DE3786592T2 - Transformation von trichoderma. - Google Patents
Transformation von trichoderma.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem zur Verwendung bei der Transformation von Trichoderma, ein Verfahren zur Expression auf hohem Niveau und Sekretion von Proteinen in Trichoderma, DNA-rekombinante Vektoren und transformierte Trichoderma-Stämme.
- Fadenpilze sind niedere Eukaryonten, die in der Biotechnologie in breitem Umfang verwendet werden, um verschiedene Fermentationsprodukte herzustellen. Pilze sekretieren viele industriell wichtige Enzyme, wie etwa Glucoamylase, Proteasen, Lactase, Pectinasen und Glucose- Oxidase.
- Fadenpilze besitzen eine Anzahl biotechnischer Vorteile. Sie produzieren im allgemeinen hohe Mengen an Proteinen, die Kultivierung im Großmaßstab ist nicht kompliziert und die Trennung des Mycels von der Kulturflüssigkeit nach der Fermentation ist einfach.
- Der mesophile imperfekte Pilz Trichoderma reesei (früher T. viride) (Lit. 1) produziert Enzyme, die bei der Umwandlung cellulosischer Biomasse benötigt werden, und ist wahrscheinlich der am weitestgehenden untersuchte aller cellulaseproduzierenden Organismen.
- Zur Hydrolyse von Cellulose zu Glucose sind drei Arten von Enzymaktivität erforderlich: zufällig spaltende Endoglucanasen (1,4-β-D-glukanglucanohydrolase, EC 3.2.1.4), die üblicherweise substituierte lösliche Substrate angreifen und keine Aktivität gegenüber kristalliner Cellulose zeigen; Cellobiohydrolase (1,4-β-D-Glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), die in der Lage ist, kristalline Cellulose abzubauen, aber keine Aktivität gegenüber derivatisierter Cellulose besitzt, und β-Glucosidase (β-D-Glucosid Glucohydrolase, EC 3.2.1.21), die Cellobiose und Cello- Oligosaccharide angreift, um Glucose zu liefern. Synergistische Wirkung zwischen einigen dieser Enzyme ist nachgewiesen worden (Lit. 2-4).
- Pilz-Cellulasen sind gereinigt und charakterisiert worden und es hat sich gezeigt, daß alle drei Haupttypen von Enzymen in mehrfachen Formen auftreten (Lit. 5). Zwei immunologisch besondere Cellobiohydrolasen, CBH I und CBH II, sind aus dem Kulturmedium von T. reesei nachgewiesen worden (Lit. 4, 6). Über fünf bis acht elektrophoretisch verschiedene Endoglukanasen ist berichtet worden, wobei viele von diesen variierende Substratspezifitäten zeigten (Lit. 7, 8, 9, 10). Über die Charakterisierung von zwei extracellulären β-Glucosidasen ist berichtet worden (Lit. 11).
- Intensive Stammentwicklung unter Verwendung des direkten Ansatzes der Mutation und des Screening hat erfolgreich mehrere, hohe Ausbeuten liefernde T. reesei-Mutantenstämme geliefert (Lit. 12-22). Die Menge an extracellulärem Protein, das von den besten T. reesei-Mutanten produziert wird, ist so viel wie 20-30 g/Liter Kulturflüssigkeit, was mehr ist als 50% des gesamten Zellproteins. Ein Hauptteil des sekretierten Proteins umfaßt Cellulasen, unter denen die CBH I-Komponente am reichlichsten vorhanden ist, wobei sie bis zu 60% der sekretierten Cellulase-Proteine darstellt.
- Das Gen für CBH I ist von Shoemaker et al. (Lit. 23) und Teeri et al. (Lit. 24) kloniert worden und die gesamte Nukleotidsequenz des Gens ist veröffentlicht worden (Lit. 23). Aus T. reesei ist auch das Gen für die wichtige Endoglucanase EG I kloniert und charakterisiert worden (Lit. 25, 26, 27). Andere isolierte Cellulase-Gene sind cbh2 (Lit. 28, 29) und egl3 (Lit. 30).
- Die Molekularbiologie von industriell wichtigen Fadenpilzen ist im allgemeinen nicht gut bekannt. Dies beruht teilweise auf dem Fehlen des sexuellen Fortpflanzungszyklus und/oder genetischen Transformationssystems. Kürzlich sind Tranformationssysteme für Neurospora crassa (Lit. 31), A. nidulans (Lit. 32, 33, 34) und A. niger (Lit. 35) oder Trichoderma (Lit. 61) entwickelt worden, die im allgemeinen ihre Basis in der Komplementation des mutanten Wirts durch ein entsprechendes funktionales Gen haben, das von dem Vektormolekül getragen wird. Von diesen Pilzen ist jedoch nur A. niger im Augenblick von industrieller Bedeutung.
- In der Klassifikation von Pilzen ist die Gattung Aspergillus eingeschlossen in der Klasse Ascomycetes, Unterklasse Euascomycetes. Euascomycetes sind unterteilt in drei Gruppen, Plectomycetes, Pyrenomycetes und Discomycetes, auf der Basis der Fruchtkörper. Die wichtigsten Gattungen sind Aspergillus und Penicillium (Lit. 49). Trichoderma wird stattdessen als ein Mitglied von Fungi imperfecti klassifiziert. Fungi imperfecti ist eine Sonderkategorie von Pilzen, die keine sexuelle Fortpflanzung oder offensichtliche Affinitäten mit sich sexuell fortpflanzenden Gattungen besitzen, wie etwa die hoch charakteristischen Aspergillus. Obgleich berichtet worden ist, daß Trichoderma ein schlecht definiertes sexuelles Stadium besitzt, das ein imperfektes Stadium der perfekten Ascomycetenspezies Hypocrea ist (Lit. 50), müssen die Gattungen Aspergillus und Trichoderma klar als taxonomische sehr unterschiedlich angesehen werden. Es ist auch gezeigt worden, daß, das argB- Gen aus Aspergillus nidulans und das pyr4-Gen aus Neurospora crassa unter nicht-stringenten Bedingungen nicht an die entsprechenden Trichoderma-Gene hybridisieren, was den Gedanken untermauert, daß Trichoderma evolutionär recht verschieden von anderen Ascomycetes ist (Vananen, S. in Vorbereitung).
- Wegen seiner außergewöhnlichen Fähigkeit, Proteine in das Wachstumsmedium zu sekretieren, ist Trichoderma reesei ein guter Kandidat als ein möglicher Wirt für die Produktion von Proteinen. Genetische Studien von T. reesei sind jedoch bisher fast ausschließlich darauf gerichtet worden, die Cellulase produzierenden Eigenschaften des Pilzes zu verbessern, und die einzige Technik, die für die Entwicklung von hypercellulotischen Trichoderma-Stämmen verwendet worden ist, ist traditionelle Mutagenese und Screening gewesen. Keine Transformationssysteme, die stabile Transformanten in Trichoderma geben, sind bisher entwickelt worden.
- Es ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Trichoderma zur Verfügung zu stellen, die mit einem effektiven Wirtsvektorsystem stabil transformiert sind, um eine Expression auf hohem Niveau und Sekretion heterologer Proteine in Trichoderma zu erhalten oder um die Produktion von homologen Proteinen zu erhöhen.
- In der vorliegenden Beschreibung mit Ansprüchen bedeutet der Ausdruck "zu Trichoderma heterologe Proteine" Proteine, die natürlicherweise nicht von Trichoderma produziert werden, wohingegen "zu Trichoderma homologe Proteine" Proteine bedeutet, die von Trichoderma selbst produziert werden.
- In den Pilz-Transformationssystemen, die zuerst entwickelt worden sind, nämlich für Aspergillus und Neurospora, wird Transformation unter Verwendung von Protoplasten durchgeführt. Die transformierende DNA wird üblicherweise in das Wirtsgenom integriert. Um ein Selektionssystem zur Identifizierung stabiler Transformanten zur Verfügung zu stellen, muß das Vektorsystem ein funktionelles Gen (einen Selektionsmarker) tragen, der entweder eine entsprechende Mutation des Wirtsgenoms komplementiert oder eine Aktivität, üblicherweise ein Enzym, liefert, das für das Wachstum des prototrophen Stamms auf einem bestimmten Wachstumsmedium erforderlich ist.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt Trichoderma-Stämme, die mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem stabil transformiert sind. Wenn das DNA-Klonierungsvektorsystem eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert, wird die Transformation von Trichoderma mit dem vorliegenden Vektorsystem eine Expression auf hohem Niveau und Sekretion des gewünschten Proteins bereitstellen, wenn der transformierte Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird.
- Gemäß ihrem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Trichoderma-Stamm zur Verfügung, der stabil transformiert ist mit einem Vektorsystem, welches umfaßt:
- a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,
- b) Funktionen, die Genexpression erleichtern, einschließlich DNA-Sequenzen, die Promotoren/Verstärker umfassen, die operabel mit besagtem Gen verbunden sind, um Expression des gewünschten Produktes zu kontrollieren, und
- c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile Trichoderma-Transformanten zu selektieren, wobei der Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen abgeleitet ist.
- Gemäß ihrem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transformation von Trichoderma zur Verfügung, bei dem ein geeigneter Trichoderma-Stamm mit dem vorliegenden Vektorsystem transformiert wird.
- Gemäß ihrem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Trichoderma zur Verfügung, welches umfaßt, daß Trichoderma mit dem vorliegenden Vektorsystem transformiert, der transformierte Stamm in einem geeigneten Medium kultiviert und das exprimierte und sekretierte Produkt aus dem Medium gewonnen wird.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins in Trichoderma zur Verfügung, durch welches ein Trichoderma-Stamm der mit dem Vektorsystem transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und das exprimierte und sekretierte Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
- Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Vektorsystem" einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehr Vektoren oder Plasmide, die zusammen die DNA- Information, die in das Wirtsgenom integriert werden soll, enthalten. Die Vektoren oder Plasmide können lineare oder geschlossene zirkulare Moleküle sein. Obgleich selbstreplizierende Plasmide in Trichoderma gegenwärtig nicht bekannt sind, deckt die Erfindung auch solche selbstreplizierenden Plasmide ab, wenn sie zu einem späteren Zeitpunkt gefunden werden sollten.
- Das Vektorsystem umfaßt DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren, Verstärkern und Transkriptionsinitiationsstellen sowie Terminatoren, einen Marker zur Selektion von Transformanten und eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein kodiert.
- Um Sekretion des exprimierten Produktes sicherzustellen, wird das Gen für das gewünschte Produkt vorzugsweise mit einer Vorregion bereitgestellt, die effektive Lenkung des exprimierten Produktes in den sekretorischen Weg der Zelle sicherstellt. Diese Vorregion, die ein natürlich auftretendes Signal- oder Leader-Peptid oder Teile desselben sein könnte, wird üblicherweise während der Sekretion vom gewünschten Produkt abgespalten, woraufhin das reife Produkt aus dem Kulturmedium isoliert werden kann.
- Das Gen für das gewünschte Produkt kann aus Genomklonen oder cDNA-Klonen erhalten werden. DNA-Sequenzen können auch synthetisiert werden.
- Die Signal/Leader-Sequenz kann abgeleitet werden von der Signal/Leader-Sequenz des Gens, das das gewünschte Protein kodiert, oder kann abgeleitet werden von Genen für andere sekretierte Proteine entweder aus Trichoderma oder aus jeder anderen Organismenquelle. Beispiele für Signal/Leader- Sequenzen, die abgeleitet sind von Genen, die ein von Trichoderma sekretiertes Protein kodieren, sind die cbh1- Signalsequenz oder die egl1-Signalsequenz oder Teile derselben. Signal/Leader-Sequenzen, die abgeleitet sind von Genen, die zu Trichoderma heterologe sekretierte Proteine kodieren, können abgeleitet werden von Genen für Aspergillus-Amylasen oder -Glucoamylase. Auch synthetische Signal/Leader-Sequenzen können verwendet werden.
- Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die Transkriptionsaktivität in Trichoderma zeigt, und kann abgeleitet werden von Genen, die entweder homolog oder heterolog zu Trichoderma sind. Beispiele für Promotoren, die von Genen abgeleitet sind, die zu Trichoderma homologe Proteine kodieren, sind der cbh1-Promotor oder egl1-Promotor oder Teile derselben. Ein Beispiel für einen Promotor, der von einem Gen für ein zu Trichoderma heterologes Protein abgeleitet ist, ist der Aspergillus-Glucoamylase-Promotor. Transkriptionsterminatoren können von denselben Quellen wie die Promotoren abgeleitet werden. Auch synthetische Promotor- oder Terminator-Sequenzen können verwendet werden,
- Es wird verstanden und ist für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, daß spezifisch erwähnte DNA-Sequenzen durch Änderung oder Deletion von ein paar Basen modifiziert werden kann, die für die Funktion des kodierten Produktes nicht wesentlich sind. Zum Beispiel können DNA-Sequenzen, die im wesentlichen mit cbh1- oder egl1-Signal- oder -Promotor-Sequenzen übereinstimmen, solange verwendet werden, wie sie die beabsichtigte Funktion in Trichoderma zeigen. Auch die Gene für die gewünschten Proteine können solange verändert werden, wie dies keine schädliche Wirkung auf die Aktivität des Proteins hat.
- Verschiedenen Selektionsmarker können verwendet werden, z.B. argB (A. nidulans oder T. reesei), amdS (A. nidulans), trp1 aus N. crassa oder trpC aus A. nidulans und pyr4 (Neurospora crassa oder T. reesei).
- Der Wirtsstamm kann entweder ein prototropher oder ein auxotropher Trichoderma-Stamm sein, abhängig vom Selektionsmarker, der im Transformationsverfahren verwendet wird. Das amdS-Gen aus A. nidulans kann, wie im experimentellen Teil der Beschreibung nachgewiesen ist, für die Transformation von prototrophen T. reesei-Stämmen verwendet werden. T. reesei wächst schlecht auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle und das Wachstum kann überdies gehemmt werden durch Zugabe von CsCl zum Medium. Das Wachstum auf Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle in Gegenwart von CsCl kann demgemäß als ein Selektionsmedium verwendet werden, um AmdS&spplus;-Transformanten zu identifizieren.
- Wenn ein Selektionsmarker verwendet wird, der eine entsprechende Mutation des Wirtsgenoms komplementiert, müssen auxotrophe Trichoderma-Mutanten konstruiert werden. Auxotrophe Trichoderma-Mutanten können mit bekannten Verfahren zur Herstellung von mutanten Stämmen hergestellt werden.
- Auxotrophe Trichoderma-Mutanten, die Uracil, Tryptophan oder Arginin zum Wachstum benötigen, wurden durch eine Filtrationsanreicherungstechnik isoliert, wie beschrieben von Nevalainen (Lit. 36). Aus Arginin benötigenden Auxotrophen wurden Mutanten, denen das argB-Gen fehlt, durch Verwendung einer Reihe von "minimal plates", geliefert von verschiedenen Zwischenprodukten in der Arginin-Biosynthese, identifiziert. Aus Uracil benötigenden Mutanten können Stämme, denen das pyr4-Gen fehlt, durch Messen der Orotidin- 5'-phosphat-Decarboxylase (OMP-Decase)-Aktivität in Mycel- Präparaten gesucht werden (Lit. 37).
- Mutanten mit einem trp1-Genmangel können durch das Fehlen der PRA-Isomerase-InGP-Synthetase-Aktivität in ihren Mycelen charakterisiert werden (Lit. 39). Der trp1-Charakter der Mutanten, die keine Enzymaktivität zeigen, kann bestätigt werden durch z.B. Transformation und Komplementation mit dem N. crassa trp1-Plasmid (Lit. 40) oder dem trpC-Plasmid von A. nidulans (Lit. 34).
- Die verwendete Transformationstechnik ist die Methode, die ausgeht von den Methoden zur Transformation von A. nidulans (Lit. 32, 33) adaptiert ist. Protoplasten werden mit bekannten Methoden hergestellt, indem Mycel auf Agarplatten gezüchtet und Mycel in einer gepufferten Lösung von Novozym 234 suspendiert wird. Anstelle der herkömmlichen Saccharoselösung von Novozym 234 kann vorteilhafterweise eine Sorbit-Lösung verwendet werden. Transformierende DNA wird dann zur Protoplast-Lösung zugegeben, wie im weiteren Detail im experimentellen Teil der Beschreibung beschrieben. Die Transformation wird üblicherweise als eine Co- Transformation durchgeführt, mit der ein nicht- selektierbares Plasmid mit hoher Häufigkeit unter Verwendung eines in ein anderes Plasmid inserierten selektierbaren Markers (z.B. amdS in p3SR2 oder argB in pSa143) in T. reesei co-transformiert wird. Ein großer Teil der Transformanten enthält das nicht-selektierbare Plasmid in das Genom integriert, wenn äquimolare Mengen DNA zur Transformation verwendet werden. Wenn ein argB&supmin; T. reesei- Stamm bei der Transformation mit äquimolaren Mengen der Plasmide p3SR2 und pSA143 verwendet wird, können Transformanten auf Doppelselektionsmedium (Minimalmedium, Acetamid, CsCl) erhalten werden. Alternativ kann ein einzelnes Plasmid zur Tranformation verwendet werden, in dem auch der selektierbare Marker inseriert ist.
- Tranformanten werden dann in einem geeigneten Medium kultiviert. Um in der Lage zu sein, das gewünschte Produkt in einem einfachen definierten Medium zu produzieren, kann ein glucoseinduzierbarer Promotor verwendet werden. Wenn Trichoderma auf einem Medium gezüchtet wird, das 1% Glucose enthält, wird Sekretion aller extracellulären Proteine, einschließlich Proteasen, stark unterdrückt. Wenn das Gen, das für das gewünschte Enzym kodiert, mit einem Promotor verbunden ist, der in glucosehaltigem Medium stark exprimiert wird, wird das gewünschte Enzym in das Wachstumsmedium sekretiert. Da andere Proteine unter diesen Bedingungen nicht produziert werden, ist das gewünschte Enzym das in das Medium sekretierte Hauptprotein.
