ES2316173T3 - Genes inducibles por wnt-1. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene: i) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos 229-1002 de la SEC ID No. 1; ii) por lo menos 700 nucleótidos y por lo menos un 95% de identidad en la secuencia determinada sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan con la secuencia de ácidos nucleicos 229-1002 de la SEC ID No. 1; iii) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos 1-783 de a SEC ID No. 4; o iv) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con el ADNc del polipéptido del clon 65 humano en el Depósito ATCC No. 209536; en el que la expresión de dicho ácido nucleico es inducible por Wnt-1.
Description
Genes inducibles por Wnt-1.
La presente invención se realizó con la ayuda
del gobierno bajo la subvención nº 5PO1 CA41086, otorgada por el
National Institutes of Health, National Cancer Institute. El
gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
La presente invención se refiere generalmente a
la identificación y el aislamiento de ADN nuevo y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos útiles en el tratamiento de
tumores.
Los Wnts son codificados por una gran familia de
genes cuyos miembros se han encontrado en gusanos redondos,
insectos, pez cartilaginoso, y vertebrados. Holland et al.,
Dev. Suppl., 125-133 (1994). Se piensa que los Wnts
funcionan en una serie de procesos de desarrollo y fisiológicos, ya
que muchas especies diversas tienen múltiples genes de Wnt
conservados. McMahon, Trends Genet., 8: 236-242
(1992); Nusse y Varmus, Cell, 69: 1073-1087 (1992).
Los genes de Wnt codifican glicoproteínas secretadas que que
se piensa que funcionan como señales paracrinas o autocrinas
activas en varios tipos de células primitivas. McMahon,
supra; Nusse y Varmus, supra. La familia del factor
de crecimiento Wnt incluye más de diez genes identificados en el
ratón (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -4, -5A, -5B, -6, -7A, -7B, -8A,
-8B, -10B, -11, -12, y 13) (ver, por ejemplo, Gavin et al.,
Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990); Lee et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272 (1995);
Christiansen et al., Mech. Dev., 51: 341-350
(1995)) y por lo menos nueve genes identificados en el humano
(Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B, y -11) mediante
clonación de ADNc. Ver, por ejemplo, Vant Veer et al.,
Mol.Cell.Biol., 4: 2532-2534 (1984).
Originalmente se identificó el
proto-oncogén de Wnt-1
(int-1) a partir de tumores mamarios
inducidos por el virus de tumor mamario de ratón (MMTV) debido a la
inserción de secuencia de ADN viral. Nusse y Varmus, Cell, 31:
99-109 (1982). En ratones adultos, se detecta el
nivel de expresión de ARNm de Wnt-1 sólo en los testículos
durante los estadios tardíos del desarrollo de esperma. La proteína
Wnt-1 es de aproximadamente 42 KDa y contiene una
región hidrofóbica amino-terminal, la cual puede
funcionar como secuencia señal para la secreción. Nusse y Varmus,
supra, 1992. Se detecta la expresión de Wnt-2/irp en
tejidos fetales y adultos de ratón y su distribución no se solapa
con el patrón de expresión para Wnt-1. Se asocia
Wnt-3 con la tumorigénesis mamaria de ratón. Se detecta la
expresión de Wnt-3 en embriones de ratón en los
tubos neurales y en las yemas de las patas. Se detectan
transcripciones de Wnt-5a en las patas delanteras y traseras
en desarrollo en los días del 9,5 al 14,5 y se concentran los
niveles más altos en ectodermo apical en el extremo distal de las
patas. Nusse y Varmus, supra (1992). Recientemente, se
describió (WO95/17416) un factor de crecimiento de Wnt, llamado
Wnt-x, junto con la detección de la expresión de
Wnt-x en los tejidos óseos y en células derivadas de hueso.
También se describió el papel de Wnt-x en el
mantenimiento de osteoblastos maduros y el uso del factor de
crecimiento de Wnt-x como agente terapéutico o en el
desarrollo de otros agentes terapéuticos para tratar enfermedades
relacionadas con los huesos.
Los Wnts pueden jugar un papel en la
señalización celular local. Estudios bioquímicos han demostrado que
la mayor parte de proteína Wnt secretada puede encontrarse asociada
con la superficie celular o la matriz extracelular más que en
difusión libre por el medio. Papkoff y Schryver, Mol. Cell. Biol.,
10: 2723-2730 (1990); Bradley y Brown, EMBO J., 9:
1569-1575 (1990).
Estudios de mutaciones en los genes de
Wnt han indicado una función para Wnts en el control
de crecimiento y en el diseño tisular. En Drosophila,
wingless (wg) codifica un gen relacionado con Wnt
(Rijsewik et al., Cell, 50: 649-657 (1987)) y
mutaciones de wg modifican el patrón de ectodermo embrionario, la
neurogénesis, y el crecimiento externo de discos imaginales. Morata
y Lawerence, Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker.
Dev. Biol., 125: 96-108 (1988); klingensmith y
Nusse, Dev. Biol., 166: 396-414 (1994). En
Caenorhabditis elegans, lin-44 codifica un homólogo
de Wnt que se requiere para divisiones celulares asimétricas. Herman
y Horvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994). Las
mutaciones knock-out en ratones han demostrado que
las Wnts son esenciales para el desarrollo del cerebro (McMahon y
Bradley, Cell, 62: 1073-1085 (1990); Thomas y
Cappechi, Nature, 346: 847-850 (1990)), y el
crecimiento extreno de primordios embrionarios de riñón (Stark
et al., Nature, 372: 679-683 (1994)), el
brote de la cola (Takada et al., Genes Dev., 8:
174-189 (1994)), y el brote de las patas. Parr y
McMahon, Nature, 374: 350-353 (1995). La
sobreexpresión de Wnts en la glándula mamaria puede dar lugar a una
hiperplasia mamaria (McMahon, supra (1992); Nusse y Varmus,
supra (1992)), y desarrollo alveolar precoz. Bradbury et
al., Dev.Biol., 170: 553-563 (1995). Zheng et
al (1996) Oncogene 12, 555-562 describen un
gen, ret, cuyo nivel de ARNm en células PC12 se incrementó mediante
la expresión de Wnt-1.
Wnt-5a y Wnt-5b se expresan en el
mesodermo lateral y posterior y el mesodermo extraembrionario del
embrión de murino de 7-8 días. Gavin et al.,
supra. Estos dominios embrionarios contribuyen a la región
AGM y tejidos de saco vitelino a partir de los cuales se derivan los
precursores hematopoyéticos multipotentes y HSCs. Dzierzak y
Medvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995); Zon
et al., en Gluckman y Coulombel, ed., Colloque, INSERM,
235:17-22 (1995), presentado en el Joint
International. Wokshop on Foetal and Neonatal Hematopoyesis and
Mechanism of Bone Marrow Failure, Paris Francia, Abril
3-6, 1995; Kanatsuy Nichikawa, Development, 122:
823-830 (1996). Se han detectado Wnt-5a,
Wnt-10b, y otras Wnts en yemas de las patas, indicando
posibles funciones en el desarrollo y el diseño de microambiente de
hueso temprano tal y como se muestra para Wnt-7b. Gavin
et al., supra; Christiansen et al., Mech.
Devel., 51: 341-350 (1995); Parr y McMahon,
supra.
El mecanismo de transducción de señal de Wnt/Wg
juega un papel importante en el desarrollo biológico del organismo
y se ha implicado en diversos cánceres humanos. Este mecanismo
también incluye el gen supresor de tumor, APC. Las mutaciones en el
gen de APC están asociadas con el desarrollo de formas heredadas y
esporádicas de cáncer colorrectal humano. La señal Wnt/Wg conduce a
la acumulación de beta-catenina/Armadillo en la
célula, dando lugar a la formación de un complejo de transcripción
bipartido que consiste en beta-catenina y un miembro
de la familia del factor de transcripción de caja HMG de factor de
unión al potenciador linfoide/factor de célula T (LEF/TCF). Este
complejo se transloca al núcleo donde puede activar la expresión de
genes "downstream" de la señal de Wnt/Wg, tales como los genes
de Engrailed y Ultrabithorax en Drosophila. No obstante, actualmente
se desconocen los genes diana "downstream" de la señalización
de Wnt-1 en vertebrados que presumiblemente
funcionan en la tumorigénesis.
Para una revisión más reciente de Wnt, ver
Cadigan y Nusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305
(1997).
Se ha implicado otra familia de proteínas, las
subfamilias Rho y Rac de proteínas Ras, en la transformación
mediante ras oncogénico. Hasta ahora, se ha observado que para la
transformación de Ras es necesaria la activación de los mecanismos
gobernados por tres miembros de la familia Rho de proteínas de unión
de GTP, CDC42, Rac, y Rho. La activación de las mutaciones de Ras
suceden en aproximadamente un 30% de todos los tumores humanos,
indicando que los elementos de los mecanismos de señalización de
CDC42, Rac, y Rho son dianas de fármacos para la terapia del
cáncer. Estos tres miembros juegan un papel central en la
organización del citoesqueleto de actina y regulan la
transcripción. Como las Ras, las proteínas Rho interactúan
directamente con proteínas quinasas, que es probable que sirvan
como dianas de efectores "downstream" de la GTPasa activada.
Las funciones de las diferentes proteínas Rho en la transformación
de Ras parecen ser distintas: CDC42 controla específicamente el
crecimiento independiente del anclaje, mientras que Rac controla la
mitogenicidad inducida por Rac. Las proteínas G pequeñas Rac1, Rac2
y Rac3 están muy relacionadas con las GTPasas. Didsbury et
al., J. Biol. Chem., 264: 16378-16382 (1989);
Moll et al., Oncogene, 6: 863-866 (1991);
Shirsat et al., Oncogene, 5: 769-772 (1990);
Haataja et al., J. Biol. Chem., 272:
20384-20388 (1997). RAC3 se localiza en el
cromosoma 17q23-25, una región frecuentemente
eliminada en el cáncer de mama. Cropp et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87: 7737-7741 (1990); Cornelis
et al, Oncogene, 8: 781-785 (1993). Datos
recientes han proporcionado pruebas de que la actividad
constitutiva de las GTPasas de la familia Rho está relacionada con
la reorganización de citoesqueleto y el crecimiento desorganizado,
la motilidad y la invasividad de las células, todos sellos
distintivos de la neoplasia.
Existe la necesidad de elucidar los miembros
adicionales de las anteriores familias, incluyendo las moléculas de
la superficie celular que pueden ser antígenos específicos de
tumores o proteínas que cumplen una función reguladora en la
iniciación del mecanismo de Wnt de tumorigénesis. Esto también
incluiría componentes "downstream" del mecanismo de
señalización de Wnt que son importantes para el fenotipo
transformado y el desarrollo del cáncer. También existe la
necesidad de identificar otras proteínas que, quizá en conjunción
con beta-catenina, regulen los genes downstream de
Wnt-1, además de las GTPasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han identificado varios genes inducidos por
Wnt-1 putativos a nivel de ARNm en un experimento de
sustracción de ADNc de alto rendimiento. De este modo, los
solicitantes han identificado nuevos clones de ADN (clon 65 y clon
320) que codifican nuevos polipéptidos que son inducidos por Wnt,
designados como clon 65 y clon 320, respectivamente. La molécula
clon 65 tiene homología con la subfamilia Rac y Rho indicada
anteriormente.
En una realización, la presente invención
proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene
por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos una identidad en la
secuencia del 70% con (a) la secuencia de ácidos nucleicos
229-1002 de la SEC ID No. 1 o (b) el complemento de
la molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico
tiene por lo menos una actividad biológica de clon 65.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene
por lo menos 700 nucleótidos y por lo menos una identidad en la
secuencia del 95% determinada sobre la longitud completa de las
secuencias que se comparan con la secuencia de ácidos nucleicos
229-1002 de la SEC ID No. 1, o (b) el complemento
de la molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico
comprende ADN que codifica el polipéptido del clon 65 humano que
tiene los residuos de aminoácidos 1 a 258 de figuras 5A y 5B (SEC
ID No. 3), o el complemento del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene por
lo menos 800 nucleótidos y por lo menos una identidad en la
secuencia del 70% con la secuencia de ácidos nucleicos
1-783 de la SEC ID No. 4, o (b) el complemento de la
molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico
comprende ADN que tiene por lo menos aproximadamente una identidad
en la secuencia del 85% con la secuencia de ácidos nucleicos
1-783 de la SEC ID No. 4, o (b) el complemento de la
molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico
comprende ADN que codifica el polipéptido del clon 65 de ratón que
tiene los residuos de aminoácidos 1 a 261 de figuras 1A y 1B (SEC ID
No. 6), o el complemento del mismo.
En aún otra realización, la presente invención
proporciona un ácido nucleico aislado que comprende ADN que tiene
por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos una identidad en la
secuencia del 70% con el ADNc del polipéptido del clon 65 humano en
el Depósito ATCC No. 209536 (pRK5E.h.WIG-3.65.4A) o
(b) el complemento de la molécula de ADN de (a). Preferiblemente,
este ácido nucleico comprende ADN que tiene por lo menos
aproximadamente una identidad en la secuencia del 95% con el ADNc
del polipéptido del clon 65 humano en el Depósito ATCC No. 209536
(pRK5E.h.WIG-3.65.4A) o (b) el complemento de la
molécula de ADN de (a).
Un aspecto adicional de la presente invención
implica un proceso para producir un polipéptido del clon 65 que
comprende el cultivo de la una célula huésped que comprende un ácido
nucleico que codifica el clon 65 bajo condiciones adecuadas para la
expresión del polipéptido del clon 65 y la recuperación del
polipéptido del clon 65 del cultivo celular.
Se proporciona además un polipéptido del clon 65
aislado codificado por el ácido nucleico que codifica el clon 65.
Preferiblemente, este polipéptido es clon 65 humano o clon 65 de
ratón.
En otra realización, la presente invención
proporciona un ácido nucleico aislado que tiene por lo menos 800
nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con (a) la
secuencia de ácidos nucleicos 229-1002 de la SEC ID
No. 1 o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y tiene por
lo menos aproximadamente una identidad en la secuencia del 70% con
(a) o (b).
También se proporciona un polipéptido codificado
por un ácido nucleico que tiene por lo menos 800 nucleótidos que se
hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de ácidos
nucleicos 229-1002 de la SEC ID No. 1 y tiene por
lo menos una identidad en la secuencia del 70% con la misma.
Preferiblemente, los complementos de las
moléculas de ADN de la presente invención permanecen unidos de
manera estable a la secuencia primaria bajo condiciones astringentes
por lo menos moderadas, y opcionalmente, en condiciones
astringentes elevadas.
También se proporcionan vectores que comprenden
los ácidos nucleicos anteriores, células huésped que comprenden al
vector, preferiblemente donde la célula es una célula de ovario de
hámster chino (CHO), una célula de E. coli, una célula
infectada por baculovirus, o una célula de levadura.
Adicionalmente, se proporciona una molécula
quimérica que comprende uno de los polipéptidos anteriores o una
variante inactivada de los mismos, fusionados a una secuencia de
aminoácidos heteróloga, donde la secuencia de aminoácidos
heteróloga puede ser, por ejemplo, una secuencia etiqueta epítopo o
una región Fc de una inmunoglobulina. También se proporciona un
anticuerpo que se une específicamente a uno de los polipéptidos
anteriores, donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo
monoclonal.
Se proporciona además una composición que
comprende uno de los polipéptidos anteriores y un portador para el
mismo, y una composición que comprende un antagonista a uno de los
polipéptidos y un portador para el mismo, donde el antagonista es
un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido del clon
65. Preferiblemente, estas composiciones pueden comprender también
un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del
crecimiento.
También se contempla un procedimiento para
tratar un trastorno relacionado con el clon 65 en un mamífero que
comprende la administración del mamífero de una cantidad eficaz de
cualquiera de las composiciones anteriores. Preferiblemente, el
trastorno es un trastorno maligno o arteriosclerosis. Más
preferiblemente, el trastorno maligno es cáncer de mama, cáncer de
ovario, cáncer de colon o melanoma.
También se contempla en la presente invención un
equipo que comprende uno de los polipéptidos del clon 65 anteriores
o antagonistas del clon 65, tales como anticuerpos
anti-clon 65, e instrucciones para el uso del
anticuerpo para detectar un cáncer inducido por Wnt.
También se contempla un procedimiento para
inducir la muerte celular que comprende exponer una célula que está
inducida por Wnt a una cantidad eficaz de uno de los polipéptidos
del clon 65 anteriores o antagonistas del clon 65, tales como
anticuerpos anti-clon 65. Preferiblemente, dicha
célula es una célula de cáncer. Más preferiblemente, la célula se
encuentra en un mamífero, más preferiblemente un humano.
Opcionalmente, también se expone a la célula una cantidad eficaz de
otro anticuerpo quimioterapéutico, tal como un anticuerpo
anti-ErbB2. Además, opcionalmente el procedimiento
comprende la exposición de la célula a un agente quimioterapéutico,
un agente inhibidor del crecimiento, o radiación. Opcionalmente, la
célula se expone al agente inhibidor del crecimiento antes de la
exposición al anticuerpo anti-clon 65.
