JPS62175183A - 繊維状菌類中に発現する異種ポリペプチドとその製造方法及びその製造のためのベクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９８５年８月２９日に提出された米国特許
番号７７１．３７４号の一部継続出願である。

（産業上の利用分野） 本発明は、繊維状菌類により発現及び分泌される異種ポ
リペプチド、及びそのポリペプチドを発現し、分泌する
ためのベクター及びそのプロセスに関するものである。

特に、本発明は、トランスフォーメーション・ベクター
及び繊維状菌類により生化学的に活性のある仔牛のキモ
シン及び異種グルコアミラーゼを発現、分泌するだめの
そのベクター使用法を開示する。

（従来の技術） 異種ポリペプチド（例えば、宿主生物により通常発現及
び分泌されないポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列
の発現はかなりの高度な状態にまで進歩してきている。

例えば、薬学的に望ましいポリペプチド（例えば、（イ
）ヒトの成長ホルモン（］、）、（ロ）ヒトの組織プラ
スミノーゲン活性化因子（２）、（ハ）種々のヒトイン
ターフェロン（５）、（ニ）第８因子（４）、（ホ）ヒ
トの血清アルブミン（３））及び、工業的に重要な酵素
（例えば、（イ）キモシンく７）、（ロ）アルファアミ
ラーゼ＜８）、（ハ）アルカリ・プロテアーゼ（９））
をコードする種々のＤＮＡ配列がクローン化され、いく
つかの異種の発現宿主中で発現することが報告されてい
る。これらの発現は原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ、ｃ
ｃｌｉ）　　（１０）、又は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）　　（１１））　、又は真核生物（例えば、ザッ
カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　（７）　、クルイベロ
ミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｌ′１ｌｙｃｅ
ｓ　Ｉａｃｔｉｓ）（１２）、又はチャイニーズ・ハム
スターのオバリー細胞（２））にヘテロポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列をトランスフオームすることによ
り行なわれる。

異種宿主中で発現される場合、種々の宿主生物中で発現
されるポリペプチドは、それらが天然に生産されるとき
のものと同様の生物学的活性を有さない。例えば、仔牛
のキモシンは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　’（１３）又
はＳ、セレビシアエ（Ｓ、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）
　　（７）中で発現されたときは、非常に低い生物学的
活性しか持たない。キモシンは通常グリコジル化されな
いので、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中での、この低い生物
学的活性は、大腸菌が本来、ポリペプチドをグリコジル
化する能力が無いことによるものではない（１４）。し
かし、このような、大腸菌（ＩＥ、ｃｏｌｉ　）又はＳ
、セレビシアエ（Ｓ、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中で
の相対的不活性は、種々の操作によって、部分的に、そ
のように発現したポリペプチドを発現後活性化すること
によって示されるように、そのポリペプチド鎖の不適当
な折りたたみ方によっているようである。そのような操
作では、発現したキモシンを生物学的活性が増加するよ
うに、いくつかの方法で変性と再生が繰り返されよう。

例えば、（イ）尿素処理（１３）、（ロ）、変性／再生
ｐ＋＋にさらす、（ハ）変性及びジスルフィド結合の切
断とそれに引き続く再生及び共有イオウ結合の再生成（
１５）。しかし、このような変性／再生操作は、非常に
効率的というわけではないしく例えば、レンニンの生物
学的活性の回復は３０％以下である（１３＞）、生物学
的に活性のあるポリペプチドを生産ずろのにはかなりの
時間と経費が必要となる。他の異種ポリペプチドはより
高等な真核生物宿主中で、うまく発現する（例えばホ乳
類細胞）。通常、そのようなポリペブチ）・は、その異
種ポリペプチド中のあるアミノ酸配列を認識し、グリコ
ンル化することのできる発現宿主を必要とするグリコポ
リペプチドである。しかし、このようなホ乳類組織培養
系は、しばしば、微生物系と比較して大量の異種ポリペ
プチドを分泌しない。さらにこのような系を維持するの
は技術的にテ（Ｌかしく、結果的に、操作に経費がかか
ることになる。

生合成デヒトロクイナーセを欠いたＮ、クラッザ（Ｎ、
　ｃｒａｓｓａ）のａ　ｒ　ｏ　Ｄ変異体の相補性を含
む繊維状菌類中でのトランスフォーメーション及び発現
が報告されている（１６）。それ以来、グルタメート・
デヒトロジェネース欠損Ｎ、クラソザ（Ｎ。

ｃｒａ、５ｓａ）変異体の相補性に基づくトランスフォ
ーメーションも発展してきている（１７）。各々の場合
、相補性に使用されたデヒ）’　Ｔ−１クイナーゼ（ｑ
ａｚ）とグルタメート・デヒドロジェネース（ａｎつ遺
伝子はＮ　クラッサ（Ｎ、　ｃｒａｓｓａ）　由来のも
ので、それ故同種発現も含まれている。繊維状菌類中で
の他の同種発現の例には、△　ニドゥランス（Ａ、ｎ１
ｄｕｌａｎｓ）中の独立栄養マーカーｔｙｐｅ（１８）
及びａｒｇＢ　（１，９）　（’）相補性ヤ、Ｔセト−
ｆミグーゼをコードするＡ．ニドゥランス（Ａ、　ｎ１
ｄｕｌａｎｓ）遺伝頂の発現によるアセトアミド又はア
クリルアミドの利用へのΔ　ニドゥランス（Ａ．、旧ｄ
ｕｌａｎｓ）　　のトランスフォーメーションが含まれ
ろ。

繊維状菌類中での異種ポリペプチドの発現は、菌類及び
細菌類のポリペプチドのトランスフォーメーション及び
発現に限定される。例えば、オロチジン−５”−リン酸
・デカルボキンレースを欠いているΔ　ニトゥランス（
Ａ．、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　は、Ｎ。

クラッザ（Ｎ、ｃｒａｓｓａ）　　由来のｐｙｒ　　４
遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドにより
トランスフオームされた。（２１，３２）Ａ、ニガー（
Ａ、ｎｉｇｅｒ　）もトランスフオームによりＡ．ニド
ゥランス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　　由来のアセトア
ミダーセ゛をコードする遺伝子を発現し、アセトアミド
及びアクリルアミドを利用している。（２２）繊維状菌
類中での細菌のポリペプチドの異種発現の例には、Ｎ、
クラッサ（Ｎ、　ｃｒａｓｓａ）　　（２３）、デクチ
トステリウム・ディスコイブラム（［］ｉｃｔｙｏｓｔ
ｅｌｌｉｕｍ　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）　（２４）及び
セファｏスポ’１１ウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａ
ｌｏ−ｓｐｏｒｉｕｍ　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）　　（
２５）中での細菌ホスホトランスフェラーゼの発現があ
る。

同種及び異種の菌類中での発現のこれら例の各々におい
て、その発現したポリペプチドはその繊維状菌類の細胞
内に維持されていた。

従って、ここで本発明の目的は、トランスフオームする
ためのベクターを含む繊維状菌類から、異種ポリペプチ
ドを発現させ、かつ分泌させるために、そのような菌類
と、そのような異種ポリペプチドを発現、分泌するだめ
のプロセスを供給することにある。

（問題点を解決するた必の手段） 本発明は、繊維状菌類から、異種ポリペプチドを発現、
分泌するだめの新しいベクターを含んでいる。該ベクタ
ーは、該異種ポリペプチドを発現、分泌するために新し
いプロセス中で用いられる。

異種ポリペプチドを発現、分泌させるために、繊維状菌
類をトランスフオームするのに用いられる該ベクターは
、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、与えら
れた繊維状菌類中の分泌系で機能性を示し、その異種ポ
リペプチドをコードする配列と機能的に結合するシグナ
ル配列をコードするＤＮＡ配列を包含する。該シグナル
配列は、異種ポリペプチドと正常な組み合せのシグナル
配列であるか、又は他のものに由来する場合もある。

また、そのベクターは、シグナル配列をコードするＤＮ
Ａ配列と機能的に結合し、繊維状菌類によって機能的に
認識されるプロモーター配列をコードするＤＮＡ配列を
含むこともある。機能的ポリアデニレーション配列が、
異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３゛末端に
機能的に結合していることが望ましい。その後、このよ
うに合成されたポリペプチドは繊維状菌類から分泌され
る。

本発明は、広く散在する種からの異種ポリペプチドを繊
維状菌類から発現、分泌させろことができることを示し
ている。特に仔牛のキモシン、アスペルギラス・ニガー
（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、　ｎｉｇｅｒ）及びフミ
コラ・クリセス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ、　ｇｒｉｓｅｓ）
由来のグルコアミラーセ、及びムコール・ミエヘイ（Ｍ
ｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）　由来のカルボキンル・プロテ
アーセをＡ。

ニドゥランス（Ａ、旧ｄｕｌａｎｓ）　中で発現し、分
泌させた。加えて、仔牛のキモシンをΔ、アワモリ（Ａ
．、ａｗａｍｏｒｉ）　　及びトリコデルマ・レエセイ
（ＴｒＩＣｈ−ｏｃｌｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）から発
現、分泌させた。生化学的に活性なキモシンを、さらに
処理するこよなしに、培地中に検出した。この結果は、
Ａ、ニドゥランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）をトラン
スフオームするのに用いたベクターが、生化学的に活性
なキモシンを作るべく酸性の環境（約ｐ＋１２　）にさ
らすことを必要とするプロキモシンを分泌するよう構築
されているという意味で驚くべきものである。

一般に、機能的プロモーターをコードするＤＮＡ配列及
び、ターミネータ−配列（ポリアデニレーション配列を
含む）を含むベクターは、種々のンクナル配列及び異種
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合し
ている。このように構築されたベクターは、繊維状菌類
をトランスフオームするのに用いた。その後、生存する
トランスフォーマントを異種ポリペプチドの発現と分泌
に対するスクリーニングにより同定する。

それよは別に、トランスフォーメーション・ベクターへ
選択特性をコードするＤＮＡ配列を組み込むことにより
、発現可能な選択特性がトランスフォーマントを単離す
るのに用いることができる。

このような選択特性の例には種々の抗体面（性（例えば
、アミノグリコシド、ベノミル等）や、栄養要求欠失を
補う遺伝子をコードする配列（ｐｙｒ　４を欠失したＡ
．ニドゥランス（Ａ．、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　、Ａ。

アワモリ（Ａ、ａｔｖａｍｏｒｉ）　　トリコデルマ・
レエセイ（Ｔｒｉｃハｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）の
ｐｙｒ　４相補性、又は、八ｒｇ　Ｂを欠失するＡ、＝
トウランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）又はＡ．アワ
モリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）の八ｒｇ　Ｂ相補性）又は
、栄養（例えばアセトアミダーセ）若しくは形態上のマ
ーカーを発現宿主に与える遺伝子をコードする配列、を
含んでいる。

公開された好ましい具体例では、本発明のトランスフォ
ーメーション・ベクターの構築に、Δ。

ニトウランス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）由来のＡ　Ｎ　
Ｓ　−■配列をコードするＤＮＡ配列が含まれている。

この配列はベクターのトランスフォーメーション効率を
増加する。しかし、これらの配列は本発明を実施する上
で絶対に必要であるとは考えていない。

加えて、ハタテリアのプラスミドｐＢＲ３２５由来のあ
るＤＮＡ配列が、公開するトランスフォーメーション・
ベクターの一部を構成している。

また、これらの配列も繊維状菌類をトランスフオームす
るのに必要であると考えられていない。そのかわり、こ
れらの配列はベクター構築中、そのベクターの細菌的複
製を与える。ベクター構築中用いることができる他のプ
ラスミド配列にはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）
、ＲＫ−２（ＡＴＣＣ３７１２５）、ｐＭＢ９ （ＡＴＣＣ３７０１９）、ｐｓｃｌｏｌ（ＡＴＣＣ３７
０３２）が含まれている。

公開される好ましい具体例は、実施例によって示されて
いるが、本発明の範囲を制限するものではない。

（定義） ゛ポリペプチドの発現′°とはポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列の発現を意味する。

゛ポリペプチド″とはペプチド結合を通して共有結合し
ているα−アミノ酸のポリマーである。

ポリペプチドは、より一般的にタンパク質と呼ばれる高
分子量のポリマーと同時に低分子量のポリマーをも含む
。加えて、ポリペプチドはホスホポリペプチド、グリコ
ポリペプチド、メタロポリペプチドである場合もある。

さらに。１つ以上のポリマー鎮が結合して１つのポリペ
プチド鎖を形成する場合もある。

ここで用いられている゛異種ポリペプチド″とは、その
ポリペプチドを発現するのに用いる繊維状菌類によって
は、通常、発現及び分泌されないポリペプチドのことで
ある。異種ポリペプチドは原核生物由来のポリペプチド
（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のα−アミ
ラーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）種のアルカリ
・プロテアーゼ、シュードモナスの種々の加水分解酵素
等）、真核生物由来のポリペプチド（例えば、修生のキ
モシン、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト
の成長ホルモン、ヒトのインターフェロン、ウロキナー
ゼ、ヒトの血清アルブミン、ファクターＶ■等）及び発
現宿主以外の菌類由来のポリペプチド（例えば、Ａ、ニ
トゥランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　　中で発現さ
れる、Δ、ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ　＞及びフミコラ・
グリセア（）ｌｕｍｉｃｏ！ａ、ｇｒｉｓｅａ　）由来
のグルコアミラーゼ、Δ、ニドゥランス（Ａ．、　ｎ１
ｄｕｌａｎｓ）　　中て発現される、ムコール・ミエヘ
イ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）由来のカルボキシル・
プロテアーゼ等）を含んでいろ。

また異種ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリ
ペプチドでその各々がその菌類発現宿主に対して同種又
は異種であるもの由来の、一部又は完全なポリペプチド
の組み合せを含むノ＼イフリソト・ポリペプチドをも含
んでいる。そのようなハイフリット・ポリペプチドの例
には、１）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ　）のクルコア
ミラーセ゛のシグナル及びプロ配列だけをコードするＤ
ＮＡ配列か、又は種々の量のアミン末端側の成熟ゲルコ
アミラーセコトンと結合した形で融合したプロキモシン
をコードするＤＮＡ配列及び２）機能性シフナル配列の
みをコードするＤＮＡ配列か、又は機能性シグナルと会
合する種々の最のアミン末端ポリペプチド・フトン若し
くは成熟フトンと融合する菌類のグルコアミラーゼ又は
カルボキシ・プロテアーゼ又はヒトの組織プラスミノー
ゲン活性化因子又は成長ホルモンをコードするＤＮＡ配
列。

さらに、本発明の異種ポリペプチドは、■）上記のハイ
ブリッドポリペプチドを形成するのに用いられたものと
同様に原核、真核及び菌類生物由来のポリペプチド配列
中に存在もしくは発生する天然の７Ｌ／リツク（ａｌｌ
ｅｌｌｉｃ）変化物　２）、異種ポリペプチド中、１つ
以上のアミノ酸の種々の欠失、挿入、置換が生ずるよう
な、例えば部位特異的突然変異などによってもたらされ
る上記異種ポリペプチドの処理変化物、も含んでいる゛
生化学的に活性のある異種ポリペプチド″とは、その能
力により媒介されることが明らかな活性型で分泌される
異種ポリペプチドで、例えば、１）天然の部分でその生
化学的活性が媒介され、２）ハイブリッド・ポリペプチ
ドの場合、ハイブリッド・ポリペプチドを構成する、少
なくとも１つの天然の部分により生化学的活性が媒介さ
れる。

上に定義した各異種ポリペプチドは、発現や分泌が起こ
る繊維状−類により認識される終止シグナルを含む異種
のＤＮＡ配列によりコードされている。宿主により認識
されると、その終止シグナルは、異種ポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡの翻訳を終了する。

パ本発明″の繊維状菌類とは真核微生物であり、副分頚
のユーマイコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）　（２６＞
の全ての繊維状型のものを含む。これらの菌類は、チチ
ン、セルロース及び他の複雑なポリザラカライドからな
る栄養生殖ミセリウムにより特徴づけられる。本発明の
繊維状菌類は形態学的、生理学的、遺伝学的に酵母とは
異なるものである。栄養生殖的な生育は、ハイファル（
ｈｙｐｈａｌ、）な伸長によるもので、炭素代謝は義務
的に好気的である。

これに対して、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）のような酵母による栄養生殖的な生育は単細胞
葉状体の出芽によるものであり、炭素代謝は発酵的であ
る。Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は
優勢で、非常に安定なディプロイド相を有し、アスペル
ギライ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）やニューロスポラ（Ｎ
ｅｗｒｏｓｐｏｒａ）のような繊維状菌類中ではディプ
ロイドは減数***前に僅かに存在するにすぎない。

Ｓ、セレビンアエ（Ｓ、Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は１７
個の染色体を有するが一方、Ａ、ニトウランス（Ａ．、
ｎ１ｃｌｕｌａｎｓ）及びＮ、クラッザ（Ｎ、　ｃｒａ
ｓｓａ）はそれぞれ８個及び７個有する。Ｓ、セレヒシ
アエ（Ｓ、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）と繊維状菌類と
の差に対する最近の説明は、８　セレビシアｘ　（Ｓ、
Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がアスペルギラス（△ｓｐｅｒ
ｇ　ｉ　ｌ　］　ｕｓ）及ヒトリコデル？　（Ｔｒ］ｃ
ｈｏｔ３ｅｒｍａ　）のイン）・ロンを持たないことや
、繊維状菌類の転写制御因子の多くを認識できないこと
を含んでいる。（２７） 繊維状菌類の色々な種が、次にあげるゲネラ（ｇｅｍｅ
ｒａ）を含んで発現宿主として用いることができる、ア
スペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　、）リコデ
ルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）　、ニー−０スポラ（
Ｎｅｗｒｏｓｐｏｒａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏ
ｒａ）　、エンドチア・ムコーノ喧［１ｎｄｏｔｈｉａ
　Ａ４ｕｃｏｒ）、コチオポラス（Ｃｏｃｈｉｏｂｏｌ
ｕｓ）及びピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）。

特異的な発現宿主には、Ａ　ニトゥランス（Ａ．、　ｎ
１ｄｕｌａｎｓ）　　（１８，１９，２０，２１，６１
）、Ａ、ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ　）　　（２２）　、
Ａ、アワモリ（Ａ、ａｗａｍｏｒ　ｉ）例えば、ＮＲＲ
Ｌ３１１．２、ＡＴＣＣ２２３４２（ＮＲＩ’；！Ｌ３
１１２）、ＡＴＣＣ／Ｉ　４７３３、ＡＴＣＣ１４３３
１及びＵＶＫ↑４３ｆ株、Δ、オリザｘ　（Ａ、ｏｒｙ
ｚａｅ）、例えば、ＡＴＣＣ１１４９０、Ｎ　クラッサ
（Ｎ、ｃｒａｓｓａ）　　（１６，１７，２３）、トリ
コデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅ
ｓｅｉ）、例えば、ＮＲＲＬ　］、　５７０９、△ＴＣ
Ｃ１，３６３］、５６７６４．５６７６５．５６４６６
．５６７６７、及びトリコブル？・ビリデ（Ｔｒｉｃｈ
ｏ−ｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、例えば、ＡＴＣＣ３
２０９８及び３２０８６、を含んでいる。

ここで用いられているように、゛′プロモーター配列″
°とは、発現の目的のためにその繊維状菌類により認識
されるＤＮＡ配列である。それは、上に定義したポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合している
。その結合には、公開されるトランスフォーメーション
・ベクターのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列の開
始コドンに対するプロモーターの位置どりをも含まれて
いる。