- Wenn das Pilzmycel entfernt ist, liegt das gewünschte Protein in der resultierenden Lösung in einer sehr reinen Form vor. Falls erforderlich, kann es sehr leicht weiter gereinigt werden, daß es fast das einzige vorhandene Protein ist.
- Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um ein Gen, das eine bestimmte Enzymaktivität des Wirtsorganismus produziert, zu modifizieren oder zu inaktivieren. Als ein Beispiel können Cellulase-negative T. reesei-Stämme konstruiert werden. Diese Mutagenese beruht auf der Transformation von Trichoderma reesei mit einem Plasmid, das ein fehlerhaftes Cellulase-Gen trägt. Homologe Rekombination des Plasmids am chromosomalen Cellulase-Locus bewirkt insertionale Inaktivierung des endogenen T. reesei- Cellulase-Gens. Das für die Transformation verwendete Plasmid enthält nur einen Teil der Cellulase kodierenden Region und produziert inaktives Protein. Keine 5'- flankierenden Sequenzen sind eingeschlossen. Eine Leserastermutation kann ebenfalls in die gestutzte Kodierungsregion eingeführt werden. Ein Selektionsmarker (argB) oder ein Marker zum Screening (lacZ) kann an das zur Transformation verwendete Plasmid gekoppelt werden. Nach Rekombination wird der Marker zwischen den zwei resultierenden fehlerhaften Cellulase-Genen plaziert sein. Das Prinzip der Methode ist in Fig. 1 dargestellt.
- Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Produktion von Chymosin und Trichoderma reesei-Endoglucanase I (EGI) veranschaulicht. Promotor-, Signal- und Leader- und Terminator-Sequenzen wurden abgeleitet von entweder dem Glucoamylase-Gen aus Aspergillus niger oder dem Trichoderma reesei cbh1-Gen. Als Selektionsmarker wurde das amdS-Gen aus A. nidulans verwendet, ebenso wie das argB-Gen aus A. nidulans.
- p285: ATCC No. 20681
- pCAMG91: Lit. 59
- pIC19R: Lit. 60
- pSa143: Lit. 51 + 54
- p3SR2: Lit. 33 + 35
- pDJB2: Lit. 38
- pMC1817: Lit. 46
- pTT01, pTT11: Lit. 28
- pUC9, pUC13: Lit. 61
- pUC18, pUC19: Lit. 58
- pTZ19R: (Pharmacia)
- pAN5-41B: Lit. 62
- E. coli-Stämme JM101, JM103, JM109 und DH1 (Lit. 51) werden als Wirte bei der E. coli-Klonierung verwendet. Trichoderma reesei-Stämme QM9414 (ATCC 26921) und RUT-C-30 (ATCC 56765) werden bei der Pilztransformation und den Expressionsstudien verwendet.
- Glucose 20 g
- (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5 g
- KH&sub2;PO&sub4; 15 g
- MgSO&sub4; 0,6 g
- CaC1 0,6 g
- FeSO&sub4;, 7H&sub2;O 5 mg
- MnSO&sub4;, H&sub2;O 1,56 mg
- ZnSO&sub4;, 7H&sub2;O 1,4 mg
- CoCl&sub2; 2 mg/ 1 H&sub2;O
- Die Figuren der Konstruktionen sind nicht maßstabsgerecht.
- Fig. 1 zeigt das Prinzip der Inaktivierung eines chromosomalen Cellulase-Gens.
- Fig. 2 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMS4, die zur Insertionsmutagenese des chromosomalen T. reesei cbh1-Locus verwendet wurden. Die Position einer Leserastermutation, die durch Inaktivierung der EcoRI-Stelle erzeugt wurde, ist mit * markiert.
- Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Plasmid p285' proC.
- Fig. 4 zeigt die Konstruktion der Plasmide pMT648 und 15 pMT813.
- Fig. 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pMT837.
- Fig. 6 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pR27.
- Fig. 7 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH100.
- Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH105.
- Fig. 9 zeigt die Konstruktion der Plasmide pAMH1103, pAMH1106 und pAMH1101 durch Loop-Mutagenese unter Verwendung synthetisierter Oligonukleotide OAMH1, OAMH2 und OAMH3.
- Fig. 10 zeigt die Linker NOR 202, NOR 203, OAMH1, OAMH2 und OAMH3.
- Fig. 11 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pAMH102 und pAMH104.
- Fig. 12 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1103 und die Konstruktion von pAMH103.
- Fig. 13 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1106 und die Konstruktion von pAMH106.
- Fig. 14 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pAMH1101 und die Konstruktion von pAMH101.
- Fig. 15 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH110.
- Fig. 16 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAMH111, verwendet zur Expression von EGI unter cbh1- Promotorfunktion.
- Fig. 17 zeigt die Expression von Chymosin in T. reesei, Western Blot. Spur 1; gereinigte Prochymosin- Kontrollsubstanz, schließt Spuren von Pseudochymosin und Chymosin ein. Spur 2; Kulturüberstand aus Wachstum von Stamm, der pAMH102 einschließt. Spur 3; Kontrollüberstand aus Stamm ohne Plasmide. Spur 4; Mycele aus Stamm, der pAMH102 einschließt.
- Auxotrophe Mutanten, die zum Wachstum Uracil, Tryptophan oder Arginin benötigen, wurden unter Verwendung von Filtrationsanreicherung isoliert, wie beschrieben von Nevalainen (Lit. 36). Das verwendete mutagene Mittel war UV- Licht. Aus Arginin benötigenden Auxotrophen wurden Mutanten, denen das argB-Gen fehlte, unter Verwendung einer Reihe von "minimal plates", geliefert von verschiedenen Zwischenprodukten in der Arginin-Biosynthese, identifiziert (Lit. 36). Mutanten, die zum Wachstum Citrullin benötigen, wurden als mögliche argB&supmin;-Mutanten angesehen. Der argB&supmin;- Charakter isolierter Mutanten wurde bestätigt, indem sie durch Verwendung des Plasmids pSa143, das das A. nidulans argB-Gen enthielt, zu Prototrophie transformiert wurden (Beispiel 4).
- Aus Uracil benötigenden Mutanten wurden Stämme, denen das pyr4-Gen fehlte, herausgesucht. Der pyr4&supmin;-Charakter dieser Mutanten wurde bestätigt durch Transformation mit einem Plasmid, welches das N. crassa pyr4-Gen (Lit. 38) enthielt (Beispiel 4).
- Mycel wurde auf Cellophanscheiben auf Kartoffeldextrose- Agar-Platten (Difco) gezüchtet. Mycel aus 5 Cellophan- Kulturen wurde in 15 ml einer 5 mg/ml-Lösung von Novozym 234 in 1,2 M Sorbit, gepuffert bei pH 5,6 mit 0,1 M Kaliumphosphat, suspendiert. Die Mischung wurde 1,5-2 h bei 30ºC inkubiert. Protoplasten wurde von Myceltrümmern durch Filtration durch gesintertes Glas (Porosität 1) getrennt, für 5 min. bei 4.000 g pelletiert und zweimal mit 1,2 M Sorbit - 10mM Tris, HCl, pH 7,5 gewaschen.
- Bessere Reinigung von Protoplasten kann erreicht werden durch Verwendung eines Verfahrens, das von Tilburn et al. beschrieben (Lit. 33). 5 mg/ml Lösung von Novozym 234 in 1,2 M MgSO&sub4;, gepuffert bei pH 5,8, wurde für die Protoplastenbildung verwendet. Nach Inkubation und Filtration wurde die Protoplastensuspension bei 4.000 g für 15 min. mit einer Deckschicht eines gleichen Volumens aus 0,6 M Sorbit - 100 mM Tris, HCl, pH 7,0, zentrifugiert. Protoplasten bildeten ein scharfes Band in halber Höhe des Röhrchens. Die Protoplasten wurden in 1 vol. 1,2 M Sorbit - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, suspendiert, heruntergeschleudert und zweimal in 1,2 M Sorbit - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, gewaschen. Die Protoplasten wurden in 1,2 M Sorbit - 10 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, bei einer Konzentration von 5 x 10&sup6; - 5 x 10&sup7; Protoplasten/ml suspendiert.
- Die Lebensfähigkeit der Protoplasten wurde auf Trichoderma- Minimalmedium mit 1 M Sorbit als osmotischem Stabilisator beurteilt. Die Protoplasten wurden in 3% Agar-Deckschicht plattiert. Die Regenerationshäufigkeit betrug 40-80% für den Stamm QM 9414 (ATCC 26921).
- Plasmid p3SR2 wurde bei der Tranformation verwendet. Es enthielt A. nidulans-DNA, die das gesamte Acetamidase- Strukturgen amdS und seine regulatorische Region amdI trug (Lit. 41 und 33).
- 20 ul (4 - 10 ug) transformierende DNA wurden zu 200 ul Protoplastenlösung zugegeben. 50 ul 25% PEG 6.000 - 50 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, wurden zugegeben und die Mischung wurde für 20 min. auf Eis inkubiert. 2 ml der PEG- Lösung wurden zugegeben und die Mischung wurde 5 min. bei Raumtemperatur weiter inkubiert. 4 ml 1,2 M Sorbit - 10 mM CaCl&sub2; - 10 mM Tris, HCl, pH 7,5, wurden zugegeben und die Protoplasten wurden in 3% Agar-Deckschicht plattiert. Das selektive Medium war Trichoderma-Minimalmedium mit 10 mM Acetamid als der einzigen Stickstoffquelle anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, und ergänzt mit 1 M Sorbit als osmotischem Stabilisator und 12,5 mM CsCl, um das Hintergrundwachstum zu unterdrücken.
- Transformationshäufigkeiten von 40 bis 600 Transformanten pro ug DNA wurden für den Stamm QM 9414 (ATCC 26921) erhalten. Die höchsten Häufigkeiten wurden erhalten, wenn die DNA mit zwei Zyklen CsCl/Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt wurde.
- Sporulation wurde auf dem selektiven Medium selten beobachtet, aber die Tranformanten sporulierten normal, wenn sie auf Kartoffeldextrose-Agar überführt wurden. Ihre Fähigkeit, auf Acetamid zu wachsen, schwankte. Der Durchmesser der Kolonien auf dem selektiven Medium lag im Bereich 1 mm bis 10 - 20 mm.
- Die Mitosestabilität der Transformanten wurde untersucht. Zehn große Transformanten variierender Größe wurden subkultiviert auf Acetamid-CsCl-Platten, sporuliert auf Kartoffeldextrose (PD) und replattiert auf PD. Um durch Heterokaryose hervorgerufene Heterogenität auszuschließen, wurden einzelne Kolonien, die aus einer Spore stammten, auf AmdS&spplus;-Phänotyp getestet. Ein positiver Klon von jedem ursprünglichen Transformanten wurde sukzessiven Plattierungen (5 Wachstumszyklen) auf nicht-selektivem Medium unterzogen und der Phänotyp wurde nach jeder Generation auf dem selektiven Medium getestet. Von 10 getesteten großen Transformanten gaben nach einem Zyklus auf nicht-selektivem Medium sechs der zehn Transformanten 100% AmdS&spplus;-Konidien, drei 47-87% und ein Transformant gab keine AmdS&spplus;-Konidien. Dieses Ergebnis blieb dasselbe über fünf nicht-selektive Wachstumszyklen, was nahelegt, daß der anfänglich instabile AmdS&spplus;-Phänotyp später stabilisiert werden kann.
- Von zehn ursprünglichen kleinen Kolonien gaben drei Sporen mit variablen Häufigkeiten von AmdS&spplus;-Phänotyp (94%, 44% und 5% der Sporen). Die anderen sieben Klone gaben nur Sporen, die nicht in der Lage waren, auf Acetamid zu wachsen. Interessanterweise zeigten alle erhaltenen AmdS&spplus;-Sporen heftiges Wachstum auf Acetamid-Platten, was für Transformanten aus großen Kolonien charakteristisch ist.
- Das Vorhandensein der Plasmid-DNA in den Transformanten wurde durch Southern-Blots auf der gesamten DNA analysiert, isoliert aus Transformanten (gemäß Raeder und Broda, Lit. 43), geschnitten mit Xho I oder Sal I und Eco RI geschnitten. Der Vektor pUC 18 und das Sal I - Eco RI- Fragment, welches das amdS-Gen von Plasmid p3SR2 enthielt, wurden als Sonden verwendet. Es wurde gezeigt, daß die Transformation durch Rekombination an einer Anzahl unterschiedlicher Stellen in der Trichoderma-Genom-DNA aufgetreten war, eine bis mehrere Kopien pro Genom.
- Komplementierung von auxotrophen Mutationen in T. reesei durch heterologe DNA wurde nachgewiesen. Das Plasmid pSa143 welches das argB-Gen aus A. nidulans enthielt, wurde verwendet, um T. reesei argB&supmin;-Mutantenstämme zu transformieren. Die Transformanten wurde auf Minimalmedium ohne Arginin bzw. 30 ug/ml Uracil selektiert. Die Transformationshäufigkeit betrug etwa 300 (150-400) Transformanten/uG DNA.
- Chromosomale DNA wurde aus den Transformanten isoliert und für Southern-Hybridisierungsexperimente verwendet, um die richtige Integration von Plasmid-DNA in die chromosomale DNA von T. reesei zu verifizieren. Mehrfach-Tandemkopien von pSa143 wurden in dem Genom integriert. Southern- und Dot- Blot-Hybridisierungen zeigten, daß in analysierten Transformanten die Kopienzahl von argB von ungefähr 2 bis über 100 schwankte. Es wurde gezeigt, daß die argB&spplus;- Transformanten phänotypisch 100% stabil über wenigstens 3 Generationen waren. Dies wurde durch sukzessive Plattierung von Konidien aus fünf Transformanten auf Komplettmedium und anschließendes Testen des Arg&spplus;-Phänotyps auf Minimalmedium getestet (50-80 Kolonien/Transformant).
- Die Möglichkeit, Trichoderma mit einem nicht-selektierbaren Plasmid zu co-transformieren, wurde zunächst mit dem Arginin-auxotrophen Mutanten gezeigt.
- Der argB&supmin; T. reesei-Stamm wurde mit gleichen molaren Mengen der A. nidulans-Plasmide pSa143 (argB) und p3SR2 (amdS) transformiert, Transformanten wurde auf Arg&spplus;-Phänotyp selektiert und auf Erwerb von amdS durch Aufstreichen auf Acetamid-CsCl-Platten getestet. Von den ArgB-Transformanten waren 86% auch AmdS&spplus;. Southern-Analyse von Co-Transformanten zeigte, daß beide Plasmide als variable Mengen an Kopien in mehreren unterschiedlichen Stellen im Genom integriert waren (Daten nicht dargestellt).
- Doppelselektion auf Minimal-Acetamid-CsCl-Medium führte zu 100 großen Amd&spplus;Arg&spplus;Transformanten pro ug DNA und einer Anzahl kleiner Kolonien, charakteristisch für amdS- Transformation.
- Als die Stabilität des ArgB&spplus;-Phänotyps der argB amdS-Co- Transformanten getestet wurde, erwiesen sich drei von fünf 100% stabil, wohingegen die anderen den ArgB&spplus;-Charakter in 7% oder 80% der analysierten Nachkommen verloren hatten. Dieselben einzelnen Kolonien hatten auch den AmdS&spplus;-Phänotyp verloren. Ob diese Instabilität durch z.B. die Co- Integration von argB mit dem amdS in dieselbe chromosomale Stelle hervorgerufen wurde, ist nicht bekannt.
- Das Plasmid pAN5-4IB, das das E. coli lacZ-Gen enthält, gekoppelt in Phase an den Promotor und die N-terminale Proteinkodierungs- region des A. nidulans Glyceraldehydphosphat-Dihydrogenase-Gens (gpd) (Lit. 55) wurde ebenfalls für Co-Transformation verwendet. Zusätzlich enthält dieses Plasmid das A. nidulans argB-Gen und pBR322- Sequenzen. Prototropher T. reesei (QM 9114) wurde mit dem Plasmid p3SR2 (amdS) und pAN5-4IB co-transformiert, Transformanten wurde auf Amd&spplus;-Phänotyp selektiert und auf β- gal-Expression auf Acetamid-CsCl-Platten, die Xgal enthielten, gescreent. Keine endogene T. reesei β- Galactosidase-Aktivität konnte nachgewiesen werden, wenn Glucose im Medium vorhanden war und der pH der Xgal-Platte neutral war.
- Nach 1-4 Tagen Wachstum war blaue Farbe sichtbar. Wenn ein 1,0/0,7-Molverhältnis der Plasmide (p3SR2/pAN5-4IB) bei der Transformation verwendet wurde, zeigten 13% der großen und 6% der kleinen Amd&spplus;-Klone β-Galactosidase-Aktivität, mit Molverhältnis von 1,0/2,6 wurden 39% bzw. 7% Xgal&spplus;-Klone erhalten. Das Vorhandensein beider Plasmide in Amd&spplus;- Transformanten, die blaue Farbe zeigten, wurde durch Southern Hybridisierung verifiziert (Daten nicht dargestellt).
- Konstruktion eines cbh1&supmin;-Trichoderma reesei-Stammes. Die Inaktivierung verschiedener Cellulase-Gene in der beschriebenen Art und Weise erlaubt die Konstruktion einer Reihe von T. reesei-Stämmen, die eine bestimmte Kombination von Cellulasen produzieren. cbh&supmin;1-Stämme sind auch wichtig für die effiziente Produktion von heterologen Proteinen, wenn der cbh1-Promotor verwendet wird. Es wurde gezeigt, daß Trichoderma reesei-Stamm QM 9414 (ATCC 26921) nur eine chromosomale Kopie des cbh1-Gens enthielt, durch Southern- Hybridisierung unter Verwendung cbh1-spezifischer Sonden, und so sollte ein Rekombinationsereignis das Gen inaktivieren. Ein inaktives Gen wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pTT01 (Lit. 28), das den cDNA-Klon des cbh1-Gens im Vektor pUC8 in voller Länge enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl I und Bgl II geschnitten. Das 0,8 kb Fragment aus der 5'-terminalen Region des cbh1-Gens wurde mit herkömmlichen Techniken aus Agarosegel isoliert. Das Fragment wurde stumpfendig gemacht unter Verwendung von S1- Nuclease und es wurde an einen mit Eco RI geschnittenen, stumpfendig gemachten pUC 18-Vektor ligiert und in E. coli JM 109 transformiert. DNA aus dem Klon, die das cbh1- Genfragment enthält, wurde isoliert und mit Restriktionsenzym Eco RI verdaut, das in der Mitte des Bgl I - Bgl II-Fragments von cbh1 schneidet. Die durch Eco RI erzeugten Termini wurden eingefüllt und zurückligiert. Ein Plasmid pMS4, das eine Leserastermutation in der Mitte des gestutzten cbh1-Genfragments enthielt, wurde erzeugt (Fig. 2).
