FI122029B - Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö - Google Patents
Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö Download PDFInfo
- Publication number
- FI122029B FI122029B FI20086253A FI20086253A FI122029B FI 122029 B FI122029 B FI 122029B FI 20086253 A FI20086253 A FI 20086253A FI 20086253 A FI20086253 A FI 20086253A FI 122029 B FI122029 B FI 122029B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- dsm
- identity
- seq
- cel45a
- endoglucanase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuottoja käyttö
Keksinnön ala Tämä keksintö koskee uudenlaisia sieniperäisiä endoglukanaaseja, niiden tuottamista sekä keinoja niiden tuottamiseksi. Tämä keksintö koskee li-5 säksi entsyymivalmisteita, jotka käsittävät vähintään yhtä uudenlaista endoglu-kanaasia, sekä menetelmiä selluloosapitoisen materiaalin käsittelemiseksi näillä entsyymivalmisteilla. Tämä keksintö koskee vielä lisäksi näitä endoglukanaaseja käsittäviä pesuainekoostumuksia ja eläinrehua.
Keksinnön tausta 10 Sellulaasit kuuluvat teollisuudessa kaikkein laajimmin käytettäviin entsyymeihin. Niitä käytetään yleisesti tekstiiliteollisuudessa, pesuaineteolli-suudessa, sellu-ja paperiteollisuudessa, rehu-ja ruokateollisuudessa, esimerkiksi leivonnassa, sekä lignoselluloosapitoisen materiaalin käsittelyssä esimerkiksi bioetanolin tuotantoa varten jne. Sellulaasikoostumusten luonne vaikeut-15 taa sellulaasien tarkoituksenmukaista käyttöä, koska nämä koostumukset ovat usein entsyymiseoksia, joilla on useita erilaisia aktiivisuuksia ja substraattis-pesifisyyksiä. Tästä syystä on yritetty aikaansaada sellulaaseja, joilla on ainoastaan halutut aktiivisuudet. Kunkin sellulaasin ainutlaatuiset ominaisuudet tekevät joistakin niistä sopivampia tiettyihin tarkoituksiin kuin muista sellulaaseis-20 ta.
Kankaan käsittelyssä sellulaasit hyökkäävät puuvillasäikeitä muodostavien selluloosamolekyylien ketjuihin ja vaikuttavat siten kankaan ominaisuuksiin.
Tekstiiliteollisuudessa ’’kivipesty” tai kulunut ulkonäkö on ollut vii-25 me vuosina farmarikankaiden valmistajien kiinnostuksen kohteena. Perinteinen
O
kivipesu hohkakivillä heikentää kankaan lujuutta ja rasittaa pesulaitteita. Suun-o taus on ollut kohti entsymaattisia farmarikankaan pintakäsittelyprosesseja, ja $2 sellulaasit ovat korvanneet hohkakivet tai niitä käytetään yhdessä hohkakivien * kanssa antamaan kankaalle sen halutun ’’kuluneen” ulkonäön. Kontrolloidut
CL
30 entsyymikäsittelyt aiheuttavat vähemmän vaurioita vaatekappaleille ja koneille sekä poistavat kivien hävittämistarpeen.
CD
§ Tekstiiliteollisuus käyttää sellulaaseja lisäksi biologiseen pintakä- oj sittelyyn, so. nyppyjen poiston tuottaman pysyvän parannuksen aikaansaami seen, sekä nyppyyntymiskestävyyden parantamiseen, pintarakenteen kirkas-35 tamiseen vähentyneen nukkaisuuden kautta, tekstiilien käsittelyn kuten peh- 2 meyden, sileyden ja silkkimäisen tunnun parantamiseen, tekstiilin laskeutu-vuuden ja kirkkaampien värien parantamiseen sekä kosteuden imukyvyn parantamiseen.
Sellulaasit käsittävät katalyyttisen domeenin tai ytimen (CD), joka 5 ilmentää sellulaasiaktiivisuutta. Sellulaasimolekyyli voi käsittää katalyyttisen domeenin lisäksi yhden tai useamman selluloosaa sitovan domeenin (CBD:t), joita kutsutaan myös hiilihydraatteja sitoviksi domeeneiksi tai moduuleiksi (CBD/CBM), jotka voivat sijaita katalyyttisen domeenin joko N- tai C-päässä. CBD:illä on hiilihydraatteja sitovaa aktiivisuutta, ja ne helpottavat entsymaattis-10 ta toimintaa kiinteillä substraateilla. Katalyyttinen ydin ja CBD ovat tyypillisesti toisiinsa yhdistettyjä joustavan ja erittäin glykosyloidun linkkerialueen kautta.
Sellulaasit, jotka hyökkäävät ensisijassa säikeen pintaan, ovat erityisen käyttökelpoisia indigovärillä värjätyn farmarikankaan kivipesussa, koska väri on säikeen pinnalla. Farmarikankaan käsittelyyn käytetyt sellulaasit jae-15 taan yleensä kahteen pääluokkaan: happamat ja neutraalit sellulaasit. Happamat sellulaasit toimivat tyypillisesti pH-välillä 4,0-5,5 ja neutraalit sellulaasit pH-välillä 6-8. Happamia sellulaaseja käytetään erityisesti biologisessa pintakäsittelyssä (nyppyjen poistossa) sekä lisäksi farmarikankaan käsittelyssä (biologisessa kivipesussa), kun taas neutraaleja sellulaaseja käytetään tyypillisesti 20 farmarikangassovellutuksissa.
Endoglukanaasit (EG:t) ovat yksi sellulaasien kolmesta tyypistä, joita tarvitaan yleisesti selluloosan biologiseen konvertoimiseen glukoosiksi. Joillakin luonnossa esiintyvillä endoglukanaaseilla on selluloosaa sitova do-meeni (CBD), kun taas toisilla sitä ei ole. Endoglukanaaseja käytetään laajasti 25 tekstiili-, pesuaine-, bioetanoli- sekä sellu- ja paperiteollisuudessa.
Sellulaasit, endoglukanaasit mukaan luettuina, voidaan luokitella 5 primaarisekvenssinsä mukaisesti ja joidenkin perheenjäsenten kolmiulotteisen ^ rakenneanalyysin tukemana useisiin glykosyylihydrolaasiperheisiin (Henrissat ^ 1991, Henrissat ja Bairoch 1993, 1996). Esimerkiksi glykosyylihydrolaasiper- ^ 30 heet 5, 7, 12 ja 45 sisältävät endoglukanaaseja. Useimmat happamista tekstii- | lisellulaaseista kuuluvat perheeseen 5, kun taas useimmat neutraaleista tekstii- oo lisellulaaseista kuuluvat perheeseen 12 tai 45.
LO
^ Endoglukanaasien teollisten käyttöjen laaja kirjo on luonut tarpeen o kaupallisille endoglukanaasituotteille, joilla on haluttu toimintakyky halutuissa ^ 35 olosuhteissa kuten halutuilla pH- ja lämpötilaväleillä.
3
Suurin osa teollisesti käytettävistä entsyymeistä toimii paremmin kohotetuissa lämpötiloissa, tavallisesti noin >50 °C:n lämpötiloissa, mutta energiansäästösyistä, paremman värinpysyvyyden ja vaatekappaleiden kutistumisen vähentämisen vuoksi on tarvetta entsyymeille, joilla on hyvä toiminta-5 kyky alemmissa lämpötilatasoissa, so. <50 °C:n lämpötiloissa, esimerkiksi noin 30-40 °C:ssa tai jopa 20-40 °C:ssa. Tällaisia kylmäaktiivisia entsyymejä on kuvattu esimerkiksi bakteereissa, erityisesti Bacilluksella. Bakteeriperäisten entsyymien tuottaminen teollisiin sovellutuksiin on kuitenkin monimutkaista ja työlästä verrattuna sieniperäisten entsyymien tuottamiseen. Mahdollisista kyl-10 mäaktiivisista sieniperäisistä endoglukanaaseista on silti yhä hyvin vähän tietoja.
Tietääksemme yhtään perheen 45 kylmässä toimivaa endogluka-naasia ei ole tähän mennessä kuvattu.
Cel45-perheen endoglukanaasi esitetään US-patentissa 15 5 610 129, joka kuvaa värin siirtymistä estävät koostumukset, jotka sisältävät
Humicola insolensin kD43-sellulaasia. Sen lämpötilaominaisuuksia ei esitetä.
Gibberella zeae -lajin Cel45-entsyymejä ei ole ehdotettu tekstiilien pintakäsittelyssä käytettäviksi.
US 7 256 032 kuvaa Cel45-sellulaasit, joilla on hyvä toimintakyky 20 tekstiilien pintakäsittelyssä. Farmarikankaan pintakäsittelyssä toimintakyky on optimaalinen 60 °C:ssa, ja matalin mitattu lämpötila on 40 °C, jossa on vähemmän kuin 50 % optimaalisesta aktiivisuudesta.
Patenttijulkaisu US2005/070003 kuvaa sellulaasivalmisteet, jotka toimivat hyvin esimerkiksi pyykinpesukoostumuksissa, äskettäin valmistettujen 25 tekstiilien biologisessa pintakäsittelyssä sekä kuluneen ulkonäön tuottamisessa selluloosapitoiselle kankaalle. Mikään kuvatuista entsymeistä ei osoita edul- 5 lista toimintakykyä matalissa lämpötiloissa.
(M
^ Siten on olemassa jatkuvaa tarvetta uusille ja edullisille endoglu- ^ kanaaseille, joilla on halutut ominaisuudet ja lämpötilaprofiilit. Esillä oleva 30 keksintö täyttää tämän tarpeen.
CC
Keksinnön lyhyt kuvaus
CO
K Esillä oleva keksintö tarjoaa nyt käyttöön uudenlaisia cel45-perheen o endoglukanaaseja, joilla on ainutlaatuinen lämpötilaprofiili, jota osoittaa hyvä o ^ toimintakyky myös matalissa lämpötiloissa. Ainutlaatuiset lämpötilaominaisuu- 35 det tarkoittavat, että mitään huomattavaa toimintakyvyn alenemista ei havaita, kun lämpötila on alle 50 °C, esimerkiksi noin 40 °C, noin 30 °C tai noin 20 °C.
4
Endoglukanaasit ovat käyttökelpoisia erilaisissa sellulaasien sovellutuksissa kuten kankaan käsittelyssä, erityisesti farmari kankaan käsittelyssä ja nyppyjen poistossa. Toisin kuin aiemmin kuvatut nyppyjä poistavat entsyymit, jotka yleensä ovat happamia sellulaaseja, uudenlaiset endoglukanaasit toimivat hy-5 vin myös suhteellisen neutraalissa pH:ssa. Tämä mahdollistaa biologisen pintakäsittelyn samanaikaisesti värjäyksen kanssa, mikä johtaa huomattaviin säästöihin. Lisäksi värinkesto on usein parempaa neutraaleissa olosuhteissa.
Esillä oleva keksintö tarjoaa käyttöön sieniperäisen endoglu-kanaasipolypeptidin, joka kuuluu glykosyylihydrolaasiperheeseen 45 ja joka 10 osoittaa huomattavaa toimintakykyä matalissa lämpötiloissa. Tämä keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön entsyymivalmisteen, joka käsittää mainittua endoglu-kanaasia, sekä mainittua entsyymiä tai entsyymivalmistetta käsittävät pesu-ainekoostumukset ja eläinrehun.
Tämä keksintö koskee esityisesti endoglukanaaseja, jotka käsittä-15 vät aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 65-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 13, vähintään 48-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 15, vähintään 87-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 17, vähintään 62-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 19, vähintään 59-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 21 tai vähin-20 tään 49-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 23 kanssa, tai niiden entsymaattista fragmenttia.
Tämä keksintö koskee lisäksi eristettyä polynukleotidia, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu seuraavista: a) nukleotidisekvenssi, jolla on sekvenssin nro 12, 14, 16, 18, 20 25 tai 22 mukainen sekvenssi tai edellä kuvattua endoglukanaasipolypeptidiä koodaava sekvenssi, 5 b) kohdan a) juosteelle komplementaarinen juoste; tai
(M
^ c) sekvenssi, joka on geneettisen koodin suhteen degeneroitunut ° minkä tahansa kohdan a) tai b) mukaisesta sekvenssistä.
00 30 Tämä keksintö koskee lisäksi mainitun polynukleotidin käsittävää £ ekspressiovektoria, mainitun ekspressiovektorin käsittävää isäntäsolua sekä E.
co coli -kantaa, jolla on tunnusnumero DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, <§ DSM 18915, DSM 18917 tai DSM 19170.
o Tämä keksintö tarjoaa vielä lisäksi käyttöön menetelmän endoglu- ^ 35 kanaasipolypeptidin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa isäntäsolu transformoidaan mainittua polypeptidiä koodaavalla ekspressiovek- 5 torilla ja mainittua isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun polypeptidin ilmentämisen, ja mainittu polypeptidi otetaan mahdollisesti talteen ja puhdistetaan.
Lopuksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön prosessin selluloosapitoi-5 sen materiaalin käsittelemiseksi, jolloin mainittu prosessi käsittää selluloosapi-toisen materiaalin saattamisen kosketukseen tämän keksinnön mukaisen en-doglukanaasipolypeptidin tai entsyymivalmisteen kanssa.
Tämän keksinnön spesifiset suoritusmuodot esitetään alisteisissa patenttivaatimuksissa. Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, yksityiskohdat 10 ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavista piirustuksista, yksityiskohtaisesta selityksestä ja esimerkeistä. On kuitenkin ymmärrettävä, että kuvauksessa, piirustuksissa ja esimerkeissä annetut suoritusmuodot ovat ainoastaan havainnollistavia tarkoituksia varten ja että erilaiset muutokset ja modifikaatiot ovat patenttivaatimusten suojapiirissä mahdollisia.