\vskip1.000000\baselineskip
La solicitud también describe un artículo de
fabricación, que comprende:
un recipiente;
una etiqueta en el recipiente; y
una composición que comprende un agente activo
contenido en el recipiente; donde la composición es eficaz para
inducir la muerte celular, la etiqueta en el recipiente indica que
la composición se puede utilizar para tratar estados patológicos
caracterizados por la sobreinducción de Wnt, y el agente activo en
la composición es uno de los polipéptidos indicados anteriormente,
o un antagonista a uno de los polipéptidos, tales como un
anticuerpo.
Las figuras 1A y 1B muestran la secuencia de
aminoácidos derivada de una proteína de clon 65 de secuencia nativa
de ratón de los aminoácidos 1 a 261 (SEC ID NO. 6) y la secuencia de
nucleótidos (y secuencia complementaria) que codifica la proteína
(SEC ID Nos. 4 y 5, respectivamente). Ésta es del clon 65.11.3 de
ratón. Se fusionó una secuencia de histidina al antígeno estable
térmicamente. Se ha eliminado la secuencia de antígeno estable
térmicamente. Hay 465 pb de la región 3' no traducida y 86 pb de la
región codificante. Las primeras 139 pb de la secuencia tiene un
89% en el contenido de GC. Esta es la región añadida comparada con
los miembros de otra familia. Un sitio potencial de glicosilación
se encuentra en el aminoácido 88 al 91. Un sitio potencial de
fosforilación de la proteína quinasa C se encuentra en los
aminoácidos 210 al 212. Los sitios potenciales de fosforilación de
caseína quinasa II se encuentran en los aminoácidos 84 a 87, 122 a
125, 164 a 167 y 202 a 205. Los sitios potenciales de
N-miristoilación se encuentran en los aminoácidos
29 a 34, 37 a 42, 46 a 51, y 225 a 240. Un sitio potencial de unión
al grupo prenilo se encuentra en el aminoácido de 258 a 261. Un
potencial motivo A (bucle P) del sitio de unión a ATP/GTP se
encuentra en los aminoácidos 59 a 66.
La figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEC ID No. 7) contenida en el ADNc del polipéptido del clon 320
humano en el depósito de ATCC no. 209534.
La figura 3 muestra otra secuencia de
nucleótidos (SEC ID No. 8) contenida en el ADNc del polipéptido del
clon 320 humano en el depósito de ATCC no. 209534.
Las figuras 4A y 4B muestran otra secuencia de
nucleótidos (y el complemento de la misma) (SEC ID Nos. 9 y 10,
respectivamente) contenida en el ADNc del polipéptido del clon 320
humano en el depósito de ATCC no. 209534.
Las figuras 5A y 5B muestran la secuencia de
aminoácidos derivada de una proteína de clon 65 de secuencia nativa
humana de los aminoácidos 1 a 258 (SEC ID NO. 3) y la secuencia de
nucleótidos de consenso (y secuencia complementaria) que codifica
la proteína (SEC ID Nos. 1 y 2, respectivamente), que deriva de tres
clones humanos de una biblioteca de hígado fetal humano. Hay 2955
pb de la región 3' no traducida y 777 pb de la región codificante
en la secuencia. Los sitios potenciales de glicosilación son desde
los aminoácidos 85 a 88, aminoácidos 138 a 141 y aminoácidos 245 a
248. Los sitios potenciales de fosforilación de la proteína quinasa
C se encuentra en los aminoácidos 140 al 142 y 207 a 209. Los
sitios potenciales de fosforilación de caseína quinasa II se
encuentran en los aminoácidos 81 a 84, 119 a 122, 161 a 164 y 199 a
2052. Los sitios potenciales de N-miristoilación se
encuentran en los aminoácidos 26 a 31, 43 a 48, y 222 a 227. Un
potencial motivo A (bucle P) del sitio de unión a ATP/GTP se
encuentra en los aminoácidos 56 a 63.
La figura 6 muestra la alineación de las
secuencias de aminoácidos de longitud completa del clon 65 humano y
de ratón (SEC ID Nos. 3 y 6, respectivamente).
La figura 7 muestra un mapa del vector pBabe
puro (5,1 kb) utilizado para transformar células con fines de
expresión diferencial. El vector incluye sitios de restricción
únicos y sitios de restricción múltiples. Aquí se muestra en forma
modificada para la clonación de Wnt-1, donde el
sitio HindIII después del promotor de SV40 en el vector
pBabe puro original ha sido eliminado y se ha añadido un sitio
HindIII al sitio de clonación múltiple del vector pBabe puro
original. Wnt-1 se clona a partir de
EcoRI-HindIII en el sitio de clonación múltiple. Las
construcciones derivadas de este vector se seleccionan en ampicilina
(100 \mug/ml) y las células infectadas en cultivo se seleccionan
en 1,0-2,5 \mug/ml de puromicina.
La figura 8 muestra las secuencias del cebador
de síntesis de ADNc PCR-Select® (SEC ID No. 20),
adaptadores 1 y 2 (SEC ID Nos. 21 y 22, respectivamente) y
secuencias complementarias para los adaptadores (SEC ID Nos. 23 y
24, respectivamente), cebador de PCR 1 (SEC ID No. 25), cebador de
PCR 2 (SEC ID No. 26), cebador de PCR 1 anidado (SEC ID No. 27),
cebador de PCR 2 anidado (SEC ID No. 28), cebador 5' de G3PDH del
cebador de control (SEC ID No. 29) y cebador 3' de G3PDH del
cebador de control (SEC ID No. 30) utilizados para la hibridación
sustractiva de supresión para identificar los clones 65 y 320.
Cuando los adaptadores se unen a ADNc digerido por RsaI, se
reestablece el sitio RsaI.
La figura 9 muestra la región del sitio de
clonación del plásmido pGEM-T utilizada para clonar
todas las secuencias de los clones 65 y 320 de la presente
invención (SEC ID Nos. 3 y 32 para las secuencias 5' y 3',
respectivamente).
La figura 10 muestra la secuencia (SEC ID No.
12) de un clon 65.11 obtenido mediante el cribado
(screening) con una sonda derivada del clon 65, que es el
clon inicial aislado en el proceso para obtener ADN del clon 65 de
longitud completa de ratón.
La figura 11 muestra la secuencia (SEC ID No.
13) de un clon 65.9 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada del clon 65.
La figura 12 muestra la secuencia (SEC ID No.
14) de un clon 65.11.1 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada de la región homóloga CDC-42 del clon
65.11.
Las figura 13A y 13B muestran la secuencia (SEC
ID No. 15) de un clon 65.11.3 obtenido mediante cribado con una
sonda derivada de la región homóloga CDC-42 del clon
65.11.
La figura 14 muestra la secuencia (SEC ID No.
16) de un clon 65.11.6 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada de la región homóloga CDC-42 del clon
65.11.
La figura 15 muestra la secuencia (SEC ID No.
17) de un clon 65.1 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada del clon 65.
La figura 16 muestra la secuencia (SEC ID No.
18) de un clon 65.6 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada del clon 65.
La figura 17 muestra la secuencia (SEC ID No.
19) de un clon 65.13 obtenido mediante cribado con una sonda
derivada del clon 65.
Los términos "polipéptido del clon 65",
"homólogo de clon 65" y variantes gramaticales de los mismos,
tal como se utilizan en la presente invención, comprenden la
proteína de la secuencia nativa derivada del clon 65 y variantes de
la misma (que se definen con detalle posteriormente). El polipéptido
del clon 65 se puede aislar de una variedad de fuentes, tales como
tipos de tejido humano o de otra fuente, o se puede preparar
mediante procedimientos recombinantes o sintéticos, o mediante
cualquier combinación de estas técnicas y técnicas similares.
Un "polipéptido del clon 65 de secuencia
natuva" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de
aminoácidos que un polipéptido del clon 65 derivado de la
naturaleza. Dichos polipéptidos del clon 65 de secuencia nativa se
pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir mediante medios
recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido del clon 65
de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas
naturales u otras formas de un polipéptido del clon 65 descrito en
la presente invención, formas variantes naturales (por ejemplo,
formas "spliced" de manera alternativa o variantes de
"splice" ("corte y empalme")), y variantes alélicas
naturales de un polipéptido del clon 65. En una realización de la
presente invención, el polipéptido del clon 65 de secuencia nativa
es un polipéptido del clon 65 de secuencia nativa de longitud
completa humano que comprende los aminoácidos 1 a 258 de las
figuras 5A y 5B (SEC ID No. 3), con o sin la metionina
N-terminal. En otra realización de la presente
invención, el polipéptido del clon 65 de secuencia nativa es un
polipéptido del clon 65 de secuencia nativa de longitud completa de
ratón que comprende los aminoácidos 1 a 261 de las figuras 1A y 1B
(SEC ID No. 6), con o sin la metionina
N-terminal.
En otra realización de la presente invención, el
polipéptido del clon 65 de secuencia nativa es el que está
codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende uno de los
"splice" del clon 65 de ratón u otras variantes de secuencia
nativa, que incluyen las SEC ID Nos. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18
ó 19, con o sin una metionina N-terminal.
El término "variante del clon 65" significa
un polipéptido del clon 65 activo tal como se define a
continuación, que tiene por lo menos aproximadamente un 80%,
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85%, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, aún más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con el clon 65 humano que tiene la
secuencia de aminoácidos deducida mostrada en las figuras 5A y 5B
(SEC ID No. 3) y/o con el clon 65 de ratón que tiene la secuencia
de aminoácidos deducida mostrada en las figuras 1A y 1B (SEC ID No.
6). Dichas variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos del clon
65 en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden a, o
eliminan de, el extremo N- o C-terminal de las
secuencias de longitud completa de las figuras 5A-B
y 1A-B (SEC ID Nos. 3 y 6, respectivamente),
incluyendo variantes de otras especies, pero se excluye un
polipéptido del clon 65 de secuencia nativa.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del clon
65 identificadas en la presente invención se define como el
porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata
que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia
del polipéptido del clon 65, después de la alineación de las
secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para
conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin
considerar ninguna sustitución conservativa como parte de identidad
de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede
conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por
ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente,
tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos
en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la
alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir
el máximo de alineación sobre la longitud completa de las secuencias
que se comparan.
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a la región
codificante de las secuencias del clon 65 identificadas en la
presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en
una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la
región codificante de la secuencia del clon 65 de interés, después
de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si
es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en
la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se puede
conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por
ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente,
tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTART^{TM}). Los
expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para
medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para
conseguir el máximo de alineación sobre la longitud completa de las
secuencias que se comparan.
"Condiciones astringentes" son aquéllas
que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada
para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico
0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan
durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como
formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de
suero bovino al 0,1%/Ficol al 0,1%/polivinilpirrolidona al
0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750
mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5
x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM
(pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN
de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato
de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS al
0,1%; o (4) utilizan un tampón de sulfato de dextrano al 10%, 2 x
SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC,
seguido de un lavado de astringencia elevada que consiste en 0,1 x
SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
astringentes" se describen en Sambrook y otros, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor
Press, 1989, e incluye la utilización de una solución de lavado y
condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica
y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un
ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación
durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende:
formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM),
fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de
dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fragmentado
desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en 1 x
SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la
materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc.,
según sea necesario para acomodar factores, tales como la longitud
de la sonda y similares.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos en la presente
invención, significa polipéptidos que se han identificado y separado
y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los
componentes contaminantes de su medio natural son materiales que
habitualmente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos
para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros
solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una
homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no
reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye
el polipéptido in situ en el interior de células
recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural
del polipéptido del clon 65 no estará presente. Normalmente, sin
embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos
una etapa de purificación.
Un ácido nucleico "aislado" que codifica un
polipéptido del clon 65 es una molécula de ácido nucleico que se
identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido
nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el
medio natural del ácido nucleico respectivo. Una molécula de ácido
nucleico que codifica el clon 65 aislada es diferente de la forma o
entorno en que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, la
molécula de ácido nucleico que codifica el clon 65 aislada se
distingue de la molécula de ácido nucleico que codifica el clon 65
tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula
de ácido nucleico que codifica el clon 65 aislada incluye una
molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente
expresan el ADN que codifica el clon 65, cuando, por ejemplo, la
molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización
cromosómica diferente de la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para
un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido
operativamente a una secuencia codificante si afecta la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está
unido operativamente a una secuencia codificante si está situado
para facilitar la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
están contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en
fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar
contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de
restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los
adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se
utilizan según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-clon 65 individuales (incluyendo
agonista, antagonista, y anticuerpos neutralizantes), y anticuerpos
anti-clon 65, y composiciones de anticuerpo con
especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo
monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se
refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos
sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales
que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles
mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas
cantidades.
"Activo" o "actividad" o "actividad
biológica", para los objetivos de la presente invención,
describen la actividad de una forma o formas de un polipéptido del
clon 65, incluyendo sus variantes, o sus antagonistas, que
mantienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de un
polipéptido del clon 65 nativo o natural (secuencia nativa) o su
antagonista. Las actividades "preferidas" para un polipéptido
del clon 65 o su antagonista incluyen la capacidad de inhibir la
proliferación de células tumorales o estimular la proliferación de
células normales y tratar la arteriosclerosis, incluyendo la
aterosclerosis, así como inducir la reparación de heridas y la
hematopoyesis, prevenir la desmoplasia, prevenir lesiones fibróticas
asociadas con trastornos de la piel, tales como escleroderma,
queloides, fascites eosinofílica, fascites nodular, y contractura de
Dupuytren, tratar enfermedades relacionadas con los huesos, tales
como osteoporosis, regular el anabolismo, incluyendo la inducción
del crecimiento, tratar trastornos inmunitarios, tratar el tumor de
Wilms y trastornos relacionados con los riñones, tratar trastornos
relacionados con los testículos, tratar trastornos relacionados con
los pulmones y tratar trastornos cardiacos.
Un "antagonista" de un polipéptido del clon
65 es una molécula que inhibe una actividad de un polipéptido del
clon 65. Los antagonistas preferidos son aquellos que interfieren
con o bloquean una actividad biológica indeseable de un polipéptido
del clon 65, tales como cuando un polipéptido del clon 65 puede
actuar para estimular las células cancerígenas y el antagonista
serviría para inhibir el crecimiento de estas células. Dichas
moléculas incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que tienen
dicha capacidad inhibidora, así como variantes de polipéptido de, y
receptores para, un polipéptido del clon 65 (si está disponible) o
partes del mismo que se unen al polipéptido del clon 65. De este
modo, el receptor puede ser clonado en la expresión a partir de la
familia; a continuación se produce una forma soluble del receptor
mediante la identificación del dominio extracelular y la escisión
del dominio transmembrana del mismo. La forma soluble del receptor
se puede utilizar entonces como antagonista, o el receptor se puede
utilizar para cribar moléculas pequeñas que antagonizarían la
actividad del polipéptido del clon 65.
Alternativamente, utilizando las secuencias de
nucleótidos murinos mostradas en las figuras 1-4
(SEC ID Nos. 4, 7, 8 ó 9, respectivamente), o la secuencia de
aminoácidos murino mostrada en la figura 1 (SEC ID No. 6) o las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos humanas mostradas en las
figuras 5A-5B (SEC ID Nos. 1 y 3), se consigue que
las variantes del clon 65 nativo actúen como antagonistas.
La actividad antagonista se puede determinar
mediante varios medios, incluyendo ensayos estándar para la
inducción de la muerte celular, tales como las descritas en la
presente invención, por ejemplo, ensayos de proliferación de
^{3}H-timidina, u otros ensayos mitogénicos, tales
como un ensayo que mide la capacidad del antagonista candidato de
inducir el crecimiento independiente de anclaje potenciado por EGF
de líneas celulares diana (Volckaert et al., Gene, 15:
215-223 (1981)) y/o la inhibición del crecimiento de
líneas de células neoplásicas. Roberts et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82: 119-123 (1985). El crecimiento
independientemente del anclaje se refiere a la capacidad de células
diana no neoplásicas tratadas con polipéptido del clon 65 o
tratadas con el polipéptido del clon 320 o tratadas con
TGF-\beta y tratadas con EGF, de formar colonias
en agar suave, una característica atribuida a la transformación de
las células. En este ensayo, el candidato se incuba junto con una
cantidad equimolar de un polipéptido del clon 65 detectable en el
ensayo de crecimiento de células diana independiente del anclaje
potenciado por EGF, y el se observa que el cultivo no consigue
inducir el crecimiento independiente del anclaje.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas. Los individuos que necesitan un tratamiento incluyen
individuos que ya padecen el trastorno o la enfermedad, así como
individuos en los cuales el trastorno o la enfermedad deben
prevenirse.
"Mamífero", para los objetivos de
tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como
mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y
animales de zoo, animales para deporte o mascotas, tales como
perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc.
Preferentemente, el mamífero es humano.