- Trichoderma wurde mit dem Plasmid pMS4 und dem A. nidulans amdS enthaltenden Plasmid p3SR2 mit 3-4 fachem molaren Überschuß von Plasmid pMS4 co-transformiert.
- Transformanten wurden auf der Basis des amdS&spplus;-Phänotyps, wie beschrieben (Beispiel 3) selektiert und auf selektivem Medium gereinigt das Acetamid als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Gereinigte Transformanten wurden auf Mikrotiterplatten in 200 ul Trichoderma-Minimalmedium mit 1% Solka-Flockencellulose als Kohlenstoffquelle und 0,2% Proteosepepton als Stickstoffquelle gezüchtet. Der Cellulase-Phänotyp wurde mit der Ouchterlony-Immundiffusion unter Verwendung nicht-verdünnter Wachstumsmedien gegen das CBHI-spezifische Antiserum (Schaf) getestet, wie beschrieben (Lit. 56). Eine Anzahl Transformanten wurde identifiziert, die normale Menge CBH II, aber kein nachweisbares CBH I produzierten.
- Als ein Beispiel eines heterologen Proteins in T. reesei wählten wir die Expression der Prochymosin-cDNA (Fig. 3). Das Präprochymosin-Gen wurde aus einer Kalbsmagen-cDNA- Bibliothek isoliert und die Pst I-Stelle von pBR322 durch G-C-Tailing inseriert (Lit. 46 und 47), um pR26 zu erhalten. pUC 9 wurde mit SalI geschnitten und ausgefüllt mit Klenow- Polymerase und ligiert mit T4-Ligase. Das erhaltene Plasmid wurde mit BamHI-EcoRI geschnitten und das 2,7 kb große Fragment wurde mit einem 0,47 kb BamHI-EcoRI-Fragment aus pR26 ligiert, um pUC9' zu schaffen, das eine HindIII-Stelle N-terminal vom Prochymosin-Gen enthält. pUC13 wurde mit BamHI-NarI und NarI-XmaI geschnitten und das große bzw. kleine Fragment wurde ligiert mit einem 0,64 kb XmaI-BclI- Fragment aus pR26, um Plamid pUC13' zu erhalten, das eine XbaI-Stelle C-terminal vom Prochymosin-Gen enthält. Ein 0,65 kb XmaI-XbaI-Fragment von pUC13' wurde mit einem 0,46 kb HindIII-XmaI-Fragment von pUC9' und einem 11 kb XbaI- HindIII-Fragment von p285 ligiert, um Plasmid p285' pro C zu schaffen, das das Prochymosin-Gen enthält, wie in Fig. 3 veranschaulicht.
- pCAMG91 wurde mit SalI- und PstI-Restriktionsendonukleasen verdaut. Aus solchen Verdauungsprodukten wurde ein 698 bp- Fragment auf einem Agarosegel isoliert. Dieses SalI-PstI- Fragment enthält die Region, die den 140 bp 3' nicht- translierten Teil der Glucoamylase-mRNA plus 540 bp 3' zur Poly(A)-Additionsstelle kodiert. Dieses 3'-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die Restriktionsstellen vor der Addition von XbaI-Linkern und der Verdauung mit XbaI-Restriktionsenzym "stumpfendig" zu machen. Dieses 3'- Ende des Glucoamylase-Gens wurde an pUC13 ligiert, linearisiert mit XbaI, um Plasmid mAMG/Term zu schaffen, daß die Glucoamylase-Gen-Poly(A)-Additionsregion enthält.
- Ein 0,5 kb SmaII-BssHII-Fragment von pCAMG91, das den Promotor und die Sequenzen, die für das Glucoamylase (AMG)Signal- und -Leader-Peptid kodieren, wurde an mit SmaI-BamHI verdauten pUC13 und einen synthetischen BssHII-BamHI- Adaptor, der die ersten 6 Aminosäuren von Prochymosin kodiert, ligiert. Aus dem resultierenden Plasmid, pMT626, wurde ein 0,8 kb NdeI-BamHI-Fragment isoliert und an ein 0,5 kb BamHI-EcoRI-Fragment aus p285'proC, das die Sequenz für die N-terminale Hälfte von proC enthält, und an ein 3,0 kb EcoRI-NdeI-Fragment von pMT622, das den C-terminalen Teil der Sequenz für proC enthält, ligiert. (pMT622 ist einfach ein EcoRI-XbaI-Subklon von p285' proC in pUC13). Das resultierende Plasmid pMT648 (siehe Fig. 4) enthält das gesamte Prochymosin-Gen, dem AMG-Promotor- und -Signal/Leader-kodierende Sequenzen vorangehen. pMT648 wurde so weiter modifiziert, daß er das argB-Gen von A. nidulans enthielt (Lit. 48). 1,8 kb NarI-eingefülltes XbaI-Fragment von pMT648 wurde an ein 6,8 kb ClaI-eingefülltes EcoRI- Fragment von pSal43 ligiert, um pMT651 zu ergeben. Sequenzen weiter stromaufwärts vom AMG-Promotor (stromaufwärtige aktivierende Sequenzen; UASs) wurden außerdem inseriert. Dies wurde erreicht durch Ligieren eines 3,7 kb ClaI-BssHII- Fragments aus dem ursprünglichen Klon pCAMG91 an das 1,1 kb BssHII-eingefüllte XbaI-Fragment von pMT648, das die proC- Sequenzen enthält und das argB-Gen als ein 3,1 kb ClaI- eingefülltes EcoRI-Fragment aus pMT813 (pMT813 ist das argB- Gen, kloniert als ein 3,1 kb BamHI-NruI-Fragment, kloniert in mit EcoRV-BglII geschnittenen p1C19R). Das resultierende Plasmid, pMT830, hat eine Expressionseinheit erhalten, die die UASs, Promotor-, Signal- und Leader-Sequenzen aus AMG und das gesamte Gen für proC enthält. Schließlich wird die Terminator-Sequenz von AMG als ein 0,6 kb xbaI-XbaI-Fragment aus Plasmid pAMG/Term genommen und in den XbaI-Schnitt und dephosphorylierten pMT830 inseriert, um pMT837 zu ergeben. Die Konstruktion von pMT837 ist in Fig. 5 veranschaulicht.
- T. reesei-Stämiue QM 9414 und RUT-C-30 wurden mit Plasmiden pMT837 und p3SR2 co-transformiert. Plasmid pMT837 enthält das Prochymosin-Gen, dem die AMG-Promotor- und -Signal/Leader-Sequenz vorangeht. Die Konstruktion von Plasmid pMT837 wurde in Beispiel 7 beschrieben (siehe auch Figs. 3-5). Co-Transformation und Selektion wurden durchgeführt wie in Beispiel 5.
- Für die Chymosinproduktion wurden Transformanten auf Minimalmedium, das 1% Solka Flockencellulose und 0,2% Proteosepepton enthielt, kultiviert.
- Die Mycele wurden gesammelt und der Überstand wurde. Falls erforderlich, durch TCA-Ausfällung konzentriert und in 2 M NaOH 10 mM Tris (pH 8,5) verdünnt. Die Proben wurden auf SDS-PAGE (7,5% - 15% Polyacrylamid-Gradient) fraktioniert und auf einem Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Die Filter wurden mit Kaninchen-Prochymosin-Antiserum inkubiert und mit 4-Chlor-1-naphtol unter Verwendung von a-Kaninchen- IgG-Peroxidase-Konjugat, bezogen von Sigma, angefärbt.
- Es wurde gezeigt, daß Chymosin in das Medium ungefähr bei dem Niveau von 1 ug/l sekretiert wurde. Da der AMG-Promotor in T. reesei klar ineffizient funktioniert, wurden homologe T. reesei-Promotor-Terminator-Vektoren konstruiert, um das Produktionsniveau von Chymosin zu verbessern.
- Die Konstruktion von heterologen Expressionsvektoren zur Herstellung von Kalbs-Prochymosin in T. reesei unter Verwendung von cbh1-Promotor.
- Das Kalbs-Prochymosin-Gen wurde erhalten aus pR27 (Fig. 6). Das PstI-PstI-Fragment ( 1.110 bp), das fast das gesamte Gen enthielt, wurde mit herkömmlichen Techniken aus Agarosegel isoliert und an die PstI-Stelle von pUC19 ligiert
- Dieses Plasmid wurde teilweise mit PstI verdaut, die Enden wurden mit S1-Nuclease stumpfendig gemacht und ein AvaII- Terminatorfragment ( 750 bp) des cbh1-Fragments (stumpfe Enden mit Klenow-Fragment) wurde in dieses Plasmid ligiert. Die Terminatorregion des cbh1-Gens wurde aus dem terminalen 1,8 kb BamHI-Fragment von cbh1-cDNA, subkloniert in pBR322, erhalten (Lit. 24).
- Dieses Plasmid, das das 'pro C-Fragment enthielt, gekoppelt mit der Terminatorregion des cbh1-Gens in pUC19, wurde pAMH 100 genannt (Fig. 7).
- Das SacII-PstI-Fragment (80 bp), das für die N-terminale Region von Prochymosin kodiert, wurde aus Plasmid pR27 isoliert (siehe Fig. 6). Die cbh1-Promotorregion wurde zuerst aus dem Genomklon λ 44A als ein 2,8 kb langes EcoRI- EcoRI-Fragment in pUC18 subkloniert (Plasmid pUA01, Fig. 8) und dann wurde ein 2,2 kb langes EcoRI-BglI-Fragment aus diesem Subklon isoliert. Die BglI-Stelle ist in der Mitte der Signalsequenz des cbh1-Gens angeordnet. Die genaue Verknüpfung des 2,2 kb langen EcoRI-BglI-Fragments, das den Promotor und etwa die Hälfte der Signalpeptid- Kodierungsregion des cbh1-Gens enthält, an das 80 bp SacII-PstI-Prochymosinfragment wird mediatisiert durch den BglI-SacII-Adaptor (NOR 202 + NOR 203, Fig. 10). Diese Fragmente zusammen mit dem Adaptor wurden in pUC19 ligiert, das mit EcoRI-PstI verdaut worden war. Dieses Plasmid kodiert für eine vollständige Signalsequenz von CBH I, fusioniert an die erste Aminosäure von Prochymosin, gefolgt von einigen seiner N-terminalen Sequenzen. Schließlich wurde aus dieser Konstruktion das EcoRI-pcbh1-ss-proC-PstI- Fragment isoliert, von seinem 3'-Ende in pAMH100, verdaut mit Sal I und Pst I, ligiert. Das 5'-Ende des Fragments und das 3'-Ende von Plasmid pAMH100 wurde eingefüllt mit Klenow und ligiert. Sowohl der Promotor des cbh1-Gens und das proC'-Fragment wurde vor 'proC, gefolgt vom cbh1- Terminatorbereich transferiert. Die Konstruktion wurde pAMH102 genannt (Fig. 11).
- Als ein selektierbarer Marker in den Expressionsplasmiden kann entweder das amdS-Gen von A. nidulans (Lit. 33, 41) oder das argB-Gen von A. nidulans verwendet werden (Lit. 45).
- Das amdS-Gen wurde als ein PvuI-SalI-Fragment aus p3SR2 isoliert und an das 6 kb lange PvuI-SalI-Fragment von pAMH102 ligiert. Dieser selektierbare Vektor wurde pAMH104 genannt (Fig. 11).
- Das aminoterminale PstI-Fragment ( 150 bp) von Präprochymosin wurde aus pR26 (Fig. 3) isoliert, das einen vollständigen Präprochymosin-cDNA-Klon einschließt, beginnend 12 bp stromaufwärts von ATG, inseriert in die PstI-Stelle in pBR322. Dieses Fragment wurde in den Polylinker von pTZ19R zusammen mit dem cbh1-Eco RI- SacI( 2,6 kb)-Promotorfragment subkloniert, das auch die Signalsequenz-Kodierungsregion von cbh1 einschließt (Fig. 8). Das cbh1-Eco RI-Sac I-Fragment wird erhalten aus einem 2,8 kb Eco RI-Eco RI-Subklon in pUC18 (pUA01, Fig. 8) des ursprünglichen λ44A-Klons (Lit. 24). pTZ19R (Pharmacia) ist ein Plasmid auf der Basis von pUC19, welches den F1- Replikationsursprung und den T7-Promotor einschließt, was die Verwendung von ss-Matrize (einzelsträngig) für Oligonukleotid-Mutagenese erlaubt. Die Konstruktion des resultierenden Plasmids (pAMH105) ist in Figur 8 veranschaulicht. Aus diesem Plasmid wurden die Sequenzen zwischen dem cbh1-Promotorbereich und proC-ATG durch Loop- Mutagenese unter Verwendung eines spezifischen Oligonukleotids, OAMH3, deletiert (Fig. 10). Die Durchführung von Oligonukleotid - gerichteter Mutagenese ist in Figur 9 veranschaulicht. Das fragliche Oligonukleotid wurde phosphoryliert, an ss-pAMH105-DNA (Lit. 57, ss-DNA wurde isoliert aus JM103/pAMH105, wie beschrieben von Pharmacia) im Molverhältnis 20:1, entsprechend, aneliert. Der Oligonukleotid-Primer wurde unter Verwendung von Klenow- Polymerase und T4-Ligase verlängert, wie in Lit. 57 beschrieben. Die verlängerte Mischung wurde mit SmaI (findet sich im Polylinker von pTZ19R, siehe Fig. 9) vor Transformation in den E. coli-Stamm mit mutL-Mismatch- Repair-Defekt, BMH71.18 (Lit. 58), verdaut. Der Transformanten-Pool wurde über Nacht in 5 ml Flüssigkultur (Luria-Brühe, wie beschrieben in Lit. 59, mit 100 ug/ml Ampicillin) gezüchtet. Plasmid-DNA wurde aus dem Transformantenpool isoliert und sie wurde erneut verdaut mit SmaI und erneut transformiert in E. coli-JM109-Stamm. Das Screening von potentiellen Deletions-Klonen wurde durchgeführt durch Verdauung unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme und die Deletionsspezifität wurde weiter durch Sequenzierung bestätigt. Das resultierende Plasmid wurde pAMH1101 genannt (Fig. 14). Dieses Plasmid wurde weiter mit EcoRI und PstI verdaut und das resultierende cbh1-preproC-Fragment wurde isoliert (Fig. 14) und an seinem PstI-Ende an das pAMH100-Plasmid, das mit PstI und SalI verdaut war, ligiert. Die Enden des resultierenden ligierten Fragments wurden mit Klenow stumpfendig gemacht und ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pAMH101 genannt und es enthielt den cbh1-Promotorbereich, fusioniert an die Signalsequenz von Prochymosin, und die gesamte Prochymosin- Kodierungsregion, fusioniert an den Terminatorbereich des cbh1-Gens (Fig. 14).
- Die Konstruktion von Plasmid pAMH1103 (Fig. 12) wurde im wesentlichen wie pAMH1101 durchgeführt, im Detail beschrieben im vorstehenden Kapitel IV, mit der Ausnahme, daß das spezifische, für diese Konstruktion verwendete Oligonukleotid OAMH1 war (Fig. 10 und 9). Das resultierende Plasmid pAMH1103 enthält eine Signalsequenz-Fusion, die Aminosäuren (aa) 1-12 aus der cbh1-Signalsequenz einschließt, fusioniert an aa 12-16 aus der preproC- Signalsequenz, die dem aminoterminalen Teil ( 140 bp) der Kodierungsregion des proC-Gens vorangeht (Fig. 12). Aus Plasmid pAMH1103 wurde das pcbh1-sso-proC' (o = Fusion)- Fragment pAMH100 im wesentlichen so in pAMH100 subkloniert, wie im vorstehenden Kapitel IV beschrieben (siehe Fig. 12). Das resultierende Plasmid pAMH103 schließt den Promotorbereich von cbh1 und die Signalsequenz-Fusion von cbh1 und preproC ein, die der proC-Kodierungsregion vorangehen, fusioniert an den cbh1-Terminatorbereich.
- Die Konstruktion von Plasmid pAMH1106 (Fig. 13) wurde im wesentlichen wie pAMH1101 durchgeführt, im Detail beschrieben im vorstehenden Kapitel IV, mit der Ausnahme, daß das spezifische, für diese Konstruktion verwendete Nukleotid OAMH2 war (Fig. 10 und 9). Aus dem resultierenden Plasmid pAMH1106, welches den Promotorbereich von cbh1, die Signalsequenz von cbh1 und die Kodierungsregion der 1-20 ersten aa von reifem CBHI einschließt, fusioniert an Kodierungsregion von proC, wurde das Fragment, das pcbh1- reifes o-proC' enthielt, im wesentlichen so in pAMH100 subkloniert, wie im vorstehenden Kapitel IV beschrieben (Fig. 12). Das resultierende Plasmid pAMH106 schließt den Promotorbereich von cbh1, die Signalsequenz von cbh1, die Kodierungsregion der aa 1-20 von reifem CBHI, fusioniert an die Kodierungsregion von proC, ein.