15 Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on kaavamainen piirros Trichoderma reesei -protoplastien transformaatiossa käytetyistä ekspressiokaseteista Cel45-rekombinanttiprote-iinien ylituottamista varten.
Kuvio 2A esittää Cel45A-rekombinanttiproteiinivalmisteiden pH-20 optimeja, ja kuva 2B esittää Cel45A-rekombinanttiproteiinivalmisteiden lämpö-tilakestävyyttä.
Kuvio 3 esittää uudenlaisten Cel45-valmisteiden lämpötilaprofiileja farmarikankaan käsittelyssä kaupallisiin Cel45-valmisteisiin verrattuina.
Kuvio 4 esittää uudenlaisten Cel45-valmisteiden toimintakykyä 25 farmarikankaan käsittelyssä eri pH-arvoissa.
^ Kuvio 5 esittää Gp_RF6293_Cel45:n toimintakykyä biologisessa ^ pintakäsittelyssä (nukanpoisto) 40 °C:ssa kontrollinäytteeseen verrattuna, jos- in 9 sa ei ole entsyymiä.
00 x Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
CL
30 Tämä keksintö perustuu tutkimuksiin, joissa sieniviljelmäkokoelmas- ^ ta seulottiin selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta. Sienikanto-
CD
g ja viljeltiin 20 °C:ssa 3-7 päivää erilaisia tuottoalustoja käyttäen. Supernatantit ° otettiin talteen ja selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta testattiin karboksimetyyli- selluloosaa (CMC) ja hydroksietyyliselluloosaa (HEC) vastaan 30 °C ja 50 °C:n 35 lämpötiloissa matalien lämpötilaprofiilien seulomiseksi. Suotuisimpia kantoja 6 testattiin edelleen pienimittaisissa biologisen kivipesun sovellutuksissa 4-7 päivän 20 °C:ssa viljelemisen jälkeen. Alustavan seulonnan jälkeen neljä kantaa valittiin genomisten kirjastojen rakentamiseen ja kirjastoja seulottiin edelleen ce/45-geenien suhteen koettimilla, jotka oli monistettu degeneroituneilla 5 alukkeilla. Positiiviset faagikloonit subkloonattiin bakteerivektoreihin ja varmistettiin sekvensoimalla ennen DSMZ:ään tallettamista. Cel45-entsyymien tuottamiseksi haluttuja aktiivisuuksia koodaavat geenit fuusioitiin Trichoderma ree-sein cbh1/cel7A-promoottoriin. Transkription lopetus varmistettiin T. reesein cbh1/cel7A-terminaattorilla, ja amdS-markkeria käytettiin positiivisten kloonien 10 seulontaan. Vektori rungosta eristettiin lineaariset ekspressiokasetit ja ne transformoitiin T. reesei -protoplasteihin, joiden tärkeimmät sellulaasit oli poistettu. Puhdistettuja transformantteja viljeltiin 7 päivää sellulaaseja indusoivassa ela-tusaineessa ja endoglukanaasiaktiivisuus testattiin viljelmän supernatantista. Myös lämpötila-ja pH-ominaisuudet testattiin. Materiaali suurimittaiseen sovel-15 lutukseen saatiin 28 °C:n laboratoriobioreaktoriviljelmistä, jotka kestivät 3-4 päivää, minkä jälkeen materiaali suodatettiin ja väkevöitiin tarvittaessa.
Viljelmien supernatantit testattiin farmarikangaskäsittelyssä pesukoneessa eri lämpötiloissa kahta kaupallista Cel45-valmistetta referensseinä käyttäen. Saatu biologisen kivipesun vaikutus arvioitiin värin reflektanssimitta-20 uksella. Yllättäen havaittiin, että sovellutuksessa mitatut lämpötilaprofiilit olivat erilaisia kuin ensimmäisessä karakterisoinnissa koeputkissa saadut lämpötila-profiilit. Farmarikangassovellutuksessa testattiin myös näytteiden pH-ominai-suudet. Lisäksi testattiin puuvillalankaisen fleece-kankaan nyppyjen/nukan poistoa pesukoneessa entsyymien eri annoksilla ja tätä verrattiin aikaisemman 25 tekniikan näytteeseen. Yllättävästi matalassa lämpötilassa saatiin nukaton pinta pienempää annosta käyttämällä kuin mitä voitiin odottaa farmarikangaskäsit-5 telyn kokeiden perusteella.
CM
^ Esillä oleva keksintö tarjoaa käyttöön uudenlaiset sieniperäiset gly- ^ kosyylihydrolaasiperheen 45 endoglukanaasipolypeptidit, joilla on olennainen 30 toimintakyky matalissa lämpötiloissa. Tässä julkaisussa käytettyinä polypeptidi | ja proteiini ovat synonyymejä.
co Tässä yhteydessä ’’sieniperäinen” tarkoittaa, että endoglukanaasi tai
LO
^ sitä koodaava pölynukleotidi voi olla peräisin sienestä ja erityisesti rihmasienes- o tä, kuten suvusta Trichoderma, Hypocrea, Penicillium, Geomyces tai Fusari- ™ 35 um. Tämän keksinnön spesifisen suoritusmuodon mukaisesti endoglukanaasi on peräisin lajista G. pannorum tai F. cf equiseti, edullisimmin kannasta G.
7 pannorum RF 6293 (CBS 119567), F. cf. equiseti RF6318 (CBS 119568), G. pannorum RF6546 (CBS 119958) tai G. pannorum RF6608 (CBS 119962).
Mikrobilähteen yhteydessä käsite ’’peräisin jostakin” tarkoittaa, että mainittu spesifinen mikrobilähde voi luonnossa esiintyessään tuottaa polypep-5 tidiä tai että polypeptidiä koodaava polynukleotidi voidaan eristää mainitusta mikrobilähteestä ja mahdollisesti ilmentää isäntäsolussa, johon mainitusta mik-robilähteestä peräisin oleva polypeptidiä koodaava polynukleotidi tai sen synteettinen versio, jossa mahdollisesti käytetään vaihtoehtoisia kodoneja, on lisätty. Tämä ei kuitenkaan sulje pois sekvenssin vähäisiä modifikaatioita esi-10 merkiksi yhden tai muutaman aminohapon tai nukleotidin substituutiolla, delee-tiolla ja/tai insertiolla niin kauan kuin koodatun ja eritetyn proteiinin entsymaat-tinen aktiivisuus säilyy.
Esillä olevan keksinnön yhteydessä ’’endoglukanaasi” (”EG”) tarkoittaa entsyymejä, jotka luokitellaan luokkaan E.C. 3.2.1.4. Ne ovat 1,4-beeta-15 D-glukaani-4-glukanohydrolaaseja ja katalysoivat 1,4-beeta-D-glykosidisidos-ten endohydrolyysiä glukoosipolymeereissä kuten selluloosassa. Jotkin endo-glukanaasit voivat lisäksi hydrolysoida esimerkiksi 1,4-sidoksia beeta-D-glu-kaaneissa, jotka sisältävät myös 1,3-sidoksia. Ne voidaan sen vuoksi luokitella endo-1,3(4)-beetaglukanaaseiksi (E.C. 3.2.1.6). Entsyymi voi siten katalysoida 20 monien substraattien reaktioita ja kuulua moniin luokkiin. Tämän keksinnön mukaiset endoglukanaasit voivat mahdollisesti sisältää signaalisekvenssin sekä yhden tai useamman selluloosaa sitovan domeenin (CBD:n), joka on katalyyttiseen domeeniin tai ytimeen (CD) yhdistynyt.
’’Glykosyylihydrolaasiperhe 45” tarkoittaa glykosyylihydrolaasiper-25 hettä kuten se on määritelty julkaisuissa Henrissat, 1991, ja Henrissat ja Bai-roch, 1993, 1996, joihin tässä viitataan. Perheen 45 sellulaasia koodaavaa o geeniä kutsutaan nimellä cel45 ja koodattua proteiinia kutsutaan nimellä
CM
uS Cel45.
° Tämän keksinnön mukaiset endoglukanaasit osoittavat olennaista 30 toimintakykyä matalassa lämpötilassa. Tässä yhteydessä ’’olennainen toimin- | takyky” tarkoittaa, että entsyymit osoittavat erinomaista toimintakykyä, kun niitä co käytetään vähintään yhden tyyppisessä sellulaasin sovellusprosessissa, ku in ten esimerkiksi tekstiilien biologisessa kivipesussa ja/tai tekstiilien biologisessa o pintakäsittelyssä tai pesussa. Uudenlaisten endoglukanaasien ainutlaatuisia 0X1 35 lämpötilaprofiileja voidaan havainnollistaa niiden ”30:50-suhteella” farmarikan- gassovellutuksessa, joka suhde osoittaa suhteellista toimintakykyä (%) 8 30 °C:ssa 50 °C:seen verrattuna. Edullisesti 30:50-suhde on vähintään 72 %, edullisemmin vähintään 80 % ja edullisimmin vähintään 90 % tai 95 %. Lämpö-tilaprofiilia voidaan vaihtoehtoisesti havainnollistaa ”40:OT-suhteella”, joka tarkoittaa suhteellista toimintakykyä (%) 40 °C:ssa optimaaliseen lämpötilaan ver-5 rattuna. Edullisesti 40:OT-suhde on vähintään 80 %, edullisemmin vähintään 90 % ja edullisimmin vähintään 95 %.
Tässä julkaisussa käytettynä käsite ’’kylmäaktiivinen” tai ’’matala lämpötila” tarkoittaa lämpötilaa, joka on <50 °C, erityisesti <45 °C, edullisesti <40 °C, esimerkiksi <30 °C.
10 Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti endoglu- kanaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 65-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 13, vähintään 48-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 15, vähintään 87-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 17, vähintään 62-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvens-15 sin nro 19, vähintään 59-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 21 tai vähintään 49-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 23 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin. Edullisesti endoglukanaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 90-prosenttinen, edullisesti vähintään 95-prosenttinen ja edullisimmin vähintään 98-prosenttinen tai 99-20 prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 13, 15, 17, 19, 21 tai 23 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin.
Esillä olevassa yhteydessä käytettynä käsite ’’identtisyys” tarkoittaa kahden aminohapposekvenssin välistä globaalista identtisyyttä toisiinsa verrattuna vastaavan geenin koodaamasta ensimmäisestä aminohaposta vii-25 meiseen aminohappoon. Esillä olevan keksinnön tarkoituksiin identtisyys määritetään edullisesti tunnettujen tietokoneohjelmien avulla tavallisia algoritmeja o käyttäen. Esimerkki tällaisesta ohjelmasta on Clone Manager Suite, joka on
(M
^ ohjelma, joka sisältää ohjelmisto-osan Align Part ja jota myy Scientific & Edu- ° cational Software -yhtiö, Durham, NC, USA. Esillä olevan keksinnön mukaises- 00 30 ti identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin erityisesti ohjelmaversiota ’’Clone | Manager 7 Align Plus 5” ja sen toimintoja ’’Compare Two Sequences/Glo- oo bal/Compare DNA sequences”. Tässä tapauksessa käytettiin seuraavista läh in ^ teistä saatavia algoritmeja: Hirschberg, D.S. (1975) A linear space algorithm o for computing longest common subsequences, Commun. Assoc. Comput.
^ 35 Mach. 18: 341 - 343; Myers, E.W. ja W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space, CABIOS 4:1, 11 - 17; Chao, K-M, W.R. Pearson ja W. Miller.
9 (1992) Aligning two sequences within a specified diagonal band, CA-BIOS 8:5, 481 - 487. Alan ammattilainen tietää, että tulokset ovat vertailukelpoisia ainoastaan, jos sekvenssin toisiaan vastaavat domeenit rinnastetaan. Näin ollen esimerkiksi sellaisten sellulaasisekvenssien, jotka sisältävät CBD- tai signaa-5 lisekvenssejä, vertailu sellaisiin sekvensseihin, joissa näitä osia ei ole, on tarkoituksettomana poissuljettua.
’’Entsymaattisesti aktiivinen fragmentti” tarkoittaa tietyn aminohapposekvenssin osaa, joka on riittävän pitkä, jotta sillä olisi haluttu entsymaatti-nen aktiivisuus. Toisin sanoen fragmentti voi olla esimerkiksi vain polypeptidin 10 kypsä osa tai jopa kypsän osan alisekvenssi. Fragmentti voi sisältää tai olla sisältämättä linkkerin ja CBD-domeenin. Tarkemmin sanottuna entsymaattinen aktiivisuus tarkoittaa sellulaasiaktiivisuutta, jolla on katalyyttinen kyky hydrolysoida selluloosaa tai sen johdoksia, kuten endoglukanaasi- tai beetaglu-kanaasiaktiivisuutta. Endoglukanaasi- ja/tai beetaglukanaasiaktiivisuuden li-15 säksi joillakin sellulaaseilla voi lisäksi olla hemisellulaasi- ja/tai ksylanaasiaktii-visuutta. Entsymaattinen aktiivisuus voidaan määrittää kuten esimerkissä 1 kuvataan.
Tämän keksinnön mukaiset polynukleotidit voivat olla joko DNA:ta tai RNA:ta. Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti endoglu-20 kanaaseja koodaa polynukleotidi, jolla on sekvenssin nro 12, 14, 16, 18, 20 tai 22 mukainen sekvenssi, tai sen fragmentti, joka on riittävän pitkä koodaamaan entsymaattisesti aktiivista endoglukanaasia. Endoglukanaaseja koodaa edullisesti polynukleotidi, joka on samanlainen kuin mikä sisältyy kantaan E. coli DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917 tai DSM 25 19170.
