste blå farve, blev bekræftet ved Southern hybridisering (resultater ikke vist).

30

I DK 175814 B1 I

I I

Eksempel 6 I

Konstruktion af en cbhr Trichoderma reesei stamme. Inaktiveringen af for-

skellige cellulasegener på den beskrevne måde gør det muligt at konstruere I

5 en række af T. reesei-stammer. som producerer en speciel kombination af I

cellulaser. cbh1 "-stammer er også vigtige til den effektive produktion af hete- I

rologe proteiner, når cbh1 -promotoren anvendes. Det blev ved Southern hy- I

bridisering under anvendelse af cbh1-specifikke probér vist, at Trichoderma

reesei stamme QM 9414 (ATCC 26921) kun indeholdt én kromosomal kopi af I

10 cbh1-genet, og én rekombinationsbegivenhed skulle derfor inaktivere genet. I

Et inaktivt gen blev konstrueret på følgende måde: Plasmidet pTT01 (ref.28),

B som indeholder fuldlængde cDNA-klonen af cbh1-genet i vektoren pUC8, I

B blev skåret med restriktionsenzymerne Bgl I og Bgl II. Det 0,8 kb lange frag- I

B ; ment fra det 5'-terminale område af cbh1-genet blev isoleret fra agarosegel I

B 15 ved hjælp af traditionelle metoder. Fragmentet blev forsynet med stumpe en- I

B der under anvendelse af S1 -nuklease, og det blev ligeret til en pUC18-vektor,

B som var skåret med EcoRI og forsynet med stumpe ender, og blev transfor- I

B meret til E.coli JM109. DNA fra den klon, som indeholder cbh1- I

B genfragmentet, blev isoleret og fordøjet med restriktionsenzymet EcoRI, som I

B 20 skærer i midten af Bgl I - Bgl II -fragmentet af cbh1. De med EcoRI- I

B frembragte ender blev udfyldt, og der blev ligeret igen. Der blev frembragt et I

B plasmid pMS4, som indeholdt en læserammeskiftmutation i midten af det

B afkortede cbh1 -genfragment (fig.2). I

B 25 Trichoderma blev cotransformeret med plasmidet pMS4 og det A. nidu- i I

B lans amdS-holdige plasmid p3SR2 med 3-4 ganges molært overskud af I

B plasmidet pM54. I

B Der blev selekteret transformanter på basis af amdS+-fænotypen som I

B 30 beskrevet (eksempel 3), og de blev oprenset på selektivt medium indehol- I

B dende acetamid som den eneste carbonkilde: Oprensede transformanter I

B blev dyrket i microtiterplader i 200 pi Trichoderma minimalt medium med 1% fl

B Solka floc cellulose som carbonkilde og 0,2% proteosepepton som nitrogen- ; B

DK 175814 B1 19 ki!do. 0σ!!ϋϊα3^σ6Γι0ι*/ρθΐΊ urøv uflucfSuyi vcu OuCMrøM0My~imiMUH0uiMUS>i0iΊ ved at anvende ufortyndet vækstmedium mod det CBH l-specifikke antiserum (får) som beskrevet (reference 56). Der blev identificeret en række trans-formanter, som producerede normale mængder CBH II, men ikke påviselige 5 CBH I mængder.

Eksempel 7 I. Fremstilling af plasmid 285'proC indeholdende prochymosingenet (fig.3).

10

Som et eksempel på et heterologt protein i T. reesei valgte vi at udtrykke prochymosin cDNA (fig.3). Preprochymosingenet blev isoleret fra et kalve-mave-cDNA-bibliotek og blev indsat i genkendelsesstedet for Pst! i pBR322 ved hjælp af en G-C-hale (ref. 46 og 47) til opnåelse af pR26. pUC9 blev skå-15 ret med Sall og udfyldt med Klenow-polymerease og blev ligeret med T4-ligase. Det opnåede plasmid blev skåret med BamHI-EcoRI, og det 2,7 kb lange fragment blev ligeret med et 0,47 kb langt BamHI-EcoRI-fragment fra pR26 til frembringelse af pl)C9\ som indeholder et genkendelsessted for HindiII N-terminalt for prochymosingenet. pUC13 blev skåret med BamHI-20 Narl og Narl-Xmal, og det store respektivt det lille fragment blev ligeret med et 0,64 kb langt Xmal-Bcll-fragment fra pR26 til opnåelse af plasmid pl)C13\ som indeholder et genkendelsessted for Xbal C-terminalt for prochymosingenet. Et 0,65 kb langt Xmal-Xbal-fragment fra pUC13’ blev ligeret med et 0,46 kb langt Hindlll-Xmal-fragment fra pUC9’ og et 11 kb langt Xbal-Hindlll-25 fragment fra p285 til frembringelse af et plasmid p285’ proC, som indeholder prochymosingenet som vist på figur 3.

II. Konstruktion af plasmid pAMG/Term.

30 pCAMG91 blev fordøjet med restriktionsendonukleaseme Sall og Pstl.

Fra en sådan fordøjelse blev der isoleret et 698 bp langt fragment på en aga-rosegel. Dette Sall-Pstl-fragment indeholder det område, som koder for den 140 bp lange, ikke-translaterede 3'-del af glucoamylase mRNA plus 540 bp 3’

I DK 175814 B1 I

I 20 I

I for poly(A)-tilføjelsesstedet. Dette 3-fragment blev behandlet med T4-DNA- I

I polymerase for at gøre restriktionsstederne "stumpendede" før tilsætningen I

I af Xbal-linkere og fordøjelse med Xbal-restriktionsenzym. Denne 3-ende af I

glucoamylasegenet blev ligeret til pUC13 liniariseret med Xbal til frembrin- I

I 5 gelse af plasmidet mAMG/Term, som indeholder poly{A)-tilføjelsesområdet I

I for glucoamylasegenet. I

I III. Konstruktion af plasmid pMT837.