- T. reesei-Stämme QM9414 und RUT-C-30 wurden mit Plasmiden pAMH102 und p3SR2 im Molverhältnis 5:1, entsprechend, co- transformiert. Die Konstruktion von Plasmid pAMH102 wurde in Beispiel 9, Kapitel II beschrieben. Co-Transformation und Selektion wurde durchgeführt wie in Beispiel 5. Die Transformanten wurden gereinigt auf selektiven Acetamid- Platten, beschrieben in Beispiel 3.
- Für die Chymosin-Produktion wurden Transformanten auf Minimalmedium (10 bis 50 ml), das 1% Solka-Flockenzellulose und 0,2% Proteosepepton enthielt, kultiviert. Die Mycele wurden gesammelt und der Überstand wurde durch TCA- Ausfällung konzentiert und in 2M NaOH 10 mM Tris (pH 8,5) verdünnt. Die Mycele wurden in Gegenwart von flüssigem Stickstoff aufgebrochen, die aufgebrochenen Zellen wurden pelletiert und der Überstand in derselben Art und Weise wie die Kulturmedien behandelt. Die Proben wurden aus SDS-PAGE (7,5%-15% Polyacrylamid-Gradient) fraktioniert und auf einen Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Die Filter wurden mit Kaninchen-Prochymosin-Antiserum und α-Kaninchen-IgG-AP (alkalische Phosphatase)-Konjugat inkubiert und mit Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, bezogen von Promega Biotec, angefärbt. Die Chymosinmenge im Inneren und außerhalb des Mycels wurde verglichen (Fig. 17). Es wurde durch Southern-Hybridisierung gezeigt, daß die Klone, die hohe Kopienzahlen von Plasmid pAMH102, integriert in die chromosomale Pilz-DNA, enthielten, auch mehr Chymosin produzierten. Wenn ein Ein-Kopien-Transformant verwendet wurde, betrug die Menge an sekretiertem Chymosin 100 ug/l Kulturmedium, wenn angenähert aus Western-Gelen (Fig. 17). Es wurde gezeigt, daß das sekretierte Prochymosin durch Western-Gele und durch die Milchgerinnungsaktivität (Chymosin läßt Milch durch Spaltung von β-Kasein gerinnen, Bestimmung (Lit. 60)) zu einem aktiven Chymosin verarbeitet wird. Die Menge an verschiedenen Formen an Chymosin (preproC, proC, C und von Chymosin abgeleitete Abbauprodukte im Innern der Zelle) im Innern des Mycels wurde zu 0,04% vom Mycel-Gesamtprotein bestimmt (Fig. 17) und die Menge an sekretiertem Chymosin betrug 60% des produzierten Gesamtchymosins. Dies zeigt die Effizienz von T. reesei, sogar heterologe Genprodukte aus den Mycelen heraus zu sekretieren.
- Transformanten mit mehreren Kopien von Plasmid pAMH104 (Fig. 11), die in der Lage sind, größere Mengen an Prochymosin zu sekretieren, wurden durch Bestimmung der Milchgerinnungsaktivität der Wachstumsmedien herausgescreent. Es wurde festgestellt, daß der beste Transformant aus den 40 untersuchten 500 ug/l Kulturmedium sekretierte, wie bestimmt auf Western-Gelen und durch Milchgerinnungsaktivität.
- Da die Menge an sekretiertem aktiven Chymosin 200fach erhöht war, wenn Kulturen in einem 5 l-Laborfermenter gezüchtet wurden, verglichen mit den Kulturen im Kleinmaßstab (10-50 ml), beträgt die Menge an von diesem Stammtyp produziertem Chymosin etwa 100 mg/l.
- Um in der Lage zu sein, Vektoren zur Herstellung von verschiedenen Proteinen in T. reesei zu konstruieren, wurde ein allgemeiner Expressionsvektor konstruiert, der die Promotor- und Terminatorbereiche des cbh1-Gens einschloß. Der cbh1-Terminator wurde zusammen mit einem Adaptor, der das STOP-Codon TAA in drei Leserahmen einschloß, in die PstI-Stelle von pUC19 subkloniert, was zu Plasmid pAMH110' führte (Fig. 15). Das PstI-Terminatorfragment wurde aus pAMH110' isoliert, der cbh1-Promotorbereich wurde aus pAMH102 als ein EcoRI-PstI-Fragment, das den Aminoterminus des proC-Gens einschloß, isoliert und diese Fragmente wurden in einen mit Eco RI-PstI verdauten pUC19-Stamm subkloniert, aus dem die einzelne NdeI-Stelle vor diesem Subklonierungsschritt mit Klenow stumpfendig gemacht worden war. Das resultierende Plasmid pAMH100 schließt den Promotor und Terminator des cbh1-Gen und zwischen diesen Sequenzen ein Füllfragment ein, das durch Verdauung mit SacII und NdeI entfernt werden kann. Nachdem die Enden stumpf gemacht worden sind, können irgendwelche cDNAs oder chromosomale Kopien von Genen zwischen dem Promotor und Terminator inseriert werden (Fig. 15).
- Um die Menge an produzierter Endoglucanase zu erhöhen, wurde das egl1-Gen mit dem stärkeren cbh1-Promotor verknüpft. Die cDNA für T. reesei-Endoglucanase I wurde als eine Eco-RI- BamHI-Fragment in den allgemeinen Expressionsvektor pAMH110 (beschrieben in Beispiel 11) subkloniert, der zunächst mit SacII - NdeI verdaut wurde, um das Füllfragment zu deletieren (Fig. 16). Das resultierende Plasmid pAMH111, das das egl1-Gen zwischen dem Promotor und Terminator des cbh1- Gens einschloß, wurde mit p3SR2 in T. reesei QM 9414 (ATCC 26921) im molaren Verhältnis 5:1, entsprechend, co- transformiert. Die Transformanten wurden auf AmdS&spplus;-Phänotyp selektiert und auf selektivem Medium weiter gereinigt. Sechs einzelne Transformanten wurden für 4 Tage in Cellulase induzierendem Medium (Solka-Flocke als eine Kohlenstoffquelle, 1%) in 50 ml-Flüssigkulturen gezüchtet. Die Kulturüberstände wurden dann auf Endoglucanase-Aktivität durch Messung der Freisetzung von reduzierenden Zuckern aus Hydroxyethylcellulose (0,1%, Lit. 12) getestet. Die EG I- Aktivitäten von Transformanten wurden mit einer Kontrolle (QM 9414) verglichen und es zeigte sich, daß der beste Transformant das 4fache der Endoglucanase-Aktivität des Kontrollstamms sekretierte. Dieses Beispiel zeigt, daß es möglich ist, die Menge an verschiedenen cellulolytischen Enzymen in T. reesei durch Veränderung des entsprechenden Promotors zu modifizieren.
- 1. Simmons, E.G., Classification of some cellulase producing Trichoderma species. In: Abstracts of Second International Mycological Congress. Tampa, Florida, USA. H.E. Aigelow & E.G. Simmons (Eds.) 1977, p. 618.
- 2. Berghem, L.E.R. & Pettersson, L.G., The mechanism of enzymatic cellulose degradation. Purification of cellulolytic enzyme from Trichoderma viride active on highly ordered cellulose. Eur.J.Biochem. 97 (1973), 21-30.
- 3. Gong, C.S., Ladisch, M.R. & Tsao, G.T., Biosynthesis, purification and mode of action of cellulases of Trichoderma reesei. Adv.Chem.Ser. 181 (1979), 261-287.
- 4. Fägerstam, L.G. & Pettersson, L.G., The 1,4-β-glucan cellobiohydrolases of Trichoderma reesei QM 9414. A new type of synergism FEBS Letters 119 (1980), 97-100.
- 5. Enari, T.M., Microbial Cellulases. In: Microbial Enzymes and Biotechnology. W.M. Fogarty (Ed.). Applied Science Publishers, London and New York, 1983, pp. 183-223.
- 6. Gilbert, I.G. & Tsao, G.T., Physical properties of T. viride cellulase. Ann. Reports on Fermentation Process 6 (1983), 323-358.
- 7. Shoemaker, S.P. & Brown, Jr., R.D., Enzymic activities of endo-1,4-β-glucanases purified from Trichoderma viride. Biochim.Biophys. Acta 523 (1978), 133-146.
- 8. Shoemaker, S.P. & Brown, Jr., R.D., Characterization of endo-1,4-β-glucanases purified from Trichoderma viride. Biochim.Biophys. Acta 523 (1978), 147-161.
- 9. Bissett, F.H., Analysis of cellulase proteins by high performance liquid chromatography. J. Chromatog. 178 (1979), 517-523.
- 10. Farkas, V.A., Jalanko, A. & Kolarova, N., Characterization of cellulase complexes from Trichoderma reesei QM 9414 and its mutants by means of analytical isoelectrofocusing in polyacrylamide gels. Biochem.Biophys.Acta 706 (1982), 105-110.
- 11. Enari, T.M., Niku-Paavola, M.-L. & Nummi, M., Comparison of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei and Aspergillus niger. In: Proceedings of 2nd International Symposium on Bioconversion and Biochemical Engineering, T.K. Ghose (Ed.). Indian Institute of Technology, New Delhi 1 (1980), 87-95.
- 12. Bailey, M.J. & Nevalainen, K.M.H., Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enzyme Microb.Technol. 3 (1981), 153-157.
- 13. Andreotti, R., Medeiros, J., Roche, C. & Mandels, M., Effects of strain and substrate on production of cellulases by Trichoderma reesei mutants. In: Proceedings of 2nd International Symposium on Bioconversion and Biochemical Engineering. T.K. Ghose (Ed.) Indian Institute of Technology, New Delhi 1 (1980), 353-388.
- 14. Farkas, V., Labudova, I., Bauer, S. & Ferenczy, L., Preparation of mutants of Trichoderma viride with increased production of cellulase. Folia Microbiol. 26 (1981), 129- 132.
- 15. Montenecourt, B.S. & Eveleigh, D.B., Selective screening for the isolation of high yielding cellulase mutants of T. reesei. Adv.Chem.Ser. 181 (1979), 289-301.
- 16. Mandels, M., Weber, J. & Parizek, R., Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride, Appl.Microbiol. 21 (1971), 152-154.
- 17. Gallo, B.J., Andreotti, R., Roche, C., Ruy, D. & Mandels, M., cellulase production by a new mutant strain of Trichoderma reesei MCG 77. Biotechnol.Bioengineer. Symp. 8 (1979) 89-102.
- 18. Warzywoda, M., Vandecasteele, J.P. & Pourquie, J., A comparison of genetically improved strains of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei. Biotechnol.Lett. 5 (1983), 243-246.
- 19. Montenecourt, B.S. & Eveleigh, D.E., Preparation of mutants of Trichoderma reesei with enhanced cellulase production. Appl.Environ.Microbiol. 34 (1977), 777-782.
- 20. Sheir-Neiss, G. & Montenecourt, B.S., Characterization of the secreted cellulases of Trichoderma reesei wild type and mutants during controlled fermentations. App.Microbiol.Biotechnol. 20 (1984), 46-53.
- 21. Shoemaker, S.P., Raymond, J.C. & Bruner, R., Cellulases: Diversity amongst improved Trichoderma strains. In: Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals A.E. Hollaender (Ed.). Plenum Press. (1981), 89-109.
- 22. Nevalainen, K.M.H., Palva, E.T. & Bailey, M.J.B., A high cellulase-producing mutant strain of Trichoderma reesei. Enzyme Microb.Technol. 3 (1980), 59-60.
- 23. Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. & Innis, M., Molecular cloning of exocellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. BIO/TECHNOLOGY 1 (1983), 691-696.
- 24. Teeri, T., Salovouori, I. & Knowles, J., The molecular cloning of the major cellulase gene from Trichoderma reesei BIO/TECHNOLOGY 1 (1983), 696-699.
- 25. Penttilä, M., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. & Knowles, J. 1986. Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete sequence of the endoglucanase I gene.Gene (1986) 45: 253-263.
- 26. EP-A-O 137 280 (Cetus Corporation).
- 27. Van Arsdel, J.N.V., Kwok, S., Schweickart, V.L., Ladner, M.B., Gelfand, T.H. & Innis, M.A., Cloning, characterization and expression in Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei. BIO/TECHNOLOGY 5: 60-64.
- 28. WO-A-85/04672 (Alko Limited).
- 29. Chen, C.M., Gritzali, M. & Stafford, T.W., Nucleotide sequence and deduced primary structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. BIO/TECHNOLOGY (1987) 5: 274- 278.
- 30. Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttilä, M., Teeri, T.T., Stahlberg, J., Johansson, G., Pettersson, G., Claeyssens, M., Tomme, P. & Knowles, J, . A new endoglucanase from Trichoderma reesei: Characterization of both gene and enzyme. Submitted for publication in BIO/TECHNOLOGY.
- 31. Case, M., Schweizer, M., Kushner, S.R. & Giles, N.H., Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76 (1979), 5259- 5263.
- 32. Ballance, J., Buxton, F.P. & Turner, G., Transformation of Aspergillus nidulans by the orotidine-5'-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassa. Biochem.Biophys. Res.Commun. 112 (1983), 284-289.
- 33. Tilburn, J., Schazzocchio, C., Taylor, G.T., Zabickyzissman, J.H. Lockington, R.A. & Davies, R.W., Transformation by integration in Aspergillus nidulans, Gene 26 (1983), 205-221.
- 34. Yelton, M., Hamer, J.E. & Timberlake, W.E., Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984), 1470-1474.
- 35. Kelly, J.M. & Hynes, M.J., Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans EMBO Journal 4 (1985), 475-479.
- 36. Nevalainen, H., Genetic improvement of enzyme production in industrially important fungal strains. Technical Research Center of Finland, Publications 26 (1985).
- 37. Beckwith, J.R., Pardee, A.B., Austrian, R. & Jacob, F. coordination of the synthesis of the enzymes in the pyridimide pathway of E. coli. J.Mol.Biol. 5 (1962), 618- 634.
- 38. Ballance, D.J. & Turner, G., Development of a highfrequency transforming vector for Aspergillus nidulans. Gene 36 (1985), 321-331.
- 39. Creighton, T.E., N-(5'-Phosphoribosyl) anthranilate isomerase-indol-3-ylglycerol phosphate synthetase of tryptophan biosynthesis. Biochem. J. 120 (1970), 699-707.
- 40. Keesey, J.K.J.R. & DeMoss, J.A., Cloning of the trp1 gene from Neurospora crassa by complementation of a trpC mutation in Escherichia coli. J.Bacteriol. 152 (1982), 954- 958.
- 41. Hynes M.J., Corrick, C.M. & King, J.A. Isolation of genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of structural and regulatory mutations. Mol.Cell.Biol. 3 (1983), 1430-1439.
- 42. Casadaban, M.J., Martinez-Arias, A., Shapira, S.K. & Chon, J., β-galactosidase gene fusions for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. Methods Enzymol. 100B (1983), 293-308.
- 43. Raeder, U. & Broda, P., Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. in Appl.Microbiol. 1 (1985) 17-20.
- 44. Sollazzo, M., Frank, R. & Cesareni, G., High-level expression of RNAs and proteins: the use of oligonukleotides for the precise fusion of coding-to-regulatory sequences. Gene 37 (1985), 199-206.
- 45. John, M.A. & Peberdy, J.F. Transformation of Aspergillus nidulans using the argB gene. Enzyme Microb.Technol. 6 (1984), 386-389.
- 46. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18 (1978), 5294-5299.
- 47. Truelsen, E., Gausing, K., Jochimsen, B., Jorgensen, P. & Marcker, K.A., Cloning of soybean leghemoglobin structural gene sequences synthesized in vitro. Nucleic Acids Res. 6 (1979), 3061-3072.
- 48. Berse, B., Dmochowska, A., Skrzypek, M. Wegleriski, P., Bates, M.A. & Weiss, R.L. Cloning and characterization of the ornithine carbamoyltransferase gene from Aspergillus nidulans. Gene 25 (1983), 109-117.
- 49. Fincham, J.R.S. et al., Fungal genetics, Botanical Monographs vol. 4, Blackwell Scientific Publications Edinburgh, p. 639, Fourth edition, 1979.
- 50. Doi, Y., Revision of the Hypocreales with cultural observations. II. Hypocrea dichromospora sp. nov. and its Trichoderma state. Bull.Nat.Sci.Mus. Tokyo 11 (1968), 185- 189.
- 51. Yanish-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J., Improved MJ13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors. Gene 33 (1985), 103-119.
- 52. Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Hoegh, I. & Fiil, N.P., Two different types of intervening sequences in the glucoamylase gene from Aspergillus niger. The EMBO Journal 3 (1984), 1581-1585.
- 53. Marsh, J.L., Erfle, M. & Wykes, E.J. The pIC plasmid and phage vectors with verstile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32 (1984), 481-485.
- 54. Vieira, J. & Messing, J., The pUC plasmids, an M13mp7 - derived System for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19 (1982), 259-268.
- 55. Van Gorcom, R.F.M., Punt, P.J., Pouwels, P.H. & Van den Hondel, C.A.M.J.J. A System for the analysis of expression signals in Aspergillus. Gene 48 (1986), 211-217.
- 56. Nummi, M., Niku-Paavola, M.-L., Lappalainen, A., Enari, T.M. & Raunio, V., Cellobiohydrolase from Trichoderma reesei. Biochem.J. 215 (1983), 677-683.
- 57. Eghtedarzadch, M.K. & Henikoff, S., Use of oligonucleotides to generate large deletions. Nucl. Acids Res. 14 (1986), 5115.
- 58. Obtained from Paul Thomas, Imperial College, Dept. of Chemistry, London.
- 59. Miller, J.H., Experiments in molecular genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
- 60. The method for determining the activity of chymosin in cleavage of milk β-kasein has been described by Siika-aho, M. (1983) Mikrobirenniinin tuottaminen, MSc Thesis. Biotechnical Laboratory, VTT, Tietotie 2, 02150 Espoo, Finland.
- 61. EP-A-0 215 594 (Genencor, Inc.).
- Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder ihrer Kombinationen, Gegenstand zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.