Tämän keksinnön mukaiset endoglukanaasit ovat edullisesti re-5 kombinanttiproteiineja. Ne valmistetaan kätevästi yleisesti tunnetulla rekombi-
C\J
^ nantti-DNA-tekniikalla heterologisessa tai homologisessa isännässä. Edullisesti^ ti endoglukanaasi yliekspressoidaan sieni-isännässä. Lyhyesti kerrottuna en- 30 doglukanaasia koodaava polynukleotidi kloonataan ja lisätään ekspressiovek-£ toriin, transformoidaan isäntäsoluun ja ilmennetään.
co ’’Ekspressiovektori” on kloonausplasmidi tai vektori, joka kykenee
LO
ilmentämään endoglukanaasiproteiineja koodaavaa DNA:ta sen jälkeen, kun o ekspressiovektori on transformoitu haluttuun isäntään. Kun käytetään sieni- ^ 35 isäntää, kiinnostava geeni viedään sieni-isäntään edullisesti osana kloonaus- tai ekspressiokuljetinta, joka integroituu sienen kromosomiin tai sallii kiinnosta- 10 van geenin integroitua isännän kromosomiin. Integraatioprosessin aikana myös muita kloonaus- tai ekspressiokuljettimen osana olevia sekvenssejä voi integroitua yhdessä mainitun DNA:n kanssa. Ekspressiovektori tai sen osat voidaan lisäksi kohdistaa ennaltamäärättyihin lokuksiin sienissä. Haluttu geeni 5 voidaan vaihtoehtoisesti aikaansaada itsenäisesti replikoituvana plasmidina.
Endoglukanaasiproteiineja koodaava DNA sijoitetaan edullisesti vektorissa olevien tiettyjen kontrollisekvenssien kuten promoottorisekvenssien kontrollin alaiseksi (so. yhdistetään toiminnallisesti niihin). Transformaation aikana nämä kontrollisekvenssit integroituvat isäntägenomiin yhdessä kiinnosta-10 van geenin kanssa. Kontrollisekvenssit voivat vaihtoehtoisesti olla integroitu-miskohdan kontrollisekvenssejä.
Ekspressiovektorin ekspression kontrollisekvenssit vaihtelevat riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämään tiettyä geeniä prokaryootti-sessa vai eukaryoottisessa isännässä. Ekspression kontrollisekvenssit voivat 15 sisältää transkription säätelyelementtejä, kuten promoottoreita, tehostajaele-menttejä ja transkription lopetussekvenssejä, ja/tai translaation säätelyelementtejä, kuten translaation aloitus-ja lopetuskohtia.
Polynukleotidimolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan kykenevän ilmentämään polypeptidiä, jos polynukleotidimolekyyli sisältää transkription sää-20 telytiedot sisältävät ekspression kontrollisekvenssit ja tällaiset sekvenssit ovat toiminnallisesti yhdistettyjä polypeptidiä koodaavaan nukleotidisekvenssiin.
Toiminnallinen yhdistäminen on yhdistämistä, jossa sekvenssi on yhdistetty säätelevään sekvenssiin (tai sekvensseihin) sillä tavalla, että sekvenssin ilmentäminen tulee säätelevän sekvenssin vaikutuksen tai kontrollin 25 alaiseksi. Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssi yhdistettynä proteiinia koodaavan sekvenssin 5'-päähän) sanotaan olevan toimin-5 nallisesti yhdistetty, jos promoottorin toiminta johtaa transkriptioon.
(M
^ Tämän keksinnön mukaiset vektorit voivat lisäksi käsittää muita ^ toiminnallisesti yhdistettyjä sääteleviä elementtejä, kuten tehostajasekvensse- 30 jä.
| Edullisessa suoritusmuodossa rakennetaan geneettisesti stabiilit co transformantit, jolloin proteiineja koodaava DNA integroidaan isännän kro-
LO
mosomiin sellaisella vektorilla transformoimalla, joka voi sisältää sekvenssejä, o jotka edistävät mainitun vektorin integroitumista kromosomiin.
^ 35 Solut, jotka ovat integroineet endoglukanaasiproteiineja koodaa van DNA:n stabiilisti kromosomeihinsa, voidaan selektoida esimerkiksi lisätyllä 11 markkerilla (markkereina), homologisella tai heterologisella, joka mahdollistaa niiden isäntäsolujen selektoimisen, jotka sisältävät ekspressiovektorin kromosomissa; markkeri voi aikaansaada esimerkiksi resistenssin biosideille, esimerkiksi antibiooteille tai raskasmetalleille kuten kuparille, tai markkerit voi-5 vat komplementoida isäntäkromosomin auksotrofista mutaatiota jne. Selektoi-tava markkeri voi olla esimerkiksi selektiogeeni, joka on suoraan yhdistetty ilmennettäviin DNA-geenisekvensseihin tai joka on lisätty samaan soluun samanaikaisella transformaatiolla. Myös muita selektiojärjestelmiä voidaan käyttää.
10 Kun endoglukanaasia koodaavan DNA:n sisältävä ekspressiovek- tori on valmistettu, se lisätään sopivaan isäntäsoluun millä tahansa monista erilaisista alalla tunnetuista sopivista keinoista, esimerkiksi transformaatiolla. Transformaation jälkeen vastaanottajasoluja kasvatetaan yleensä sopivassa selektiivisessä elatusaineessa, jolla selektoidaan transformoituneiden solujen 15 kasvua.
Sopivia ekspressio- ja tuottoisäntäjärjestelmiä ovat esimerkiksi sieni-isännille Trichoderma (EP 244 234) tai Aspergillus, kuten A. oryzaelle tai A. nigerille (julkaisut WO 97/08325 ja WO 95/33386, US-patentti nro 5 843 745, US-patentti nro 5 770 418), kehitetty tuottojärjestelmä tai Fusa-20 riumille, kuten F. oxysporumille (Malardier et ai., 1989) tai Chrysosporium luckowenselle, kehitetty tuottojärjestelmä. Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan voidaan käyttää osittain sellulaasi- ja/tai hemisellulaasi-ja/tai proteaasipuutteellisia isäntäkantoja. Bakteereille kehitettyjä sopivia tuot-tojärjestelmiä ovat Bacillukselle, esimerkiksi B. subtilikselle, B. licheniformiksel-25 le, B. amyloliquefaciensikselle tai E. colille kehitetty tuottojärjestelmä tai sä-desienelle Streptomyces kehitetty tuottojärjestelmä. Hiivoille kehitettyjä sopivia o tuottojärjestelmiä ovat järjestelmät, jotka on kehitetty hiivoille Saccharomyces,
CM
^ Shizosaccharomyces, Pichia pastoris tai Hansenula. Lisäksi mahdollisia ovat ^ tuottojärjestelmät muissa mikrobeissa, esimerkiksi bioetanolituotantoon tarkoi- 30 tetuissa yhdistetyn prosessoinnin fermentatiivisissa mikrobeissa, tai nisäkässo-| luissa tai kasveissa.
co Kloonatun geenisekvenssin (-sekvenssien) ilmentäminen johtaa
LO
halutun proteiinin tuotantoon tai tämän proteiinin fragmentin tuotantoon. Tämä o ilmentäminen voi tapahtua transformoiduissa soluissa jatkuvalla tavalla tai ^ 35 kontrolloidulla tavalla.
12 Tämän keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden saamiseksi halutut ominaisuudet omaavia isäntiä (tämä tarkoittaa isäntiä, jotka kykenevät ilmentämään taloudellisesti järkeviä määriä endoglukanaasiproteiineja) viljellään sopivissa olosuhteissa, ja halutut entsyymit erittyvät edullisesti isännistä viljel-5 män elatusaineeseen ja otetaan mahdollisesti talteen mainitusta viljelmän ela-tusaineesta alalla tunnetuilla menetelmillä. Tällaisen tuotannon isäntä on edullisesti rihmasieni, kuten Trichoderma tai Aspergillus, ja erityisesti T. reesei.
Esillä olevassa yhteydessä käytettynä ’’entsyymivalmiste” tarkoittaa mitä tahansa entsyymituotetta, joka sisältää vähintään yhtä tässä julkai-10 sussa kuvatun uudenlaista endoglukanaasia. Tällainen entsyymivalmiste voi siten olla käytetty viljelmän elatusaine tai suodos. Käytetty viljelmän elatusaine tarkoittaa isännän viljelmän elatusainetta, joka käsittää tuotettuja entsyymejä. Edullisesti isäntäsolut erotellaan mainitusta elatusaineesta tuoton jälkeen. Tällaiset valmisteet voidaan haluttaessa kylmäkuivata tai entsymaattinen aktiivi-15 suus voidaan muuten väkevöidä ja/tai stabiloida säilytystä varten. Haluttu entsyymi voidaan tarvittaessa eristää ja puhdistaa edelleen tavanomaisten menetelmien avulla, kuten suodattamalla, uuttamalla, saostamalla, kromatografialla, affiniteettikromatografialla, elektroforeesilla tai vastaavalla.
Tämän keksinnön etuna on kuitenkin se, että viljelmän elatusainet-20 ta isäntäsolujen kanssa tai ilman niitä voidaan käyttää entsyymivalmisteena sellaisenaan ilman lisäpuhdistusta, koska endoglukanaasiproteiinit voidaan erittää viljelmän elatusaineeseen ja ne osoittavat aktiivisuutta käytetyn elatus-aineen ympäröivissä olosuhteissa. Entsyymivalmisteet ovat hyvin taloudellisia aikaansaataviksi ja käytettäviksi, koska spesifisen entsyymin puhdistaminen 25 viljelmän elatusaineesta ei ole välttämätöntä.
Yhden tai useamman endoglukanaasiproteiinin lisäksi entsyymi-o valmisteet voivat käsittää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, joita voivat olla
CM
^ esimerkiksi muut sellulaasit, amylaasit, lipaasit, proteaasit, hemisellulaasit, ksy- ^ lanaasit, pektinaasit ja/tai oksidaasit kuten lakkaasit, peroksidaasit ja katalaa- 30 sit. Ennen endoglukanaasiproteiinilla käsittelemistä tai sen aikana tai sen jäl-| keen voidaan tehdä vaihtoehtoisesti toinen entsyymikäsittely. Entsyymikäsittely co voi käsittää esimerkiksi yhden tai useamman amylaasikäsittelyn (esimerkiksi farmarikankaan liimanpoistoa varten), yhden tai useamman sellulaasikäsittelyn 00 o ja/tai yhden tai useamman peroksidaasi- ja/tai lakkaasikäsittelyn. Riippuu so- ^ 35 vellutuksesta, mitä muita entsyymejä entsyymivalmisteeseen sisällytetään tai mitä muita entsyymejä entsyymikäsittelyssä käytetään.
13
Endoglukanaasiproteiinin lisäksi entsyymivalmiste voi sisältää lisäaineita, kuten stabilointiaineita, puskureita, säilöntäaineita, pinta-aktiivisia aineita ja/tai viljelmän elatusaineen aineosia. Edullisia lisäaineita ovat sellaiset, joita käytetään yleisesti sellaisissa entsyymivalmisteissa, jotka on tarkoitettu 5 siihen sovellutukseen, johon entsyymivalmistetta käytetään.
Entsyymivalmisteet voidaan tarjota käyttöön nestemäisinä tai kiinteinä, esimerkiksi kuivattuna jauheena tai rakeina, erityisesti pölyämättöminä rakeina, tai stabiloituna nesteenä. On ajateltavissa, että entsyymivalmisteita voidaan edelleen rikastaa spesifisen hyödykkeen vaatimusten täyttämiseksi 10 erilaisissa sovellutuksissa, esimerkiksi tekstiiliteollisuudessa. Isännän erittämien entsyymiaktiivisuuksien seos voi olla edullinen tietyssä teollisessa sovellutuksessa, esimerkiksi biologisessa pintakäsittelyssä ja biologisessa kivipesus-sa.
Endoglukanaasiproteiinit ja niiden valmisteet ovat käyttökelpoisia 15 esimerkiksi tekstiili-, rehu-ja ruokasovellutuksissa, esimerkiksi leivontasovellu-tuksissa, biomassan hydrolysoinnissa, esimerkiksi bioetanolin tuotannossa, sekä kasviöljy-, pesuaine- sekä selluloosa- ja paperiteollisuudessa. Niitä voidaan käyttää minkä tahansa selluloosapitoisen materiaalin käsittelyyn, kuten tekstiilimateriaalin, muassa tai eläinrehussa käytettyjen kasvien tai kasviperäi-20 sen materiaalin käsittelyyn, öljyn uuttamiseen tarkoitetun kasvimateriaalin käsittelyyn tai puusta peräisin olevan mekaanisen tai kemiallisen selluloosan tai kierrätyskuidun käsittelyyn. Niitä voidaan lisätä myös pesuaineisiin esimerkiksi kankaan huolto-ominaisuuksien parantamiseksi nyppyyntymisen eston, har-maantumisen eston, värien kirkastamisen ja pehmentämisen kautta sekä teks-25 tiilien puhdistustehon, esimerkiksi tahranpoiston parantamiseksi. Pesuaine-koostumukset sisältävät tavallisesti lisäksi apuaineita, kuten pinta-aktiivisia ai-5 neita (anionisia, ionittomia, kationisia ja amfolyyttisiä pinta-aktiivisia aineita),
(M
^ tehoaineita ja muita mahdollisia aineosia, kuten harmaantumisen estoaineita ja ° tahroja suspendoivia aineita, optisia kirkasteita, valkaisuaineita, väriaineita ja 00 30 pigmenttejä sekä hydrolaaseja.
| Esillä olevassa yhteydessä ’’selluloosapitoinen materiaali” tarkoitta taa mitä tahansa materiaalia, joka käsittää merkittävänä aineosana selluloosaa m tai sen johdoksia. Selluloosapitoinen materiaali saatetaan kosketukseen te-o hokkaan määrän proteiinia kanssa sopivissa olosuhteissa, kuten sopivassa ^ 35 pH:ssa ja lämpötilassa, ja reaktion annetaan jatkua riittävän pitkän ajan, jotta entsymaattinen reaktio tapahtuu. Kuvattuja endoglukanaaseja käytetään edul- 14 lisesti lämpötilavälillä noin 20-50 °C ja edullisemmin noin 30-50 °C. Käyttökelpoiset lämpötilat ovat <50 °C, esimerkiksi ^45 °C tai joissakin tapauksissa <40 °C tai jopa <30 °C. Sopiva pH-väli on noin 3-9, edullisesti noin 4-8 ja erityisesti noin 5-6,5.
