JP2702924B2 - トリコダーマの形質転換 - Google Patents

トリコダーマの形質転換

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トリコダーマの形質転換に使用するための
ベクターシステム、トリコダーマにおけるタンパク質の
高レベルでの発現及び分泌のための方法、DNA組換え体
ベクター及び形質転換されたトリコダーマ菌株に関す
る。 〔発明の背景〕 繊維状菌類は、種々の発酵生成物を製造するために生
物工学に広く使用される下等真核生物である。菌類は多
くの工業的に重要な酵素、たとえばグルコアミラーゼ、
グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼ、ペクチ
ナーゼ及びクルコセオキシダーゼを分泌する。 繊維状菌類は多くの生物工学的利点を有する。それら
は一般的に高い量のタンパク質を産生し、大規模での培
養では複雑でなく、そして発酵の後、培養液体からの菌
糸体の分離が容易である。 中温性不完全菌類トリコダーマ リーセイ〔以前はT.
ビリデ（Ｔ．viride）〕（参照１）は、セルロースバイ
オマスの転換に必要とされる酵素を産生し、そしてたぶ
ん最っとも広く研究されたセルラーゼ産生生物である。 セルロースのグリコースへの加水分解のためには、３
種のタイプの酵素活性が必要とされる；通常、置換され
た可溶性基質を攻撃し、そして結晶性セルロースに親和
性を示さない、ランダム切断性エンドグルカナーゼ（1,
4−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、EC.3.2.1.
4）；結晶性セルロースを分解することができるが、し
かし誘導体化されたセルロースに対する活性を持たない
セルロビオヒドロラーゼ（1,4−β−Ｄ−グルカン セ
ルロビオヒドロラーゼ、EC.3.2.1.91）及びグルコース
を得るためにセロビオース及びセロ−オリゴ糖を攻撃す
るβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシド グルコヒ
ドロラーゼ、EC.3.2.1.21）。いくらかのこれらの酵素
間の相乗作用が示された（参照２〜４）。 菌類のセルラーゼが精製され、そして特徴づけられ、
そしてすべての３種の主要タイプの酵素は、多種の形で
存在することが示された（参照５）。２つの免疫学的に
異なるセルロビオヒドロラーゼ、すなわちCBH I及びCBH
IIは、T.リーセイの培養培地から検出された（参照4,
6）。５〜８の電気泳動的に異なるエンドグルカナーゼ
が報告され、それらの多くは、基質特異性を変えること
を示した（参照7,8,9,10）。２つの細胞外β−グルコシ
ダーゼの特徴化が報告された（参照11）。 突然変異及びスクリーニングの直接的アプローチを用
いて開発された多くの菌株は、いくつかの高収率のT.リ
ーセイの突然変異株を好結果をもたらして産生した（参
照11〜22）。最良のT.リーセイ突然変異体によって産生
された細胞外タンパク質の量は、培養流体１当り20〜
30gであり、これは合計細胞タンパク質の50％以上であ
る。分泌されたタンパク質の主要部分は、セルラーゼを
含み、そしてその間には、CBH I成分が最っとも豊富で
あり、そして分泌されたセルラーゼタンパク質の60％ま
で示す。 CHB Iのための遺伝子は、Shomakerなど（参照23）及
びTeeriなど（参照24）によってクローンされ、そして
該遺伝子の完全なヌクレオチド配列は公表されている
（参照23）。T.リーセイからまた、主なエンドグルカナ
ーゼEG Iのための遺伝子がクローンされ、そして特徴づ
けられた（参照25,26,27）。他の単離されたセルラーゼ
遺伝子はcbh２（参照28,29）及びegl３（参照30）であ
る。 産業的に重要な戦域状菌類の分子生物学は、一般的に
良く知られていない。これは一部、有性生殖サイクル多
び／又は遺伝的な形質転換システムの不十分な認識によ
る。細菌、形質転換システムが、ネウロスポラ クラサ
（参照31）、A.ニジュランス（参照32,33,34）及びA.ニ
ガー（Ａ．niger）参照35）のために開発され、そして
