FI108358B - Trichoderman transformointi - Google Patents

Trichoderman transformointi Download PDF

Info

Publication number
FI108358B
FI108358B FI871908A FI871908A FI108358B FI 108358 B FI108358 B FI 108358B FI 871908 A FI871908 A FI 871908A FI 871908 A FI871908 A FI 871908A FI 108358 B FI108358 B FI 108358B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
trichoderma
strain
vector system
plasmid
Prior art date
Application number
FI871908A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI871908A (fi
FI871908A0 (fi
Inventor
Mogens Trier Hansen
Anu Marjukka Harkki
Jonathan Kenneth Knowles
Kaisu Milja Helena Nevalainen
Merja Elisa Penttilo
Original Assignee
Altia Group Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10597131&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI108358(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Altia Group Oy filed Critical Altia Group Oy
Publication of FI871908A0 publication Critical patent/FI871908A0/fi
Publication of FI871908A publication Critical patent/FI871908A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI108358B publication Critical patent/FI108358B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01003—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Stabilization Of Oscillater, Synchronisation, Frequency Synthesizers (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)

Description

1 108358
Trichoderman transformointi
Esillä oleva keksintö koskee vektorisysteemiä käytettäväksi 5 Trichoderman transformoinnissa, menetelmää korkea-asteiselle ilmentymiselle ja proteiinien erittymiselle Trichodermalla, yhdistelmä-DNA-vektoreita ja transformoituja Trichoderma-kantoja.
10 Rihmamaiset sienet ovat alempia eukaryootteja, joita käytetään laajalti biotekniikassa tuottamaan erilaisia fermen-tointituotteita. Sienet erittävät monia teollisesti tärkeitä entsyymejä, kuten esimerkiksi glukoamylaasia, proteaaseja, laktaasia, pektinaaseja ja glukoosioksidaasia.
15
Rihmamaisiin sieniin liittyy suuri määrä bioteknisiä etuja. Ne tuottavat yleensä suuria määriä proteiineja, viljely suuressa mitassa ei ole monimutkaista ja rihmaston erottaminen kasvuliemestä fermentoinnin jälkeen on helppoa.
20
Mesofiilinen imperfekti sieni Trichoderma reesei (aikaisem-min T. viride) (ref. 1) tuottaa entsyymejä, joita tarvitaan selluloosapitoisen biomassan konversiossa, ja on luultavasti laajimmin tutkittu kaikista sellulaasia tuottavista organis-25 meistä.
Selluloosan hydrolysoimiseksi glukoosiksi tarvitaan kolme entsyymiaktiivisuuden lajia: umpimähkäisesti pilkkovaa endo-glukanaasia (1,4-B-D-glukaani-glukanohydrolaasi, EC 3.2.1.4) 30 joka tavallisesti hajottaa substituoituja liukoisia substraatteja, eikä osoita aktiivisuutta kiteistä selluloosaa f . kohtaan; sellobiohydrolaasia (1,4-fi-D-glukaani-sellobiohydrolaasi, 35 EC 3.2.1.91), joka kykenee hajottamaan kiteistä selluloosaa, mutta joka ei sisällä aktiivisuutta selluloosan johdannaisia kohtaan, ja β-glukosidaasia (β-D-glukosidi-glukohydrolaasi, EC 3.2.1.21), joka hajottaa sellobioosia ja sello-oligosak 2 108358 karideja, jolloin syntyy glukoosia. Joidenkin näiden entsyymien välillä on osoitettu yhteistoimintaa (ref. 2-4).
Sienten sellulaaseja on puhdistettu ja karakterisoitu, ja 5 kaikilla kolmella pääentsyymityypillä on osoitettu esiintyvän monenlaisia muotoja (ref. 5). Kaksi immunologisesti erottuvaa sellobiohydrolaasia, CBH I ja CBH II, on todettu T. reesein kasvualustasta (ref. 4, 6). Viidestä kahdeksaan elektroforeettisesti erottuvaa endoglukanaasia on raportoi-10 tu, joista monilla esiintyy vaihtelevia substraattispesifi-syyksiä (ref. 7, 8, 9, 10). Kahden ekstrasellulaarisen β-glukosidaasin karakterisoinnista on raportoitu (ref. 11).
Intensiivinen kantojen kehittäminen, käyttämällä suoraa mu-15 taation ja valinnan lähestymistapaa, on menestyksellisesti tuottanut useita suurisaantoisia T. reesein mutanttikantoja (ref. 12-22). Parhaiden T. reesein mutanttien tuottaman ekstrasellulaarisen proteiinin määrä on niinkin paljon kuin 20-30 g/1 kasvulientä, mikä on enemmän kuin 50 % solun koko-20 naisproteiinista. Huomattava osa erittyvästä proteiinista käsittää sellulaaseja, joiden joukossa CBH I -komponenttia on eniten, edustaen jopa 60 % erittyvistä sellulaasipro-teiineista.
25 Shoemaker et ai. (ref. 23) ja Teeri et ai. (ref. 24) ovat < ’ kloonanneet cbhl -geenin, ja geenin koko nukleotidisekvenssi on julkaistu (ref. 23). Myös T. reesein tärkeimmän endoglu-kanaasin EG I:n geeni on kloonattu ja karakterisoitu (ref.
25, 26, 27). Muita eristettyjä sellulaasigeenejä ovat cbh2 30 (ref. 28, 29) ja eg!3 (ref. 30).
. Teollisesti tärkeisiin rihmamaisiin sieniin kohdistuva mo lekyylibiologia ei yleensä ole hyvin tunnettua. Tämä johtuu osaksi siitä, että suvullinen lisääntymiskierto ja/tai ge-35 neettinen transformaatiosysteemi puuttuvat. Äskettäin on kehitetty transformaatiosysteemit Neurospora crassalle (ref. 31), A. nidulansille (ref. 32, 33, 34) ja Ä. nigerille (ref. 35), niiden perustuessa yleensä mutantti-isännän komplemen- 3 108358 toitumiseen (täydentämiseen) vastaavalla toiminnallisella, vektorimolekyylin sisältämällä geenillä. Näistä sienistä • kuitenkin vain A. niger on tällä hetkellä teollisesti kiin nostava .
5
Sienten taksonomiassa Trichoderma luokitellaan kuuluvaksi luokkaan Fungi imperfecti (ref. 49). Fungi imperfecti on sienten keräilyryhmä, jonka jäsenillä ei ole suvullista lisääntymistä. Aspergillus-lajit kuuluvat joko Fungi imperfec-io ti -luokkaan tai askomykeetteihin riippuen siitä, muodostavatko ne suvullisia itiöitä vai eivät. Aspergillus niger kuuluu Fungi imperfecti -ryhmään, ja Aspergilluksen suvullinen muoto, Aspergillus (Emericella) nidulans, kuuluu askomykeetteihin, alaryhmään plektomykeetit. Trichoderma kuuluu 15 myös Fungi imperfecti -ryhmään; sen suvullinen muoto Hypo-crea (ref. 50), kuuluu askomykeetteihin, mutta alaryhmään pyrenomykeetit. Sukuja Aspergillus ja Trichoderma voidaan pitää taksonomisesti erilaisina.
20 Poikkeuksellisen kykynsä ansiosta erittää proteiineja kasvualustaan Trichoderma reesei on hyvä ehdokas mahdollisena isäntänä proteiinien tuottamiseen. T. reesein geneettiset tutkimukset on tähän mennessä kuitenkin melkein poikkeuksetta suunnattu sienen sellulaasin tuotto-ominaisuuksien paran-25 tamiseen, ja ainoa tekniikka, jota on käytetty hypersellulo-lyyttisten Trichoderma-kantojen kehittämiseksi, on ollut perinteistä mutageneesia ja valikointia. Yhtään transformaa-tiosysteemiä Trichodermalle ei toistaiseksi ole kehitetty.
30 Esillä olevan keksinnön pääkohteena on luoda tehokkaalla vektorisysteemillä stabiilisti transformoitu Trichoderma, jotta saataisiin aikaan heterologisten proteiinien korkean tason ilmeneminen ja erittyminen Trichodermasta tai jotta saataisiin lisätyksi homologisten proteiinien tuotantoa.
35
Esillä olevassa selityksessä ja vaatimuksissa ilmaisu "Trichoderman suhteen heterologiset proteiinit" tarkoittaa • "' 108358 4 proteiineja, joita Trichoderma ei luonnostaan tuota, kun taas "Trichoderman suhteen homologiset proteiinit" tarkoittaa proteiineja, joita Trichoderma tuottaa itse.
5 Sienten transformaatiosysteemeissä, jotka ensimmäisenä kehitettiin, nimittäin Aspergillukselle ja Neurosporalle. transformaatio suoritetaan käyttämällä protoplasteja. Transformoiva DNA liitetään tavallisesti isäntägenomiin. Seulonta-systeemin aikaansaamiseksi pysyvien transformanttien iden-10 tifioimista varten vektorisysteemin on sisällettävä toiminnallinen geeni (selektiomarkkeri), joka joko täydentää isän-tägenomissa olevaa vastaavaa mutaatiota tai tuo tullessaan aktiivisuuden, tavallisesti entsyymin, jota tarvitaan pro-totrofisen kannan kasvuun määrätyllä kasvualustalla.
15
Esillä oleva keksintö kuvaa yhdistelmä-DNA-vektorisysteemil-lä stabiilisti transformoituja Trichoderma-kantoia. Silloin kun vektorisysteemi sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua proteiinituotetta, Trichoderman transformointi tällä 20 vektorisysteemillä saa aikaan halutun proteiinin voimakkaan ilmentymisen ja erittymisen, kun transformoitua mikro-organismia kasvatetaan sopivassa kasvualustassa.
Ensimmäisessä näkökohdassaan esillä oleva keksintö antaa 25 käyttöön Trichoderma-kannan, joka on stabiilisti transformoitu vektorisysteemillä, joka käsittää a) geenin, joka koodaa haluttua proteiinituotetta, b) toiminnon, joka helpottaa geenin ilmentymistä mukaan lukien promoottorit/tehostimet, jotka on toiminnallisesti 30 kytketty toisiinsa, jotta ne voivat säädellä halutun tuotteen ilmenemistä, * c) valinnaisesti signaali/leader(esi) -sekvenssin, yhdistyneenä halutun tuotteen geenin 5'-päähän yläpuolisesti ja d) selektiomarkkerin.
35
Toisessa näkökohdassaan esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän Trichoderman transformoimiseksi, jossa sopiva • .
'108358 5
Trichoderma-kanta transformoidaan kyseisellä vektorisystee-millä.
Kolmannessa näkökohdassaan esillä oleva keksintö antaa käyt-5 töön menetelmän proteiinin tuotantoon Trichodermassa. joka menetelmä käsittää Trichoderman transformoinnin kyseisellä vektorisysteemillä, transformoidun kannan viljelemisen sopivassa kasvualustassa ja ilmentyneen ja erittyneen tuotteen talteen ottamisen kasvualustasta.
10
Esillä oleva keksintö antaa myös käyttöön menetelmän proteiinin tuottamiseen Trichodermassa. jonka menetelmän avulla vektorisysteemillä transformoitua Trichoderma-kantaa viljellään sopivassa kasvualustassa, ja ilmentynyt ja erittynyt 15 proteiini otetaan talteen kasvualustasta.
Tässä yhteydessä käytettynä ilmaisu "vektorisysteemi" sisältää yhden vektorin tai plasmidin tai kaksi tai useampia vektoreita tai plasmideja, jotka yhdessä sisältävät isäntäge-20 nomiin integroitavan DNA-informaation. Vektorit tai plasmi-dit voivat olla lineaarisia tai suljetun renkaan muotoisia molekyylejä. Vaikkakaan itsereplikoituvia plasmideja Tricho-dermalla ei tunneta tällä hetkellä, kattaa keksintö myös sellaiset itsereplikoituvat plasmidit, jos niitä sattuisi 25 löytymään myöhemmin.
Vektorisysteemi käsittää DNA-sekvenssit, jotka koodaavat toimintoja, jotka helpottavat geenin ilmentymistä mukaan lukien promoottorit, tehostimet ja transkription aloituskohdat 30 samoin kuin terminaattorit, markkerin transfoxmanttien seulomiseksi ja DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua proteii- ' : nia.
> · ·
Ilmentyneen tuotteen erittymisen varmistamiseksi halutun 35 tuotteen geeni on edullisesti varustettu pre-alueella, mikä varmistaa ilmentyneen tuotteen tehokkaan ohjautumisen solun eritysreitille. Tämä pre-alue, joka voisi olla luonnostaan esiintyvä signaali- tai leaderpeptidi tai osia siitä, leik- s 108358 6 kautuu yleensä halutusta tuotteesta erittymisen aikana, jolloin kypsä tuote voidaan eristää kasvualustasta.
Halutun tuotteen geeni voidaan saada genomisista klooneista 5 tai cDNA-klooneista. DNA-sekvenssejä voidaan myös syntetisoida.
Signaali/leadersekvenssi voi olla peräisin haluttua tuotetta koodaavan geenin signaali/leadersekvenssistä tai se voi olla 10 peräisin geeneistä, jotka koodaavat muita erittyviä proteiineja, joko Trichodermasta tai mistä tahansa muusta organis-milähteestä. Esimerkkejä signaali/leadersekvensseistä, jotka on saatu geeneistä, jotka koodaavat Trichoderman erittämää proteiinia, ovat cbhl-signaalisekvenssi tai eqll-siqnaali-15 sekvenssi tai niiden osat. Signaali/leadersekvenssejä, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka koodaavat Trichoderman suhteen heterologisia, erittyviä proteiineja, voidaan saada geeneistä, jotka koodaavat Aspergilluksen amylaaseja tai glukoamylaasia. Myös synteettisiä signaali/leadersekvenssejä 20 voidaan käyttää.
Promoottori voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, joka on transkriptionaalisesti aktiivinen Trichodermassa, ja se voi olla peräisin Trichoderman suhteen joko homologisista tai 25 heterologisista geeneistä. Esimerkkejä promoottoreista, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka koodaavat Trichoderman suhteen homologisia proteiineja, ovat cbhl-promoottori tai egll-promoottori tai niiden osat. Esimerkki promoottorista, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Trichoderman suhteen 30 heterologista proteiinia, on Aspergilluksen glukoamylaasi- promoottori. Transkription terminaattorit voivat olla peräisin samoista lähteistä kuin promoottorit. Myös synteettisiä promoottori- tai terminaattorisekvenssejä voidaan käyttää.
35 Alaa tuntevalle on selvää ja ilmeistä, että kaikkia spesifisesti mainittuja DNA-sekvenssejä voidaan modifioida muutaman emäksen korjaamisella tai poistamisella, jotka eivät ole 7 108358 välttämättömiä koodattavan tuotteen toiminnalle. Esimerkiksi DNA-sekvenssejä, jotka ovat olennaisesti samanlaisia kuin ‘ cbhl-tai egll-signaali- tai promoottorisekvenssit, voidaan käyttää niin kauan kuin ne toimivat aiotulla tavalla Tricho-' 5 dermassa. Myös geenejä, jotka koodaavat haluttuja proteiine ja, voidaan muuttaa kunhan tällä ei ole haitallista vaikutusta proteiinin aktiivisuuteen.
Erilaisia selektiomarkkereita voidaan käyttää, esim. argB 10 (A. nidulans tai T. reesei), amdS (A. nidulans), trpC
(A. nidulans), trpl (Neurospora orassa) ja pyr4 (Neurospora orassa tai T. reesei).
Isäntäkanta voi olla joko prototrofinen tai auksotrofinen 15 Trichoderma-kanta, riippuen selektiomarkkerista, jota käytetään transformointimenettelyssä. A. nidulansin amdS-geeniä voidaan käyttää, kuten osoitetaan selityksen kokeellisessa osassa, prototrofisten T. reesei -kantojen transformointiin. T. reesei kasvaa heikosti asetamidi ainoana typpilähteenä, 20 ja kasvua voi vielä inhiboida lisäämällä CsCl:a alustaan.
Kasvua asetamidilla ainoana typenlähteenä CsCl:n läsnäollessa, voidaan niin muodoin käyttää selektiossa AmdS+-transfor-manttien identifioimiseksi.
25 Jos käytetään selektiomarkkeria, joka täydentää isäntägeno-min vastaavaa mutaatiota, on konstruoitava auksotrofisiä Trichoderma-mutantteja. Auksotrofisiä Trichoderma-mutantteja voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä mutanttikantojen tuottamiseksi.
30
Auksotrofisiä Trichoderma-mutantteja, jotka tarvitsevat ura-·“ - siiliä, tryptofaania tai arginiinia kasvuun, eristettiin suodatusrikastustekniikan avulla, kuten Nevalainen on kuvaillut (ref. 36). Arginiinia tarvitsevien auksotrofien jou-35 kosta identifioitiin mutantteja, joissa oli toimimaton argB-geeni, käyttämällä minimaalimaljasarjaa, lisättynä erilaisilla arginiinin biosynteesin välituotteilla. Urasiilia tar-vitsevien mutanttien joukosta voidaan yrittää hakea kantoja, 108358 8 joilla pyr4-geeni on toimimaton, mittaamalla orotidiini-5'-fosfaattidekarboksylaasin (OMP-dekaasi) aktiivisuus myseeli-preparaateissa (ref. 37) .
5 Mutantit, joilla trpl-geeni on toimimaton, voidaan karakterisoida PRA-isomeraasi - InGP-syntetaasi -aktiivisuuden puuttumisen avulla niiden myseelistä (ref. 39). Niiden mu-tanttien trpl-ominaisuus. joilla ei esiinny entsyymiaktiivisuutta, voidaan varmistaa esim. transformoimalla ja komple-10 mentoimalla N. crassan trpl-plasmidin kanssa (ref. 40) tai A. nidulansin trpC-plasmidin kanssa (ref. 34).