5 Endoglukanaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiilimateriaalien, kuten kankaiden ja vaatekappaleiden tai langan käsittelyyn. Tekstiilimateriaali voidaan valmistaa luonnossa esiintyvistä selluloosaa sisältävistä kuiduista tai ihmisen valmistamista selluloosaa sisältävistä kuiduista tai näiden sekoituksista tai synteettisten kuitujen ja selluloosaa sisältävien kuitujen seoksista. Sellu-10 loosaa sisältävä materiaali on edullisesti puuvillaa, erityisesti farmarikangasta. Tarmarikankaalla” tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä farkku kangasta, tavallisesti farkkuvaatekappaleita, erityisesti farmarihousuja. Farmarikangas on edullisesti indigovärjättyä farmarikangasta. Farmarikangasta voidaan käsitellä myös indigon johdoksilla tai indigolla yhdessä jonkin muun väriaineen kanssa, 15 esimerkkinä farmarikankaan indigovärjäys rikkipohjan kanssa.
Kuvatut endoglukanaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiiliteollisuudessa, edullisesti biokivipesussa ja bioviimeistelyssä.
Kivipesussa on kolme vaihetta: liimanpoisto, hankaus ja jälkikäsittely. Ensimmäinen vaihe, liimanpoistoprosessi, on tavallisesti farmarihousujen en-20 simmäinen märkäkäsittely ja tarkoittaa tärkkelyksen tai muiden liima-aineiden poistamista, joita on tavallisesti käytetty loimilankoihin vaurioiden estämiseksi kudontaprosessin aikana. Tärkkelyspitoisten liima-aineiden poistoon käytetään alfa-amylaaseja parannettua ja tasalaatuista märkäprosessointia varten. Lii-manpoiston jälkeen farmarihousut yleensä huuhdellaan vedellä tai ne viedään 25 suoraan hankausvaiheeseen.
Toinen vaihe, hankaus, voidaan tehdä entsyymeillä tai hohkakivillä 5 tai molemmilla. Joka tapauksissa värin poistamiseen tarvitaan mekaanista toi-
C\J
^ mintaa, ja käsittely tehdään yleensä pesukoneissa kuten rumpupesukoneissa.
^ Käsite ’’kulunut” tarkoittaa farmarikankaan ulkonäköä, jolloin kangasta on käsi- 30 telty sellulaasientsyymeillä tai kivillä tai molemmilla. Synonyymisiä ilmauksia £ ovat ’’kivipesty ulkonäkö” tai ’’kulunut ulkonäkö”. Epätasaisen värinpoiston tu- oo loksena on kontrasteja värjäytyneiden alueiden ja niiden alueiden välillä, joista väri on poistettu.
00 o Flankausta seuraa yleensä kolmas vaihe, jälkikäsittely, joka sisäl- ^ 35 tää pesu- ja huuhteluvaiheet, joiden aikana voidaan käyttää pesuaineita, opti sia kirkasteita, valkaisuaineita tai huuhteluaineita. Entsymaattisen käsittelyn 15 jälkeen reaktio tulee pysäyttää käsiteltyjen materiaalien vaurioitumisen estämiseksi esimerkiksi lämpötila-ja/tai pH-inaktivoinnilla, jolloin viimeksi mainittu käsittää perusteellisen huuhtelun ja/tai pesuaineen poispesemisen. Tämä varmistaa sen, että kuidun mekaaninen lujuus ei edelleen heikkene entsyymin jatku-5 van läsnäolon kautta.
Esillä olevassa yhteydessä käytettynä kankaan tai vaatekappaleen ’’biokivipesu” tarkoittaa entsyymien käyttöä hohkakivien sijasta tai niiden lisäksi kankaan tai vaatekappaleen, erityisesti farmarikankaan, käsittelyyn.
Kuten yllä todettiin, sellulaasilla käsitteleminen voi kokonaan kor-10 vata hohkakivillä käsittelemisen. Sellulaasikäsittely voidaan kuitenkin haluttaessa myös yhdistää hohkakivikäsittelyyn voimakkaasti hankautuneen pintakäsittelyn tuottamiseksi.
Endoglukanaasit ovat käyttökelpoisia myös kankaiden ja vaatekappaleiden biologisessa pintakäsittelyssä. ’’Bioviimeistely” (jota kutsutaan 15 myös nimellä nyppyjen esto, nukanpoisto, karvanpoisto tai biologinen viimeistely) tarkoittaa entsyymien käyttöä selluloosapitoisten kuitujen kontrolloidussa hydrolyysissä kankaan tai langan pinnan modifioimiseksi sellaisella tavalla, joka pysyvästi estää nyppyyntymistaipumusta, parantaa kankaan tuntua kuten pehmeyttä ja sileyttä, kirkastaa pintarakenteen vähentämällä nukkaantumista, 20 mikä johtaa värien kirkastumiseen ja voi myös auttaa kankaan laskeutuvuutta, kosteuden imukykyä ja värjäytyvyyttä.
Muihin käyttöihin kuuluvat käyttö pesuainekoostumuksissa kan-kaanhuolto-ominaisuuksien parantamiseksi nyppyyntymisen eston, harmaan-tumiseneston, värien kirkastamisen ja pehmentämisen kautta sekä tekstiilien 25 puhdistustehon, esimerkiksi tahranpoiston parantamiseksi.
Entsymaattinen nyppyjen poisto voidaan tehdä missä tahansa vai-o heessa tekstiilin märkäprosessoinnin aikana, edullisesti mahdollisen liiman-
<M
^ poiston ja/tai valkaisun jälkeen, ja voidaan käyttää samanlaisia olosuhteita kuin ^ biokivipesussa. Tekstiilejä voidaan käsitellä myös vaatekappaleiden muodos- 30 sa.
£ Nestesuhde (nesteen tilavuuden suhde kankaan painoa kohden) co biokivipesussa ja bioviimeistelyssä voi olla vaihteluvälillä 3:1-20:1, edullisesti
LO
^ 5:1-10:1. Käsittelyaika voi olla 15 minuuttia-90 minuuttia ja edullisesti 30 mi- 00 o nuuttia-60 minuuttia. On korostettava, että entsyymiannos riippuu suuresti ™ 35 kangastyypistä, laitteistosta, prosessiolosuhteista (pH, lämpötila, nestesuhde, käsittelyaika, farmarikankaan määrä, prosessin skaala) sekä entsyymivalmis- 16 teen tyypistä ja vastaavista. Alan ammattilainen kykenee määrittelemään sopivat annokset ja olosuhteet.
Tämän keksinnön mukainen menetelmä selluloosapitoisen materiaalin käsittelyyn sisältää myös lignoselluloosapitoisen materiaalin hydrolysoin-5 nin esimerkiksi bioetanolituotantoa varten. Yksi esimerkki yhdistetyn biopro-sessoinnin (CBP) käytöstä lignoselluloosapitoisen materiaalin hydrolyysissä kuvataan esimerkiksi julkaisussa van Zyl et ai., teoksessa Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:205 - 235.
Tätä keksintöä havainnollistetaan tarkemmin seuraavilla ei-rajoitta-10 villa esimerkeillä.
Esimerkki 1. Selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta ilmentävien kantojen seulonta
Roal Oy -yhtiön viljelmäkokoelman noin 180 sienikannan kykyä tuottaa selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta testattiin. Sienikanto-15 ja viljeltiin 100 ml:n tilavuudessa pyörivässä ravistelijassa (200 rpm) 20 °C:n lämpötilassa 3-7 päivää. Testattiin useita tuottoalustoja, jotka sisälsivät hiilen lähteenä Solka Floc -selluloosaa. Viljelyn jälkeen solut ja muut kiinteät aineet kerättiin sentrifugoimalla ja supernatantti otettiin talteen. Jos valmistetta ei käytetty välittömästi, sitä säilytettiin erinä -20 °C:ssa.
20 Matalampien lämpötilojen entsyymiaktiivisuuden arvoimiseksi ravis- tuspulloviljelmävalmistetta analysoitiin 30 °C:ssa ja 50 °C:ssa yhden tunnin ajan. Kaikista ravistuspullojen supernatanteista määritettiin seuraavat aktiivisuudet:
Endoglukanaasiaktiivisuus (CMCaasi-aktiivisuus): 25 Tämä määritettiin 3-prosenttinen (paino/tilavuus) karboksimetyylisel- ^ luloosa (CMC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa, olennaisesti siten kuin ^ on kuvattu julkaisuissa Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana et ai., 2004. Pel in 9 kistävät sokerit mitattiin DNS-reagenssilla. Määritys tehtiin sekä pH-arvossa “ 5,0 että pH-arvossa 7,0.
| 30 Endoglukanaasiaktiivisuus (HEC-aktiivisuus): Tämä määritettiin 1-prosenttinen (paino/tilavuus) hydroksietyylisellu- nj loosa (HEC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa, olennaisesti siten kuin on § kuvattu julkaisussa Bailey ja Nevalainen 1981. Pelkistävät sokerit mitattiin o «m DNS-reagenssilla. Määritys tehtiin sekä pH-arvossa 5,0 että pH-arvossa 7,0.
17
Kantojen viljelmien supernatanttivalmisteet testattiin pienen mittakaavan biologisen kivipesun sovellutuksessa LP-2 Launder Ometer -laitteella seuraavasti. Noin 7,2 g farmarikangastilkkuja (12 x 12 cm), joille oli tehty lii-manpoisto, ladattiin teräspalloihin 1,2 litran säiliöihin, jotka sisälsivät 100 ml 5 Mcllvaine-puskuria ja 100 ml viljelmän supernatanttia, ja Launder Ometer -laitetta käytettiin 30 °C:ssa 120 minuuttia. Emäksisen pesun ja pesuainepe-sun jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti lämpimällä vedellä ja ilma-kuivattiin. Tulokset arvioitiin sekä silmämääräisesti että mittaamalla väri reflek-tanssiarvoina (tietoja ei esitetä).
10 Alustavan seulonnan jälkeen sovellutusten lisätutkimuksiin valittiin neljä kantaa (Geomyces pannorum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusari-um cf. equiseti RF6318). Tätä tarkoitusta varten kantoja RF6546 ja RF6608 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm) 20° C:n lämpötilassa 4-7 päivää elatusaineessa, joka sisältää seuraavia aineita (g/litra): Solka 15 Floc -selluloosa 10,0, maissirankkijauhe 1,5, soijajauhe 0,5, CaC03 0,5, (NH4)2HP04 1,5, KH2P04 2,0, MgS04 H20 0,5, NaCI 0,5, NH4N03 0,5, Tween-80 0,5, hivenaineliuos nro 1 0,5, hivenaineliuos nro 2 0,5, parafiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon 6,4. Hivenaineliuos nro 1 (mg/litra): MnS04 1,6, ZnS04'H20 3,45, CoCI2'H20 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litra): FeS04'H20 5,0. Kantoja 20 RF6293 ja RF6318 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm) 20 °C:n lämpötilassa 4-6 päivää elatusaineessa, joka sisältää seuraavia aineita (g/litra): Solka Floc -selluloosa 30,0, maissirankkijauhe 9,0, soijajauhe 1,5, CaC03 1,5, (NH4)2HP04 4,5, KH2P04 6,0, MgS04H20 1,5, NaCI 0,5, NH4NC>3 1,5, Tween-80 0,5, hivenaineliuos nro 1 0,5, hivenaineliuos nro 2 0,5, 25 parafiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon 6,4. Hivenaineliuos nro 1 (mg/litra): MnS04 1,6, ZnS04H20 3,45, CoCI2'H20 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litra): o FeS04'H20 5,0.
(M
o Esimerkki 2. Endoglukanaasigeenien kloonaus kannoista Geomyces “ pannorum RF6293, RF6546, RF6608 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 c 30 DNA:n (plasmidien, DNA-fragmenttien) eristykseen ja entsyymikäsit- telyihin, E. coli -transformaatioihin jne. käytettiin tavanomaisia molekyylibiologi gian menetelmiä. Käytetyt perusmenetelmät kuvataan tavallisissa molekyyli- o biologian käsikirjoissa, esimerkiksi teoksissa Sambrook et ai. (1989) sekä ^ Sambrook ja Russell (2001).