I 10 Et 0,5 kb langt Small-BssHII-fragment fra pCAMG91, som indeholder I

I promotoren og de sekvenser, som koder for glucoamylase(AMG)signal- og I

I lederpeptidet, blev ligeret til Smal-BamHI-fordøjet pUC13 og en syntetisk I

I BssHII-BamHI-adaptor, som koder for de første 6 aminosyrer i prochymosin. I

I Fra det fremkomne plasmid, pMT626, blev der isoleret et 0,8 kb langt Ndel- I

I 15 BamHI-fragment, og det blev ligeret til et 0,5 kb langt BamHI-EcoRI-fragment I

fra p285'proC, som indeholder sekvensen for den N-terminale halvdel af I

I proC. og til et 3,0 kb langt EcoRI-Ndel-fragment fra pMT622, som indeholder I

I den C-terminale del af sekvensen for proC. (pMT622 er simpelthen en Eco- I

I Rl-Xbal-subklon af p285’ proC i pUC13). Det fremkomne plasmid pMT648 I

I 20 (se fig.4) indeholder hele prochymosingenet med foranstillet AMG-promotor I

I og signal/leder-kodende sekvenser. pMT648 blev yderligere modificeret til at I

I indeholde arqB-qenet fra A. nidulans (ref.48). Et 1,8 kb langt Narl-udfyldt I

I Xbal-fragment fra pMT648 blev ligeret til et 6,8 kb langt Clal-udfyldt EcoRI- I

I fragment fra pSal43 til frembringelse af pMT651. Der blev ydermere indsat I

I 25 sekvenser yderligere opstrøms AMG-promotoren (opstrømsaktiverende se- I

I kvenser UAS'er). Dette blev opnået ved at ligere et 3,7 kb langt Clal-BssHII- I

I fragment fra den oprindelige klon pCAMG91 til et 1,1 kb langt BssHII-udfyldt I

Xbal-fragment fra pMT648, som indeholder proC-sekvenseme. og argB- I

I genet som et 3,1 kb langt Clal-udfyldt EcoRI-fragment fra pMT813 (pMT813 I

I 30 er arqB-qenet klonet som et 3,1'kb langt BamHI-Nrul-fragment klonet i I

I EcoRV-Bglll-skåret piC19R). Det fremkomne plasmid, pMT830, har en eks- I

I pressionsenhed, som indeholder de opstrømsaktiverende sekvenser, promo- I

I toren, signal- og ledersekvenser fra AMG og hele genet for proC. Endelig I

DK 175814 B1 21

Klr\»< fnrmSnol/MOAl/wrtnrtrkn f^r1 Λ ΛΛ/*^ Ι»·λ *"»f Λ β l/l·* !«««♦ VU«I Vk»%l

Wiv« VWI · iw*v\/ \/ν»ιι >WI (Wiv/I · IVI · i»t»w nu vi V , v iu/ auil^l / U/U l_/\l/U I

fragment fra plasmidet pAMG/Term og indsat i pMT830 skåret med Xbal og dephosphoryleret til frembringelse af pMT837. Konstruktionen af pMT837 er vist på fig.5.

5

Eksempel 8

Produktion af chymosin under anvendelse af pMT837.

10 T. reesei stammerne QM 9414 og RUT-C-30 blev cotransformeret med plasmiderne pMT837 og p3SR2. Plasmidet pMT837 indeholder prochymo-singenet med foranstillet AMG-promotor og signal/leder-sekvens. Konstruktionen af plasmid pMT837 blev beskrevet i eksempel 7 (se også figurerne 3-5). Cotransformation og selektion blev udført som i eksempel 5.

15

For chymosinproduktion blev transformanter dyrket på minimalmedium indeholdende 1% Solka floc cellulose og 0,2% proteosepepton.

Myceliet blev opsamlet, og supematanten blev om nødvendigt koncen-20 treret ved TCA-præcipitering og blev fortyndet i 2 M NaOH 10 mM Tris (pH

8,5). Prøverne blev fraktioneret på SDS-PAGE (7,5% - 15% polyacrylamid-gradient) og blev ved elektroblotting overført til et nitrocellulosefilter. Filtrene blev inkuberet med kaninprochymosinantiserum og blev farvet med 4-chlor-1-naftol under anvendelse af α-kanin-lgG-peroxidasekonjugat købt fra Sigma.

25

Det blev vist, at chymosin blev secerneret i mediet i en mængde på ca. 1 pg/l. Eftersom AMG-promotoren klart fungerede ineffektivt i T\ reesei. blev der konstrueret homologe T reesei promotor-terminatorvektorer for at forbedre produktionsmængden af chymosin.