そのプロモーター配列はシグナル配列と異種ポリペプチ
ドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含んでいる
。実施例には、Ａ　ニガー（Ａ、ｎｉｇｅｒ　）のグル
コアミラーセ蓋３９．４８）、ムコール・ミエヘイ（Ｍ
ｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）のカルボキシル・プロテアー
ゼ、Δ、ニガ〜（Ａ、ｎｉｇｅｒ　）のα−グルコシダ
ーセ（２８）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｂｏ
ｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオハイドロレース
Ｉ（２９）、Ａ、ニトゥランス（Ａ．、　ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ　）のｔｒｐＣ（１８）のプロモーター及びＳＶ４
０の初期プロモーターのようなより高度な真核生物プロ
モーター（２４）を含んでいる。

同様に、゛ターミネーター配列″は、発現宿主に認識さ
れ転写を終止するＤＮＡ配列である。これは発現される
べく異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの３°端に機
能的に結合している。実施例には、Δ、ニドゥランス（
Ａ．、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　のｔｒｐＣ（１８）、Δ
、ニガー（Ａ．、ｎｉｇｅｒ　）　（Ｄグ）Ｉｉミコア
ミラーゼ３９．４８）、Δ　ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ　
）のα−グルコシダーゼ（２８）、及びムコール・ミエ
ヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）のカルボキシル・プ
ロテアーゼのクーミネークーが含まれるが、いかなる菌
類ターミネータ−も、本発明において機能的であるよっ
てある。

゛ボリアデレージョン配列″′とは、転写の際、発現宿
主により認識され、転写されたｍ　Ｒ，Ｎ　Ａにポリア
デノシン残基を付加するＤＮＡ配列である。

それは、発現すべき異種ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの３゛端に機能的に結合している。実施例には、Ａ　
ニトゥランス（Δ、　ｎ１ｃｌｕｌａｎｓ）　　のｔｒ
ｐＣ（１８）、Ａ、ニガー（Ａ．、ｎｉｇｅｒ　）のグ
ルコアミラーセ゛（３９，４８）、Ａ．ニガー（Ａ、ｎ
ｉｇｅｒ　）のグルコンダーゼ（２８）、２ｕびムコー
ル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）のカルボキ
シルのポリアデニレーション配列が含まれろ。しかし、
いかなる菌類のポリアデニレーション配列も、本発明に
おいて機能的であるようである。

゛シグナル配列′″とは、異種ポリペプチドのアミノ末
端に機能的に結合したとき、宿主の繊維状菌類からその
異種ポリペプチドが分泌するのを助けるアミノ酸配列の
ことである。そのような／グナル配列は、異種ポリペプ
チドと正常に会合しているシグナル配列である場合もあ
るしく本来のシグナル配列）、又、他の生物由来のもの
（外来のシグナル配列）である場合もある。シグナル配
列は本来のシグナル配列を利用するか、もしくは、シグ
ナル配列と異種ポリペプチドの翻訳を許すような適正な
読み枠となるように、異種ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列に外来のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列
を結合することによって、異種ポリペプチドに機能的に
結合している。本発明を実施するのに有用なシグナル配
列は、修生のプレプロキモシン（１，５）、Ａ、ニガー
（Ａ、ｎｉｇｅｒ　）のグルコアミラーゼ（３９）、ム
コール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）のカル
ボキシル・プロテアーゼ及びトリコデルマ・レエセイ（
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のセルラーセ゛
（２９＞、由来のシグナルを含んでいる。しかし、異種
ポリペプチドの分泌を許す全てのシグナル配列は本発明
により考慮されている。

゛′プロペプチド″もしくは゛プロ配列゛′とは、成熟
した生物学的に活性なポリペプチドのアミン末端に位置
するアミノ酸配列である。そのように位置する場合、そ
のポリペプチドをザイモゲンと呼ぶ。一般にザイモゲン
は生物学的に不活性で、サイモケンからプロペプチドが
、触媒的又は自己触媒的に切断することにより、成熟し
た活性ポリペプチドに転換することができる。

本発明の具体例中、゛′トランスフォーメー／ヨン・ベ
クター゛′とは、異種ポリ−°プチトをコードするＤＮ
Ａ配列及び、それと機能的に結合した異種又は同種のシ
グナル配列を二」−トするＤ　Ｎ　Ａ配列である。さら
に、Ｉ−ランスフォーメーンヨン・ベクターは、機能的
プロモーター及びポリアデニレーション配列をニコード
するＤＮＡ配列を含むこともある。また、−１−８己の
各トランスフォーメーション・ベクターは菌予頁のトラ
ンスフォーメーション効率を高める配列と同様に、発現
１Ｊ能な選択特性をコードする配列を含むＪ−ともある
。

パトランスフォーメー／ヨン゛°は、ｌ−ランスフォー
メーンヨン・ベクターが繊、Ｖ、ｆｅ状菌類に導入され
るプロセスである。本発明のトランスフォーメーション
の方法により、繊維状菌類の造伝子中にトランスフォー
メーション・ベクターの全部又は一部が安定に組み込ま
れる。しかし、自己複製する染色体外トランスフォーメ
ーション・ベクターを維持するトランスフォーメーショ
ンも考えられている。

（一般的方法） ＤＮＡの゛消化゛′とは、ＤＮＡ中のある位置のみに作
用する酵素でＤＮＡを触媒的に切断することである。そ
のような酵素を制限酵素と呼び、各々の特異的部位を制
限部位と呼ぶ。。゛′部分″消化とは制限酵素による不
完全分解のことで、つまり、与えられた制限エンドヌク
レアーゼに対して、ＤＮＡ基質の全ての部位ではなく、
一部が切断される条件が選ばれる。ここで用いられる種
々の制限酵素は市販されており、酵素提供者により確立
されたそれらの反応条件、補因子及びその他の必要物が
用いられる。一般に、約１マイクログラムのプラスミド
又はＤＮＡフラグメントに対し、約１ユニツトの酵素及
び約２０マイクロリツトルの緩衝溶液が使われる。通常
、３７℃で約１時間のインキュベーション時間が使われ
るが、提供者の指示に従って変化することもある。イン
キュベーション後、タンパク質は、フェノール及びクロ
ロホルムによる抽出により除かれ、消化した核酸はエタ
ノール沈殿により木屑から回収する。制限酵素による消
化の後に、末端５′　リン酸をハタテリアのアルカリ・
ホスファクー士により加水分解し、連結に際し、制限部
位での他のＤＮＡフラグメントの挿入を妨害するべく、
ＤＮＡフラグメントの２つの末端が閉鎖ループを形成す
るのを防ぐ。

制限消化物からの、決められたＤＮＡフラグメントの゛
′回収″又は゛単離″とはポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動による消化物の分甜、そのフラグメントの同定、
望ましいフラグメントを含むゲル画分の除去及び一般に
は電気流出によるＤＮＡのゲルからの分離を意味する。

（３０）゛連結″とは２つの二本鎖核酸フラグメント間
にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する
。（３０）もしも他言しない場合は、連結は、０．５マ
イクログラムの連結すべき、およそ等モル量のＤＮＡフ
ラグメントに対し、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーセ（
パリガーゼ゛′）をつかう条件て既知の緩衝液を用いて
行なう。

パオリゴヌクレオチド′はフレア（Ｃｒｅａ）等の方法
により（３］、　）　、化学的に合成し、さらにポリア
クリルアミド・ケルてｉ′青がしブこ短かい長さの１本
鎖又は２本鎖のポリデオキンヌクレオチドである。

゛トランスフォーメーション″とは、ある生物中にＤＮ
Ａを導入し、その結果そのＤ　ＮＡが染色体外要素又は
染色体組み込み体として維持されることを意味する。他
言しない限り、大腸菌（Ｂｃｏｌｉ）のトランスフォー
メーションに対してここで用いる方法は塩化力ルンウム
法である（３０）。

Ａ、−トウランス（Ａ．、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）のＧ１９
１株（グラスコー大学、培養収集所）は、Δ、ニドゥラ
ンス（Ａ．、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　のスフェロプラスト
ンスフォーメーンヨン・ベクターとインキュベートする
ことによりトランスフオームする。０１９１株の遺伝型
は、ｐａｂａΔ１（ｐ−アミノ安息香酸要求）、ｆｗΔ
１（色素形成）、ｍａｎＡ２（モノアミン非利用）、及
びρｙｒＧ８９（オロチジン・ホスフェート・デカルボ
キシレース欠損）である。

スフェロプラストは次の修正を加えて、バランス（Ｂａ
ｉｌａｎｃｅ）　　等のセロファン法により調製した。

Ａ．ニトゥランス＜Ａ，旧ｄｕｌａｎｓ）の細胞壁を２
？Ｈｔｊするために、まずノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ
ｅ）　　２　３　４（デンマークのノホ王業（Ｎｏｖｏ
　Ｉｎ＋ｊｕｓｆ：ｒｉｅｓ）製）を部分的に精製した
。ノボザイム２３４の１０［）〜５００ｍｇの試料を２
．５ｍｎの０．６Ｍｋｌに溶解する。その２．５ｍ１画
分をＱ６ＭｋＣＩ！．で平衡化したＰＤ１０カラム（ス
ウェーデンのファルマンアーアプスラ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ−１１ｐｓｕｌｌａ）社製）にチャージし、その酵
素を３．５ｍβの同様の緩衝液で流出した。　セロファ
ン・デスクをノポザイム２３４（５ｍｇ／ｍｊ２）中で
２時間インキュベートし、さらに０．６ＭＫＣｐで洗浄
した。その消化物と洗い水を合せ、ミラクロス（カリフ
ォルニア州、う・ショク（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のカルハ
イオケム・ベーリンク（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ　）社製）で濾過し、記述されているように洗
浄した（２１）。５０又は１５ｍβのコニカルチューブ
で１０００Ｘｇで１０分間遠心した。水中で２０分間イ
ンキュベートし、２ｍβのポリエチレングリコール４０
００溶液（２　５　０ｍｇ／ｍｐ）を加え、室温で５分
間インキユヘートシ、さらに４ｍｆｆの０．４ＭＫｌ、
５０ｍＭＣａＣ　Ｒ　２溶液を加えた。トランスフオー
ムしたプロＩ・プラストを遠心し、０．６ＭＫＣβ、５
０ｍＭＣａＣβ２に再懸濁し、さらに記述のとおりプレ
ーティン’）”シタ＜　２　１　）。ゼロ・コントロー
ルは、プラスミドＤＮΔなしの２０μβの２　０７ＩＩ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｌ（　Ｃ　Ｉ！．、］、ｍＭＥＤＴＡＳ
ｐＨ７．４でインキユベートシたプロトプラストで行っ
た。ポジティブ・コントロールはここに述べているよう
に構築した５μｇのｐＤＪＢ３でのトランスフォーメー
ションを含んでいる。再生頻度は５〜１０ｐｐｍのパハ
及び５　０　Ｑｐｐｍのウリジンを補った最少培地に希
釈物をブレーティングすることで決定した。再生は０５
から５％の範囲であった。

ｐ　Ｄ　Ｊ　Ｂ　１に関連した低いトランスフォーメー
ション効率のために、ムコール（Ｍｕｃｏｒ　）酸プロ
プアーセ遺伝子を含む誘導体（　ｐ　Ｍ　ｅ　Ｊ　Ｂ　
］−７　）は非常に低いトランスフォーメーション効率
をもつことが期待された。結果的に、Ａ．ニドゥランス
（Ａ．．ｎｉｄｕｌａｎｓ）　のｐＭｅＪＢｌ−７のト
ランスフォーマントを得るため、コトランスフォーメー
ションを用いた。これはまず、非選択性のΔＮＳ−１を
含むベクターを構築し、さらにｐＭｅＪＢｌ−７とＡＮ
Ｓ−］フラクメントを含有する非選択性ベクターとの混
合物でスフェロプラストをトランスフオームすることで
成される。このアプローチのための原理は、ΔＮＳ−１
をもつベクターは多くのコピー中に組込まれ、ｐＭｅＪ
　Ｂ　］−７の組込みに対し相同的領域を与えるであろ
うということである。ΔＮＳ−　１ベクターは、ｐＤＪ
Ｂ−３からのＡＮＳ−　１のＰｓｔ　Ｊ　−　Ｐｖｕ　
ＩＴ　７　ラグメント（図１２Δ、１３Ｂ）をｐＵｃ１
８にサブクローンすることにより調整する。（３３）２
つのプラスミド（ｐＭｅＪＢｌ−７とΔＮＳ−１を含む
ベクター）を混合しく各２．５μｇ）、上述のトランス
フォーメーンヨン・プロトコールに従った。

ベクターｐＧＲＧ１−ｐＧＲ（ｌ及びｐＤＪＢ−ｇａｍ
で得られたトランスフォーマントは３７℃で３又は４日
インキュベーション後、移し替えた。

５　ｐｐｍのｐ−アミ７安息香酸を補った最小培地寒天
プレートの中央にトランスフォーマント由来のミセリア
ル・トランスファーをイノキュレートした。最小培地プ
レートへのイノキクレーション後３〜５日たって、１ｍ
β蒸留水、０．０２％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ　）　
−２０中にミセリアル・フラグメントを攪拌することに
より、胞子ザスペンジョンを調製した。およそ５Ｘ１０
’の胞子を５（］ｍｍ＆の次の組成の培地を含む２５０
ｍβの振とうフラスコにイノキュレートした。：（ｇ／
Ｉ！、）マルトテキストリンＭ−０４０（アイオワ州、
ムスカチン（Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ　）　、グレイン・プ
ロセンング・コープ（Ｇｒａｉｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ　Ｃｏｒｐ　）　５０　ｇＸＮａＮ０３６　ｇ　、　
Ｍｇ５Ｏ＜　　・７１１２００．５　ｇ、　ＫＣβ０．
５２ｇ。

Ｋ　Ｈ２ＰＯ，６８ｇ、１ｍβ微量元素溶液、１ｍＡＭ
ΔＺＬＩ　　ＤＦ−６０ｐ消泡剤（イリノイ州、ガーニ
イー（Ｇｕｒｎｅｅ）　、マゼフ１ケミカル中インク（
Ｍａｚｅｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｉｎｃ、　　）、１
０ｐｐｍｐ−アミノ安息香酸、及び５０ｐｐｍストレブ
トマインン硫酸塩。ＭＡＺＵに代って、保集血清アルブ
ミンもしくは他の適当な界面活性剤のようなものも用い
ることができる。ムコール（Ｍｕｃｏｒ　）酸プロテア
ーゼ分泌はアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
）完全培地（ＩＩ２当り２０ｇのテ゛キストロース、１
ｇペプＩ・ン、２０ｇのマルト抽出物）でテストした。

アスペルギラス・ニトウランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｄｕｌａｎｓ）　）ランスフォーマントによるキ
モシン分泌の炭赤源制御は、５％デンプンの代りに、１
％のフラクトス、スクロース又はデキストＤ−スを補っ
た同様の培地に対する−に連のデンプン培地中での分泌
を測定することにより検定した。全ての場合において、
培地は３７℃、ロータリー・ンエカー（１５０ｒｐｍ）
でインキ１、ベートした。ｐＤＪＢ３由来のトランスフ
ォーマントはコントロールとして使われた。

種々の分泌されたキモシン及びｌ、コール・ミニヘイ（
Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）のカルボキシル・プロテ
ア−セのウェスターン・プロットがトービン（Ｔｏν）
旧ｎ）等の方法に従って行われた（３５）。

キモシン・培地中の高塩濃度とこの塩のゲル電気泳動へ
の影響のために、脱塩ステップが必要である。予め作ら
れたＧ−２５カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　　）　、Ｐ　Ｄ　１０　）をｐＨ６，０の５０ｍＭ
Ｎａ２８ＰＯ４で平衡化した。培地の２．５ｍβをその
カラムにかけた。タンパク質を３．５ｍβの同緩衝液で
流出させた。プロット上に存在ずろ異種ポリペプチドは
、まずニトロセルロース・プロットをウサギの抗−キモ
シン（３６）又はウサギの抗−ムコール・ミエヘイ（Ｍ
ｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）カルボキシル・プロテアー
セ血清（３６）と接触させた。次にそのプロットをホー
スラディツシュ・パーオキシデース（カルフォルニア、
リッチモンド　バイオ−ラット社）と結合させたヤギー
抗−ウサギ血清と接触し、展開した。ゲルにかける前に
、５０μβの溶媒（キモシンの場合には脱塩する）を２
５μβのＳＤＳ試料緩衝液と混合した。最終濃度が１％
となるようβ−メルカプトエタノールを加えた。

その試料を９５℃で５分間処理した後、４０〜５０μｐ
の試料をゲルにチャージした。また各ゲルには各２ｐＲ
の６５０．６５．６．５　μｇ　／ｍβのキモシン・標
準物質と分子量マーカーをチャージした。

ｐｍｅＤＪｌ−７）ランスフォーマントのウェスタン・
プロットをゲル浸透を行なわないこと以外、同様に分析
した。

プロテアーゼ活性は、ソコール（Ｓｏｋｏｌ　　）　等
（３７）により述べられた方法により検出した。

ルリア（Ｌｕｒｉａ　）培地に１〜１．５％のスキム・
ミルク（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ　）　）を補ない、その
３０〜３５ｍβを１５０ｍｍのンヤーレに注いだ。培地
２〜５μβ画分をシャーレにスポットし、そのプレート
を加湿箱中３７℃で１晩インキュベ−トシた。その活性
はプレート上に生ずるミルクのクロッティングの量をｍ
ｍ単位で測定することに基づいて決定した。そのプレー
トを１００’ＣＨＩＩ／ｍβモジくは１６．６　ＣＩＩ
Ｕ／ｍ　Ｉ！のレンニン（ＣＨＵ−Ｃｈｒ　ハンセン単
位、コペンハーゲン、Ａ．／Ｓ　　ＸＣｈｒ−ハンセン
・ラボラトリ−（Ｈａｍｓｅｎ′ｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｕｍ）希釈物で共スポツテイングした。凝結帯の直
径（ｍｍ　）と酸素濃度は、対数関係にある。

プロテアーゼのタイプを区別するのに、カルボキシル・
プロテアーゼのキモシンタイプの阻害剤であるペプスタ
チンを、キモシン由来のプロテアーゼ活性の阻害のため
使用した。キモシン変異株試料とコントロール培地を、
プロテアーゼ活性分析にかける前に、ＤＭＳＯ中ＩＱｍ
Ｍペプスクチンを１００倍希釈したもので５分間ブレイ
ンキュベートした。

５％デンプン培地中のｐＤＪＢ　−ｇａｍ　−１，）ラ
ンスフォーマントによるグルコアミラーゼ分泌は、ｐ−
ニトロフェノール−α−グルコピラノント（ＰＮＰΔＧ
）（３８）をフリーのグルコースとｐ−ニトロフエノキ
ザイドへの転換を触媒するグルコアミラーゼの活性に基
づく方法により検定した。基質、ＰＮＰΔＧ、をＤＭＳ
Ｏ中１５０ｍｇ／ｍｐに溶解、３−１５μｐ画分をｐＨ
４，３０，２Ｍ酢酸ソーダ、１ｍＭ塩化カルシウム溶液
２００　μβて希釈した。２５μｐの試料をミクロクイ
クー・プレートのウェルに入れる。等量の０から１０シ
ク−ｙ　（５ｉｇｍａ　）　Ａ　・ニガー（Δ　ｎｉｇ
ｅｒ　）　−＋−ニット／ｍβ（ＭＯ，セントルイス、
シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、　）　）の範囲の標準物質を各々別のウェルに入れ
る。各ウェルに、２．２５から１１．２５ｍｇ／ｍ　Ｒ
のＰＮＰΔＧ溶液２００μβを加える。反応は６０℃で
３０分から１時間行った。

その時間は、酵素濃度に依存する。反応は、５０μ１）
２ｔＶｌ）ルズマーベースを加えることにより停止した
。プレートを４０５１ｍで測定し、酵素濃度は検量線か
ら算出した。