35 Kantojen Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608 ja
Fusarium cf. equiseti RF6318 genomisten kirjastojen rakentamiseen käytettiin 18
Lambda DASH®ll/SamHI -vektoria (Stratagene, USA) sen toimittajan ohjeiden mukaisesti. Kromosomaaliset DNA:t, jotka oli eristetty julkaisun Raeder ja Bro-da (1985) mukaan, digestoitiin osittain Sau3A\Ma. Digestoidut DNA:t fraktioitiin koon perusteella ja valitun kokoiset fragmentit (5 - 20 kb) yhdistettiin ligaatiolla 5 Bam HI-dig esto ituihin lambda-vektorin käsivarsiin. Ligaatioseokset pakattiin Gi-gapack III Gold -pakkausuutteilla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Stratagene, USA). Rakennettujen genomisten kirjastojen titterit esitetään taulukossa 1.
Taulukko 1. Rakennettujen genomisten kirjastojen titterit
Kanta Genomisen kirjaston Monistetun genomi- titteri sen kirjaston titteri __pfu/ml (x 106)__pfu/ml (x 108)
Geomyces pan norum RF6293 0,38 100,0
Geomyces pannorum RF6546 0,04 6
Geomyces pannorum R6608 0,04 0,3
Fusarium cf. equiseti RF6318 0,46 60,0 10 Kantojen Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608 ja
Fusarium cf. equiseti RF6318 genomisia kirjastoja seulottiin koettimilla, jotka monistettiin PCR:llä degeneroituneita alukkeita ja genomista DNA:ta templaat-tina käyttäen. Heterologisten alukkeiden sekvenssit perustuivat konservoitu-neisiin endoglukanaasisekvensseihin (taulukko 2, sekvenssit nro 1-5). Kon-15 servoituneet sekvenssit tunnistettiin rinnastamalla kantojen Humicola grisea var. thermoidea AB003107, Fusarium oxysporum L29381, Melanocarpus al-bomyces AJ515703 ja Gibberella zeae AY342397 aiemmin julkaistut aminohapposekvenssit. PCR-reaktioseoksissa oli 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM o KCI, 0,1 % Triton X-100:a, 1,5 mM MgCb, 0,1 mM dNTP:itä, 1 μΜ kutakin
(M
^ 20 aluketta ja 1-2 yksikköä Dynazyme II -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ^ sekä 0,5-1 pg genomista DNA:ta. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraa- ^ vat: 5 minuuttia ensimmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä,
X
£ jokaisessa 1 minuutti 95 °C:ssa, 30 sekunnin hybridisoiminen 52,5 °C:ssa co (±7,5 °C:n gradientti) ja 1 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pi- 25 dentäminen 72 °C:ssa 5 minuutin ajan. PCR-reaktioissa käytetyt genomiset 00 § DNA-templaatit luetellaan taulukossa 3.
(M
19
Taulukko 2. Degeneroituneet oligonukleotidit, joita testattiin PCR-alukkeina koettimien monistamiseksi endoglukanaasigeenien seulomiseen kannoista Geomyces pannorum RF6547, RF6546, RF6608 ja Fusari-um cf. equiseti RF6318
Oligonukleotidi Pituus Sekvenssi*3 Sekvenssi (bp) nro
Cel45_S1__20 TAYTGGGAYTGYTGYAARCC (s)__1
Cel45_S2__17 TGGTGYTGYGCNTGYTA (s)__2
Cel45_AS1__17 TARCANGCRCARCACCA (as)__3
Cel45_AS2__17 GTRCANCCRTCRAADAT (as)__4
Cel45_AS3__23 TTRTCSGCRTTYTGRAACCARTC (as)__5 5 (a D = A tai G tai T, R = A tai G, S = C tai G, N = A tai G tai T tai C, Y = T tai C; sulkeissa oleva "s" = sense-juoste, sulkeissa oleva ”as” = antisense-juoste.
Useista reaktioista saatiin DNA-tuotteita, joilla oli odotetut koot (arvioitu julkaistuista endoglukanaasisekvensseistä). Kaikkein spesifisimmistä 10 PCR-reaktioista eristettiin odotetun kokoiset DNA-fragmentit, ja ne kloonattiin pCR® 4-TOPO®-vektoriin (Invitrogen, USA). Insertit karakterisoitiin sekvensoi-malla ja tekemällä Southern blot -hybridisaatiot genomisiin DNA:ihin, jotka oli digestoitu eri restriktioentsyymeillä. Taulukossa 3 esitetään PCR-fragmentit, jotka valittiin käytettäviksi koettimina kantojen Geomyces pannorum RF6293, 15 RF6546, RF6608 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 genomisten kirjastojen seu lontaan.
δ
CM
ih o oo
X
cc
CL
00
LO
CM
CD
00
O
O
CM
20
Taulukko 3. PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet ja kantojen Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 ge-nomisten kirjastojen endoglukanaasigeenien seulontaan valitut koetti-met. Genominen templaatti-DNA ja koetinfragmentin sisältävän plasmidin 5 nimi esitetään.
Geeni Eteenpäin Taaksepäin PCR- Saatu Sekv. Plasmidin suuntautunut suuntautunut reaktiossa fragmentti nro insertti aluke aluke templaattina (kb)
käytetty genominen DNA
RF6293_ce/45A Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6293 0,6 kb 6 pALK2038 RF6293_ce/45B Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6289 0,6 kb 7 pALK2039 RF6318_ce/45A Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6318 0,6 kb 8 pALK2047 RF6546_ce/45A Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6546 0,6 kb 9 pALK2040 RF6608_ce/45A Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6608 0,6 kb 10 pALK2042 RF6608_ce/45B Cel45_S1 Cel45_AS3 RF6608 0,6 kb 11 pALK2041
Kaikista näistä koettimista päätellyillä aminohapposekvensseillä oli homologiaa useiden julkaistujen Cel45-sekvenssien kanssa (BLAST-ohjelma, versio 2.2.9 NCBkssä, National Center for Biotechnology Information; Altschul 10 et ai., 1990).
Taulukossa 3 lueteltujen plasmidien insertit leimattiin digoksigeniinil-la sen toimittajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). Monistetut genomiset kirjastot (1 x 105-6 x 105 plakkia) seulottiin leimatuilla koetinfragmenteilla. Filt-tereiden hybridisaatiolämpötila oli 68 °C, ja filttereitä pestiin 2x5 minuuttia ^ 15 huoneenlämmössä käyttämällä liuosta 2 x SSC / 0,1 % SDS, jonka jälkeen g seurasi 2x15 minuuttia 68 °C:ssa liuoksessa 0,1 x SSC / 0,1 % SDS. Jokai- oo sesta hybridisaatiosta saatiin useita positiivisia plakkeja. Jokaisesta seulonnas- x ta puhdistettiin viisi voimakkaasti hybridisoituvaa plakkia. Faagi-DNA:t eristet-
CC
tiin ja karakterisoitiin Southern blot -hybridisaatioilla. Valitut, koettimeen hybridiin 20 soituvat restriktiofragmentit subkloonattiin pBluescript II KS+ -vektoriin ja kloo-
C\J
g nien merkitykselliset alueet sekvensoitiin.
o o Kaikkiaan kloonattiin kuusi ce/45-geeniä; yksi ce/45-geeni kannoista
Geomyces pannorum RF6546 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 sekä kaksi ce/45-geeniä kannoista Geomyces pannorum RF6293 ja RF6608. Taulukossa 21 4 esitetään yhteenvetona tiedot koettimista, joita käytettiin geenien seulontaan, faagikloonit, joista geenit eristettiin, valitut restriktiofragmentit, jotka sisältävät täysipituiset geenit sekä niiden promoottori- ja terminaattorialueet, plasmidien nimet sekä näitä plasmideja sisältävien E. co//-kantojen DSM-talletusnumerot.
5 Taulukko 4. Endoglukanaasigeenien kloonaamiseen käytetyt koettimet, faagiklooni ja valitut subloonit, plasmidin numero ja vastaavan E. coli -kannan talletusnumero
Geeni Seulonnassa Faagi- pBluescript II Plasmidi E. colin käytetty klooni KS+:aan subkloo- nro talletusnro __koetin___nattu fragmentti +___
Gp_RF6293_ce/45A pALK2038 F78 3,5 kb H/ndlll pALK2206 DSM 18916
Gp_RF6293_ce/45B pALK2039 F105 2,3kbXbal pALK2221 DSM 19171
Fe_RF6318_ce/45A pALK2047 F122 2,5 kb EcoRI pALK2226 DSM 19173
Gp_RF6546_ce/45A pALK2040 F85 6,0 kb Λ/ofl pALK2208 DSM 18915
Gp_RF6608_ce/45A pALK2042 F88 2,5kbXbal pALK2207 DSM 18917
Gp_RF6608_ce/45B pALK2041 F108__9,0kbXbal pALK2219 DSM 19170
Merkitykselliset tiedot geeneistä ja päätellyistä proteiinisekvensseis-10 tä (sekvenssit nro 12-23) esitetään vastaavasti yhteenvetona taulukossa 5 ja taulukossa 6.
Taulukko 5. Yhteenveto kannoista Geomyces pannorum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 eristetyistä endogluka-naasigeeneistä
Geeni Pituus intro- Koodaava alue Intronien Intronien Sekvenssi t— nien kanssa (bp)<b lukumäärä pituudet (bp) nro O (bp),a (M--—----- ^ Gp_RF6293_ce/45A 1036 912 1 121 12 ° Gp RF6293 ce/45B 966 846 2 58,59 14 oo ——-=-----:-- ^ Fe_RF6318_ce/45A 1162 1098 1 61 16 X------ £ Gp_RF6546_ce/45A 1028 912 1 113 18 CO Gp RF6608 ce/45A 1026 912 1 111 20 to —i-=-=------ S Gp RF6608 ce/45B 969 846 2 61,59 22 oo ------ § 15 (a STOP-kodoni sisältyy tähän.
(M
(b STOP-kodoni ei sisälly tähän.
Taulukko 6. Yhteenveto kannoista Geomyces pannorum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 saatujen endoglu- kanaasigeenien sekvensseistä päätellyistä aminohapposekvensseistä 22
Endoglukanaasi- Aminoh. ss NN:n CBD(b Ennustettu Ennustettu Sekvenssi proteiini lukumäärä pituus(a pl nro _____ss ei sisälly(c (ss ei sisälly)__
Gp_RF6293_Cel45A 304 22 T247 - L282 28678__5/I3__13
Gp_RF6293_Cel45B 282 26 27309__4J7__15
Fe_RF6318_Cel45A 366__20 A306 - N346 36284__^25__17
Gp_RF6546_Cel45A 304 22 T247 - L282 28762 4,93 19
Gp_RF6608_Cel45A 304 22 T247 - L282 28504 4,33 21
Gp_RF6608_Cel45B 282 26 30324 4,37 23 (a Signaalisekvenssin ennuste tehtiin ohjelmalla SignalP V3.0 (Nielsen et ai., 1997; Bendtsen et ai., 5 2004); NN-arvo saatiin neuraaliverkostoja käyttämällä.
(b Selluloosaa sitova domeeni (CBD); CBD-alueen aminohapot on merkitty. Ennustettu signaalisekvenssi ei sisältynyt tähän.
(c Ennuste tehtiin ExPASy-palvelimen Compute pl/MW -työkalulla (Gasteiger et ai., 2003).
10 Taulukossa 7 ja 8 esitetään kannoista Geomyces pannorum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen Cel45-sekvenssien vertailut toisiinsa. Päätellyistä Cel45-sekvensseistä esitetään sekä täysipitkät aminohapposekvenssit että ydinproteiinit, joista puuttuu CBD-alue. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Mana-15 ger (versio 9) ja toimintoja ’’Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix”.
δ C\| ιό cp 00 cc cu 00 m C\l
CO
00 o o C\l 23
Taulukko 7. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Geomyces pan-norum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf equiseti RF6318 pääteltyjen Cel45-aminohapposekvenssien rinnastuksesta. Rinnastettiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät signaalisekvenssit.
Gp_RF6293 Gp_RF6293 Fe_ RF6318 Gp_RF6546 Gp_RF6608 Gp_RF6608
Proteiini Cel45A Cel45B Cel45A Cel45A Cel45A Cel45B
Gp_RF6293_Cel45A ||||!!!!!|||||| 39 46 85 87 38
Gp RF6293 Cel45B ||||||||11!ΐ||||| 30 40 38 89
Fe_ RF6318_Cel45A |||||||11||||||| 45 45 31
Gp_R F6546_Ce I45 A 87 38
Gp RF6608 Cel45A |!!!!!!!||||||| 38
Gp RF6608 Cel45B _!|||||||||||||||||| 5
Taulukko 8. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Geomyces pan-norum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen Cel45-aminohapposekvenssien rinnastuksesta. Rinnastettiin ydinsekvenssit, joista puuttuvat signaalisekvenssi ja linkkeri-CBD-alueet.
Gp_RF6293 Gp_RF6293 Fe_ RF6318 Gp_RF6546 Gp_RF6608 Gp_RF6608
Proteiini Cel45A Cel45B Cel45A Cel45A Cel45A Cel45B
Gp RF6293 Cel45A |||||||l!!|||||||| 41 58 88 89 41
Gp RF6293 Cel45B !!!!!!|||!|||||| 39 42 42 89
Fo RF6318 Cel45A ||||||ί!!!!|Ι1Ι1Ι 60 60 39
Gp_R F6546_Ce I45 A !!!!!!!!||!Ι1Ι1ΙΙ 92 42
Gp RF6608 Cel45A !1!!!!||1|||||| 41
Gp RF6608 Cel45B |||||||||!1|||||| 5 10
(M
g Taulukoissa 9A ja 9B esitetään kantojen Geomyces pannorum οό RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen x Cel45-endoglukanaasisekvenssien vertailu tietokannoista löytyneisiin sek- ^ vensseihin.