それらは、ベクター分子によって担持されるそれぞれの
機能性遺伝子により突然変異宿主の相補性においてそれ
らの主成分を一般的に有する。しかしながら、これらの
菌類の中でA.ニガーのみが当座は、産業的興味の対象で
ある。 菌類の分類において、属アスペルジラスは、綱アスコ
マイセティス（Ascomycetes）、サブクラス ユーアス
コマイセティス（Euascomycetes）に含まれる。ユーア
スコマイセティスは、子実体に基づいて３つの群、すな
わちプレクトマイセティス（Plectomycetos）、ピレノ
マイセティス（Pryenomycetes）及びジスコマイセティ
ス（Discomycetes）に分けられる。最っとも重要な属
は、アスペルジラス及びペニシアム（参照56）である。
代わりに、トリコダーマが不完全菌類のメンバーとして
分類される。不完全菌類は、有性生殖又は有性生殖属と
の明確な類似性を持たない菌類、たとえばひじょうに特
徴的なアスペルジラスのキャッチ−オール カテゴリー
である。トリコダーマは、完全なアスコマイセティス種
ハイポクレア（Hypocrea）（参照57）の不完全状態であ
る不十分に定義された生殖段階を有することを報告され
たけれども、属アスペルジラス及びトリコダーマは明ら
かに、分類学上ひじょうに異なると思われる。アスペル
ジラス ニジュランスからのarg b遺伝子及びネウロス
ポラ クラサからのPyr4遺伝子は、非ストリンジェント
条件下でそれぞれのトリコダーマの遺伝子にハイブリダ
イズせず、従ってトリコダーマは他のアスコマイセテス
（Ascomycetes）と進化論的にまったく異なるという考
えを推定できることもまた示された（Vananen,S.,調製
において）。 増殖培地中にタンパク質を分泌する、その例外的能に
よって、トリコダーマ リーセイは、タンパク質の産生
のための可能な宿主として良好な候補者であると思われ
る。しかしながら、これまでは、T.リーセイの遺伝研究
は、該菌類のセルラーゼ産生特性を改良することにほと
んど向けられ、そしてハイパーセルロチック（Hyper−c
ellulotic）トリコダーマ菌株の開発のために使用され
る技術は、単に従来の突然変異生成及びスクリーニング
であった。トリコダーマのための形質転換システムは、
今まで開発されていない。 トリコダーマ リーセイのための有効な宿主−ベクタ
ーシステムを提供し、トリコダーマ中に異質のタンパク
質の高い発現及び分泌レベルを得、又は同質のタンパク
質の産生を高めることが本発明の主な目的である。 本発明の明細書において、表現“トリコダーマに異質
のタンパク質”とは、トリコダーマによって天然に産生
されないタンパク質を意味し、ところが“トリコダーマ
に同質のタンパク質”とは、トリコダーマ自体によって
産生されるタンパク質を意味する。 初めに開発された菌類の形質転換システムにおいて、
すなわちアスペルジラル及びネウロスポラにおいては、
形質転換がプロトプラストを用いて行なわれる。形質転
換性DNAが通常、宿主のゲノム中に組込まれる。安定し
た形質転換体を同定するための選択システムを得るため
には、ベクターシステムが、宿主ゲノムの対応する突然
変異を補足するか、又は特定の増殖培地上での原栄養株
の増殖のために必要な活性、通常酵素を供給する機能的
な遺伝子（選択マーカー）を担持すべきかである。 〔発明の要約〕 本発明は、トリコダーマの形質転換のための組み換え
体DNAクローニングベクターシステムを記載する。このD
NAクローニングベクターシステムが目的とするタンパク
質生成物をコードするDNA配列を含有する場合、本発明
のベクターシステムによるトリコダーマの形質転換は、
形質転換された微生物が適切な培養培地中において増殖
される場合、目的とするタンパク質の高レベルの発現及
び分泌を提供するであろう。 その第１の観点によれば、本発明は、 ａ）目的とするタンパク質生成物をコードする遺伝子、 ｂ）目的とする生成物の発現を制御するために機能可能
的に結合されたプロモーター／エンハンサーを含む遺伝
子発現を促進する機能、 ｃ）場合によっては、目的とする生成物のために該遺伝
子の５′末端の上流に融合されたシグナル／リーダー配
列及び ｄ）選択マーカーを含んで成るベクターシステムを提供