Käytettävänä transformointitekniikkana on menetelmä, joka on sovellettu A. nidulansin transformointmenetelmistä (ref.
15 32, 33). Protoplasteja valmistetaan tunnetuilla menetelmillä kasvattamalla rihmastoa agarmaljoilla sellofaanin päällä, ja suspendoimalla rihmasto puskuroituun NovozymR 234 -liuokseen. Tavanomaisen NovozymR 234:n sakkaroosiliuoksen asemesta voidaan edullisesti käyttää sorbitoliliuosta. Transformoiva DNA 20 lisätään sitten protoplastiliuokseen kuten on kuvailtu yksityiskohtaisemmin selityksen kokeellisessa osassa. Transformointi suoritetaan tavallisesti yhteistransformointina, jonka avulla ei-selektoituva plasmidi yhteistransformoidaan T. reeseihin suurella frekvenssillä käyttämällä selektoitavaa 25 markkeria liitettynä toiseen plasmidiin (esim. amdS p3SR2:-ssa tai argB pSal43:ssa). Suuri osa transformanteista sisältää ei-selektoituvan plasmidin integroituneena genomiin, jos ekvimolaarisia määriä DNA:ta käytetään transformointiin. Silloin kun käytetään T. reesein argB--kantaa transformoin-30 nissa ekvimolaaristen määrien kanssa plasmideja p3SR2 ja pSal43, voidaan transformantteja saada kaksoisselektioalus-talla (minimaalialusta, asetamidi, CsCl). Vaihtoehtoisesti transformointiin voidaan käyttää yhtä plasmidia, johon on liitetty halutun geenin lisäksi myös selektiomarkkeri.
35
Transformantteja viljellään sen jälkeen sopivassa kasvualustassa. Jotta olisi mahdollista tuottaa haluttua tuotetta yk-.·*. sinkertaisessa, tarkoin määritellyssä alustassa, voidaan 9 108358 käyttää glukoosilla indusoituvaa promoottoria. Kun Tricho-dermaa kasvatetaan alustalla, joka sisältää 1 % glukoosia, estyy useimpien ekstrasellulaaristen proteiinien, mukaan lukien proteaasit, erittyminen voimakkaasti. Kun geeni, joka 5 koodaa haluttua entsyymiä, yhdistetään promoottoriin, joka ilmentyy voimakkaasti glukoosia sisältävässä alustassa, erittyy haluttu entsyymi kasvualustaan. Koska muita proteiineja ei tuoteta näissä olosuhteissa, haluttu entsyymi on pääasiallinen proteiini, joka erittyy alustaan.
10
Kun sienirihmasto poistetaan, on haluttu proteiini läsnä muodostuneessa liuoksessa hyvin puhtaassa muodossa. Tarvittaessa sitä voidaan edelleen puhdistaa hyvin helposti, koska se on melkein ainoa läsnä oleva proteiini.
15
Esillä olevaa keksintöä voidaan myös käyttää modifioimaan tai inaktivoimaan geeniä, joka tuottaa isäntäorganismin tiettyä entsyymiaktiivisuutta. Esimerkiksi sellulaasinega-tiivisia T. reesei-kantoja voidaan konstruoida. Tämä muta-20 geneesi perustuu Trichoderma reesein transformointiin plas-midilla, joka sisältää puutteellisen sellulaasigeenin. Plas-midin homologinen rekombinoituminen kromosomaalisessa sel-lulaasilokuksessa aiheuttaa T. reesein endogeenisen sellulaasigeenin insertionaalisen inaktivoitumisen. Transfor-25 mointiin käytettävä plasmidi sisältää vain osan sellulaasia » koodaavasta alueesta ja tuottaa inaktiivista proteiinia. Viereistä 5'-sekvenssiä ei sisällytetä mukaan. Lukuraamimu-taatio voidaan myös liittää typistettyyn koodaavaan alueeseen. Selektiomarkkeri (argB) tai markkeri seulontaan (IacZ) 30 voidaan liittää transformointiin käytettävään plasmidiin.
Rekombinoitumisen jälkeen markkeri tulee sijoittumaan kahden muodostuneen, puutteellisen sellulaasigeenin väliin. Menetelmän periaate esitetään kuviossa 1.
35 Esillä olevaa keksintöä valaistaan kymosiinin ja Trichoderma reesein endoglukanaasi I:n (EGI) tuottamisen avulla. Pro- ; moottori-, signaali- ja leader- ja terminaattorisekvenssit saatiin joko Aspergillus nigerin glukoamylaasigeenistä tai 10 108358
Trichoderma reesein cbhl-geenistä. Selektoitavana markkerina käytettiin A. nidulansin amdS- tai argB-geeniä.
Materiaalit 5
Plasmidit: p285 ATCC No. 20681 PCAMG91: ref. 52 pIC19R: ref. 53 10 pSal43: refs. 45 + 48 p3SR2: refs. 33 + 35 pDJB2: ref. 38 pMC1817: ref. 42 pTTOl, pTTll: ref. 28 15 pUC9, pUC13: ref. 54 pUC18, pUC19: ref. 51 pTZ19R: (Pharmacia) pAN5-4IB: ref. 55 20 E. coli -kantoja JM101, JM103, JM109 ja DH1 (ref. 51) käytetään E. colin kloonauksessa. Trichoderma reesein kantoja QM9414 (ATCC 26921) ja RUT-C-30 (ATCC 56765) käytetään sienten transformointi- ja ekspressiotutkimuksissa.
25 Trichoderman minimaalialusta:
Glukoosi 20 g (NH4)2S04 5 g ΚΗ2Ρ04 15 g 30 MgS04 0,6 g
CaCl2 0,6 g
FeS04, 7H20 5 mg
MnS04, H20 1,56 mg
ZnS04, 7H20 1,4 mg 35 CoCl2 2 mg/1 H20 * ' · 108358 11
Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuviot konstruktioista eivät ole oikeassa mittakaavassa.
Kuvio 1 esittää kromosomaalisen sellulaasigeenin inaktivoin-5 nin periaatetta.
Kuvio 2 esittää plasmidien pMS4 konstruoimista, joita käytetään T. reesein kromosomaalisen cbhl-lokuksen insertiomuta-geneesiin. Lukuraamimutaation asemaa, joka mutaatio syntyy EcoRI-kohdan inaktivoitumisen kautta, merkitään *:llä.
10 Kuvio 3 esittää plasmidin p285' proC:n konstruoimista.
Kuvio 4 esittää plasmidien pMT648 ja pMT813 konstruoimista. Kuvio 5 esittää plasmidin pMT837 konstruoimista.
Kuvio 6 esittää plasmidin pR27 restriktiokarttaa.
Kuvio 7 esittää plasmidin pAMHlOO restriktiokarttaa.
15 Kuvio 8 esittää plasmidin pAMH105 konstruoimista.
Kuvio 9 esittää plasmidien pAMH1103, pAMHHOf ja pAMHHOl konstruoimista silmukkamutageneesin avulla käyttämällä synteettisiä oligonukleotideja 0AMH1, OAMH2 ja OAMH3.
Kuvio 10 esittää linkkereitä NOR 202, NOR 203, OAMH1, OAMH2 20 ja OAMH3.
Kuvio 11 esittää plasmidien pAMH102 ja pAMH104 restriktio-karttoja.
Kuvio 12 esittää plasmidin pAMH1103 restriktiokarttaa ja : plasmidin pAMH103 konstruoimista.
25 Kuvio 13 esittää plasmidin pAMHH06 restriktiokarttaa ja ·. plasmidin pAMH106 konstruoimista.
Kuvio 14 esittää plasmidin pAMHllOl restriktiokarttaa ja plasmidin pAMHlOl konstruoimista.
Kuvio 15 esittää plasmidin pAMHHO konstruoimista.
30 Kuvio 16 esittää plasmidin pAMHlll konstruoimista, jota käytetään EGI:n ekspressioon cbhl-promoottorin toiminnan alai-sena.
Kuvio 17 esittää kymosiinin ilmentymistä T. reeseissä. Western blot. Rivi 1; puhdistettu prokymosiinikontrolli, sisäl-35 tää jonkin verran pseudokymosiinia ja kymosiinia. Rivi 2; kannan, joka sisältää pAMH102:n, kasvuliemen supernatantti. Rivi 3; kontrollisupernatantti kannasta ilman plasmideja.
«
Rivi 4; rihmastoa kannasta, joka sisältää plasmidin pAMHl02.
12 108358
KOKEELLINEN OSA
Esimerkki 1 5 T. reesein auksotrofisten mutanttikantojen indusointi, rikastaminen ja eristäminen
Auksotrofisia mutantteja, jotka tarvitsevat urasiilia, tryp-10 tofaania tai arginiinia kasvuun, eristettiin käyttäen suoda-tusrikastusta kuten Nevalainen on kuvannut (ref. 36). Käytetty mutageeni oli UV-valo. Arginiinia tarvitsevien auksot-rofien joukosta identifioitiin mutantteja, joilla oli vajavainen argB-geeni, käyttämällä minimaalimaljasarjaa varus-15 tettunä erilaisilla arginiinin biosynteesin välituotteilla (ref. 36). Sitrulliinia kasvuun tarvitsevia mutantteja pidettiin mahdollisina argB”-mutantteina. Eristettyjen mutant-tien argB~-ominaisuus varmistettiin transformoimalla ne pro-totrofisiksi käyttämällä plasmidia pSal43, joka sisälsi A^ 20 nidulansin argB-geenin (esimerkki 4).
Urasiilia tarvitsevien mutanttien joukosta etsittiin kantoja, joilla oli vajavainen pyr4-geeni. Näiden mutanttien sisältämä pyr4”-ominaisuus voidaan varmistaa transformoinnilla 25 plasmidin kanssa, joka sisälsi N. crassan pyr4-geenin (ref.
38) (esimerkki 4).
Esimerkki 2 30 Protoplastien valmistaminen
Rihmastoa kasvatettiin sellofäänilevyillä perunadekstroosi-agarmaljoilla (Difco). Rihmasto viidestä sellofaaniviljel-mästä suspendoitiin 15 ml:aan NovozymR 234 (5 mg/ml), 1,2 M 35 sorbitolissa (pH 5,6, puskuroitu 0,1 M kaliumfosfaatin avulla). Seosta inkuboitiin 1,5-2 tuntia 30°C:ssa. Protoplastit erotettiin myseelijäännöksestä suodattamalla lasisintterin läpi (huokoisuus 1), pelletoitiin 5 min g-arvolla 4000 g ja 108358 13 pestiin kahdesti liuoksella 1,2 M sorbitoli-lOniM Tris, HC1 pH 7,5.
Protoplastien parempi puhdistuminen voidaan saavuttaa käyt-5 tämällä Tilburnin et ai. (ref. 33) kuvaamaa menetelmää. No-vozymR 234 :n liuosta, 5 mg/ml, 1,2 M MgS04:ssä puskuroituna pH:ssa 5,8 käytettiin protoplastien muodostamiseksi. Inku-boinnin ja suodattamisen jälkeen protoplastisuspensio sent-rifugoitiin 4000 g 15 min ajan siten, että suspension päällä 10 oli vastaava tilavuus liuosta 0,6 M sorbitoli - 100 mM Tris, HCL, pH 7,0. Protoplastit muodostivat selvärajaisen vyöhykkeen nestekerrosten väliin. Protoplastit suspendoitiin 1 tilavuuteen liuosta 1,2 M sorbitoli - 10 mM Tris, HC1, pH 7,5, sentrifugoitiin alas ja pestiin kahdesti liuoksella 1,2 M 15 sorbitoli - 10 mM Tris, HC1, pH 7,5. Protoplastit suspendoitiin liuokseen 1,2 M sorbitoli - 10 mM CaCl2 - 10 mM Tris, HC1, pH 7,5 konsentraationa 5 x 106 - 5 x 107 protoplas-tia/ml.
20 Protoplastien elinkyky arvioitiin Trichoderman minimaali- alustalla 1 M sorbitolin ollessa osmoottisena stabiloijana.
Protoplastit maljaviljeltiin 3- %:iseen agarpintakerrokseen. Regeneraatiofrekvenssi kannalle QM 9414 (ATCC 26921) oli 40-80 %.
25 r ♦ \ Esimerkki 3 T. reesein transformointi käyttäen A. nidulansin asetamidaa-si(amdS)-geeniä 30
Plasmidia p3SR2 käytettiin transformoinnissa. Se sisälsi A. nidulansin DNA:ta, joka sisälsi kokonaisen asetamidaasira-kennegeenin amdS ja sen säätelevän alueen amdl (ref. 41 ja 33) .
20 μΐ transformoivaa DNA:ta (4-10 μg) lisättiin 200 μΙζΆΆη protoplastiliuosta. 50 μΐ liuosta 25 % PEG 6000 - 50 mM CaCl2 ί - 10 mM Tris, HC1, pH 7,5 lisättiin, ja seosta inkuboitiin 35 14 108358 20 minuuttia jäähauteessa. 2 ml PEG-liuosta lisättiin, ja seosta inkuboitiin vielä 5 minuuttia huoneen lämpötilassa. 4 ml liuosta 1,2 M sorbitoli - 10 mM CaCl2 - 10 mM Tris, HC1, pH 7,5 lisättiin, ja protoplastit maljättiin 3- %:isessa 5 agarpäällyskerroksessa. Selektiivinen alusta oli Trichoder-man minimaalialusta, jossa oli 10 mM asetamidia ainoana ty-penlähteenä (NH4)2S04:n asemesta ja johon oli lisätty 1 M sorbitolia osmoottiseksi stabilaattoriksi ja 12,5 mM CsCl:a taustakasvun ehkäisemiseksi.
10
Transformointifrekvenssit 40-600 transformanttia per μg DNA saatiin kannalle QM 9414 (ATCC 26921). Suurimmat frekvenssit saatiin silloin kun DNA oli puhdistettu kahdella CsCl/etidi-umbromidisentrifugointisyklillä.
15
Sporulointia todettiin harvoin selektiivisellä alustalla, mutta transformantit itiöivät normaalisti siirrettäessä pe-runadekstroosiagarille. Niiden kyky kasvaa asetamidilla vaihteli. Pesäkkeiden halkaisijat selektiivisellä alustalla 20 olivat alueella 1 mm - 10-20 mm.
Transformanttien mitoottista stabiilisuutta tutkittiin. Kymmenen suurta toisistaan eroavan kokoista transformanttia eri kokoisten joukosta viljeltiin edelleen asetamidi-CsCl -mal-25 joilla, saatettiin itiöimään perunadekstroosilla (PD) ja maljaviljeltiin edelleen PD:llä. Heterokaryoosin aiheuttaman heterogeenisuuden pois sulkemiseksi, testattiin yksittäisiä pesäkkeitä, jotka olivat saaneet alkunsa yhdestä itiöstä, AmdS+-fenotyypin suhteen. Yksi positiivinen klooni kustakin 30 alkuperäisestä transformantista maljaviljeltiin perättäisestä (5 kasvusykliä) ei-selektiivisellä alustalla, ja feno-V tyyppi testattiin jokaisen sukupolven jälkeen selektiivisellä alustalla. Kymmenestä testatusta suuresta transformantista, yhden syklin jälkeen ei-selektiivisellä alustalla, kuusi 35 kymmenestä transformantista tuotti 100 % AmdS+-itiöitä, kolme 47-87 %, ja yksi transformantti ei tuottanut yhtään AmdS+-itiöitä. Tämä tulos säilyi samana kautta viiden ei- a a . a · 108358 15 selektiivisen kasvusyklin, viitaten siihen, että alunperin epästabiili AmdS+-fenotyyppi voidaan stabiloida myöhemmin.
Kymmenestä alkuperäisestä pienestä pesäkkeestä kolme tuotti 5 itiöitä, joissa AmdS+-fenotyypin esiintymistiheys vaihteli (94 %, 44 % ja 5 % itiöistä). Muut seitsemän kloonia tuottivat vain itiöitä, jotka eivät kyenneet kasvamaan asetami-dilla. Mielenkiintoista kyllä, kaikki AmdS+-itiöt, joita saatiin, kasvoivat voimakkaasti asetamidimaljoilla, mikä oli 10 ominaista suuripesäkkeisille transformanteille.
Transformanteissa olevan plasmidi-DNA:n läsnäoloa analysoitiin Southern-hybridisaation avulla kokonais-DNA:sta, joka oli eristetty transformanteista (Raederin ja Brodan mukaan, 15 ref. 43), katkaistu XhoI:llä tai Sällillä ja EcoRI:llä. Vektoria pUC18 ja Sali-EcoRI -fragmenttia, joka sisälsi plasmi-din p3SR2 amdS-geenin, käytettiin koettimina. Transformaation osoitettiin tapahtuneen rekombinaation kautta monissa eri paikoissa Trichoderman genomisessa DNA:ssa, yhdestä useam-20 paan kopiota genomia kohti.
Esimerkki 4 T. reesein transformointi A. nidulansin ja N. crassan plas-25 mideilla 9
Auksotrofisten mutaatioiden komplementaatio T. reeseissä heterologisella DNA:11a osoitettiin. Plasmidia pSal43, joka sisälsi A. nidulansin argB-geenin, käytettiin transformoi-30 taessa T. reesein argB'-mutanttikantoja. Trans formant te ja valikoitiin minimaalialustalla ilman arginiinia. Transfor-maatiofrekvenssi oli suunnilleen 300 (150 - 400) transfor-manttia/jug DNA:ta. Plasmidia pDJB2, joka sisälsi pyr4-geenin N. crassasta. voitiin käyttää transformoitaessa T. reesein 35 pyr4'-mutanttikantoja käyttämällä seulonnassa minimaalialus- taa ilman urasiililisäystä.