Un "trastorno relacionado con el clon 65"
es cualquier enfermedad que se beneficiaría del tratamientote los
polipéptidos del clon 65 o los antagonistas del clon 65 de la
presente invención. Esto incluye trastornos crónicos y agudos, así
como aquellos estados patológicos que predisponen al mamífero al
trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos a
tratar en la presente invención incluyen tumores benignos y
malignos; leucemias y tumores linfoides; trastornos neuronales,
gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos
glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos;
trastornos relacionados con la hematopoyesis; trastornos del
crecimiento del tejido; trastornos de la piel; desmoplasia, lesiones
fibróticas; trastornos de riñón; trastornos relacionados con los
huesos; traumas, tales como quemaduras, incisiones, y otras heridas;
estados catabólicos; trastornos relacionados con los testículos; y
trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, incluyendo
arteriosclerosis. Un "trastorno relacionado con Wnt" es el
causado por lo menos por la regulación por incremento del mecanismo
del gen Wnt, incluyendo Wnt-1 y
Wnt-4, pero preferiblemente Wnt-1,
y puede incluir cáncer.
Los términos "cáncer", "canceroso" y
"maligno" se refieren o describen el estado fisiológico en
mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular
no regulado. Algunos ejemplos de cáncer incluyen, pero no se
limitan a, carcinoma, incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma,
melanoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos más particulares de
dichos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer
de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no
pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el linfoma de Hodgkin y el
linfoma de no Hodgkin, el cáncer pancreático, el gliobastoma, el
cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, tal como
carcinoma hepático y hematoma, el cáncer de vejiga, el cáncer de
mama, el cáncer de colon, el cáncer colorectal, el carcinoma
endometrial, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de
riñón, tal como el carcinoma de células renales y tumores de Wilms,
carcinoma de células basales, melanoma, el cáncer de próstata, el
cáncer de vulva, el cáncer tiroideo, el cáncer testicular, el cáncer
de esófago, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los
cánceres preferidos para el tratamiento de la presente invención
son mama, colon, pulmón y melanoma.
El término "agente citotóxico", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una sustancia que
inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción
de las células. Se pretende que el término incluya isótopos
radioactivos (por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y
Re^{186}), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como
toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico,
vegetal o animal o fragmentos de los mismos.
Un "agente quimoterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Algunos
ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina,
doxorubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de
citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa,
busulfano, citoxina, taxol, toxotero, metotrexato, cisplatino,
melfalano, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida,
mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino,
tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina,
mitomicinas, esperamicinas (véase la patente de Estados Unidos No.
4.675.187), melfalano y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.
También se incluyen en esta definición agentes hormonales que
actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores,
como por ejemplo tamoxifeno y onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento",
cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un
compuesto o una composición que inhibe el crecimiento de una célula,
tal como una célula cancerígena que sobreexpresa
Wnt-1, bien in vitro o in vivo. Por lo
tanto, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce
significativamente el porcentaje de las células malignas en fase S.
Algunos ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen
los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un
punto diferente de la fase S), tal como agentes que inducen la
detención de G1 y la detención de la fase M. Algunos bloqueadores
clásicos de fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina),
taxol e inhibidores topo II, tales como doxorubicina,
daunorubicina, etopósido, y bleomicina. Los agentes que detienen G I
que también se extienden sobre la detención de la fase S, por
ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno,
prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato,
5-fluorouracilo, y ara-C. Puede
encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer,
Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle
regulation, oncogenes y antineoplastic drugs" por Murakami et
al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13.
El anticuerpo 4D5 (y equivalentes funcionales del mismo) también se
pueden utilizar para este objetivo si el cáncer implica células
cancerosas que sobreexpresan ErbB2. Véase, por ejemplo,
WO 92/22653.
WO 92/22653.
"Análisis Northern" o "transferencia
Northern" es un método utilizado para identificar secuencias de
ARN que se hibridan con una sonda conocida, tal como un
oligonucleótido, fragmento de ADN, ADNc o fragmento del mismo, o
fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo, tal como
^{32}P, o mediante biotinilación, o con una enzima. El ARN a
analizar normalmente se separa electroforéticamente en un gel de
agarosa o poliacrilamida, se transfiere a una membrana de
nitrocelulosa, nylon u otra membrana adecuada y se hibrida con la
sonda, utilizando técnicas estándar conocidas en el sector, tales
como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de
Sambrook et al., supra.
La técnica de "reacción en cadena de la
polimerasa" o "PCR", tal como se utiliza en la presente
invención, se refiere a un procedimiento en el que cantidades muy
pequeñas de una pieza específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se
amplifican tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No.
4.683.195 concedida el 28 de julio de 1987. En general, la
información de la secuencia de los extremos de la región de interés
o más allá necesita estar disponible, de manera que se pueden
diseñar cebadores oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos
o similares en la secuencia a las cadenas opuestas de la plantilla a
amplificar. Los nucleótidos del extremo 5' terminal de los dos
cebadores pueden coincidir con los extremos del material
amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias de
ARN específicas, secuencias de ADN específicas de AND genómico
total, y ADNc transcrito de ARN celular total, bacteriófago o
secuencias de plásmido, etc. Véase, en general, Mullis et
al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987);
Erlich, ed, PCR Technology (Stockton Press; NY, 1989). Tal como se
utiliza en la presente invención, la PCR se considera que es un
ejemplo, pero no el único, de un método de reacción de la ácido
nucleico polimerasa para la amplificación de una muestra de prueba
de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido
como cebador y un ácido nucleico polimerasa para amplificar o
generar una pieza especifica de ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican un
polipéptido al que se hace referencia en la presente solicitud como
polipéptido del clon 65. En particular, se han identificado y
aislados ADNc que codifican nuevos polipéptidos del clon 65 murino y
humano, tal como se describe en detalle en los Ejemplos
siguientes.
Utilizando los programas informáticos de
alineación de secuencias BLAST y FastA, se observó que las
secuencias codificantes de clon 65 de ratón y humano, así como las
tres secuencias para el clon 320 del ratón descritas en la presente
invención, muestran una homología significativa con las secuencias
de ADN descritas en la base de datos Gen Bank, incluyendo las
publicadas por Adams et al., Nature 377-174
(1995).
Utilizando los programas informáticos de
alineación de secuencias BLAST y FastA, se observó que el clon 65
de ratón y humano muestra una homología significativa con miembros
de la familia Rho de GTPasas pequeñas (clon 65 de ratón y humano
con un 58-59% y 59% homológos, respectivamente, con
la proteína de unión a G25k gtp humana, isoformas de placenta y
cerebro, y un 59% homólogo con la proteína de unión a CDC42 GTP
canina). Por consiguiente, se cree que los polipéptidos del clon 65
descritos en la presente solicitud poseen actividad que se
relaciona con el tratamiento de varios cánceres con los que está
asociado Ras, así como con la arteriosclerosis, tal como
aterosclerosis.
Además de los polipéptidos del clon 65 de
secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente
invención, se contempla que se pueden preparar variantes de estas
secuencias. Las variantes del clon 65 pueden prepararse
introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN que
codifica el clon 65 o mediante síntesis de los polipéptidos del
clon 65 de la variante deseada. Los expertos en la materia
entenderán que los cambios de aminoácido pueden alterar los
procesos post-traducción de los polipéptido del clon
65, tales como la modificación del número o posición de los sitios
de glicosilación o la alteración de las características de anclaje a
membrana, si el polipéptido del clon 65 activo está unido a
membrana.
Pueden realizarse variaciones en las secuencias
del clon 65 secuencia nativa de longitud completa o en diferentes
dominios de los polipéptidos del clon 65 descritos en la presente
invención, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y
directrices para llevar a cabo mutaciones conservativas y no
conservativas descritas, por ejemplo, en la patente de Estados
Unidos No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución,
una eliminación o una inserción de uno o más codones que codifican
el polipéptido del clon 65 que da lugar a un cambio en la secuencia
de aminoácidos en comparación con el polipéptido del clon 65 de
secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante
sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro
aminoácido en cualquier parte del polipéptido del clon 65. La guía
para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse,
sustituirse o eliminarse sin afectar de forma adversa la actividad
deseada, puede obtenerse comparando la secuencia del polipéptido
del clon 65 con la de las moléculas de proteína homólogas Rac o Rho
conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de
aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Las
sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la
sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene
propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la
sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones
de aminoácidos conservativos. Las inserciones o eliminaciones pueden
estar opcionalmente en el rango de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5 aminoácidos. La variación permitida puede
determinarse realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones
o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y evaluando las
variantes resultantes en cuanto a la actividad en ensayos in
vitro para la regulación por incremento o descenso de genes y en
animales transgénicos o knock-out.
Las variaciones pueden realizarse en el ADN
clonado para producir un ADN variante usando métodos conocidos en
la técnica tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos
(dirigida de sitio) (Carter et al., Nucl. Acids Res.,
13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487
(1987)), la mutagénesis de casete [Wells et al., Gene, 34:
315(1985)], el rastreo de alanina, la mutagénesis por PCR, la
mutagénesis de selección por restricción (Wells et al.,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas
conocidas.
El análisis de rastreo de aminoácidos puede
emplearse también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el
rastreo están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños.
Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La
alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo preferido en este
grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y
es menos probable que altere la conformación de la cadena principal
en la variante. También se prefiere habitualmente la alanina porque
es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente
tanto en posiciones escondidas como en las expuestas Creighton,
Proteins: Structure and Molecular Properties, (W. H. Freeman &
Co., San Francisco, 1983); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976). Si
la sustitución por alanina no rinde suficiente cantidad de
variante, se puede utilizar un aminoácido isotérico.
Además, las variantes de eliminación de los
polipéptidos del clon 65 de longitud completa incluyen variantes de
las que se ha eliminado el péptido señal N-terminal,
si existe, y/o la metionina de iniciación.
Dentro del ámbito de esta invención se incluyen
modificaciones covalentes de los polipéptidos del clon 65. Un tipo
de modificación covalente incluye la reacción de residuos de
aminoácidos marcados de un polipéptido del clon 65 con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas
laterales seleccionadas o los residuos N- o
C-terminales. La derivatización con agentes
bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular un polipéptido
del clon 65 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua
para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos
anti-clon 65, y viceversa. Entre los agentes de
reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres
disuccinimidílicos, tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos
glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina
y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de
serilo o treonilo, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina (Creighton, supra, páginas
79-86), la acetilación de la amina
N-terminal, y la amidación de cualquier grupo
carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido del clon 65 incluido en el alcance de la presente
invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo
del polipéptido. Por "alteración del patrón de glicosilación
nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende
indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados
en la secuencia nativa (ya sea mediante la eliminación del sitio
de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de los grupos
de glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos) y/o la
adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes
en la secuencia nativa. Además, la expresión incluye cambios
cualitativos si está presente la glicosilación de las proteínas
nativas que implican un cambio en la naturaleza y la proporción de
los diversos residuos de azúcar.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido del clon 65 se puede realizar alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o
treonina en la secuencia nativa (para sitios de glicosilación unidos
a O). La secuencia de aminoácidos puede alterarse opcionalmente a
través de los cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la
mutación del ADN que codifica el polipéptido del clon 65 ó 320 en
bases preseleccionadas, de manera que los codones que se generan se
traducirán en los aminoácidos deseados. La mutación mutaciones en el
ADN se pueden realizar utilizando métodos descritos
anteriormente.
Otros medios para aumentar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido del clon 65 es mediante acoplamiento
químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos
procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO
87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y
Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas
259-306 (1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido del clon 65 se puede realizar química o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para
la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son
conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52
(1987) y por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131
(1981). La división enzimática de grupos carbohidrato en los
polipéptidos se puede conseguir mediante la utilización de un
conjunto de endo- y exoglicosidasas tal y como se describe en
Thotakura et al. Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente comprende la
unión del polipéptido del clon 65 a uno de un conjunto de polímeros
no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o
polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de
Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417;
4.791.192 ó 4.179.337.
El polipéptido del clon 65 de la presente
invención también se puede modificar de manera que forme una
molécula quimérica que comprenda un polipéptido del clon 65, o un
fragmento del mismo, fusionado a un polipéptido o secuencia de
aminoácidos heterólogos. En una realización, dicha molécula
quimérica comprende una fusión del polipéptido del clon 65 con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede
unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El
epítopo etiqueta se sitúa generalmente en el extremo terminal amino
o carboxilo de una molécula del clon 65 nativa o variante. La
presencia de dichas formas de epítopo etiquetadas se pueden
detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta.
Además, la disposición del epítopo etiqueta permite que el
polipéptido del clon 65 se purifique fácilmente mediante
purificación de afinidad utilizando un anticuerpo
anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que
se une al epítopo etiqueta. En una realización alternativa, la
molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido del
clon 65, o fragmentos del mismo, con una inmunoglobulina o una
región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente
de la molécula quimérica, dicha fusión podría ser la región Fc de
una Ig, tal como una molécula IgG.
En la técnica se conocen varios polipéptidos
etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre los ejemplos se
incluyen etiquetas poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la
etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and
Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la
etiqueta de gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su
anticuerpo. Paborsky et al., Protein Engineering, 3
(6): 547-553 (1990). Entre otros polipéptidos
etiqueta se incluyen el péptido-Flag [Hopp et
al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)];
el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:
192-194 (1992)]; un péptido epítopo de
\alpha-tubulina [Skinner et al., J.
Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y el
péptido-etiqueta de la proteína T7 del gen 10
[Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
La siguiente descripción se refiere
principalmente a la producción de polipéptidos del clon 65 mediante
el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector
que contiene por lo menos ADN que codifica las secuencias de
maduras o de longitud completa del clon 65 humano o de ratón (SEC ID
Nos. 3 ó 6, respectivamente).
Naturalmente, se contempla que para preparar
polipéptidos del clon 65 se puedan utilizar procedimientos
alternativos que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la
secuencia del polipéptido del clon 65, o partes de la misma, se
pueden producir mediante síntesis directa de péptidos utilizando
técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewan et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman
Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis
de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas
manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se
puede realizar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos
Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones
del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del
polipéptido del clon 65 de forma separada y se pueden combinar
utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir un
polipéptido del clon 65 de longitud completa.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN que codifica un polipéptido del clon 65
se puede obtener a partir de una biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido del
clon 65 y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el
ADN que codifica el polipéptido del clon 65 humano se puede obtener
convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido humano, tal como una biblioteca de hígado fetal o,
en cualquier caso, tal como se describe en los Ejemplos. Los genes
que codifican polipéptidos del clon 65 también se puede obtener a
partir de una biblioteca genómica o mediante síntesis de
oligonucleótidos.
Un método adicional alternativo de clonación del
polipéptido del clon 65 es la hibridación supresiva sustractiva,
que es un método para generar sondas y bibliotecas de ADNc reguladas
de manera diferencial o específicas de tejido. Esto se describe,
por ejemplo, en Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93: 6025-6030 (1996). El procedimiento se basa
principalmente en una técnica denominada PCR de supresión y combina
la normalización y sustracción en un procedimiento único. La etapa
de normalización iguala la abundancia de ADNcs en la población
diana y la etapa de sustracción excluye las secuencias comunes entre
las poblaciones diana y conductoras.
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas
(tales como anticuerpos para un polipéptido del clon 65 u
oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente
20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de
interés o la proteína codificada por la misma. El cribado del ADNc
o la biblioteca genómica con la sonda seleccionada se puede
realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en
Sambrook et al., supra. Un medio alternativo para
aislar el gen que codifica un polipéptido del clon 65 es utilizar la
metodología de PCR. Sambrook et al., supra;
Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y
suficientemente inequívocas para que se minimicen los falsos
positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera
que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca
que se criba. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la
técnica, e incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP
marcado con ^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las
condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la
astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al.,
supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y
alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otras
bases de datos de secuencias privadas. La identidad en la secuencia
(a nivel de aminoácidos o nucleótidos) en las regiones definidas de
la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se
puede determinar mediante la alineación de secuencias utilizando
programas de software informático, tales como ALIGN, DNAstar e
INHERIT que utilizan varios algoritmos para medir la homología.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado
del ADNc o las bibliotecas genómicas seleccionadas utilizando las
secuencias de aminoácidos deducidas descritas en la presente
invención por primera vez, y, si es necesario, utilizando
procedimientos convencionales de extensión con cebadores tal y como
se describe en Sambrook et al., supra, para detectar
precursores e intermedios de procesamiento de ARNm que puede que no
se hayan transcrito de forma inversa en el ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para
la producción de polipéptido del clon 65 y se cultivan en medios
nutrientes convencionales modificados para que sean adecuados para
inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los
genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de
cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se
pueden seleccionar por un técnico en la materia sin una
experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y
técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos
celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook
et al., supra.