Claims (26)
1. Trichoderma-Stamm, der stabil transformiert ist mit einem
Vektorsystem, welches umfaßt:
a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,
b) Funktionen, die Genexpression erleichtern, einschließlich
DNA-Sequenzen, die Promotoren/Verstärker umfassen, die
operabel mit besagtem Gen verbunden sind, um Expression des
gewünschten Produktes zu kontrollieren, und
c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile
Trichoderma-Transformanten zu selektieren, wobei der
Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen
abgeleitet ist.
2. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem außerdem eine
Signal/Leader-Sequenz umfaßt, die stromaufwärts an das 5'-Ende
des Gens für das gewünschte Proteinprodukt fusioniert ist.
3. Stamm nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor des
Vektorsystems in Trichoderma funktionieren kann.
4. Stamm nach Anspruch 1, wobei der Promotor des Vektorsystems
abgeleitet ist von einen Gen für ein zu Trichoderma
heterologes Protein.
5. Stamm nach Anspruch 2, wobei die Signal/Leader-Sequenz des
Vektorsystems abgeleitet ist von einem Gen für ein von
Trichoderma sekretiertes Protein.
6. Stamm nach Anspruch 2, wobei die Signal/Leader-Sequenz des
Vektorsystems abgeleitet ist von einem sekretierten Protein,
das zu Trichoderma heterolog ist.
7. Stamm nach Anspruch 5 bis 6, wobei die Signal/Leader-
Sequenz des Vektorsystems abgeleitet ist von der
Signal/Leader-Sequenz der gewünschten Proteine.
8. Stamm nach Anspruch 5, wobei die Signalsequenz des
Vektorsystems die Trichoderma reesei cbh1-Signalsequenz ist.
9. Stamm nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz des
Vektorsystems die Aspergillus-Glucoamylase-Signalsequenz ist.
10. Stamm nach Anspruch 1, wobei das gewünschte Protein zu
Trichoderma homolog ist.
11. Stamm nach Anspruch 1, wobei das gewünschte Protein zu
Trichoderma heterolog ist.
12. Stamm nach Anspruch 11, wobei das gewünschte Produkt
Prochymosin ist.
13. Stamm nach Anspruch 10, wobei das gewünschte Protein T.
reesei-Endoglucanase (EG I) ist.
14. Stamm nach Anspruch 3, wobei der Promotor des
Vektorsystems der Trichoderma reesei chb1-Promotor ist.
15. Stamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der
Promotor des Vektorsystems der Aspergillus-Glucoamylase-
Promotor ist.
16. Stamm nach Anspruch 1, wobei der Selektionsmarker des
Vektorsystems abgeleitet ist von dem Aspergillus nidulans
amdS-Gen, dem Aspergillus nidulans- oder Trichoderma reesei
argB-Gen, dem Trichoderma reesei pyr4-Gen oder dem Aspergillus
nidulans trpC-Gen.
17. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem wenigstens
zwei Plasmide oder Vektoren umfaßt.
18. Stamm nach Anspruch 17, wobei der Selektionsmarker des
Vektorsystems auf einem Plasmid angeordnet ist und die
restlichen DNA-Sequenzen, die in das Wirtsgenom eingebaut
werden sollen, auf einem anderen Plasmid angeordnet sind.
19. Stamm nach Anspruch 1, wobei das Vektorsystem ein Plasmid
oder einen Vektor umfaßt.
20. Verfahren zur Transformation von Trichoderma, wobei ein
geeigneter Trichoderma-Stamm mit einem Vektorsystem
transformiert ist, welches umfaßt:
a) ein Gen, das ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert,
b) Funktionen, die Genexpression erleichtern, einschließlich
DNA-Sequenzen, die Promotoren/Verstärker umfassen, die
operabel mit besagtem Gen verbunden sind, um Expression des
gewünschten Produktes zu kontrollieren, und
c) einen Selektionsmarker, der in der Lage ist, stabile
Trichoderma-Transformanten zu selektieren und stabil
transformierte Trichoderma zu selektieren durch das
Vorhandensein des Selektionsmarkers, wobei der
Selektionsmarker nicht vom Neurospora crassa pyr-4-Gen
abgeleitet ist.
21. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in
Trichoderma, wobei ein Stamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis
19 in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und das
exprimierte und sekretierte Proteinprodukt aus dem
Kulturmedium gewonnen wird.
22. Verfahren zur Herstellung eines Proteinproduktes in
Trichoderma, welches umfaßt, daß in einem geeigneten
Kulturmedium ein geeigneter stabiler transformierter
Wirtsmikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19
kultiviert und das exprimierte und sekretierte Proteinprodukt
aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der
Wirtsmikroorganismus ein prototropher T. reesei-Stamm ist.
24. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei der
Wirtsmikroorganismus ein auxotropher T. reesei-Stamm ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei dem
Wirtsstamm jegliches Gen fehlt, das ein unerwünschtes Produkt
kodiert.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei dem Wirtsstamm das chb1-
Gen fehlt.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5320960A (en) * | 1992-04-03 | 1994-06-14 | Genencor International, Inc. | Method of preparing solution enriched in xylanase using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt |
US5298405A (en) * | 1986-04-30 | 1994-03-29 | Alko Limited | Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production |
US5780292A (en) * | 1987-04-29 | 1998-07-14 | Alko Group Ltd. | Production of phytate degrading enzymes in trichoderma |
US5610034A (en) * | 1987-04-29 | 1997-03-11 | Alko Group Ltd. | Immunoglobulin production by trichoderma |
US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
WO1989009259A1 (en) * | 1988-03-24 | 1989-10-05 | Novo-Nordisk A/S | A cellulase preparation |
CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
CA1341226C (en) * | 1988-08-16 | 2001-05-01 | Wim Van Hartingsveldt | Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains |
FR2649120B1 (fr) * | 1989-06-30 | 1994-01-28 | Cayla | Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede |
US5120463A (en) * | 1989-10-19 | 1992-06-09 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
US5688290A (en) * | 1989-10-19 | 1997-11-18 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
US5837515A (en) * | 1990-05-16 | 1998-11-17 | Alko-Yhtiot Oy | Enzyme preparations and methods for their production |
FI903443A (fi) * | 1990-07-06 | 1992-01-07 | Valtion Teknillinen | Framstaellning av lackas genom rekombinantorganismer. |
AU657911B2 (en) * | 1990-07-16 | 1995-03-30 | Roal Oy | Immunoglobulin production by (Trichoderma) |
US5290474A (en) * | 1990-10-05 | 1994-03-01 | Genencor International, Inc. | Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp |
US5525507A (en) * | 1990-10-05 | 1996-06-11 | Genencor International, Inc. | Methods for treating cotton-containing fabric with cellulase composition containing endoglucanase component and which is free of all CBH I component |
CA2093422C (en) * | 1990-10-05 | 2001-04-03 | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS | |
US5654193A (en) * | 1990-10-05 | 1997-08-05 | Genencor International, Inc. | Methods for treating cotton containing fabrics with cellulase |
US5328841A (en) * | 1990-10-05 | 1994-07-12 | Genencor International, Inc. | Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol |
US5650322A (en) * | 1990-10-05 | 1997-07-22 | Genencor International, Inc. | Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases |
US5246853A (en) * | 1990-10-05 | 1993-09-21 | Genencor International, Inc. | Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I |
WO1992010581A1 (en) * | 1990-12-10 | 1992-06-25 | Genencor International, Inc. | IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI |
DE69202858T2 (de) * | 1991-03-22 | 1996-02-22 | Novonordisk As | Herstellungsverfahren für chymosin. |
CA2134446A1 (en) * | 1992-05-01 | 1993-11-11 | Kathleen A. Clarkson | Methods for treating cotton-containing fabrics with cbh i enriched cellulase |
DK0655890T3 (da) * | 1992-07-31 | 2005-06-06 | Ab Enzymes Gmbh | Rekombinante celler, DNA-konstruktioner, vektorer og fremgangsmåder til ekspression af phytatnedbrydende enzymer i önskede forhold |
US5665585A (en) * | 1992-09-03 | 1997-09-09 | Alko-Yhiot Oy | Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma |
GB9400623D0 (en) * | 1994-01-14 | 1994-03-09 | Univ Leeds | Exploitation of the cellulase enzyme complex of neurospora |
US5877016A (en) | 1994-03-18 | 1999-03-02 | Genentech, Inc. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
US5708142A (en) | 1994-05-27 | 1998-01-13 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor receptor-associated factors |
US7816129B2 (en) | 1994-07-29 | 2010-10-19 | Ab Enzymes Gmbh | Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi |
US5834251A (en) * | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
US5700686A (en) * | 1995-06-06 | 1997-12-23 | Iogen Corporation | Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing |
US6451764B1 (en) | 1995-09-08 | 2002-09-17 | Genentech, Inc. | VEGF-related protein |
EP1619250B1 (de) | 1996-01-08 | 2009-11-25 | Genentech, Inc. | OB Rezeptor-Variante und Liganden |
US6159462A (en) * | 1996-08-16 | 2000-12-12 | Genentech, Inc. | Uses of Wnt polypeptides |
US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
US6100076A (en) | 1997-01-31 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | O-fucosyltransferase |
DE69737457T2 (de) | 1997-01-31 | 2007-11-29 | Genentech, Inc., South San Francisco | O-fukosyltransferase |
JP3957765B2 (ja) | 1997-04-07 | 2007-08-15 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | 抗vegf抗体 |
ATE541586T1 (de) | 1997-04-07 | 2012-02-15 | Genentech Inc | Behälter mit anti-vegf antikörpern |
US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
AU9120898A (en) | 1997-08-27 | 1999-03-16 | Chiron Corporation | Molecular mimetics of meningococcal b epitopes |
AU1288399A (en) | 1997-10-29 | 1999-05-17 | Genentech Inc. | Wnt-1 induced secreted polypeptides: wisp-1, -2 and -3 |
EP2033970A3 (de) | 1997-10-29 | 2009-06-17 | Genentech, Inc. | WNT-1-induzierbare Gene |
EP2050762A3 (de) | 1998-03-10 | 2009-07-08 | Genentech, Inc. | Neue Polypeptide und für diese kodierende Nukleinsäuren |
EP1865061A3 (de) | 1998-05-15 | 2007-12-19 | Genentech, Inc. | IL-17-homologe Polypeptide und ihre therapeutische Verwendung |
EP3112468A1 (de) | 1998-05-15 | 2017-01-04 | Genentech, Inc. | Il-17-homologe polypeptide und therapeutische verwendung davon |
PT1076703E (pt) | 1998-05-15 | 2007-10-10 | Genentech Inc | ''utilizações terapêuticas de polipéptido homólogos de il-17'' |
US20020172678A1 (en) | 2000-06-23 | 2002-11-21 | Napoleone Ferrara | EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use |
JP2002527066A (ja) | 1998-10-15 | 2002-08-27 | カイロン コーポレイション | 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子 |
EP1950300A3 (de) | 1998-11-18 | 2011-03-23 | Genentech, Inc. | Antikörpervarianten mit höherer Bindungsaffinität im Vergleich zu verwandten Antikörpern |
AU2367600A (en) | 1998-12-16 | 2000-07-03 | Chiron Corporation | Human cyclin-dependent kinase ((hpnqalre)) |
EP1820859B9 (de) | 1998-12-22 | 2009-10-28 | Genentech, Inc. | Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung des neoplastischen Zellenwachstums |
MXPA01007170A (es) | 1999-01-15 | 2002-07-30 | Genentech Inc | Variantes de polipeptidos con funcion efectora alterada. |
EP1956030B1 (de) | 1999-06-15 | 2009-11-11 | Genentech, Inc. | Sekretierte und Transmembran-Polypeptide sowie Nukleinsäuren zu deren Kodierung |
CH694589A5 (de) | 1999-06-25 | 2005-04-15 | Genentech Inc | Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern. |
EP1305412A2 (de) | 1999-10-14 | 2003-05-02 | Clontech Laboratories Inc. | Chromo/fluoroproteine aus anthozoa und verwendung der gleichen |
CA2492049A1 (en) | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
DK1897945T3 (da) | 1999-12-23 | 2012-05-07 | Genentech Inc | IL-17 homologe polypeptider og terapeutiske anvendelser deraf. |
ES2386317T3 (es) | 2000-01-10 | 2012-08-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Genes expresados diferencialmente en cáncer de mama |
BR0110610A (pt) | 2000-04-11 | 2003-04-29 | Genentech Inc | Anticorpos isolados, imunoconjugados, cadeias de polipeptìdeos, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo ou cadeia de polipeptìdeos, método de tratamento de disfunções em mamìferos, método de indução da apoptose de uma célula cancerosa, método para matar uma célula b, método para matar uma célula que expresse um receptor de erbb e usos dos anticorpos isolados |
EP2042597B1 (de) | 2000-06-23 | 2014-05-07 | Genentech, Inc. | Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen in Verbindung mit Angiogenese |
EP2168980A1 (de) | 2000-06-23 | 2010-03-31 | Genentech, Inc. | Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen in Verbindung mit Angiogenese |
EP1383881A2 (de) | 2000-06-26 | 2004-01-28 | Novozymes A/S | Lipolytische enzyme aus fusarium und acremonium stämmen |
DK1303293T3 (da) | 2000-07-27 | 2009-03-30 | Genentech Inc | Sekventiel indgivelse af CPT-11 og APO-2L-polypeptid |
ATE412009T1 (de) | 2000-08-24 | 2008-11-15 | Genentech Inc | Methode zur inhibierung von il-22 induziertem pap1 |
EP1944317A3 (de) | 2000-09-01 | 2008-09-17 | Genentech, Inc. | Sekretierte und Transmembran-Polypeptide sowie Nukleinsäure zu deren Kodierung |
US7456001B2 (en) | 2000-09-05 | 2008-11-25 | Novozymes A/S | Lipoxygenase |
US6673580B2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-06 | Genentech, Inc. | Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides |
FI120310B (fi) | 2001-02-13 | 2009-09-15 | Valtion Teknillinen | Parannettu menetelmä erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä |
RU2338752C2 (ru) | 2001-03-22 | 2008-11-20 | Ново Нордиск Хелт Кэр Аг | Производные фактора vii свертывания крови |
AU2002305151A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2002303261A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
AU2002258728A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
CN100359006C (zh) | 2001-04-20 | 2008-01-02 | 诺和酶股份有限公司 | 脂肪氧合酶 |
US20070160576A1 (en) | 2001-06-05 | 2007-07-12 | Genentech, Inc. | IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof |
EP1992643A3 (de) | 2001-06-20 | 2008-12-10 | Genentech, Inc. | Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung und Diagnose von Tumoren |
ES2386346T3 (es) | 2001-08-29 | 2012-08-17 | Genentech, Inc. | Ácidos nucleicos y polipéptidos Bv8 con actividad mitógena |
KR101008758B1 (ko) | 2001-09-18 | 2011-01-14 | 제넨테크, 인크. | 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물 |
AU2002333211B2 (en) | 2001-09-27 | 2008-05-08 | Novo Nordisk Health Care Ag | Human coagulation factor VII polypeptides |
NZ532027A (en) | 2001-10-10 | 2008-09-26 | Neose Technologies Inc | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
EP2305313B1 (de) | 2001-10-10 | 2014-03-26 | ratiopharm GmbH | Neumodulierung und Glykokonjugation von Interferon alpha (IFNa) |
CA2467383C (en) | 2001-12-19 | 2012-08-28 | The University Of Chicago | Rapidly maturing fluorescent proteins and methods for using the same |
MXPA04006554A (es) | 2002-01-02 | 2005-03-31 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor. |
CA2476518A1 (en) | 2002-02-22 | 2003-09-04 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
US7244565B2 (en) | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US7138512B2 (en) | 2002-04-10 | 2006-11-21 | Georgetown University | Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
NZ535925A (en) | 2002-04-16 | 2008-06-30 | Genentech Inc | An isolated antibody that binds to a particular polypeptide |
EP2305710A3 (de) | 2002-06-03 | 2013-05-29 | Genentech, Inc. | Synthetische Antikörperphagenbibliotheken |
MXPA04012243A (es) | 2002-06-07 | 2005-02-25 | Genentech Inc | Composiciones y metodos para l diagnostico y tratamiento de tumores. |
WO2004008099A2 (en) | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Genentech, Inc. | METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS THAT ARE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES |
DK1543038T4 (da) | 2002-09-11 | 2020-11-09 | Genentech Inc | Proteinoprensning |
AU2003276874B2 (en) | 2002-09-11 | 2009-09-03 | Genentech, Inc. | Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
EP1539228B1 (de) | 2002-09-11 | 2010-12-29 | Genentech, Inc. | Neue zusammensetzung und verfahren zur behandlung von immunerkrankungen |
EP1578364A4 (de) | 2002-09-16 | 2011-06-08 | Genentech Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von erkrankungen des immunsystems |
EP2500438A3 (de) | 2002-09-25 | 2012-11-28 | Genentech, Inc. | Neue Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Psoriasis |
AU2003298607B9 (en) | 2002-10-29 | 2011-08-04 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
CA2503748A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-27 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases |
JP2011516026A (ja) | 2002-11-26 | 2011-05-26 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法 |
EP1572744B1 (de) | 2002-12-16 | 2010-06-09 | Genentech, Inc. | Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen |
WO2004065417A2 (en) | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Genentech, Inc. | Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture |
KR101294959B1 (ko) | 2003-03-12 | 2013-08-09 | 제넨테크, 인크. | 조혈을 촉진하기 위한 bv8 및(또는) eg-vegf의 용도 |
RU2332986C2 (ru) | 2003-04-04 | 2008-09-10 | Дженентек, Инк. | Высококонцентрированные композиции антител и белков |
EP1620551B1 (de) | 2003-04-28 | 2013-09-18 | Novozymes A/S | Phospholipase und verfahren zur herstellung davon |
EP1629010A1 (de) | 2003-05-30 | 2006-03-01 | Genentech, Inc. | Behandlung mit anti-vegf antikörpern |
CN101974090B (zh) | 2003-06-12 | 2015-06-17 | 伊莱利利公司 | Glp-1类似物融合蛋白质 |
SI1641822T1 (sl) | 2003-07-08 | 2013-08-30 | Genentech, Inc. | IL-17 A/F heterologni polipeptidi in njihove terapevtske uporabe |
US20050106667A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-05-19 | Genentech, Inc | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