他言がない場合、染色体ＤＮＡは次のような操作で繊維
状菌類から抽出した。繊維状菌類を適当な培地で３から
４日間生育させた。マイセリアは、細かいチーズクロス
で培地を濾過することで収穫し、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍＭＥＤＴΔの緩衝液で洗浄
した。過剰の液体はマイセリアをチーズクロスで押しつ
けることにより取除いた。

湿ったマイセリア約３から５グラムを同量の殺菌済、酸
洗浄済砂と乳鉢、乳棒で混合した。その混合物を５分間
すりつぶして、細かいペーストを作った。さらに１０ｍ
１の５０　ｍ　Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，５ｍ
ＭＥＤＴΔを加えて、５分間その混合物をすりつぶした
。そのスラリーを５０ｍβのキャップ付遠心管に注ぎ、
２５ｍＡのフェノール−クロロホルムで抽出した（同体
積の５０　ｍ　Ｍｔｒｉｓ−ＨＣＡ　、　ｐＨ７，５，
５ｍＭＥＤＴΔで平衡化したもの）。低速遠心により相
分離させ、その水層に対し、３回抽出をくり返した。そ
の水層を合せて（総体積約２０ｍｆ！、）、殺菌済遠心
管中で、２ｍβの３Ｍ酢酸す）　ＩＪウム、ｐＨ５，４
と混合した。氷冷したイソプロパツール（２５ｍβ）を
加え、その遠心管を１時間−２０℃で放置した。その遠
心管を高速で遠心し核酸をペレット化し、上清は捨てた
。そのペレットを３０分間風乾させ、その後４００ｐＲ
の１０　ｍ　１Ｖｌｔｒｉｓ−ＨＣＲ、ｐＨＶ、　５．
１ｍＭＥＤＴＡ　（ＴＥ緩衝液）にサスペンドした。膵
リボヌクレアーゼ（ＭＤ、セントルイス、シグマケミカ
ル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　　）
をｍＡ当り１０μｇの濃度になるように添加し、室温で
３０分間インキュベートする（３０）。その後、リボヌ
クレアーセ′はフェノール−クロロホルム抽出により取
り除く。水層を慎重に取って、４０μβの３Ｍ酢酸ソー
ダ、ｐ＋＋　５．４を含む試験管に移す。その溶液に水
冷エタノールを重層し、界面にＤＮＡが沈澱するので、
それをガラス棒でまきとる。このＤＮＡを乾燥し、少量
のＴＥ緩衝液（１００〜２００μｊ２＞に溶解する。Ｄ
ＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸収により決定した。

選択したトランスフォーマント中のキモシンＤＮＡ配列
の染色体組込みを確かめるためにサウザーン・ハイブリ
ダイゼーションを行った（３０）。

トランスフォーマントの胞子サスペンションをアスペル
ギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）の完全培地にイノ
キュレートし、ロータリー・シェーカー中で、３７℃、
２４〜４８時間インキュベートした。培地は非選択的で
、５ｐｐｍのｐ−アミノ安息香酸を補い、独立栄養の親
株の生育のため十分なウラシルが含まれている。実際に
は、これらサウザーンはトランスフォーマントの安定性
に対するテストも行った。マイセリアの濾過後、砂です
りつぶし、先に述べたようにＤＮＡを精製した。さらに
トランスフォーマン）ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し
、フラグメントをアガロース・ゲル電気泳動により分離
した。コントロール・レーンは消化したｐＤＪＢ３　ト
ランスフォーマントＤＮＡ及び非消化ＤＮＡを含んでい
る。ゲルをエチジウム・フロマイトで染色し、写真擦影
し、ニトロセルロース又はニドラン（ＮＨ，キーン（Ｋ
ｅｅｎｅ　）　、シュＬ／イチャー及びシュＩル（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１　）製）に
ブロツトシ、放射性ラベルしたプラスミド又は特異的フ
ラグメントで探った。

実施例　１ アスペルギラス　ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）によるアスペルギラス・ニガー
（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）のグルコ
アミラーゼの発現と分泌 Δ、ｐＧＡ１の構築 アスペルギ゛ラス・ニガ゛−（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ　）（培養番号７　（Ｃｕｌｔｕｒｅ　
＃　７　）　、、　ＣΔ、ザウス・ザンフランシスコ（
Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　）　、カル
チャー・コレクション・ジェネンカー（じｕｌｔｕｒｅ
［：ｏｌｌｅｃｔ、＋ｏｎ　Ｇｃｎｅｎｃｏｒ　）　）
を猾しい曝気下、３０℃で３日間生育させた。染色体Ｄ
ＮＡは先に述ベブこ方法て行　っ　ブこ。

合成オリゴヌクレオチドをハイフリタイセーンヨン・プ
ローブとして使用し、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）由来のクルコアミラ
ーゼ遺伝子の検出を行った。そのオリゴヌクレオチドの
長さは２８塩基長（２８ｍａｒ）で、公表されているグ
ルコアミラーセを二フードする配列の最初の９１７３フ
トンに相当する。（３９）ＭｅｔＳｅｒＰｈｅＡｒｇＳ
ｅｒＬｅｕＬｅｕ八１ａＬｅｕＳｅｒ５　′へＴＧＴＣ
ＧＴＴへＣＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴビＧＣＣロＴ６八３　
′そのオリゴヌクレオチドは、製造業者により指示され
た試薬と方法を用いてバイオサーチ（Ｂｉ。

５ｅａｒｃｈ　）製自動ＤＮＡ合成機（ＣΔ、サンラフ
ァ工／ｌ／　（Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ　）　、バイオサ
ーチ（Ｂｉｏ　５ｅａｒｃｈ）製）で合成した。アスペ
ルギラス、ニガー（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ
ｅｒ　）のゲノムＤＮΔに対し、サウザーン法によりグ
ルコアミラーゼ配列の存否を分析した（３０）。簡羊に
言うさ、アスペルギラス・ニガー（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）　ＤＮＡ１０μｇをＢｃｏＲ１
制限エンドヌクレアーセで消化する。

消化したＤＮＡを標準法に従って１％アガロース・ケル
電気泳動にかける（３０）。ＤＮＡを１０ｘ　Ｓ　ＳＣ
（１，５Ｍ　ＮａＣ，ｉ！、０．１５　Ｍクエン酸３ナ
トリウム）中のプロッティングにより、ゲ゛ルからニト
ロセルロース膜（ＮＨ，キーン（１（ｅｅｎｅ　）、シ
、（ノイチャー及びン：ｗ、　ｘ　／ｌ／　（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ　）製）に移す（３０
）。８０℃の真空オーブンで焼くことにより、ＤＮＡを
ニトロセルロースに固定し、放射性ラベルしたオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、低塩濃度（２，４０）ハ
イブリダイゼーションを行う。合成オリゴヌクレオチド
の放射性ラベル化は７　Ｑ　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７，５）　１０　ｍＭ　ＭｇＣＡ２．５　ｍｔｖ
ｌジチオスレイトール、３　Ｑ　ｐｍｏｌｅ合成オリゴ
ヌクレオチド、２　Ｑ　ｐｍｏｌｅのガンマ（３２ｐ）
ΔＴＰ（Ｉｐ、シカゴ、７フーシヤム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ　）　、比活性５０００ｃｉ／ｍ　ｍｏｌ　）　、及
び５ユニツトのＴ４ポリヌクレオチド、キナーセにュー
・インクランド、バイオラブ（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ
　　−Ｂｉｏｌａｂｓ　）を含む５０μｎ反応溶液中３
７℃で行なわれる。ハイブリダイゼーション後、フィル
ターを２ＸＳＳＣ１０，１％ラウリル硫酸す）　ＩＪウ
ム（ＳＤＳ）で１５分間洗浄し、３７℃、２ＸＳＳＣで
２度洗う。フィルターを空気乾燥後、サラン・ラップ（
ダウ・ケミカル（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）で包み
、−７０℃でコダックのＸ　Ｏｍａｔ−ＡＲＸ線　フィ
ルムにかけてオートラジオグラフ像を得た。オートラジ
オグラフ像後、ハイブリダイゼーションのバンドが３．
５キロ塩基対のＢｃｏＲ１フラグメントに対応して明確
に確認できる。

アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒ　）のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化し、標
準法（３０）に従って、ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動によってサイズ別に分画した。３から４ｋｂのザイ
ズのＤＮＡフラクメントが切られ、ゲルから溶出した（
３０）。このＤＮＡフラクメントを大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃ：ｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）のクローニングベクタ
ーｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）において、りＴ
ｉ１−ン・ライフラリ−を作るのに用いた。クローニン
グ・ベクターを１ＥｃｏＲ］で切断し、ハタテリア・ア
ルカリ・ホスファターゼ（ベセスダ・リサーチ・ラフ（
Ｂｅｔｂｅｓｄａ　Ｒｏｓｅａｒｃｈ　ｌ、ａｂｓ）製
）で脱リン酸化した３、典型的な脱リン酸化反応は、５
０μｐの５０　ｍ　Ｍｔｒｉｓ−１１ｃｐ（ｐＨ８，０
）、５０ｍＭＮａＣ１，中１μｇの消化ベクターＤＮＡ
と１ユニットのアルカリホスファターゼにより行った。

その反応物を６５℃で１時間インキュベートした。オス
ファクーゼはフェノール−クロロホルム抽出により除去
した。それからＢＣＯＲ１による、選ばれたザイスのア
スペルギラス・ニガー（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕＳｎｉｇ
ｅｒ　）のＤＮＡを１ＥｃｏＲ］て切断し脱リン酸化し
たｐＢＲ３２２と連結した。典型的な連結反応は次のも
のを含んでいる；各１１００ｎのベクター及び挿入ＤＮ
Ａ、ＩユニットのＴ４　　ＤＮＡリガーセ（ベセスダ・
リサーチ・ラブ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｃａｒｃｈ　
Ｌａｂｓ））、２５　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−１１ｃ、ｆ
７　（ｐＨ７５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｎ２．１０　ｍＭ
ジチオスレイトノベ及びｌ　ｍＭＡＴＰ力月０μβ体積
中に存在する。連結反応は１６℃で１８から２４時間イ
ンキュベートする。連結したＤＮＡは、モリソン（Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ　）の方法く４１）により調製した大腸菌
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　２９４のコンピテント細胞（ＡＴ
ＣＣ３１４４６）をトランスフオームするのに用いた。

トランスフォーマントを、最終濃度５０μｇ／ｍβのカ
ルベネシリンを含むＬ　Ｂ寒天プレート（３０）で選択
した。グルコアミラーゼ遺伝子配列をもつトランスフォ
ーマントは、プローブとして、グルコアミラーゼ特異的
２８量体を使ったコロニー・ハイブリダイゼーション法
（３０）によって同定した。ハイブリクイズしたコロニ
ーを１４Ｍ　ｍし、プラスミドＤＮＡをアルカリ−３Ｄ
Ｓ−ミニスクリーン操作（３０）により、その各々から
単離した。この方法で選択したプラスミドは全て合成り
ルコアミラーゼプローブにハイブリダイズする３、　５
　ｋ　ｂのＥｃｏＲ１フラグメントを含んでいた。その
ようなｐＧａｊ２と命名したプラスミドを、さらに解析
するた杓に選んだ。ｐＧａｐ中の挿入物から１．１　ｋ
ｂのＥｃｏＲ１−Ｂｇβ■フラク゛メントをＭｌ、　３
ｍｐ９　（４２）にサブクローンし、グイデオキン・チ
ェーン・クーミネーション法（４３）により部分的に配
列決定し、そのクローン化ＤＮＡがグルコアミラーゼ遺
伝子をコードしていることを確かめた。ｐＧａ、ｇｌ中
に含まれる３、　５　ｋ　ｂのＢｃｏＲｌフラグメント
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図を図１に示した。そ
れは、既知のｐＢＲ３２２の制限部位に関する方向製を
知るために、単−及び２重の制限消化によって作られた
。（４４）ＢｙｐＧａ５の構築 ｐＧａｐのヌクレオチド配列及び制限地図はｐＧａｐが
全グルコアミラーゼ・コード領域と２２１ヌクレオチド
の５′側ＤＮＡを含んでいることを示した。この５′側
領域の配列は、驚くべきことに、ΔＴＧの開始コドンの
」１流に存在する。ＴＡＴΔＡΔＴ及びＣΔΔＴボック
スのある典型的な真核生物ブロモ−クー配列出回じであ
る（４８）。

しかし、アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ遺伝子のかなり上
流の活性化部位が最終的なトランスフォーメーション・
ベクター中に含まれることを確かめるために、５′側の
少なくとも１．．０００ｂｐのＤＮＡを含む大きいゲノ
ムフラグメントをクローン化した。すでに述べたと同じ
サウザーン・プロッティング実験により、ｐＧａｐから
の放射性ラベルしたＥｃｏＲ１クルコアミラーゼフラグ
メントとハイブリクイズする６、　５　ｋ　ｂのＣｌａ
　ｌフラグメントを同定した。

そのＢｃｏＲ１フラグメントはアルファー［：３２Ｐ　
：］　−ｄＣＴＰ　（アマ−ジャム、比活性３０００　
ｃｉ／ｍ　ｎｏｔ　　）をつかってニック・トランスレ
ーション（３０）により放射性ラベルした。ラベル反応
は、製造業者により提供された説明に従って、ニック・
トランスフームヨン・キット（ベセスダ・リサーチ・ラ
ブ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ１５ｅａｒｃｈ　ｌ、ａｂｓ
　）を用いた。フィルターはハイブリダイズされ、高塩
濃度条件で洗浄した（３０）。

ハイブリダイゼーションにより同定した６、５ｋｂのＣ
ｌａ　　Ｉフラグメントを先に述べたような方法でクロ
ーン化した。アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）のＩ）　Ｎ　Ａを［：］ａ　
　Ｉで消化し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によ
りサイズ別に分画した。５５から３ｋｂの間に移動した
ＤＮＡフラグメントを切り出し、ゲルから流出した。こ
のフラクションをＣ１ａ　　Ｉ切断し、脱リン酸したｐ
ＢＲ３２５と連結した（４５）。この連結混合物を大腸
菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ＞　２９４のコンペテント細胞をト
ランスフオームするのに用いた。トランスフォーマント
は、カルヘネンリン（５０μｇ／ｍｎ）を含むＬＢ寒天
プレート上で選択した。

グルコアミラーゼ遺伝子配列を含むコロニーをコ０ニー
・ハイフリダイゼーションにより同定した（３０）。ハ
イブリダイズしたコロニーから抽出したプラスミドＤＮ
Ａは、先にｐＧａｊ２中にクローン化した３、　５　ｋ
　ｂのＢｃｏＲ１フラグメントを含んでいた。これらの
組換えプラスミドは、ンークエント・プライマーとして
合成オリコヌクレオチド（２８量体）をつかったスーパ
ーコイル・ＤＮＡ配列決定法により確認されたように、
アスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒ　）のグルコアミラーゼ遺伝子をコードしてい
た。その５．５　ｋ　ｂのＣｌａ　　Ｉフラグメントの
制限エントヌクレアーセ切断地図を、ｐＢＲ３２５中に
クローン化したＤＮＡを単−及び二重消化することによ
り構築した。

ベクターＤＮΔ中の制限部位を参照点として用い、その
フラグメントの方向を決めた。この制限地図を図１に示
した。グルコアミラーゼ遺伝子の位置は、ｐＧａ５′の
制限部位を、先に公表されているり′ルコアミラー士遺
伝子のそれと比較することにより決定した（３９．４７
．４８）。地図のデータから、クローン化フラグメント
内に、およそ３、３　ｋ　ｂの５′側フランキングＤＮ
Ａと約１ｋｂの３′側フランキングＤＮＡが含まれるこ
とが確かめられた。

１９８５年８月２８日、プラスミドルＧａ５は大腸菌（
Ｅ、　ｃｏｌｉ）　２９４中、ＡＴＣＣに預けられ、５
３２４９番と命名された。

Ｃ，アスペルギラスーニガー（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼの発現及び分泌の
ためのベクター グルコアミラーゼ遺伝子を含むｐＧａ５由来の６．５に
、ｂのＣ］ａＩ７ラグメントを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ
　）−アスペルギ゛ラス・ニド′嘗シランス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）のシャトルベクタ
ーｐ　Ｄ　Ｊ　Ｂ　３中に、図２に示すごとくクローン
化した。ｐＤＪＢ３シャトルベクターは、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）のプラスミドｐＢＲ３２５由来の選択可能な
ベータ・ラクトアミラーゼ遺伝子及び複製開始点、アス
ペルキラス・ニドウランス（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｎ１ｃｌｕｌａｎｓ）のＧ１９１株においてウリジン
に対する栄養要求を救済するニューオスポラ・クラッザ
（Ｎｅｗｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ　）由来のｐｙｒ　　
４遺伝子、アスペルギラスニドウランス（（Ａ．ｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　ｉこおいて安定
な組込みトランスフォーマントを高頻度に出現させるア
スペルギラス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）由来のＡＮＳＩとして知られる配
列、クローニングのだめの唯一のＢｃｏＲ１及びＣβａ
Ｉ制限部位を有している。ｐＤＪＢは図１４に示したよ
うに構築した。プラスミドｐＦＢ６　（３２）をＢｇｌ
　　ｍで完全消化し、さらに旧ｎｄ■で部分消化した。

ｐｙｒ　４遺伝子（およそ２ｋｂ）を含むフラグメン）
Ｂをゲル電気泳動により精製し、旧ｎｄｌ］ＪとＢａｍ
旧で消化したｐＢＲ，３２５（フラグメントＡ）と連結
し、プラスミドｐＤＪＢ１を生成した。

ＥｃｏＲ１で消化したｐＦＢ６に巳ｃｏＲ１で消化した
Ａ、＝ドウランス（Ａ．、　ｎ１ｃｌｕｌａｎｓ）ゲ゛
ツムＤＮＡ（０１９１株又はＦＧＳＣ＃４−由来の株）
を連結することにより、ＡＮＳ−１配列をクローン化し
た。生じたｐＦＢ６中のＥｃｏＲ１フラグメント・プー
ルを用い、ｕｒａ３−３・セレビンアエ（Ｓ。

Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　（例えば、ＡＴＣＣ４４７
６９，４４７７０等）をトランスフオームした。自己複
製プラスミドｐｌｎｔＡをＳ、セレヒ゛シアエ（Ｓ、ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から精製する。ｐｌｎｔＡをＢｃ
ｏＲｌて消化し、ＡＮＳ−１フラグメントをゲル電気泳
動で精製し、３ｃｏＲｌで消化したｐＤＪＢｌと連結し
、プラスミドｐＤＪＢ２を生成した。ｐＤＪＢ２をＥＣ
ＯＲ１で部分消化し、ＤＮＡポリメレース１　（クレノ
ー）で処理し、再連結によりプラスミドｐＤＪＢ３を生
成した。ＡＮＳ−１フラグメントの部分的ヌクレオチド
配列及び制限地図を図１３Δと１３Ｂに示　しゾこ。

プラスミ）ｐＧａ５をＣｆ１ａ　　１て消化し、大きい
方のフラグメント（フラグメントΔ）をアガロース・ゲ
ル電気泳動によりベクターから分離した。

このフラグメントを、口βａＩで消化し、脱リン酸化し
たｐＤＪＢ３と連結した（フラグメントＢ）。

この連結混合物を用いて、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）
　２９４のコンペテント細胞をトランスフォーマントた
。このトランスフォーマントをカルベネンリンヲ補った
（５０μｇ／ｍβ）ＬＢ寒天プレート上で選択した。こ
れらのトランスフォーマント由来のプラスミドＤＮΔの
解析は、期待どおり、グルコアミラーゼ・フラグメント
が挿入されていることを示した。両方向を向いたグルコ
アミラーゼ・フラグメントが種々のトランスフォーマン
トをスクリーニンクすることにより得られた。ｐＤＪＢ
　−ｇａｍ　　１と命名した１つのプラスミドをアスペ
ルギラス・ニトウランス（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
　ｎ＋ｄｕｌａｎｓ　）のプロトプラスト 意に選択した。