. »· a l » 16 108358
Kromosomaalista DNA:ta eristettiin transformanteista ja käytettiin Southern-hybridisaatiokokeisiin plasmidi-DNA:n oikean integroitumisen varmistamiseksi T. reesein kromosomaa-liseen DNA:hän. pSal43:n monta peräkkäiskopiota oli integ-5 roituneena genomissa. Southern- ja "dot blot" -hybridisaati-ot osoittivat, että analysoiduissa transformanteissa argB:n kopiomäärä vaihtelee suunnilleen kahdesta yli sataan. ArgB+-transformanttien osoitettiin olevan fenotyyppisesti 100- %: isesti stabiileja vähintään 3 sukupolven ajan. Tämä testat-10 tiin viidestä transformantista itiöiden peräkkäisillä malja-viljelyillä ei-selektiivisellä alustalla ja testaamalla sen jälkeen Arg+-fenotyyppi minimaalialustalla (50-80 pesäkettä/ transformantti).
15 Esimerkki 5 T. reesein yhteistransformointi amdS- ja argB-plasmideilla
Mahdollisuus kotransformoida Trichoderma ei-selektoituvalla 20 plasmidilla osoitettiin ensiksi arginiinin suhteen auksotro- fisella mutantilla.
T. reesein argB'-kanta transformoitiin yhtä suurilla molaari-silla määrillä A. nidulansin plasmideja pSal43 (argB) ja 25 p3SR2 (amdS), transformantteja valikoitiin ArgB+-fenotyy-*. pin suhteen ja testattiin amdS:n siirtymisen osalta viljelemällä asetamidi-CsCl-maljoille. ArgB+-transformanteista 86 % oli myös AmdS+. Yhteistransformanttien Southern-analyysi osoitti, että molempia plasmideja oli integroitunut vaihte-30 levinä kopiomäärinä useissa eri kohdissa genomia (tuloksia ei esitetä).
Kaksoisvalikoinnissa minimaali-asetamidi-CsCl-alustalla oli tuloksena 100 suurta AmdS+Arg+ - transformanttia per μg DNA:-3Ξ ta ja joukko pieniä pesäkkeitä, mikä on ominaista amdS-transformaatiolle.
, »· 17 108358
Kun argB amdS -yhteistransformanttien ArgB+-fenotyypin sta-biilisuutta testattiin, osoittautui kolme viidestä 100 % stabiiliksi, kun taas muut olivat menettäneet ArgB+-ominai-suuden 7 %:ssa tai 80 %:ssa analysoiduista jälkeläisistä.
5 Samat yksittäiset pesäkkeet olivat menettäneet myös AmdS+-fenotyypin. Sitä, aiheuttiko tämän epästabiilisuuden esim. argB:n yhteisintegroituminen amdS:n kanssa samaan kromoso-maaliseen paikkaan, ei tiedetä.
10 Plasmidia pAN5-4IB, joka sisältää E. colin IacZ-geenin kytkettynä oikeassa lukuraamissa A. nidulansin glyseraldehydi-fosfaattidehydrogenaasigeenin (gpd) (ref. 55) promoottoriin ja N-terminaalista proteiinia koodaavaan alueeseen, käytettiin myös kotransformointiin. Tämä plasmidi sisältää lisäksi 15 A. nidulansin argB-geenin ja pBR322-sekvenssejä. Prototrofi-nen T. reesei (QM 9414) kotransformoitiin plasmideilla p3SR2 (amdS) ja pAN5-4IB, transformantteja valikoitiin AmdS+-feno-tyypin suhteen ja seulottiin B-gal:n ekspression osalta ase-tamidi-CsCl-maljoilla, jotka sisälsivät Xgal:a. T. reesein 20 endogeenista β-galaktosidaasiaktiivisuutta ei voitu havaita silloin, kun glukoosia oli läsnä alustassa, ja Xgal-maljojen pH oli neutraali.
1-4 kasvatuspäivän jälkeen sininen väri oli nähtävissä. Kun 25 transformaatiossa käytettiin plasmidien (p3SR2/pAN5-4IB) mo- laarista suhdetta 1,0/0,7, β-galaktosidaasiaktiivisuutta esiintyi 13 %:ssa suuria ja 6 %:ssa pieniä AmdS+-klooneja, molaarisen suhteen ollessa 1,0/2,6, saatiin 39 % ja 7 % Xgal+-klooneja, vastaavasti. Molempien plasmidien läsnäolo 30 AmdS+-transformanteissa, jotka olivat väriltään siniset, varmistettiin Southern-hybridisaation avulla (tuloksia ei esi- ·" tetty) .
35 Esimerkki 6 . . cbhl”-Trichoderma reesei -kannan konstruointi. Eri sellulaa- • —— I — III.» — • l sigeenien inaktivointi kuvatulla tavalla tekee mahdolliseksi 18 i 08 358 konstruoida sarjan T. reesei -kantoja, jotka tuottavat tietyn yhdistelmän sellulaaseja. cbhT-kannat ovat myös tärkeitä heterologisten proteiinien tehokkaan tuottamisen kannalta, kun käytetään cbhl-promoottoria. Trichoderma reesein kannan 5 QM 9414 (ATCC 26921) osoitettiin sisältävän vain yhden cbhl-geenin kromosomaalisen kopion Southern-hybridisaation avulla käyttäen cbhl-spesifisiä koettimia, ja siten yhden rekombi-naatiotapahtuman pitäisi inaktivoida geeni. Inaktiivinen geeni konstruoitiin seuraavasti. Plasmidi pTTOl (ref. 28), 10 joka sisälsi cbhl-geenin täyspitkän cDNA:n kloonin vektorissa pUC8, katkaistiin restriktioentsyymeillä Bgll ja BcrIII.
0,8 ke:n kappale cbhl-geenin 5'-terminaaliselta alueelta eristettiin agaroosigeeliltä tavanomaisilla menetelmillä. Kappaleesta tehtiin tasapäinen käyttämällä Sl-nukleaasia, ja 15 se ligoitiin EcoRI:llä katkaistuun, tasapäiseen pUC18-vekto-riin ja transformoitiin E. coliin JM 109. cbhl-geeni fragmen-tin sisältävästä kloonista eristettiin DNA ja katkaistiin se restriktioentsyymillä EcoRI. joka katkaisee cbhl:n Ball -Bglll -fragmentin keskeltä. EcoRI:n tuottamat päät täytet-20 tiin ja takaisinligoitiin. Muodostui plasmidi pMS4, joka sisältää lukuraamimutaation keskellä katkaistua cbhl-geenin fragmenttia (kuvio 2).
Trichoderma yhteistransformoitiin plasmidilla pMS4 ja A. ni-25 dulansin amdS:n sisältävällä plasmidilla p3SR2, plasmidin pMS4 molaarisen ylimäärän ollessa 3-4-kertainen.
Transformantteja valikoitiin AmdS+-fenotyypin perusteella kuten kuvattiin (esimerkki 3) ja puhdistettiin selektiivi-30 sellä alustalla, joka sisälsi asetamidia ainoana hiilenläh-teenä. Puhdistettuja transformantteja kasvatettiin mikro-tiitterilevyillä 200 ^l:ssa Trichoderman minimaalialustaa, jossa oli 1 % Solka floc -selluloosaa hiilenlähteenä ja 0,2 % proteoosipeptonia typenlähteenä. Sellulaasifenotyyppi tes-35 tattiin Ouchterlony-immunodiffuusion avulla käyttämällä laimentamat tornia kasvualustoja CBHI -spesifistä antiseerumia (lammas) vastaan, kuten on kuvailtu (ref. 56). Muutamia I 08358 19 transformantteja identifioitiin, jotka tuottivat CBH II:ta mutta ei lainkaan havaittavaa CBH I:tä.
Esimerkki 7 5 I. Plasmidin 285'proC valmistaminen, joka plasmidi sisältää prokymosiinigeenin (kuvio 3)
Esimerkkinä heterologisesta proteiinista T. reeseissä välit-10 tiin ilmennettäväksi prokymosiinin cDNA (kuvio 3). Preproky-mosiinigeeni eristettiin cDNA-kirjastosta, joka oli valmistettu käyttäen vasikan mahasta eristettyä lähetti-RNA:ta. Preprokymosiinigeeni liitettiin pBR322:n Pstl-katkaisukoh-taan päiden G-C-käsittelyn avulla (ref. 46 ja 47), jolloin 15 saatiin pR26. pUC9 katkaistiin Sällillä ja täytettiin Kle-now-polymeraasin avulla ja ligoitiin T4-ligaasin avulla. Saatu plasmidi katkaistiin BamHI-EcoRI:llä. ja 2,7 kein suuruinen fragmentti ligoitiin 0,47 kein pR26:sta peräisin olevan BamHI-EcoRI- fragmentin kanssa, jolloin muodostui pUC9', 20 joka sisälsi Hindlll-katkaisukohdan prokymosiinigeenin N-terminaalisella puolella. pUC13 katkaistiin BamHI-Narl:11a ja Narl-Xmal:11a. ja suurta fragmenttia vastaava pieni fragmentti ligoitiin 0,64 kein pR26:sta peräisin olevan Xmal-Bcll-fragmentin kanssa, jolloin saatiin plasmidi pUC13', 25 joka sisälsi Xbal-kohdan prokymosiinigeenin C-terminaalisel- *: la puolella. pUC13':n 0,65 kein Snal-Xbal-fragmentti ligoi tiin pUC9':n 0,46 kein Hindlll-Xmal-fragmentin ja p285:n 11 kein Xbal-Hindin-fragmentin kanssa, jolloin muodostui plasmidi p285' proC, joka sisältää prokymosiinigeenin kuten on 20 kuvattu kuviossa 3.
II. Plasmidin pAMG/Term konstruointi pCAMG91 katkaistiin Sali- ja PstI-restriktioendonukleaaseil-35 la. Tällaisesta seoksesta eristettiin 698 emäsparin fragmentti agaroosigeelillä. Tämä Sali-PstI-fragmentti sisältää alueen, joka koodaa glukoamylaasin mRNAm 140 epin ei-trans-loitua 3'-osaa plus 540 epitä poly(A)-lisäyspaikan 3'-puo- 20 1 08358 lella. Tätä 3'-fragmenttia käsiteltiin T4-DNA-polymeraasilla restriktioentsyymien katkaisukohtien päiden tasaamiseksi ennen Xbal-linkkereiden lisäämistä ja katkaisua Xbal-restrik-tioentsyymillä. Tämä glukoamylaasigeenin 3'-pää ligoitiin 5 Xbal:llä linearisoituun pUC13:een plasmidin mÄMG/Term luomiseksi, joka sisältää glukoamylaasigeenin poly(A) alueen.
III. Plasmidin pMT837 konstruointi 10 pCAMG91:n 0,5 ke:n Small-BssHII-fragmentti, joka sisältää promoottorin ja sekvenssit, jotka koodaavat glukoamylaasin (AMG) signaali- ja leaderpeptidiä, ligoitiin Smal-BamHI:llä katkaistuun pUC13:een ja synteettiseen BssHII-BamHI-adapto-riin, joka koodaa prokymosiinin kuutta ensimmäistä aminohap-15 poa. Muodostuneesta plasmidista, pMT626, eristettiin 0,8 ke:n Ndel-BamHI-fragmentti ja ligoitiin p285'proC:n 0,5 ke:n BamHI-EcoRI-fragmenttiin, joka sisältää proC:n N-terminaali-sen puoliskon sekvenssin, ja pMT622:n 3,0 ke:n EcoRI-Ndel-fragmentiin, joka sisältää proC:n C-terminaalisen osan sek-20 venssin. (pMT622 on p285'proC:n EcoRI-Xbal-klooni pUC13:-ssa). Muodostunut plasmidi pMT648 (katso kuvio 4) sisältää koko prokymosiinigeenin, jota edeltävät AMG-promoottori ja koodaavat signaali/leadersekvenssit. pMT648:aa modifioitiin edelleen niin, että se sisältää A. nidulansin argB-geenin 25 (ref. 48). pMT648:n 1,8 ke:n Narl-täytetty Xbal-fragmentti v ligoitiin pSal43:n 6,8 ke:n Clal-täytetty EcoRI-fragment- tiin, jolloin saatiin pMT651. AMG-promoottorista kauempana yläpuolella olevat sekvenssit (yläpuoliset aktivoivat sekvenssit; UAS:t) liitettiin lisäksi. Tämä saatiin aikaan li-30 goimalla 3,7 ke:n Clal-BssHII-fragmentti alkuperäisestä pCAMG91-kloonista pMT648-plasmidista saatuun 1,1 ke:n BssHII:11a täytetty Xbal-fragmenttiin, joka sisältää proC-sekvenssit; ja argB-geeniin 3,1 ke:n Clal-täytetty EcoRI-fragmenttina pMT813-plasmidista (pMT813 sisältää argB-geenin 35 kloonattuna 3,1 ke:n BamHI-NruI-fragmenttina EcoRV-Bglll:11a katkaistuun pIC19R-plasmidiin). Muodostunut plasmidi, . . pMT830, sisältää ekspressioyksikön, joka sisältää UAS:t, promoottorin, signaali- ja leadersekvenssit AMG:stä ja koko 21 108358 proC-geenin. Lopuksi AMG: n terminaattorisekvenssi otetaan plasmidista pAMG/Term 0,6 ke:n Xbal-Xbal-fragmenttina ja liitetään Xbal:llä katkaistuun ja defosforyloituun plasmi-diin pMT830, jolloin saadaan pMT837. pMT837:.i konstruointi 5 on kuvattu kuviossa 5.
Esimerkki 8
Kymosiinin tuottaminen käyttäen pMT837:ää 10 T. reesei -kannat QM 9414 ja RUT-C-30 yhteistransformoitiin plasmideilla pMT837 ja p3SR2. Plasmidi pMT837 sisältää pro-kymosiinigeenin, jota edeltävät AMG-promoottori ja signaa-li/leadersekvenssi. Plasmidin pMT837 rakentaminen kuvattiin 15 esimerkissä 7 (katso myös kuviot 3-5) . Yhteistransformointi ja seulonta suoritettiin kuten esimerkissä 5.
Kymosiinin tuotantoa varten transformantteja kasvatettiin minimaalialustassa, joka sisälsi 1 % Solka fl.c.c -selluloosaa 20 ja 0,2 % proteoosipeptonia.
Rihmastot kerättiin talteen, ja tarvittaessa supernatantti konsentroitiin TCA-saostuksella ja liuotettiin 2M NaOH 10 mM Tris (pH 8,5) -liuokseen. Näytteet ajettiin SDS-PAGE-gee-25 Iissä (7,5 % - 15 % polyakryyliamidigradientti) ja siirret-tiin nitroselluloosafiltterille (Western blot). Filttereitä inkuboitiin kanin prokymosiiniantiseerumin kanssa, ja ne värjättiin 4-kloori-l-naftolilla käyttäen a-kani-IgG-perok-sidaasi-konjugaattia Sigmalta.
30
Kymosiinia osoitettiin erittyvän alustaan suunnilleen 1 μ9/1· Koska AMG-promoottori toimii selvästi tehottomasti T. reeseissä. rakennettiin homologisia T. reesein promoottori-terminaattorivektoreita kymosiinin tuotantotason parantami-35 seksi.
>1 · 22 1 08358
Esimerkki 9
Heterologisten ekspressiovektoreiden rakentaminen vasikan prokymosiinin tuottamiseksi T. reeseissä käyttäen cbhl-pro-5 moottoria.
I. Prokymosiinigeenin yhdistäminen cbhl-terminaattorialueeseen 10 Vasikan prokymosiinigeeni saatiin plasmidista pR27 (kuvio 6). Pstl-PstI-kappale (~ 1110 emäsparia), joka sisälsi melkein koko geenin, eristettiin agaroosigeeliltä tavanomaisilla menetelmillä, ja liitettiin pUC19-plasmidin Pstl-katkai-sukohtaan.
15 Tämä plasmidi katkaistiin osittain Pstl:llä, päät tasattiin Sl-nukleaasilla, ja cbhl-geenin Avail-terminaattorifragment-ti (~ 750 ep tasaiset päät tehty Klenow'n fragmentin avulla) ligoitiin tähän plasmidiin. cbhl-geenin terminaattorialue 20 saatiin pBR322:ssa kloonatun cbhl DNA:n terminaalisesta 1,8 ke:n BamHI-fragmentista (ref. 24). Tämä plasmidi, joka sisältää J_proC-fragmentin liittyneenä cbhl-geenin terminaatto-rialueeseen pUC19:ssa, nimettiin pAMH100:ksi (kuvio 7).
25 II. cbhl-promoottorialueen ja prokymosiinia koodaavan alueen yhdistäminen käyttäen Bgll-SacII-adaptoria
SacII-PstI-fragmentti (80 ep), joka koodaa prokymosiinin N-terminaalista aluetta, eristettiin plasmidista pR27 (katso 30 kuvio 6). cbhl-promoottorialue kloonattiin ensin genomises-ta kloonista \44A 2,8 ke pitkänä EcoRI-EcoRI- fragmenttina plasmidiin pUC18 (plasmidi pUAOl, kuvio 8), ja sen jälkeen ~ 2,2 ke pitkä EcoRI-Bgll-fragmentti eristettiin tästä ala-kloonista. BglI-katkaisukohta sijaitsee keskellä cbhl-geenin 35 signaalisekvenssiä. ~ 2,2 ke:stä pitkän EcoRI-Bgll-fragmen-tin, joka sisältää promoottorin ja noin puolet cbhl-geenin signaalipeptidiä koodaavasta alueesta, tarkkaa liittämistä ~ 80 emäsparin SacII-Pstl-prokymosiinifragmer.ttiin välittää 23 108 358
Bgll-SacII-adaptori (NOR202 + NOR203, kuvio 10). Nämä fragmentit yhdessä adaptorin kanssa ligoitiin pUC19:ään, joka oli katkaistu EcoRI-PstI:llä. Tämä plasmidi koodaa CBH I:n kokonaista signaalisekvenssiä liitettynä prokymosiinin en-5 simmäiseen aminohappoon, jota seuraavat muutamat sen N-ter-minaaliset nukleotidit. Lopuksi tästä konstruktiosta eristettiin EcoRI-pcbhl ss-proC-Pstl-fragmentti, ligoitiin 3'-päästään plasmidiin pAMHlOO, joka oli katkaistu Sällillä ja Pstlillä. Fragmentin 5'-pää ja plasmidin pAMHlOO EcoRI-pää 10 täytettiin Klenow'in avulla ja ligoitiin. Näin ollen cbhl-geenin promoottori ja proC1-fragmentti siirrettiin 'proCin edellä, jota seurasi cbhl-terminaattorialue. Konstruktiolle annettiin nimi pAMH102 (kuvio 11).