WO2005019258A2 (en) | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
ATE547519T1 (de) | 2003-09-09 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide |
EP2301568A1 (de) | 2003-11-17 | 2011-03-30 | Genentech, Inc. | Antikörper gegen IRTA2 für die Behandlung von hämatopoetischen Tumoren |
ES2382333T3 (es) | 2003-11-21 | 2012-06-07 | Danisco Us Inc. | Expresión de enzimas hidrolizantes de almidón granular en trichoderma y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidón granular |
JP5422101B2 (ja) | 2004-01-07 | 2014-02-19 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド | M−csf特異的モノクローナル抗体およびその使用 |
CN103755800B (zh) | 2004-02-02 | 2016-02-24 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素多肽与其用途 |
US8097445B2 (en) | 2004-03-25 | 2012-01-17 | Danisco Us Inc. | Exo-endo cellulase fusion protein |
WO2005093050A2 (en) | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Genencor International, Inc. | Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same |
KR20120126130A (ko) | 2004-03-29 | 2012-11-20 | 가르파마 컴퍼니 리미티드 | 신규 갈렉틴 9 개변체 단백질 및 그 용도 |
ATE515515T1 (de) | 2004-03-30 | 2011-07-15 | Glaxo Group Ltd | Immunglobuline gegen menschlisches osm |
US7794713B2 (en) | 2004-04-07 | 2010-09-14 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases |
US7250298B2 (en) | 2004-04-07 | 2007-07-31 | The University Of Chicago | Monomeric red fluorescent proteins |
US20150017671A1 (en) | 2004-04-16 | 2015-01-15 | Yaping Shou | Methods for detecting lp-pla2 activity and inhibition of lp-pla2 activity |
MXPA06013599A (es) | 2004-05-27 | 2007-03-15 | Genencor Int | Expresion heterologa de una alfa amilasa estable en condiciones acidas de aspergillus kawachi y aplicaciones en la hidrolisis del almidon granular. |
US7413887B2 (en) | 2004-05-27 | 2008-08-19 | Genecor International, Inc. | Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof |
US7332319B2 (en) | 2004-05-27 | 2008-02-19 | Genencor International, Inc. | Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus |
EP1749092A2 (de) | 2004-05-27 | 2007-02-07 | Genencor International, Inc. | Säurestabile alpha-amylasen mit körnige stärke hydrolisierender aktivität und enzymzusammensetzungen |
BRPI0512235A (pt) | 2004-06-18 | 2008-02-19 | Ambrx Inc | polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos |
TWI307630B (en) | 2004-07-01 | 2009-03-21 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
MX2007000784A (es) | 2004-07-20 | 2007-04-09 | Genentech Inc | Inhibidores de proteina 4 tipo angiopoietina, combinaciones y su uso. |
FI118339B (fi) | 2004-09-21 | 2007-10-15 | Ab Enzymes Oy | Uusi lakkaasientsyymi ja sen käyttö |
DK1817055T3 (da) | 2004-11-10 | 2013-04-08 | Diadexus Inc | Ovr110-antistofsammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
US7638491B2 (en) | 2004-12-22 | 2009-12-29 | Ambrx, Inc. | Therapies using non-natural amino acids and polypeptides |
CN103690936A (zh) | 2004-12-22 | 2014-04-02 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素 |
ATE462726T1 (de) | 2005-01-07 | 2010-04-15 | Diadexus Inc | Ovr110-antikörperzusammensetzungen und verwendungsverfahren dafür |
ZA200706858B (en) | 2005-02-18 | 2008-10-29 | Genencor Int | Polypeptides having alpha-amylase and granular starch hydrolyzing activity |
JP5209466B2 (ja) | 2005-03-21 | 2013-06-12 | ビロベイ,インコーポレイティド | システインプロテアーゼ阻害剤としてのアルファケトアミド化合物 |
CN101146907B (zh) | 2005-04-12 | 2015-04-08 | 金克克国际有限公司 | 蛋白质生产被改变的基因失活突变体 |
US7741093B2 (en) | 2005-04-29 | 2010-06-22 | Ab Enzymes Oy | Cellulases and their uses |
WO2006124667A2 (en) | 2005-05-12 | 2006-11-23 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for modulating immune responses |
NZ563341A (en) | 2005-06-06 | 2009-10-30 | Genentech Inc | Methods for identifying agents that modulate a gene that encodes for a PRO1568 polypeptide |
EP1922410A2 (de) | 2005-08-15 | 2008-05-21 | Genentech, Inc. | Genunterbrechungen, zusammensetzungen und verfahren in verbindung damit |
EP2316930A1 (de) | 2005-09-14 | 2011-05-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Menschliche Polypeptide des Koagulationfaktors VII |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US7749704B2 (en) | 2005-11-01 | 2010-07-06 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Promoter polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods |
UA96139C2 (uk) | 2005-11-08 | 2011-10-10 | Дженентек, Інк. | Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1) |
JP2009520949A (ja) | 2005-11-16 | 2009-05-28 | アンブルックス,インコーポレイテッド | 非天然アミノ酸を含んでいる組成物および方法 |
MY147669A (en) | 2005-11-18 | 2012-12-31 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses |
US20090293137A1 (en) | 2005-11-21 | 2009-11-26 | Genentech, Inc. | Novel Gene Disruptions, Compositions and Methods Relating Thereto |
GB0525662D0 (en) | 2005-12-16 | 2006-01-25 | Glaxo Group Ltd | Immunoglobulins |
US7256032B2 (en) | 2005-12-22 | 2007-08-14 | Ab Enzymes Oy | Enzymes |
DK1969123T3 (en) | 2005-12-22 | 2017-08-28 | Ab Enzymes Oy | Hitherto UNKNOWN ENZYMS |
AU2007233263A1 (en) | 2006-02-17 | 2007-10-11 | Genentech, Inc. | Gene disruptons, compositions and methods relating thereto |
RU2008141912A (ru) | 2006-03-23 | 2010-04-27 | Новартис АГ (CH) | Противоопухолевые лекарства на основе антител к клеточным антигенам |
EP2614839A3 (de) | 2006-04-05 | 2015-01-28 | Genentech, Inc. | Verfahren zur Verwendung von BOC/CDO zur Modulation der Hedgehog-Signalisierung |
BRPI0709726A2 (pt) | 2006-04-05 | 2011-07-26 | Abbott Biotechnology Ltd. | purificaÇço de anticorpo |
US7361487B2 (en) | 2006-04-13 | 2008-04-22 | Ab Enzymes Oy | Enzyme fusion proteins and their use |
JP2009536022A (ja) | 2006-04-19 | 2009-10-08 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 新規の遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法 |
AU2007244683A1 (en) | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Pikamab, Inc. | Methods and compositions for antibody therapy |
EP2024393A2 (de) | 2006-05-15 | 2009-02-18 | Sea Lane Biotechnologies,llc. | Neutralisierende antikörper gegen influenza-viren |
US7862812B2 (en) | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
CA2656063C (en) | 2006-06-21 | 2016-10-18 | Musc Foundation For Research Development | Targeting complement factor h for treatment of diseases |
AU2007276294B2 (en) | 2006-06-30 | 2012-11-29 | Novo Nordisk A/S | Anti-NKG2A antibodies and uses thereof |
US20080026376A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Huaming Wang | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
AR062435A1 (es) | 2006-08-18 | 2008-11-05 | Xoma Technology Ltd | Anticuerpo especifico prlr (receptor de prolactina) y sus usos |
CN106008699A (zh) | 2006-09-08 | 2016-10-12 | Ambrx公司 | 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途 |
US7985783B2 (en) | 2006-09-21 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of California | Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification |
CN101522893B (zh) | 2006-10-10 | 2014-07-09 | 丹尼斯科美国公司 | 具有改变性质的葡糖淀粉酶变体 |
WO2009048488A1 (en) | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Danisco Us, Inc., Genencor Division | Glucoamylase variants with altered properties |
CN104650225B (zh) | 2006-10-27 | 2019-10-01 | 勒帕斯公司 | 用于结合鞘氨醇-1-磷酸的组合物和方法 |
CN101687031B (zh) | 2006-10-27 | 2014-05-14 | 勒帕斯公司 | 用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法 |
CA2668208C (en) | 2006-11-02 | 2017-09-12 | Daniel J. Capon | Hybrid immunoglobulins with moving parts |
RU2447449C2 (ru) | 2006-11-14 | 2012-04-10 | Дженентек, Инк. | Модуляторы нейрональной регенерации |
EP2121743B1 (de) | 2006-11-22 | 2015-06-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Gezielte therapeutika auf der basis von manipulierten proteinen für tyrosinkinaserezeptoren, einschliesslich igf-ir |
AU2007325283B2 (en) | 2006-11-27 | 2012-08-30 | Diadexus, Inc. | Ovr110 antibody compositions and methods of use |
MX2009006034A (es) | 2006-12-07 | 2009-10-12 | Novartis Ag | Anticuerpos antagonistas contra ephb3. |
AU2008209404B2 (en) | 2007-01-22 | 2012-08-16 | Genentech, Inc. | Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies |
WO2008097497A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-14 | Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company | Vegf pathway blockade |
US20080220498A1 (en) | 2007-03-06 | 2008-09-11 | Cervin Marguerite A | Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties |
US8143046B2 (en) | 2007-02-07 | 2012-03-27 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties |
SI2140021T1 (sl) | 2007-02-22 | 2012-04-30 | Genentech Inc | Postopki za detekcijo vnetne ÄŤrevesne bolezni |
CN101657537B (zh) | 2007-03-14 | 2013-06-19 | 丹尼斯科美国公司 | 里氏木霉α-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化 |
CA2682147C (en) | 2007-03-30 | 2017-08-08 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-21 polypeptides and their uses |
US8093016B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-01-10 | Danisco Us Inc. | Use of an aspartic protease (NS24) signal sequence for heterologous protein expression |
ES2585702T3 (es) | 2007-05-30 | 2016-10-07 | Lpath, Inc | Composiciones y métodos para la unión al ácido lisofosfatídico |
US9163091B2 (en) | 2007-05-30 | 2015-10-20 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid |
BRPI0812767A2 (pt) | 2007-06-07 | 2014-12-02 | Genentech Inc | Anticorpos para c3b e métodos para prevenção e tratamento de distúrbios associados ao complemento |
PT3597659T (pt) | 2007-07-09 | 2023-04-04 | Genentech Inc | Prevenção da redução de ligações de dissulfureto durante a produção recombinante de polipéptidos |
SG183044A1 (en) | 2007-07-16 | 2012-08-30 | Genentech Inc | Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugatesand methods of use |
EP2502937B1 (de) | 2007-07-16 | 2016-04-06 | Genentech, Inc. | Anti-CD 79b Antikörper und Immunkonjugate sowie Verwendungsverfahren |
CN101361968B (zh) | 2007-08-06 | 2011-08-03 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用 |
WO2009031992A1 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | Elizabeth Varriano-Marston | Method for controlling banana quality by packaging |
WO2009035500A1 (en) | 2007-09-12 | 2009-03-19 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Trichoderma promoter |
KR101662622B1 (ko) | 2007-10-04 | 2016-10-05 | 지모제넥틱스, 인코포레이티드 | B7 패밀리 구성원 zB7H6 및 관련된 조성물 및 방법 |
US8592194B2 (en) | 2007-10-09 | 2013-11-26 | Danisco Us Inc. | Glucoamylase variants with altered properties |
US8361465B2 (en) | 2007-10-26 | 2013-01-29 | Lpath, Inc. | Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents |
US20090148435A1 (en) | 2007-10-30 | 2009-06-11 | Genentech, Inc. | Antibody purification by cation exchange chromatography |
US8679749B2 (en) | 2007-11-01 | 2014-03-25 | The University Of Chicago | Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation |
EP2209807A1 (de) | 2007-11-08 | 2010-07-28 | Genentech, Inc. | Anti-faktor-b-antikörper und ihre verwendungen |
US8057796B2 (en) | 2007-11-12 | 2011-11-15 | Theraclone Sciences, Inc. | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza |
WO2010135521A2 (en) | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Theraclone Sciences, Inc. | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza |
ES2795989T3 (es) | 2007-11-20 | 2020-11-25 | Danisco Us Inc | Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas |
NZ603812A (en) | 2007-11-20 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their uses |
AR069501A1 (es) | 2007-11-30 | 2010-01-27 | Genentech Inc | Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular) |
US8003325B2 (en) | 2007-11-30 | 2011-08-23 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods |
MX2010006576A (es) | 2007-12-13 | 2010-10-15 | Danisco Us Inc | Composiciones y metodos para producir isopreno. |
CN102978258A (zh) | 2008-01-02 | 2013-03-20 | 丹尼斯科美国公司 | 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法 |
AR070141A1 (es) | 2008-01-23 | 2010-03-17 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Anticuerpos humanizados especificos para el factor von willebrand |
EP2628753A1 (de) | 2008-01-24 | 2013-08-21 | Novo Nordisk A/S | Humanisierter monoklonaler Anti-human-NKG2A-Antikörper |
CA2713504A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-13 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
MX2010008632A (es) | 2008-02-08 | 2010-08-30 | Ambrx Inc | Leptina-polipeptidos modificados y sus usos. |
DK2268806T3 (da) | 2008-02-11 | 2013-07-15 | Danisco Us Inc | Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei |
MX2010009885A (es) | 2008-03-10 | 2010-11-30 | Theraclone Sciences Inc | Composiciones y métodos para la terapia y diagnóstico de citomegalovirus. |
CA2719201A1 (en) | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Sea Lane Biotechnologies, Llc. | Neutralizing molecules to viral antigens |
KR101924831B1 (ko) | 2008-04-09 | 2018-12-05 | 제넨테크, 인크. | 면역 관련 질병의 치료를 위한 신규한 조성물 및 방법 |
US8673609B2 (en) | 2008-04-18 | 2014-03-18 | Danisco Us Inc. | Buttiauxella sp. phytase variants |
MX2010011706A (es) | 2008-04-23 | 2011-03-15 | Danisco Us Inc | Variantes de isopreno-sintasa para produccion microbiana mejorada de isopreno. |
LT2280996T (lt) | 2008-05-06 | 2016-12-12 | Genentech, Inc. | Subrendusio giminingumo crig variantai |
MY156256A (en) | 2008-07-02 | 2016-01-29 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for producing isoprene free of c5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges |
EP2318029B1 (de) | 2008-07-23 | 2017-11-01 | Ambrx, Inc. | Modifizierte bovine g-csf-polypeptide und ihre verwendung |
ES2527943T5 (es) | 2008-08-14 | 2019-03-07 | Genentech Inc | Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas |
AR073279A1 (es) | 2008-09-05 | 2010-10-28 | TransAlgae Ltd | Resistencia a herbicida para mantener cultivos axenicos de algas por manipulacion genetica |
WO2010031076A2 (en) | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Danisco Us Inc. | Conversion of prenyl derivatives to isoprene |
ZA201102111B (en) | 2008-09-15 | 2013-10-30 | Danisco Us Inc | Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation |
BRPI0918453A2 (pt) | 2008-09-15 | 2019-12-17 | Danisco Us Inc | sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno |
MY169163A (en) | 2008-09-15 | 2019-02-19 | Danisco Us Inc | Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway |
WO2010034015A2 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Modulating the alternative complement pathway |
CA2738033C (en) | 2008-09-26 | 2019-11-26 | Ambrx, Inc. | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
KR101647164B1 (ko) | 2008-09-26 | 2016-08-09 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 |
SG10201702922VA (en) | 2008-10-20 | 2017-06-29 | Abbvie Inc | Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography |
CN102307593B (zh) | 2008-10-22 | 2016-04-13 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 轴突变性的调节 |
US8871202B2 (en) | 2008-10-24 | 2014-10-28 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate |
EP2346903A1 (de) | 2008-11-06 | 2011-07-27 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Behandlung mit anti-alpha2-integrinantikörpern |
JP5548698B2 (ja) | 2008-12-15 | 2014-07-16 | ダニスコ・ユーエス・インク | ハイブリッドアルファ‐アミラーゼ |
AR074777A1 (es) | 2008-12-19 | 2011-02-09 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union a antigeno |
FI20086236A0 (fi) | 2008-12-23 | 2008-12-23 | Valtion Teknillinen | Heksuronihapon konversio heksarihapoksi |
MY161071A (en) | 2008-12-30 | 2017-04-14 | Danisco Us Inc | Methods of producing isoprene and a co-product |
FI122029B (fi) | 2008-12-30 | 2011-07-29 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
WO2010078376A2 (en) | 2008-12-30 | 2010-07-08 | Ventana Medical Systems, Inc. | Fc-specific polymer-conjugated antibodies and their diagnostic use |
EA020843B1 (ru) | 2009-02-03 | 2015-02-27 | Амуникс Оперейтинг Инк. | Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции |
SI3260136T1 (sl) | 2009-03-17 | 2021-05-31 | Theraclone Sciences, Inc. | Humani imunodeficientni virus (HIV)-nevtralizirajoča protitelesa |
EP2414399A1 (de) | 2009-04-01 | 2012-02-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Anti-fcrh5-antikörper und immunkonjugate und anwendungsverfahren |
WO2010118243A2 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists to treat lupus |
EP2421966A2 (de) | 2009-04-23 | 2012-02-29 | Danisco US Inc. | Dreidimensionale struktur von isopren-synthase und verwendung davon zur erzeugung von varianten |
US8609101B2 (en) | 2009-04-23 | 2013-12-17 | Theraclone Sciences, Inc. | Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) neutralizing antibodies |
FI121712B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö |
FI121711B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö |
CN102428176B (zh) | 2009-05-19 | 2016-11-16 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 淀粉酶多肽 |
ES2705249T3 (es) | 2009-06-08 | 2019-03-22 | Amunix Operating Inc | Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso |
SI2440241T1 (sl) | 2009-06-08 | 2017-11-30 | Amunix Operating Inc. | Polipeptidni rastni hormoni in postopki za njihovo izdelavo in uporabo |
TWI427149B (zh) | 2009-06-17 | 2014-02-21 | Danisco Us Inc | 使用dxp及mva途徑之改良之異戊二烯製造 |
TWI434921B (zh) | 2009-06-17 | 2014-04-21 | Danisco Us Inc | 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統 |
FI121851B (fi) | 2009-07-08 | 2011-05-13 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö |
JP2012533306A (ja) | 2009-07-15 | 2012-12-27 | アボット・ラボラトリーズ | 機械的伝達による細胞産生の強化 |
AU2010272483B2 (en) | 2009-07-17 | 2016-07-21 | Omeros Corporation | MASP isoforms as inhibitors of complement activation |
US8765431B2 (en) | 2009-07-23 | 2014-07-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Method for enzymatic production of decarboxylated polyketides and fatty acids |