Los procedimientos de transfección son conocidos
por el técnico en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y
electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la
transformación se realiza utilizando técnicas estándar adecuadas a
dichas células. El tratamiento de calcio que utiliza cloruro
cálcico, tal y como se describe en Sambrook et al.,
supra, o la electroporación se utilizan generalmente para
procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular
sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal
como describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y
WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de
mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede utilizar el
procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van
der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la
Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito aspectos
generales de transformaciones de sistemas de células huésped de
mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo
habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al.,
J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también
se pueden utilizar otros procedimientos para introducir ADN en
células, tales como mediante microinyección nuclear,
electroporación, fusión de protoplasto bacteriano con células
intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para
varias técnicas para transformar células de mamífero, véase Keown
et al., Methods in enzymology,
185:527-537 (1990) y Manssur et al.,
Nature, 336. 348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para la
clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente
invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas
superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero so se
limitan a, eubacterias, tales como organismos
Gram-negativo o Gram-positivo, por
ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia,
por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium,
Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y
Shigella, así como Bacilli, tal como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41 P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de
abril de 1989), Pseudomonas, tales como P. aeruginosa,
y Streptomyces. . Varias cepas de E. coli
están disponibles públicamente, tales como la cepa de E.
coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC
31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC
53.635). Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La cepa
W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferible
ya que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de
ADN recombinantes. Preferiblemente, la célula huésped secreta
cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa
W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los
genes que codifican proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de
dichos huéspedes incluyendo la cepa de E. coli W3110 1A2, que
tiene el genotipo completo tonA; la cepa de E. coli
W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3;
la cepa de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el
genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT kan^{r}; la cepa de
E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP
ompT rbs7 ilvG kan^{r}; la cepa de E. coli W3110 40B4,
que es una cepa 37D6 con una mutación de deleción degP no
resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene
proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados
Unidos No. 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990.
Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in
vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de ácido nucleico
polimerasa.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son
huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que
codifican el polipéptido del clon 65 ó 320. El Saccharomyces
cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior
utilizado habitualmente. Sin embargo, están habitualmente
disponibles y son útiles en la presente invención un conjunto de
otros géneros, especies y cepas, tales como Schizosaccharomyces
pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383
publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces
(Patente de Estados Unidos No. 4.943.529; Fleer et al.,
Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por
ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574;
Louvencourt et al. J. Bacteriaol., 737 [1983]), K.
fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045),
K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500),
K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al.,
Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K.
marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris
(EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic. Microbiol.
28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma
reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces
occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y
hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora,
Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero
de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A.
nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum et al.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A.
Niger Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985].
Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente invención
e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en
metanol seleccionado del género que consiste en Hansenula,
Candida, Kloeckera, Pichia, Sacckaromyces, Torulopsis, y
Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son
ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C.
Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptido del clon 65 glicosilados se derivan de organismos
multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se
incluyen células de insectos, tales como Droshophila S2 y
Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de
líneas celulares huésped de mamíferos útiles se incluyen células de
ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Algunos ejemplos más
específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por
SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de
embrión humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en
cultivo de suspensión, (Graham et al., J. Gen Virol., 36:59
(1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de
sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula
huésped apropiada se considera que está dentro de la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico), que codifica el polipéptido del clon 65 deseado se puede
insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación
del ADN) o para la expresión. Existen varios vectores disponibles
públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de
plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos
nucleicos apropiada se puede insertar en el vector mediante una
serie de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o
sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando
técnicas conocidas en el sector. Los componentes de los vectores
incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias
señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un
elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de
la transcripción. La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de unión
estándar que son conocidas por un técnico en la materia.
El polipéptido del clon 65 deseado se puede
producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como
un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede
ser una secuencia señal, si el polipéptido del clon 65 es apto para
ser secretado, u otro polipéptido que tiene un sitio de división
específico en el extremo N-terminal de la proteína
o polipéptido maduro o de longitud completa. En general, la
secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una
parte del ADN que codifica el polipéptido del clon 65 que se
inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia
señal procariota tal como, por ejemplo, secuencias líderes de la
fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxinaII estable
térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal
puede ser, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levadura,
la secuencia líder del factor alfa (incluyendo las secuencias líder
del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces
líderes, el último descrito en la Patente de Estados Unidos No.
5.010.182), o la secuencia líder de la fosfatasa ácida, la
secuencia líder de C. Albicans glucoamilasa (EP 362.179
publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO
90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de
células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos se pueden
utilizar para dirigir la secreción de la proteína, tales como
secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o
especies relacionadas, así como secuencias líderes virales
secretoras, e incluyendo señales del polipéptido del clon 65.
Ambos vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la
replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias,
levadura, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322
es adecuado para la mayoría de bacterias
gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en
células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán
habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador
seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicillina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo,
el gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
que codifica el polipéptido del clon 65, tal como DHFR o timidina
quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo
natural es la línea de células CHO deficiente en actividad de DHFR,
que se prepara y propaga tal y como se describe por Urlaub et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de
selección adecuado para su utilización en la levadura es el gen
trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7. Stinchcomb
et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene,
7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980). El gen
trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa
mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en
triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1.
Jones, Genetics, 85:12 (1977).
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácidos nucleicos que codifica el polipéptido del clon 65 para
dirigir la síntesis de ARNm. Son conocidos los promotores
reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Entre
los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se
incluyen los sistemas de promotores de
\beta-lactamasa y lactosa [Chang et al.,
Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544
(1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano
(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y
promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo
(S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido del
clon 65.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen
promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una
transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son
las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo
C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la
utilización en la expresión en levaduras se describen en detalle en
EP 73.657.
La transcripción del clon 65 de vectores en
células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante
promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del
polioma, virus de la viruela aviar (Patente del Reino Unido
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el
Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma
aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la
hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40); de
promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de
actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque
térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con
los sistemas de célula huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN
que codifica un polipéptido del clon 65 por eucariotas superiores
mediante la inserción de una secuencia de potenciador en el vector.
Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN,
habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un
promotor para aumentar su transcripción. Muchas secuencias de
potenciador se conocen actualmente de genes de mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador
de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el
potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador del promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador
se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una
posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del
polipéptido del clon 65, pero se sitúa preferiblemente en un sitio
5' desde el promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles habitualmente desde las
regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs
eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte
no traducida del ARNm que codifica el polipéptido del clon 65.
En Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se
describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células
huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de polipéptidos
del clon 65 en cultivos de células de vertebrados recombinantes.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación génica y/o la expresión se
pueden medir directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional o transferencia Northern para
cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de
puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una
sonda marcada de forma adecuada, basada en las secuencias
proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, se
pueden usar anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles
específicas, incluidas cadenas dobles de ADN, cadenas dobles de ARN
y cadenas dobles híbridas de ADN-ARN o cadenas
dobles de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez
pueden estar marcados y el ensayo se puede llevar a cabo donde la
cadena doble esté unida a una superficie, de manera que una vez se
ha formado la cadena doble en la superficie, puede detectarse la
presencia del anticuerpo unido a la cadena doble.
Alternativamente, la expresión génica se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de
ejemplo pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar
en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden
preparar contra un polipéptido del clon 65 de secuencia nativa o
contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN
proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia
exógena fusionada a ADN que codifica el polipéptido del clon 65 y
que codifica un epítopo de anticuerpo específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las formas del polipéptido del clon 65 pueden
ser recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de las
células huésped. Si están unidas a membrana, se pueden liberar de la
membrana mediante una solución de detergente adecuada (por ejemplo,
Tritón-X 100) o por división enzimática. Las células
empleadas en la expresión del polipéptido del clon 65 se pueden
romper a través de diversos mecanismos físicos o químicos, tales
como ciclos de congelación y descongelación, sonicación, ruptura
mecánica o agentes que lisan las células.
Se puede desear purificar el polipéptido del
clon 65 a partir de proteínas o polipéptidos celulares
recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de
procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento
en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC
de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de
intercambio catiónico, tal como DEAE; "cromatofocusing";
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico;
filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex^{TM}
G-75; columnas de proteína A Sepharose^{TM} para
eliminar contaminantes, tales como IgG; y columnas quelantes de
metales para unirse a las formas epítopo-etiqueta
del polipéptido del clon 65. Se pueden usar diversos métodos de
purificación de proteínas, y dichos métodos son conocidos en la
técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in
Enzymology, 182 (1990); y Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice, (Springer-Verlag, New York 1982).
En un ejemplo específico de purificación, una
etiqueta poli-HIs o una parte Fc de IgG humana se
añaden a la región codificante C-terminal del ADNc
para el clon 65 antes de la expresión. El medio acondicionado de
las células transfectadas se recoge mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtran. Para las construcciones
etiquetadas con poli-His, la proteína se puede
purificar utilizando una columna de Ni-NTA. Después
de cargarse, la columna se puede lavar con tampón de equilibrio
adicional y la proteína eluida con tampón de equilibrio que
contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se puede
entonces, si se desea, desalar en un tampón de almacenamiento.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de los polipéptidos del clon 65 se pueden purificar
del medio acondicionado mediante el bombeo en una columna de
Proteína A de 5 ml que se había equilibrado en tampón fosfato.
Después de cargarse, la columna se puede lavar de manera extensa con
tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico. La
proteína eluida se puede neutralizar inmediatamente mediante la
recogida de fracciones de 1 ml en tubos que contienen tampón TRIS.
La proteína altamente purificada se puede posteriormente desalar en
tampón de almacenamiento tal como se ha descrito anteriormente para
las proteínas etiquetadas con poli-HIS. La
homogeneidad de la proteína se puede evaluar mediante
SDS-geles de poliacrilamida y mediante la
secuenciación de aminoácidos N-terminal mediante
degradación de Edman.
La etapa o etapas de purificación seleccionadas
dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción
utilizado y el polipéptido del clon 65 concreto producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican los polipéptidos del clon 65 tiene
varias aplicaciones en la disciplina de la biología molecular,
incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de
cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El
ácido nucleico que codifica el polipéptido del clon 65 también será
útil para la preparación de polipéptido del clon 65 mediante las
técnicas recombinantes descritas en la presente invención.
Las secuencias de nucleótidos de longitud
completa para el clon 65 de ratón o humano (SEC ID Nos. 4 y 1,
respectivamente), o partes de las mismas, se pueden utilizar como
sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar o
detectar el gen de longitud completa que codifica el polipéptido del
clon 65 de interés o para aislar o detectar incluso otros genes
(por ejemplo, aquéllos que codifican variantes naturales del
polipéptido del clon 65, otros miembros de la familia del
polipéptido del clon 65 o polipéptidos del clon 65 de otras
especies) que tienen una identidad de secuencia deseada con las
secuencias del polipéptido del clon 65 descritas en las figuras 1 y
5 (SEC ID Nos. 6 y 3, respectivamente). Por ejemplo, se pueden
utilizar procedimientos tales como la hibridación in situ,
la transferencia Northern y Southern, y el análisis PCR para
determinar si el ADN y/o el ARN que codifican un polipéptido del
clon 65 diferente están presente en el tipo o tipos de células que
se evalúan. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Por ejemplo, las
sondas de hibridación pueden derivar de ESTs, secuencias clonadas o
secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos
potenciadores, e intrones de ADN que codifica una secuencia nativa
del polipéptido del clon 65.
A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado
comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen del
clon 65 utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una
sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de
hibridación se pueden marcar con una serie de marcadores, incluyendo
radionucleótidos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcadores
enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a
través de los sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas
marcadas que tienen una secuencia complementaria a la de cualquiera
de los genes que codifican el polipéptido del clon 65 de la presente
invención se pueden utilizar para cribar bibliotecas de ADNc
humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de dichas
bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se
describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos.
Las sondas también se pueden utilizar en
técnicas de PCR para generar un conjunto de secuencias para la
identificación de secuencias del clon 65 estrechamente
relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido del clon 65 también se pueden utilizar para construir
sondas de hibridación para mapear el gen que codifica el polipéptido
del clon 65 particular y para el análisis genético de individuos
con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos
proporcionadas en la presente invención se pueden mapear a un
cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando
técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis
de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de
hibridación con bibliotecas.
El ácido nucleico que codifica un polipéptido
del clon 65 se puede utilizar como diagnóstico para determinar el
grado y velocidad de expresión del ADN que codifica un polipéptido
del clon 65 en las células de un paciente. Para realizar este
ensayo, se trata una muestra de células de un paciente, a través de
la hibridación in situ, o mediante otro medio adecuado, y se
analiza para determinar si la muestra contiene moléculas de ARNm
capaces de hibridarse con la molécula de ácido nucleico.
Los ácidos nucleicos que codifican el
polipéptido del clon 65 o cualquiera de sus formas modificadas
también se pueden utilizar para generar animales transgénicos o
animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el
desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal
transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que
tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el
animal o en un antecesor del animal en estado prenatal, por
ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN que está
integrado en el genoma de una célula de la que se desarrolla un
animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica un
polipéptido del clon 65 se puede utilizar para clonar ADN genómico
que codifica el polipéptido del clon 65 según las técnicas
establecidas y las secuencias genómicas se utilizan para generar
animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que
codifica el polipéptido del clon 65.
Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
se han convertido en convencionales en la técnica y se describen,
por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y
4.870.009 y WO 97/38086. Habitualmente, se marcarían células
concretas para la incorporación al transgén del clon 65 con
potenciadores específicos de tejido. Se pueden utilizar animales
transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica el
polipéptido del clon 65 introducido en la línea germinal del animal
en una etapa embrionaria, para examinar el efecto de la expresión
aumentada de ADN que codifica el polipéptido del clon 65. Dichos
animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos
pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones
patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de
la invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la
reducción de la incidencia de la condición patológica, en
comparación con animales no tratados que llevan el transgén,
indicaría una potencial intervención terapéutica en la condición
patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar homólogos
no humanos de polipéptidos del clon 65 para construir un animal
"knock out" con polipéptidos del clon 65 que tiene un gen
defectuoso o alterado que codifica un polipéptido del clon 65 como
resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que
codifica el polipéptido del clon 65 y el ADN genómico alterado que
codifica el polipéptido del clon 65 introducido en una célula
embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica el
polipéptido del clon 65 se puede utilizar para clonar ADN genómico
que codifica el polipéptido del clon 65 según las técnicas
establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica el
polipéptido del clon 65 se puede eliminar o sustituir por otro gen,
tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede
utilizar para monitorizar la integración. Habitualmente, se
incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado
(en los extremos 5' y 3'). Véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi,
Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de
recombinación homólogos. El vector se introduce en una línea de
células madres embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación)
y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha
recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno. Véase, por
ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992). A continuación, se
inyectan las células seleccionadas en un blastocito de un animal
(por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de
agregación. Véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.
(IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152. A
continuación, se puede implantar un embrión quimérico en un animal
criado hembra pseudoembarazada adecuado y el embrión se hace nacer
para crear un animal "knock out". La progenie que alberga el
ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales se puede
identificar mediante técnicas estándar y utilizar para criar
animales en los que todas las células del animal contienen el ADN
recombinado de forma homóloga. Los animales knock out se pueden
caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra
ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones
patológicas debido a la ausencia del polipéptido del clon 65.
En particular, los ensayos en los que los
miembros de las familias de Rac y Rho se utilizan normalmente se
realizan preferiblemente con el polipéptido del clon 65. Además, un
ensayo para determinar si TGF-\beta induce el
polipéptido del clon 65, que indica un papel en el cáncer, se puede
realizar tal como se conoce en la técnica, así como ensayos que
implican la inducción de la muerte celular y ensayos de
proliferación de ^{3}H-timidina. También se
realizan ensayos mitogénicos y de crecimiento de tejido con el
polipéptido del clon 65 tal como se ha indicado anteriormente. Los
resultados se aplican consecuentemente.
Los polipéptidos del clon 65 de la presente
invención también se puede utilizar para inducir la formación de
anticuerpos anti-polipéptido del clon 65, los cuales
se identifican mediante cribado de rutina tal como se indica en
detalle a continuación.
Para fines de diagnóstico, el polipéptido del
clon 65 se puede utilizar según la tecnología de inmunoensayo.
Algunos ejemplos de inmunoensayos son proporcionados por Wide en las
páginas 199-206 de Radioinmune Assay Method,
Kirkham y Huner, ed., E&S. Livingstone, Edinburgo, 1970.
De este modo, en una realización, los
polipéptidos del clon 65 se pueden marcar de manera detectable e
incubar con una muestra de prueba que contiene las moléculas de
interés (tal como fluidos biológicos, por ejemplo, suero, esputo,
orina, etc.) y establecer la cantidad de molécula de clon 65 unida a
la muestra.
La inmovilización de reactivos es necesaria para
ciertos métodos de ensayo. La inmovilización conlleva la separación
del polipéptido del clon 65 de cualquier analito que permanezca
libre en la solución. Esto se realiza de manera convencional
insolubilizando el polipéptido del clon 65 antes del procedimiento
de ensayo, mediante adsorción a un a matriz o superficie insoluble
en agua (Bennich et al., U.S. 3.720.760), mediante
acoplamiento covalente (por ejemplo, utilizando reticulación con
glutaraladehído) o mediante insolubilización de la molécula
posteriormente, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.