Ｄ　グルコアミラーゼの発現と分泌 前述したように、アスペルギラス・ニトウランス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ　）のＧ１９１
株をｐ　Ｉ）ＪＢ−ｇａｍｌでトランスフオームした。

前述したように、ｐＤＪＢ−ｇａｍ−１７４　、９、１
０、１１及び１３と命名した５個のトランスフォーマン
トのグルコアミラーゼ活性を分析した。結果を表１に示
す。

表　　　１ ５に れから分るように各ｐＩ）Ｊ　Ｂ　−ｇａｍ　−１　）
ランスフォーマントはコントロール以上のグルコアミラ
ーゼ活性を生じ、これはトランスフオームした菌類から
生物学的に活性のあるグルコアミラーゼが発現、分泌し
ていることを示している。

実施例　２ アスペルギラス・ニドゥランス（Δｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）からの仔牛キモシンの発現と分
泌天然の仔牛キモシンの前駆体くプレプロキモシン）、
モジ＜ハアスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　　ｎｉｇｅｒ　）のグルコアミラーゼとプロキモ
シンに対するＤＮＡ配列が精密に融合している融合前駆
体をコードするよう発現ベクターを構築した。これらベ
クターの構築の戦略は次のようなステップを含んでいる
。まず、グルコアミラーゼ・プロモータ一部分と、グル
コアミラーゼの５′側コ一ド領域部分を含むＤＮＡ配列
をプレプロキモシンのアミン末端部分に対応するＤＮＡ
配列の上流にクローン化した。次に、そのＤＮＡフラグ
メント間のヌクレオチドを、特異的プライマ一配列をつ
がい、Ｍ　１．　３の部位特異的突然変異（４０）によ
り欠失させた。最後に、融合した配列を含むＤＮＡセグ
メントはプロキモノン配列の残りの部分とともに、アス
ペルキラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ
ｅｒ）のグルコアミラーゼ遺伝子の５′及び３′制御配
列をもつ発現ベクター中に組込んだ。これらのステップ
は図３から図７に概略を示した。

Ａ．ｍｐ１９ＧＡＰＲの構築 プラスミドｐＧａ．５を用いて、グルコアミラーゼ・プ
ロモータ一部分とコード領域のアミン末端セグメントを
有する３３７ｂｐのＥｃｏＲ　ｌ　−Ｒｓａ　　Ｉ　Ｄ
　Ｎ△フラグメント（フラグメントΔ）を誘導した。

フラグメントΔをＥＣＯＲ　１と３ｍａ　　Ｊで消化し
たＭ１３ｍｌ１１．９ＲＦ−ＤＮＡと連結した（フラグ
メントＢ）。

その連結混合物を用いて大腸菌（Ｅ，　ｃｏｌｉ）　Ｊ
　Ｍｌｏｌ　（ΔＴＣＣ３３８７６）をトランスフオー
ムした。対応するＲＦ−ＤＮＡの制限解析により、クリ
ア・プラークをフラグメント△に対し分析した。ｍｐｌ
　９　Ｒ　−Ｒｓｄ　と命名したフラグメントΔを、５
８ 含む１つの単離物をＰｓｔ　　］とＸｂａ　　Ｉて消化
し、大きい方のフラグメント（フラグメントＣ）を単離
した。小さい方のｘｂａ■−Ｐｓｔ■配列（フリクメン
）Ｄ）は、５′側のプレプロキモシン配列を含むｐＲ３
（４９）から誘導し、電気泳動により精製したのち、フ
ラグメントＣと連結することにより、図３に示したよう
なファージ・テンプレートｍｐ１９ｃΔＰＲを作った。

Ｂ１部位特異的欠失突然変異 図８に示したように、ｍ１１１９ＧＡＰＲ△Ｃ１を部位
特異的突然変異により、グルコアミラーゼのシグナルペ
プチトコドンとプロキモシンに対するコドンの間のヌク
レオチドを欠失させることによりｍｐ１９ＧＡＰＲから
誘導した。このようにｍ　ｐ　１．９ＧΔＰＲ△Ｃ１に
おいては、グルコアミラーゼのシグナルペプチトコドン
は、プロキモシンの最初のコドンと精密に融合しである
。部位特異的突然変異は、一本領Ｍ　１．３テンブート
で、第２の鎖の合成開始に唯一のオリゴヌクレオチドを
使用すること以外は、先に述べられた方法（４０）で行
なわれた。（図４）（４０）。ｍｐ１９ＧΔＰＲ△Ｃ１
を誘導するのに用いられた合成オリゴヌクレオチド′は
５　′ＧＣＴＣＧＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧ八Ｇ八Ｔ
ＣＡＣＣＡＧ３　′である。望へしへ欠失が起こったプ
ラークは、以前に述べた放射性ラベルしたプライマーと
のハイフリダイヤ−／ヨンにより同定ｌまた。

ｍｐ１９ＧＡＰＲ△Ｃ３においては、グルコアミラーゼ
の開始コドンの直前のヌクレオチドとプレプロキモシン
のＡＴＣ開始コドンの間のヌクレオチドを合成オリゴヌ
クレオチド（フプライマ−３）を用いた部位特異的突然
変異により結合している。

５　　′ＡＣＴＣ口ＣＣＣ八ＣＣＧへＡＡＴＧＡＧＧＴ
ＧＴＣＴＣＧＴ　３　　′図８に示すように、結果的に
その突然変異は、グルコアミラーゼプロモーター領域は
プレプロキモソンの開始コドンと精密に結合させている
。

Ｃ９仔牛キモンンの発現上分泌のためのベクターの構築 図４に示されているように、グルコアミラーゼ配列と５
′プロキモンン配列の各融合物（ｍｐ１９ＧＡＰＲ△Ｃ
１及びｍｐ１９ＧＡＰＲ△Ｃ３）は、アスペルギラス・
ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎ
ｓ　）のトランスフォーメーションベクターｐＤＪＢ３
において、３′プロキモシン配列とサツカロミセス、セ
レビシアｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ　）のホスホグリセレートキナーセ（ＰＧＫ
）のクーミネーターと結合している。ｍｐ１９ＧＡＰＲ
△Ｃ１とｍｐ１９ＧＡＰＲ八Ｃ３の複製型全Ｃ３ｏＲ１
とＰＳｔ　１で消化した。その小さい方のフラグメント
（フラグメント１）を単離した。プラスミドｐＢＲ３２
２もＥｃｏＲ１とＰｓｔ　１で消化し、その大きい方の
ベクターフラグメント（フラグメント２）を単離した。

フラグメント１と２を連結し、大腸菌（し、ｃｏｌｉ　
）　２９４をトランスフオームするのに用いた。

プラスミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲ△Ｃ１もしくはｐＢＲ
３２２ＧＡＰＲ八Ｃ３を含むテトラサイクリン耐性コロ
ニーを単離した。フラグメント２も大腸菌（Ｅ、　ｃｏ
ｌ　ｉ　）のポリメレース１　（クレノー・フラグメン
ト）で処理した。生じたプラントエンドフラグメントを
連結により環状化し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）　２９
４をトランスフオームするのに用いた。プラスミドｐＢ
Ｒ３２２△ＲＰを含む１つのテトラサイクリン耐性コロ
ニーを単離し、旧ｎｄ■とＳａｌ　Ｉで消化した。その
大きい方のベクターフラグメント（フォーマント３）を
単離した。プラスミドｐＣＲ１６０を旧ｎｄＩ［及びＰ
ｓｔ　Ｉで消化シ、フラグメント５（３’プロキモンン
、コドンを融合したイーストのＰＧＫクーミネーターを
含む）を単離した。フラグメント３．４及び５を連結し
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　２９４をトランスフオーム
するのに用いた。プラスミドｐＢＲ，３２２ＧＡＰＲ△
Ｃ１もしくはｐＢＲ３２２ＧΔＰＲ△Ｃ３を含むテトラ
サイクリン耐性のトランスフォーマント プラスミドｐＣＲ　１　６　０は、イースト中のプラス
ミドとして、その維持を許すイーストの２μｍ複製オリ
ジン、イーストの選択マーカーとしてのイーストのＴＲ
Ｐ−　１遺伝子、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２由来の大
腸菌（Ｅ，　ｃｏｌ　ｉ　）の複製オリジン及びアンピ
シリン耐性遺伝子、及びプロレンニン発現ユニットヲ含
んでいる。プロレンニン発現ユニットは、イーストのＰ
ＧＫ遺伝子由来のプロモーター、プロレンニンコード領
域及びＰＣＫ遺伝子由来のクーミネーターを含んでいる
。このプラスミドの構築は次のような方法で図９に示さ
れろように行った。プラスミドＹＥｐｌＰＴ　（５０）
を旧ｎｄＩＩＩて部分消化し、さらにｔＥｃｏＲｌて完
全消化し、ベクター・フラグメントΔを単離した。第２
のプラスミドｐＰＧＫ−１６００（５１）をＥｃｏＲ１
及び旧ｎｄｌｌＩで部分消化し、ＰＧＫプロモーターフ
ラグメントＢを単離した。フラグメントΔとＢを連結し
、中間体ｐｉｎｔｌ　を作り、再びＰ、ｃｏＲＩと１イ
１ｎｄｌで部分消化して、ベクターフラグメン）Ｃを単
離した。ＰＧＫクーミネーターフラグメントＤを単離し
、さらにプラスミドｐＢ１を旧ｎｄｌＪＪと３ａｎ　　
３Ａで消化した（５２）。ＰＲ，１（４９＞ＤＮＡを１
３ｃｏＲ１とＢＣβ１で切断することにより、プロレン
ニンフラク゛メントＥを単離した。フラグメントＣ１Ｄ
及びＥを連結し、イーストの発現プラスミドｐＣＲ１６
０を生成した。ＰＧＫプロモーター、構造遺伝子及びタ
ーミネータ−のヌクレオチド配列が報告されている（５
３）。

プラスミドｐＢＲ３２２ＧＡＰＲ△Ｃ１とｐＢＲ３２２
ＧＡＰＲ△Ｃ３は各々のプロキモンンに対する完全な転
写ユニッ）・を含んでいろ。この転写ユニットはは前駆
体プロキモシンを一］−１・する配列、グルコアミラー
ゼ・プロモーター及びイーストのＰＧＫクーミネークー
を含んでいる。しかし、これらのプラスミド透導体及び
後に述べるプラスミドｐＢＲ３２２ＧΔＰＲ△Ｃ２及び
ｐＢＲ３２２ＧΔＰＲ△４　　（ｐｉｎｔ　Ｉ　Ｃ１−
４）と命名した。

図５）は、Ａ、ニドゥランス（Ａ　、　ｎ１ｄｕｌａｎ
ｓ　）のＧ１９１にトランスフオームされたとき、検出
されうるキモンンを生産しなかった。これらの誘導体プ
ラスミドが何故キモシンを発現及び分泌できないかは、
分っていない。しかし、引き続く結果を照らしてみると
、これらプラスミド中のイース）ＰＫＧクーミネークー
もしくは短かいグルコアミラーゼプロモーター配列はＡ
　ニドゥランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　Ｇ　１９
１により認識されないようである。これらの結果に基づ
き、さらにｐＢＲ３２２ＧＡＰＲ△Ｃプラスミドを修正
した。

次のようなステップで、その転写ユニットを、アスペル
ギラス・ニトゥランス（Ａ．ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ
ｃｌｕｌａｎｓ　）のトランスフォーメーション・ベク
ターｐＤＪＢ３に移した。付加的にグルコアミラーゼの
５′フランキング配列をそのプロモーターの丁度５′側
に組込み、発現を制御するのに関係するかなり上流の活
性化部位の存在を確保した。

さらに、ＰＫＧクーミネークーを、ＰＧの５由来のＡ。

ニガー（Δ　ｎｉｇｅｒ　）のグルコアミラーゼのター
ミネータ−と置き換えた。特に図５中、各プラスミド（
ｐＢＲ３２２ＧＡＰＲ△Ｃ１又はｐＢＲ３２２ＧＡＰＲ
△Ｃ２＞をｌａ　ｌ　で消化し、フラグメント６を単離
した。またプラスミドｐＤＪＢ３もＣ１ａ　ｌで消化し
、バクテリア・アルカリ・オスファターゼで処理して、
自己連結を妨いだ。

この消化したプラスミド（フラグメント７）をフラグメ
ント６と結合し、プラスミドｐＩＮＴＩ−１又はｐＩｎ
ｔｌ−３を含む、アンピシリン耐性コ０ニーを単離した
。これらのプラスミドをＸｈｏ　　ＴとＮｓｉ　　Ｉで
消化し、より大きいベクターフラグメント（フラグメン
ト８）を単離した。広範囲の５′及び３′のフランキン
グ配列と同様、全クルコアミラーセ遺伝子を含むプラス
ミドｐＧａ５をＸｈｏ　　■とＮ５１１で消化し、より
小さいフラグメント（フラグメント９、およそ１．７０
０’ｂｐの５′側の配列を含んでいる）を単離した。フ
ラグメント８と９を連結し、大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）　
２９４をトランスフオームした。プラスミドｐｌｎｔ　
２−１又はｐｉｎｔ　２−３を含むアンピシリン耐性コ
ロニーを単離した。

これらのプラスミドは、グルコアミラーゼ・ターミネー
ターではなく、イーストのＰＧＫクーミネーターを含ん
でいる点で、最終的ベクターとは決定的に異なる（図７
参照）。

キモシン発現ベクターを構築する上での付加的ステップ
図６に概説しである。プラスミドｐＲ１（４９）を用い
て、プロキモンンのｃＤＮΔの３′端を含む小さなりｃ
ｌｌ−Ａｓｐ７１８ＤＮΔフラグメントくフラグメント
Ａ）をＩＪ離した。フラグメントΔを引きつつき、ＰＯ
Ｃｌ８中にクローン化し、Δｓｐ７］、８とＢａｍ　Ｈ
Ｉで消化した（フラグメン）Ｂ）。同様にプラスミドｐ
Ｇａ５から１２ｋｂのＣ１ａ　Ｉ　−Ａｓｐ　７１．８
のＤＮＡ７ラクメント（フラグメントＤ）を単１ｊｌし
、八ｃｃ　　ｌ及び八ｓｐ７］、８で切断したＰＯＣｌ
２（フラグメントＣ）にクローン化した。生じた中間体
プラスミド、ＰＵＣ−ｉｎｌｌとＰＵＣ−ｉｎｔ　　２
をＳａｌ　　１とＨｉｎｄｌｌで消化し、フラグメント
ＥとＦを屯離した。さらにこれらのフラグメントを連結
し、ＨｉｎｄＩＩＩ−△５ｐ７１８フラグメン）・（フ
ラグメントＨ）」−、クルコアミラーゼ・ターミネーク
ー配列が引き続く、プロキモシンの３′末端を含むＰＵ
Ｃ−ｉｎｔ、３を生成した。

ｐＢＲ−１ｉｎｋと命名した新しいクローニング・ベク
ターを、ｐＢＲ３２２の唯一のＢａｍ　Ｈ１部位に合成
オリゴヌクレオチドを挿入することにより作った。この
リンカ−は次の配列を内包している。

５　　′　ＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＣＴＣＧ八Ｇ八Ｔ［
：Ｇへ’ｒＣ３へ３へ　′　ＧＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴ
ＣＴＡＧＣＴＡＣＣＴ八Ｇ５’このベクターの大きい方
のｆｌｉへｄｌｌＴ　−Ｘｈｏ　　Ｉフラグメント（フ
ラグメントＧ）を電気泳動により精製した。同様にプラ
スミドｐｌｎｔ２−］及びｐｌｎｔ　２−３のＸｈｏ　
　Ｉ−ＡＳｐ７　］、　８制限フラグメントを電気泳動
的に精製した。一連の三種の連結反応において、異なる
■−フラクメントとフラグメントＧ及びｌ（を連結して
、中間体ｐｌｎｔ　３−１とｐ’ｔｎｔ　３−３を生成
した。これらの重要な中間体は、グルコアミラーセ・プ
ロモーター領域種々のンク゛ナル及びプロキモシン（又
はプレプロキモシン）配列へのプロペプチド融合体が最
後にグルコアミラーセ・ターミ洋−クー領域を従えろ形
で全て便利なＣｆｆａ　　Ｉ制限部位内に含んでいろ。

ｐ　Ｂ　Ｒ−１ｉｎｋのリンカ−中のもののように、あ
るｌａ　　Ｉ部位は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）のＤ
ＮＡメチル化により■害されるので、プラスミドｐｉｎ
ｔ　３−１からｐｌｎｔ　３−４までのものは、０Ｍ４
８（ΔＴＣＣ３９０９９）と命名した大腸菌（ｆＥ、　
ｃｏｌｉ　）のｄａｍ　−株にトランスフオームし、そ
こからプラスミドを再単離した。メチル化されていない
ＤＮＡをＣ，ｉ！ａ　　Ｉで消化し、電気泳動により、
フラグメントＪを屯離した。引きつづいて、各々のクル
コアミラーゼープロキモシン融合体からのフラグメント
ＪをｐＤＪＢ３　　（フラグメントＫ）の唯一のｌａ　
　１部位にクローン化し最終的発現ベクターｐｃＲｃ　
１とｐＧＲＣ３を生成した。

Ｄ、修生キモシンの発現と分泌 先に述べたように、アスペルギラス・ニドゥランス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）のＧ１９
１にｐＧＲＧｌ及びｐＧＲＣ，３をトランスフオームし
た。

５個のｐＧＲＧｌ及び５個のｐＧＲＣ３）ランスフォー
マントを解析した。ウェスクーン解析（示されていない
）は、各トランスフォーマントが、抗キモシンと反応し
、仔ウシのキモシンと同じか又はわずかに高分子量の位
置まで移動するタンパク質を分泌した。より高分子量分
子種は不適正なプロセンング、裸地効果又はグルコシル
化によるものかもしれない。組込みはザウザーン・ハイ
ブリダイゼーソヨン（結果は示していない）により、ひ
とつのトランスフォーマントに対し確かめた。各トラン
スフォーマントもキモンン活性検定した。この検定結果
を表Ｈに示す。

表■ ｐ　Ｄ　Ｊ　８３　　１．　　　０−０．１３ｐＧＲＧ
１　　５　　　０−１．５ ｐＧＲＧ３　　５　　０．０５−７．０これらの結果は
、ｐｃＲｃｌ及びｐＧＲＣ３の双方ともｐＤＪＢ３コン
トロール以上の種々のレベルのプロテアーゼを分泌する
ことを示している。

たまたま、ｐＤＪＢ３コントロール培地中にバックグラ
ンドのタンパク分解活性が検出された。後に示されるよ
うに、このトランスフォーマントのタンパク分解活性は
、キモシンを１つのメンバーとするカルボキシル・プロ
テアーゼのアスパラギン酸ファミリーと会合している。

実施例　３ アスペルギラスーニトゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）からの融合ポリペプチドの発現
と分泌Δ　ニドゥランス（Ａ．ｎ１ｄｕｌａｎｓ）から
発現・分泌させるだめの２つの融合ポリペプチドを構築
した。１つの融合ポリペプチドは、アスペルギラス・ニ
ガー（△ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）のグルコ
アミラーゼのプロ配列と最初の１０ケのアミノ酸を含む
アミン末端側の領域と、仔牛のプロキモシンを構成する
カルボキンル末端側領域を含んでいる。

第２の融合ポリペプチドはアスペルギラス・ニガー（Δ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラー
ゼのプロ配列のみのアミノ末端領域と仔牛のプロキモシ
ンのカルボキンル末端領域を含んでいる。