EP2459591B1 (de) | 2009-07-31 | 2014-08-20 | Genentech, Inc. | Hemmung von tumormetastase mittels anti-g-csf-antikörpern |
WO2011022465A1 (en) | 2009-08-19 | 2011-02-24 | Danisco Us Inc. | Combinatorial variants of glucoamylase with improved specific activity and/or thermostability |
AU2010284963C1 (en) | 2009-08-19 | 2014-11-27 | Danisco Us Inc. | Variants of glucoamylase |
CA2772051C (en) | 2009-08-24 | 2020-08-18 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
SI2473617T1 (sl) | 2009-09-01 | 2020-07-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Izboljšano prečiščevanje beljakovin z modificirano elucijo beljakovine A |
EP2473522B1 (de) | 2009-09-02 | 2016-08-17 | Genentech, Inc. | Smoothened-mutant und verfahren zu seiner anwendung |
US8926976B2 (en) | 2009-09-25 | 2015-01-06 | Xoma Technology Ltd. | Modulators |
US9885711B2 (en) | 2009-09-25 | 2018-02-06 | Xoma Technology Ltd. | Screening methods |
BR112012008907A2 (pt) | 2009-10-15 | 2020-11-24 | Genentech, Inc | fatores de crescimento de fibroblastos quiméricos com especificidade receptora alterada |
DK3037104T3 (da) | 2009-10-20 | 2020-07-20 | Abbvie Inc | Isolering og renselse af anti-il-13 antistoffer ved brug af protein a beslægtet kromatografi |
EP3011970A3 (de) | 2009-10-22 | 2016-06-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | Modulation der axondegeneration |
EP2490718B1 (de) | 2009-10-22 | 2016-01-13 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren und zusammensetzungen zur modulation der hepsin-aktivierung des makrophagen-stimulierenden proteins |
WO2011056502A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use |
WO2011056497A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor type iib compositions and methods of use |
WO2011056494A1 (en) | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations |
US20110098862A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-04-28 | ExxonMobil Research Engineering Company Law Department | Multi-stage processes and control thereof |
RU2012124093A (ru) | 2009-11-12 | 2013-12-20 | Дженентек, Инк. | Способ увеличения плотности дендритных шипиков |
SG10201408598XA (en) | 2009-11-30 | 2015-02-27 | Genentech Inc | Antibodies for treating and diagnosing tumors expressing slc34a2 (tat211 = seqid2 ) |
EP2507258B1 (de) | 2009-12-01 | 2016-04-20 | Novo Nordisk A/S | Neue peptidyl-alpha-hydroxyglycin-alpha-amidierende lyasen |
WO2011080050A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-07-07 | Novartis Ag | Binding molecules |
WO2011071577A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Genentech, Inc. | Anti-vegf-c antibodies and methods using same |
JP5984676B2 (ja) | 2009-12-18 | 2016-09-06 | シーエスエル、リミテッド | ポリペプチドを精製する方法 |
PE20121707A1 (es) | 2009-12-21 | 2012-12-17 | Ambrx Inc | Polipeptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos |
SG2014011340A (en) | 2009-12-21 | 2014-07-30 | Genentech Inc | Antibody formulation |
CN102666578A (zh) | 2009-12-21 | 2012-09-12 | Ambrx公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
FI122937B (fi) | 2009-12-30 | 2012-09-14 | Roal Oy | Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit |
EA023700B1 (ru) | 2010-01-28 | 2016-07-29 | Глаксо Груп Лимитед | Cd127-связывающие белки |
CN102985113B (zh) | 2010-02-23 | 2015-05-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法 |
CA3027824A1 (en) | 2010-02-23 | 2011-09-01 | Sanofi | Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses |
UA108227C2 (xx) | 2010-03-03 | 2015-04-10 | Антигензв'язуючий білок | |
WO2011107591A1 (en) | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Rigshospitalet | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
US9107440B2 (en) | 2010-03-29 | 2015-08-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polypeptides having transgalactosylating activity |
BR112012024713B1 (pt) | 2010-03-31 | 2021-02-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | anticorpo humanizado, seus usos e composição farmacêutica que o compreende |
WO2011123813A2 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Amunix Operating Inc. | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
WO2011133931A1 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease |
CN107090045A (zh) | 2010-05-03 | 2017-08-25 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法 |
HUE030820T2 (en) | 2010-05-28 | 2017-06-28 | Hoffmann La Roche | Decreasing Lactate Levels and Enhancing Polypeptide Production by Control of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinase Expression |
WO2011150454A1 (en) | 2010-06-01 | 2011-12-08 | Monash University | ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET |
AR081556A1 (es) | 2010-06-03 | 2012-10-03 | Glaxo Group Ltd | Proteinas de union al antigeno humanizadas |
BR112012032276A2 (pt) | 2010-06-17 | 2016-11-16 | Danisco Us Inc | composições de combustível compreendendo derivados de isopreno |
KR101768118B1 (ko) | 2010-06-25 | 2017-08-14 | 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) | 기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물 |
WO2012010635A1 (en) | 2010-07-22 | 2012-01-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel antigen binding proteins |
WO2012019169A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Danisco Us Inc. | Production of isoprene under neutral ph conditions |
WO2012019159A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Danisco Us Inc. | Neutral ph saccharification and fermentation |
CA2807664A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Theraclone Sciences, Inc. | Anti-hemagglutinin antibody compositions and methods of use thereof |
EP2420250A1 (de) | 2010-08-13 | 2012-02-22 | Universitätsklinikum Münster | Anti-Syndecan-4-Antikörper |
KR20130100125A (ko) | 2010-08-13 | 2013-09-09 | 제넨테크, 인크. | 질환의 치료를 위한, IL-1β 및 IL-18에 대한 항체 |
US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
RS59193B1 (sr) | 2010-08-17 | 2019-10-31 | Ambrx Inc | Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena |
JP2013535983A (ja) | 2010-08-24 | 2013-09-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | 低温コメタンパク質濃縮物を含有する食品 |
EP4226935A3 (de) | 2010-08-31 | 2023-09-06 | Theraclone Sciences, Inc. | Antikörper zur neutralisierung des humanen immundefizienzvirus (hiv) |
CN102380091A (zh) | 2010-08-31 | 2012-03-21 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用 |
JP2014506115A (ja) | 2010-09-15 | 2014-03-13 | アリグナ テクノロジーズ,インク. | リグニン由来の化合物からの芳香族化学物質のバイオプロダクション |
WO2012040041A1 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Abbott Laboratories | Purification of antibodies using simulated moving bed chromatography |
TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
US8481680B2 (en) | 2010-10-05 | 2013-07-09 | Genentech, Inc. | Mutant smoothened and methods of using the same |
EP2624854B1 (de) | 2010-10-08 | 2016-08-03 | Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd | Moesininhibitoren und ihre verwendungen |
KR101571940B1 (ko) | 2010-10-08 | 2015-11-25 | 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디. | 면역성 혈소판 감소증과 관련된 모에신 단편 |
JP5868410B2 (ja) | 2010-10-08 | 2016-02-24 | シャンハイ クーシン バイオテック カンパニー,リミテッド | 再生不良性貧血と関連しているモエシン断片 |
KR101641756B1 (ko) | 2010-10-08 | 2016-07-21 | 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디. | 모에신 단편 및 그의 용도 |
WO2012045281A1 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd. | Diagnostic and therapeutic uses of moesin fragments |
JP2014502148A (ja) | 2010-10-27 | 2014-01-30 | ダニスコ・ユーエス・インク | イソプレン生産の向上を目的としたイソプレン合成酵素変異体 |
FI123942B (fi) | 2010-10-29 | 2013-12-31 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja |
CA2816950C (en) | 2010-11-04 | 2018-11-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il-23 antibodies |
BR112013011167A2 (pt) | 2010-11-05 | 2016-08-23 | Abbvie Inc | "exame de suplementos eficientes e efetivos para o desenvolvimento de meio quimicamente definido em cultura de células." |
WO2012099566A1 (en) | 2010-11-17 | 2012-07-26 | Sea Lane Biotechnologies, Llc | Influenza virus neutralizing agents that mimic the binding site of an influenza neutralizing antibody |
WO2012088450A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Danisco Us Inc. | Biological production of pentose sugars using recombinant cells |
CA2824279A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Cephalon Australia Pty Ltd | Modified antibody with improved half-life |
BR112013018316A2 (pt) | 2010-12-22 | 2018-09-11 | Danisco Us Inc | composições e métodos para produção aprimorada de isopreno usando dois tipos de enzimas ispg |
SG192727A1 (en) | 2011-02-14 | 2013-09-30 | Theraclone Sciences Inc | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza |
JP2014515598A (ja) | 2011-03-10 | 2014-07-03 | エイチシーオー アンティボディ, インク. | 二重特異性三鎖抗体様分子 |
WO2012122512A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Hco Antibody, Inc. | Recombinant production of mixtures of single chain antibodies |
US20120238730A1 (en) | 2011-03-15 | 2012-09-20 | Abbott Laboratories | Integrated approach to the isolation and purification of antibodies |
CN103533929A (zh) | 2011-03-15 | 2014-01-22 | 特罗科隆科学有限公司 | 用于流行性感冒的治疗和诊断的组合物和方法 |
WO2012128810A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Abbott Laboratories | Methods and systems for the analysis of protein samples |
FI123425B (fi) | 2011-03-31 | 2013-04-30 | Ab Enzymes Oy | Proteaasientsyymi ja sen käytöt |
JP6248029B2 (ja) | 2011-03-31 | 2017-12-13 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ベータ7インテグリンアンタゴニストの投与方法 |
US9062106B2 (en) | 2011-04-27 | 2015-06-23 | Abbvie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
US8785165B2 (en) | 2011-04-29 | 2014-07-22 | Danisco Us Inc. | Single pH process for starch liquefaction and saccharification for high-density glucose syrups |
JP6400470B2 (ja) | 2011-05-16 | 2018-10-03 | ジェネロン(シャンハイ)コーポレイション リミテッド | 多重特異性Fab融合タンパク質および使用法 |
KR102148982B1 (ko) | 2011-06-03 | 2020-08-27 | 조마 테크놀로지 리미티드 | Tgf-베타에 특이적인 항체 |
JP2013040160A (ja) | 2011-07-01 | 2013-02-28 | Genentech Inc | 自己免疫疾患を治療するための抗cd83アゴニスト抗体の使用 |
ES2670621T3 (es) | 2011-07-11 | 2018-05-31 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Anticuerpos que se unen a OX40 y sus usos |
WO2013022799A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Danisco Us Inc. | PRODUCTION OF ISOPRENOIDS UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS |
CA2842481A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | Genentech, Inc. | Inhibition of angiogenesis in refractory tumors |
US8822651B2 (en) | 2011-08-30 | 2014-09-02 | Theraclone Sciences, Inc. | Human rhinovirus (HRV) antibodies |
CN103945861B (zh) | 2011-09-12 | 2018-06-05 | 阿穆尼克斯运营公司 | 胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法 |
JP2014533929A (ja) | 2011-09-23 | 2014-12-18 | アムゲン リサーチ (ミュンヘン) ゲーエムベーハー | 5t4およびcd3に対する二重特異的結合性分子 |
CA2851855A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Bp Corporation North America Inc. | Use of plant promoters in filamentous fungi |
CA2851308A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Bp Corporation North America Inc. | Use of mammalian promoters in filamentous fungi |
TWI679212B (zh) | 2011-11-15 | 2019-12-11 | 美商安進股份有限公司 | 針對bcma之e3以及cd3的結合分子 |
EA031948B1 (ru) | 2011-11-16 | 2019-03-29 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции |
CA2857168C (en) | 2011-12-01 | 2020-10-27 | Protevobio, Inc. | Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof |
WO2013090915A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | Braskem S.A. | Modified microorganisms and methods of making butadiene using same |
WO2013091903A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Novo Nordisk A/S | Anti-crac channel antibodies |
AU2012355356B2 (en) | 2011-12-22 | 2017-10-12 | Genentech, Inc. | Ion exchange membrane chromatography |
MX357071B (es) | 2012-01-19 | 2018-06-22 | Univ Cincinnati | Medicamentos que comprenden apolipoproteína a-iv no glicosilada para el tratamiento de diabetes. |
EP2809684A1 (de) | 2012-01-31 | 2014-12-10 | Genentech, Inc. | Anti-ig-e m1'-antikörper und verwendungsverfahren dafür |
EP2812024B1 (de) | 2012-02-09 | 2018-04-11 | Var2 Pharmaceuticals ApS | Targeting von chondroitinsulfatglycanen |
EP3549953A1 (de) | 2012-02-15 | 2019-10-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Rekombinante faktor-viii-proteine |
EP2814840B1 (de) | 2012-02-15 | 2019-11-13 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Faktor-viii-zusammensetzungen und verfahren zur herstellung und verwendung davon |
MX353382B (es) | 2012-03-01 | 2018-01-10 | Amgen Res Munich Gmbh | Moleculas de union polipeptido de larga duracion. |
WO2013158275A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
US9550818B2 (en) | 2012-04-27 | 2017-01-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods for use of vascular endothelial growth factor antagonists |
US9163263B2 (en) | 2012-05-02 | 2015-10-20 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene |
EA201401204A1 (ru) | 2012-05-03 | 2015-05-29 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Антитела к il-23p19 |
WO2013177118A2 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-28 | Abbvie Inc. | Novel purification of non-human antibodies using protein a affinity chromatography |
US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
EP3305896A1 (de) | 2012-06-08 | 2018-04-11 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Polypeptide mit transgalactosylierungsaktivität |
CA2878684A1 (en) | 2012-07-25 | 2014-01-30 | University Of Cincinnati | Method of treating hyperglycemic disorders using apolipoprotein aiv |
JP2015524808A (ja) | 2012-07-25 | 2015-08-27 | ユニバーシティ・オブ・シンシナティ | アポリポタンパク質aivを用いたi型糖尿病の治療法 |
MX2015002099A (es) | 2012-08-22 | 2015-05-11 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes que tienen actividad glucoamilasa. |
JOP20200308A1 (ar) | 2012-09-07 | 2017-06-16 | Novartis Ag | جزيئات إرتباط il-18 |
US20150307865A1 (en) | 2012-10-15 | 2015-10-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor vii polypeptides |
MY173334A (en) | 2013-01-02 | 2020-01-16 | Ichnos Sciences SA | Antibodies that bind to tl1a and their uses |
JO3519B1 (ar) | 2013-01-25 | 2020-07-05 | Amgen Inc | تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3 |
US9920121B2 (en) | 2013-01-25 | 2018-03-20 | Amgen Inc. | Antibodies targeting CDH19 for melanoma |
US10653779B2 (en) | 2013-03-13 | 2020-05-19 | Genentech, Inc. | Formulations with reduced oxidation |
AR095398A1 (es) | 2013-03-13 | 2015-10-14 | Genentech Inc | Formulaciones con oxidación reducida |
RU2707550C2 (ru) | 2013-03-13 | 2019-11-27 | Дженентек, Инк. | Составы со сниженным окислением |
CA2906057A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Genentech, Inc. | Antibody formulations |
CA3113172A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Genentech, Inc. | Screen for compound that prevents protein oxidation based on comparison with l-tryptophan |
US20140271633A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Mammalian cell culture performance through surfactant supplementation of feed media |
EP2836515A1 (de) | 2013-03-14 | 2015-02-18 | AbbVie Inc. | Zusammensetzungen aus schwach sauren spezies und verfahren zur herstellung und verwendung davon |
WO2014142882A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
AU2014240431A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-08-27 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing the same using displacement chromatography |
BR112015022529A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Genentech Inc | meios de cultura de células e processos de produção de anticorpo |
US20140283157A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Diadexus, Inc. | Lipoprotein-associated phospholipase a2 antibody compositions and methods of use |
ES2759061T3 (es) | 2013-03-15 | 2020-05-07 | Biomolecular Holdings Llc | Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica |
PT2970449T (pt) | 2013-03-15 | 2019-11-06 | Amgen Res Munich Gmbh | Moléculas de ligação de cadeia única compreendendo abp n-terminal |
WO2014145768A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bp Corporation North America Inc. | Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi |
WO2014140368A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Antibody constructs for influenza m2 and cd3 |
AR095374A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-10-14 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Moléculas de unión para bcma y cd3 |
PL2970875T3 (pl) | 2013-03-15 | 2020-08-10 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Kompozycje do hodowli komórkowych z przeciwutleniaczami i sposoby wytwarzania polipeptydów |
US10233249B2 (en) | 2013-03-19 | 2019-03-19 | Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. | Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases |
BR112015024856A2 (pt) | 2013-03-27 | 2018-04-17 | Genentech Inc | métodos de determinação ou de monitoramento |
CN112430266A (zh) | 2013-05-31 | 2021-03-02 | 基因泰克公司 | 抗壁磷壁酸抗体和缀合物 |
US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
AR097648A1 (es) | 2013-09-13 | 2016-04-06 | Amgen Inc | Combinación de factores epigenéticos y compuestos biespecíficos que tienen como diana cd33 y cd3 en el tratamiento de leucemia mieloide |
SG10201708542RA (en) | 2013-09-27 | 2017-12-28 | Genentech Inc | Anti-pdl1 antibody formulations |
EP3069137A1 (de) | 2013-11-05 | 2016-09-21 | Novartis Ag | Organische verbindungen |
CN104623637A (zh) | 2013-11-07 | 2015-05-20 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用 |
WO2015086746A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | A method for preparing a dairy product having a stable content of galacto-oligosaccharide(s) |
HUE047699T2 (hu) | 2013-12-17 | 2020-05-28 | Hoffmann La Roche | Eljárások rákbetegségek kezelésére PD-1-tengelyhez kötõdõ antagonisták és taxánok alkalmazásával |