Lo indicado anteriormente son simplemente
ensayos de diagnóstico de ejemplo. Otros métodos desarrollados
ahora o posteriormente para la determinación de estos analitos se
incluyen en el alcance de la presente invención.
Además, los polipéptidos del clon 65 son útiles
para cribar compuestos que se unen a los mismos tal como se ha
definido anteriormente. Preferiblemente, estos compuestos son
moléculas pequeñas, tales como moléculas orgánicas o péptidos que
muestran una o más de las actividades deseadas. Los ensayos de
cribado de este tipo son habituales en la técnica y se puede
utilizar cualquiera de dichos procedimientos de cribado, mediante
los cuales la muestra de prueba entra en contacto con el polipéptido
del clon 65 de la presente invención y se determinan el grado de
unión y la actividad biológica de la molécula unida.
Los polipéptidos del clon 65 son también útiles
en la purificación por afinidad de una molécula que se une al
polipéptido del clon 65 y en la purificación de anticuerpos del
mismo. El polipéptido del clon 65 está acoplado habitualmente a una
resina inmovilizada, tal como Affi-Gel 10^{TM}
(Bio-Rad, Richmond, CA) u otras de dichas resinas
(matrices de soporte) mediante medios conocidos en la técnica. La
resina se equilibra en un tampón (tal como uno que contiene 150 mM
de NAcl, 20 nm de HEPES, pH 7,4 complementado hasta contener un 205
de glicerol y un 0,5% de NP-40) y la preparación a
purificar se coloca en contacto con la resina, mediante lo cual las
moléculas se absorben selectivamente al polipéptido del clon 65 en
la resina.
A continuación, la resina se lava
secuencialmente con tampones adecuados para eliminar el material no
adsorbido, incluyendo contaminantes no deseados, de la mezcla a
purificar, utilizando, por ejemplo, 150 mM de NaCl, 20 mM de HEPES,
pH 7,4, conteniendo NP-40 al 5%; 150 mM de NaCl, 20
mM de HEPES, pH 7,4, conteniendo 0,5 M de NaCl y
NP-40 al 0,1%; 150 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, pH
7,4, conteniendo deoxicolato al 0,1%; 150 mM de NaCl, 20 mM de
HEPES, pH 7,4, conteniendo NP-40 al 0,1%; y una
solución de NP-40 al 0,1%, glicerol al 20% y 50 mM
de glicina, pH 3. A continuación, la resina se trata para eluir la
molécula de unión utilizando un tampón que romperá el enlace entre
la molécula de unión y el polipéptido del clon 65 (utilizando, por
ejemplo, 50 mM de glicina, pH 3, NP-40 al 0,1%,
glicerol al 20% y 100 M de NaCl).
Se contempla que los polipéptidos del clon 65 de
la presente invención se pueden utilizar para tratar varios
condiciones patológicas, incluyendo aquellas caracterizadas por la
sobreexpresión y/o activación de por lo menos el mecanismo de Wnt.
Además, son útiles en el diagnóstico del cáncer, por ejemplo, como
marcador para una mayor susceptibilidad para el cáncer o para tener
cáncer. Entre las condiciones patológicas o trastornos de ejemplo a
tratar con los polipéptidos del clon 65 se incluyen tumores benignos
o malignos (por ejemplo, carcinomas renales, hígado, riñón, vejiga,
testicular, mama, gástrico, ovaio, colorrectal, próstata,
pancreático, pulmón, esófago, vulva, tiroides, hepático; sarcomas;
glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y
tumores linfoides; otras trastornos, tales como trastornos
neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos
glandulares, macrófagos, epiteliales, estromales y blastocoélicos;
trastornos cardíacos; trastornos renales; trastornos catabólicos;
trastornos relacionados con los huesos, tales como osteoporosis; y
trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, tales como
arteriosclerosis.
Los polipéotidos del clon 65 de la presente
invención se administran a un mamífero, preferiblemente un humano,
según los procedimientos conocidos, tales como administración
intravenosa como bolo o mediante infusión continua durante un
periodo de tiempo, mediante las rutas intramuscular,
intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular,
intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Se
prefiere la administración intravenosa o subcutánea del
polipéptido.
Las formulaciones terapéuticas del polipéptido
del clon 65 se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla
del polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con portadores,
excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente
aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición,
Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o
soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes
aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y
concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como
fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que
incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como,
cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio;
cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol
butílico o bencílico; alquil parabens, tales como metil o propil
paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol;
3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, histidina, argnina o lisina; monosacáridos, disacáridos
y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas;
agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa,
manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales,
tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de
Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales
como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol
(PEG).
(PEG).
Se pueden combinar otras pautas terapéuticas con
la administración de los polipéptidos del clon 65 de la presente
invención. Por ejemplo, el paciente a tratar con los polipéptidos
descritos en la presente invención también puede recibir terapia de
radiación si el trastorno es el cáncer. Alternativamente, o
adicionalmente, se puede administrar un agente quimioterapéutico al
paciente con cáncer. La preparación y pautas de dosificación para
dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar según las
instrucciones del fabricante o se determinan empíricamente por un
técnico. La preparación y pautas de dosificación para dicha
quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, Ed.,
M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, Md, 1992). El agente
quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración del
polipéptido o se puede administrar simultáneamente con el mismo. El
polipéptido se puede combinar con un compuesto
anti-estrógeno, tal como tamoxifeno, o una
anti-progesterona, tal como onapristona (véase, EP
616812) en dosis conocidas para dichas moléculas.
Puede ser deseable también coadministrar con el
polipéptido del clon 65 (o anticuerpos
anti-polipéptido del clon 65), anticuerpos contra
otros antígenos asociados con tumores, tales como anticuerpos que se
unen a HER-2, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, o factor
endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, se
pueden co-administrar al paciente dos o más
anticuerpos anti-cáncer diferentes, tales como
anticuerpos anti-ErbB2 con el polipéptido del clon
65 (o anticuerpos anti-polipéptido del clon 65).
Algunas veces, también puede ser beneficioso administrar una o más
citoquinas al paciente.
En una realización preferida, el polipéptido del
clon 65 se co-administra con un agente inhibidor del
crecimiento al paciente con cáncer. Por ejemplo, el agente
inhibidor del crecimiento se puede administrar en primer lugar,
seguido del polipéptido del clon 65. Sin embargo, también se
contempla la administración simultánea o la administración del
polipéptido del clon 65 en primer lugar. Las dosis adecuadas para el
agente inhibidor del crecimiento son aquellas utilizadas en la
presente y pueden disminuirse debido a la acción combinada
(sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el polipéptido.
Los anticuerpos, agentes citotóxicos, citoquinas, o agentes
inhibidores del crecimiento están presentes de manera adecuada en
combinación en cantidades que son eficaces para el objetivo
pretendido.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase,
por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed. (1980)
supra.
Las formulaciones a utilizar en la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación
controlada adecuadas se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas
matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de
liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por
ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente U.S.A. No.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros
de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON
DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de
ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato
de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación
de moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo
largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden idear estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que
el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir
mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización
de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la
utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones
de matrices de polímero específicas.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad o el trastorno, la dosificación apropiada del
polipéptido del clon 65 dependerá del tipo de trastorno a tratar,
tal y como se han definido anteriormente, la gravedad y la
evolución de la enfermedad, si el polipéptido se administra con
objetivos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial
clínico del paciente y la respuesta al polipéptido; la ruta de
admisnitración, la condición del paciente y la discreción del
médico de asistencia. El polipéptido se administra de forma
adecuada al paciente en una vez o durante una serie de
tratamientos.
Dependiendo del tipo y gravedad de la
enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo,
0,1-20 mg/kg) de polipéptido del clon 65 es una
dosis candidata inicial para la administración al paciente,
mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o
mediante infusión continua. Una dosificación diaria habitual podría
variar desde aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para
administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de
la condición, el tratamiento se mantiene hasta que tenga lugar
supresión deseada de síntomas del trastorno. Sin embargo, pueden
ser útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia
se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos
convencionales.
También se contempla un artículo de fabricación
que contiene materiales útiles para el tratamiento de los
trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación
comprende un recipiente y un marcador. Entre los recipientes
adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y
tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de una
variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente
contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la
condición patológica y puede tener un puerto de acceso estéril (por
ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial de solución
intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de
inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el
polipéptido del clon 65. El marcador en el recipiente o asociado
con el mismo indica que la composición se utiliza para el
tratamiento de la condición patológica o trastorno de elección. El
artículo de fabricación puede comprender además un segundo
recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal
como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer
y solución de dextrosa. Puede incluir también otros materiales
deseables desde un punto de vista comercial y del usuario,
incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y
prospectos con instrucciones para su uso.
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La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-polipéptido del clon 65. Entre los
anticuerpos de ejemplo se incluyen anticuerpos policlonales,
monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-polipéptido
del clon 65 de la presente invención pueden comprender anticuerpos
policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos
policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los
anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por
ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y,
si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o
adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones
múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante
puede incluir el polipéptido del clon 65 o una proteína de fusión
del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una
proteína conocida para que sea inmunogénica en el mamífero que se
inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se
incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de la lapa
californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor
de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes se pueden
incluir el adyuvante completo de Freund y el adyuvante
MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de
trehalosa sintético). El protocolo de inmunización se puede
seleccionar por un experto en la materia sin una gran
experimentación.
Los anticuerpos anti-polipéptido
del clon 65 pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando
procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y
Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma,
se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro animal
huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos
que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los
linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el
polipéptido del clon 65 o una proteína de fusión del misma.
Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica
("PLBs") si se desean células de origen humano, o células de
bazo o se utilizan células de nódulos linfáticos si se desean
fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se
fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de
fusión adecuado, tal como PEG, para formar una célula de hibridoma.
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (Academia
Press: Nuevo York 1986), páginas 59-103. Las líneas
celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero
transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor,
bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de
mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar
en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o
más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para
los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y
timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento
de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, soportan un nivel de
expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras
de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como
medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas
celulares de mieloma humano y heteromieloma de
ratón-humano se han descrito para la producción de
anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J. Immunol., 133:3001
(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production
Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
1987) páginas, 51-63.
A continuación, el medio de cultivo en el que
las células de hibridoma se cultivan se pueden ensayar para la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
polipéptido del clon 65. Preferiblemente, la especificidad de unión
de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma
se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de
unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis
Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar. Goding, supra. Entre los medios de
cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio
de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar
in vivo como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o
fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN
que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención
se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una
fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células
huésped, tales como células COS de simio, células CHO o células de
mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina,
para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células
huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por
ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios
constantes de la cadena pesada y ligera humanos en lugar de las
secuencias homólogas murinas (Patente de Estados Unidos No.
4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
6851-6855 (1984)) o uniendo covalentemente a la
secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la
secuencia codificante para un polipéptido de no inmunoglobulina.
Dicho polipéptido de no inmunoglobulina se puede sustituir por los
dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se
puede sustituir por los dominios variables de un sitio de
combinación a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear
un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc
para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente,
los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo
de aminoácido o se eliminan para evitar la reticulación.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias
conocidas en la técnica.
Los anticuerpos anti-polipéptido
del clon 65 de la invención pueden comprender además anticuerpos
humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de
anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas
(tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras
subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen
una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre
los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador),
tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad
y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la
estructura de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los
residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados
también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o la estructura
importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos,
dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las
regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y
todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una
secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado preferiblemente también comprenderá por lo menos una
parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente
la de una inmunoglobulina humana. Jones et al., Nature,
321:
522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no
humanos se indican frecuentemente como residuos "importados",
que se adquieren de un dominio variable "importado". La
humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el
procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al.,
Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et
al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen
et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)),
mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por
las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por
consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que
sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido
sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son
habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de
DCR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden
producir utilizando varias técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos. Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol., 222: 581 (1991). Las técnicas de Cole et al. y
Boerner et al. están también disponibles para la preparación
de anticuerpos monoclonales humanos. Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985);
Boerner et al., J. Inmunol., 147(1):
86-95 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es por un
polipéptido del clon 65; el otro es por cualquier otro antígeno, y
preferiblemente por una proteína o receptor o subunidad del receptor
de la superficie celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes. Millstein y Cuello, Nature, 305:
537-539 (1983). Debido a la variedad aleatoria de
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas
diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía
de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659
(1991) se describen procedimientos similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra,
CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la
unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210
(1986).
Los anticuerpos heteroconjugados están también
dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas
[Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de
la infección por VIH. WO 91/00360; WO 92/300373; EP 03089. Se
contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro
utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de
proteínas, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por
ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una
reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un
enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este
objetivo se incluyen el iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.
4.676.980.
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Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar como agentes de purificación por afinidad. En este
proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida, tal como
una resina SEPHADEX^{TM} o papel de filtro, utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado
se pone en contacto con una muestra que contiene el polipéptido del
clon 65 (o un fragmento del mismo) a purificar y, a continuación,
se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará
sustancialmente todo el material en la muestra a excepción del
polipéptido del clon 65 que está unido al anticuerpo inmovilizado.
Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal
como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el polipéptido del
clon 65 del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-polipéptido
del clon 65 también pueden ser útiles en los ensayos de diagnóstico
para el polipéptido del clon 65, por ejemplo, detectando su
expresión en células, tejidos o suero específicos. De este modo, se
pueden utilizar los anticuerpos en el diagnóstico de tumores humanos
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No.
5.183.884).
Para las aplicaciones de diagnóstico, el
anticuerpo se marcará habitualmente con un grupo detectable.
Existen numerosos marcadores disponibles que se pueden agrupar
preferiblemente en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos, tales como ^{35}S,
^{14}C, ^{125}I, ^{3}H, y ^{131}I. El anticuerpo se puede
marcar con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en
Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2. Coligen et
al., Ed., Wiley-Interscience. Nueva York, 1991),
por ejemplo, y la radiactividad se puede medir utilizando recuento
por centelleo.
(b) Están disponibles marcadores fluorescentes,
tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o
fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo,
Lissamina, ficoeritrina y Texas Red. Los marcadores fluorescentes
se pueden conjugar al anticuerpo utilizando las técnicas descritas
en Current Protocols in Immunology, supra., Coligen, ed.,
por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un
fluorímetro.
(c) Están disponibles varios marcadores de
enzima-sustrato y la Patente de de Estados Unidos
No. 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de éstos. La
enzima preferiblemente cataliza una alteración química del sustrato
cromogénico que se puede medir utilizando varias técnicas. Por
ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un
sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. De modo
alternativo, la enzima puede alterar la fluorescencia o la
quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un
cambio en la fluorescencia están descritas anteriormente. El
sustrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado
mediante una reacción química y puede entonces emitir luz que se
puede medir (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona
energía a un aceptor fluorescente. Entre los ejemplos de marcadores
enzimáticos se incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de
luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de Estados Unidos No.
4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas,
malato deshidrogenada, ureasa, peroxidasa, tal como peroxidasa de
rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima,
sacarina oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa,
y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa),
oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa),
lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para
conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et
al., Methods for the Preparation of
Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme
Immunoassay, en Methods in Enzym., Vol. 73, Langone y Van Vunakis,
eds. (Nueva York: Academic Press, 1981), páginas
147-166.
Entre los ejemplos de combinaciones de
enzima-sustrato se incluyen, por ejemplo:
(i) peroxidasa de rábano picante (HRPO) con
hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno peroxidasa
oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilen diamina
(OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil
benzidina (TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con
para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico;
y
(iii)
\beta-D-galactosidasa
(\beta-D-Gal) con un sustrato
cromogénico (por ejemplo,
p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa)
o sustrato fluorogénico
4-metillumbeliferil-\beta-D-galactosidasa).
Para los expertos en la materia, están
disponibles numerosas otras combinaciones de
enzima-sustrato. Para una revisión general de las
mismas, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.275.149 y
4.318.980.
Algunas veces, el marcador está indirectamente
conjugado con el anticuerpo. El técnico experto conocerá las
diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo se
puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias
categorías de marcadores mencionados anteriormente se pueden
conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente
a avidina y, de este modo, el marcador se puede conjugar con el
anticuerpo de esta manera indirecta. De modo alternativo, para
conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo,
el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo,
digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados
anteriormente se conjuga con un anticuerpo
anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo
anti-digoxina). De este modo, se puede conseguir la
conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
En otra realización de la presente invención, el
anticuerpo anti-polipéptido del clon 65 no necesita
estar marcado, y la presencia del mismo se puede detectar utilizando
un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo
anti-polipéptido del clon 65.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar en cualquier método de ensayo conocido, tal como
ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo e
indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal
Antibodies A Manual of Techniques, (Nueva York: CRC Press. Inc.,
1987), páginas 147-158.
Los ensayos de unión competitiva dependen de la
capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la
muestra de prueba para la unión con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad del polipéptido del clon 65 en la muestra
de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que
se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la
cantidad de patrón que se une, los anticuerpos preferiblemente se
insolubilizan antes o después de la competición, de manera que el
patrón y el analito que están unidos a los anticuerpos se pueden
separar de manera adecuada del patrón y el analito que permanecen no
unidos.