CO
m
(M
CD
00 o o
(M
24
Taulukko 9A. Kantojen Geomyces pannorum RF6293, RF6546 ja RF6608 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen endoglukanaasisekvens-sien kanssa suurimman identtisyyden omaavat sekvenssit. Rinnastettiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät signaalisekvenssit. 5 Tietokantahaku tehtiin käyttämällä BLAST (tblastn, nr/nt database) -hakua, ja identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin Clone Manager 9 -ohjelmaa (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Eliö ja tunnusnumero__Identtisyys (%)
Gp_RF6293_Cel45A 100
Neurospora orassa, XM_952014 57
Gp_RF6293_Cel45B 100
Pyrenophora tritici-repentis, XM_001935986__47_
Fe_RF6318_Cel45A 100
Gibberella zeae, AY342397 86
Gibberella zeae, XM_382834__86_
Gp_RF6546_Cel45A 100
Neurospora orassa, XM_952014 57
Gp_RF6608_Cel45A 100
Sclerotinia sclerotiorum, XM_001597582 58
Gp_RF6608_Cel45B 100
Pyrenophora tritici-repentis, XM_001935986 48 δ
(M
i tn o i oo
X
en
CL
OO
m
(M
CD
00 o o
(M
25
Taulukko 9B. Patenttijulkaisun sekvenssien suurin identtisyys kantojen Geomyces pannorum RF6293 ja RF6546 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen endoglukanaasisekvenssien kanssa. Rinnastettiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisälsivät signaalisekvenssit. 5 The Chemical Abstracts Service (CAS) Registry System-, DGEGE- ja Patended Protein Sequences NCBI -tietokantahaut tehtiin BLAST:n avulla, ja identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Eliö ja tunnusnumero__Identtisyys (%)
Gp_RF6293_Cel45A 100 US7256032, SEQ ID: 21__64_
Fe_ RF6318_Cel45A 100 US5610129 A, SEQ ID: 4__78_
Gp_RF6546_Cel45A 100 US2005070003A1, SEQ ID: 6__61_ 10
Esimerkki 3. Cel45-rekombinanttiproteiinien tuottaminen Trichoderma reeseissä
Rakennettiin ekspressioplasmidit kannoista Geomyces pannorum RF6293 ja RF6546 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 peräisin olevien Cel45-15 rekombinanttiproteiinien yliekspressiota Trichoderma reeseissä varten. Rakennetut ekspressioplasmidit luetellaan taulukossa 10. ce/45-rekombinanttigeenit, jotka sisälsivät omat signaalisekvenssinsä, fuusioitiin täsmälleen T. reesein cb/i1/ce/7A-promoottoriin (p cbh1). Transkription lopetus varmistettiin T. ree-o ^ sein cbh'\Icel7A-terminaattorilla (t cbh1) ja A. nidulansin amc/S-markkerigeeniä 0 20 käytettiin transformanttien selektioon, kuten julkaisussa Paloheimo et ai.
$2 (2003) kuvataan. Lineaariset ekspressiokasetit (kuvio 1) eristettiin vektorirun- 1 goista Λ/ofl-digestion jälkeen, ja kasetit transformoitiin T. reesein A47- ja/tai A51-protoplasteihin (molemmista kannoista on poistettu neljää tärkeintä sellu- ^ laasia CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B ja EGII/Cel5A koodaavat geenit).
CD
g 25 Transformaatiot tehtiin kuten julkaisussa Penttilä et ai. (1987) käyttäen julkai- ° sussa Karhunen et ai. (1993) kuvattuja muunnelmia ja selektoimalla asetami- dilla ainoana typen lähteenä (amdS-markkerigeeni). Transformantit puhdistet- tiin selektiomaljoilla yksittäisten kuromaitiöiden kautta ennen niiden spekulaa tiota PD:llä.
26
Taulukko 10. Ekspressiokasetit, jotka rakennettiin kannoista Geomyces pannorum RF6293 ja RF6546 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 peräisin 5 olevien Cel45-proteiinien ylituottamiseksi Trichoderma reeseissä. Eks-pressiokasettien kokonaisrakenne oli kuviossa 1 kuvatun kaltainen. Kloonatut ce/45-geenit fuusioitiin täsmälleen T. reesein cbhMcen A-promoottoriin.
Endoglukanaasi- Ekspressio- Ekspressio- Terminaattori(b _proteiini__plasmidi__kasetti(a__
Gp_RF6293_Cel45A pALK2215 8,6 kb NotI 196bp(M/yl)
Gp_RF6293_Cel45B pALK2224 8,6 kb NotI 196bp(Sa/l)
Fe_RF6318_Cel45A pALK2230 8,9 kb NotI 335 bp (EcoRI)
Gp_RF6546_Cel45A pALK2218 8,6 kb Not\ 225 bp (Sspl) (a Ekspressiokasetti T. reesein transformaatioon eristettiin vektorirungosta Λ/ofl-diges-10 tiolla.
(b Kloonatun rekombinanttigeenin STOP-kodonin jälkeisten nukleotidien määrä, joka sisällytettiin ekspressiokasettiin. Sulkumerkkien sisällä esitetään ekspressiokasetin rakentamisessa käytetty restriktiokohta genomisen geenifragmentin 3'-päässä.
15 Transformanttien endoglukanaasituotanto analysoitiin ravistuspullo- viljelmien viljelmäsupernatanteista (50 ml). Transformantteja kasvatettiin 7 päivää kompleksisessa laktoosipohjaisessa sellulaaseja indusoivassa elatusai-neessa (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella KFfePO^IIa. Endoglukanaasiaktiivisuus määritettiin 3-prosenttinen (paino/tilavuus) karbok-^ 20 simetyyliselluloosa (CMC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa julkaisujen o Bailey ja Nevalainen, 1981, ja Flaakana et ai., 2004, mukaisesti. Valittujen uS transformanttien genotyypit varmistettiin Southern blot -kokeilla, joihin sisälly- o ^ tettiin lukuisia genomisia digestejä, ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena. Rekombinanttiendoglukanaasiproteiinien heterologista tuottoa £ 25 analysoitiin SDS-PAGE:lla ja sitä seuraavalla Coomassie-värjäyksellä.
^ Cel45A-rekombinanttientsyymivalmisteet karakterisoitiin pH-optimin S ja lämpötilakestävyyden suhteen. Ylituotettujen Cel45A-proteiinien pH-optimit § määritettiin yleisessä Mcllvaine-puskurissa pH-vaihteluvälillä 4,0-8,0 käyttä-
(M
mällä 3-prosenttista (paino/tilavuus) karboksimetyyliselluloosaa (CMC) sub-30 straattina (kuvio 2 A). Rekombinanttisten endoglukanaasiproteiinien lämpötila- 27 kestävyys määritettiin mittaamalla CMCaasiaktiivisuus yleisessä Mcllvaine-puskurissa optimi-pH:ssa 1 tunnin reaktioajalla (kuvio 2B).
Valittuja endoglukanaasia tuottavia transformantteja viljeltiin labora-toriobioreaktoreissa 28 °C:ssa edellä osoitetussa elatusaineessa 3-4 päivää 5 pH-kontrollilla 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4), jotta saataisiin materiaalia sovellusteste-jä varten. Supernatantit kerättiin talteen sentrifugoimalla ja Seitz-K 150- ja EK-suodattimien läpi suodattamalla (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Saksa).
Esimerkki 4. Cel45-rekombinanttiproteiinien toimintakyky farmarikankaan 10 käsittelyssä eri lämpötiloissa
Cel45-rekombinanttiproteiineilta, jotka oli tuotettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, testattiin niiden kyky farmari-kankaan biologiseen kivipesuun eri lämpötiloissa samanlaisen kuluneen ulkonäön tuottamiseksi kuin hohkakivillä aikaansaatu ulkonäkö. Vertailuksi käytet-15 tiin kaupallisia Cel45-entsyymejä Ecostone®N400 (Roal Oy, Suomi) ja Deni-max™ 399S (Novozymes).
Indigovärjätystä twill-farmarikankaasta valmistettua, englantilaiselta toimittajalta hankittua yhtä farmarihousuparia käytettiin kokeen päämateriaali-na ECOSTONE® A200 -alfa-amylaasilla tehdyn liimanpoiston jälkeen ja täyte-20 materiaalina käytettiin kahta Apache-farmarihousuparia (Labels Fashion Limited, U.K.), joille oli tehty liimanpoisto. Sellulaasikäsittelyt tehtiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesuimurilla taulukossa 11 kuvatuissa olosuhteissa.
Taulukko 11. Sellulaasikäsittelyissä käytetyt koeolosuhteet/prosessipara- metrit__ ^ Prosessiparametri__ ° Farmarikankaan määrä__1,6 kg_ S Vesi 17 litraa 1-- $2 Puskuri/pH-kontrolli (pH 6) Säädetty Na2HPQ4-H2Q:lla ja sitruunahapolla x Aika__55 min_
Lämpötila 20, 30, 40, 50 tai 60 °C
00 --
Sellulaasiannos 250-1 500 NCU / g kangasta
CD
1 25 cvj Entsyymejä annosteltiin neutraalin sellulaasin aktiivisuusyksikköinä (NCU) kankaan painoa kohden. Entsyymiaktiivisuus mitattiin pelkistävien soke-reiden vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta (3-prosenttinen CMC) 28 50 °C:ssa 50 mM Hepes-puskurissa, pH 7,0 (NCU-aktiivisuus, Haakana et al. 2004). Cel45-rekombinanttiproteiineja annosteltiin pitoisuutena 1 250 NCU/g kangasta, Ecostone®N400:a pitoisuutena 1 500 NCU/g kangasta ja Denimax™ 399S:ää pitoisuutena 250 NCU/g. Kunkin entsyymin annostus oli riittävä anta-5 maan helposti mitattavat tai detektoitavat erot (kirkkauden lisäys = delta L* > 2 yksikköä) koko lämpötilavälin ylitse. Entsyymit inaktivoitiin nesteen poisvalut-tamisen jälkeen nostamalla pH-arvo yli 11:een lisäämällä 4,2 g NaOH:a (10 minuuttia, 40 °C) ja huuhtelemalla kolme kertaa. Farmarihousut kuivattiin rum-pukuivaajassa.
10 Kokeen päämateriaalin biologisen kivipesun vaikutelmaa tai han kautumisen tasoa arvioitiin mittaamalla väriä reflektanssiarvoina Minolta CM 2500 -spektrofotometrillä käyttämällä väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja (valonlähde D65/2°). Väri farmarikankaan etu- ja takapuolelta mitattiin liimanpois-ton jälkeen (so. ennen sellulaasikäsittelyä) sekä sellulaasikäsittelyn jälkeen.
15 Farmarikankaan etupuolen jokainen mittaus oli noin 40 mittauksen keskiarvo. Myös farmarikangassovellutuksen lämpötilaprofiilia havainnollistettiin laskemalla suhteellinen toimintakyky (%) 30 °C:ssa 50 °C:seen verrattuna (30:50-suhde) sekä suhteellinen toimintakyky (%) 40 °C:ssa optimaaliseen lämpötilaan verrattuna (40/OT-suhde).Tulokset esitetään taulukoissa 12-14 ja kuvios- 20 sa 3.
δ
(M
tn o i oo
X
en
CL
OO
m
(M
CD
00 o o
(M
29
Taulukko 12. Cel45-valmisteiden läm poti laprof i i I it farmarikankaan käsittelyssä. Käsittelyjä kaupallisilla Cel45-entsyymivalmisteilla käytettiin vertailuksi.
Entsyymi Lämpötila L*:n suhteellinen lisäys __TO__(%)_
Gp_RF6293_Cel45A__60__54_
Gp_RF6293_Cel45A__50__95_
Gp_RF6293_Cel45A__40__100_
Gp_RF6293_Cel45A__30__93_
Gp_RF6293_Cel45A__20__65_
Gp_RF6546_Cel45A__60__99_
Gp_RF6546_Cel45A__50__100_
Gp_RF6546_Cel45A__40__81_
Gp_RF6546_Cel45A__30__74_
Fe_RF6318_Cel45A__50__96_
Fe_ RF6318_Cel45A__40__100_
Fe_ RF6318_Cel45A__30__76_
Fe_RF6318_Cel45A__20__62_
Ecostone® N400__60__100_
Ecostone® N400__50__91_
Ecostone® N400 40 75 T- Ecostone® N400 30 64 δ (M___ g Denimax™ 399S 60 100 oo Denimax™ 399S 50 92 x Denimax™ 399S 40 62
Denimax™ 399S 30 40
CO
tn
(M
CD
00 o o
(M
30
Taulukko 13. Uudenlaisten Cel45-entsyymien ja kaupallisten Cel-45-valmisteiden lämpötilaprofiileista lasketut 30:50-ja 40:QT-suhteet Entsyymi 30:50-suhde (%) 40:OT-suhde (%)
Gp RF6293 Cel45A__98__100_
Gp RF6546 Cel45A__74__81_
Fe RF6318 Cel45A__79__100_
Ecostone® N400__70__75_
Denimax™ 399S__43__62_
Taulukon 12 ja kuvion 3 tulokset osoittavat, että uudenlaisilla Cel45-5 rekombinanttientsyymeillä on sovellutuksessa matalammat lämpötilaprofiilit kuin kaupallisilla Cel45-entsyymeillä Ecostone®N400:lla ja Denimax™ 399S:llä. Gp_RF6293_Cel45A osoittaa optimaalista toimintakykyä hyvin laajalla lämpötilavälillä 30-50 °C, mikä on yllättävää, koska lämpötilaoptimi testaus-olosuhteissa oli huomattavasti suurempi (55-60 °C, kuvio 2B). Optimaalinen 10 lämpötilaväli Gp_RF6546_Cel45A:lle ja Fe_RF6318_Cel45A:lle on myös matalampi kuin kaupallisille entsyymeille.