する。 その第２の観点によれば、本発明は、トリコダーマの
形質転換のための方法を提供し、ここで適切なトリコダ
ーマ菌株が本発明のベクターシステムにより形質転換さ
れる。 その第３の観点によれば、本発明は、本発明のベクタ
ーシステムによりトリコダーマを形質転換し、該形質転
換された菌株を適切な培地中で培養し、そして発現さ
れ、そして分泌された生成物を該培地から回収すること
を含んで成る、トリコダーマにおけるタンパク質の産生
のための方法を提供する。 本発明はまた、トリコダーマ中にタンパク質の産生の
ための方法も提供し、この方法によって、ベクターシス
テムにより形質転換されたトリコダーマ菌株は、適切な
培地中で培養され、そして発現され、そして分泌された
タンパク質が該培養培地から回収される。 本発明はさらに、安定して形質転換されたトリコダー
マ菌株を提供する。 本明細書に使用される場合、“ベクターシステム”と
は、宿主ゲノム中に組込まれるべきDNA−情報を共に含
む単一のベクター又はプラスミドもしくは複数のベクタ
ー又はプラスミドを含む。該ベクター又はプラスミド
は、線状又は閉環状分子である。トリコダーマ中におけ
る自己複製プラスミドは現在知られていないが、本発明
はまた、のちに見出されるにちがいない、そのような自
己複製プラスミドも包含する。 本発明のベクターシステムは、プロモーター、エンハ
ンサー及び転写開始部位並びにターミネーターを含む遺
伝子発現を促進する機能をコードするDNA−配列、形質
転換体の選択のためのマーカー及び目的のタンパク質を
モードするDNA配列を含んで成る。 発現された生成物の分泌を確保するために、目的とす
る生成物のための遺伝子は、好ましくは、細胞の分泌路
中に、発現された生成物の有効な方向を確保する前領域
を提供される。この前領域（天然に存在するシグナル又
はリーダーペプチドもしくはその一部である）は一般的
に、分泌の間、目的の生成物から切断され、この後、そ
の成熟した生成物は、培養培地から単離され得る。 目的とする生成物のための遺伝子は、ゲノム遺伝子は
cDNAクローンから得られる。DNA−配列はまた、合成さ
れ得る。 シグナル／リーダー配列は、目的とするタンパク質を
コードする遺伝子のシグナル／リーダー配列に由来し、
又はトリコダーマ又は他の生物源のいづれかからの他の
分泌されたタンパク質のための遺伝子に由来する。トリ
コダーマによって分泌されるタンパク質をコードする遺
伝子に由来するシグナル／リーダー配列の裂は、cbh1シ
グナル配列又はegl1シグナル配列又はその一部である。
トリコダーマに異質の分泌されたタンパク質をコードす
る遺伝子に由来するシグナル／リーダー配列は、アスペ
ルジラスのアミラーゼ又はグルコアミラーゼのための遺
伝子に由来する。また合成シグナル／リーダー配列も使
用され得る。 プロモーターは、トリコダーマ中に転写活性を示すDN
A配列であり、そしてトリコダーマに同質か又は異質の
遺伝子に由来することができる。トリコダーマに同質の
タンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーター
の例は、CBH Iプロモーター又はEG Iプロモーターもし
くはその一部である。トリコダーマに異質のタンパク質
のための遺伝子に由来するプロモーターの例は、アスペ
ルジラスのグルコアミラーゼ プロモーターである。転
写ターミネーターは、プロモーターと同じ源に由来す
る。また合成プロモーター又はターミネーター配列も使
用され得る。 特別に言及されたすべてのDNA配列は、コードされた
生成物の機能に不可欠な塩基の数個を補正又は欠失する
ことによって変性され得ることが理解され、そしてそれ
は当業者にとっては明らかである。たとえば、cbh1又は
egl1シグナル又はプロモーター配列に実質的に類似する
DNA配列は、それらがトリコダーマ中において意図され
た機能を示すかぎり使用され得る。また目的とするタン
パク質のための遺伝子は、これがタンパク質の活性に対
して悪影響を持たないかぎり、変えられ得る。 異なった選択マーカー、たとえばargB（A.ニジュラン
ス又はT.リーセイ）、amdS（A.ニジュランス）及びPyr4
（ネウロスポラ クラサ又はT.リーセイ）が使用され得