30

22 I

DK 175814 B1 I

Eksempel 9 I

Konstruktion af heterologe ekspressionsvektorer til produktion af kalvepro- I

i chymosin i T. reesei under anvendelse af cbh1-promotor. I

I. Sammenføjningen af prochymosingenet og cbh 1 -terminatorområdet.

Kalveprochymosingenet blev opnået fra plasmid pR27 (fig.6). Pstl-Pstl-

fragmentet (ca. 1110 bp), som næsten indeholdt hele genet, blev isoleret fra I

10 agarosegel ved traditionelle metoder og blev ligeret til genkendelsesstedet I

for Pst1 i pUC19. I

Dette plasmid blev delvis fordøjet med Pstl, enderne blev gjort stumpe I

med S1-nuklease, og et Avall-terminatorfragment (ca. 750 bp) fra cbh1-genet I

15 (stumpe ender med Klenow-fragment) blev ligeret i dette plasmid. Terminato- I

rområdet for cbh 1-genet blev opnået fra det terminale 1,8 kb lange BamHI- I

fragment fra cbh1 -cDNA subklonet i pBR322 (ref. 24). I

Dette plasmid, som indeholder 'proC-fraomentet koblet med terminato- I

20 rområdet af cbh1-genet i pUC19, blev kaldt pAMH100 (fig.7). I

II. Fusionen af cbh1-promotorområdet og det prochymosinkodende område I

under anvendelse af en Bgll-Sacll-adaptor. I

25 Sacll-Pstl-fragmentet (80 bp), som koder for det N-terminale område af I

prochymosin, blev isoleret fra plasmid pR27 (se figur 6). cbh1- I

promotorområdet blev først subklonet fra genomklonen λ44Α som et 2,8 kb I

langt EcoRI-EcoRI-fragment i pUC18 (plasmid pUA01, fig.8), og derefter blev I

et ca. 2,2 kb langt EcoRl - Bgll-fragment isoleret fra denne subklon. Genken-

30 delsesstedet for Bgll findes i midten af signalsekvensen for cbh1-genet. Den I

præcise sammenføjning af det ca. 2,2 kb lange EcoRl - Bgll-fragment, som I

indeholder promotoren, og ca. halvdelen af det signalpeptidkodende område I

af cbh 1-genet, til det ca. 80 bp lange Sadl - Pstl-prochymosinfragment blev DK 175814 B1 23 —C rv — M r*-ii i i____/μαπ λλλ , iki/ΝΠ λλλ c. _ *r%\ r\: t--- n^uigici ci i u^irua^iraua^iui ci i ^niwi\ £>\J£- ‘ i ί\»/ιλ ny. i v/· LMddC 11 ay menter blev sammen med adaptoren ligeret i pUC19 fordøjet med EcoRI -Pstl. Dette plasmid koder for en fuldstændig signalsekvens af CBHI-fusioneret til den første aminosyre af prochymosin efterfulgt af nogle af dens 5 N-terminale sekvenser. Fra denne konstruktion bjev EcoRI - pcbhl ss -proC - Pstl-fragmentet endeligt isoleret, og det blev ligeret fra dets 3-ende i pAMHIOO fordøjet med Sall og Pstl. 5'-enden af fragmentet og 3'- enden af plasmid pAMHIOO blev udfyldt med Klenow-fragment og ligeret. Promotoren af cbhi-genet og pro C'-fragmentet blev således overført foran ’ proC efter-10 fulgt af cbh1-terminatorområdet. Konstruktionen blev benævnt pAMH102 (fig.

11).

III. Tilføjelsen af en selekterbar markør til et chymosinekspressionsplasmid.

15 Som en selekterbar markør i ekspressionsplasmiderne kan enten amdS- genet fra A. nidulans (ref. 33, 41) eller arqB-qenet af Æ nidulans anvendes (ref. 42).

amdS-genet blev isoleret som et Pvul - Sall-fragment fra p3SR2, og det 20 blev ligeret til det 6 kb lange Pvul - Sall-fragment fra pAMH 102. Denne se-lekterbare vektor blev benævnt pAMH104 (fig.11). 1

Den præcise fusion af cbhi -promotoren og de præprochymosinkodende sekvenser under anvendelse af oligonukleotider.

25

Det aminoterminale Pstl-fragment (ca. 150 bp) af præprochymosin blev isoleret fra pR26 (fig. 3), som inkluderer en komplet præprochymosin cDNA-klon, der starter 12 bp opstrøms ATG, og det blev indsat i genkendelsesstedet for Pstl i pBR322. Dette fragment blev subklonet i polylinkeren fra 30 pTZ19R sammen med cbhi EcoRI-Sacl (ca. 2,6 kb) promotorfragmentet, som også inkluderer det signalsekvenskodende område af cbhi (fig.8). cbh1-EcoRI - Sacl-fragmentet blev opnået fra en 2,8 kb stor EcoRI - EcoRI -subklon i pUC18 (pUA01, fig. 8) af den oprindelige X44A-klon (ref.24).

I DK 175814 B1 I

i 24 I

I pTZ19R (Pharmacia) er et pUC19-baseret plasmid, som inkluderer F1- I

I replikationsorigin og T7-promotoren, som muliggør anvendelsen af ss- I

I template (enkeltstrenget) til oligonukleotidmutagenisering. Konstruktionen af I

det fremkomne plasmid (pAMH 105) er vist på fig.8. Fra dette plasmid blev I

I 5 sekvenserne mellem cbh1 -promotorområdet og proC ATG fjernet ved sløjfe- I

I mutagenisering under anvendelse af et specifikt oligonukleotid, OAMH 3 I

I (fig.10). Udførelsen af oligonukleotidstyret mutagenisering er vist på fig. 9. I

I Det pågældende oligonukleotid blev phosphoryleret henholdsvis annealet til I

I ! SS pAMH 105 DNA (ref.57, ss-DNA blev isoleret fra JM103/pAMH105 som I

I 10 beskrevet af Pharmacia) i et molforhold på 20:1. Oligonukleotidprimeren blev I

I forlænget med Klenow-polymerase og T4-ligase som beskrevet i ref. 57. Ef- I

I ter forlængelse blev blandingen fordøjet med Smal (spalter i polylinkeren fra I

I pTZ19R, se figur 9) forud for transformation i den mutL-fejlparringsrepara-

I tionsstamme af E.coli. BMH71.18 (ref.58). Transformantpuljen blev dyrket I

I 15 natten over i 5 ml flydende kultur (Luria-bouillon som beskrevet i ref.59, med I

I 100 pg/ml ampicillin). Plasmid-DNA blev isoleret fra transformantpuljen og

I blev genfordøjet med Smal og gentransformeret i E.coli stamme JM109. I

I Screening af potentielle deletionskloner blev udført med fordøjelse under an- I