Δ、融合ポリペプチドを発現及び分泌するためのベクタ
ー 上記の融合ポリペプチドをコードするベクターを前述の
ｐｃｐ、ｃｌとｐ　Ｇ　ＲＧ　３を構築したときと同様
の操作に従って、ｍｐ１９ＧＡＰＲから、特異的配列を
欠失させることにより構築した。図８に示すように、ｍ
ｐ１９ＧＡＰＲ△Ｃ２において、グルコアミラーゼ・プ
ロペプチドコドンと、プロキモシンのコドンの間のヌク
レオチドは上述の部位特異的突然変異により欠失させた
。この突然変異のために合成したオリゴヌクレオチド′
（プライマー？）の配列は ５　　′ＴＧ八ＴへＴＣＣ八八へへＧ［：ＧＣＴＧＡＧ
ＡＴＣＡＣＣ八６３　′である。

このへ然変異は、グルコアミラーゼ・プロモーター、ン
グナル・ペプチド及びプロペプチド・コドンをプロキモ
シンの最初のコドンに融合することを意図している。ｍ
ｐ１９ＧＡＰＲ△Ｃ４において、成熟グルコアミラーゼ
の１０番目のコドンと、プロキモシンのコドンとの間の
ヌクレオチドを合成オリゴヌクレオチド（プライマー４
）を用いたＭ　１．３の部位特異的突然変異により欠失
させた。

５　　′ＴＧ八ＧへＡＡＣＧΔＡＧＣＧＧＣＴＧ八Ｇへ
ＴＣＡＣ口八Ｇへ’この欠失によりり゛ルコアミラーゼ
・プロモーター領域、ングナルペプチド配列、プロペプ
チド配列、成熟グルコアミラーゼの１０番目までのコド
ンを、図８に示すようにプロキモシンのコドンに融合し
た。これらの発現及び分泌ベクターをｐｃＲ２とｐＧＲ
Ｇ４と命名し、Δ、ニドゥランス（Δ、　ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ）をトランスフオームするのに用いた。

Ｂ、ｐＧＲ２とｐＧＲ４でトランスフオームしたアスペ
ルギラス・ニドゥランスくΔｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ旧＋
１ｌｕｌａｎｓ　）からのキモシンの発現と分泌光に述
べたように、ｐＧＲＧ２とｐＧＲＧ４）ランスフォーマ
ントを培養した。その培地を、ウェスタン・プロットに
より、キモシン活性を検定し、ｐＧＲＧ　Ｉ及びｐＧ、
ＲＧ３で得られたものと同じ結果を与えた。ｐＧＲＧ２
）ランスフォーマントの組込みはサウザーン解析により
確かめられたく結果は示していない）。キモシン検定の
結果を表■に示した。

表　　　■ ｐＤＪＢ３　　１　　０−０．１３ ｐＧＲＧ２　　１．　０．００１−０．４２ｐＧＲＧ４
　　６　０．００４−０．７５再度、各トランスフォー
マントはｐＤＪＢ３コントロール以上のプロテアーゼ活
性を示し、そのトランスフォーマントにより、プロテア
ーゼが発現及び分泌されていることを示した。ｐＧＲＧ
ｌとｐＧＲＧ３の場合と同様に、それらプロテアーゼは
、ペプスクチン阻害で確かめられたように、カルボキシ
ルプロテアーゼのアスパラギン酸ファミリーに属してい
る。重要なことは、これらの結果により、繊維状菌類の
中で、ハイブリットポリペプチドが発現していることが
示されていることである。

実施例　４ ペプスクチン阻害研究 キモシンを含む種々の構築を含む上記ベクターの３個に
ついて、前に述べたようなペプスクチン叩害検定解析を
行った。結果を表■に示す。

表■ ペプスタチンとプレインギュベートした試料は活性が著
しく減少し、トランスフォーマントにより生産されるプ
ロテアーゼが、キモシンがその一員である酸プロテアー
ゼのアスパラギン酸ファミリーに属することを示した。

ウエスクーン解析からのデータと共にこのデータは、生
物学的に活性なキモシンが、ｐＧＲＧ　ｌ、ｐｃｔマＧ
２、ｐＧＲＧ３、及びｐＧＲＧ４でトランスフオームし
たΔ。

ニトウランス（Ａ　、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）のＧ１９
１により発現及び分泌されることを示している。

実施例■及び実施例ＩＩＩにおける異なるベクター構築
物に対して検出されたキモシン活性の程度は、各トラン
スフォーマンヨン・ベクター内に組込まれた種々のング
ナルの認識の程度の差を反映しているのかもしれない。

特別な構築物においては、キモシン活性の変化は菌類ゲ
ノム中に組込まれるベクターのコピー数やもしくは、そ
のような組込みの位置に関係しているようだ。

実施例　５ 炭素源研究 １つのベクターｐｃＲｃ４でΔ、ニドゥランス（Ａ　、
　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）をトランスフオームし、その後
、先に述べた種々の炭素源について生育させてみた。

この検定結果を表５に示す。

表　　　Ｖ 種々の炭素源により生産されるキモシン活性（μｇ／ｍ
β） デンプン　クルコース　フラクトース　スクロースｐＤ
ＪＢ３　　０　　　　　０　　　　　０　　　　　０ｐ
ＧＲＧ４　　３．５　　　　３．５　　　　０．９　　
　　１．７５これらの結果は、明らかに、キモシンが炭
素源とは無関係に分泌されていることを示している。

これは、グルコアミラーゼ・プロモーターの転写制御が
、Δ、ニガー（Δ、　ｎｉｇｅｒ　）中でのものと違い
、デンプンにより誘導されるのではないことを示してい
る。

実施例　６ ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）の
カルボキシル・プロテアーゼの発現と分泌 Ａ、カルボキシルプロテアーゼのゲノムプローブムコー
ル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）の酸プロ
テアーゼの部分的−次構造（５４）は低い遺伝的冗長性
の領域に対して調査された。１８７〜１９１残基（ブタ
のペプシン番号システムを用いた）のｔｒｙ−ｔｒｙ　
−ｐｈｅ　−ｔｒｐ　−ａｓｐ　、を選んだ。このアミ
ノ酸に対応するコード配列に相補的なオリゴヌクレオチ
ド ５　　’　−ＧＣ（Ｇ／Ａ＞ＴＣＣＣ八（Ｇ／八）ＡＡ
　（Ｇ／Ａ＞ＴＡ　（Ｇ／八）ＴＡ−３′を合成しく３
１）、ガンマ−１：３２Ｐ　）　−ＡＴＰとＴ４のポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてラベルした（３０）。

Ｂ、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　
）のカルホキシル・プロテアーゼのクローニンク゛ｌ、
コー／ｌ、−ミニヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）
　　（オランダ３７０．７５．セントシル・プリュー・
ブーア・シメルカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｂｕｒ
ｅａｕ　ＶｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　
）　）由来のケノムＤＮへを次のように調製した。ＹＭ
Ｅ培地（３ｇ／ｐイーストエクストラク）・、３ｇ／、
＋２マルトエクストラクト、５ｇ／βペプトン、１０ｇ
／βクルコース）中で生育した細胞を遠心により集菌し
、０．５ＭＮａＣｐにより２度洗って、凍結乾燥した。

さらに細胞膜を細胞に砂を加えて、乳鉢と乳棒でその混
合物をすりつぶすことにより破壊した。生じた粉を、２
５％ショ糖５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩＩ］８８．
０　）、１．０ｍＭＥＤＴΔを含む溶液に懸濁（乾燥重
量クラム当り］、５ｍｆｆ）した。ＳＤＳを最終濃度０
１％となるように加え、そのサスペンションを半分量の
フェノールで１度、半分量のクロロホルムで３度抽出し
た。最終的な木屑を１０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＤＣＩ
！。

（ｐｔ１８．０）、１ｍＭＥＤＴＡに対シテ、ヨ＜透析
した。それからＤＮＡを、酢酸ナトリウム（ｐ１１５．
５）が０．３　Ｍの濃度になるように加え、さらに冷エ
タノールの２５倍容を加えることにより沈澱させた。こ
のＤＮＡ画分を製造業者の指示に従って種々の制限エン
トヌクレアーセで消化し、ザウザーン法を用いて、先に
述べられたプローブの配列と相補的な配列に対して分析
した。およそ２，５ｋｂ（キロベース）の正のハイブリ
ダイズバンドを１１ｉｎｄｌＴＩ消化１）　Ｎ　Ａ中に
同定した。）ｌｉｎｄｌｌｌ消化ゲノムＤＮＡをポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離し、２．０〜３．
（ｌｋｂのＤＮＡを含むゲルフラグメントを先に述べた
ように電気流出した。ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ
　ｍ１ｅｈｅｉ　）の酸プロテアーゼ遺伝子に対応する
配列に富んでいると考えられろこの電気流出ＤＮＡをエ
タノール沈澱した。クローニング・ベクターｐＢＲ３２
２（ＡＴＣＣ３７０１７）を旧ｎｄｌＪＪで消化し、バ
クテリア・アルカリ・ホスファターセで脱リン酸した。

典型的には１０μｐ反応液中、１．０ｍｇのベクターと
１００ｍｇの大きさのそろったＤＮＡを、ＡＴＰとＴ４
ＤＮＡ　ＩＪガーセの存在下で結合した。その反応物は
、カルンウム・ンヨック操作（３０）により、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）　２９４にトランスフオームした。約２
、ＯＸｌ、０４のアンピンリン耐性コロニーヲ得り。

これらのおよそ９８％が、テトラザイクリンを含む培地
中で生育てきないことによって示されるように、クロー
ン化挿入物を含んでいる。これらのコロニーについて、
ＤＮＡプローブの配列と相補的な配列の存否を標準的な
コロニー・ハイブリダイゼーション操作により検定した
。プラスミドｐＭｅ　５　′ｍｕｃを含む、正のハイブ
リダイズしたコロニーは、予想される２、５ｋｂの大き
さのｔｌ　ｉ　ｎ　ｄ“■挿入物を含むことが分った。

このフラグメントの末端をＭ１３シークエンシング・ベ
クターにザックローンしく３３）、その配列をグイデオ
キシ・チェーン・クーミ不−ンヨン法により決定した。

１つの末端は、酸プロテアーゼ遺伝子の、既知アミン末
端アミノ酸配列に対応する配列を含んでいた。

隣接する３′領域をよりＣ末端側のコード配列を得るた
めに配列決定した。その配列決定の戦略は図１０に示し
である。このように、そのタンパク質の成熟型に対する
全てのコード配列が得られた。

そのフラグメントの５′末端は成熟型アミン末端に対応
するコドンの１１２ｂｐ　（塩基対）上流に生ずること
が分った。この」−流領域は読み枠に合った開始コドン
を含まないのでプロペプチドの一部となると考えられる
。５′側の翻訳されない配列同様、開始コドンを含むＤ
ＮＡを得るためにより５′側のクローンを次のようにし
て単離した。

ｐＭｅ５　′ＣＲａ　ｔｌｉｎｄ　Ｉｎ挿入物の旧ｎｄ
　ＩＩＩ　−Ｃｌａ　Ｉ　８１３ｂｐ５′側ザブフラグ
メントを単離し、ニックトランスレーション法によりラ
ベル化した（３０）。

このラベル化フラグメントをザウザーン法によりＣｌａ
　Ｉ消化したムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅ
ｈｅｉ）ゲノムＤＮＡをつり上げるのに用いた。この実
験でおよそ１３００ｂｐの分子量に対応するハイブリダ
イゼーションの単一バントがｇＢＨされた。このザイズ
の大きさのそろったＤＮＡを単離し、Ｃ１ａＩで消化し
、脱リン酸化したｐＢＲ３２２に、上述の方法でクロー
ン化した。

およそ９０００のアンピシリン耐性コロニーを得た。そ
れらの約９０％はテトラザイクリン含有培地で生育でき
ないことで示されるようなりローン化挿入物を含んでい
た。これらのコロニーに対し、ニックトランスレートし
たプローブのものに相補的な配列の存否について標準的
コロニー・ハイフリダイセーンヨン操作により検定した
。プラスミドｐＭｅ　　２を含む正のハイフリダイスを
するコロニーは期待されるように１，３ｋｂのＣ１ａ　
　Ｉ挿入物を含んでいることが分った。このフラグメン
トの末端の配列決定が、１つの末端はｐＭｅ　５　’Ｃ
ｌａ中の旧ｎｄｌｌＩフラグメントのＣｌａ　　１部位
近傍の配列に対応しており、図１０に示されるフラグメ
ントの配向をとっていたことを示した。さらに、Ｃ１ａ
　　Ｉフラグメントの配列決定が開始コドンと５′側の
非翻訳配列を明らかにした。全コード配列と、５′側及
び３′側のフランキング配列を図１０に示した。その誘
導した一次構造と、直接的にアミノ酸の配列決定により
決定したものとの比較で、ムコ−／ｌ／　（Ｍｕｃｏｒ
　）タンパク質は６９残基のアミノ酸が延長している前
駆体として作られることが分った。一般にリーター配列
中に存在する構造特性に基ついて、−２１から−１の残
基がリーク−ペプチドを包含し、２１から６９の残基が
、キモシン及びペプシンを含む他の酸プロテアーゼのザ
イモゲン型中にみられるものと同類のプロペプチドを包
含しているらしい。（５５） Ｃ，ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　
）のカルボキシル・プロテアーゼの発現及び分泌ベクタ
ームコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）
のカルボキシル・プロプアーゼを発現し、分泌するため
のベクターは、コード配列、５′側フランキング配列（
プロモーター）、及び３′側フランキング配列（ターミ
ネークー及びポリアデニレーション部位）を含む全ての
本来のムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ
　）酸プロテアーゼ転写ユニットを含んでいる。

このベクターを作るための全戦略は図１２に示シタ。ア
スペルギラス・ニドゥランス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）のト
ランスフォーメーシ−３ンーベクターｐＤＪＢ１をＣｌ
ａ　　ＩとＢｃｏＲ１で消化し、より大きいベクターフ
ラグメント（フラグメントＩ）を単離した。プラスミド
ｐＭｅ　　５　′ＣｌａをＥｃｏＲ１とＣｌａ　　Ｉで
消化し、フラグメント２を単離した。このフォーマント
は約５００ｂｐの５′側フランキング配列とともに、酸
プロテアーゼの５′側コドンを含んでいる。フラグメン
ト１と２を連結し、大腸菌（Ｂ、ｃｏｌｉ）　２９４を
トランスフォーＡ　Ｌだ。プラスミドｐＭｅ　Ｊ　Ｂｉ
ｎｔを含むアンピシリン耐性コロニーを単離した。この
プラスミドをＣｌａ　　Ｔで消化し、自己連結を防ぐた
於に、バクテリア・アリカリ・オスファクー士で処理し
、フォーマント３と命名した。プラスミドｐＭｅ　　２
をＣｌａ　　Ｉで消化し、より小さいフラグメント（フ
ラグメント４）を単離した。このフラグメントはムコー
ル・ミエヘイ（ｌＪｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）の酸プ
ロテアーゼの３′側コドンと、約１８００ｐｂの３′側
フランキング配列を含んでいる。フラグメント３と４を
連結し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ＞　２９４をトランスフ
オームした。プラスミドｐＭｅ　Ｊ　１３１−７を含む
アンピンリン耐性コロニーを単離した。このベククーラ
、アスペルギラス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）にトラフ　ニア、　７　オ
ー　ムした。

Ｄ、アスペルギラス・ニド１クランス（Δｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ旧山＋１ａｎｓ　）に上山＋１ａｎｓ・ミニヘ
イ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ　　）のカルボキシル・プ
ロテアーゼの発現と分泌 ６個のトランスフォーマントのサウザーン・プロプ）　
解析Ｌｉアスペルギラス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）ゲノム中に、全ムコ
ール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ　）酸プＤ
　テアーゼ遺伝子が存在することを示した（結果は示し
ていない）。さらに、各トランスフォーマントはウェス
タン・プロット（結果は示していない）と酸プロテアー
ゼ活性の解析を行った。プロテアーゼ検定の結果を表■
に示した。

表　　　Ｖｌ １　　　　　　　　　　　０．　ＯＯ３２０、００７ ４０、ＯＯ５ ５０、００５ ６０，０１２ これらの実験は、ムコール・ミエヘイ（Ｍ　ｕ　ｃ　ｏ
　ｒｍｉｅｂｅｉ）のカルボキシル・プロテアーゼに対
する特異的抗体と反応し、ミルクの凝固活性をもつタン
パク質の発現と分泌を示している。そのタンパク質は、
本来のくムコール・ミエヘイ（Ｍ　ｕ　ｃ　ｏ　ｒｍｉ
ｅｈｃｉ　）由来のタンパク質の分子量より、わずかに
大きい、見かけの分子量をもつことが、電気泳動解析に
より分った。これは、アスペルギラス・ニトウランス（
ΔｓｐｅｒｇｉｌｌｕＳｎｉｄｕｌａｎｓ　）がこノ／
”　ＩＪコプロティンヲ、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃ
ｏｒ　ｍ１ｅｈｃｉ　）とは異なるレベルのクリコンル
化を行うことを示しているのかもしれない。アスペルギ
ラス・ニトゥランス（△ｓｐｃｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕ
ｌａｎｓ　）由来のムコール・ミエヘイ（Ｍｕ　ｃ　ｏ
　ｒｍｉｃｌ）ｅｉ）酸プロテアーゼは、本来のものと
同様の特異的活性をもっているようであるので、それは
成熟型にまでプロセンング（細胞によってか、又は自己
触媒的に）されているらしい。キモシンやペプチンのよ
うな他の酸プロテアーゼの非プロセンンク型はプロセン
ングをうけて（自己触媒的に）活性を示すザイモゲンで
ある。種々のトランスフォーマントの中での発現のいろ
いろなレベルは、アスペルギラス・ニドゥランス（△ｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ　）ゲノム中での
プロテアーゼ遺伝子の位置又はコピー数を反映している
らしい。しかし、生物学的に活性なカルボキンル・プロ
テアーゼの発現及び分泌は、Δ、ニドウランス（Δ、　
ｎ１ｄｕｌａｎｓ）がムコール９ミニヘイＵｕｃｏｒ　
ｍ１ｅｈｅｉ　）のカルボキンル・ブ丁コテアーセ′の
プロモーター、ングナル及びクーミネーターシグナルを
認識していることを示している。

実施例　７ Δ、アワモリ　（Ａ、　ａｖ＋ａｍｏｒｉ　　）及びト
リコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅ
ｅｓｅｉ　）　ｐｙｒＧ栄養要求性変異株からの、ｐＧ
ＲＧｌ−４によってコードされたキモシンの発現と分泌 ｐｃＲｃ　１からｐＧＲＧ４までのプラスミド（ｐＧＲ
Ｇｌ−４）も、Ａ、アワモリ　（Δａν）計ｏｒ　＋）
　及ｉＪ　）リコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅ
ｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　）のオルチシン−５′−リン酸
デカルボキンレース（ＯＭＰＣａｓｅ）欠失変異株をト
ランスフオームするのに用いた。ｐＧＲＧｌ−４プラス
ミドによりコードされているＮ。

クラッザ（Ｎ　、　Ｃｒａｓｓａ）由来のｐｙｒ　４遺
伝子は、ウリジンのない条件で、これらＯＭ　Ｐ　Ｃａ
５ｅ変異株ヲ補ない、うまくトランスフォーマントを単
離させた。このようなΔ、アワモＩＪ　（Ａ　、　ａｖ
＋ａｍｏｒｉ　　）及びＴ、レエセイ　（Ｔ　、　ｒｅ
ｅｓｅｉ　）のトランスフオームした変異株はその培地
中に検出可能量の生物学的に活性なキモシンを分泌した
。