る。 宿主菌株は、形質転換方法に使用される選択マーカー
に依存して、原栄養性又は栄養要求性トリコダーマ菌株
である。本明細書の実験部分に示されているように、
Ａ．ニジュランスからのamdSの遺伝子は、原栄養性I.リ
ーセイの形質転換のために使用され得る。T.リーセイの
単一の窒素源としてアセトアミド上で完全に増殖せず、
そしてその増殖は培地上にCsClを添加することによって
さらに阻害され得る。従って、CsClの存在下で単一の窒
素源としてアセトアミド上での増殖は、amdS+形質転換
体を同定するために選択培地として使用され得る。 宿主ゲノムの対応する突然変異を相補する選択マーカ
ーが使用される場合、栄養要求性トリコダーマ突然変異
体が構成されるべきである。栄養要求性トリコダーマ突
然変異体は、突然変異株を産生するための既知方法によ
って製造され得る。 増殖のためのウラシル、トリプトファン又はアルギニ
ンを必要とする栄養要求性トリコダーマ突然変異体は、
Nevalainen（参照36）によって記載されているようにし
て、濾過濃縮技法（filtration enrichment techniqu
e）によって単離された。アルギニン要求性栄養要求体
から、argB遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニン
生合成において異なった中間体によって供給される一連
の最少プレートを用いることによって同定された。ラウ
シル要求性突然変異体から、Pyr4遺伝子を欠失する菌株
を、菌糸体調製物（参照37）においてオロチジン−５′
−ホスフェートデカルボキシラーゼ（OMP decase）の活
性を測定することによって見出すことができる。 trp1遺伝子欠失の突然変異体は、それらの菌糸体にお
けるPRAイソメラーゼ−InGPシンセターゼ活性の欠失に
よって特徴づけられる（参照40）。酵素活性を示さない
突然変異体のtrp1−特性は、たとえばN.クラサのtrp1プ
ラスミド（参照41）又はA.ニジュランスのtrpC−プラス
ミド（参照34）による形質転換及び相補性によって確認
され得る。 使用される形質転換技法は、A.ニジュランスの形質転
換法（参照32,33）から改造された方法である。プロト
プラストは、寒天プレート上で菌糸体を増殖し、そして
Novozym 234の緩衝溶液中に菌糸体を懸濁することによ
り既知の方法によって調製される。従来のNovozym 234
のスクロース溶液の代わりに、ソルビトール溶液が好都
合に使用され得る。次に、本発明の実験部にさらに詳し
く記載しているようにして、形質転換性DNAが前記プロ
トプラスト溶液に添加される。形質転換は普通、同時形
質転換として行なわれ、それによって、選択不可能なプ
ラスミドがもう１つのプラスミド中に挿入される選択可
能なマーカー（たとえばp3SR2中へのamdS又はpSa143中
へのargB）を用いて高頻度でT.リーセイ中に同時形質転
換される。等モル量のDNAが形質転換のために使用され
る場合、高い割合の形質転換体が、ゲノム中に組込まれ
た選択不可能なプラスミドを含む。argB -T.リーセイ菌
株が、等モル量のプラスミドp3SR2及びpSa143による形
質転換に使用される場合、形質転換体を、二重選択培地
（最少培地、アセトアミド、CsCl）上に得ることができ
る。他方の、単鎖のプラスミドは、形質転換のために使
用され得、ここでまた、マーカーが挿入される。 次に、形質転換体は、適切な培地中で培養される。単
純な培地中に目的とする生成物を産生することができる
ためには、グルコース誘導性プロモーターが使用され
る。トリコダーマが１％グルコースを含む培地上で増殖
される場合、プロテアーゼを含む、すべての細胞外タン
パク質の分泌が強く抑制される。目的とする酵素をコー
ドする遺伝子がグルコース含有性培地中において強く発
現されるプロモーターに連結される場合、目的とする酵
素は増殖培地に分泌される。他のタンパク質はこれらの
条件下で産生されないので、目的とする酵素は、培地中
に分泌される主なタンパク質である。 菌類の菌糸体が除去される場合、目的とするタンパク
質は、種々の純粋な形でその得られた溶液に存在する。
必要により、それはさらにひじょうに容易に、精製され