I vendelse af forskellige restriktionsenzymer, og deletionsspecificiteten blev I

I 20 yderligere bekræftet ved sekventering. Det fremkomne plasmid blev benævnt . I

I pAMH1101 (fig.14). Dette plasmid blev yderligere fordøjet med EcoRI og I

I Pstl, og det fremkomne pcbhl- præproC-fraoment blev isoleret (fig.14) og

I ligeret i dets Pstl-ende til pAMHIOO-plasmid fordøjet med Pstl og Sall. En- I

derne af det fremkomne, ligerede fragment blev gjort stumpe ved hjælp af I

I 25 Klenow-fragment og blev ligeret. Det fremkomne plasmid blev benævnt I

I pAMH101, og det indeholder cbh1-promotorområdet fusioneret til prochymo- I

I sins signalsekvens og hele det prochymosinkodende område fusioneret til I

cbh1-genets terminatorområde (fig.14). I

I 30 V. Den præcise fusion af cbh1-promotoren og præproC-qenet ved signalse- : I

kvensfusion udført under anvendelse af oligonukleotider. ; I

DK 175814 B1 25 ^amlh <ιλο /·τ:~. λ o\ uu.. . .*«·** — i\ui <«?n vmuwi ιόι i cii pioomiu ^//~uvii i i i vv/ V11^* '^/ uwnyi v givi ι *?ν*ι ^ν/ι 11 for pAMH1101, som er beskrevet i detaljer i det foranstående afsnit IV med den undtagelse, at det specifikke oligonukleotid, som blev anvendt til denne konstruktion, var 0AMH1 (fig. 10 og 9). Det fremkomne plasmid pAMH1103 5 indeholder en signalsekvensfusion, som inkluderer aminosyrerne (aa) 1-12 fra cbh 1 -signalsekvensen fusioneret til aa 12-16 fra præproC-signal-sekvensen, der ligger foran den aminoterminale del (ca. 140 bp) af det kodende område for proC-qenet (fig. 12). Fra plasmidet pAMH1103 blev p cbh1-sso- proC'-fraqmentet (o = fusion) subklonet i pAMHIOO stort set som 10 beskrevet i i det foranstående afsnit IV (se figur 12). Det fremkomne plasmid pAMH 103 inkluderer promotorområdet af cbh1 og signalsekvensfusionen af cbh1 og præproC. der ligger foran det proC-kodende område fusioneret til cbhl -terminatorområdet.

15 VI. Den præcise fusion af det cbhl-kodende område til det proC-kodende område under anvendelse af oligonukleotider.

Konstruktionen af plasmid pAMH1106 (fig. 13) blev udført stort set som for pAMH1101 beskrevet i detaljer i det foranstående afsnit IV med den und-20 tagelse, at det specifikke oligonukleotid, som blev anvendt til denne konstruktion, var OAMH2 (fig. 10 og 9). Fra det fremkomne plasmid pAMH 1106 inklusiv promotorområdet af cbhl, signalsekvensen af cbhl og det kodende område for 1-20 af de første aa af modent CBH I fusioneret til det kodende område for proC blev det fragment, som indeholder pcbhl-modent o- proC' 25 subklonet i pAMHIOO stort set som beskrevet i det foranstående afsnit IV (fig.

12). Det fremkomne plasmid pAMH106 inkluderer promotorområdet af cbhl. signalsekvensen af cbhl, det kodende område for aa 1-20 af modent CBHI fusioneret til det kodende område for proC.

30 Eksempel 10

Produktion af chymosin under anvendelse af pAMH102 og pAMH104.

I DK 175814 B1 I

I I

I T. reesei stamme QM9414 og RUT-C-30 blev cotransformeret med I

I plasmideme pAMH 102 og p3SR2 i et molforhold på 5:1. Konstruktionen af I

I plasmid pAMH102 blev beskrevet i eksempel 9 afsnit II. Cotransformation og I

I selektion blev udført som i eksempel 5. Transformanteme blev oprenset på I

I 5 selektive acetamidplader som beskrevet i eksempel 3. I

I For chymosinproduktion blev transformanter dyrket på minimalmedium I

I ; (10 til 50 ml) indeholdende 1% Solka floc cellulose og 0,2% proteosepepton. I

Mycelium blev opsamlet, og supernatanten blev koncentreret ved TCA- I

I 10 præcipitering og blev fortyndet i 2 M NaOH, 10 mM Tris (pH 8,5). Myceliet I

I blev brudt i nærværelse af flydende nitrogen, de åbne celler blev pelleteret, I

I og supernatanten blev behandlet på samme måde som dyrkningsmediet. I

I Prøverne blev fraktioneret på SDS-PAGE (7,5% - 15% polyacrylamidgra- I

I dient) og blev overført ved elektroblotting til et nitrocellulosefilter. Filtrene blev I

I 15 inkuberet med kaninprochymosinantiserum og α-kanin-lgG-AP-konjugat (AP I

I : = alkalisk phosphatase) og blev farvet med nitroblåtetrazolium og 5-brom-4- I

I chlor-3-indolylphosphat købt fra Promega Biotec. Mængden af chymosin in- I

I den for og uden for myceliet blev sammenlignet (fig.17). Det blev ved I

I Southern-hybridisering vist, at de kloner, som indeholder et højere antal ko- I

I 20 pier af plasmid pAMH 102 integreret i svampekromosom-DNA'et, også produ- I

I cerede mere chymosin. Når der blev anvendt en transformant med 1 kopi var I

I mængden af secerneret chymosin 100 pg/l dyrkningsmedium, når mængden I

I blev tilnærmet ud fra Western-geler (fig.17). Det blev ved hjælp af Western- I

I geler og mælkekoaguleringsaktiviteten vist, at secerneret prochymosin blev I

I 25 modnet til et aktivt chymosin (chymosin koagulerer mælk ved at spalte β- I

I kasein (ref.60)). Mængden af forskellige former af chymosin (præproC, proC, I

I C og chymosin-afledte nedbrydningsprodukter inden i cellen) i myceliet blev I

I bestemt til at være 0,04% af total mycelieprotein (fig.17), og mængden af I

I secerneret chymosin var 60% af total produceret chymosin. Dette viser T. I

I 30 reesei's effektivitet med hensyn til at secernere selv heterologe genprodukter I