Ａ、ｐｙｒＧ栄養要栄養要求性成 Δ、アワモリ（Ａ、　ａｗａｍｏｒｉ　　）及びＴ　レ
エセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ　）のｐｙｒ　Ｇ栄養要求
性変異体を得るのに用いた方法は、ピリミジン・アナロ
タの５＝フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）に関する迩択
を含んでいる（５６）。ＦＯＡが野性株を死滅させる機
構は分っていない。しかし、ＦＯＡに対するＯ　Ｍ　Ｐ
　Ｃａ５ｅ−欠失変異株の耐性という見地から、その毒
性が、ＦＯＡの５−フルオロ−ＵＭＰへの転換を通して
起こるらしい。細胞の死がフッ素化したりボヌクレオチ
ド又はデオキンリボヌクレオチドによるものかどうかは
明らかではない。次に示したのがＴ、ｌ／Ｉセイ（Ｔ　
、　ｒｅｅｓｅｉ　）とＡ、ア’７％す（Δ、　ａｗａ
ｍｏｒｉ　）のＯＭＰＣａｓｅ−欠失（ＦＯＡ−耐性）
変異株を単離する方法である。

１、トリコデルマ・レエセイ　（Ｔｒ　ｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａｒｅｅｓｅｉ　） Ｔ　レエセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ　）のＰ３７株（Ｎ
ＲＲＬ　　１５７０９）の新鮮な胞子サスペンションを
０．０１％のトウィーン８０を含む滅菌した蒸留水で洗
浄した。この胞子サスペンジョン１５ミリリツトル（１
ミリリットル当り１．Ｘ１０７ケの胞子）を滅菌済マグ
ネソクスクーラーロツドとともに滅菌シャ−レ（１，ｏ
ＯＸ２０ｍｍ）の中に入れた。フタ−を取り、暗闇中、
Ｕ■赤光源ら２５ｃｍ離して、その胞子を２５４％ｍの
紫外光（ＬＩ　Ｖ　）で照射した（１平方センチメート
ル当り、７０００マイクロワツト）。胞子を一定にカク
ハンした。

ＵＶ照射を３分間続けた（これは７０％の胞子を殺すの
に十分な時間である）。照射した胞子を５０ｍｐ遠心管
中に集め、光回復を防ぐために暗闇中に一時間保存した
。胞子を遠心によりペレフト化し、そのペレットを０．
０１％のトウィーン−８０を含む２００μβの滅菌水に
阿懸濁した。

そのザスペンジョンを希釈し、０１５％のＦＯＡ（フロ
ツグ、ゲインズウ゛イル（Ｇａｉｎｓｖｉｌｌｅ）、Ｓ
ＣＭスペシャルティー、ケミカルズ（Ｓｐｅｃｉａｌｔ
ｙＣｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）を含むＹＮＢ寒天培地（
アミノ酸を除いた０、７％のイーストの窒零塩基、１０
ｍＭウリジン、２％寒天）」乙にプレーディンクしたく
５６）。３７℃、４日間のインキ」ベーンコン後、７５
ケのコロニーをＩ”　ＯＡを含む新鮮なＹＮＢ培地に選
びとった。７５ケのコロニー中６２ケが生育し、最小寒
天培地（６ｇ／　ＲＮａＮＯ２，０，５２ｇ／　Ｉ２　
ＫｃＩ！　、　１．５２ｇ／　β　Ｋ１１２ＰＤ、　　
、　　１ｍｌ’　β（数量元素溶液、１％グルコース、
０．１％Ｍｇｓ［］、、２０　ｇ／　Ｉ２寒天）及び１
　ｍｇ／ｍβのウリジンを加えた最小培地につまようし
て植え込んで、ウリジン栄養要求性を調べた。６２ケの
中熱物の全てがウリジン入りの最小寒天培地で生育した
が、そのうち９ケが最小寒天培地のみては生育できなか
った。これら９ケの株を再び、最小培地及びウリジン入
り最小培地に植え込んだ。その株のうちの２つがウリジ
ンを補った。最小寒天培地でのみ生育した。

このうち、′Ｆ　レエセイ（Ｔ　、　ｒｅｅｓｅｉ　）
　ｐｙｒ　Ｇ　２９と命名したものは、最小」Σり地の
みでは、生育できないがウリジン入りの最小培地ではよ
く生育した。２，７′スペルギラス　アワモリΔｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ　　） （ｉ）Ａ、７７モリ　（Δ、　ａｗａｍｏｒｉ　　）　
ＵＶＫ　１４３［−株のグリコアミラーセのハイパープ
ロデュザーの生産 Ａ、アワモリ　（Δ、　ａ＋ｖａｍｏｒｉ　　）のＮＲ
ＲＬ３１１２株の胞子は、３０℃でポテト・デキス）ｏ
−ス寒天培地（ＰＤΔ、ディフコ社）上で５〜７日間生
育させて得た。プレート表面を滅菌した０１％トウィー
ン蒸留水溶液で洗い、しずかに胞子をはがずことにより
胞子を収穫した。胞子を遠心により洗浄し、最終的にｌ
ＸｌＯ７から２×１０８胞子／ｍβの濃度となるように
同緩衝液に再懸濁した。調製物を４℃で保存した。

胞子２ｍβを滅菌シャーレに加えた。シャーレのフタを
除いて、胞子を紫外線（ＵＶ）ランプ（１５ワツト、殺
菌用）にさらした。露光時間及びランプからの距離等の
条件は、胞子が９０から９９．９％死滅するように調整
した。生存した胞子をＰＤΔ培地」二にブレーティング
し、個々の独立したコロニーを形成させた。

個々の突然変異させたコロニーからの胞子を、５％コー
ンミール、０．５％イースト・イノストラクト、２％コ
ーン・ステープリカーを含み、ｐ１１４５に調整後２５
　Ｑ＋ｎｊｌ！フラスコ中で滅菌した５ＱｍＡのスクリ
ーニング培地にイノキュレートした。しかし、炭素源と
して、コーン又はコーン・スクーチを含む、どのような
培地でも同様の結果を与えるであろう。培養を一定にカ
クハンしながら３０〜３５℃で４〜５日間行った。検定
のため、試料は毎日又は運転の最後を取り出した。

グルコアミラーゼ活性の見積りは無色の基質（ハラ−ニ
トロ−フヱニルーアルファーグルコシド、ＰＮＰΔＧ）
からの色形成基（パラ−ニトロ−フェノール）の放出を
測定して行った。

次の方法を用いた。

基質−１８０ｍｇＰＮＰＡＣをｐｆ＋４．７の０．１Ｍ
酢酸ソーダ緩衝液２５　［］ｎｌにとかし、４℃に保存
しブこ。

検定、基質１ｍｌを４０℃のウォーターハスで平衡化す
る。０２ｍＩ２．の試料（又は希釈試料）を加え、４０
℃で３０分間インキキュートする。９ｍβの０．　Ｉ　
Ｍ　Ｎａ２Ｃｏ３をカクハンしながら加え、色が出てく
るＪ：で室温で１５分間放置する。その混合物をワット
マン（Ｗａｔｔｍａｎ　）の４２濾紙で濾過し、適当な
分光光度計で４２０ｎｍの吸収を測定する。すべての変
異株のＰ　Ｎ　ＰΔＧ　１−’ベルを親株により生産さ
れる標べｆ、値と比較し、親株のＰＮＰΔＧ加水分解に
対する百分率として報告する。

［ＪＶＫ１４３ｆと命名した１つのグルコアミラーセハ
イパープロデューシンク株を栄養要求突然変異により選
択した。

（１１）栄養要求性突然変異 Ａ　ア’７％υ　（Ａ、ａｖｔａｍａｒｉ　　）　ｔＪ
ＶＫ　Ｉ　４３１株からの胞子の調整、ＵＶ突然変異、
及び変異体解析を次の修正に従い、Ｔ、レエセイ（Ｔ　
、ｒｅｅｓｅｉ）と同様に行った。

ａ、ＬＩＶ光による７０％死滅に２５分必要とした。

ｂ、ＹＮＢ寒天培地の代りに最小培地を用いた。

ｃ、ＦＯΔ濃度を０．１％とした。

１５のｐｙｒ　Ｇ変異株がみつかった。この単離物のう
ちの３つを、ｐｙｒ　４〜５、ｐｙｒ４−７、ｐｙｒ４
−８と命名し、トランスフォーメーション実験のために
選択した。

Ｂ、Δ、アワモリ　（Ａ　、　ａｖｔａｍｏｒｌ）及び
Ｔ、レエセイ（Ｔ　、ｒｅｅＳｅｉ　）のｐｙｒ栄養要
求性株のトランスフォーメーンヨン Δ　アワモリ（Ａ　、　ａｗａｍｏｒｉ　）及び′■゛
、レエセイ（Ｔ　、　ｒｅｅｓｅｉ　）の栄養要求株を
Δ、ニトゥランス（Δ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）に対して
、以前に述べた操作を修正してトランスフォーマントた
。およそ１×１０８ケの胞子を、２％グルコース、０．
５％イーストイイノトラクトに１ｍｇ／ｍβのウリジン
を補ったイースト・イノストラクト・グルコース（ＹＥ
Ｇ）培地にイノキュレートした。その培養を３７℃ンエ
ーカー中で（２０Ｏｒｐｍ　）　１２−ＬＬ　５時間行
った（Ｔ、レエセイ（Ｔ　、　ｒｅｅｓｅｉ　）は３０
℃で行った）。遠心により、ジャームリンクを収穫し、
滅菌したＹＥＣ培地で１度洗った。その後、滅菌した２
　０　Ｑｍβプラスデックビン（Ｎ、Ｙ、コーニング、
コーニング社製）中で、０．６ＭＫＣｌ。

０．５％ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）　２３４　（
デンマーク、ノボ工業（Ｎｏｖａ　！ｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ　）　）　、０．５％Ｍｇ５Ｏａ　　・７Ｉ］２０．
０．０５％仔牛修生アルフミンを含む５０％ＹＥＧ培地
を用い、３０℃でインキクベートした。１５０ｒｐｍの
カクハンを３０分間行った後、そのプロトプラスト・づ
スペンジョンをさらに１時間上記のようにインキュベー
トし、０．６ＭＫＣβで湿らせた滅菌済ミラクロス（カ
リフォルニア、ラジョラ（ＬａＪｏｌｌａ　）　、カル
バイオ・ケム・ベーリング社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　
Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ）製）で濾過した。濾過した
プロトプラストを遠心し、洗浄して、先に述べた各プラ
スミドｐＧＲＧ１−４でトランスフオームした。Ａ、ア
ワモリ（Δ、　ａｖ＋ａｍｏｒｉ　　）のトランスフォ
ーメーンヨンには次の修正を行った。

１、、　０．６　Ｍ　ＫＣ，ｉ！の代りに０．７ＭＫＣ
Ｒを用いた。

２、トランスフォーメーション及び再生培地全浸透圧的
に安定化するため０，６ＭＫＣβの代りに１．２Ｍソル
ビトールを用いた。

ＣＡ、ア’７モリ（Δ、　ａｗａｍｏｒｉ　　）及びＴ
、レエセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ）　　トランスフォー
マントの解析Ａ、　　７ワモリ（Δ、ａｌＩ＋ａｍｏｒ
ｉ　）及びＴ、レエセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ　）のト
ランスフォーマント双方とも、培養培地中にキモシンポ
リペプチドを分泌した。これは、特異的キモシン抗体と
反応するキモシン・ポリペプチド及び酵素的に活性なキ
モシンということに対して、培養濾液を分析することに
よって決定した（結果は示していない）（ウェスタン・
イムノブロッティング技術及びエンザイム・イムノ・ア
ッセイ）。

実施例　８ アスペルギラス（Δｓｐｅｒｇ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ　）種
のａｒｇ　Ｂ栄養要求変異株からの異種ポリペプチドの
発現と分泌。

アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種のａｒｇ
　Ｂ栄養要求株からの異種ポリペプチドの発現と分泌も
行った。

この実施例は、Ａ、ニドゥランス（Δ　旧ｄｕｌａｎｓ
）由来のａｒｇ　Ｂ遺伝子と、プラスミドｐ　Ｇ　ＲＧ
　１−、−４の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を含むベクターによる、Δ、ニドゥランス（Δ。

ｎ１ｄｕｌａｎｓ）及びΔ　アワモリ（Ａ．　ａ＋・）
ａｍｏｒｉ　）のａｒｇ　Ｂ栄養要求株の相補製トラン
スフォーメーンヨンについて述べている。ａｒｇ　Ｂ遺
伝子は、オルニチン・トランス力ルハミラーセー（ＯＴ
Ｃ）をコードしている。

ここで用いた遺伝子マーカー、ｂｉ八へ　ａｒｇ　Ｂ２
　、ｍｅｔＧ　１を含むΔ　ニドゥランス（Δ、　ｎ１
ｄｕｌａｎｓ）のａｒｇ　Ｂ栄養要求株は、ボーランド
、ワルンヤワ、アル・ウジヤス゛ドウスキー（Ａ．ｌ、
　１１　ｊａｓｄｏｖ７ｓｋ　ｉ　ｅ　）４００−４７
８、ワルシャワ大学遺伝学科、Ｐ。

ウニグレンスキー（Ｐ、　Ｗｅｇｌｅｎｓｋｉ　）博士
から人手したものである。Δ、アワモリ（Ａ．ａν＋ａ
ｍｏｒｉ　　）ａｒｇ　Ｂ変異株は次のように誘導した
。

Ａ、７スペルギラス・アワモリ（Δｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓａｗａｍｏｒｉ　）のａｒｇ　Ｂ栄養要求変異株の弔
離Δ、アワモリ　（Δ、　ａｖ＋ａｍｏｒｉ　　）のし
ＪＶＫ　１４３株の胞子の新鮮なサスペンションを調製
し、９５％の胞子が死滅するのに十分な露光時間以外は
、先に述べたものと同様にＵＶ突然変異を行った。

それから胞子を遠心し、滅菌水で洗って、２５ｍβの滅
菌した最小培地に再懸濁した。これらのサスペンション
を激しく曝気しながら３７℃ンエーカでインキ、ベート
した。このような条件下で野性型の胞子は出芽し、栄養
増殖マイセリアへと成育していくが、栄養要求株はそう
はならない。培地を３日間、６から８時間毎に滅菌した
ミラクロスで無菌的に濾過した。この段階で、はとんど
の野生型マイセリアを除き、一方出芽しない栄養要求株
はミラクロス・フィルターを通過する（フィルタレーン
ヨン・エンリッチメント）。各濾過ステップにおいて濾
過した胞子を遠心し、新鮮な最小培地に再懸濁した。３
８間の濃縮ののぢ、胞子を希釈し、５０ｍ１Ｖ４のシト
ルリンを補った最小寒天培地にブレーティングした。そ
のプレートを３７℃で２〜３１１間インキュベートした
。個々のコロニーをこれらのプレートからつまようじで
２つのスクリーニング・プレートに移した。１つのプレ
ートは１．ＯｍＭのオルニチンを含む最小寒天培地で、
他方は５［］ｍＭントルリンを含む最小寒天培地である
。これらのスクリーニングプレー１・にコＤニーを移す
のは次のような原理による。ＯＴＣ（ａｒｇ　Ｂ遺伝子
産物）はアルギニン生合成経路の中でオルニチンのシト
ルリンへの変換を触媒する。

このように、ａｒｇ　Ｂ変異株（ＯＴＣを欠いている）
はシトルリンを添加した最小培地では生育するが、オル
ニチンを添加した最小培地では生育できない。

この方法によって、およそ４０００個のコロニーをスク
リーニングして、１５個のａｒｇ　Ｂ変異株を得た。Δ
、アワモリ（Ａ　、　ａｗａｍｏｒｉ　）　ａｒｇ　Ｂ
　３と命名した１つの株は最小培地では全く生育を示さ
ないが、アルギニン又はシトルリンを添加した最小培地
ではよく生育する。○ＴＣ活性レベルを決定する検定（
５７）は、ａｒｇＢ３変異株は、野生株より少なくとも
３０倍も少ない○ＴＣ活性を生産することを示した。こ
れらのデータに従って、Δ、アワモリ（Δ、　ａｗａｍ
ｏｒｉ　）　ａｒｇ　Ｂ　３株をトランスフォーメーシ
ョン実験のために選択した。

Ｂ、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）種の
トランスフォーメーションのための、ａｒｇＢに基づく
プロキモシン発現ベクターの構築 この構築において（図１５参照）、最初のステップは、
トランスフォーメーション促進配列ＡＮＳ−１と選択可
能なａｒｇ　Ｂ遺伝子を同じプラスミド上で結合するこ
とである。これを行うために、Ａ　ニトウランス〈Δ、
　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）由来のａｒｇ　Ｂ遺伝子を含むプ
ラスタ）ｐＢＢ１１６　（５９）をＰＳｔＩとＢａｍ　
ＨＩで消化し、ａｒｇ　Ｂ構造遺伝子を含む、目的とす
るフラグメントΔを単離した。プラスミドｐＤＪＢ２　
（５９）をＢＣＯＲ１とＰｓｔ　１で消化し、ΔＮＳ−
１配列を含む、目的のフラグメントＢを単離した。フラ
グメント△とＢを、プラスミドベクターＰＵＣ１８（３
３）の大きい方のＥｃｏＲ１−Ｂａｍ　ＨＩフラグメン
トを含むフラグメントＣと結合し、三つの部分が連結し
ているプラスミドｐΔＲＧ−ＤＪＢを作った。

この構築の第２ステツプとして、Ｃ１ａ　Ｉ部位を含む
合成りＮＡポリリンカーをｐΔＲＧ−ＤＪＢ中に挿入し
、種々のプロキモシン発現ユニットを含むＣ１ａ　Ｉフ
ラグメントの挿入を可能にした。プラスミドｐＡＲ（、
ＤＪＢをＢａｍＨＩで消化し、さらにバクテリア・アル
カリ・ホスファターゼで脱リン酸した。指示された合成
りＮＡポリリンカーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化し、切断したｐ　Ａ　ＲＧ　−、−Ｄ　Ｊ　Ｂ
と連結してｐｃＪｌ、６１−を生成した。このプラス−
、ｌ−を［Ｉａ　ｒの消化に対して耐性であると分った
ので、まず、Ｃｌａ　Ｉ　Ｋｇ位のメチル化を防ぐため
に、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）のｄａｍ−変異株ＧＭ
４８をトランスフオームするのに用いた。０Ｍ４８）ラ
ンスフォーマン）・からのプラスミドの単離してうまく
口ａ１て切断し、ノ＼クチリア・アルカリ・ホスファタ
ーゼで脱リン酸した。

この構築の最終ステップでは、Ｃｌａ　Ｉで切断したｐ
ｃＪ１６Ｌベクターを、プラスミドｐｃＲｃ１〜ｐＧＲ
Ｇ４からの各（’：１ａ　　Ｉプロキモンン発現フラグ
メントと結合した。生じた４つのブラスミ１−８ｐＣＪ
：：ＧＲ，Ｇ１〜ｐＣＪ：　：ＧＲＧ４を原栄養株に対
し、Ａ、二Ｆウランス（Δ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）及びΔ
、アワモリ（Δ、ａｖ＋ａｍｏｒｉ　）のａｒｇ　Ｂ変
異株をトランスフオームするのに用いた。生じたトラン
スフォーマントをプロキモシンポリペプチトの発現に対
し分析した。

Ｃ９Ａ．ニドゥランス（Ａ　、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）
及び△。

アワモリ（Δ　ａｗａｍｏｒｉ　　）のトランスフォー
マントの分析 ｐＣＪ　・　・ＧＲＧ　１〜ｐＣＪ　：　　：ＧＲＧ４
でトランスフオームしたΔ、アワモリ（Ａ、ａｗａｍａ
ｒｉ　　）及びΔ、ニトウランス（Ａ　、　ｎ１ｄｕｌ
ａｎｓ　）から分泌したキモシンポリペプチドをミルク
凝固検定及びエンザイト・イム／“ｒツセイ及びウェス
タン・イム／フロラティング技術により検出した。各々
の場合（結果は示していない）、トランスフオームした
菌類は、培養培地中に生物学的に活性のあるキモシンを
分泌した。