Sekä Gp_RF6293_Cel45A:lla että Fe_RF6318_Cel45A:lla on parempi toimintakyky 40 °C:ssa kuin 50 °C:ssa, mikä on ainutlaatuinen ominaisuus muihin cel45-perheeseen kuuluviin entsyymeihin kuten referenssinä käy-15 tettyihin kaupallisiin valmisteihin verrattuna, jotka tyypillisesti toimivat parhaiten 50-60 °C:ssa. Taulukon 13 tulokset osoittavat, että sekä 30/50- että 40/OT-suhteet ovat suotuisampia näillä uudenlaisilla endoglukanaaseilla kuin kaupallisilla Cel45-valmisteilla.
5 Taulukon 14 tulokset osoittavat, että Gp_RF6293_Cel45A-rekombi-
(M
^ 20 nanttientsyymillä voidaan saada suurempi biologisen kivipesun tai hankautuvia misen vaikutus matalammassa lämpötilassa (30 °C) kaupallisiin Cel45-entsyy- ^ meihin verrattuna.
X
en
CL
CO
m
(M
CD
00 o o
(M
31
Taulukko 14. Gp_RF6293_Cel45A-valmisteella 30 °C:ssa ja pH-arvossa 6 käsitellyn farmarikankaan etupuolen värimittaukset. Käsittelyjä kaupallisilla entsyymivalmisteilla käytettiin vertailuksi. L* tarkoittaa kirkkautta.
Entsyymi Aktiivisuus/ Ennen sellu- Sellulaasikäsittelyn L*:n g vaate- laasikäsittelyä__jälkeen_ lisäys kappaletta L* L*
Gp_RF6293_Cel45A 1250 NCU/g__16,87__22,19__5,32
Ecostone® N400__1500 NCU/g__16,95__21,75__4,80
Denimax™ 399S__250 NCU/g__16,82__19,29__2,47
Denimax™ 399S 1250 NCU/g 16,82 21,36_ 4,54 5 Esimerkki 5. Cel45-rekombinanttiproteiinien toimintakyky farmarikankaan käsittelyssä eri pH-arvoissa
Cel45-rekombinanttiproteiineilta, joka oli tuotettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, testattiin niiden kyky farmari-kankaan biokivipesuun eri pH-arvoissa samanlaisen kuluneen ulkonäön tuot-10 tamiseksi kuin hohkakivillä aikaansaatu ulkonäkö.
Koejärjestelmä biokivipesulle oli kuten esimerkissä 4, paitsi että käytettiin farmarihousujen eri erää ja että lämpötila oli 40 °C ja pH 5-7. Myös sellulaasikäsittelyn vaikutusta arvioitiin kuten esimerkissä 4.
Taulukossa 15 ja kuviossa 4 esitetään tulokset, jotka osoittavat, että 15 Gp_RF6293_Cel45A:n optimaalinen pH-väli on 5-6,5 ja Fe_RF6318_Cel45A:n optimaalinen pH-väli on 6-6,5.
δ
(M
tn o i oo
X
en
CL
OO
m
(M
CD
00 o o
(M
Table 15. Cel45-rekombinanttivalmisteilla eri pH-arvoissa 40 °C:ssa käsi tellyn farmarikankaan etupuolen värimittaukset. L* tarkoittaa kirkkautta.
32
Ennen sellu- Sellulaasikäsittelyn
Entsyymi pH laasikäsittelyä__jälkeen_ L*:n lisäys ___\J__\J__
Gp_RF6293_Cel45A__5__16,70__22,33__5,63
Gp_RF6293_Cel45A__6__16,63__22,36__5,73
Gp_RF6293_Cel45A 6,5__16,75__22,2__5,45
Gp_RF6293_Cel45A__7__16,75__21,16__4,41
Fe_ RF6318_Cel45A__5__16,55__19J5__2,95
Fe_RF6318_Cel45A__6__16,53__20,66__4,13
Fe_ RF6318_Cel45A 6,5__16,47__20,22__3,75
Fe_ RF6318_Cel45A 7 16,53 19,92 3,39
Esimerkki 6. Cel45-rekombinanttiproteiinien toimintakyky bioviimeiste-lyssä (nyppyjen poisto / karvanpoisto / nukanpoisto) 5 Cel45-rekombinanttiproteiinien, joka oli tuotettu esimerkissä 3 kuva tulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, kykyä puuvillaneuleen nyppy-jen/nukan poistoon testattiin ja verrattiin Cel45-entsyymiin, jolla on erinomaiset nyppyjen poiston ominaisuudet (W02006/117432). Sellulaasikäsittelyt tehtiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesuimurilla taulukossa 16 kuvatuissa 10 olosuhteissa.
Sataprosenttisesta puuvillasta valmistettua kolmilankaista fleece-kangasta (tyyppi 9761, Orneule, Suomi) käytettiin koemateriaalina täytemateriaalin kanssa. Kangasta esipestiin ensin 10 minuuttia 50 °C:ssa ja huuhdeltiin 3 ^ kertaa. Sen jälkeen puuvillaneuloskangasta käsiteltiin sellulaasilla 40 °C:ssa ^ 15 tai 50 °C:ssa 60 minuutin ajan. Entsyymit annosteltiin neutraalin sellulaasin ak- g tiivisuusyksikköinä (NCU) kankaan painoa kohden. Nesteen poisvaluttamisen i oo jälkeen entsyymi inaktivoitiin (10 minuuttia 60 °C:ssa) nostamalla pH-arvo yli x 11:een natriumhydroksidilla. Kangasta huuhdeltiin sitten kolme kertaa ja kui-
CE
vattiin rumpukuivaajalla.
OO
LO
CM
CD
00 o o
CM
33
Taulukko 16. Biologisissa pintakäsittelyissä käytetyt koe-olosuhteet/prosessiparametrit
Prosessiparametri__
Kankaan määrä__1,0 kg_
Vesi__15 litraa_ pH-säätö__etikkahapolla (80-prosenttinen)
Aika 60 min_ Lämpötila__40 °C / 50 °C_
Sellulaasiannos 250 NCU/g kangasta_
Neulenäytteitä arvioitiin silmämääräisesti sen mukaan, paljonko ha-5 valttiin pintasäikeitä ja nukkaa. Kunkin arvioinnin tulos kvantitoitiin merkitsemällä tulos standardien muodostamaan skaalaan verrattuna. Nämä standardit olivat saman kankaan paloja, jotka oli pesty eri määrillä sellulaasia, ja niiden pintasäikeiden tai nukan intensiteetin vaihteluväli oli numerovälillä 1-5 puolen yksikön välimatkoin. Numero 0 oli kontrollinäyte, jota käsiteltiin ilman entsyy-10 miä. Mitä suurempi numero, sen parempi nyppyjen poiston / karvanpoiston vaikutus. Numero 5 tarkoittaa, että pintasäikeet tai nukka olivat poistuneet. Tulokset esitetään taulukoissa 17 ja 18. Taulukoiden 17 ja 18 tulokset osoittavat, että Gp_RF6293_Cel45A, Gp_RF6546_Cel45A:lla ja Fe_RF6318_Cel45A:lla on erinomaiset nyppyjen poiston ominaisuudet. Oli yllättävää, että 15 Gp_RF6293_Cel45A oli tehokas paljon pienemmällä aktiivisuusannoksella nyppyjen poistossa / karvanpoistossa kuin farmarikankaan käsittelyssä aiemmissa esimerkeissä. Lisäksi havaittiin, että optimaalisin pH-väli Gp_RF6293_Cel45A:lle nyppyjen poistossa on pH 5,5-noin 7.
^ Neutraali sellulaasi, jolla on erinomaiset nyppyjen poiston ominai- ^ 20 suudet, kuten Gp_RF6293_Cel45A-proteiini, mahdollistaa bioviimeistelyn sa- g manaikaisesti värjäyksen kanssa.
i 00
X
cc
CL
00
LO
C\l
CO
00
O
O
CM
Taulukko 17. Cel45-rekombinanttiproteiineilla 40 °C:ssa ja pH-arvossa 6 tehtyjen biologisten pintakäsittelyjen tulokset 34
Entsyymi Aktiivisuus/g Arviointi __kangasta__
Cel45 (WQ2006/117432)__250 NCU/g__3I5_
Gp_RF6293_Cel45A__500 NCU/g__5_
Gp_RF6293_Cel45A__250 NCU/g__4_
Gp_RF6293_Cel45A 125 NCU/g 3 4-5 tarkoittaa erinomaista nyppyjen/nukan poiston vaikutusta, 3 tar-5 koittaa hyvää nyppyjen/nukan poiston vaikutusta, 0 tarkoittaa, ettei ole lainkaan nyppyjen/nukan poiston vaikutusta (käsittely ilman entsyymiä).
Taulukko 18. Cel45-rekombinanttiproteiineilla 50 °C:ssa ja pH-arvossa 6 tehtyjen biologisten pintakäsittelyjen tulokset
Entsyymi__g kangasta__Olosuhteet Arviointi
Control__0__pH 6, 50 °C__0
Gp_RF6293_Cel45A 500 NCU/g pH 6, 50 °C__5
Gp_RF6546_Cel45A 1000 NCU/g pH 6, 50 °C__4
Fe_RF6318_Cel45A 1250 NCU/g pH 6, 50 °C__5
Fe_RF6318_Cel45A 625 NCU/g pH 6, 50 °C 4,5 δ
(M
tn o i oo
X
en
CL
OO
uo
(M
CO
OO
O
o
CM
35
Kirjallisuusviitteet
Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers ja DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403 - 410.
5 Bailey M ja Nevalainen H. 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cel-lulase. Enzyme Microb. Technol. 3:153 -157.
Bendtsen JD, H Nielsen, G von Heijne ja S Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol.Biol. 340:783 - 795.
10 Gasteiger E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, RD Appel ja A Bai- roch. 2003. ExPASy: the proteiomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3 784 - 3 788.
Haakana H, Miettinen-Oinonen A, Joutsjoki V, Mäntylä A, Suominen P ja Vehmaanperä J. 2004. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus al-15 bomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technol. 34:159 - 167.
Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309 - 316.
Henrissat B. ja Bairoch A. (1993) New families in the classification 20 of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781 - 788.
Henrissat B. ja Bairoch A. (1996). Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695 - 696.
Joutsjoki, VV, TK Torkkeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transfor-
25 mation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P
^ (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma ™ reesei. Curr. Genet. 24:223 - 228.
in 9 Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993.
” High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglu-
Ee 30 canase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515 - 522.
Q_
Malardier L, Daboussi MJ , Julien J, Roussel F, Scazzocchio C ja c$ Brygoo Y. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus § nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 15:147 - ° 156.
36
Needleman S. ja Wunsch C. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443 - 453.
Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak ja G von Heijne. 1997. Identifi-5 cation of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of thier cleavage sites. Protein Engineering 10:1 - 6.
Nierstrasz V.A. ja Warmoeskerken M.M.C.G. (2003) Process engineering and industrial enzyme applications. Teoksessa: Textile processing with enzymes. A. Cavaco-Paulo ja G. M. Giibitz (toim.) Woodhead Publishing Ltd, 10 Cambridge, s.120 -157.
Rice P, Longden I ja Bleasby A. (2000). EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276 - 277.
Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma 15 reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69:7 073-7 082.
Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155 -164.
20 Raeder U ja P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamen tous fungi. Lett. Appi. Microbiol. 1:17- 20.
Sambrook J, EF Fritsch ja T Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory 25 manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
van Zyl WH, Lynd LR, den Haan R, McBride JE. 2007 Consolidated o bioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. Adv
CM
^ Biochem Eng Biotechnol.;108:205 - 35.
o 00
X
x D.