I uden for myceliet. I

- : ! DK 175814 B1 27 γλ__li..._______a. X-- a.______r________a__—... - -i--1 - i -: 11:__i _ _ ?___ _ r _»____!_i ur c? i uic; v ouccii^i iui u cn ι&ιυι 11 icji iici iii^u auor\uiiyc rvupici di μιαοιιιιυ pAMH104 (fig.11), som var i stand til at secernere store mængder af pro-chymosin, ved at bestemme mælkekoaguleringsaktiviteten af vækstmediet.

Den bedste transformant ud af 40 undersøgte fandtes at secernere 500 pg/l 5 dyrkningsmedium bestemt på Western-geler og ved mælkekoaguleringsaktivitet.

Eftersom mængden af secerneret, aktivt chymosin blev forøget 200 gange, når kulturer blev dyrket i en 5 liter laboratoriefermentor sammenlignet 10 med kulturer i lille skala (10-50 ml), er mængden af chymosin, der produceres af denne stammetype, omkring 100 mg/l.

Eksempel 11 15 Konstruktion af en generel ekspressionsvektor for produktion af homologe og heterologe proteiner i T\ reesei.

| For at være i stand til at konstruere vektorer til produktion af forskellige proteiner i T. reesei blev der konstrueret en generel ekspressionsvektor in-20 kluderende promotoren og terminatorområdet af cbh1-genet. cbh1-terminatoren blev subklonet sammen med en adaptor, som indeholder stop-codonet TAA i 3 læserammer, i genkendelsesstedet for Pstl i pUC19, hvilket resulterer i plasmidet pAMH110' (fig.15). Pstl-termihatorfragmentet blev isoleret fra pAMH110\ cbh1 -promotorområdet blev isoleret fra pAMH102 som et 25 EcoR|-Pstl-fragment inklusiv den aminoterminale ende af proC-genet, og disse fragmenter blev subklonet i et EcoRI-Pstl-fordøjet pUC19*, i hvilket det enkelte genkendelsessted for Ndel var blevet forsynet med stumpe ender med Klenow-fragment forud for dette subkloningstrin. Det fremkomne plasmid pAMH110 inkluderer promotoren og terminatoren af cbh1 -genet og 30 mellem disse sekvenser et fyldfragment, som kan fjernes ved fordøjelse med Sadl og Ndel. Efter at enderne er gjort stumpe kan hvilke som helst cDNA'er eller kromosomale kopier af gener indsættes mellem promotoren og terminatoren (fig. 15).

I DK 175814 B1 I

I 28 I

I Eksempel 12 I

Ekspression af T. reesei endoqlucanase I under cbh1-promotor. I

I 5 I

I For at forøge den producerede mængde af endoglucanase blev egl1- I

I genet sammenføjet med den stærkere cbh1-promotor. cDNA fra T. reesei I

I endoglucanase I blev subklonet som et EcoRI - BamHI-fragment i den gene- I

relle ekspressionsvektor pAMH110 (beskrevet i eksempel 11), som først blev I

I 10 fordøjet med Sadl - Ndel for at fjerne fyldfragmentet (fig. 16). Det fremkomne I

I plasmid pAMHIH, som indeholder eg[1-genet mellem promotoren og termi- I

I natoren af cbh1-genet, blev cotransformeret med p3SR2 til T. reesei QM I

I 9414 (ATCC 26921) i et molforhold på 5:1. Transformanterne blev selekteret I

I for AmdS+-fænotype og blev yderligere oprenset på et selektivt medium. I

I 15 Seks individuelle transformanter blev dyrket i 4 dage i cellulaseinducerende I

I medium (Solka floc som en carbonkilde, 1%) i 50 ml flydende kulturer. Kul- I

I tursupematanterne blev derefter undersøgt for endoglucanaseaktivitet ved at I

I måle frigørelsen af reducerende sukker fra hydroxyethylcellulose (0,1%, I

ref.12). Transformantemes EG I aktiviteter blev sammenlignet med en kontrol I

I 20 (QM 9414), og det blev vist, at den bedste transformant secernerede 4 gange I

I kontrolstammens endoglucanaseaktivitet. Dette eksempel viser, at det er mu- I

I ligt at modificere mængderne af forskellige cellulolytiske enzymer i T. reesei I

ved at ændre den respektive promotor. I

DK 175814 B1 29

Roforonror 1. Simmons, E.G., Classification of some cellulase producing Trichoderma species. I: Abstracts of Second International Mycological Congress. Tampa, 5 Florida, USA. H.E.Aigelow & E.G.Simmons (red.) 1977, s.618.

9 2. Berghem, L.E.R. & Pettersson, L.G., The mechanicm of enzymatic cellulose degradation. Purification of cellulolytic enzyme from Trichoderma viride active on highly ordered cellulose. Eur. J. Biochem. 97 (1973), 21-30.

10 3. Gong, C.S., Ladisch, M.R. & Tsao, G.T., Biosynthesis, purification and mode of action of cellulases of Trichoderma reesei. Adv. Chem.Ser. 181 (1979), 261-287.

15 4. Fågerstam, L.G. & Pettersson, L.G., The 1,4-p-glucan cellobiohydrola- ses of Trichoderma reesei QM 9414. A new type of synergism. FEBS Letters 119(1980), 97-100.

5. Enari, T.-M., Microbial Cellulases. I: Microbial Enzymes and Biotechno-20 logy. W.M. Fogarty (red). Applied Science Publishers, London og New York, 1983, s.183-223.