実施例　９ Ａ、ニドウラｙス（Ａ　、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）からの
、フミコラ・グリセア（ｌｌｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓ
ｅａ　）のグルコアミラーゼの発現と分泌 菌類フミコラ・グリセア（ｆｌｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉ
ｓｅａ　）から、グルコアミラーゼ遺伝子を単離し、タ
ローン化した。それから、この遺伝子をａｒｇ　Ｂ発現
プラスミドｐｃＪ１６ｒ−に連結した。生成したベクタ
ー、ｐＣＪ：Ｒ８ＨＩ及びｐＣＪ：Ｒ３Ｈ２を、フミコ
ラ・グリセア（ｌｌｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ　）
のグルコアミラーゼを発現、分泌させるべく、ａｒｇＢ
欠失Ａ．ニトゥランス（Δ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　　（
実施例８）をトランスフオームするのに用いた。

Ａ．フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓ
ｅａ　）のグルコアミラーゼ遺伝子の単離とクローニン
グ。

１、　７ミコラψグリセア□Ｉｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉ
ｓｅａ　）のグルコアミラーゼの！’＋’ｒ製 正しいＨ，グリセア（Ｈ，ｇｒｉｓｅａ）　　（ザーモ
イデ７　（ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）の変化物・ＮＲＲＬ
　１．５２１９）のグルコアミラーゼをΔ、Ｅ、スティ
リー社（Δ、　Ｅ、　５ｔａｌｅｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ）
から人手した。その酵素を、４．６ｍｍＸ　２５０ｍｍ
のジンクロムパック（ＳｙｎｃｈｒｏｍＰａｋ　）　Ｃ
４逆相カラムでのクロマトグラフィーにより、同質なも
のに精製した。最初、カラムを０．０５％トリエチルア
ミン及び０．０５％トリフルオロ酢酸（溶液Δ）で０．
５ｍβ／ｍｉｎの流速で平衡化した。グルコアミラーゼ
試料注入後、カラムを溶液Δで２分間洗い、それから、
毎分５％の溶液Ｂの勾配を４０％溶媒Ｂになるまで流し
た。その後、勾配を分当り０．５％の溶媒Ｂとなるよう
に変え、グルコアミラーゼはおよそ５５％溶媒Ｂのとき
に流出してきた。この時点で、グルコアミラーゼは、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって均一であ
ると判定された。

２、Ｈ，グリセア（Ｊ−ｆ、　ｇｒｉｓｅａ　）のグル
コアミラーゼのアミノ酸配列 精製したＨ　、グリセア（Ｈ，ｇｒｉｓｅ　）のグルコ
アミラーゼのアミノ末端配列を先に述べた方法で得たく
６０）。配列は、次のようである。

八人ＶＤＴＦＩＮＴＥＫＰＳＡＸＮＳＬここに示した、
これら及び他の文字によるペプチド配列は、各文字が次
のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味している。

アミノ酸　　　　３文字記弓・　　１文字記号さらに付
加的アミノ酸配列決定を行うた必のペプチドフラグメン
トを得るために、精製したクルコアミラーセ（１ｍｇ／
ｍβ）を、１０８℃で２時間、２％酢酸により消化した
。その物質を直接、上記のように平衡化したジンクロム
バク’）　（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ−ｐａｋ）Ｃ４カラム（
４，８ｍｍＸ　１００ｍｍ）に注入した。１００％溶媒
Δ（上記参照）で２分間洗った後、そのペプチドを溶媒
Ｃの直線勾配で流出したく毎分１％）。溶媒Ｃは、プロ
パツール中、０．０５％トリエチルアミンと０．０５％
トリフルオロ酢酸を含んでいるものである。この時点で
、三つのペプチドをさらに解析する為に選んだ。ひとつ
のペプチド（ＣＡ３）は直接配列決定した。他の２つの
ペプチド（ＧＡＩとＣＡ２）の混合物は次のように４．
、８ｍｍｘ　２５０ｍｍのジンクロムバク（Ｓｙｎｃｈ
−ｒｏｍｐａｋ　）　Ｃ４カラムでさらに精製した。Ｇ
ＡｌとＣＡ２の混合物を３倍容の溶媒Δで希釈し、カラ
ムに注入した。２分間洗浄した後、そのペプチドを溶媒
りの直線勾配で流出した（毎分０５％）。

溶媒りは３５％プロパノ−ルー６５％アセトニトリル中
に０．０５％トリエチルアミン、００５％トリフルオロ
酢酸を含むものである。分離したＧＡｌとＣＡ２は再び
同様な方法で精製され、−Ｌ述に従ってアミノ酸の配列
決定がなされた。ペプチドＧΔ１、ＣＡ２、ＣＡ３の配
列は、次のとおりである。

ＧＡＩ　　　ＰＩ、ｌＮ５ＩＴＶＰＩＫＡＴＧＸＡＶＯ
ＹＫＹＩＫＶＸＱＬＧＡ２　　　ＡＡＶＲＰＬＩＮＰＥ
ＫＰＩＡＷＮＸＬＫ八ＮＩＧＰＮＧ八３　　１ＮＴＩＥ
ＫへＩＡＷＮＫＬへＡＮＩＧＰＮＧＫＡＡＰＧＡＡＡＧ
ＶＶＩ八５ＰＳＲＴＤ３、　合成オリゴヌクレオチドプ
ローブＨ，グリセア（ト１０ｇｒｉｓｃａ）のクルコア
　ミラーゼ遺伝子をコードするゲノ１．　Ｄ　Ｎ　Ａは
、次のようにクローン化した。４８ケのオリゴヌクレオ
チドの合成混合物を、グルコアミラーゼ遺伝子を検出す
るハイブリダイゼーション・プローブとして用いた。オ
リゴヌクレオチドの長さは１７塩基（１７量体）で、Ｈ
，グリセア（Ｈ、ｇｒｉｓｅａ　）のグルコアミラーゼ
由来の６ケのアミノ酸〈上記、Ｇ△１ペプチドのアンダ
ーラインの個所）の配列に対応している。

Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ｌｌｅ　Ｌｙｓ５　
　’　ＣＡＡ　　ＴＡＴ　へＡへ　ＴＡＴ　　ＡＴＴ　
　ＡＡ　　　３　　’ＣＧＣＣ ４８ケのオリゴヌクレオチドの混合物は６ケのブールで
、その各々が８ケの異なる合成１７量体を含むよう合成
した。

ブール１　：　５　′ＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴ
ＡＡ　３　′　　ＣＧ ブール 　　ＣＧ ブー／しへ人　：　５　　′ＣＡ八ＴへＴへＡＡＴＡＴ
ＡＴＣＡＡ　　３　　’　　ＣＧ ブール 　　ＣＧ ブール へへへ　Ｇ ブール 　　ＣＧ オリゴヌクレオチドは、製造業者により指定された試薬
と方法に従い、バイオザーチ社製自動ＤＮＡ合成機（Ｃ
Ａ，ザン・ラフアニル、パイオサ−チ社）。

４゜正しいオリゴヌクレオチド・プローブの選択１−（
、グリセア（ｉ−１、ｇｒｉｓｅａ　）由来のゲノｌ、
　Ｄ　ＮＡを、サウザーン法により（３０）、グルコ“
ｒミラーゼ配列の存否について分析した。手短かに、１
−ｉ　、グリセア（Ｈ，ｇｒｉｓｅａ）　ＤＮＡをＢａ
ｍ　ＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。この消化
したＩ）　ＮＡの６画分（各プローブ・プール当り１ケ
）を、１％アガローズ・ゲル電気泳動により、サイズ別
に分画した。先に述べた方法で、そのＤＮＡをニトロセ
ルロースにプロッティングしたあと、そのＤ　Ｎ　Ａは
、８０’ｊで真空オーブン中、ニトロセルロース−Ｌに
固定した。そのフィルターを、Ｒａｍ　ｌ（Ｉ消化ＤＮ
Ａの６画分に従って６片に切り、各小片を１８時開、合
成オリゴヌクレ引チトプローブのプールの１つと低塩濃
度で）＼イブリダイズさせた（２．４０）。（そのプロ
ーブは、以前に述べたように、ガンマ（３２ｐｌΔＴＰ
とＴ４ポリヌクレオチドキナ−士を用いて放射性ラベル
しである。）ハイブリダイゼーション後、そのフィルク
ーを２ｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳを用い、３７℃で１５
分間洗い、さらに同温度で２ＸＳＳＣを用いて２度洗っ
た。フィルターを空気乾燥し、ザランラップで包み、そ
して、コダック（Ｋｏｄａｋ　）のＸ　Ｏｍａｔ−ＡＲ
Ｘ線フィルムにかけて、オートラジオグラフ像を得た。

オートラジオグラフの現像後、３．７ｋｂのＢａｍ　Ｈ
Ｔフラグメントに対応するかすかなハンドが、プール３
でハイブリダイズした小片に見ることができた。

ハイブリダイゼーション・シグナルを改善するために、
８ケの個々のオリゴヌクレオチドとして、プール３を再
合成した。８ケの各オリゴヌクレオチドをプローブとし
て、ザウザーン・ハイブリダイゼーション実験をくり返
した。それらの１７量体プローフのうぢの１つがＨ，グ
リセア（ＨｇｒｉＳｅａ）のゲノムＤＮ△の３．７　ｋ
ｂＢａｍ　ＨＩフラグメントとハイブリダイズすること
が分った。そのオリゴヌクレオチドの配夕ＩＪＩま５′
Ｃ八ＧＴＡＣ八八ＧＴＡＴＡＴＣ八八である。この１７
量体はＨ、グリセア（Ｉｔ、　ｇｒ　１ｓｅａ）のクル
コアミラーセ遺伝子のクローニングのためのハイブリダ
イゼーション・プローブとして用いブこ。

５グルコアミラ一ゼ遺伝子配列のクローニング１−（、
グリセア（ｌ（、ｇＴｉｓｅａ　）のゲノムＤＮΔをＢ
ａｍ　）−ｉ　Ｉで消化し、標準法（３０）従ってポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動によりサイズ別に分画し
た。２から／４ｋｂまでの大きさのＤＮＡフラグメント
を切り出しケ“ルから流出させた。このＤＮＡ画分を大
腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）クローニング・ベクターｐＢ
Ｒ３２２（ΔＲＣＣ３７０１７）中にクローン・ライブ
ラリーを作るのに用いた。そのクローニング・ベクター
をＢａｎ　ｔ（Ｉで消化し、バクテリア・アルカリ・ホ
スファターゼで脱リン酸化した。そのホスファターゼを
フェノール−クロロホルム（］　：　ｌｖ／ｖ　）で抽
出し除去した。Ｂａｍ　）ｉ　Ｔで切断し、大きさの決
ったＩ（、グリセア（Ｈ。

ｇｒｉｓｅａ）　ＤＮＡを、Ｂａｍ　ＨＩで切断し、脱
リン酸化したｐＢＲ３２２に連結した。このように連結
したＤＮＡを、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）　　（４
１）の方法により調製した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　２
９４　（ΔＴＣＣ３１４４６）のコンペテント細胞をト
ランスフオームするのに用いた。トランスフォーマント
を５０量ｇ／ｍｊ！の濃度でカルベネシリンを含むＬ　
Ｂ寒天プレー）　（３０）で選択した。グルコアミラー
セ遺伝子配列をもつトランスフォーマントは、プローブ
として特異的１７量体く」−述）を使うことにより、コ
ロニー・ハイブリダイゼーション法（３０）により同定
した。ハイブリダイズしたコロニーは精製され、その各
々から、アルカリ−８ＤＳミニスクリ一ン操作（３０）
によってプラスミドを単離した。このようにして選び出
されたブラスミｌ＝は、全て、グルコアミラーゼ特異的
１７量体プローブにハイブリダイズする３、７ｋｂのＢ
ａｍＨＩフラグメントを含んでいた。ｐ　ＲＳ　Ｈ１と
命名したその１つのプラスミドが次の解析のだ約に選ば
れた。

ｐＲ８）（Ｉからの６００ｂｐの５ａｎ３Ａフラグメン
トをハタラジオファージＭ１３ｍｐ（３３）にサブクロ
ーンし、部分的にグイデオキン・ヂエーン・ターミネー
ション法により配列決定を行って、そのクローン化した
ＤＮＡが、グルコアミラーゼ遺伝子をコードしているこ
とを確かめた。ｐＲ８Ｈｌ中に含まれる３、７ｋｂのＢ
ａｍ　ｆ−ｉ　１７ラクメントの制限エントヌクレアー
セ切断地図を図１６に示した。ｐＢＲ’３２２中、既知
の制限部位に対するＤＮΔフラグメントの配向に、１ケ
所及び２ケ所の制限消化が生ずる（４４）。我々が得た
ＤＮＡの配列データと、制限地図に基つき、り゛ルコア
ミラーゼ遺伝子の全コード配列が、ｐ　ＲＳ　Ｈｌ中の
３．７ｋｂのＢａｍ　ｌ−１１フラグメント内に含まれ
る確率が高いことが分った。

Ｂ　フミコラ・グリセア（１−１ｕｍｉｃｏｌａ、　ｇ
ｒｉｓｅａ　）のグルコアミラーゼ遺伝子を含むａｒｇ
　Ｂベクターの構築 ｐ　ＲＳ　Ｈ１からの３．７ｋｂ　　ｆｌａｍ　ＨＩフ
ラグメントを、選択可能な、Δ、ニドゥランス（△。

ｎ１ｄｕｌａｎｓ＞由来のａｒｇ　Ｂ遺伝子を含むｐｃ
Ｊｌ、６■−中にクローン化した（面配向を含んで）（
図１７）。生じたベクター、ｐｃＪｉＲ３ｌ（１及びｐ
ＣＪ　１Ｒ３Ｈ２をａｒｇ欠失Δ、ニトゥランス（Ａ．
ｎ１ｃｌｕｌａｎｓ）をトランスフオームするのに用い
た。

ＣＨ，グリセア（１−１，ｇｒｉｓｅａ　）のグルコア
ミラーセの発現と分泌 原栄養トランスフォーマントを精製し、単一の炭素源と
してデンプンを含んだ最小培地にイノキュレートした（
この培地は、ｐ＋＋を５０に調整したこと以外は、キモ
ンンの生産の際に述べたものと同一のものである）。培
養濾液について、Ｉ−１，グリセア（ｆ（、ｇｒｉｓｃ
ａ　）のグルコアミラーセ活性の検定を行った。図１８
は、ｐｃＪｊＲ８Ｈ１でトランスフオームしたΔ、ニド
ウランス（Δ。

ｎ１ｔｌｕｌａｎｓ　）によるＩ」　グリセア（Ｈ、ｇ
ｒｉｓｅａ　）のクルコアミラーセの細胞外生産を示し
ている。ネガティブ・コントロールとしては、トランス
フオームしていないａｒｇ　Ｂ欠失Δ、ニドウランス（
Ａ．ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）を用いた。

先に特に好ましい具体例を記述したが、本発明がそれに
制限されるものではないことは理解されよう。この分野
に精通した人に七っては、公開された具体例に対して、
種々の修正がなされるであろうし、そのような修正が本
発明の範囲を逸脱するものではないことは明らかであろ
う。

次の文献目録中にまとめられ、そして各々、先のテキス
ト中にカッコ付数字で示した参照資料を参考のため組み
入れた。

文　　　献　　　口　　　録 １、　ヒッッｘマン（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ）　、Ｒ，Ａ
９等、１９８４年゛′組込みＤＮＡ産物″中、インンユ
リンーインターフェロンー成長ホルモン、ゴーデル（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ）、Ｄ、１１．等、１９７９年、ネーチャ
ー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２８１巻５　／１．４．−５
４８頁２、ハイネス（ｌｌａｙｎｅｓ）　、Ｊ、等、１
９８３年核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、）　１１巻、６８７−７０６頁ペニカ（Ｐｅｎｎｉ
ｃａ）、　Ｄ、　　等、１９８３年、ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　　３０１巻、２＋、４．−２２１頁３、　
　ｏ　−７（Ｌａｗｎ）、　Ｒ，等、１９８１年核酸研
究（Ｎｕｃｌ、八ｃｉｃｌｓ　Ｒｅｓ、）　９巻、６１
０３−旧１４頁４、　ウッド（Ｗｏｏｄ）、　Ｊ　１等
、１９８４年、ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、　３１
２巻３３０−３３７頁５　ヘイネッカ−（ｌｌｅｙｎｅ
ｋｅｒ）　、　Ｈ，Ｌ、　　等、ヨーｐツバ特許局出版
００９２１８２号、　１．９８３年１年月０月２刊行６
、トウイテ（Ｔｕｉｔｅ）、　Ｍ、　Ｆ、　　等、　１
９８２年エンボージャーナル（ＥＭＢＯ・Ｊ、）１巻、
６０３〜６０８頁 ７、　メラー（Ｍｅｔｅｏｒ）、　Ｊｏ等、１９８２年
ジーン（Ｇｅｎｅ）　２４巻、１−１４頁 ８．　　シｚ東ｒ７（Ｓ＋ｂａｋｎｖ）、Ｍ、、等１９
８３年、ＦＩＥＭＳ　　ミクロハイオル　レフ−（Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ）　　１７巻８１−８５頁 ９、　ウ、　ルス（Ｗｅｌｔｓ）、　、１．Ａ．２等、
１９８２年　核研究（Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅ５）
　　１　］］巻、７９１１頁　０バーｊ−イ（［ｌａｔ
、ｙ）、Ｄ、　、等、１．９８１年、ジー７　（Ｇｅｎ
ｅ）　、　１６巻、７９−８７頁］　１シバ、：］７　
（Ｓ＋ｂａｋｏｖ　）　０Ｍ、　、等　１９８４年゛バ
チルスの遺伝学とハイオテクノロジーパＡＴ、ガネサ７
　（Ｇａｎｅｓａｎ　）　、　、Ｊ　、　Ａ　、ホック
（Ｈｏｃｋ）　、　絢ニューヨーク、アカデミツク・プ
レス版 １２、エデンス（ｔＥｄｅｎｓ　）　、　Ｌ、　、等、
１９８４年ヨーロッパ特許局出版物［ＥＰＯ１２９２６
８Ａ２号１３、　７−スド７　（Ｍａｒｓｔｏｎ　）　
、　Ｆ、　Ａ、　０．　。

等　１９８４年、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ　−ｔｅ
ｃｈｎｏｌ、）　　２巻、８００−８０４頁１４、　７
　オルト７７　（Ｆｏｌｔｍａｎ　）　、　Ｂ、　、等
。

１９７９年、生化学雑誌（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　）
　。

２５４巻、８４４７−８４５６頁 １５、ハイエンガ（Ｈａ、ｙｅｎｇａ　）　、　Ｋ　、
　Ｊ　、　、等。

１９８４年、ヨーロッパ特許出願　ＢＰＯ１１４５０７
１６、ケース（Ｃａｓｅ）　、　Ｍ、　Ｅ、　、等、１
９７９年、プロシーディソゲ　オブ　ナショナル、アカ
テ゛ミー、ザイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、　）。

米国、７６巻、５２５９−５２６３頁 ランボうィツ（Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ　）　、米国特許第
４、、４．８６．５３３号 １７、　　キンセー（Ｋｉｎｓｅｙ）、　Ｊ、Ａ．、と
Ｊ、　Ａ、ランボセク（Ｒａｍｂｏｓｅｋ）　１．９８
４年、゛分子及び細胞生物学”　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　４巻
、Ｉｌ’ｌ−１２２頁 １８、イニルドア　（Ｙｅｌｔｏｎ　）　、　Ｍ、　、
等、１９８４年。