得る。なぜならば、それはほとんどタンパク質のみであ
るからである。 本発明はまた、宿主生物のある酵素活性を産生する遺
伝子を変性又は不活性化するためにも使用され得る。例
としては、セルラーゼ−陰性T.リーセイ菌株が構成され
得る。この突然変異生成は、欠失されたセルラーゼ遺伝
子を担持するプラスミドによるトリコダーマ リーセイ
の形質転換に基づかれる。染色体セルラーゼ遺伝子産で
のプラスミドの同質組換えは、内在性T.リーセイ セル
ラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こす。形質転換の
ために使用されるプラスミドは、セルラーゼコード領域
の一部のみを含み、そして不活性タンパク質を産生す
る。５′を末端とする配列は含まれない。フレームシフ
ト変異がまた、切断されたコード領域に導入され得る。
選択マーカー（argB）又はスクリーニングのためのマー
カー（lacZ）が形質転換のために使用されるプラスミド
に連結され得る。組換えの後、マーカーは、２種の得ら
れらた欠陥性セルラーゼ遺伝子の間に、配置されるであ
ろう。その方法の原理は第１図に示される。 本発明は、キモシン及びトリコダーマ リーセイのエ
ンドグルカナーゼＩ（EG I）によって例示される。プロ
モーター、シグナル及びリーダー並びにターミネーター
配列は、アスペルジラス ニガーからのグルコアミラー
ゼ遺伝子又はトリコダーマ リーセイのcbh1遺伝子のい
づれかに由来した。選択マーカーとして、A.ニジュラン
スからのamdS遺伝子が使用された。 材 料 プラスミド： p285:ATCC 20681 pCAMG91:参考文献59 piC19R:参考文献60 pSa143:参考文献51＋54 p3R2:参考文献33＋35 pDJB2:参考文献38 pMC1817:参考文献46 pTT01,pTT11:参考文献28 pUC9,pUC13:参考文献61 pUC18,pUC19:参考文献58 pTZ19R:（Pharmacia） pAN5−41B:参考文献62 菌株： Ｅ．コリ（Ｅ.coli）株、JM101,JM103,JM109及びDHI
（参照59）がＥ．コリ クローニングにおいて宿主とし
て使用される。トリコダーマ リーセイ菌株QM9414（AT
CC 26921）及びRUT−Ｃ−30（ATCC 56765）が菌類の形
質転換及び発現研究に使用される。 トリコダーマの最小培地： グルコース 20g （NH4）2SO4 5g KH2PO4 15g MgSO4 0.6g CsCl 0.6g FeSO4,7H2O 5mg MnSO4,H2O 1.56mg ZnSO4,7H2O 1.4mg CoCl2 2mg/1H2O 実 験 例 １ 栄養要求性T.リーセイ突然変異菌株の誘導、濃縮及び単
離。 増殖のためにウラシル、トリプトファン又はアルギニ
ンを必要とする栄養要求性突然変異体を、Nevalainen
（参照36）によって記載されているようにして、濾過濃
縮法に用いて単離する。使用される突然変異誘発剤は、
紫外線である。アルギニン要求性の栄養要求体から、ar
gB遺伝子を欠失する突然変異体が、アルギニン生合成に
おいて異なった中間体によって供給される一連の最少プ
レートを用いることによって同定される（参照36）。増
殖のためにシトルリンを必要とする突然変異体は、可能
性あるargB −突然変異体として考慮される。単離された
突然変異体のargB-特性は、A.ニジュランスのargB遺伝
子（例４）を含むプラスミドpSa143を用いて原栄養体中
にそれらを形質転換することによって確認される。 ラウシル要求性突然変異体から、pyr4遺伝子を欠失す
る菌株が捜し求められる。 これらの突然変異体から、Pyr4 −特性を、N.クラサの
Pyr4遺伝子（参照38）を含むプラミドによる形質転換に
よって確認した。 例 ２ プロトプラストの調製。 菌糸体をポテトデキストロース寒天プレート（Difc
o）上のセルファン ディスク上で増殖する。５枚のセ
ルファン培養物からの菌糸体を、0.1Mリン酸カリウムに
よりph5.6で緩衝化された、1.2Mソルビトール中Novozym
234の5mg/ml溶液15ml中に懸濁する。その混合物を30