6. Gilbert, I.G. & Tsao, G.T., Physical properties of T. viride cellulase. Ann. Reports on Fermentation Process 6 (1983) 323-358.

25 7. Shoemaker, S.P. & Brown, Jr., R.D., Enzymatic activities of endo-1,4-p-glucanases purified from Trichoderma viride. Biochem. Biophys.Acta. 523 (1978) 133-146.

30 8. Shoemaker, S.P. & Brown, J.r, R.D., Characterization of endo-1,4-p- glucanases purified from Trichoderma viride. Biochem. Biophys.Acta 523.

(1978),147-161.

I DK 175814 B1 I

I 30 I

I 9, Bissett, F.H., Analysis of cellulase proteins by high performance liquid I

I chromatography. J.Chromatog. 178 (1979) 517-523. I

I 10. Farkas, V.A., Jalanko, A. & Kolarova, N., Characterization of cellulase I

5 complexes from Trichoderma reesei QM 9414 and its mutants by means of I

I analytical isoelectrofocusing in polyacrylamide gels. Biochem.Biophys.Acta I

I 706(1982) 105-110. I

I 11. Enari, T.-M., Niku-Paavola, M.-L. & Nummi, M., Comparison of celluloly- I

I 10 tic enzymes from Trichoderma reesei and Aspergillus njger. I: Proceedings of I

I 2nd International Symposium on Bioconversion and Biochemical Enginee- I

I ring. T.K.Ghose (ref.). Indian Institute of Technology, New Delhi 1 (1980) 87- I

I 95· I

I 15 12. Bailey, M.J. & Nevalainen, K.M.H., Induction, isolation and testing of I

stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing I

I cellulase. Enzyme Microb. Technol. 3 (1981) 153-157. I

H 13. Andreotti, R., Medeiros, J., Roche, C. & Mandels, M., Effects of strain I

20 and substrate on production of cellulases by Trichoderma reesei mutants. I: I

Proceedings of 2nd International Symposium on Bioconversion and Bioche- I

mical Engineering. T.K. Ghose (red.) Indian Institute of Technology, New I

Delhi, 1 (1980) 353-388. I

25 14. Farkas, V., Labudova, I., Bauer, S. & Ferenczy, L., Preparation of mu- I

H tants of Trichoderma viride with increased production of cellulase. Folia I

I Microbiol. 26 (1981) 129-132. I

15. Montenecourt, B.S. & Eveleigh, D.E., Selective screening for the isolati- I

30 on of high yielding cellulase mutants of T. reesei. Adv. Chem.Ser. 181 (1979) I

289-301. I

DK 175814 B1 31 16. Mandels M Weber j λ pgrizek, R., Enhanced cellulose production by a mutant of Trichoderma viride. Appl. Microbiol. 21 (1971) 152-154.

17. Gallo, B.J., Andreotti, R., Roche, C., Ruy, D. & Mandels, M., Cellulase 5 production by a new mutant strain of Trichoderma reesei MCG 77. Biotech- nol. Bioengineer. Symp. 8 (1979) 89-102.

18. Warzywoda, M., Vandecasteele, J.P. & Pourquie, J., A comparison of genetically improved strains of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei.

10 Biotechnol. Lett. 5 (1983) 243-246.

19. Montenecourt, B.S. & Eveleigh, D.E., Preparation of mutants of Tricho-derma reesei with enhanced cellulase production. Appl. Environ. Microbiol. 34(1977) 777-782.

15 20. Sheir-Neiss, G. & Montenecourt, B.S., Characterization of the secreted cellulases of Trichoderma reesei wild type and mutants during controlled fermentations. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20 (1984)46-53.

20 21. Shoemaker, S.P., Raymond, J.C. & Bruner, R., Cellulases: Diversity amongst improved Trichoderma strains. I: Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals. A.E. Hollaender (red). Plenum Press. (1981) 89-109.

25 22. Nevalainen, K.M.H., Palva, E.T. & Bailey, M.J.B., A high cellulase- producing mutant strans of Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technoi. 3.

(1980)59-60.

23. Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., 30 Myambo, K. & Innins, M., Molecular cloning of exocellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. BIO/ TECHNOLOGY 1 (1983) 691-696.

I DK 175814 B1 I

I 32 I

I 24. Teeri, T., Salovouri, I. & Knowles, J., The molecular cloning of the major I

I cellulase gene from Trichoderma reesei. BIO/TECHNOLOGY 1 (1983) 696- I

I 699. I

I 5 25. Penttila, M, Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. & Knowles, I

I J. 1986. Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete I

I sequence of the endoglucanase I gene. Gene (1986) 45:253-263. I

I 26. EP-A-0137 280 (Cetus Corporation). I

I 10 I

I 27. Van Arsdel, J.N.V., Kwok, S., Schweickart, V.L., Ladner, M.B., Gelfand, I

I T.H. & Innis, M.A., Cloning, characterization and expression in Saccharomv- I

ces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei. Bio/Technology I

I 5:60-64. I

I 15 I

I 28. WO-A-85/04672 (Alko Ltd.) I

I 29. Chen, C.M., Gritzali, M. & Stafford, T.W., Nucleotide sequence and de- I

I duced primary structure of cellobiohydrolase II from Tricho-derma reesei. I

20 Bio/Technology (1987) 5:274-278. I

I 30. Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttila, M., Teeri, T.T., Ståhlberg, J., I

Johansson, G., Pettersson, G., Claeyssens, M., Tomme, P. & Knowles, J., A I

new endoglucanase from Trichoderma reesei: characterization of both gene I

25 and enzyme. Submitted for publication in Bio/Technology. I

I 31. Case, M., Schweizer, M., Kushner, S.R. & Giles, N.H., Efficient trans- I

formation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. I

Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76 (1979) 5259-5263. I

30 I

32. Ballance, J., Buxton, F.P. & Turner, G., Transformation of Aspergillus I

nidulans by the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Neurospora I

crassa. Biochem.Biophvs.Res.Commun. 112(1983) 284-289. I

Η I

DK 175814 B1 33 33. Tilburn, J., Schazzocchio, C., Taylor, G.T., Zabickyzissman, J.H., Lock-ington, R.A. & Davies, R.W., Transformation by integration of Aspergillus ni-dulans. Gene 26 (1983) 205-221.