Los ensayos de sándwich implican la utilización
de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una parte
inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un
ensayo de sándwich, el analito de la muestra de prueba se une a un
primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido y, a
continuación, un segundo anticuerpo se une al analito, formando así
un complejo de tres partes insolubles. Véase, por ejemplo, la
Patente de Estados Unidos No. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede
estar marcado en sí mismo con un grupo detectable (ensayos de
sándwich directos) o se puede medir utilizando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo
detectable (ensayo de sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo de sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo
detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor
puede ser reciente o congelada o puede estar envuelta de parafina y
fijada con un conservante, tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para
ensayos de diagnóstico in vivo. Preferiblemente, el
anticuerpo se marca con un radionucleido (tal como ^{111}In,
^{99}Tc, ^{14}C, ^{131}I, ^{125}I, ^{3}H, ^{32}P o
^{35}S), de manera que el tumor se puede localizar utilizando
inmunocentelleografía.
Adicionalmente, los anticuerpos
anti-polipéptido del clon 65 pueden ser útiles como
antagonistas de las funciones del polipéptido del clon 65, donde el
polipéptido del clon 65 se regula por incremento en células
cancerosas o estimula su proliferación o se regula por incremento en
tejido aterosclerótico. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos
anti-polipéptido del clon 65 pueden ser por sí
mismos o con un agente quimioterapéutico u otro tratamiento para el
cáncer o fármaco, tal como anticuerpo anti-HER2,
eficaces en el tratamiento de ciertas formas de cáncer, tal como
cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, y melanoma. Entre
los usos adicionales para los anticuerpos se incluyen la inhibición
de la unión de un polipéptido del clon 65 a su receptor, si es
aplicable, o a una proteína que se une al polipéptido del clon 65,
si es aplicable. Para el uso terapéutico, los anticuerpos se pueden
utilizar en las formulaciones, pautas, rutas y dosis indicadas
anteriormente en los usos para los polipéptidos del clon 65. Además,
los anticuerpos anti-polipéptido del clon 65 se
pueden administrar en la linfa, así como en el torrente
sanguíneo.
Por conveniencia, el anticuerpo
anti-polipéptido del clon 65 de la presente
invención se puede disponer en formato de kit, es decir una
combinación de reactivos envasados en cantidades predeterminadas con
instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el
anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y
cofactores necesarios por la enzima (por ejemplo, un precursor de
sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectables).
Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes,
tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis), y
similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se
pueden variar para proporcionar concentraciones en solución de los
reactivos que maximizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo.
Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos
secos, normalmente liofilizados, incluyendo excipientes que en
disolución proporcionarán una solución de reactivos que tiene la
proporción adecuada.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el
alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo
contrario. El origen de las células identificadas en los siguientes
ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de
la ATCC pertenecen a la American Type Culture Collection, 10801
University Blvd., Manassas, Virginia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han identificado varios genes putativos que
codifican los polipéptidos del clon 65 y 320 a nivel de ARNm en un
experimento de sustracción de ARNc de PCR-Select de
alto rendimiento llevado a cabo utilizando una línea celular de
mamífero ratón (C57MG), que se ha transformado por un vector
retroviral Wnt-1 y comparado con la línea celular
parental. La familia de polipéptidos del clon 65 y 320 descritos en
la presente invención, incluyendo el gen del clon 65, se indujo
sólo en la línea celular transformada
C57MGWnt-1.
Se aisló independientemente el clon 65 de ratón
mediante cribado diferencial de Wnt-1 utilizando
hibridación de supresión sustractiva (SSH), tal y como está
descrito por Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93: 6025-6030 (1996). Se llevó a cabo la SSH
utilizando el el kit de sustracción de ADNc
PCR-SELECT® (Clontech Laboratories, Inc.) de
acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADNc de doble
cadena (ds) conductor a partir de 2 microgramos de ARN poliA+
aislado de una línea celular mamaria de ratón (C57MG), disponible
de una línea celular mioepitelial de cáncer de mama de ratón. Esta
línea celular se describe en Brown et al., Cell, 46:
1001-1009 (1986); Olson y Papkoff, Cell Growth and
Differentiation, 5: 197-206 (1994); Wong et
al., Mol. Cell. Biol., 14: 6278-6286 (1994); y
Jue et al., Mol. Cell, Biol., 12: 321-328
(1992), y es sensible a Wnt-1 pero no a
Wnt-4. Se sintetizó ADNc ds prueba a partir de 2
microgramos de ARN poliA+ aislado a partir de una versión
transformada de C57MG, llamada C57MG/wnt-1.
Se preparó la línea celular derivada mamaria de
ratón C57MG/wnt-1 mediante la transformación en
primer lugar de la línea parental con un vector retroviral de
Wnt-1, pBabe Puro (5,1 kb). Este vector tiene un 5'
LTR, elementos de empaquetamiento, un sitio de clonación múltiple,
el gen de resistencia a puromicina alejada del promotor de SV40, un
3' LTR, y los elementos bacterianos para la replicación y la
selección de ampicilina. Se modificó ligeramente el vector para la
clonación de Wnt-1 mediante la eliminación del sitio
HindIII tras el promotor de SV40 y la adición de un sitio
HindIII en el sitio de clonación múltiple. Se clonó
Wnt-1 a partir de EcoRI-HindIII en el
sitio de clonación múltiple. La Figura 7 muestra un mapa del
vector.
Se desarrollaron las células derivadas
transformadas de un modo convencional, y se seleccionó la población
celular final en DMEM + FCS al 10% con 2,5 \mug/ml de puromicina
para estabilizar el vector de expresión. Se realizó la PCR
utilizando el kit de Clontech, incluyendo el cebador de síntesis de
ADNc (SEC ID Nº: 20), adaptadores 1 y 2 (SEC ID Nos: 21 y 22,
respectivamente) y secuencias complementarias para los adaptadores
(SEC ID Nos: 23 y 24, respectivamente), cebador 1 de PCR (SEC ID No:
25), cebador 2 de PCR (SEC ID No: 26), cebador 1 de PCR anidado
(SEC ID No: 27), cebador 2 de PCR anidado (SEC ID No: 28), cebador
G3PDH5' de cebador de control (SEC ID No: 29), y cebador G3PDH3' de
cebador de control (SEC ID No: 30), mostrado en la Figura 8.
Se insertaron productos generados a partir de la
reacción de PCR secundaria en la región del sitio de clonación del
vector pGEM-T (Promega), mostrado en la Figura 9
(SEC ID Nos: 31 y 32 para las secuencias 5' y 3', respectivamente).
Se prepararon los ADNs de plásmido utilizando el Wizard Miniprep
Kit^{TM} (Promega). Se realizó la secuenciación de ADN de los
fragmentos de PCR subclonados de forma manual mediante la reacción
de terminación de cadena (Sequenase 2.0^{TM} Kit, Pharmacia). Se
realizaron búsquedas de homología de ácido nucleico utilizando el
programa BLAST anotado anteriormente.
Se secuenciaron un total de 1384 clones a partir
de más de 5000 encontrados. Se prepararon un total de 1996
plantillas de ADN. Se utilizó un programa para recortar el vector, y
se utilizó un programa diferente para agrupar los clones en dos o
más clones idénticos o con un solapamiento de 50 bases iguales. A
continuación, se realizó un BLAST de un clon representativo de la
agrupación. Se diseñaron cebadores para RT-PCR para
ver si los clones se expresaban de manera diferencial.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon inicial aislado, designado como clon 65,
tenía 212 pb y la secuencia:
Los cebadores de RT-PCR se
diseñaron para confirmar la expresión diferencial, obtener clones
adicionales, cribar clon de ratón de longitud completa, y cribar el
clon humano. Los cebadores de RT-PCR se diseñaron
tal como se indica a continuación:
Para el procedimiento de RT-PCR,
se desarrollaron líneas celulares para la subconfluencia antes de
extraer el ADN. El ARN total se extrajo utilizando
Stat-60^{TM} (Tel-Test^{TM} B)
según las instrucciones del fabricante. La primera cadena de ADNc
se preparó a partir de 0,1 \mug - 3 \mug de ARN total con el
kit Superscript^{TM} RT (Gibco, BRL). La amplificación por PCR de
5 \mul de la primera cadena de ADNc se realizó en una reacción de
PCR con 50 \mul. Los cebadores anteriores se utilizaron para
amplificar la primera cadena de ADNc. Como controles, se utilizaron
cebadores correspondientes a las posiciones de nucleótidos
707-729 (sentido;
5'-GTGGCCCATGCTCTGGCAGAGGG (SEC ID No. 35)) o
836-859 (sentido;
5'-GACTGGAGCAAGGTCGTCCTCGCC (SEC ID No. 36)) y
1048-1071 (antisentido;
5'-GCACCACCCACAAGGAAGCCATCC (SEC ID No. 37)) de
triosafosfato isomera humana (huTPI) (Maquat et al., J.
Biol. Chem., 260: 3748-3753 (1985); Brown et
al., Mol. Cell. Biol., 5: 1694-1706 (1985)),
para amplificar la primera cadena de ADNc. Para la triosafosfato
isomera de ratón, se utilizaron para la amplificación los cebadores
correspondientes a las posiciones de nucleótidos
433-456 (sentido:
5'-GACGAAAGGGAAGCCGGCAT
CACC (SEC ID No. 38)) o 457-480 pb (sentido; 5'-GAGAAGGTCGTGTTCGAGCAAACC (SEC ID No. 39)) y 577-600 pb (antisentido; 5'- CTTCTCGTGTACTTCCTGTGCCTG (SEC ID No. 40)) o 694-717 pb (antisentido; 5'-CACGTCAGCTGGCGTTGCCAGCTC (SEC ID NO. 41)).
CACC (SEC ID No. 38)) o 457-480 pb (sentido; 5'-GAGAAGGTCGTGTTCGAGCAAACC (SEC ID No. 39)) y 577-600 pb (antisentido; 5'- CTTCTCGTGTACTTCCTGTGCCTG (SEC ID No. 40)) o 694-717 pb (antisentido; 5'-CACGTCAGCTGGCGTTGCCAGCTC (SEC ID NO. 41)).
Brevemente, se añadieron 4 \muCi de
(-^{32}P)CTP (3000 Ci/mmol) a cada reacción con 2,5 U de
TaKaRa Ex Taq^{TM} (Panvera, Madison, WI) y 0,2 \muM de cada
dNTP. Las reacciones se amplificaron en un 480 PCR
termociclador^{TM} (Perkin Elmer) utilizando las siguientes
condiciones: 94ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 30 segundos, 72ºC
durante 1 minuto, durante 18-25 ciclos. Se realizó
una electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 6% de 5 \mul de
productos de PCR. El gel se expuso a una película. Se obtuvieron
mediciones de densitometría utilizando el software Alpha Ease
Version 3.3a^{TM} (Alpha Innotech Corporation) para cuantificar
los productos génicos específicos de clon 65 y clon 320 o
específicos de TPI.
Se hibridaron las transferencias (blots)
Northern de múltiples tejidos de adulto (Clontech) y la
transferencia Northern del poliA+ARN de C57MG parental y del
derivado C57MG/Wnt-1 (2 \mug/banda) con una sonda
designada como 65.50.mer.2 de las bases de nucleótidos
261-310 de las figuras 1A y 1B:
generada utilizando los cebadores
indicados anteriormente. Las membranas se lavaron en 0,1 x SSC a
55-65ºC y se expusieron a autorradiografía. Las
transferencias se rehibridaron con una sonda sintética de 75 pb del
gen de actina humano. Véase, Godowski et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86: 8083-8087 (1989) para un
procedimiento de fabricación de una sonda con oligos solapantes,
que es cómo se preparó la sonda de
actina.
Los clones que codificaban el polipéptido del
clon 65 de longitud completa de ratón se aislaron mediante el
cribado de ARN biblioteca 211: C57MG/Wnt-1 mediante
hibridación de colonias con la sonda anterior. Los insertos de
ciertos de estos clones se subclonaron en pBLuescript^{TM} IISK+ y
su secuencia de ADN se determinó mediante secuenciación de didesoxi
ADN en ambas cadenas.
La técnica recientemente descrita de SSH combina
una eficacia de sustracción elevada con una representación igualada
de secuencias expresadas de manera diferencial. Este procedimiento
se basa en reacciones específicas de PCR que permiten la
amplificación exponencial de ADNcs que difieren en abundancia,
mientras que se suprime la amplificación de secuencias de
abundancia idéntica en dos poblaciones. La técnica de SSH se utilizó
en la presente invención para aislar genes expresados en una célula
mioepitelial mamaria de ratón transformada con
Wnt-1, cuya expresión se reduce o está
ausente en la célula mioepitelial parental. El poliA+ARN extraído
de ambos tipos de células se utilizo para sintetizar los ADNcs de
prueba y conductores. El grado de eficacia de la sustracción se
monitorizó mediante análisis de transferencia Southern de productos
de PCR no sustraídos y sustraídos utilizando una sonda de
\beta-actina. No se observó ARNm de
\beta-actina en los productos de PCR sustraídos,
confirmando la eficacia de la sustracción.
Después de llevar a cabo la
RT-PCR y el análisis de transferencia Northern en el
clon inicial para confirmar la expresión diferencial, se observó
aproximadamente una inducción de 2 veces en la línea celular
Wnt-1 mediante transferencia Northern y una
inducción de 4,5 veces mediante RT-PCr. Tras el
cribado de la biblioteca, se obtuvo el clon 65 de longitud completa
de ratón, designado como clon 65.11.3. El ADNc para el clon 65 de
ratón codifica una nueva proteína intracelular que es inducida
fuertemente en la línea celular Wnt-1/C57 mg, pero
está ausente o a niveles muy bajos, en las células C57 mg
parentales. Este clon, 65.11.3, codifica una proteína
aproximadamente idéntica en un 48-60% en la
secuencia a miembros de la familia Rho de GTPasas pequeñas.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos putativa del clon 65 de ratón se muestran en las
figuras 1A y 1B (SEC ID Nos. 4 y 6, respectivamente). La alineación
de las secuencias de aminoácidos del clon 65 de humano y ratón se
muestra en la figura 6 (SEC ID Nos. 3 y 6, respectivamente). El clon
de ratón se colocó en pRK5E, descrito anteriormente, y se depositó
con la ATCC. Tras la transformación en células JM 109, el plásmido
hace que las células sean resistentes a ampicilina. Tras la
digestión con HindIII y NotI, las células
proporcionan un inserto en el ratón de 786 pares de bases desde el
codón Met hasta el codón de parada. Existen 1824 pb en dirección 5'
del sitio NotI que codifican el antígeno estable al calor (HSA) de
ratón (CD24) fusionado al inserto del clon 65, que se puede eliminar
mediante digestión con NotI. Debido a que la secuencia de HSA
adyacente al extremo 5' del gen se extrajo electrónicamente, no
existe secuencia 5' para el clon 65 en dirección 5' de la Met en
las figuras 1A y 1B.
Sin limitarse a ninguna teoría, los cebadores de
PCR/RT pueden caer en la 3'UTR de un clon "spliced"
alternativamente dado que el clon final 65.11.3 (clon 65 de ratón)
no tiene estas secuencias. Se obtuvieron un conjunto de otros
clones mediante el cribado de una biblioteca de ADNc de C57
mg/Wnt-1 utilizando las sondas específicas
descritas a continuación.
Se identificaron dos clones posteriores,
designados como 65.11 y 65.9 y que tenían 2224 y 2004 pb,
respectivamente, utilizando una sonda derivada del clon 65 original
de 212 pb. Sus secuencias (SEC ID Nos. 12 y 13, respectivamente) se
muestran en las figuras 10 y 11, respectivamente. Los clones 65.11 y
65.9 tienen diferentes extremos 5', prácticamente extremos 3'
idénticos, y repeticiones CA. El extremo 5' del clon 65.11 tiene
una región del tipo CDC-42. El extremo 5' del clon
65.9 contiene una región con homología con parte de una EST de 314
pb, AA462407 (aislada de una glándula mamaria de ratón).
Se obtuvieron otros tres clones de la misma
biblioteca mediante cribado con una sonda derivada de la región
homóloga a CDC-42 del clon 65.11:clon 65.11.1 que
tiene 836 pb (SEC ID No. 14; figura 12), el clon 65.11.3 del clon
65 de longitud completa de ratón (SEC ID No. 15; figuras
13A-13B) que tiene 2251 pb, descrito a
continuación, y la región codificante del cual se describe en las
figuras 1A-1B y comparte una región en el extremo
5' con EST AA613604 (aislado de placenta de ratón adulto) y el clon
65.11.6 que tiene 847 pb (SEC ID No. 16, figura 14).
Los otros tres clones (65.1, 65.6 y 65.13)
también se obtuvieron del cribado primario (utilizando una parte
del clon 65 original como sonda, uno de los cuales (clon 65.1) tiene
un extremo 5' similar al del clon 65.9). Las secuencias de estos
clones (SEC Id Nos. 17, 18 y 19, respectivamente) se muestran en las
figuras 15, 16 y 17, respectivamente.