℃で1.5〜２時間、インキュベートする。焼結ガラス濾
過（多孔度１）により菌糸体破壊物からプロトプラスト
を分離し、4000gで５分間ペレット化し、そして1.2Mソ
ルビトール−10mMのTris,HCl（pH7.5）溶液により２度
洗浄する。 プロトプラストのより良好な精製は、Tillburnなど
（参照33）によって記載された方法を用いることによっ
て達成され得る。pH5.8で緩衝化された、1.2MのMgSO
4中、Novozym 234の5mg/ml溶液を、プロトプラスティ
ングのために使用する。インキュベーション及び濾過の
後、そのプロトプラスト懸濁液を、0.6Mソルビトール−
100mMのTris,HCl（pH7.0）の等体積と共に4000gで15分
間、遠心分離する。プロトプラストは、管の中間に鋭い
バンドを形成する。そのプロトプラストを、1.2Mソルビ
トール−10mMのTris,HCl溶液（pH7.5）１体積中に懸濁
し、回転沈殿せしめ、そして1.2Mソルビトール−10mMの
Tris,HCl溶液（pH7.5）により２度洗浄する。そのプロ
トプラストを、５×106〜５×107個のプロトプラスト/m
lの濃度で、1.2Mソルビトール10mMのCaCl2−10mMのTri
s,HCl溶液（pH7.5）中に懸濁する。 プロトプラストの生存率を、浸透圧安定剤として1Mソ
ルビトールを含むトリコダーマの最少培地上で評価す
る。その再生頻度は、菌株QM9414（ATCC 26921）のため
には40〜80％である。 例 ３ A.ニジュランスのアセトアミダーゼ（amdS）を用いてT.
リーセイの形質転換。 プラスミドp3SR2を、形質転換に使用する。それは、
完全なアセトアミダーゼ構造遺伝子amdS及びその調節領
域amd Iを担持するＡ．ニジュランスDNAを含む（参照45
及び33）。 形質転換性DNA20μ（４〜10μｇ）を、プロトプラ
スト溶液200μ中に添加する。25％PEG 6000−50mMのC
aCl2−10mMのTris,HCl溶液（pH7.5）50μを添加し、
そしてその混合物を、氷上で20分間、インキュベートす
る。PEG溶液2mlを添加し、そしてその混合物を、室温で
さらに５分間、インキュベートする。1.2Mソルビトール
−10mMのCaCl2−10mMのTris,HCl溶液（pH7.5）4mlを添
加し、そしてそのプロトプラストを３％寒天表面上にプ
レートする。その選択培地は（NH4）2SO4の代わりに単
一の窒素源として10mMアセトアミドを有するトリコダー
マ最少培地であり、そして浸透圧安定剤として1Mソルビ
トール及びバックグラウンド増殖を抑制するために12.5
mMのCsClにより補充される。 40〜600個の形質転換体/DNAμｇの形質転換頻度を、
菌株QM9414（ATCC 26921）のために得る。最っとも高い
頻度は、DNAが２サイクルのCsCl/エチジウムブロミド遠
心分離により精製される場合に得られる。 胞子形成は選択培地上ではめったに観察されないが、
しかしポテト デキストロース寒天に移される場合、通
常、その形質転換体は胞子形成する。アセトアミド上で
増殖するそれらの能力は多様である。選択培地上でのコ
ロニィーの直径は、1mm以下から10〜20mmの範囲であ
る。 形質転換体の有糸***安定性を調べた。種々のサイズ
の10個の大きな形質転換体を、アセトアミド−CsClプレ
ート上に継代培養し、ポテト デキストロース（PD）上
に胞子形成し、そしてPD上に再プレートした。ヘテロカ
リオシスによって引き起こされた異質性（heterogeneit
y）を除くために、１つの胞子から生まれる個々のコロ
ニィーをAmdS+表現型について試験した。おのおのの元
の形質転換体からの１つの陽性クローンを、非選択性培
地上で連続プレーチング（５増殖サイクル）にゆだね、
そしておのおのの世代の後、表現型を選択培地上で試験
した。１つのサイクルの後、10個の大きな形質転換体を
非選択培地上で試験し、その10個の形質転換のうち６個
は100％のAmdS+分生子を与え、３個は47〜87％の分生子
を与え、そして１つの形質転換体は、AmdS+分生子を与
えなかった。この結果は、５つの非選択性増殖サイクル