5 34. Yelton, M., Hamer, J.E. & Timberlake, W.E., Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81. (1984) ! 1470-1474.

10 35. Kelly, J.M. og Hynes, M.J., Transformation of Aspergillus niqer by the amdS gene of Aspergillus nidulans, EMBO Journal 4 (1985) 475-479.

36. Nevalainen, H., Genetic improvement of enzyme production in industrially important fungal strains. Technical Research Centre of Finland, Publica- 15 tions 26 (1985).

37. Beckwith, J.R., Pardee, A.B., Austrian, R. & Jacob, F., Coordination of the synthesis of the enzymes in the pyridimide pathway of E.coli. J.Mol.Biol. 5(1962)618-634.

20 38. Ballance, D.J. & Turner, G., Development of a high-frequency transforming vector for Aspergillus nidulans. Gene 36 (1985) 321-331.

39. Creighton, T.E:, N-(5'-Phosphoribosyl)anthranilate isomerase-indol-3-25 ylglycerol phosphate synthetase of tryptophan biosynthesis. Biochem.J. 120 (1970)699-707.

40. Keesey, J.K.J.R. & DeMoss, J.A., Cloning of the trp-1 gene from Neu-rospora crassa by complementation of a trpC mutatoin in Escherichia coli, 30 J.Bacteriol. 152(1982)954-958.

I DK 175814 B1 I

I 34 I

I 41. Hynes, M.J., Corrick, C.M. & King, J.A. Isolation of genomic dones con- I

I taining the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of I

I structural and regulatory mutations. Mol.Cell.Biol. 3 (1983), 1430-1439. I

I 5 42. Casadaban, M.J., Martinez-Arias, A., Shapira, S.K. & Chon, J., β* I

I galactosidase gene fusions for analyzing gene expression in Escherichia coli I

I and yeast. Methods Enzymol. 100B (1983) 293-308. I

I 43. Raeder, U. & Broda, P., Rapid preparation of DNA from filamentous fun- I

I 10 gi. Lett, in Appl. Microbiol. 1_ (1985) 17-20. I

I 44. Sollazzo, M., Frank, R. & Cesareni, G., High-level expression of RNAs I

I and proteins: the use of oligonucleotides for the precise fusion of coding-to- I

I regulatory sequences. Gene 37 (1985) 199-206. I

I 15 i

I 45. John, M.A. & Peberdy, J.F., Transformation of Aspergillus nidulans using I

I the araB gene. Enzyme. Microb. Technol. 6 (1984), 386-389. I

I 46. Chirgwin, J.W., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. & Rutter, W.J., Isolation I

I 20 of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. I

I Biochemistry 18 (1979), 5294-5299. I

I 47. Truelsen, E., Gausing, K„ Jochimsen, B., Jørgensen, P. & Marcker, I

Η K.A., Cloning of soybean leghemoglobin structural gene sequences synthesi- I

I 25 zed in vitro. Nucleic Acids Res. 6 (1979), 3061-3072. I

I 48. Berse, B., Dmochowska, A., Skrzypek, M., Wegleriski, P., Bates, M.A. & I

I Weiss, R.L. Cloning and characterization of the ornithine carbamoyltransfe- I

I rase gene from Aspergillus nidulans. Gene 25 (1983), 109-117. I

1 30 I

I 49. Fincham, J.R.S. et al., Fungal genetics, Botanical Monographs bd.4, I

I Blackwell Scientific Publications Edinburgh, s.639, 4.udgave, 1979. I

DK 175814 B1 35 RO Dni Y Rpx/icinn nf tho Wwnnnrooloo ^ulturol nKe«r\/^»/%r%o II LJw *— . , - ------ -· · vr”· ...... w-*·-. «-· wwwv· .....*7 pocrea dichromospora sp. nov. and its Trichoderma state. Bull. Nat. Sci.

Mus. Tokyo, 11 (1968), 185-189.

5 51. Yanish-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J., Improved MJ13 phage clo ning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC 19 vectors. Gene 33 (1985) 103-119.

52. Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Høegh, I. & Fill, N.P., Two different ty-10 pes of intervening sequences in the glucoamylase gene from Aspergillus ni- qer. The EMBO Journal 3 (1984), 1581-1585.

53. March, J.L., Erfle, M. & Wykes, E.J. The pIC plasmid and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selection by insertional inactiva- 15 tion. Gene 32 (1984), 481-485.

54. Vieira, J. & Messing, J., The pUC plasmids, an M13mp7 - derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19 (1982), 259-268.

20 55. Van Gorcom, R.F.M., Punt, P.J., Pouwels, P.H. & Van den Hondel, C.A.M.J.J., A system for the analysis of expression signals in Aspergillus.

Gene 48 (1986) 211-217.

25 56. Nummi, M., Niku-Paavola, M.-L, Lappalainen, A., Enari, T.-M. & Raunio, V., Cellobiohydrolase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 215 (1983), 677-683.

57. Eghtedarzadch, M.K. & Henikoff, S., Use of oligonucleotides to generate 30 large deletions. Nucl. Acids Res. 14 (1986), 5115.