プロシーディング　オブ　ナショナル・アカデミ−・ザ
イエ７７．　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　　）米国、８１巻、１４７０−１４７４頁。

ムラ＝　−（Ｍｕｌｌ、ａｎｅｙ）　、　Ｅ、Ｊ、、等
、１９８５年。

゛分子及び一般遺伝学”　（Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ
ｔ、　）１９９巻、３７−４５頁 １９、　　ジ：、　７　（Ｊｏｈｎ）　、　Ｍ、　Ａ、
及びＪ、Ｆ、ペバーデ、Ｉ　−（Ｐｅｂｅｒｄｙ　）　
、　　１９８４年、エンザイム　マイクロバイオロジー
技術、　　（ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ、ｔｅｃｈｎｏ
ｌ、　　）　６巻、　３８６−３８９頁２０、　　チル
ハーフ　（Ｔｉｌｂｕｒｎ　）等、１９８２．ジーｙ　
（Ｇｅｎｅ）　２６巻、２０５〜２２１頁２１、　　バ
ランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ）　、　Ｄ、Ｊ、、　　等、
　１９８３年バイオケム・バイオフイズ、リサーチ・コ
ミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　　）１１２巻、２８４〜２８９頁 ２２、ケリー（Ｋｅｌｌｙ　）　、　Ｊ　、　Ｍ　、及
びＭ、ハイネス（ｌｌｙｎｅｓ　）　１９８５年、ＥＭ
Ｂｏ、４巻。

４７５〜４７９頁 ２３、　　プル（ＢＬＩＩＩ）　、　Ｊ、　Ｈ，、、及
Ｊ、Ｃ，ウートン（Ｗｏｏｔｏｎ）　１９８４年、ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３１　Ｑ巻、７０１−７
０４頁２４、バークレー　（Ｂａｒｃｌａｙ　）　、　
Ｓ　、　Ｌ　　及びＥメラー（Ｍｅｌｌｅｒ）　１９８
３年１分子及び細胞生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎ
ｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、　３巻、
２１．１７−２１３０頁 ２５、インボリア（Ｉｎｇｏｌｉａ　）　、　Ｐ、　Ｌ
、　、等。

１９８４年、２８頁 ＡＳＭ会議、微生物の遺伝学及び分子生物工業（Ｇｅｎ
ｅｔ、ａｎｄ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏ、　ｌｎｄ、　Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　）　。

（要約） ２６、　　アレクトポーロス（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ
　）、　ｃ、　Ｊ、　。

１９６２年、インダクトリー、マイコロジー（Ｉｎｄｕ
ｃｔｏｒｙ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ　）　二、：Ｌ　−ヨー
ク、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　
Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、Ｉｎｃ、　） ２７、　　インニス（Ｉｎｎｉｓ　）　、　Ｍ、　Ａ、
等、　１９８５年。

サイＩ　ンｘ　（Ｓｃ＋ｅｎｃｅ　）　、　２２８巻、
２１−２６頁２８、へ／チラ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ）　、
　Ｍ、　Ｅ、　、等。

１９８４年１分子及び一般遺伝学（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　）　、　１９４巻、４９４−４９９頁２
９、　　’ｙユニーーカー（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ　　）
　、　　Ｓ　、　　Ｐ　。

等、１９８４年、ヨーロッパ特許出願 ＥＰＯ１３７２８０Δ１ ３０、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、　Ｔ、等、
　１９８２年。

分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　）　、　ニューヨーク、コールド・スプリンタ・ハ
ーノ＼−・コールド・スプリング・ノ飄−ノ＼−出版（
Ｃｏｌｄ。

Ｓｐｒｉｎｇ、　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）３１、　
　フレア（Ｃｒｅａ）　、　Ｒ，等、１９７８年、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）米
国、７５巻、５７６５−５７６９頁 ３２、　　ブクストン（Ｂｕｘｔｏｎ）　、　Ｆ　　及
びラッドフォード（Ｒａｄｆｏｒｄ　）Ａ．、、１．９
８３年７分子及び一般遺伝学（Ｎｌａｌ、　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｔ、＞　１９０巻。

４０３−１０５頁 ３３、　　ヤニッシューペラン（ＹａｎｉＳｃｈ　−Ｐ
ｅｒｒｏｎ）　。

Ｃ１，ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）　、　Ｊ、　、及びメ
シング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、　Ｊ　、　１９８５年
、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　３３年、１０３−１１９頁
３４、　　クラクーブック（Ｃ１ｕｔｔｅｒｂｕｃｋ　
）　、　Ｊ、ｔｌ、。

１９７４年、遺伝学ノーンドブツク（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）中”　７　スヘルキ５　ス
・ニトウランス（Δｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｎ１ｃｌ
ｕｌａｎｓ）　、キング（Ｋｉｎｇ）　、　Ｒ，Ｃ，＄
Ｌ　Ｐ４４７−５１０ニユーヨーク、プレナム出版５ ３５、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）　、　Ｈ，等、１９７
９年。

プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　人ｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、　）米国、７６巻、４３５０−４３５４頁 ３６、　　ウチャマ（ｉｉｃｈｉｙａｍａ）　、　Ｈ，
、等、　１９８１年。

生化学雑誌（Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　、　９０巻
、４８３〜４３７頁 ３７　ソコル（Ｓｏｋｏｌ　）　、　Ｐ　　Δ、１等、
　１．９７９年。

パ臨床及び微生物雑誌”　（Ｊ、　ＣＩｉｎｏＭｉｃｒ
Ｃｌｌｎｏ、）９巻、５３８−５４０頁 ３８　ポロク（Ｐｏｌｌｏｃｋ　）　、　Ｍ、　Ｒ，、
１９６１年゛一般微生物学雑誌”　（、Ｊ、　Ｇｅｎ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２６巻、２３９−２５３頁 ３９、ナンハーグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ　）　、　Ｊ　、　
Ｈ，、等。

１９８４年１分子細胞生物学（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉａｓ、　　）　４巻、２３０６−２３１５頁４０、
アゾルーｙン（Ａｄｅｌｌｍａｎ）　、　Ｊ　、　Ｐｌ
ｌ等。

１９８３年、ＤＮＡ、２巻、１８３−１．９３頁４１、
モリ７　：／　（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）　、　Ｄ、　Ａ、
　、　１９７９年。

メソッド・イン・エンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＥ
ｎｚｙｍｏｌ　）　６８巻、３２６−３３１頁４２、　
　メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　、　Ｊ、　、　１９
８３年。

メソッド・イン・エンザイモロジ−（ＭｅｔｈｏｄｓＢ
ｎｚｙｍｏｌ　）　１０１巻、２０−７８頁４３、サン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）　、　Ｆ、　、等、１９７７年、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカテ゛ミー・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ。

３ｃｉ、　）米国、７４巻、５４６３−５４６７頁４４
、ポリバー　（Ｂｏｌｉｖａｒ　）　、　Ｆ　、　、等
１９７７年、ジー７　（Ｇｅｎｅ）　、　２巻、９５−
１１３頁４５、ポリバー　（Ｂｏｌｉｖａｒ　）　、　
Ｓ、　、　１９７８年。

ジーｙ　（Ｇｅｎｅ）　、　４巻、１２１１３６頁４６
、’７レイス（Ｗａｌｌａｃｅ　）　、　Ｒ，Ｂ、　、
等。

１９８１年、核酸研究（Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅ５
）　　９巻。

３６４７−３６５６頁 ４７、ナンバーグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ　）　、　Ｊ　、　
Ｈ，、等。

１９８４年１国際特許出版物ＷＯ３４１０２０９２１号
。

４８、ボニル（Ｂｏｅｒ）　、　Ｅ、　、等、１９８４
年。

ＥＭＢ○　ジャーナル、３巻、　１５８１−１５８５頁
４９、　　ヨーロッパ特許局出版物、０１１６７７８号
、１９８４年、８月２９日刊行。

５０、　　ヒッツェマン（旧ｔｚｅｍａｎ）　、　Ｒ，
Ａ、　、等。

１９８３年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　’）　、　
　２１９巻、６２０−６２５頁 ５１、　　ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）　、　Ｒ
、Δ、１等。

１９８３年、核酸研究（Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
、＞　１１巻、２７４５１７６３頁 ５２、　　ヒッツ１　”’；’ン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）
　、　Ｒ，Ａ、　。

１９８０年、生物化学雑誌（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　）　。

２５５巻、１２０７３頁 ５３、　　ヒラ７　ｘ　７７　（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　）
　、　Ｒ、Δ、９等。

１９８２年、核酸研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、）　１０巻、７７９１−７８０８頁 ５４、　　ベック（Ｂｅｃｈ）　、Δ９Ｍ、、及びフォ
ルト７７　（Ｆｏｌｔｍａｎ　）　、　Ｂ、　、　　１
９８１年、ネス・ミルク・ディリー・ジャーナル（Ｎｅ
ｔｈ、　ＭｉｌｋＤａｉｒｙ　Ｊ、　）　、　３５巻、
２７５１８０頁５５、　７　、？　／ｌ／ドア７　（Ｆ
ｏｌｔｍａｎｎ）　、　Ｂ、　、及びぺ′デルセフ　（
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）　、　Ｖ、　Ｂ、　、　　１９７７
年。

ニューヨーク・プレナム出版、Ｊ、タング（Ｔａｎｇ）
　＋Ｎｉ１ｔ、　　”酸プロテアーゼ”Ｐ３−２２゜５
６、　　ボーク（Ｂｏｅｋｅ　）　、　Ｊ　、　Ｄ、　
、等、　１．９８４年。

分子及び一般遺伝学（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ
、）　。

１９７巻、３４５−３４６頁 ５７　ハザベ（ｔ３ａｓａｂｅ）　、　Ｊ　、Ｒ，、等
、　１．９７９年。

アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）　　９４巻、３５６−３６０頁５８、　
　ハース（Ｂｅｒｓｅ　）　、　Ｂ、　、等、１９８３
年。

ジー７　（Ｇｅｎｅ）　２５巻、１０９−１１７頁５９
、　　バー）　ンス（Ｂａｌａｎｃｅ　）　、　Ｄ、　
Ｊ　、　、等。

１９８５年、ジーン（Ｇｅｎｅ）　３６巻、３２１−３
３１頁 ６０．０ツドリグｘス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　）　、　
Ｈ，、等。

１９８４年、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ
．ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　　１３４巻、５３Ｌ−
５４７頁 ６１、　　ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｒｌ）　、　
　Ｉ　、　Ｉ−、、等。

１９８５年、ＥＭＢＯジャーナル、４巻。

１、３０７−１３１１頁

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＧａｌ及びｐＧａ５にアスペルギラス・ニガ
ー（Δｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）のグルコア
ミラーゼを挿入した制限地図である。 第２図はｐＤ　Ｊ　Ｂ　−ｇａｍ　−］の構成を示す。 第３図はｍｌ）１９ＧＡＰＲの構成を示す。 第４．５．６及び７図はｐＧＲＧｌ、ｐＧＲＧ２、ｐＧ
ＲＧ３及びｐＧＲＧ４の構成を示す。 第８図はＩＬＩ）１９ＧＡＰＲからｍｐ　１９ＧＡＰＲ
△Ｃ１〜Ｃ４を発生させるために用いた戦略を示す。 第９図はｐｃＲ１６０の構成を示す。 第１０図は５′及び３′７−７７キング（ｆ　Ｉａｎｋ
ｉｎｇ）配列を含むムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　
ｍ１ｅｈｅｉ　）カルボキシル・プロテアーゼ遺伝子の
部分的な制限地図である。 第１１図Δ、Ｂ及びＣは完全なコード配列及び５′及び
３′フランキング配列を含むムコール・ミｘヘイ（Ｍｕ
ｃｏｒ　ｍｊｅｈｅｉ　）カルボキシル◆プロテアーゼ
のＤＮＡ配列である。 第１２図はｐＭｅＪＢ−７の構成を示す。 第１３図へ及びＢは部分的なヌクレオチド及びＡＮＳ−
１の制限地図である。 第１４図はｐＤＪＢ−３の構成を示す。 第１５図はプラスミドｐＣＪ：ＧＲＧＩ〜ｐＣＪ：ＧＲ
Ｇ４の構成を示す。 第１６図はｐＲ３Ｈ１からの３．７　ｋｂ　　Ｒａｍ　
ＨＩフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ***地図で
ある。 第１７図はｐＣＪ：Ｒ３ＨＩ及びｐＣＪ：Ｒ３Ｈ２の構
成を示す。 第１８図はＡ．ニドゥランス（Δ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ
）からのＨ、グリセア（）（、ｇｒｉｓｅａ　）グルコ
アミラーゼの発現を示す。 八ＬＯ ・ｈ 発、 ）鉢 へ −←　　づ＜　　　ＬＤｏ　　　ｔ−ｔ←　　Ｏくｃｆ
−Ｉ　　　　　（Ｄ←　　　　Ｐ−１←　　　　２口〇
　　　　−〇＞〇　　−υ　　慴＜　　　−ｔ−ｓ＜　
　　ｃｔ。 １←　　　　　口υ　　　　Ｉｌｊ←　　　　０（鈎○
なＥ　　諾ゴ　　２ｇ　　に８　おご 幻○　　■←　　鈎Ｏ−Ｏ飄← ｘＯぶＨト一く　　　　幻←　　　　＋Ｃ＞υＥ−１Ω
バー　　　　−ト　　　　メ０　　　−０１’）Ｃ１ｓ
−＋ｏ　　　　　ス←　　　　唖ト　　　　コ←々〉　
　巳試　；呂　　ｔ８　二じ 幻〇　　　　　−ｃ）ｃｌ：○　　　　コロ　　　　０
０工ご　　：試　　：〉　　二じ　公に 二と　　フ巳　　！５　旨　巳

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で、繊
   維状菌類中で発現することができ、かつ該異種ポリペプ
   チドの分泌をうながすことができるＤＮＡ配列。
2. （２）異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及びそ
   れと機能的に結合するシグナル配列を含有する、繊維状
   菌類にトランスフォームするためのベクターで、該シグ
   ナル配列が該繊維状カビの分泌系で機能的であるベクタ
   ー。
3. （３）上記シグナル配列が上記異種ポリペプチドに対し
   て天然のものである特許請求の範囲第２項記載のベクタ
   ー。
4. （４）上記天然のシグナル配列及び上記ヘテロ配列が（
   イ）仔牛のプリプロキモシン、（ロ）ムコール・ミエヘ
   イ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）のプリプロカルボキシ
   ル・プロテアーゼ及び（ハ）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
   ｒ）のプリプログルコアミラーゼ、をコードするＤＮＡ
   配列からなるグループから選択したものである特許請求
   の範囲第３項記載のベクター。
5. （５）上記シグナル配列が上記異種ポリペプチドに対し
   、外来のものである特許請求の範囲第２項記載のベクタ
   ー。
6. （６）上記外来のシグナル配列が、（イ）仔牛のプリプ
   ロキモシン、（ロ）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグ
   ルコアミラーゼ、及び（ハ）ムコール・ミエヘイ（Ｍｕ
   ｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）のカルボキシル・プロテアーゼ
   、のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含むグルー
   プから選択したものである特許請求の範囲第５項記載の
   ベクター。
7. （７）前記シグナル配列をコードする前記ＤＮＡ配列に
   機能的に結合する転写及び翻訳制御配列を含む前記繊維
   状菌類により機能的に認識されるプロモーター配列をコ
   ードするＤＮＡ配列をさらに含む特許請求の範囲第２項
   記載のベクター。
8. （８）上記プロモーター配列をコードする上記ＤＮＡ配
   列が、（イ）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコア
   ミラーゼ及びムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅ
   ｈｅｉ）のカルボキシル・プロテアーゼのプロモーター
   配列をコードするＤＮＡ配列からなるグループから選択
   したものである特許請求の範囲第７項記載のベクター。
9. （９）前記異種ポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ配
   列に機能的に結合した、機能性ポリアデニレーション配
   列をコードするＤＮＡ配列をさらに含む特許請求の範囲
   第２項記載のベクター。
10. （１０）上記ポリアデニレーション配列が、Ａ．ニガー
    （Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ又はムコール・
    ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）のプロテアーゼ
    のポリアデニレーション配列をコードするＤＮＡ配列か
    らなるグループから選択したものである特許請求の範囲
    第９項記載のベクター。
11. （１１）前記繊維状菌類中で発現可能な分泌特性をコー
    ドするＤＮＡ配列をさらに含む特許請求の範囲第２項記
    載のベクター。
12. （１２）上記分泌特性が、（イ）Ｎ．クラーサ・ピル４
    （Ｎ．ｃｒａｓｓａ　ｐｙｒ４）（ロ）Ａ．ニドゥラン
    ス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、（ハ
    ）Ａ．ニドゥランス・アルグＢ（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
    　ａｒｇＢ）及び（ニ）Ａ．ニドゥランス・トリプＣ（
    Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ　ｔｒｐＣ）をコードするＤＮＡ
    配列からなるグループから選択したものである特許請求
    の範囲第１１項記載のベクター。
13. （１３）前記繊維状菌類中への前記ベクターのトランス
    フォーメーション効率を増加させ得るＤＮＡ配列をさら
    に含む特許請求の範囲第２項記載のベクター。
14. （１４）菌類へのトランスフォーメーション効率の増加
    のための上記ＤＮＡ配列がＡＮＳ−１である特許請求の
    範囲第１３項記載のベクター。
15. （１５）前記の分泌される異種ポリペプチドが酵素であ
    る特許請求の範囲第２項記載のベクター。
16. （１６）上記酵素が（イ）キモシン、（ロ）プロキモシ
    ン、（ハ）プリプロキモシン、（ニ）Ａ．ニガー（Ａ．
    ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、（ホ）フミコーラ・
    グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ）のグルコ
    アミラーゼ、及び（ヘ）ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏ
    ｒ　ｍｉｅｈｅｉ）のカルボキシル・プロテアーゼから
    なるグループから選択したものである特許請求の範囲第
    １５項記載のベクター。
17. （１７）前記の分泌される異種ポリペプチドがホ乳類の
    ポリペプチドである特許請求の範囲第２項記載のベクタ
    ー。
18. （１８）前記の分泌される異種ポリペプチドが生化学的
    に活性をもつものである特許請求の範囲第２項記載のベ
    クター。
19. （１９）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含む
    繊維状菌類。
20. （２０）異種ポリペプチドを発現及び分泌することがで
    きる繊維状菌類。
21. （２１）上記繊維状菌類が（イ）アスペルジラス（Ａｓ
    ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、（ロ）トリコデルマ（Ｔｒｉ
    ｃｈｏｄｅｒｍａ）種、及び（ハ）ムコール（Ｍｕｃｏ
    ｒ）種を含むグループから選択したものである特許請求
    の範囲第２０項記載の繊維状菌類。
22. （２２）上記繊維状菌類がＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉ
    ｄｕｌａｎｓ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）
    、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）種である特許請求の範囲
    第２０項の繊維状菌類。
23. （２３）上記異種ポリペプチドが、（イ）キモシン、（
    ロ）プロキモシン、（ハ）プリプロキモシン、（ニ）Ａ
    ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、（ホ
    ）フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅ
    ａ）のグルコアミラーゼ、及び（ヘ）ムコール・ミエヘ
    イ（Ｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）のカルボキシル・プロ
    テアーゼからなるグループから選択した酵素である特許
    請求の範囲第２０項記載の繊維状菌類。
24. （２４）上記の分泌する異種ポリペプチドがホ乳類のポ
    リペプチドである特許請求の範囲第２０項記載の繊維状
    菌類。
25. （２５）（イ）異種ポリペプチドを発現し、該繊維状菌
    類から該異種ポリペプチドの分泌をうながすことができ
    るＤＮＡ配列を含むベクターを繊維状菌類にトランスフ
    ォームすること、及び（ロ）該異種ポリペプチドを発現
    及び分泌すること、を含む異種ポリペプチドの製造方法
    。