CN105899535A (zh) | 2013-12-17 | 2016-08-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法 |
US20150190506A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-07-09 | Genentech, Inc. | Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists |
CN106062005A (zh) | 2013-12-30 | 2016-10-26 | 医药生命融合研究团 | 抗krs单克隆抗体及其用途 |
WO2015116902A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Genentech, Inc. | G-protein coupled receptors in hedgehog signaling |
WO2016039801A1 (en) | 2014-01-31 | 2016-03-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel anti-baff antibodies |
ES2694857T3 (es) | 2014-02-04 | 2018-12-27 | Genentech, Inc. | Smoothened mutante y métodos de uso de la misma |
CN106456574A (zh) | 2014-03-14 | 2017-02-22 | 丹尼尔·J·卡鹏 | 含有非肽连接的杂合免疫球蛋白 |
EP3122799B8 (de) | 2014-03-25 | 2020-03-11 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur herstellung von poloxamer zur verwendung bei zellkulturmedium |
WO2015148809A1 (en) | 2014-03-27 | 2015-10-01 | Genentech, Inc. | Methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease |
CN106132439A (zh) | 2014-03-31 | 2016-11-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法 |
US11345908B2 (en) | 2014-05-30 | 2022-05-31 | Braskem S.A. | Modified microorganisms comprising an optimized system for oligosaccharide utilization and methods of using same |
WO2015198320A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | Methods of purifying antibodies |
WO2016004197A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using cobalt |
US20160185848A1 (en) | 2014-07-09 | 2016-06-30 | Abbvie Inc. | Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using sugars |
EP3708679A1 (de) | 2014-07-24 | 2020-09-16 | Boehringer Ingelheim International GmbH | In der behandlung von il-23a-assoziierten erkrankungen nützlicher biomarker |
AU2015295242B2 (en) | 2014-07-31 | 2020-10-22 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution |
AU2015294834B2 (en) | 2014-07-31 | 2021-04-29 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs |
AR101669A1 (es) | 2014-07-31 | 2017-01-04 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3 |
EP3193932B1 (de) | 2014-09-15 | 2023-04-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antikörperformulierungen |
WO2016059602A2 (en) | 2014-10-16 | 2016-04-21 | Glaxo Group Limited | Methods of treating cancer and related compositions |
TW202124419A (zh) | 2014-10-24 | 2021-07-01 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 經修飾之fgf-21多肽及其用途 |
JP6974166B2 (ja) | 2014-11-07 | 2021-12-01 | デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス | マンナナーゼ、セルラーゼおよびペクチナーゼが欠乏している、ベータ−ガラクトシダーゼ活性および/またはトランスガラクトシル化活性を発現する組換え宿主細胞 |
MX2017006320A (es) | 2014-11-17 | 2017-08-10 | Genentech Inc | Terapia combinada que comprende agonistas de unión de ox40 y antagonistas de unión del eje de pd-1. |
RU2731055C2 (ru) | 2014-12-03 | 2020-08-28 | Дженентек, Инк. | Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение |
SG10202103879YA (en) | 2015-02-04 | 2021-05-28 | Boehringer Ingelheim Int | Methods of treating inflammatory diseases |
CA2975875A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Genentech, Inc. | Mutant smoothened and methods of using the same |
CN108064267A (zh) | 2015-02-09 | 2018-05-22 | 丹尼斯科美国公司 | 真菌菌株及使用方法 |
EP3978530A1 (de) | 2015-02-26 | 2022-04-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | Integrin-beta7-antagonisten und verfahren zur behandlung von morbus crohn |
EP3265491A1 (de) | 2015-03-03 | 2018-01-10 | Xoma (Us) Llc | Behandlung von postprandialer hyperinsulinämie und hyperglykämie nach bariatrischer chirurgie |
WO2016144773A1 (en) | 2015-03-06 | 2016-09-15 | Abbvie Inc. | Arabinosylated glycoproteins |
JP6901400B2 (ja) | 2015-04-03 | 2021-07-14 | ゾーマ テクノロジー リミテッド | TGF−β及びPD−1の阻害物質を使用する癌の治療法 |
JP2018512422A (ja) | 2015-04-14 | 2018-05-17 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 疾患の処置法 |
WO2016166360A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3 |
BR112017024579A2 (pt) | 2015-05-22 | 2018-07-31 | Dupont Nutrition Biosci Aps | acetolactato descarboxilase |
EP3763827A1 (de) | 2015-05-29 | 2021-01-13 | F. Hoffmann-La Roche AG | Pd-l1-promotormethylierung bei krebs |
WO2016205320A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Genentech, Inc. | Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes |
TWI717375B (zh) | 2015-07-31 | 2021-02-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Cd70及cd3抗體構築體 |
TWI793062B (zh) | 2015-07-31 | 2023-02-21 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | Dll3及cd3抗體構築體 |
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WO2017024060A1 (en) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | Biogen Ma Inc. | Factor ix fusion proteins and methods of making and using same |
TWI797060B (zh) | 2015-08-04 | 2023-04-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
EP3334763A4 (de) | 2015-08-11 | 2019-04-03 | Wuxi Biologics (Cayman) Inc. | Neuartige anti-pd-1-antikörper |
DK3344282T3 (da) | 2015-09-02 | 2020-12-14 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Glycosidhydrolaser og anvendelse heraf til forebyggelse og/eller behandling af en patogen infektion hos et dyr |
US20190248905A1 (en) | 2015-09-07 | 2019-08-15 | Helmholtz Zentrum Muenchen-Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Novel igfr-like receptor and uses thereof |
TWI733695B (zh) | 2015-09-18 | 2021-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
SG11201804951SA (en) | 2015-12-30 | 2018-07-30 | Genentech Inc | Use of tryptophan derivatives for protein formulations |
US10525137B2 (en) | 2015-12-30 | 2020-01-07 | Genentech, Inc. | Formulations with reduced degradation of polysorbate |
LT3411404T (lt) | 2016-02-03 | 2022-12-27 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Psma ir cd3 bispecifiniai, t ląsteles aktyvuojantys antikūno konstruktai |
IL260958B1 (en) | 2016-02-03 | 2024-07-01 | Amgen Res Munich Gmbh | Constructs of bispecific antibodies to BCMA and CD3 that bind to T cells, preparations containing the same and uses thereof |
EA039859B1 (ru) | 2016-02-03 | 2022-03-21 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3 |
AU2017213826A1 (en) | 2016-02-04 | 2018-08-23 | Curis, Inc. | Mutant smoothened and methods of using the same |
CN116196412A (zh) | 2016-03-15 | 2023-06-02 | 中外制药株式会社 | 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗gpc3抗体治疗癌症的方法 |
CN109476756B (zh) | 2016-03-15 | 2022-05-31 | 埃泰美德(香港)有限公司 | 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途 |
WO2017161976A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Ltd | Novel anti-pd-l1 antibodies |
CA3018794A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Use of il-23 antibodies for treating generalized pustular psoriasis |
US11510966B2 (en) | 2016-04-15 | 2022-11-29 | Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd | Use of IL-22 in treating necrotizing enterocolitis |
EP3464354B1 (de) | 2016-06-02 | 2021-07-28 | Bloom Diagnostics AG | Antikörper zur bindung an humane anti-müller-hormone (amh) und deren verwendungen |
EP3478831B1 (de) | 2016-06-30 | 2021-01-20 | Danisco US Inc. | Aspartat-proteasen |
WO2018026748A1 (en) | 2016-08-01 | 2018-02-08 | Xoma (Us) Llc | Parathyroid hormone receptor 1 (pth1r) antibodies and uses thereof |
EP3497129A1 (de) | 2016-08-08 | 2019-06-19 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Therapeutische und diagnostische verfahren für krebs |
BR112019004988A2 (pt) | 2016-09-16 | 2019-06-04 | Dupont Nutrition Biosci Aps | variantes de decarboxilase de acetolactato que tem atividade específica aprimorada |
EP3515950A4 (de) | 2016-09-20 | 2020-10-28 | Wuxi Biologics Ireland Limited. | Neuartige anti-pcsk9-antikörper |
CA3037875A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Use of low ph active alpha-1,4/1,6-glycoside hydrolases as a feed additive for ruminants to enhance starch digestion |
JP2019534710A (ja) | 2016-09-28 | 2019-12-05 | ゾーマ (ユーエス) リミテッド ライアビリティ カンパニー | インターロイキン2に結合する抗体およびその使用 |
WO2018067599A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Danisco Us Inc. | Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates |
EP3848390A1 (de) | 2016-10-14 | 2021-07-14 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Verfahren zur behandlung von krankheiten |
WO2018075474A1 (en) | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Medical University Of South Carolina | Compositions and methods for treating central nervous system injury |
WO2018093752A1 (en) | 2016-11-15 | 2018-05-24 | Danisco Us Inc. | Filamentous fungi with improved protein production |
WO2018138376A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Novel igfr-like 2 receptor and uses thereof |
JOP20190189A1 (ar) | 2017-02-02 | 2019-08-01 | Amgen Res Munich Gmbh | تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t |
WO2018148419A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof |
WO2018152496A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of zika virus infection |
EP3592429A1 (de) | 2017-03-06 | 2020-01-15 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Neuartige pilzfucosidasen und deren verwendung zur vorbeugung und/oder behandlung einer pathogenen infektion bei einem tier |
EP4095161A1 (de) | 2017-03-15 | 2022-11-30 | Tsinghua University | Neuartige anti-trkb-antikörper |
EP3601350A1 (de) | 2017-03-27 | 2020-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Kombinationstherapie gegen il-36r-antikörper |
WO2018182284A1 (ko) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 | 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체 |
EP3615569A1 (de) | 2017-04-25 | 2020-03-04 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antikörper und verfahren zur diagnose und behandlung von epstein-barr-virus-infektionen |
WO2018204907A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Amgen Inc. | Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs for improved storage and administration |
US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
WO2019018629A1 (en) | 2017-07-19 | 2019-01-24 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | ANTIBODIES AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING INFECTION WITH HEPATITIS B VIRUS |
US11339221B2 (en) | 2017-11-01 | 2022-05-24 | Tufts Medical Center, Inc. | Bispecific antibody constructs and methods of use |
JP7344206B2 (ja) | 2017-12-11 | 2023-09-13 | アムジェン インコーポレイテッド | 二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス |
UY38041A (es) | 2017-12-29 | 2019-06-28 | Amgen Inc | Construcción de anticuerpo biespecífico dirigida a muc17 y cd3 |
CA3092037A1 (en) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | Celgene Corporation | Bcma-binding antibodies and uses thereof |
KR102340989B1 (ko) | 2018-03-28 | 2021-12-20 | 에이비온 주식회사 | 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도 |
CN112334485A (zh) | 2018-04-06 | 2021-02-05 | 百进生物科技公司 | 抗-四次穿膜蛋白33药剂及其组合物以及制备和使用方法 |
WO2019213416A1 (en) | 2018-05-02 | 2019-11-07 | The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Antibodies and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of epstein barr virus infection |
TW202015723A (zh) | 2018-05-18 | 2020-05-01 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 治療a型血友病的方法 |
SG11202012446UA (en) | 2018-06-23 | 2021-01-28 | Genentech Inc | Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor |
EA202190094A1 (ru) | 2018-06-29 | 2021-04-21 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Антитела против cd40 для применения в лечении аутоиммунного заболевания |
US20210278406A1 (en) | 2018-07-13 | 2021-09-09 | Varct Diagnostic Aps | Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa |
AR115925A1 (es) | 2018-08-08 | 2021-03-10 | Genentech Inc | Uso de derivados de triptófano y l-metionina para formulación de proteínas |
MX2021003213A (es) | 2018-09-21 | 2021-05-12 | Genentech Inc | Metodos de diagnostico para cancer de mama triple negativo. |
EP3856343A1 (de) | 2018-09-25 | 2021-08-04 | Biolegend, Inc. | Anti-tlr9-mittel und zusammensetzungen sowie verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
KR20210068408A (ko) | 2018-09-28 | 2021-06-09 | 암젠 인크 | 가용성 bcma에 대한 항체 |
AU2019356564A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-04-29 | Amgen Inc. | Downstream processing of bispecific antibody constructs |
EP3870614A1 (de) | 2018-10-23 | 2021-09-01 | GlyCardial Diagnostics, S.L. | Antikörper spezifisch für glykosyliertes apoj und verwendungen davon |
AU2020248645A1 (en) | 2019-03-27 | 2021-10-28 | Tigatx, Inc. | Engineered IgA antibodies and methods of use |
MX2021013671A (es) | 2019-05-09 | 2021-12-10 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-sema3a y sus usos para tratar enfermedades oculares. |
KR20220012262A (ko) | 2019-05-24 | 2022-02-03 | 산유 바이오파마슈티컬스 씨오., 엘티디. | 신형 cldn18.2 결합분자 |
US20220259547A1 (en) | 2019-06-13 | 2022-08-18 | Amgeng Inc. | Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics |
TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
WO2021010800A1 (ko) | 2019-07-18 | 2021-01-21 | 제이더블유바이오사이언스 주식회사 | Wrs 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 |
JP2022545917A (ja) | 2019-08-27 | 2022-11-01 | トニックス ファーマ リミテッド | 修飾tff2ポリペプチド |
AU2020345787A1 (en) | 2019-09-10 | 2022-03-24 | Amgen Inc. | Purification method for bispecific antigen-binding polypeptides with enhanced protein L capture dynamic binding capacity |
KR102442204B1 (ko) | 2019-09-20 | 2022-09-08 | 경북대학교 산학협력단 | Cox2 단백질의 아세틸화 검출용 항체 및 이의 용도 |
TW202126685A (zh) | 2019-09-24 | 2021-07-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 |
AU2020381536A1 (en) | 2019-11-13 | 2022-04-21 | Amgen Inc. | Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules |
CA3161898A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Basf Se | Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals |
MX2022007714A (es) | 2019-12-20 | 2022-07-19 | Basf Se | Disminucion de la toxicidad de terpenos y aumento de la posible produccion en microorganismos. |
WO2021150824A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof |
CN113461817A (zh) | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 苏州泽璟生物制药股份有限公司 | 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用 |
KR20230002559A (ko) | 2020-04-15 | 2023-01-05 | 제넨테크, 인크. | 구리 손실 완화 |
IL298431A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-pd-1 antibodies |
MX2022015157A (es) | 2020-06-02 | 2023-01-16 | Arcus Biosciences Inc | Anticuerpos para tigit. |
US20210388064A1 (en) | 2020-06-15 | 2021-12-16 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus antibodies and fragments thereof |
MX2022015877A (es) | 2020-06-16 | 2023-01-24 | Genentech Inc | Metodos y composiciones para tratar cancer de mama triple negativo. |
EP3939999A1 (de) | 2020-07-14 | 2022-01-19 | Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) | Antikörper zur neutralisierung der interleukin-11-rezeptor-alpha-unterheinheit (il11ra) und verwendungen davon |
WO2022093640A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | BioLegend, Inc. | Anti-nkg2c agents and compositions and methods for making and using the same |
WO2022093641A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | BioLegend, Inc. | Anti-nkg2a agents and compositions and methods for making and using the same |
EP4240767A1 (de) | 2020-11-06 | 2023-09-13 | Amgen Inc. | An cd3 bindende polypeptidkonstrukte |
BR112023008629A2 (pt) | 2020-11-06 | 2023-10-03 | Amgen Inc | Construtos de polipeptídeos que se ligam seletivamente a cldn6 e cd3 |
TW202233678A (zh) | 2020-11-06 | 2022-09-01 | 德商安美基研究(慕尼黑)公司 | 具有增強的剪切特徵的多肽 |
CN112480248B (zh) | 2020-11-24 | 2023-05-05 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 与cld18a2特异性结合的分子 |
CN117043181A (zh) | 2020-12-18 | 2023-11-10 | 基尼科萨制药有限公司 | 蛋白质组合物以及其产生和使用方法 |
AU2022246675A1 (en) | 2021-04-02 | 2023-10-19 | Amgen Inc. | Mageb2 binding constructs |
EP4373855A1 (de) | 2021-07-23 | 2024-05-29 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Igfr-l1-antikörper und verwendungen davon |
WO2023105087A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Tubulis Gmbh | Novel flt3 antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof in combination with tyrosine kinase inhibitors |
EP4238988A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-06 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Antikörper gegen sars-cov-2 und verwendungen davon |
WO2023173011A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Transient expression of therapeutic proteins |
WO2024059675A2 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-21 | Amgen Inc. | Bispecific molecule stabilizing composition |
US20240182596A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-06-06 | Tubulis Gmbh | Anti-napi2b antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof |
WO2024083953A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Tubulis Gmbh | Novel anti-tpbg antibody and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1338400C (en) * | 1983-08-31 | 1996-06-18 | David H. Gelfand | Recombinant fungal cellulases |
JPS62175183A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-07-31 | ジエネンコ− インコ−ポレ−テツド | 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドとその製造方法及びその製造のためのベクタ− |
EP0625577A1 (de) * | 1985-08-29 | 1994-11-23 | Genencor International, Inc. | Expression von heterologer Polypeptiden in filamentlözen Pilzen, Verfahren zu deren Herstellung und Vektoren zu deren Herstellung |
-
1986
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-
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- 1987-04-29 EP EP87303834A patent/EP0244234B2/de not_active Expired - Lifetime
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-
1995
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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