58. Opnået fra Paul Thomas, Imperial College, Dept, of Chemistry, London.

I DK 175814 B1 I

I 36 I

I 59. Miller, J.H., Experiments in Molecular genetics (1972), Cold Spring Har- I

I bor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. I

I 60. The method for determining the activity of chymosin in cleavage of milk I

I 5 β-kasein has been described by Siika-aho, M. (1983) Mikrobirenniinin tuot- I

I taminen, Msc.Thesis. Biotechnical Laboratory, VTT, Tietotie 2, 02150 Espoo, I

I Finland. I

61. EP-A-0 215 594 (Genencor, Inc.). ' I

I 10 I

I De træk, der er beskrevet i den foregående beskrivelse, i de efterfølgende I

krav og/eller på tegningen kan, både separat og i enhver kombination deraf, I

være af afgørende betydning for realisering af opfindelsen i forskellige former I

I deraf. I

I 15 I

Claims (23)

11. Trichoderma-stamme stabilt transformeret med et vektorsystem omfattende: 5 a) et gen, der koder for et ønsket proteinprodukt. b) funktioner, der letter genekspression herunder DNA sekvenser omfattende promotorer/ forstærkere, som er tilknyttet på funktionsdygtig måde til styring af ekspression af det ønskede produkt, og c) en selektionsmarkør, der er i stand til at selektere stabile Tricho-10 derma-transformanter. hvor selektionsmarkøren ikke er afledt fra Neurospora crassa pyr-4-genet.

2. Stamme ifølge krav 1, hvori vektorsystemet yderligere omfatter en I signal/leder-sekvens fusioneret opstrøms til 5-enden af genet for det ønske- I 15 de proteinprodukt. I

3. Stamme ifølge krav 1 eller 2, hvori vektorsystemets promotor kan I fungere i Trichoderma. I

4. Stamme ifølge krav 1, hvori vektorsystemets promotor hidrører fra I et gen for protein, der er heterologt med Trichoderma. I

5. Stamme ifølge krav 2, hvori vektorsystemets signal/leder-sekvens I hidrører fra et gen for et protein, der secerneres af Trichoderma. I

6. Stamme ifølge krav 2, hvori vektorsystemets signal/leder-sekvens I hidrører fra et secerneret protein, der er heterologt med Trichoderma. I

7, Stamme ifølge krav 5 eller 6, hvori vektorsystemets signal/leder- I 30 sekvens hidrører fra signal/leder-sekvensen for de ønskede proteiner. I

8. Stamme ifølge krav 5, hvori vektorsystemets signalsekvens er I Trichoderma reesei cbh1 -sionalsekvensen. I I DK 175814 B1 I 38

9. Stamme ifølge krav 6, hvori vektorsystemets signalsekvens er I Aspergillus glucoamylasesignalsekvensen. I 5 10. Stamme ifølge krav 1, hvori det ønskede protein er homologt med I Trichoderma.

11. Stamme ifølge krav 1, hvori det ønskede protein er heterologt I med Trichoderma. I 10

12. Stamme ifølge krav 11, hvori det ønskede produkt er prochymo- I sin.

13. Stamme ifølge krav 10. hvori det ønskede produkt er Trichoderma 15 reese| endoglucanase (EG I).

14. Stamme ifølge krav 3, hvori vektorsystemets promotor er Tricho- derma reesei cbh1-promotoren.

15. Stamme ifølge krav 4, hvori vektorsystemets promotor er Asper- gillus olucoamvlasepromotoren.

16. Stamme ifølge krav 1, hvori vektorsystemets selektionsmarkør hidrører fra Aspergillus nidulans amdS-qenet, Aspergillus nidulans eller Trl· 25 choderma reesei argB-genet, Trichoderma reesei pyr4-oenet eller Aspergillus nidulans trpC-qenet. H ! 17. Stamme ifølge krav 1, hvori vektorsystemet omfatter mindst to | plasmider eller vektorer. I ! 30

18. Stamme ifølge krav 17, hvori vektorsystemets selektionsmarkør befinder sig på det ene plasmid, og at de resterende DNA-sekvenser, som skal inkorporeres i værtsgenomet, befinder sig på det andet plasmid. I DK 175814 B1 39

119. Stamme ifølge krav 1, hvori vektorsystemet omfatter ét plasmid eller én vektor.

20. Fremgangsmåde til transformation af Trichoderma. hvori en egnet Trichoderma stamme transformeres med et vektorsystem omfattende: a) et gen, der koder for et ønsket proteinprodukt, b) funktioner, der letter genekspression herunder DNA sekvenser 10 omfattende promotorer/ forstærkere, som er tilknyttet på funktionsdygtig måde til genet til styring af ekspression af det ønskede produkt, og c) en selektionsmarkør, der er i stand til at selektere stabile Tricho-derma-transformanter og selektere stabilt transformeret Trichoderma ved selektionsmarkørens tilstedeværelse, hvor selektionsmarkøren ikke er afledt 15 fra Neurospora crassa pvr-4-qenet.

21. Fremgangsmåde til produktion af et proteinprodukt i Trichoderma. hvori en stamme ifølge et hvilket som helst af kravene 1-19 dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og det udtrykte og secernerede proteinprodukt udvindes 20 fra dyrkningsmediet.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af et proteinprodukt i Trichoderma. som omfatter dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af en egnet stabilt transformeret værtsmikroorganisme ifølge et hvilket som helst af kravene 1-19 og 25 udvinding af det udtrykte og secernerede proteinprodukt fra dyrkningsmediet.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 22, hvori værtsmikroorga-nismen er en prototrofT. reesei stamme. I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 22, hvori værtsmikroorga- I nismen er en auxotrof reesei stamme. I I DK 175814 B1 I 40

25. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 21 - 24, hvori værtsstammen mangler et hvilket som helst gen, der koder for et uøn- I sket produkt. I 5 26. Fremgangsmåde ifølge krav 25, hvori værtsstammen er defekt i I cbh1 -genet.