15 III. Selektoituvan markkerin lisääminen kymosiinin ekspres-sioplasmidiin
Selektoivana markkerina ekspressioplasmideissa voidaan käyttää joko A. nidulansin amdS-geeniä (ref. 41, 35) tai A^ 20 nidulansin argB-geeniä (ref. 45) .
AmdS-geeni eristettiin Pjml-Sali-fragmenttina p3SR2:sta ja ligoitiin 6 ke pitkään PvuI-Sall-fragmenttiin pAMH102:sta. Tätä selektoitavaa vektoria nimitettiin pAMH104:ksi (kuvio 25 11).
IV. cbhl-promoottorin ja preprokymosiinia koodaavien sekvenssien tarkka yhteenliittäminen käyttäen oligonukleotideja 30 Preprokymosiinin aminoterminaalinen PstI-kappale (~ 150 ep) eristettiin pR26:sta (kuvio 3), joka sisältää täydellisen preprokymosiinin cDNA-kloonin, alkaen 12 emäsparia ATGin yläpuolelta, liitettynä Pstl-katkaisukohtaan pBR322:ssa.
Tämä fragmentti kloonattiin pTZ19R:n polylinkkeriin yhdessä 35 cbhl EcoRI-SacI (~ 2,6 kb) -promoottorifragmentin kanssa, joka myös sisältää cbhl:n signaalisekvenssiä koodaavan alu- 24 1 08358 een (kuvio 8). cbhl EcoRI-SacI -fragmentti saadaan alkuperäisen ^44A-kloonin (ref. 24) 2,8 ke:n EcoRI-EcoRI-kloonista pUC18:ssa (pUAOl, kuvio 8). pTZ19R (Pharmacia) on pUC19-pe-räinen plasmidi, joka sisältää replikaation Fl-aloituskohdan 5 ja T7-promoottorin, joka mahdollistaa ss-templaatin (yksi-juosteinen) käyttämisen oligonukleotidimutageneesiin (ref. 44). Muodostuneen plasmidin rakentaminen (pAMH105) on kuvattu kuviossa 8. Tästä plasmidista poistettiin sekvenssit cbhl-promoottorialueen ja proC ATG:n välistä silmukkamuta-10 geneesin avulla käyttäen spesifistä oligonukleotidia, OAMH 3 (kuvio 10). Oligonukleotidin ohjaamaa mutageneesia esitetään kuviossa 9. Kyseessä oleva oligonukleotidi fosforyloitiin, liitettiin ss pAMH105 DNA:han (ref. 57, ss-DNA eristettiin JM103/pAMH105:stä kuten Pharmacia on kuvannut) molaarisessa 15 suhteessa 20:1. Oligonukleotidialuketta pidennettiin käyttämällä Klenow-polymeraasia ja T4-ligaasia kuten kuvataan referenssissä 57. Pidennettyjen alukkeiden seos katkaistiin Smal:llä (sijaitsee pTZ19R:n polylinkkerissä, katso kuvio 9) ennen transformointia E. coli -kantaan, joka on mutL "mis-20 match repair deficient" -kanta BMH71.18 (ref. 58). Transfor-mantteja kasvatettiin yli yön 5 mlrssa nestemäistä viljelmää (Luria-liemi, kuten kuvattiin referenssissä 55, 100 μg/ml ampisilliinin kanssa). Plasmidi-DNA:ta eristettiin transfor-manttijoukosta, ja se katkaistiin uudelleen Smal:llä ja ·; 25 transformoitiin E. colin JM 109 -kantaan. Potentiaalisten deleetiokloonien seulonta suoritettiin käyttäen erilaisia restriktioentsyymejä, ja deleetion spesifisyys varmistettiin sekvensoimalla. Muodostunutta plasmidia nimitettiin pAMH-1101:ksi (kuvio 14). Tämä plasmidi katkaistiin EcoRI:llä ja 30 PstI:llä, ja muodostunut pcbhl-preproC-fragmentti eristet- 1 tiin (kuvio 14) ja ligoitiin PstI-päästään PstI:llä ja
Sali:llä katkaistuun plasmidiin pAMHlOO. Muodostuneen li-goidun fragmentin päät tasoitettiin Klenow'in avulla ja ligoitiin. Syntynyt plasmidi pAMHlOl sisältää cbhl-promootto-35 rialueen liitettynä prokymosiinin signaalisekvenssiin ja kokonaisen prokymosiinin koodaavan alueen liitettynä cbhl- V. geenin terminaattorialueeseen (kuvio 14).
25 1 08358 V. cbhl-promoottorin ja preproC-qeenin tarkka yhteenliittäminen signaalisekvenssiliitoksien avulla käyttäen oligonuk-leotideja 5
Plasmidi pAMH1103 (kuvio 12) rakennettiin pääpiirteissään kuten pAMHHOl, joka kuvattiin yksityiskohtaisesti edellä olevassa luvussa IV. PAMH1103:n rakentamisessa käytetty spesifinen oligonukleotidi oli OAMH1 (kuviot 10 ja 9). Muodos-10 tunut plasmidi pAMH1103 sisältää signaalisekvenssiliitoksen, johon kuuluvat aminohapot (aa) 1-12 cbhl-signaalisekvessistä liitettynä aminohappoihin 12-16 preproC-signaalisekvenssis-tä, joka edeltää proC-geenin (kuvio 12) koodaavan alueen aminoterminaalista osaa (~ 140 bp). pcbhl-sso-proC' (o = yh-15 teenliittyminen) -fragmentti plasmidista pAMH1103 kloonattiin pAMH100:aan pääpiirteissään kuten kuvattiin edeltävässä luvussa IV (katso kuvio 12). Muodostunut plasmidi pAMHl03 sisältää cbhl:n promoottorialueen, cbhl:n ja preproC:n sig-naalisekvenssit yhteenliitettyinä, proC-koodaavan alueen ja 20 cbhl-terminaattorialueen.
VI. cbhl-koodausalueen tarkka yhteenliittäminen proC-koo-dausalueeseen käyttämällä oligonukleotideja 25 Plasmidin ρΑΜΗΙΙΟβ (kuvio 13) konstruointi suoritettiin oleellisesti siten kuin plasmidin pAMHllOl, jota kuvattiin yksityiskohtaisesti edeltävässä luvussa IV sillä poikkeuksella, että tähän konstruointiin käytetty spesifinen oligonukleotidi oli OAMH2 (kuviot 10 ja 9). Muodostuneesta plas-30 midista ρΑΜΗΙΙΟβ, joka sisältää cbhl:n promoottorialueen, cbhl:n signaalisekvenssin ja kypsän CBHI:n ensimmäisiä 1-20 aminohappoja koodaavan alueen yhtyneenä proC;n koodaavaan alueeseen; fragmentti, joka sisältää pcbhl-kypsä o-proC':n kloonattiin pAMH100:aan olennaisesti siten kuin kuvattiin 35 edellä olevassa kappaleessa IV (kuvio 12). Muodostunut plasmidi pAMH106 sisältää cbhl:n promoottorialueen, cbhl:n sig • . naalisekvenssin, kypsän CBHI:n aminohappoja 1-20 koodaavan alueen yhtyneenä proC:n koodaavaan alueeseen.
26 108358
Esimerkki 10
Kymosiinin tuottaminen käyttäen plasmideja pAMH102 ja PAMH104 5 T. reesein kannat QM 9414 ja RUT-C-30 yhteistransformoitiin plasmideilla pAMH102 ja p3SR2 molaarisessa suhteessa 5:1. Plasmidin pAMH102 konstruointia kuvattiin esimerkin 9 luvussa II. Yhteistransformointi ja valikointi suoritettiin esimerkin 5 mukaisesti. Transformantit puhdistettiin selektii-10 visillä asetamidimaljoilla kuten kuvattiin esimerkissä 3.
Kymosiinin tuottamiseksi transformantteja viljeltiin mini-maalialustalla (10 - 50 ml), joka sisälsi 1 % Solka floc -selluloosaa ja 0,2 % proteoosipeptonia. Rihmastot kerättiin 15 talteen, ja supernatantti konsentroitiin TCA-saostuksella ja liuotettiin 2M NaOH-lOmM Tris -liuokseen (pH 8,5). Rihmastot hajotettiin nestetypessä, rikotut solut pelletoitiin, ja supernatanttia käsiteltiin samalla tavalla kuin kasvualustaa. Näytteet ajettiin SDS-PAGE-geelissä (7,5 % - 15 % po-20 lyakryyliamidigradientti) ja proteiinit siirrettiin nitro-selluloosafiltterille (Western blot). Filttereitä inkuboi-tiin kanin prokymosiiniantiseerumin ja «-kani-IgG-Ap(alkali-nen fosfataasi)-konjugaatin kanssa ja värjättiin nitro-sini-nen-tetratsoliumilla ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaa-25 tiliä, Promega Biotec'iltä. Kymosiinin määrää rihmaston sisä- ja ulkopuolella vertailtiin (kuvio 17). Southern-hybri-disaation avulla osoitettiin, että kloonit, jotka sisälsivät suurempia plasmidin pAMH102 kopiomääriä integroituneina sienen kromosomaaliseen DNA:hän, tuottivat myös enemmän kymo-30 siinia. Käytettäessä yhden kopion transformanttia, oli erittyvän kymosiinin määrä 100 μg/l kasvualustaa arvioituna Wes-tern-filttereistä (kuvio 17). Erittyvän kymosiinin osoitettiin Western-filttereiden ja maidon juoksuttumisaktiivisuu-den määrittämisen avulla prosessoituvan aktiiviseksi kymo-35 siiniksi (kymosiini juoksuttaa maidon katkaisemalla β-kase-iinin (ref. 60). Erilaisten kymosiinin muotojen määrän (pre proC, proC, C ja kymosiiniperäiset hajoamistuotteet solun I 08358 27 sisällä) rihmaston sisällä määritettiin olevan 0,04 % rihmaston kokonaisproteiinista (kuvio 17), ja erittyvän kymo-siinin määrä oli 60 % tuotetusta kokonaiskymosiinista. Tämä osoittaa T. reesein tehokkuuden erittää jopa heterologisia 5 geenituotteita rihmaston ulkopuolelle. Transformantteja, joissa oli useita plasmidin pAMH104 kopioita (kuvio 11), jotka kykenevät erittämään suurempia määriä prokymosiiniä, seulottiin määrittämällä maidon juoksuttumisaktiivisuus kasvualustasta. Parhaan transformantin, 40:stä tutkitusta, to-10 dettiin erittävän 500 ^g/l kasvualustaa määritettynä Wes tern- filttereistä ja maidon juoksuttumisaktiivisuuden avulla.
Koska erittyvän, aktiivisen kymosiinin määrä lisääntyi 200-15 kertaisesti, kun viljelmiä kasvatettiin 5 l:n laboratorio- fermenttorissa verrattuna pienimittaisiin viljelyihin (10-50 ml), tällä kantatyypillä tuotetun kymosiinin määrä on suunnilleen 100 mg/1.
20 Esimerkki 11
Yleisekspressiovektorin konstruointi homologisten ja hetero-logisten proteiinien tuottamiseksi T. reeseissä.
25 Jotta kyettäisiin konstruoimaan vektoreita erilaisten prote-*· iinien tuottamiseksi T. reeseissä. konstruoitiin yleisvekto- ' Λ ri, joka sisältää cbhl-geenin promoottori- ja terminaattori-alueet. cbhl-terminaattori kloonattiin yhdessä adaptorin kanssa, joka sisältää STOP-kodonin TAA kolmessa lukuraamis-30 sa, pUCl9:n PstI-katkaisukohtaan. josta oli r.nloksena plas-midi pAMHHO' (kuvio 15). PstI-terminaattorifragmentti eristettiin pAMHHO':sta, cbhl-promoottorialue eristettiin pAMH-102:sta EcoRI-PstI-fragmenttina sisältäen proC-geenin amino-pään, ja nämä fragmentit kloonattiin EcoRI-PstI-katkaistuun 35 pUC19*:iin, jonka ainoa Ndel-kohta oli tasattu Klenowilla ennen tätä kloonausvaihetta. Muodostunut plasmidi pAMHHO sisältää cbhl-geenin promoottorin ja terminaattorin, ja näi-den sekvenssien välissä täytekappaleen, joka voidaan poistaa 28 1 08558 katkaisemalla SacII:11a ja Ndel:llä. Sen jälkeen kun päät on tasattu, mikä tahansa cDNA tai kromosomaalinen geenikopio voidaan liittää promoottorin ja terminaattorin väliin (kuvio 15) .
5
Esimerkki 12 T. reesein endoglukanaasi I:n ilmentyminen cbhl-promoottorin alaisuudessa 10
Tuotetun endoglukanaasin määrän lisäämiseksi, egll-geeni kytkettiin voimakkaaseen cbhl-promoottoriin. T. reesein endoglukanaasi I:n cDNA kloonattiin EcoRI-BamHI-fragmenttina yleisekspressiovektoriin pAMHHO (kuvattu esimerkissä 11), 15 joka katkaistiin ensin SacII-Ndel:llä täytekappaleen poistamiseksi (kuvio 16). Muodostunut plasmidi pAMHlll, joka sisältää egll-geenin' cbhl-geenin promoottorin ja terminaattorin välissä, kotransformoitiin p3SR2:n kanssa T. reesei QM 9414 (ATCC 26921):een molaarisessa suhteessa 5:1. Transfor-20 mänttejä selektoitiin AmdS+-fenotyypin suhteen ja puhdistettiin edelleen selektiivisellä alustalla. Kuutta yksittäistä transformanttia kasvatettiin 4 päivän ajan sellulaasia indusoivalla alustalla (Solka floc hiilenlähteenä, 1 %) 50 ml:ssa nestemäistä viljelmää. Viljelmien supernatanttien 25 endoglukanaasiaktiivisuus testattiin sen jälkeen mittaamalla pelkistävien sokereiden vapautuminen hydroksietyyliselluloo-sasta (0,1 %, ref. 12). Transformanttien EGI-aktiivisuuksia verrattiin kontrolliin (QM 9414), ja parhaan transformantin osoitettiin erittävän 4-kertaisesti kontrollikannan endoglu-30 kanaasiaktiivisuuden. Tämä esimerkki osoittaa, että on mahdollista modifioida T. reeseissä olevien eri sellulolyyttis-·. ten entsyymien määriä niiden promoottoria vaihtamalla.
* 29 1U8558 Lähdeluettelo 1. Simmons, E.G., Classification of some cellulase producing Trichoderma species. In: Abstracts of Second International 5 Mycological Congress. Tampa, Florida, USA. H.E. Aigelow & E.G. Simmons (Eds.) 1977, s. 618.
2. Berghem, L.E.R. & Pettersson, L.G., The mechanism of enzymatic cellulose degradation. Purification of cellulolytic 10 enzyme from Trichoderma viride active on highly ordered cellulose. Eur.J.Biochem. 9Ί (1973), 21-30.
3. Gong, C.S., Ladisch, M.R. & Tsao, G.T., Biosynthesis, purification and mode of action of cellulases of Trichoderma 15 reesei. Adv.Chem.Ser. 181 (1979), 261-287.
4. Fägerstam, L.G. & Pettersson, L.G., The 1,4-S-glucan cellobiohydrolases of Trichoderma reesei QM 9414. A new type of synergism. FEBS Letters 119 (1980), 97-100.
20 5. Enari, T.-M., Microbial Cellulases. In: Microbial Enzymes and Biotechnology. W.M. Fogarty (Ed.). Applied Science
Publishers, London and New York, 1983, s. 183-223.
25 6. Gilbert, I.G. & Tsao, G.T., Physical properties of Ί\_ ;* viride cellulase. Ann. Reports on Fermentation Process 6 (1983), 323-358, 7. Shoemaker, S.P. & Brown, Jr., R.D., Enzymic activities of 30 endo-1,4-β-glucanases purified from Trichoderma viride.
Biochim.Biophys.Acta 523 (1978), 133-146.
8. Shoemaker, S.P. & Brown, Jr., R.D., Characterization of endo-1,4-β-glucanases purified from Trichoderma viride.
35 Biochim.Biophys.Acta 523 (1978), 147-161.
I · · 30 108358 9. Bissett, F.H., Analysis of cellulase proteins by high performance liquid chromatography. J. Chromatog. 178 (1979), 517-523.
5 10. Farkas, V.A., Jalanko, A. & Kolarova, N.,
Characterization of cellulase complexes from Trichoderma reesei QM 9414 and its mutants by means of analytical isoelectrofocusing in polyacrylamide gels. Biochem.Biophys. Acta 706 (1982), 105-110.
10 11. Enari, T.-M., Niku-Paavola, M.-L. & Nummi, M., Comparison of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei and Aspergillus niger. In: Proceedings of 2nd International
Symposium on Bioconversion and Biochemical Engineering. T.K.
15 Ghose (Ed.). Indian Institute of Technology, New Delhi 1 (1980), 87-95.
12. Bailey, M.J. & Nevalainen, K.M.H., Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved 20 production of solubilizing cellulase. Enzyme Microb.Technol. 3 (1981), 153-157.