Los clones posteriores, que pueden ser variantes
de "splice", contienen piezas del extremo 3' del clon inicial
y/o contienen un extremo 5' inusual, y/o contienen un extremo de
tipo CDC-42.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc para el clon 320 de ratón se aisló
independientemente mediante cribado diferencial de
Wnt-1 utilizando el procedimiento descrito en el
ejemplo 1. El clon inicial aislado se designó como clon 320 y tenía
165 pb. Había dos clones en este grupo. El clon se secuenció por lo
menos parcialmente tal como se ha descrito anteriormente y los
cebadores de RT-PCR se diseñaron tal como se indica
a continuación:
320.pcr.top 1: (correspondiente a las bases
2319-2342 de las figuras 4A-4B)
y
320.pcr.bot1: (correspondiente a las bases
2423-2446 de las figuras 4A-4B)
Los procedimientos de RT-PCR y
transferencia Northern se llevaron a cabo tal como se ha descrito en
el Ejemplo 1 para confirmar la expresión diferencial.
A continuación, se aislaron cuatro clones que
codifican el clon 320 de ratón de longitud por lo menos parcial
mediante el cribado de ARN biblioteca 211:
C57MG/Wnt-1 mediante hibridación de colonias con una
sonda designada como 320.50.mer.1 de las bases de nucleótidos
1997-2046 de las figuras 4A y 4B:
El ADNc para el clon 320 de ratón codifica una
nueva proteína que está fuertemente inducida en la línea celular
Wnt-1/C57 mg, pero está ausente en las células C57
mg parentales y puede ser útil en la regulación de las células
cancerosas.
La secuencia de nucleótidos de una secuencia de
consenso formada por los tres clones (SEC ID No. 7) se muestra en
las figuras 4A y 4B. La secuencia de nucleótidos de otro clon del
clon 320 de ratón se muestra en las figuras 5A y 5B (SEC ID No. 8)
y de otro clon se muestra en la figura 6 (SEC ID No. 9). La
secuencia de consenso es una secuencia del clon 320 de ratón de
2822 pb que no tiene un marco de lectura abierto obvio o aparente y
es probablemente un clon parcial. Cuando el ARN de tumores que
aparecen en ratones en una colonia establecida a partir de dos
ratones transgénicos machos Wnt-1 (proporcionados
por Harold Varmus en NCI) se sometió a RT-PCR
utilizando los cebadores anteriores, el clon 320 fue fuertemente
inducido. Una sección muy pequeña de aproximadamente sólo 200 pb de
la secuencia de consenso se empareja con una región en la 3'UTR de
Wnt-5A humana.
El clon de ratón se colocó en pRK5E, descrito
anteriormente, y se depositó con la ATCC. Tras la transformación en
células JM 109, el plásmido hace que las células sean resistentes a
ampicilina. Tras la digestión con BamHI y HindIII, se
proporciona un inserto de ratón de un tamaño de aproximadamente 3000
pares de bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar el clon humano de longitud completa
correspondiente a 65.11.3 (clon 65 de ratón), se cribó una
biblioteca de ADNc de hígado fetal humano (Clontech), tratado con el
kit SuperScript^{TM} utilizando el vector pRK5E tal como se ha
descrito anteriormente, con una sonda (65.50.mer.2 (SEC ID No. 42)
indicada anteriormente en el Ejemplo 1) a baja astringencia (20% de
formamida, 1 X SSC, lavado a 55ºC).
Se identificaron cuatro clones: 65.1, 65.4, 65.5
y 65.6. Los insertos para estos clones se subclonaron en
pBlue-
script^{TM} IISK+ y su secuencia de ADN se determinó mediante secuenciación de didesoxi ADN en ambas cadenas. Se obtuvo una secuencia de consenso a partir de estos clones para producir tanto la secuencia de nucleótidos como la secuencia de aminoácidos putativa para el clon 65 humano. La secuencia de consenso y la secuencia de aminoácidos derivada se muestran en las figuras 5A y 5B (SEC ID Nos. 1 y 3, respectivamente). El clon 65.1 (SEC ID No. 46) empieza en el nucleótido de posición 51 y termina en el 227 de la SEC ID No. 1 y está rodeada en la figura. El segundo clon 65.4 (SEC ID No. 47) empieza en el nucleótido de posición 51 y termina en el 824 de la SEC ID No. 1. El tercer clon 65.6 (SEC ID No. 48) empieza en el nucleótido de posición 480 y termina en el 1319 de la SEC ID No. 1 en las figuras 5A-5B. Esta secuencia de consenso de las 5A-5B (SEC ID No. 1) tiene una homología del 93% con la secuencia de nucleótidos del clon 65 de la figura 1 (SEC ID No. 4). Véase la figura 6. Mediante la búsqueda de homología, se observa que el clon 65 humano, al igual que el clon 65 de ratón, es un miembro de la familia de Rho, Rac y CDC42. Debido a la homología con la familia de Rho y Rac, se cree que estas proteínas están implicadas en la regulación por incremento de los genes del cáncer.
script^{TM} IISK+ y su secuencia de ADN se determinó mediante secuenciación de didesoxi ADN en ambas cadenas. Se obtuvo una secuencia de consenso a partir de estos clones para producir tanto la secuencia de nucleótidos como la secuencia de aminoácidos putativa para el clon 65 humano. La secuencia de consenso y la secuencia de aminoácidos derivada se muestran en las figuras 5A y 5B (SEC ID Nos. 1 y 3, respectivamente). El clon 65.1 (SEC ID No. 46) empieza en el nucleótido de posición 51 y termina en el 227 de la SEC ID No. 1 y está rodeada en la figura. El segundo clon 65.4 (SEC ID No. 47) empieza en el nucleótido de posición 51 y termina en el 824 de la SEC ID No. 1. El tercer clon 65.6 (SEC ID No. 48) empieza en el nucleótido de posición 480 y termina en el 1319 de la SEC ID No. 1 en las figuras 5A-5B. Esta secuencia de consenso de las 5A-5B (SEC ID No. 1) tiene una homología del 93% con la secuencia de nucleótidos del clon 65 de la figura 1 (SEC ID No. 4). Véase la figura 6. Mediante la búsqueda de homología, se observa que el clon 65 humano, al igual que el clon 65 de ratón, es un miembro de la familia de Rho, Rac y CDC42. Debido a la homología con la familia de Rho y Rac, se cree que estas proteínas están implicadas en la regulación por incremento de los genes del cáncer.
El clon de ratón se colocó en un plásmido pRK5E,
tal como se ha descrito anteriormente y se depositó con la ATCC.
Tras la transformación en células JM 109, las células se volvieron
resistentes a ampicilina. Tras la digestión con XbaI y
NotI, se proporciona un inserto de un tamaño de 777 pares de
bases desde el ATG hasta el codón de parada.
La hibridación in situ es una técnica
potente y versátil para la detección y localización de secuencias
de ácidos nucleicos en preparaciones de células o tejido. Puede ser
útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica,
analizar la distribución en el tejido de la transcripción,
identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en
la síntesis de ARNm específico y ayudar en el mapeo de los
cromosomas.
La hibridación in situ se llevó a cabo
siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett,
Cell Vision 1: 169-176 (1994)),
utilizando ribosondas marcadas con ^{33}P generadas por PCR.
Brevemente, se seccionan tejidos humanos bañados en parafina y
fijados a formalina, se desparafinaron, se desproteinaron en
proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron
posteriormente para una hibridación in situ tal y como se
describe por Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda
antisentido marcada con [^{33}-P] UTP a partir de
un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante toda la noche. Los
portaobjetos se sumergen en una emulsión nuclear de rastreo Kodak
NTB2 y se expusieron durante 4 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se secaron con concentradores centrífugos de
tipo Speed-Vac 6,0 \mul (125 mCi) de
^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000
Ci/mol). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP
secado, se añaden los siguientes ingredientes:
2,0 \mul 5x de tampón de transcripción
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul;
cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul RNAsina
1,0 \mul de plantilla de ADN (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de
PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora.
Se añadieron un total de 1,0 \mul de RQ1 ADNasa, seguido de
incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron un total de 90
\mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0), y la mezcla se
pipeteó sobre papel DE81. La solución remanente se cargó en una
unidad de ultrafiltración MICROCON-50^{TM}, y se
centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de
filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó
utilizando el programa 2 (3 minutos). Después del giro final de
recuperación, se añadieron un total de 100 \mul de TE. A
continuación, se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel
DE81 y se contaron en 6 ml de BIOFLUOR II^{TM}.
La sonda se extendió sobre un gel de TBE/urea.
Se añadieron un total de 1-3 \mul de la sonda o 5
\mul de ARN MrkII a 3 \mul de solución tampón de carga. Después
de calentar sobre un bloque de calor a 95ºC durante 3 minutos, el
gel se colocó inmediatamente sobre hielo. Los pocillos del gel se
nivelaron, se cargó la muestra y se operó a 180-245
voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en un envoltorio de
plástico (marca SARAN^{TM}) y se expuso a una película XAR con
una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC desde una
hora hasta toda la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Los portaobjetos se extrajeron del congelador,
se colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en
una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la
condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en
paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de extracción, y
se lavaron en 0,5 x SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente
(25 ml 20 x SSC +
975 ml s.c. H_{2}O). Después de la desproteinación en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100% durante 2 minutos cada una.
975 ml s.c. H_{2}O). Después de la desproteinación en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100% durante 2 minutos cada una.
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron
en s.c. H_{2}O, y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a
temperatura ambiente, durante 5 minutos casa vez. Las secciones se
desproteinaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10
mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa; 37ºC, 15 minutos)
para tejido de embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 \mul en
250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en
formalina. El posterior enjuague en 0,5 x SSC y deshidratación se
llevaron a cabo tal y como se ha descrito anteriormente.
Los portaobjetos se dispusieron en una caja de
plástico recubierta por tampón de Caja (4 x SSC, formamida al 50%).
El papel de filtro se saturó. El tejido se recubrió con 50 \mul de
tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de s.c.
H_{2}O), se centrifugó y se calentó en el microondas durante 2
minutos con la tapa aflojada. Después de enfriar sobre hielo, se
añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20 x SSC y 9 ml de s.c.
H_{2}O, y el tejido se centrifugó bien y se incubó a 42ºC durante
1-4 horas.
Se calentaron a 95ºC durante 3 minutos 1,0 x
10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml reserva) por
portaobjeto. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo, y se
añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjeto.
Después de centrifugar, se añadieron 50 \mul de una mezcla de
^{33}P a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los
portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 55ºC.
El lavado se realizó durante 2 x 10 minutos con
2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC + 16 ml de
EDTA 0,25 M, V_{f}=4 L), seguido de un tratamiento con ARNasaA a
37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón
de ARNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2 x 10
minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de
lavado de astringencia fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 x
SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 L).
Se realizó un análisis in situ en las
secuencias de ADN descritas en la presente invención. Los
oligonucleótidos utilizados para estos análisis son los
siguientes.
(1) Clon 65.11
\newpage
(2) Clon 320.50
Se realizó un análisis in situ en las
secuencias de ADN anteriores descritas en la presente invención.
Los resultados de estos análisis son los siguientes.
(1) Clon 65.11
Expresión en tejidos de ratón: Este clon se
expresó en ganglios espinales en desarrollo de un ratón E15.5 y en
las cúspides de las válvulas cardiacas de un ratón adulto.
(2) Clon 320.50
Expresión en tejidos de ratón: Este clon se
expresó en la capa de células piramidales de hipocampo y la
circunvolución dentada de un cerebro de ratón adulto. También se
expresó en el pulmón, médula renal y folículos pilosos de un ratón
E15.5.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del clon
65 ó 320 como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
del clon 65 de longitud completa humano (tal como se muestra en las
figuras 5A y 5B, SEC ID No. 3), o del clon 65 de ratón (tal como se
muestra en las figuras 1A y 1B, SEC ID No. 6), o del clon 320 de
longitud completa de ratón (las secuencias parciales mostradas en
las figuras 2, 3 y 4; SEC ID Nos. 7, 8 y 9, respectivamente) se
utiliza como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como
aquéllos que codifican variantes naturales de estos polipéptidos del
clon 65 y 320 particulares) en bibliotecas de ADNc de tejido humano
o bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que
contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las
siguientes condiciones de elevada astringencia. La hibridación de la
sonda radiomarcada derivada de polipéptido del clon 65 o
polipéptido del clon 320 a los filtros se realiza en una solución al
50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al
0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución de Denhardt,
y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de
los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al
0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs
que tienen una identidad secuencial deseada con el ADN que codifica
un polipéptido de clon 65 ó 320 de secuencia nativa de longitud
completa utilizando las técnicas estándar conocidas en el
sector.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de polipéptido del clon 65 ó 320 mediante la
expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
de clon 65 ó 320 se amplifica inicialmente utilizando cebadores de
PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para las
enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para
enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se
puede utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de
vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase
Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que
contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la
tetraciclina. El vector se digiere con una enzima de restricción y
se desfosforila. A continuación, las secuencias amplificadas por
PCR se unen en el vector. El vector preferiblemente incluirá
secuencias que codifican un gen resistente a un antibiótico, un
promotor trp, una secuencia líder poli-His
(incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia
poli-His, y sitio de división para la
enteroquinasa), la región codificante de clon 65 o la región
codificante de clon 320, el finalizador transcripcional lambda, y un
gen argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza
para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook et. al.,
supra. Los transformantes se identifican por su capacidad
para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las
colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plásmido se puede
aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la
secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el
caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche
se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor
escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una
densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la
expresión se activa.
Después de cultivar las células durante muchas
más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación.
El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y
el polipéptido de clon 65 ó 320 se puede a continuación purificar
utilizando una columna quelante de metal en condiciones que
permiten la unión fuerte de la proteína.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de polipéptido de clon 65 ó 320 mediante
la expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 se puede utilizar como vector de
expresión. El ADN apropiado que codifica el polipéptido de clon 65
ó 320 está ligado en el pRK5 con enzimas de restricción
seleccionadas para permitir la inserción del ADN para el
polipéptido de clon 65 ó 320 utilizando procedimientos de unión
tales como los descritos en Sambrook et. al., supra.
A los vectores resultantes se les hacer referencia convenientemente
de manera general como pRK5E.clon 65 o pRK5E.clon320,
respectivamente, en la siguiente descripción general.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se cultivan para unirse en placas de cultivo de tejidos en
un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y
opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se
mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5E.clon 65 o
pRK5E.clon 320 se mezcla con aproximadamente 1 \mug de ADN que
codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et. al.,
Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1
mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de
CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50
mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se
deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El
precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja reposar
durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se
aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en solución salina
tamponada con fosfato (PBS) durante 30 segundos. A continuación,
las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo
y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 pCi/ml
^{35}S- metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el
medio acondicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y
se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y
exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para
revelar la presencia del polipéptido de clon 65 ó 320. Los cultivos
que contienen células transfectadas pueden experimentar una
incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en
bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir
el polipéptido de clon 65 ó 320 en células 293 transitoriamente
utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por
Somparyrac et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 1575 (1981).
Las células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un frasco
giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5E.clon65 o
pRK5E.clon 320. En primer lugar, las células se concentran en el
fraco giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El
precipitado de ADN-dextrano es incubado en el
residuo celular durante cuatro horas. Las células se tratan con
glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo
de tejido, y se reintroducen en el frasco giratorio que contiene el
medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1
\mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro
días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para
eliminar las células y los debris. La muestra que contiene el
polipéptido de clon 65 ó 320 expresado se puede concentrar a
continuación y purificar mediante cualquier procedimiento
seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, polipéptido de clon 65 ó
320 puede expresarse en células CHO. El pRK5E.clon 65 o
pRK5E.
clon 320 pueden transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio remplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido de clon 65 ó 320, el medio de cultivo puede remplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene el polipéptido de clon 65 ó 320 expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
clon 320 pueden transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio remplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido de clon 65 ó 320, el medio de cultivo puede remplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene el polipéptido de clon 65 ó 320 expresado puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido de clon 65 ó 320 etiquetado con
epítopo puede expresarse también en células CHO huésped. El
polipéptido de clon 65 ó 320 puede subclonarse fuera del vector
pRK5. Suva et al., Science, 237: 893-896
(1987); EP 307.247 publicada el
15-3-1989. El inserto del subclón
puede experimentar PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta
de epítopo concreta, tal como una etiqueta de
poli-His en un vector de expresión de Baculovirus.
El inserto de polipéptido de clon 65 ó 320 etiquetado con
poli-His puede subclonarse a continuación en un
vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección, tal
como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las
células CHO pueden transfectarse (tal y como se ha descrito
anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje puede
realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar
la expresión. El medio de cultivo que contiene el polipéptido de
clon 65 ó 320 etiquetado con poli-His expresado
puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier
procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de
afinidad de quilato con Ni^{2+}.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de un polipéptido de clon 65 ó 320 en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levadura se construyen para la producción o secreción intracelular
de un polipéptido de clon 65 ó 320 a partir del promotor ADH2/GAPDH.