00
LO
CM
CD
00
O
O
CM
37
Sekvenssit
Sekvenssi Sekvenssi nro 1 Oligonukleotidialuke Cel45_S1 2 Oligonukleotidialuke Cel45_S2 3 Oligonukleotidialuke Cel45_AS1 4 Oligonukleotidialuke Cel45_AS2 5 Oligonukleotidialuke Cel45_AS3 6 PCR-fragmentti, joka saatiin G. pannorum RF6293:sta alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 7 PCR-fragmentti, joka saatiin G. pannorum RF6289:stä alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 8 PCR-fragmentti, joka saatiin F. cf. equiseti RF6318:sta alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 9 PCR-fragmentti, joka saatiin F. cf. equiseti RF6546:sta alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 10 PCR-fragmentti, joka saatiin G. pannorum RF6608:sta alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 11 PCR-fragmentti, joka saatiin G. pannorum RF6608:sta alukkeilla __Cel45_S1 ja Cel45_AS3_ 12 G. pannorum RF6293:n cel45A-geenin nukleotidisekvenssi 13 G. pannorum RF6293:n Cel45A:n päätelty aminohapposekvenssi 14 G. pannorum RF6293:n cel45B-geenin nukleotidisekvenssi 15 G. pannorum RF6293:n Cel45B:n päätelty aminohapposekvenssi ° 16 F. cf. equiseti RF6318:n cel45A-geenin nukleotidisekvenssi g 17 F. cf. equiseti RF6318:n Cel45A:n päätelty aminohapposekvenssi οό 18 G. pannorum RF6546:n cel45A-geenin nukleotidisekvenssi T 19 G. pannorum RF6546:n Cel45A:n päätelty aminohapposekvenssi tr 20 G. pannorum RF6608:n cel45A-geenin nukleotidisekvenssi ίο 21 G. pannorum RF6608:n Cel45A:n päätelty aminohapposekvenssi (M-- ig 22 G. pannorum RF6608:n cel45B-geenin nukleotidisekvenssi o ° 23 G. pannorum RF6608:n Cel45B:n päätelty aminohapposekvenssi 38
Talletetut mikrobit
Talletettu kanta Viljelmä- Talletuspäivä Tunnusnumero _ Kokoelma
Geomyces pannorum RF6293 1) 7.4.2006 CBS 119567
Fusarium cf. equiseti RF6318 1) 7.4.2006 CBS 119568
Geomyces pannorum RF6546 1) 16.6.2006 CBS 119958
Geomyces pannorum RF6608 1) 16.6.2006 CBS 119962 E. coli -kanta, joka sisältää 2) 10.1.2007 DSM 18916 plasmidin pALK2206____ E. coli -kanta, joka sisältää 2) 16.3.2007 DSM 19171 plasmidin pALK2221_ E. coli -kanta, joka sisältää 2) 16.3.2007 DSM 19173 plasmidin pALK2226____ E. coli -kanta, joka sisältää 2) 10.1.2007 DSM 18915 plasmidin pALK2208 E. coli -kanta, joka sisältää 2) 10.1.2007 DSM 18917 plasmidin pALK2207 E. coli -kanta, joka sisältää 2) 16.3.2007 DSM 19170 plasmidin pALK2219 1) Centraalbureau Voor Schimmelcultures osoitteessa Upsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, Alankomaat 2) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhof-5 fenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa δ c\i ιό o oo
X
cc
CL
00 m
CM
CD
00 o o
CM
Claims (18)
1. Sieniperäinen endoglukanaasipolypeptidi, joka kuuluu glykosyyli-hydrolaasien perheeseen 45, ja jolla on oleellinen suorituskyky alhaisissa lämpötiloissa, ja joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 65-5 prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 13, vähintään 48-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 15, vähintään 87-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 17, vähintään 90-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 19, vähintään 90-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 21 tai vähintään 49-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 23 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivinen fragmentti.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 90-prosenttinen identtisyys, edullisesti vähintään 95-prosenttinen identtisyys ja edullisimmin vähintään 98-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 13, 15, 17 tai 23 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivinen fragmentti.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 95-prosenttinen identtisyys ja edullisesti vähintään 98-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 19 tai 21 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivinen fragmentti.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, joka 20 on peräisin sienestä Geomyces tai Fusarium, edullisesti sienestä G. pannorum or F. cf equiseti, edullisimmin sienestä G. pannorum RF 6293 (CBS 119567), F. cf. equiseti RF6318 (CBS 119568), G. pannorum RF6546 (CBS 119958), tai G. pannorum RF6608 (CBS 119962).
5. Eristetty polynukleotidi, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seu- ^ 25 raavista: o ^ a) nukleotidisekvenssi, jolla on sekvenssin nro 12, 14, 16, 18, 20 tai LO o 22 mukainen sekvenssi, tai sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mu- “ kaista endoglukanaasipolypeptidiä, g b) kohdan a) komplementaarinen juoste tai CL 30 c) sekvenssi, joka on degeneroitunut geneettisen koodin suhteen o] minkä tahansa kohdan a) tai b) mukaisesta sekvenssistä. CD
§ 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen polynukleotidi, joka vastaa E. S co//-kannan DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, tai DSM 19170 sisältämää polynukleotidia.
7. Ekspressiovektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen polynukleotidin.
8. Isäntäsolu, joka sisältää patenttivaatimuksen 7 mukaisen eks-pressiovektorin.
9. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipo- lypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää vaiheet, joissa isäntäsolu transformoidaan ekspressiovektorilla, joka koodaa mainittua polypeptidiä, ja viljellään mainittu isäntäsolu olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun polypeptidin ekspression, ja valinnaisesti polypeptidi otetaan talteen ja puhdistetaan.
10. Entsyymivalmiste, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipolypeptidin.
11. Menetelmä selluloosapitoisen materiaalin käsittelemiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa selluloosapitoinen materiaali saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipolypeptidin tai 15 patenttivaatimuksen 10 mukaisen entsyymivalmisteen kanssa.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa käsittely suoritetaan lämpötilassa <50 °C, edullisesti <40 °C.
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, joka suoritetaan pH:ssa noin 3-9, edullisesti 4-8 ja edullisemmin 5-6,5.
14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, joka on biokivi- pesu tai bioviimeistely.
15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, joka on lignosel-luloosapitoisen materiaalin hydrolyysi tai elintarvikesovellus.
16. Pesuainekoostumus, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mu- 25 kaisen endoglukanaasipolypeptidin tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen entsyymivalmisteen.
17. Eläinrehu, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen endo- <N ^ glukanaasipolypeptidin tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen entsyymivalmis- ° teen. 00 30
18. E. coli-kanta, jolla on talletusnumero DSM 18916, DSM 19171, | DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, tai DSM 19170. 00 uo (M CO 00 O o CM
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20086253A FI122029B (fi) | 2008-12-30 | 2008-12-30 | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
| CN200980153489.3A CN102272297B (zh) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | 真菌内切葡聚糖酶、它们的生产和应用 |
| BRPI0923915A BRPI0923915B1 (pt) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | endoglucanases fúngicas, seu método de produção, processo para tratar material celulósico, composição detergente,alimento animal, cepa de e. coli, vetor de expressão, e microrganismo transgênico |
| PT98361306T PT2370573E (pt) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Endoglucanases fúngicas, sua produção e utilização. |
| DK09836130.6T DK2370573T3 (en) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Svampeendoglucanaser, their production and use |
| US13/142,609 US8609387B2 (en) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Fungal endoglucanases, their production and use |
| MX2011007142A MX2011007142A (es) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Endonucleasas fungicas, su produccion y uso. |
| ES09836130.6T ES2554652T3 (es) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Endoglucanasas fúngicas, su producción y su uso |
| PCT/FI2009/051043 WO2010076388A1 (en) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Fungal endoglucanases, their production and use |
| EP09836130.6A EP2370573B1 (en) | 2008-12-30 | 2009-12-28 | Fungal endoglucanases, their production and use |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20086253A FI122029B (fi) | 2008-12-30 | 2008-12-30 | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
| FI20086253 | 2008-12-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20086253A0 FI20086253A0 (fi) | 2008-12-30 |
| FI20086253A FI20086253A (fi) | 2010-07-01 |
| FI122029B true FI122029B (fi) | 2011-07-29 |
Family
ID=40240648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20086253A FI122029B (fi) | 2008-12-30 | 2008-12-30 | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8609387B2 (fi) |
| EP (1) | EP2370573B1 (fi) |
| CN (1) | CN102272297B (fi) |
| BR (1) | BRPI0923915B1 (fi) |
| DK (1) | DK2370573T3 (fi) |
| ES (1) | ES2554652T3 (fi) |
| FI (1) | FI122029B (fi) |
| MX (1) | MX2011007142A (fi) |
| PT (1) | PT2370573E (fi) |
| WO (1) | WO2010076388A1 (fi) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112013020264A2 (pt) | 2011-02-09 | 2016-09-20 | Novozymes As | composição de eliminação de boboto, uso da composição de eliminação de borboto, e, micróbio geneticamente modificado |
| JP6188794B2 (ja) * | 2012-06-08 | 2017-08-30 | アンコル インターナショナル コーポレイション | 粉状または粒状組成物との組合せに特に有用な、増加した水溶性を有する視覚的に対照的な美的粒子 |
| CN102787076B (zh) * | 2012-06-18 | 2014-06-04 | 中国科学院微生物研究所 | 一株耐冷玫红假裸囊菌及其在制备冷水纤维素酶中的应用 |
| EP2885406B1 (en) | 2012-08-16 | 2018-10-03 | Bangladesh Jute Research Institute | Cellulose and/or hemicelluloses degrading enzymes from macrophomina phaseolina and uses thereof |
| PT3553172T (pt) | 2012-08-16 | 2023-01-27 | Novozymes As | Método para tratamento de tecido com endoglucanase |
| US9328456B2 (en) | 2012-08-16 | 2016-05-03 | Novozymes A/S | Method for treating textile with endoglucanase |
| WO2014094618A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| WO2014101753A1 (en) | 2012-12-24 | 2014-07-03 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| US9506050B2 (en) | 2012-12-24 | 2016-11-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| US8771993B1 (en) * | 2013-02-12 | 2014-07-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanse activity and polynucleotides encoding same |
| US8778639B1 (en) | 2013-02-12 | 2014-07-15 | Novozymes Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
| MX2016005190A (es) | 2013-10-25 | 2016-08-08 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad endoglucanasa y polinucleotidos que los codifican. |
| CN103589701B (zh) * | 2013-11-18 | 2015-02-04 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种低温纤维素酶及其应用 |
| FR3013731B1 (fr) | 2013-11-22 | 2017-09-01 | Ifp Energies Now | Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations |
| FR3022558B1 (fr) | 2014-06-20 | 2019-01-25 | Proteus | Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations |
| FR3022557B1 (fr) | 2014-06-20 | 2019-01-25 | Proteus | Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations |
| KR20170100495A (ko) | 2014-12-31 | 2017-09-04 | 노보자임스 에이/에스 | 폴리에스테르 직물의 처리 방법 |
| BR112017028065A2 (pt) | 2015-06-26 | 2018-09-11 | Novozymes As | sistema de bioacabamento |
| CN110484462B (zh) * | 2019-07-09 | 2021-03-16 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 申氏杆菌属新物种及其应用 |
| CN110643519A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-03 | 华东理工大学 | ***素高产的南极真菌突变株、其选育方法及其应用 |
| CN111154743B (zh) * | 2020-04-01 | 2021-01-05 | 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 | 突变型纤维素酶及其在玉米青贮中的应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
| JP3681750B2 (ja) | 1992-10-06 | 2005-08-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | セルラーゼ変異体 |
| FR2720902B1 (fr) | 1994-06-09 | 1996-08-23 | Gervais Danone Sa | Produit alimentaire multicouches présentant une couche barrière consommable. |
| CN1182451A (zh) | 1995-03-17 | 1998-05-20 | 诺沃挪第克公司 | 新的内切葡聚糖酶 |
| US6008029A (en) | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
| ATE466934T1 (de) * | 1998-10-23 | 2010-05-15 | Meiji Seika Kaisha | Endoglukanase und zellulase enthaltende präparate |
| CN102766614A (zh) | 2003-12-03 | 2012-11-07 | 明治制果药业株式会社 | 内切葡聚糖酶stce和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品 |
| US7256032B2 (en) | 2005-12-22 | 2007-08-14 | Ab Enzymes Oy | Enzymes |
| MX2008008225A (es) * | 2005-12-22 | 2008-10-01 | Ab Enzymes Oy | Nuevas enzimas. |
| FI120045B (fi) | 2005-12-22 | 2009-06-15 | Roal Oy | Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit |
-
2008
- 2008-12-30 FI FI20086253A patent/FI122029B/fi active IP Right Grant
-
2009
- 2009-12-28 CN CN200980153489.3A patent/CN102272297B/zh active Active
- 2009-12-28 ES ES09836130.6T patent/ES2554652T3/es active Active
- 2009-12-28 US US13/142,609 patent/US8609387B2/en active Active
- 2009-12-28 DK DK09836130.6T patent/DK2370573T3/en active
- 2009-12-28 BR BRPI0923915A patent/BRPI0923915B1/pt active IP Right Grant
- 2009-12-28 PT PT98361306T patent/PT2370573E/pt unknown
- 2009-12-28 EP EP09836130.6A patent/EP2370573B1/en active Active
- 2009-12-28 WO PCT/FI2009/051043 patent/WO2010076388A1/en active Application Filing
- 2009-12-28 MX MX2011007142A patent/MX2011007142A/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI20086253A0 (fi) | 2008-12-30 |
| EP2370573B1 (en) | 2015-10-21 |
| WO2010076388A1 (en) | 2010-07-08 |
| US20110269212A1 (en) | 2011-11-03 |
| PT2370573E (pt) | 2015-12-24 |
| BRPI0923915A8 (pt) | 2017-12-19 |
| CN102272297A (zh) | 2011-12-07 |
| FI20086253A (fi) | 2010-07-01 |
| MX2011007142A (es) | 2011-07-28 |
| BRPI0923915A2 (pt) | 2015-10-06 |
| US8609387B2 (en) | 2013-12-17 |
| BRPI0923915B1 (pt) | 2019-09-10 |
| CN102272297B (zh) | 2014-07-30 |
| EP2370573A4 (en) | 2012-12-12 |
| EP2370573A1 (en) | 2011-10-05 |
| ES2554652T3 (es) | 2015-12-22 |
| DK2370573T3 (en) | 2015-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI122029B (fi) | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö | |
| FI122028B (fi) | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö | |
| EP1969123B1 (en) | Novel enzymes | |
| US7256032B2 (en) | Enzymes | |
| EP3212777B1 (en) | Fungal endoglucanase variants, their production and use | |
| EP2007884B1 (en) | Cellulase fusion proteins and their use | |
| US7981654B2 (en) | Cellulases and their uses | |
| EP1874927A1 (en) | Improved cellulases | |
| JP2001523463A (ja) | 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法 | |
| US7361487B2 (en) | Enzyme fusion proteins and their use | |
| FI119325B (fi) | Uusia endoglukanaasi polypeptidejä ja niiden tuotto ja käyttö |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 122029 Country of ref document: FI |