13. Andreotti, R. , Medeiros, J., Roche, C. & Mandels, M. , Effects of strain and substrate on production of cellulases by 25 Trichoderma reesei mutants. In: Proceedings of 2nd
International Symposium on Bioconversion and Biochemical Engineering. T.K. Ghose (Ed.) Indian Institute of Technology, New Delhi 1 (1980), 353-388.
3 0 14. Farkas, V., Labudova, I., Bauer, S. L Ferenczy, L.,
Preparation of mutants of Trichoderma viride with increased ; : production of cellulase. Folia Microbiol. 26. (1981), 129-132.
15. Montenecourt, B.S., & Eveleigh, D.E., Selective screening 35 for the isolation of high yielding cellulase mutants of T. reesei. Adv.Chem.Ser. 181 (1979), 289-301.
• · 108358 31 16. Mandels, M., Weber, J. & Parizek, R., Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride. Appi.Microbiol. 21 (1971), 152-154.
5 17. Gallo, B.J., Andreotti, R., Roche, C., Ruy, D. & Mandels, M., Cellulase production by a new mutant strain of Trichoderma reesei MCG 77. Biotechnol.Bioengineer. Symp. 8 (1979), 89-102.
18. Warzywoda, M., Vandecasteele, J.P. & Pourquie, J., A 10 comparison of genetically improved strains of the cellulolytic funcrus Trichoderma reesei. Biotechnol.Lett. 5 (1983), 243-246.
19. Montenecourt, B.S., & Eveleigh, D.E., Preparation of mutants of Trichoderma reesei with enhanced cellulase 15 production. Appi.Environ.Microbiol. 34 (1977), 777-782.
20. Sheir-Neiss, G. & Montenecourt, B.S., Characterization of the secreted cellulases of Trichoderma reesei wild type and mutants during controlled fermentations. App.Microbiol.
20 Biotechnol. 20 (1984), 46-53.
21. Shoemaker, S.P., Raymond, J.C. & Bruner, R., Cellulases: Diversity amongst improved Trichoderma strains. In: Trends in the Biology of Fermantations for Fuels and Chemicals A.E.
25 Hollaender (Ed.) Plenum Press. (1981), 89-109.
22. Nevalainen, K.M.H., Palva, E.T. & Bailey, M.J.B., A high cellulase-producing mutant strain of Trichoderma reesei. Enzyme Microb.Technol. 3 (1980), 59-60.
30 23. Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., • Kwok, S., Myambo, K. & Innis, M. , Molecular cloning of exocellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. BIO/TECHNOLOGY 1 (1983). 691-696.
35 24. Teeri, T., Salovuori, I. & Knowles, J., The molecular cloning of the major cellulase gene from Trichoderma reesei BIO/TECHNOLOGY 1 (1983), 696-699.
108358 32 25. Penttilä, M., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. & Knowles, J. 1986. Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete sequence of the endoglucanase I gene. Gene (1986) 45; 253-263.
5 26. Patent application EP-137 280 (Cetus Corporation) 27. Van Arsdel, J.N.V., Kwok, S., Schweickart, V.L., Ladner, M.B., Gelfand, T.H. & Innis, M.A., Cloning, characterization 10 and expression in Saccharomvces cerevisiae of endoglucanase I from Trichoderma reesei. BIO/TECHNOLOGY 5: 60-64.
28. Patent application WO 85/04672 (Alko Ltd.) 15 29. Chen, C.M., Gritzali, M. & Stafford, T.W., Nucleotide sequence and deduced primary structure of cellobiohydrolase II from Trichocderma reesei. BIO/TECHNOLOGY (1987) 5: 274-278.
30. Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttilä, M., Teeri, T.T., 20 Stählberg, J., Johansson, G., Pettersson, G., Claeyssens, M., Tomme, P. & Knowles, J. , A new endoglucanase from Trichoderma reesei: Characterization of both gene and enzyme. Submitted for publication in BIO/TECHNOLOGY.
25 31. Case, M., Schweizer, M., Kushner, S.R., & Giles, N.H. ,
Efficient transformation of Neurospora crassa by utilizing hybrid plasmid DNA. Proc .Natl .Acad. Sei. USA 76 (1979), 5259- 5263 .
30 32. Ballance, J., Buxton, F.P. & Turner, G., Transformation of Aspergillus nidulans by the orotidine-5'-phosphate : decarboxylase gene of Neurospora crassa.
Biochem.Biophys.Res .Commun. 112 (1983), 284-289.
35 33. Tilburn, J. , Schazzocchio, C., Taylor, G.T.,
Zabickyzissman, J.H., Lockington, R.A. & Davies, R.W., Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene 26 .'•.I (1983), 205-221.
108358 33 34. Yelton, M., Hamer, J.E. & Timberlake, W.E.,
Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984), 1470-1474.
5 35. Kelly, J.M. & Hynes, M.J., Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans EMBO Journal 4 (1985), 475-479.
36. Nevalainen, H., Genetic improvement of enzyme production 10 in industrially important fungal strains. Technical Research
Center of Finland, Publications 26 (1985) .
37. Beckwith, J.R., Pardee, A.B., Austrian, R. & Jacob, F., Coordination of the synthesis of the enzymes in the pyridimide 15 pathway of E. Coli. J.Mol.Biol. 5 (1962), 61.5-634.
38. Ballance, D.J., & Turner, G., Development of a high- frequency transforming vector for Aspergillus nidulans. Gene 36 (1985), 321-331.
20 39. Creighton, T.E., N-(5'-Phosphoribosyl) anthranilate isomerase-indol-3-ylglycerol phosphate synthetase of tryptophan biosynthesis. Biochem.J. 120 (1970), 699-707.
25 40. Keesey, J.K.J.R. & DeMoss, J.A., Cloning of the trpl gene : from Neurospora crassa by complementation of a trpC mutation in Escherichia coli. J.Bacteriol. 152 (1982), 954-958.
41. Hynes M.J., Corrick, C.M. & King, J.A., Isolation of 30 genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of structural and regulatory mutations. Mol.Cell.Biol. 3. (1983), 1430-1439.
42. Casadaban, M.J., Martinez-Arias, A., Shapira, S.K. & 35 Chon, J., β-galactosidase gene fusions for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. Methods Enzymol. 100B (1983), 293-308.
« - · · 34 1 08 358 43. Raeder, U. & Broda, P., Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett, in Appi.Microbiol. 1 (1985) 17-20.
44. Sollazzo, M., Frank, R. & Cesareni, G., High-level 5 expression of RNAs and proteins: the use of oligonucleotides for the precise fusion of coding-to-regulatory sequences. Gene 37 (1985), 199-206.
45. John, M.A. & Peberdy, J.F. Transformation of Aspergillus 10 nidulans using the argB gene. Enzyme Microb.Technol. £ (1984), 386-389.
46. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. & Rutter, W.J., Isolation of biologically active ribonucleic acid from 15 sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18 (1978), 5294-5299.
47. Truelsen, E., Gausing, K., Jochimsen, B., Jorgensen, P. & Marcker, K.A., Cloning of soybean leghemogiobin structural 20 gene sequences synthesized in vitro. Nucleic Adics Res. 6.
(1979), 3061-3072.
48. Berse, B., Dmochowska, A., Skrzypek, M. Wegleriski, P., Bates, M.A. & Weiss, R.L. Cloning and characterization of the 25 ornithine carbamoyltransferase gene from Aspergillus nidulans.
; Gene 25. (1983), 109-117.
49. Ainsworth and Bisbyl 1983. Dictionary of the Fungi. Commonwealth Mycological Institute. Cew. England.
30 50. Doi, Y., Revision of the Hypocreales with cultural ' observations. II. Hypocrea dichromospora sp. nov. and its
Trichoderma state. Bull.Nat.Sci .Mus . Tokyo 1J. (1968), 185-189.
35 51. Yanish-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. , Improved MJ13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mp 18 and pUC 19 vectors. Gene 22. (19 85) , Λ: 103-119.
35 1 08358 52. Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Hoegh, I. & Fiil, N.P., Two different types of intervening sequences in the glycoamylase gene from Aspergillus niger. The EMBO Journal 3. (1984), 1581-1585.
5 53. Marsh, J.L., Erfle, M. & Wykes, E.J. The pIC plasmid and phage vectors with verstile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32 (1984), 481- 485.
10 54. Vieira, J. & Messing, J., The pUC plasmids, an M13mp7 -derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19. (1982), 259-268.
15 55. Van Gorcom, R.F.M., Punt, P.J., Pouwels, P.H. & Van den
Hondel, C.A.M.J.J. A system for the analysis of expression signals in Aspergillus. Gene 48 (1986), 211-217.
56. Nummi, M., Niku-Paavola, M.-L., Lappalainen, A., Enari, 20 T.-M. & Raunio, V., Cellobiohydrolase from Trichoderma reesei.
Biochem.J. 215 (1983), 677-683.
57. Eghtedarzadch, M.K. & Henikoff, S., Use of oligonucleotides to generate large deletions. Nucl. Acids Res.
25 14 (1986), 5115.
« 58. Obtained from Paul Thomas, Imperial College, Dept, of Chemistry, London 30 59. Miller, J.H., Experiments in molecular genetics (1972),
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
60. The method for determining the activity of chymosin in cleavage of milk β-kasein has been described by Siika-Aho, M. 35 (1983), Mikrobirenniinin tuottaminen, MSc Thesis. Biotechnical
Laboratory, VTT, Tietotie 2, 02150 Espoo, Finland.

Claims (27)

108358
1. Trichoderma-kanta, joka on stabiilisti transformoitu vektorisysteemillä, tunnettu siitä, että se käsittää 5 a) geenin, joka koodaa haluttua proteiinituotetta, b) toiminnot, jotka helpottavat geenin ilmentymistä, sisältäen promoottorit/tehostimet/terminaattorit käyttökelpoisesti geeniin kytkettyinä halutun tuotteen ilmentymisen kontrolloimiseksi, ja 10 c) selektiomarkkerin, jonka avulla kyetään valikoimaan stabiilit Trichoderma-transformantit.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi signaali/leadersekvenssin yh- 15 distyneenä haluttua proteiinituotetta koodaavan geenin 5'-pään yläpuolisesti.
3. Patenttivaatimuksen 1. tai 2 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin promoottori voi toimia Tricho- 20 dermassa.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin promoottori on peräisin geenistä, joka koodaa Trichoderman suhteen heterologista proteiinia. ... 25 * 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kanta, tunnettu siitä, että signaali/leadersekvenssi on peräisin geenistä, joka koodaa Trichoderman erittämää proteiinia.
6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kanta, tunnettu siitä, . . että signaali/leadersekvenssi on peräisin erittyvästä prote- * ‘ iinista, joka on Trichoderman suhteen heterologinen.
7. Patenttivaatimusten 5 ja 6 mukainen kanta, tunnettu 35 siitä, että signaali/leadersekvenssi on peräisin haluttujen proteiinien signaali/leadersekvenssistä. • 37 108 358
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin signaalisekvenssi on Trichoderma reesein cbhl-sicrnaalisekvenssi.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin signaalisekvenssi on Aspercrilluksen glukoamylaasin signaalisekvenssi.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, 10 että haluttu proteiini on homologinen Trichoderman suhteen.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että haluttu proteiini on heterologinen Trichoderman suhteen.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kanta, tunnettu siitä, että haluttu tuote on prokymosiini.
13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen kanta, tunnettu siitä, että haluttu proteiini on T. reesein endoglukanaasi (EG I). 20
14. Patenttivaatimuksen 3 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin promoottori on Trichoderma reesein cbhl-. cbh2-. egll-. eg!2-promoottori.
15. Patenttivaatimuksen 3 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin terminaattori on Trichoderma reesein cbhl-. cbh2-, egll-, egl2-terminaattori.
16. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kanta, tunnettu siitä, 30 että vektorisysteemin promoottori on Asoerailluksen gluko- amylaasipromoottori. » ♦ *
17. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin terminaattori on Asperailluksen gluko- 35 amylaasiterminaattori.
18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemin selektiomarkkeri on peräisin Aspergillus 108358 nidulansin amdS-geenistä, Aspergillus nidulansin tai Trichoderma reesein argB-geenistä, Trichoderma reesein tai Neurospora crassan pyr4-geenistä tai Aspergillus nidulansin trpC-geenistä. 5
19. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemi käsittää vähintään kaksi plasmidia tai vektoria.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen kanta, tunnettu siitä, että selektiomarkkeri sijaitsee yhdessä plasmidissa ja loput DNA-sekvenssit, jotka on tarkoitus liittää isäntägenomiin, sijaitsevat toisessa plasmidissa.
21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kanta, tunnettu siitä, että vektorisysteemi käsittää yhden plasmidin tai vektorin.
22. Menetelmä Trichoderman transformoimiseksi, tunnettu siitä, että sopiva Trichoderma-kanta transformoidaan vekto- 20 risysteemillä, joka käsittää a) geenin, joka koodaa haluttua proteiinituotetta, b) toiminnot, jotka helpottavat geenin ilmentymistä, sisältäen promoottorit/tehostimet/terminaattorit käyttökelpoisesti geeniin kytkettyinä halutun tuotteen ilmentymisen 25 kontrolloimiseksi, ja • ' c) selektiomarkkerin, jonka avulla kyetään valikoimaan stabiilit Trichoderma-transformantit, ja valikoidaan stabiilisti transformoidut Trichodermat selektiomarkkerin avulla.
23. Menetelmä proteiinituotteen tuottamiseksi Trichodermal- la, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-21 . mukaista kantaa viljellään sopivassa kasvualustassa ja ilmen tynyt ja erittynyt proteiinituote otetaan talteen vilje-lyalustasta.
24. Patenttivaatimuksen 22 tai 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntämikro-organismi on prototrofinen Ί\ • . reesei -kanta. 35 33 1 08358
25. Patenttivaatimuksen 22 tai 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntämikro-organismi on auksotrofinen T. reesei -kanta. 5
26. Jonkin patenttivaatimuksen 22-25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäkanta on vajavainen jonkin geenin suhteen, joka koodaa ei-toivottua tuotetta.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäkannan cbhl -geeni on vajavainen.
FI871908A 1986-04-30 1987-04-29 Trichoderman transformointi FI108358B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8610600 1986-04-30
GB868610600A GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-04-30 Transformation of trichoderma

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI871908A0 FI871908A0 (fi) 1987-04-29
FI871908A FI871908A (fi) 1987-10-31
FI108358B true FI108358B (fi) 2002-01-15

Family

ID=10597131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI871908A FI108358B (fi) 1986-04-30 1987-04-29 Trichoderman transformointi

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0244234B2 (fi)
JP (2) JP2702924B2 (fi)
AT (1) ATE91714T1 (fi)
DE (1) DE3786592T3 (fi)
DK (1) DK175814B1 (fi)
ES (1) ES2056817T5 (fi)
FI (1) FI108358B (fi)
GB (1) GB8610600D0 (fi)
IE (1) IE60428B1 (fi)
NO (1) NO871785L (fi)

Families Citing this family (537)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5320960A (en) * 1992-04-03 1994-06-14 Genencor International, Inc. Method of preparing solution enriched in xylanase using low molecular weight alcohol, organic salt and inorganic salt
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US5780292A (en) * 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
US5610034A (en) * 1987-04-29 1997-03-11 Alko Group Ltd. Immunoglobulin production by trichoderma
US5258287A (en) * 1988-03-22 1993-11-02 Genentech, Inc. DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53
WO1989009259A1 (en) * 1988-03-24 1989-10-05 Novo-Nordisk A/S A cellulase preparation
CA1333777C (en) * 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi
CA1341226C (en) * 1988-08-16 2001-05-01 Wim Van Hartingsveldt Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains
FR2649120B1 (fr) * 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5120463A (en) * 1989-10-19 1992-06-09 Genencor International, Inc. Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes
US5688290A (en) * 1989-10-19 1997-11-18 Genencor International, Inc. Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes
US5837515A (en) * 1990-05-16 1998-11-17 Alko-Yhtiot Oy Enzyme preparations and methods for their production
FI903443A (fi) * 1990-07-06 1992-01-07 Valtion Teknillinen Framstaellning av lackas genom rekombinantorganismer.
AU657911B2 (en) * 1990-07-16 1995-03-30 Roal Oy Immunoglobulin production by (Trichoderma)
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5525507A (en) * 1990-10-05 1996-06-11 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabric with cellulase composition containing endoglucanase component and which is free of all CBH I component
CA2093422C (en) * 1990-10-05 2001-04-03 DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS
US5654193A (en) * 1990-10-05 1997-08-05 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton containing fabrics with cellulase
US5328841A (en) * 1990-10-05 1994-07-12 Genencor International, Inc. Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol
US5650322A (en) * 1990-10-05 1997-07-22 Genencor International, Inc. Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
US5246853A (en) * 1990-10-05 1993-09-21 Genencor International, Inc. Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I
WO1992010581A1 (en) * 1990-12-10 1992-06-25 Genencor International, Inc. IMPROVED SACCHARIFICATION OF CELLULOSE BY CLONING AND AMPLIFICATION OF THE β-GLUCOSIDASE GENE OF TRICHODERMA REESEI
DE69202858T2 (de) * 1991-03-22 1996-02-22 Novonordisk As Herstellungsverfahren für chymosin.