El ADN que codifica un polipéptido de clon 65 ó 320 y el promotor
se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en
el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular.
Para la secreción, el ADN que codifica un polipéptido de clon 65 ó
320 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que
codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal del clon 65 ó 320
nativo u otro péptido señal de mamífero, o factor alfa de levadura o
la secuencia señal/líder secretora de la invertasa, y secuencias
enlazadoras (si se necesitan) para la expresión.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y una separación mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
azul de Coomassie.
El polipéptido de clon 65 ó 320 recombinante
puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción
de las células de levadura del medio de fermentación por
centrifugación y, a continuación, la concentración del medio
utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que
contiene polipéptido del clon 65 ó 320 puede purificarse
adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna
concretas.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de un polipéptido de clon 65 ó 320 en células de
insectos infectadas de Baculovirus.
La secuencia que codifica un polipéptido de clon
65 ó 320 se fusiona en dirección 5' de un epítopo etiqueta
contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo
etiquetas incluyen etiquetas de poli-His y
etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden
utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos
derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como
pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica un
polipéptido de clon 65 ó 320 o la parte deseada de la secuencia
codificante (tal como la secuencia que codifica la proteína madura
si la proteína es extracelular) se amplifica mediante PCR con
cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5'
puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes
(seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas
esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el
vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina
(disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y
como se describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
A continuación, el polipéptido de clon 65 ó 320
etiquetado con poli-His expresado puede purificarse,
por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de
Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a
continuación. Los extractos se preparan a partir de las células
recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito
por Rupert et. al., Nature, 362:
175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se
lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml de HEPES,
pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA; glicerol al 10%;
NP-40 al 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces
durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se depuran por
centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de
carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y
se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una
columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente
disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con
25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El
extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por
minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el
tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la
fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado
secundario (50 mM fosfato: 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH
6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de
alcanzar la línea base a A_{280} de nuevo, la columna se
desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón
de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan
mediante SDS-PAGE y tinción con plata o
transferencia Western con
Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen polipéptido de clon
65 ó 320 etiquetado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan
contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del
polipéptido de clon 65 ó 320 etiquetado con IgG (o con Fc) puede
realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo,
por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína
G.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generan antisueros policlonales en conejos
blancos hembra de Nueva Zelanda contra polipéptido del clon 65
murino y humano y contra polipéptido del clon 320 murino. Los
antígenos utilizados son proteínas fusionadas con histidina o con
la parte Fc de IgG. Cada proteína se homogeniza con adyuvante
completo de Freund para la inyección primaria y con adyuvante
incompleto de Freund para todas los refuerzos posteriores. Para la
inmunización primaria y el primer refuerzo, se inyectan 3,3 \mug
por kg de peso corporal directamente en los nódulos linfáticos
popliteales tal como se describe en Bennett et al., J. Biol.
Chem., 266: 23060-23067 (1991) y "Production of
Antibodies by Inoculation into Lymph Nodes" de Morton Sigel et
al. en Methods in Enzimology, Vol. 93 (Nueva York: Academic
Press, 1983). Para los posteriores refuerzos, se inyectan 3,3 \mug
por kg de peso corporal en puntos subcutáneos e intramusculares.
Las inyecciones se realizan cada 3 semanas con tomas de muestras de
sangre en las siguientes dos semanas.
Las técnicas para producir anticuerpos
monoclonales que se pueden unir específicamente a un polipéptido
del clon 65 ó 320 son conocidas en la técnica y están descritas, por
ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunogenes que se
pueden utilizar se incluyen polipéptido del clon 65 ó 320
purificado, proteínas de fusión que contienen el polipéptido del
clon 65 ó 320, y células que expresan el polipéptido del clon 65 ó
320 recombinante en la superficie celular. La selección del
inmunogén puede realizarse según el técnico en la materia sin una
gran experimentación.
Los ratones, tal como Balb/c, se inmunizan con
el inmunogen del clon 65 ó 320 emulsionado en adyuvante completo de
Freund y se injecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una
cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el
inmunogén se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de
las patas traseras del animal. A continuación, los ratones
inmunizados se refuerzan de 10 a 12 días después con inmunogén
adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación,
durante diversas semanas, los ratones también se pueden reforzar con
inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se
pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de
sangre retro-orbitales para ser analizadas en
ensayos ELISA para detectar anticuerpos para polipéptido del clon 65
ó 320.
Después de detectar un título de anticuerpo
adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les
puede inyectar una inyección intravenosa final de un polipéptido del
clon 65 ó 320. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se
sacrifican y las células del bazo se recogen. A continuación, las
células del bazo se fusionan (usando PEG al 35%) a una línea
celular de mieloma murino seleccionada, tal como la P3X63AgU.1,
disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de
hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo
de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células
no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de
bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un
ELISA por la reactividad contra un polipéptido del clon 65 ó 320.
La determinación de células de hibridomas "positivas" que
secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra un
polipéptido del clon 65 ó 320 está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden
inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para
producir ascites que contiene los anticuerpos monoclonales
anti-polipéptido del clon 65 ó 320.
Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en
matraces de cultivos de tejidos o en botellas en rodillo. La
purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la
ascites se puede realizar usando precipitación con sulfato de
amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel.
Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada
en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Se desarrollan las células BT474 y
MDA-MB-23 establecidas de tumor
mamario humano (que están disponibles de ATCC) en medio esencial
mínimo (Gibco, Grand Island, NY) complementado con suero bovino
fetal (FBS) al 10% inactivado por calor (Hyclone, Logan, UT),
piruvato sódico, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no
esenciales, y 2x de solución vitamínica y se mantiene a 37ºC en
CO_{2} al 5%. Zhang et al., lnyas, & Metas.,
11:204-215 (1991); Price et al., Cancer
Res., 50: 717-721 (1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogen los anticuerpos monoclonales
anti-clon 65 o anti-clon 320 que
pueden prepararse tal y como se describe anteriormente, con PBS que
contiene EDTA 25 mM y se utilizan para immunizar ratones BALB/c. Se
administran a los ratones inyecciones i.p. de 10^{7} células en
0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Se administran
inyecciones i.p. de un extracto de membrana de Wnt purificado con
aglutinina de germen de trigo (WGA) en Sepharose en las semanas 9 y
13 a los ratones con antisueros que inmunoprecipitaron
Wnt-1 marcado con ^{32}P. Esto va seguido de una
inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de Wnt-1
y se fusionan los esplenocitos línea de mieloma de ratón
X63-Ag8.653. Se criban los sobrenadantes de
hibridoma para la unión de Wnt-1 mediante ELISA y
radioinmunoprecipitación. Se utiliza MOPC-21 (IgG1)
(Cappell, Durham, NC) como un control de emparejamiento de
isotipo.
De manera adicional, pueden utilizarse los
anticuerpos monoclonales murinos IgG_{1}k
anti-ErbB2 4D5 (ATCC CRL 10463 depositados el 24 de
mayo, 1990) y 7C2, específicos para el dominio extracelular de
ErbB2, con los anticuerpos anteriores. Se producen tal y como se
describe en Fendly et al, Cancer Research,
50:1550-1558 (1990) y WO89/06692.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinan las células simultáneamente según la
viabilidad y el estado del ciclo celular mediante citometría de
flujo en un FACSTAR PLUS^{TM} (Becton Dickinson Immunocytometry
Systems USA, San Jose. CA). Se recogen las células de tumor mamario
mediante el lavado de la monocapa con PBS, la incubación de las
células en tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM (Gibco), y su
resuspensión en medio de cultivo. Se lavan las células dos veces
con PBS que contiene FBS al 1% y se incuba el residuo durante 30
minutos en hielo con 50 \mul de
7-aminoactinomicina D (7AAD) 400 \muM (Molecular
Probes. Eugene. OR), un colorante vital que tiñe todas las células
permeables. A continuación, se fijan las células con 1,0 ml de
paraformaldehído al 0,5% en PBS y se permeabilizan simultáneamente
y se tiñen durante 16 horas a 4ºC con 220 \mul de colorante
HOECHST 33342^{TM} 10 \mug/ml (también un colorante de unión a
ADN) que contiene TWEEN 20^{TM} al 5%.
Se recopilan los datos de 1 x 10^{4} células y
se almacenan utilizando el software de LYSYS II^{TM} y se
analizan utilizando el software de PAINT-AGATE
^{TM} (Becton Dickinson). Darzynkiewica et al., Cytometry,
13:795-808 (1992); Picker et al., J.
Immunol., 150:1105-1121 (1993). Se determinan la
viabilidad y el porcentaje de células en cada estadio del ciclo
celular en células individuales seleccionadas utilizando tinciones
7AAD y Hoechst, respectivamente. (Se excluyen dobletes de células
mediante el análisis de pulsos de la anchura frente área de la
señal Hoechst.) Se determinan las cantidades celulares utilizando
hemocitómetros.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan anticuerpos
anti-clon 65 y anti-clon 320
radiyodados mediante el procedimiento Iodogen^{TM}. Fracker et
al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80: 849-857
(1978). Se realizan ensayos de unión utilizando células que
expresan receptores apropiados cultivadas en placas de cultivo
tisular de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson Labware. Lincoln
Park, N.J.). Se tripsinizan y se siembran las células en pocillos de
placas de 96 pocillos en una densidad de 10^{4} células/pocillo y
se dejan adherirse durante toda la noche. Se lavan las monocapas
con medio de cultivo frío complementado con azida sódica al 0,1% y,
a continuación, se incuba por triplicado con 100 \mul de
diluciones en serie de anticuerpos
^{125}I-anti-clon 65 o
^{125}I-anti-clon 320 en medio de
cultivo frío que contiene azida sódica al 0,1% durante 4 horas en
hielo. Se estima la unión no específica mediante la preincubación
de cada muestra con un exceso molar de 100 veces de anticuerpos no
radioactivos en un volumen total de 100 \mul. Se elimina la
radioactividad no unida mediante dos lavados con medio frío que
contiene azida sódica al 0,1%. Se detecta la radioactividad asociada
a las células en un contador gamma tras la solubilización de las
células con 150 \mul de NaOH 0,1 M/pocillo. Se determinan las
constantes de unión (K_{d}) del polipéptido del clon 65 y
el polipéptido del clon 320 y las afinidades de unión del
anticuerpo anti-clon 65 y anti-clon
320 mediante análisis Scatchard.
Se espera que los anticuerpos contra los
polipéptidos del clon 65 y el clon 320 afectarán el crecimiento de
estas células.
Los siguientes materiales se han depositado con
la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Estos depósitos se realizaron según lo
estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo
(Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del
depósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según
los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo
entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricción de la progenie de los cultivos de los
depósitos al uso público tras la concesión de la respectiva patente
estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de
cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que
sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para
alguien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and
Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC
\NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas
(incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera
o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones
adecuadas, los materiales serán inmediatamente reemplazados en una
notificación por otros iguales. La disponibilidad del material
depositado no se interpreta como una licencia para realizar la
invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad
de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
El documento escrito anterior se considera que
es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la
invención. La presente invención no se limita en su alcance por la
construcción depositada, ya que la realización depositada pretende
ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente
invención y otras construcciones que son funcionalmente
equivalentes están dentro del alcance de la presente invención. Los
depósitos de los materiales de la presente invención no constituyen
una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente
invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier
aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni
se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a
las ilustraciones específicas que representa.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
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LOS CODIFICAN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1176R1PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 52
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,8cm13
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3960
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<212> ADN
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<213> Humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 258
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<212> PRT
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<213> Humano
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 2351
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<212> ADN
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<213> Ratón
\newpage
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 2251
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<212> ADN
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<213> Ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
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<212> PRT
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<213> Ratón
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 2822
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<212> ADN
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<213> Ratón
\newpage
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
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<212> ADN
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<213> Ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2526
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<212> ADN
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<213> Ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
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<211> 2526
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<212> ADN
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<213> Ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
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<211> 204
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<212> ADN
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<213> Ratón
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<400> 11
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2224
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<212> ADN
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<213> Ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2004
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1016
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4075
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 847
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Desconocido
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<222> 504
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier nucleótido
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<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1953
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<212> ADN
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<213> Ratón
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Ratón
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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<210> 20
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<211> 14
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgtacaa gctt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-44
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 22
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> La secuencia está sintetizada
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\hfill43
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<211> 10
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<223> La secuencia está sintetizada
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\hfill10
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<210> 24
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<222> 1-11
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<223> La secuencia está sintetizada
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\hfill11
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<222> 1-22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<223> La secuencia está sintetizada
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\hskip-.1em\dddseqskiptgtagcgtga agacgacaga a
\hfill21
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<210> 27
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<222> 1-22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgagcggcc gcccgggcag gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<222> 1-22
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<223> La secuencia está sintetizada
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\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
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<210> 30
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<221> Secuencia artificial
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<222> 1-20
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<223> La secuencia está sintetizada
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<210> 31
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<211> 163
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> Secuencia artificial
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<222> 1-163
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<223> La secuencia está sintetizada
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<400> 31
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<210> 32
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-163
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagggtgg gtgggaaaga gtga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacagcgtcc tttatgtcac ttcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggcccatg ctctggcaga ggg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactggagca aggtcgtcct cgcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaccaccca caaggaagcc atcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgaaaggg aagccggcat cacc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaaggtcg tgttcgagca aacc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
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<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctcgtgt acttcctgtg cctg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgtcagct ggcgttgcca gctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-50
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacttctcg gccgtggtgt ctgtagatgg gcggcctgtg agactccagc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacacacgc atggaggcaa gctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-24
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccatcttgt ttacagctcc acca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-50
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcctgacct ttggggctgc cacttcccag gacgaccact gcctgcccac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 774
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-47
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattctaat acgactcact atagggcagc gttgactcag aaaaacc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-48
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgaaatt aaccctcact aaagggagca tatgaatttc agccctaa
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-48
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattctaat acgactcact atagggcacg cacatctgtt tccgtttt
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1-47
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia está sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgaaatt aaccctcact aaagggacca tccccgctct ctaccta
\hfill47
Claims (18)
1. Ácido nucleico aislado que comprende ADN
que tiene:
i) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos
un 70% de identidad en la secuencia con la secuencia de ácidos
nucleicos 229-1002 de la SEC ID No. 1;
ii) por lo menos 700 nucleótidos y por lo menos
un 95% de identidad en la secuencia determinada sobre la longitud
completa de las secuencias que se comparan con la secuencia de
ácidos nucleicos 229-1002 de la SEC ID No. 1;
iii) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos
un 70% de identidad en la secuencia con la secuencia de ácidos
nucleicos 1-783 de a SEC ID No. 4; o
iv) por lo menos 800 nucleótidos y por lo menos
un 70% de identidad en la secuencia con el ADNc del polipéptido del
clon 65 humano en el Depósito ATCC No. 209536;
en el que la expresión de dicho ácido nucleico
es inducible por Wnt-1.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1
parte (ii), que comprende ADN que codifica un polipéptido del clon
65 humano que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 258 de la SEC ID
No. 3.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1
parte (iii), que comprende ADN que tiene por lo menos un 85% de
identidad en la secuencia con (a) la secuencia de ácidos nucleicos
1-783 de la SEC ID No. 4.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 1
parte (iii), que comprende ADN que codifica un polipéptido del clon
65 de ratón que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 261 de la SEC
ID No. 6.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 1
parte (i), que se hibrida bajo condiciones astringentes con el
complemento de ácidos nucleicos 229-1002 de la SEC
ID No. 1.
6. Ácido nucleico aislado que comprende ADN
que es el complemento de la secuencia de ADN según cualquiera de
las reivindicaciones 1-5.
7. Vector que comprende el ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Célula huésped cultivada que comprende el
vector según la reivindicación 7.
9. Proceso para producir un polipéptido del
clon 65 que comprende cultivar la célula huésped según la
reivindicación 8, bajo condiciones adecuadas para la expresión del
polipéptido del clon 65 y recuperar el polipéptido del clon 65 del
cultivo celular.
10. Polipéptido del clon 65 aislado codificado
por el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
11. Polipéptido según la reivindicación 10 que
es un polipéptido del clon 65 humano o del clon 65 de ratón.
12. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido del clon 65 según la reivindicación 10 o la
reivindicación 11, fusionado a una secuencia de aminoácidos
heteróloga.
13. Molécula quimérica según la reivindicación
12, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia de etiqueta epítopo o una región Fc de una
inmunoglobulina.
14. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido del clon 65 según la reivindicación 10 u 11.
15. Anticuerpo según la reivindicación 14, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
16. Composición que comprende el polipéptido
según la reivindicación 10 u 11 y un portador para el mismo.
17. Composición que comprende un antagonista
para el polipéptido según la reivindicación 10 u 11 y un portador
para el mismo, en la que dicho antagonista es un anticuerpo que se
une específicamente a un polipéptido del clon 65.
18. Método de identificación de un compuesto
que se une a un polipéptido según la reivindicación 10 u 11,
comprendiendo el método el contacto del polipéptido con un compuesto
de prueba y la determinación del grado de unión.
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