CA2134446A1 (en) * 1992-05-01 1993-11-11 Kathleen A. Clarkson Methods for treating cotton-containing fabrics with cbh i enriched cellulase
DK0655890T3 (da) * 1992-07-31 2005-06-06 Ab Enzymes Gmbh Rekombinante celler, DNA-konstruktioner, vektorer og fremgangsmåder til ekspression af phytatnedbrydende enzymer i önskede forhold
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
GB9400623D0 (en) * 1994-01-14 1994-03-09 Univ Leeds Exploitation of the cellulase enzyme complex of neurospora
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5708142A (en) 1994-05-27 1998-01-13 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor-associated factors
US7816129B2 (en) 1994-07-29 2010-10-19 Ab Enzymes Gmbh Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi
US5834251A (en) * 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5700686A (en) * 1995-06-06 1997-12-23 Iogen Corporation Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing
US6451764B1 (en) 1995-09-08 2002-09-17 Genentech, Inc. VEGF-related protein
EP1619250B1 (en) 1996-01-08 2009-11-25 Genentech, Inc. OB receptor variant and ligands
US6159462A (en) * 1996-08-16 2000-12-12 Genentech, Inc. Uses of Wnt polypeptides
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US6100076A (en) 1997-01-31 2000-08-08 Genentech, Inc. O-fucosyltransferase
DE69737457T2 (de) 1997-01-31 2007-11-29 Genentech, Inc., South San Francisco O-fukosyltransferase
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
ATE541586T1 (de) 1997-04-07 2012-02-15 Genentech Inc Behälter mit anti-vegf antikörpern
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
AU9120898A (en) 1997-08-27 1999-03-16 Chiron Corporation Molecular mimetics of meningococcal b epitopes
AU1288399A (en) 1997-10-29 1999-05-17 Genentech Inc. Wnt-1 induced secreted polypeptides: wisp-1, -2 and -3
EP2033970A3 (en) 1997-10-29 2009-06-17 Genentech, Inc. Polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP2050762A3 (en) 1998-03-10 2009-07-08 Genentech, Inc. Human cornichon-like protein and nucleic acids encoding it
EP1865061A3 (en) 1998-05-15 2007-12-19 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
EP3112468A1 (en) 1998-05-15 2017-01-04 Genentech, Inc. Il-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
PT1076703E (pt) 1998-05-15 2007-10-10 Genentech Inc ''utilizações terapêuticas de polipéptido homólogos de il-17''
US20020172678A1 (en) 2000-06-23 2002-11-21 Napoleone Ferrara EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use
JP2002527066A (ja) 1998-10-15 2002-08-27 カイロン コーポレイション 転移性乳癌および結腸癌調節遺伝子
EP1950300A3 (en) 1998-11-18 2011-03-23 Genentech, Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
AU2367600A (en) 1998-12-16 2000-07-03 Chiron Corporation Human cyclin-dependent kinase ((hpnqalre))
EP1820859B9 (en) 1998-12-22 2009-10-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
MXPA01007170A (es) 1999-01-15 2002-07-30 Genentech Inc Variantes de polipeptidos con funcion efectora alterada.
EP1956030B1 (en) 1999-06-15 2009-11-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids endoding the same
CH694589A5 (de) 1999-06-25 2005-04-15 Genentech Inc Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern.
EP1305412A2 (en) 1999-10-14 2003-05-02 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
CA2492049A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DK1897945T3 (da) 1999-12-23 2012-05-07 Genentech Inc IL-17 homologe polypeptider og terapeutiske anvendelser deraf.
ES2386317T3 (es) 2000-01-10 2012-08-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Genes expresados diferencialmente en cáncer de mama
BR0110610A (pt) 2000-04-11 2003-04-29 Genentech Inc Anticorpos isolados, imunoconjugados, cadeias de polipeptìdeos, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo ou cadeia de polipeptìdeos, método de tratamento de disfunções em mamìferos, método de indução da apoptose de uma célula cancerosa, método para matar uma célula b, método para matar uma célula que expresse um receptor de erbb e usos dos anticorpos isolados
EP2042597B1 (en) 2000-06-23 2014-05-07 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP2168980A1 (en) 2000-06-23 2010-03-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogensis
EP1383881A2 (en) 2000-06-26 2004-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes from strains of fusarium and acremonium
DK1303293T3 (da) 2000-07-27 2009-03-30 Genentech Inc Sekventiel indgivelse af CPT-11 og APO-2L-polypeptid
ATE412009T1 (de) 2000-08-24 2008-11-15 Genentech Inc Methode zur inhibierung von il-22 induziertem pap1
EP1944317A3 (en) 2000-09-01 2008-09-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7456001B2 (en) 2000-09-05 2008-11-25 Novozymes A/S Lipoxygenase
US6673580B2 (en) 2000-10-27 2004-01-06 Genentech, Inc. Identification and modification of immunodominant epitopes in polypeptides
FI120310B (fi) 2001-02-13 2009-09-15 Valtion Teknillinen Parannettu menetelmä erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä
RU2338752C2 (ru) 2001-03-22 2008-11-20 Ново Нордиск Хелт Кэр Аг Производные фактора vii свертывания крови
AU2002305151A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002303261A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
CN100359006C (zh) 2001-04-20 2008-01-02 诺和酶股份有限公司 脂肪氧合酶
US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1992643A3 (en) 2001-06-20 2008-12-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
ES2386346T3 (es) 2001-08-29 2012-08-17 Genentech, Inc. Ácidos nucleicos y polipéptidos Bv8 con actividad mitógena
KR101008758B1 (ko) 2001-09-18 2011-01-14 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
AU2002333211B2 (en) 2001-09-27 2008-05-08 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor VII polypeptides
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
AU2004236174B2 (en) 2001-10-10 2011-06-02 Novo Nordisk A/S Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP2305313B1 (en) 2001-10-10 2014-03-26 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of interferon-alpha (IFNa)
CA2467383C (en) 2001-12-19 2012-08-28 The University Of Chicago Rapidly maturing fluorescent proteins and methods for using the same
MXPA04006554A (es) 2002-01-02 2005-03-31 Genentech Inc Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor.
CA2476518A1 (en) 2002-02-22 2003-09-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7244565B2 (en) 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
NZ535925A (en) 2002-04-16 2008-06-30 Genentech Inc An isolated antibody that binds to a particular polypeptide
EP2305710A3 (en) 2002-06-03 2013-05-29 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
MXPA04012243A (es) 2002-06-07 2005-02-25 Genentech Inc Composiciones y metodos para l diagnostico y tratamiento de tumores.
WO2004008099A2 (en) 2002-07-15 2004-01-22 Genentech, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS THAT ARE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
DK1543038T4 (da) 2002-09-11 2020-11-09 Genentech Inc Proteinoprensning
AU2003276874B2 (en) 2002-09-11 2009-09-03 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP1539228B1 (en) 2002-09-11 2010-12-29 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
EP1578364A4 (en) 2002-09-16 2011-06-08 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING IMMUNE DISEASES
EP2500438A3 (en) 2002-09-25 2012-11-28 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of psoriasis
AU2003298607B9 (en) 2002-10-29 2011-08-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2503748A1 (en) 2002-11-08 2004-05-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases
JP2011516026A (ja) 2002-11-26 2011-05-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065417A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
KR101294959B1 (ko) 2003-03-12 2013-08-09 제넨테크, 인크. 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의 용도
RU2332986C2 (ru) 2003-04-04 2008-09-10 Дженентек, Инк. Высококонцентрированные композиции антител и белков
EP1620551B1 (en) 2003-04-28 2013-09-18 Novozymes A/S Phospholipase and method of producing it
EP1629010A1 (en) 2003-05-30 2006-03-01 Genentech, Inc. Treatment with anti-vegf antibodies
CN101974090B (zh) 2003-06-12 2015-06-17 伊莱利利公司 Glp-1类似物融合蛋白质
SI1641822T1 (sl) 2003-07-08 2013-08-30 Genentech, Inc. IL-17 A/F heterologni polipeptidi in njihove terapevtske uporabe
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
ATE547519T1 (de) 2003-09-09 2012-03-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide
EP2301568A1 (en) 2003-11-17 2011-03-30 Genentech, Inc. Antibody against IRTA2 for the treatment of tumour of hematopoietic origin
ES2382333T3 (es) 2003-11-21 2012-06-07 Danisco Us Inc. Expresión de enzimas hidrolizantes de almidón granular en trichoderma y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidón granular
JP5422101B2 (ja) 2004-01-07 2014-02-19 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用
CN103755800B (zh) 2004-02-02 2016-02-24 Ambrx公司 经修饰的人类生长激素多肽与其用途
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
WO2005093050A2 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
KR20120126130A (ko) 2004-03-29 2012-11-20 가르파마 컴퍼니 리미티드 신규 갈렉틴 9 개변체 단백질 및 그 용도
ATE515515T1 (de) 2004-03-30 2011-07-15 Glaxo Group Ltd Immunglobuline gegen menschlisches osm
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
US7250298B2 (en) 2004-04-07 2007-07-31 The University Of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
US20150017671A1 (en) 2004-04-16 2015-01-15 Yaping Shou Methods for detecting lp-pla2 activity and inhibition of lp-pla2 activity
MXPA06013599A (es) 2004-05-27 2007-03-15 Genencor Int Expresion heterologa de una alfa amilasa estable en condiciones acidas de aspergillus kawachi y aplicaciones en la hidrolisis del almidon granular.
US7413887B2 (en) 2004-05-27 2008-08-19 Genecor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
US7332319B2 (en) 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
EP1749092A2 (en) 2004-05-27 2007-02-07 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
BRPI0512235A (pt) 2004-06-18 2008-02-19 Ambrx Inc polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos
TWI307630B (en) 2004-07-01 2009-03-21 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
MX2007000784A (es) 2004-07-20 2007-04-09 Genentech Inc Inhibidores de proteina 4 tipo angiopoietina, combinaciones y su uso.
FI118339B (fi) 2004-09-21 2007-10-15 Ab Enzymes Oy Uusi lakkaasientsyymi ja sen käyttö
DK1817055T3 (da) 2004-11-10 2013-04-08 Diadexus Inc Ovr110-antistofsammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse heraf
US7638491B2 (en) 2004-12-22 2009-12-29 Ambrx, Inc. Therapies using non-natural amino acids and polypeptides
CN103690936A (zh) 2004-12-22 2014-04-02 Ambrx公司 经修饰的人类生长激素
ATE462726T1 (de) 2005-01-07 2010-04-15 Diadexus Inc Ovr110-antikörperzusammensetzungen und verwendungsverfahren dafür
ZA200706858B (en) 2005-02-18 2008-10-29 Genencor Int Polypeptides having alpha-amylase and granular starch hydrolyzing activity
JP5209466B2 (ja) 2005-03-21 2013-06-12 ビロベイ，インコーポレイティド システインプロテアーゼ阻害剤としてのアルファケトアミド化合物
CN101146907B (zh) 2005-04-12 2015-04-08 金克克国际有限公司 蛋白质生产被改变的基因失活突变体
US7741093B2 (en) 2005-04-29 2010-06-22 Ab Enzymes Oy Cellulases and their uses
WO2006124667A2 (en) 2005-05-12 2006-11-23 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
NZ563341A (en) 2005-06-06 2009-10-30 Genentech Inc Methods for identifying agents that modulate a gene that encodes for a PRO1568 polypeptide
EP1922410A2 (en) 2005-08-15 2008-05-21 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP2316930A1 (en) 2005-09-14 2011-05-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor VII polypeptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7749704B2 (en) 2005-11-01 2010-07-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
JP2009520949A (ja) 2005-11-16 2009-05-28 アンブルックス，インコーポレイテッド 非天然アミノ酸を含んでいる組成物および方法
MY147669A (en) 2005-11-18 2012-12-31 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
US20090293137A1 (en) 2005-11-21 2009-11-26 Genentech, Inc. Novel Gene Disruptions, Compositions and Methods Relating Thereto
GB0525662D0 (en) 2005-12-16 2006-01-25 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
DK1969123T3 (en) 2005-12-22 2017-08-28 Ab Enzymes Oy Hitherto UNKNOWN ENZYMS
AU2007233263A1 (en) 2006-02-17 2007-10-11 Genentech, Inc. Gene disruptons, compositions and methods relating thereto
RU2008141912A (ru) 2006-03-23 2010-04-27 Новартис АГ (CH) Противоопухолевые лекарства на основе антител к клеточным антигенам
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
BRPI0709726A2 (pt) 2006-04-05 2011-07-26 Abbott Biotechnology Ltd. purificaÇço de anticorpo
US7361487B2 (en) 2006-04-13 2008-04-22 Ab Enzymes Oy Enzyme fusion proteins and their use
JP2009536022A (ja) 2006-04-19 2009-10-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 新規の遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法
AU2007244683A1 (en) 2006-04-27 2007-11-08 Pikamab, Inc. Methods and compositions for antibody therapy
EP2024393A2 (en) 2006-05-15 2009-02-18 Sea Lane Biotechnologies,llc. Neutralizing antibodies to influenza viruses
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
CA2656063C (en) 2006-06-21 2016-10-18 Musc Foundation For Research Development Targeting complement factor h for treatment of diseases
AU2007276294B2 (en) 2006-06-30 2012-11-29 Novo Nordisk A/S Anti-NKG2A antibodies and uses thereof
US20080026376A1 (en) 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
AR062435A1 (es) 2006-08-18 2008-11-05 Xoma Technology Ltd Anticuerpo especifico prlr (receptor de prolactina) y sus usos
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
CN101522893B (zh) 2006-10-10 2014-07-09 丹尼斯科美国公司 具有改变性质的葡糖淀粉酶变体
WO2009048488A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Danisco Us, Inc., Genencor Division Glucoamylase variants with altered properties
CN104650225B (zh) 2006-10-27 2019-10-01 勒帕斯公司 用于结合鞘氨醇-1-磷酸的组合物和方法
CN101687031B (zh) 2006-10-27 2014-05-14 勒帕斯公司 用于治疗眼疾和眼病的组合物及方法
CA2668208C (en) 2006-11-02 2017-09-12 Daniel J. Capon Hybrid immunoglobulins with moving parts
RU2447449C2 (ru) 2006-11-14 2012-04-10 Дженентек, Инк. Модуляторы нейрональной регенерации
EP2121743B1 (en) 2006-11-22 2015-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
AU2007325283B2 (en) 2006-11-27 2012-08-30 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
MX2009006034A (es) 2006-12-07 2009-10-12 Novartis Ag Anticuerpos antagonistas contra ephb3.
AU2008209404B2 (en) 2007-01-22 2012-08-16 Genentech, Inc. Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
WO2008097497A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R & D Company Vegf pathway blockade
US20080220498A1 (en) 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
SI2140021T1 (sl) 2007-02-22 2012-04-30 Genentech Inc Postopki za detekcijo vnetne ÄŤrevesne bolezni
CN101657537B (zh) 2007-03-14 2013-06-19 丹尼斯科美国公司 里氏木霉α-淀粉酶增强玉米淀粉的糖化
CA2682147C (en) 2007-03-30 2017-08-08 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
US8093016B2 (en) 2007-05-21 2012-01-10 Danisco Us Inc. Use of an aspartic protease (NS24) signal sequence for heterologous protein expression
ES2585702T3 (es) 2007-05-30 2016-10-07 Lpath, Inc Composiciones y métodos para la unión al ácido lisofosfatídico
US9163091B2 (en) 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
BRPI0812767A2 (pt) 2007-06-07 2014-12-02 Genentech Inc Anticorpos para c3b e métodos para prevenção e tratamento de distúrbios associados ao complemento
PT3597659T (pt) 2007-07-09 2023-04-04 Genentech Inc Prevenção da redução de ligações de dissulfureto durante a produção recombinante de polipéptidos
SG183044A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugatesand methods of use
EP2502937B1 (en) 2007-07-16 2016-04-06 Genentech, Inc. Anti-CD 79b Antibodies And Immunoconjugates And Methods Of Use
CN101361968B (zh) 2007-08-06 2011-08-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用
WO2009031992A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Elizabeth Varriano-Marston Method for controlling banana quality by packaging
WO2009035500A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Danisco Us Inc., Genencor Division Trichoderma promoter
KR101662622B1 (ko) 2007-10-04 2016-10-05 지모제넥틱스, 인코포레이티드 Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
US8361465B2 (en) 2007-10-26 2013-01-29 Lpath, Inc. Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents
US20090148435A1 (en) 2007-10-30 2009-06-11 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
US8679749B2 (en) 2007-11-01 2014-03-25 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
EP2209807A1 (en) 2007-11-08 2010-07-28 Genentech, Inc. Anti-factor b antibodies and their uses
US8057796B2 (en) 2007-11-12 2011-11-15 Theraclone Sciences, Inc. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza
WO2010135521A2 (en) 2009-05-20 2010-11-25 Theraclone Sciences, Inc. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza
ES2795989T3 (es) 2007-11-20 2020-11-25 Danisco Us Inc Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas
NZ603812A (en) 2007-11-20 2014-06-27 Ambrx Inc Modified insulin polypeptides and their uses
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
US8003325B2 (en) 2007-11-30 2011-08-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods
MX2010006576A (es) 2007-12-13 2010-10-15 Danisco Us Inc Composiciones y metodos para producir isopreno.
CN102978258A (zh) 2008-01-02 2013-03-20 丹尼斯科美国公司 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法
AR070141A1 (es) 2008-01-23 2010-03-17 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticuerpos humanizados especificos para el factor von willebrand
EP2628753A1 (en) 2008-01-24 2013-08-21 Novo Nordisk A/S Humanized anti-human NKG2A monoclonal antibody
CA2713504A1 (en) 2008-01-31 2009-08-13 Genentech, Inc. Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
MX2010008632A (es) 2008-02-08 2010-08-30 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
DK2268806T3 (da) 2008-02-11 2013-07-15 Danisco Us Inc Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei
MX2010009885A (es) 2008-03-10 2010-11-30 Theraclone Sciences Inc Composiciones y métodos para la terapia y diagnóstico de citomegalovirus.
CA2719201A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Sea Lane Biotechnologies, Llc. Neutralizing molecules to viral antigens
KR101924831B1 (ko) 2008-04-09 2018-12-05 제넨테크, 인크. 면역 관련 질병의 치료를 위한 신규한 조성물 및 방법
US8673609B2 (en) 2008-04-18 2014-03-18 Danisco Us Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
MX2010011706A (es) 2008-04-23 2011-03-15 Danisco Us Inc Variantes de isopreno-sintasa para produccion microbiana mejorada de isopreno.
LT2280996T (lt) 2008-05-06 2016-12-12 Genentech, Inc. Subrendusio giminingumo crig variantai
MY156256A (en) 2008-07-02 2016-01-29 Danisco Us Inc Compositions and methods for producing isoprene free of c5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges
EP2318029B1 (en) 2008-07-23 2017-11-01 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
ES2527943T5 (es) 2008-08-14 2019-03-07 Genentech Inc Métodos para eliminar un contaminante usando cromatografía de membrana de intercambio iónico de desplazamiento de proteínas
AR073279A1 (es) 2008-09-05 2010-10-28 TransAlgae Ltd Resistencia a herbicida para mantener cultivos axenicos de algas por manipulacion genetica
WO2010031076A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Conversion of prenyl derivatives to isoprene
ZA201102111B (en) 2008-09-15 2013-10-30 Danisco Us Inc Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
BRPI0918453A2 (pt) 2008-09-15 2019-12-17 Danisco Us Inc sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno
MY169163A (en) 2008-09-15 2019-02-19 Danisco Us Inc Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
WO2010034015A2 (en) 2008-09-22 2010-03-25 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Modulating the alternative complement pathway
CA2738033C (en) 2008-09-26 2019-11-26 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
KR101647164B1 (ko) 2008-09-26 2016-08-09 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도
SG10201702922VA (en) 2008-10-20 2017-06-29 Abbvie Inc Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
CN102307593B (zh) 2008-10-22 2016-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 轴突变性的调节
US8871202B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate
EP2346903A1 (en) 2008-11-06 2011-07-27 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Treatment with anti-alpha2 integrin antibodies
JP5548698B2 (ja) 2008-12-15 2014-07-16 ダニスコ・ユーエス・インク ハイブリッドアルファ‐アミラーゼ
AR074777A1 (es) 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
FI20086236A0 (fi) 2008-12-23 2008-12-23 Valtion Teknillinen Heksuronihapon konversio heksarihapoksi
MY161071A (en) 2008-12-30 2017-04-14 Danisco Us Inc Methods of producing isoprene and a co-product
FI122029B (fi) 2008-12-30 2011-07-29 Ab Enzymes Oy Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
WO2010078376A2 (en) 2008-12-30 2010-07-08 Ventana Medical Systems, Inc. Fc-specific polymer-conjugated antibodies and their diagnostic use
EA020843B1 (ru) 2009-02-03 2015-02-27 Амуникс Оперейтинг Инк. Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции
SI3260136T1 (sl) 2009-03-17 2021-05-31 Theraclone Sciences, Inc. Humani imunodeficientni virus (HIV)-nevtralizirajoča protitelesa
EP2414399A1 (en) 2009-04-01 2012-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2010118243A2 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists to treat lupus
EP2421966A2 (en) 2009-04-23 2012-02-29 Danisco US Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
US8609101B2 (en) 2009-04-23 2013-12-17 Theraclone Sciences, Inc. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) neutralizing antibodies
FI121712B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
FI121711B (fi) 2009-04-30 2011-03-15 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö
CN102428176B (zh) 2009-05-19 2016-11-16 杜邦营养生物科学有限公司 淀粉酶多肽
ES2705249T3 (es) 2009-06-08 2019-03-22 Amunix Operating Inc Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso
SI2440241T1 (sl) 2009-06-08 2017-11-30 Amunix Operating Inc. Polipeptidni rastni hormoni in postopki za njihovo izdelavo in uporabo
TWI427149B (zh) 2009-06-17 2014-02-21 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
FI121851B (fi) 2009-07-08 2011-05-13 Ab Enzymes Oy Sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö
JP2012533306A (ja) 2009-07-15 2012-12-27 アボット・ラボラトリーズ 機械的伝達による細胞産生の強化
AU2010272483B2 (en) 2009-07-17 2016-07-21 Omeros Corporation MASP isoforms as inhibitors of complement activation
US8765431B2 (en) 2009-07-23 2014-07-01 The Regents Of The University Of Michigan Method for enzymatic production of decarboxylated polyketides and fatty acids
EP2459591B1 (en) 2009-07-31 2014-08-20 Genentech, Inc. Inhibition of tumor metastasis using anti-g-csf-antibodies
WO2011022465A1 (en) 2009-08-19 2011-02-24 Danisco Us Inc. Combinatorial variants of glucoamylase with improved specific activity and/or thermostability
AU2010284963C1 (en) 2009-08-19 2014-11-27 Danisco Us Inc. Variants of glucoamylase
CA2772051C (en) 2009-08-24 2020-08-18 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
SI2473617T1 (sl) 2009-09-01 2020-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Izboljšano prečiščevanje beljakovin z modificirano elucijo beljakovine A
EP2473522B1 (en) 2009-09-02 2016-08-17 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
US9885711B2 (en) 2009-09-25 2018-02-06 Xoma Technology Ltd. Screening methods
BR112012008907A2 (pt) 2009-10-15 2020-11-24 Genentech, Inc fatores de crescimento de fibroblastos quiméricos com especificidade receptora alterada
DK3037104T3 (da) 2009-10-20 2020-07-20 Abbvie Inc Isolering og renselse af anti-il-13 antistoffer ved brug af protein a beslægtet kromatografi
EP3011970A3 (en) 2009-10-22 2016-06-08 F. Hoffmann-La Roche AG Modulation of axon degeneration
EP2490718B1 (en) 2009-10-22 2016-01-13 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
US20110098862A1 (en) 2009-10-27 2011-04-28 ExxonMobil Research Engineering Company Law Department Multi-stage processes and control thereof
RU2012124093A (ru) 2009-11-12 2013-12-20 Дженентек, Инк. Способ увеличения плотности дендритных шипиков
SG10201408598XA (en) 2009-11-30 2015-02-27 Genentech Inc Antibodies for treating and diagnosing tumors expressing slc34a2 (tat211 = seqid2 )
EP2507258B1 (en) 2009-12-01 2016-04-20 Novo Nordisk A/S Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
WO2011080050A2 (en) 2009-12-11 2011-07-07 Novartis Ag Binding molecules
WO2011071577A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Genentech, Inc. Anti-vegf-c antibodies and methods using same
JP5984676B2 (ja) 2009-12-18 2016-09-06 シーエスエル、リミテッド ポリペプチドを精製する方法
PE20121707A1 (es) 2009-12-21 2012-12-17 Ambrx Inc Polipeptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos
SG2014011340A (en) 2009-12-21 2014-07-30 Genentech Inc Antibody formulation
CN102666578A (zh) 2009-12-21 2012-09-12 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
FI122937B (fi) 2009-12-30 2012-09-14 Roal Oy Menetelmä selluloosamateriaalin käsittelemiseksi sekä tässä käyttökelpoiset CBH II/Cel6A entsyymit
EA023700B1 (ru) 2010-01-28 2016-07-29 Глаксо Груп Лимитед Cd127-связывающие белки
CN102985113B (zh) 2010-02-23 2015-05-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
CA3027824A1 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Sanofi Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
UA108227C2 (xx) 2010-03-03 2015-04-10 Антигензв'язуючий білок
WO2011107591A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
US9107440B2 (en) 2010-03-29 2015-08-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
BR112012024713B1 (pt) 2010-03-31 2021-02-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh anticorpo humanizado, seus usos e composição farmacêutica que o compreende
WO2011123813A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
WO2011133931A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease
CN107090045A (zh) 2010-05-03 2017-08-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
HUE030820T2 (en) 2010-05-28 2017-06-28 Hoffmann La Roche Decreasing Lactate Levels and Enhancing Polypeptide Production by Control of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinase Expression
WO2011150454A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Monash University ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET
AR081556A1 (es) 2010-06-03 2012-10-03 Glaxo Group Ltd Proteinas de union al antigeno humanizadas
BR112012032276A2 (pt) 2010-06-17 2016-11-16 Danisco Us Inc composições de combustível compreendendo derivados de isopreno
KR101768118B1 (ko) 2010-06-25 2017-08-14 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 기도 감염의 치료를 위한 방법 및 약학 조성물
WO2012010635A1 (en) 2010-07-22 2012-01-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel antigen binding proteins
WO2012019169A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Production of isoprene under neutral ph conditions
WO2012019159A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Neutral ph saccharification and fermentation
CA2807664A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Theraclone Sciences, Inc. Anti-hemagglutinin antibody compositions and methods of use thereof
EP2420250A1 (en) 2010-08-13 2012-02-22 Universitätsklinikum Münster Anti-Syndecan-4 antibodies
KR20130100125A (ko) 2010-08-13 2013-09-09 제넨테크, 인크. 질환의 치료를 위한, ＩＬ-1β 및 ＩＬ-18에 대한 항체
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
RS59193B1 (sr) 2010-08-17 2019-10-31 Ambrx Inc Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena
JP2013535983A (ja) 2010-08-24 2013-09-19 ダニスコ・ユーエス・インク 低温コメタンパク質濃縮物を含有する食品
EP4226935A3 (en) 2010-08-31 2023-09-06 Theraclone Sciences, Inc. Human immunodeficiency virus (hiv)-neutralizing antibodies
CN102380091A (zh) 2010-08-31 2012-03-21 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用
JP2014506115A (ja) 2010-09-15 2014-03-13 アリグナ テクノロジーズ，インク． リグニン由来の化合物からの芳香族化学物質のバイオプロダクション
WO2012040041A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Abbott Laboratories Purification of antibodies using simulated moving bed chromatography
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
US8481680B2 (en) 2010-10-05 2013-07-09 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP2624854B1 (en) 2010-10-08 2016-08-03 Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd Moesin inhibitors and uses thereof
KR101571940B1 (ko) 2010-10-08 2015-11-25 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디. 면역성 혈소판 감소증과 관련된 모에신 단편
JP5868410B2 (ja) 2010-10-08 2016-02-24 シャンハイ クーシン バイオテック カンパニー，リミテッド 再生不良性貧血と関連しているモエシン断片
KR101641756B1 (ko) 2010-10-08 2016-07-21 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디. 모에신 단편 및 그의 용도
WO2012045281A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Shanghai Kexin Biotech Co., Ltd. Diagnostic and therapeutic uses of moesin fragments
JP2014502148A (ja) 2010-10-27 2014-01-30 ダニスコ・ユーエス・インク イソプレン生産の向上を目的としたイソプレン合成酵素変異体
FI123942B (fi) 2010-10-29 2013-12-31 Ab Enzymes Oy Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja
CA2816950C (en) 2010-11-04 2018-11-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-23 antibodies
BR112013011167A2 (pt) 2010-11-05 2016-08-23 Abbvie Inc "exame de suplementos eficientes e efetivos para o desenvolvimento de meio quimicamente definido em cultura de células."
WO2012099566A1 (en) 2010-11-17 2012-07-26 Sea Lane Biotechnologies, Llc Influenza virus neutralizing agents that mimic the binding site of an influenza neutralizing antibody
WO2012088450A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Danisco Us Inc. Biological production of pentose sugars using recombinant cells
CA2824279A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
BR112013018316A2 (pt) 2010-12-22 2018-09-11 Danisco Us Inc composições e métodos para produção aprimorada de isopreno usando dois tipos de enzimas ispg
SG192727A1 (en) 2011-02-14 2013-09-30 Theraclone Sciences Inc Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza
JP2014515598A (ja) 2011-03-10 2014-07-03 エイチシーオー アンティボディ， インク． 二重特異性三鎖抗体様分子
WO2012122512A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Hco Antibody, Inc. Recombinant production of mixtures of single chain antibodies
US20120238730A1 (en) 2011-03-15 2012-09-20 Abbott Laboratories Integrated approach to the isolation and purification of antibodies
CN103533929A (zh) 2011-03-15 2014-01-22 特罗科隆科学有限公司 用于流行性感冒的治疗和诊断的组合物和方法
WO2012128810A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Abbott Laboratories Methods and systems for the analysis of protein samples
FI123425B (fi) 2011-03-31 2013-04-30 Ab Enzymes Oy Proteaasientsyymi ja sen käytöt
JP6248029B2 (ja) 2011-03-31 2017-12-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド ベータ７インテグリンアンタゴニストの投与方法
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US8785165B2 (en) 2011-04-29 2014-07-22 Danisco Us Inc. Single pH process for starch liquefaction and saccharification for high-density glucose syrups
JP6400470B2 (ja) 2011-05-16 2018-10-03 ジェネロン（シャンハイ）コーポレイション リミテッド 多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質および使用法
KR102148982B1 (ko) 2011-06-03 2020-08-27 조마 테크놀로지 리미티드 Tgf-베타에 특이적인 항체
JP2013040160A (ja) 2011-07-01 2013-02-28 Genentech Inc 自己免疫疾患を治療するための抗ｃｄ８３アゴニスト抗体の使用
ES2670621T3 (es) 2011-07-11 2018-05-31 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anticuerpos que se unen a OX40 y sus usos
WO2013022799A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Danisco Us Inc. PRODUCTION OF ISOPRENOIDS UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
CA2842481A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Genentech, Inc. Inhibition of angiogenesis in refractory tumors
US8822651B2 (en) 2011-08-30 2014-09-02 Theraclone Sciences, Inc. Human rhinovirus (HRV) antibodies
CN103945861B (zh) 2011-09-12 2018-06-05 阿穆尼克斯运营公司 胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法
JP2014533929A (ja) 2011-09-23 2014-12-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ５ｔ４およびｃｄ３に対する二重特異的結合性分子
CA2851855A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
CA2851308A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
EA031948B1 (ru) 2011-11-16 2019-03-29 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции
CA2857168C (en) 2011-12-01 2020-10-27 Protevobio, Inc. Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof
WO2013090915A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Braskem S.A. Modified microorganisms and methods of making butadiene using same
WO2013091903A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Novo Nordisk A/S Anti-crac channel antibodies
AU2012355356B2 (en) 2011-12-22 2017-10-12 Genentech, Inc. Ion exchange membrane chromatography
MX357071B (es) 2012-01-19 2018-06-22 Univ Cincinnati Medicamentos que comprenden apolipoproteína a-iv no glicosilada para el tratamiento de diabetes.
EP2809684A1 (en) 2012-01-31 2014-12-10 Genentech, Inc. Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
EP2812024B1 (en) 2012-02-09 2018-04-11 Var2 Pharmaceuticals ApS Targeting of chondroitin sulfate glycans
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
EP2814840B1 (en) 2012-02-15 2019-11-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii compositions and methods of making and using same
MX353382B (es) 2012-03-01 2018-01-10 Amgen Res Munich Gmbh Moleculas de union polipeptido de larga duracion.
WO2013158275A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9550818B2 (en) 2012-04-27 2017-01-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for use of vascular endothelial growth factor antagonists
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
EA201401204A1 (ru) 2012-05-03 2015-05-29 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитела к il-23p19
WO2013177118A2 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of non-human antibodies using protein a affinity chromatography
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
EP3305896A1 (en) 2012-06-08 2018-04-11 DuPont Nutrition Biosciences ApS Polypeptides having transgalactosylating activity
CA2878684A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 University Of Cincinnati Method of treating hyperglycemic disorders using apolipoprotein aiv
JP2015524808A (ja) 2012-07-25 2015-08-27 ユニバーシティ・オブ・シンシナティ アポリポタンパク質ａｉｖを用いたｉ型糖尿病の治療法
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
MY173334A (en) 2013-01-02 2020-01-16 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to tl1a and their uses
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
US9920121B2 (en) 2013-01-25 2018-03-20 Amgen Inc. Antibodies targeting CDH19 for melanoma
US10653779B2 (en) 2013-03-13 2020-05-19 Genentech, Inc. Formulations with reduced oxidation
AR095398A1 (es) 2013-03-13 2015-10-14 Genentech Inc Formulaciones con oxidación reducida
RU2707550C2 (ru) 2013-03-13 2019-11-27 Дженентек, Инк. Составы со сниженным окислением
CA2906057A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Genentech, Inc. Antibody formulations
CA3113172A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Genentech, Inc. Screen for compound that prevents protein oxidation based on comparison with l-tryptophan
US20140271633A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbvie Inc. Mammalian cell culture performance through surfactant supplementation of feed media
EP2836515A1 (en) 2013-03-14 2015-02-18 AbbVie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2014142882A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbvie Inc. Protein purification using displacement chromatography
AU2014240431A1 (en) 2013-03-14 2015-08-27 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing the same using displacement chromatography
BR112015022529A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Genentech Inc meios de cultura de células e processos de produção de anticorpo
US20140283157A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Diadexus, Inc. Lipoprotein-associated phospholipase a2 antibody compositions and methods of use
ES2759061T3 (es) 2013-03-15 2020-05-07 Biomolecular Holdings Llc Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica
PT2970449T (pt) 2013-03-15 2019-11-06 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de ligação de cadeia única compreendendo abp n-terminal
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
WO2014140368A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Research (Munich) Gmbh Antibody constructs for influenza m2 and cd3
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
PL2970875T3 (pl) 2013-03-15 2020-08-10 F.Hoffmann-La Roche Ag Kompozycje do hodowli komórkowych z przeciwutleniaczami i sposoby wytwarzania polipeptydów
US10233249B2 (en) 2013-03-19 2019-03-19 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
BR112015024856A2 (pt) 2013-03-27 2018-04-17 Genentech Inc métodos de determinação ou de monitoramento
CN112430266A (zh) 2013-05-31 2021-03-02 基因泰克公司 抗壁磷壁酸抗体和缀合物
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
AR097648A1 (es) 2013-09-13 2016-04-06 Amgen Inc Combinación de factores epigenéticos y compuestos biespecíficos que tienen como diana cd33 y cd3 en el tratamiento de leucemia mieloide
SG10201708542RA (en) 2013-09-27 2017-12-28 Genentech Inc Anti-pdl1 antibody formulations
EP3069137A1 (en) 2013-11-05 2016-09-21 Novartis Ag Organic compounds
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
WO2015086746A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps A method for preparing a dairy product having a stable content of galacto-oligosaccharide(s)
HUE047699T2 (hu) 2013-12-17 2020-05-28 Hoffmann La Roche Eljárások rákbetegségek kezelésére PD-1-tengelyhez kötõdõ antagonisták és taxánok alkalmazásával
CN105899535A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
US20150190506A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
CN106062005A (zh) 2013-12-30 2016-10-26 医药生命融合研究团 抗krs单克隆抗体及其用途
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2016039801A1 (en) 2014-01-31 2016-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies
ES2694857T3 (es) 2014-02-04 2018-12-27 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
CN106456574A (zh) 2014-03-14 2017-02-22 丹尼尔·J·卡鹏 含有非肽连接的杂合免疫球蛋白
EP3122799B8 (en) 2014-03-25 2020-03-11 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of preparing a poloxamer for use in cell culture medium
WO2015148809A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Genentech, Inc. Methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
CN106132439A (zh) 2014-03-31 2016-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 包含抗血管发生剂和ox40结合激动剂的组合疗法
US11345908B2 (en) 2014-05-30 2022-05-31 Braskem S.A. Modified microorganisms comprising an optimized system for oligosaccharide utilization and methods of using same
WO2015198320A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Methods of purifying antibodies
WO2016004197A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using cobalt
US20160185848A1 (en) 2014-07-09 2016-06-30 Abbvie Inc. Methods for modulating the glycosylation profile of recombinant proteins using sugars
EP3708679A1 (en) 2014-07-24 2020-09-16 Boehringer Ingelheim International GmbH Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
AU2015295242B2 (en) 2014-07-31 2020-10-22 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
AU2015294834B2 (en) 2014-07-31 2021-04-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
AR101669A1 (es) 2014-07-31 2017-01-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3
EP3193932B1 (en) 2014-09-15 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulations
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
TW202124419A (zh) 2014-10-24 2021-07-01 美商必治妥美雅史谷比公司 經修飾之fgf-21多肽及其用途
JP6974166B2 (ja) 2014-11-07 2021-12-01 デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス マンナナーゼ、セルラーゼおよびペクチナーゼが欠乏している、ベータ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を発現する組換え宿主細胞
MX2017006320A (es) 2014-11-17 2017-08-10 Genentech Inc Terapia combinada que comprende agonistas de unión de ox40 y antagonistas de unión del eje de pd-1.
RU2731055C2 (ru) 2014-12-03 2020-08-28 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение
SG10202103879YA (en) 2015-02-04 2021-05-28 Boehringer Ingelheim Int Methods of treating inflammatory diseases
CA2975875A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
CN108064267A (zh) 2015-02-09 2018-05-22 丹尼斯科美国公司 真菌菌株及使用方法
EP3978530A1 (en) 2015-02-26 2022-04-06 F. Hoffmann-La Roche AG Integrin beta7 antagonists and methods of treating crohn's disease
EP3265491A1 (en) 2015-03-03 2018-01-10 Xoma (Us) Llc Treatment of post-prandial hyperinsulinemia and hypoglycemia after bariatric surgery
WO2016144773A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Abbvie Inc. Arabinosylated glycoproteins
JP6901400B2 (ja) 2015-04-03 2021-07-14 ゾーマ テクノロジー リミテッド ＴＧＦ−β及びＰＤ−１の阻害物質を使用する癌の治療法
JP2018512422A (ja) 2015-04-14 2018-05-17 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 疾患の処置法
WO2016166360A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3
BR112017024579A2 (pt) 2015-05-22 2018-07-31 Dupont Nutrition Biosci Aps acetolactato descarboxilase
EP3763827A1 (en) 2015-05-29 2021-01-13 F. Hoffmann-La Roche AG Pd-l1 promoter methylation in cancer
WO2016205320A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
WO2017024060A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biogen Ma Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
TWI797060B (zh) 2015-08-04 2023-04-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
EP3334763A4 (en) 2015-08-11 2019-04-03 Wuxi Biologics (Cayman) Inc. NOVEL ANTI-PD-1 ANTIBODIES
DK3344282T3 (da) 2015-09-02 2020-12-14 Dupont Nutrition Biosci Aps Glycosidhydrolaser og anvendelse heraf til forebyggelse og/eller behandling af en patogen infektion hos et dyr
US20190248905A1 (en) 2015-09-07 2019-08-15 Helmholtz Zentrum Muenchen-Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Novel igfr-like receptor and uses thereof
TWI733695B (zh) 2015-09-18 2021-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 治療發炎性疾病之方法
SG11201804951SA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Genentech Inc Use of tryptophan derivatives for protein formulations
US10525137B2 (en) 2015-12-30 2020-01-07 Genentech, Inc. Formulations with reduced degradation of polysorbate
LT3411404T (lt) 2016-02-03 2022-12-27 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma ir cd3 bispecifiniai, t ląsteles aktyvuojantys antikūno konstruktai
IL260958B1 (en) 2016-02-03 2024-07-01 Amgen Res Munich Gmbh Constructs of bispecific antibodies to BCMA and CD3 that bind to T cells, preparations containing the same and uses thereof
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
CN116196412A (zh) 2016-03-15 2023-06-02 中外制药株式会社 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗gpc3抗体治疗癌症的方法
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
WO2017161976A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Ltd Novel anti-pd-l1 antibodies
CA3018794A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Use of il-23 antibodies for treating generalized pustular psoriasis
US11510966B2 (en) 2016-04-15 2022-11-29 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Use of IL-22 in treating necrotizing enterocolitis
EP3464354B1 (en) 2016-06-02 2021-07-28 Bloom Diagnostics AG Antibodies that bind to human anti-müllerian hormone (amh) and their uses
EP3478831B1 (en) 2016-06-30 2021-01-20 Danisco US Inc. Aspartic proteases
WO2018026748A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Xoma (Us) Llc Parathyroid hormone receptor 1 (pth1r) antibodies and uses thereof
EP3497129A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
BR112019004988A2 (pt) 2016-09-16 2019-06-04 Dupont Nutrition Biosci Aps variantes de decarboxilase de acetolactato que tem atividade específica aprimorada
EP3515950A4 (en) 2016-09-20 2020-10-28 Wuxi Biologics Ireland Limited. NEW ANTI-PCSK9 ANTIBODIES
CA3037875A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use of low ph active alpha-1,4/1,6-glycoside hydrolases as a feed additive for ruminants to enhance starch digestion
JP2019534710A (ja) 2016-09-28 2019-12-05 ゾーマ （ユーエス） リミテッド ライアビリティ カンパニー インターロイキン２に結合する抗体およびその使用
WO2018067599A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Danisco Us Inc. Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates
EP3848390A1 (en) 2016-10-14 2021-07-14 Boehringer Ingelheim International GmbH Methods of treating diseases
WO2018075474A1 (en) 2016-10-17 2018-04-26 Medical University Of South Carolina Compositions and methods for treating central nervous system injury
WO2018093752A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danisco Us Inc. Filamentous fungi with improved protein production
WO2018138376A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Novel igfr-like 2 receptor and uses thereof
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
WO2018148419A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
WO2018152496A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Compositions and methods for the diagnosis and treatment of zika virus infection
EP3592429A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 DuPont Nutrition Biosciences ApS Novel fungal fucosidases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
EP4095161A1 (en) 2017-03-15 2022-11-30 Tsinghua University Novel anti-trkb antibodies
EP3601350A1 (en) 2017-03-27 2020-02-05 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti il-36r antibodies combination therapy
WO2018182284A1 (ko) 2017-03-27 2018-10-04 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 세포 외막에 노출되는 라이실-tRNA 합성효소 N-말단 영역에 특이적으로 결합하는 항체
EP3615569A1 (en) 2017-04-25 2020-03-04 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies and methods for the diagnosis and treatment of epstein barr virus infection
WO2018204907A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Amgen Inc. Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs for improved storage and administration
US10793634B2 (en) 2017-06-09 2020-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-TrkB antibodies
WO2019018629A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services ANTIBODIES AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING INFECTION WITH HEPATITIS B VIRUS
US11339221B2 (en) 2017-11-01 2022-05-24 Tufts Medical Center, Inc. Bispecific antibody constructs and methods of use
JP7344206B2 (ja) 2017-12-11 2023-09-13 アムジェン インコーポレイテッド 二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス
UY38041A (es) 2017-12-29 2019-06-28 Amgen Inc Construcción de anticuerpo biespecífico dirigida a muc17 y cd3
CA3092037A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Celgene Corporation Bcma-binding antibodies and uses thereof
KR102340989B1 (ko) 2018-03-28 2021-12-20 에이비온 주식회사 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
CN112334485A (zh) 2018-04-06 2021-02-05 百进生物科技公司 抗-四次穿膜蛋白33药剂及其组合物以及制备和使用方法
WO2019213416A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Antibodies and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of epstein barr virus infection
TW202015723A (zh) 2018-05-18 2020-05-01 美商百歐維拉提夫治療公司 治療ａ型血友病的方法
SG11202012446UA (en) 2018-06-23 2021-01-28 Genentech Inc Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
EA202190094A1 (ru) 2018-06-29 2021-04-21 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитела против cd40 для применения в лечении аутоиммунного заболевания
US20210278406A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Varct Diagnostic Aps Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa
AR115925A1 (es) 2018-08-08 2021-03-10 Genentech Inc Uso de derivados de triptófano y l-metionina para formulación de proteínas
MX2021003213A (es) 2018-09-21 2021-05-12 Genentech Inc Metodos de diagnostico para cancer de mama triple negativo.
EP3856343A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Biolegend, Inc. Anti-tlr9 agents and compositions and methods for making and using the same
KR20210068408A (ko) 2018-09-28 2021-06-09 암젠 인크 가용성 bcma에 대한 항체
AU2019356564A1 (en) 2018-10-11 2021-04-29 Amgen Inc. Downstream processing of bispecific antibody constructs
EP3870614A1 (en) 2018-10-23 2021-09-01 GlyCardial Diagnostics, S.L. Antibodies specific for glycosylated apoj and uses thereof
AU2020248645A1 (en) 2019-03-27 2021-10-28 Tigatx, Inc. Engineered IgA antibodies and methods of use
MX2021013671A (es) 2019-05-09 2021-12-10 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-sema3a y sus usos para tratar enfermedades oculares.
KR20220012262A (ko) 2019-05-24 2022-02-03 산유 바이오파마슈티컬스 씨오., 엘티디. 신형 cldn18.2 결합분자
US20220259547A1 (en) 2019-06-13 2022-08-18 Amgeng Inc. Automated biomass-based perfusion control in the manufacturing of biologics
TW202115112A (zh) 2019-06-27 2021-04-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗-angpt2抗體
WO2021010800A1 (ko) 2019-07-18 2021-01-21 제이더블유바이오사이언스 주식회사 Wrs 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
JP2022545917A (ja) 2019-08-27 2022-11-01 トニックス ファーマ リミテッド 修飾ｔｆｆ２ポリペプチド
AU2020345787A1 (en) 2019-09-10 2022-03-24 Amgen Inc. Purification method for bispecific antigen-binding polypeptides with enhanced protein L capture dynamic binding capacity
KR102442204B1 (ko) 2019-09-20 2022-09-08 경북대학교 산학협력단 Cox2 단백질의 아세틸화 검출용 항체 및 이의 용도
TW202126685A (zh) 2019-09-24 2021-07-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途
AU2020381536A1 (en) 2019-11-13 2022-04-21 Amgen Inc. Method for reduced aggregate formation in downstream processing of bispecific antigen-binding molecules
CA3161898A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Basf Se Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals
MX2022007714A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Basf Se Disminucion de la toxicidad de terpenos y aumento de la posible produccion en microorganismos.
WO2021150824A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
CN113461817A (zh) 2020-03-31 2021-10-01 苏州泽璟生物制药股份有限公司 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用
KR20230002559A (ko) 2020-04-15 2023-01-05 제넨테크, 인크. 구리 손실 완화
IL298431A (en) 2020-05-26 2023-01-01 Boehringer Ingelheim Int Anti-pd-1 antibodies
MX2022015157A (es) 2020-06-02 2023-01-16 Arcus Biosciences Inc Anticuerpos para tigit.
US20210388064A1 (en) 2020-06-15 2021-12-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus antibodies and fragments thereof
MX2022015877A (es) 2020-06-16 2023-01-24 Genentech Inc Metodos y composiciones para tratar cancer de mama triple negativo.
EP3939999A1 (en) 2020-07-14 2022-01-19 Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Interleukin 11 receptor alpha subunit (il11ra) neutralizing antibodies and uses thereof
WO2022093640A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 BioLegend, Inc. Anti-nkg2c agents and compositions and methods for making and using the same
WO2022093641A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 BioLegend, Inc. Anti-nkg2a agents and compositions and methods for making and using the same
EP4240767A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Amgen Inc. Polypeptide constructs binding to cd3
BR112023008629A2 (pt) 2020-11-06 2023-10-03 Amgen Inc Construtos de polipeptídeos que se ligam seletivamente a cldn6 e cd3
TW202233678A (zh) 2020-11-06 2022-09-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 具有增強的剪切特徵的多肽
CN112480248B (zh) 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
CN117043181A (zh) 2020-12-18 2023-11-10 基尼科萨制药有限公司 蛋白质组合物以及其产生和使用方法
AU2022246675A1 (en) 2021-04-02 2023-10-19 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
EP4373855A1 (en) 2021-07-23 2024-05-29 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Igfr-l1 antibodies and uses thereof
WO2023105087A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Tubulis Gmbh Novel flt3 antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof in combination with tyrosine kinase inhibitors
EP4238988A1 (en) 2022-03-01 2023-09-06 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
WO2023173011A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Bristol-Myers Squibb Company Transient expression of therapeutic proteins
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
US20240182596A1 (en) 2022-10-18 2024-06-06 Tubulis Gmbh Anti-napi2b antibodies and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof
WO2024083953A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Tubulis Gmbh Novel anti-tpbg antibody and antibody-drug-conjugates based thereon, therapeutic methods and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
JPS62175183A (ja) * 1985-08-29 1987-07-31 ジエネンコ−　インコ−ポレ−テツド 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドとその製造方法及びその製造のためのベクタ−
EP0625577A1 (en) * 1985-08-29 1994-11-23 Genencor International, Inc. Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for their preparation, and vectors for their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
EP0244234A3 (en) 1988-10-12
JP2702924B2 (ja) 1998-01-26
ATE91714T1 (de) 1993-08-15
EP0244234B2 (en) 2001-11-07
DE3786592T2 (de) 1993-11-04
NO871785L (no) 1987-11-02
DE3786592D1 (de) 1993-08-26
ES2056817T3 (es) 1994-10-16
DK219087A (da) 1987-10-31
JPH08173156A (ja) 1996-07-09
NO871785D0 (no) 1987-04-29
DE3786592T3 (de) 2002-05-29
DK219087D0 (da) 1987-04-29
GB8610600D0 (en) 1986-06-04
FI871908A (fi) 1987-10-31
EP0244234A2 (en) 1987-11-04
IE60428B1 (en) 1994-07-13
IE871149L (en) 1987-10-30
DK175814B1 (da) 2005-03-07
ES2056817T5 (es) 2002-05-01
FI871908A0 (fi) 1987-04-29
JPS6394981A (ja) 1988-04-26
EP0244234B1 (en) 1993-07-21
JP2769305B2 (ja) 1998-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI108358B (fi) Trichoderman transformointi
Nakari-Set� l� et al. Production of Trichoderma reesei cellulases on glucose-containing media
Harkki et al. A novel fungal expression system: secretion of active calf chymosin from the filamentous fungus Trichoderma reesei
Uusitalo et al. Enzyme production by recombinant Trichoderma reesei strains
FI117388B (fi) Valintamerkkigeenittömät hiivakannat, menetelmä niiden valmistamiseksi ja näiden kantojen käyttö
CA1341532C (en) Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for making same, and vectors for making same
US5874276A (en) Cellulase enzymes and systems for their expressions
Singh et al. Heterologous protein expression in Hypocrea jecorina: a historical perspective and new developments
US20220145278A1 (en) Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates
KR20020093932A (ko) 사상균 크리소스포리움 분야에서의 발현 조절 서열 및발현 생성물
US12031168B2 (en) Methods for controlling protease production
JP3522744B2 (ja) セルラーゼタンパク質を含有する水性混合物からキシラナーゼの豊富な組成物を単離する方法
Kurzatkowski et al. Glucose-induced secretion of Trichoderma reesei xylanases
US5610034A (en) Immunoglobulin production by trichoderma
JP2023523925A (ja) 糸状菌細胞におけるタンパク質産生の増強のための組成物及び方法
AU657911B2 (en) Immunoglobulin production by (Trichoderma)
FI114482B (fi) Erittyvien proteiinien lisääntynyt tuotanto eukaryoottisilla yhdistelmäsoluilla
FI116529B (fi) Menetelmiä oleellisesti puhtaan EG III -sellulaasin tuottamiseksi alkoholia käyttäen
JP6830891B2 (ja) 真菌宿主株、ｄｎａ構築物および使用方法
EP3775222B1 (en) Fungal chaperone proteins
CN112105740A (zh) 真菌宿主中的长链非编码rna表达
FI120097B (fi) Uudet entsyymivalmisteet ja niiden valmistusmenetelmät
Podkaminer et al. Heterologous protein expression in Hypocrea jecorina: A historical perspective and new developments

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: ALTIA GROUP OY

MA Patent expired