を通して同様のままであり、初めの不安定なAmdS+表現
型が後で安定化され得ることを示唆した。 元の10個の小さなコロニィーのうち、３個は、種々の
頻度のAmdS+表現型を有する胞子を与えた（94％,44％及
び５％の胞子）。他の７個のクローンは、アセトアミド
上で増殖し得ない胞子のみを与えた。興味あることに
は、得られたすべてのAmdS+は、大きなコロニィーの形
質転換体の特徴を有する、活発な増殖をアセトアミドプ
レート上で示した。 形質転換体におけるプラスミドDNAの存在を全DNAのサ
ザン法によって分析し、形質転換体から単離し（Raeder
及びBrodaに従って、参照44）、Xho I又はSal I及びEco
R Iにより切断した。ベクターpUC18及びプラスミドp3SR
2のamdS遺伝子を含むSal I−EcoR Iフラグメントを、プ
ローブとして使用する。その形質転換体は、トリコダー
マのゲノムDNA中の多くの異なった部位で、すなわちゲ
ノム当り１〜数個のコピィーでの組換えによって生じる
ことが示された。 例 ４ A.ニジュランス及びN.クラサのプラスミドによるT.リー
セイの形質転換。 異質DNAによる栄養要求性突然変異の相補性をT.リー
セイにおいて示す。A.ニジュランスからのargB遺伝子を
含むプラスミドpSa143を使用して、T.リーセイのargB −
突然変異体株を形質転換する。N.クラサからのpyr4遺伝
子を含むプラスミドpDJB2を用いて、T.リーセイのpyr4
−突然変異体株を形質転換する。その形質転換体を、ア
ルギニン又は30μg/mlウラシルを含まない最少培地上で
それぞれ選択した。両者の場合の形質転換の頻度は、約
300個の形質転換体/DNAμｇである。 染色体DNAを、その形質転換体から単離し、そしてサ
ザン ハイブリダイゼーション実験のために使用し、T.
リーセイの染色体DNA中へのプラスミドDNAの正しい組込
みを確めた。 複数のタンデムコピーのpSaL143をゲノム中に組込ん
だ。サザン及びドット ブロット ハイブリダイゼーシ
ョンは、分析された形質転換において、ArgBのコピー数
がおよそ２〜100以上異なることを示した。argB ＋形質
転換体は、少なくとも３世代を通して、表現型的に100
％安定していることが示された。これは、完全培地上で
５個の形質転換からの分生子の連続プレーチングによっ
て試験し、そしてその後、最少培地（50〜80個のコロニ
ィー／形質転換体）上でArg+表現型を試験した。 例 ５amdS 及びargBプラスミドによるT.リーセイの同時形質転
換。 非選択性プラスミドによりトリコダーマを同時に形質
転換するための可能性は、アルギニン栄養要求性変異体
により最初に示された。 argB -T.リーセイ株を、等モル量のA.ニジュランスプ
ラスミドpSa143（argB）及びp3SR2（amdS）により形質
転換し、形質転換体をArg+表現型について選択し、そし
てアセトアミド−CsCl−プレート上で画線培養すること
によってamdSの取得について試験した。ArgB形質転換体
のうち、86％がまたAmdS+であった。同時形質転換体の
サザン分析は、両プラスミドが、ゲノム中のいくつかの
異なった位置に種々の量のコピーとして組込まれたこと
を指摘した（データは示されていない）。 アセトアミド−CsCl最少培地上での二重選択は、DNA
μｇ当り約100個のAmd+Arg+形質転換体及びamdS形質転
換の特徴を示す多くの小さなコロニィーをもたらした。 argB amdS同時形質転換体のArgB+表現型の安定性を
試験する場合、５個のうち３個が100％安定していると
判明され、ところが他は、分析された子孫の７％又は80
％においてArgB+特性を失っていた。同じ個々のコロニ
ィーはまた、AmdS+表現型も失なっていた。この不安定
性が、たとえば、同じ染色***置へのamdSと共にargBの
同時組込みによって引き起こされたかどうかは、知られ
ていない。 Ｅ．コリのlacZ遺伝子を含むプラスミドpAN5−4IBが
プロモーターに位相が一致して結合し、そしてA.ニイジ
ュランスのグリセルアルデヒデホスフェート デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（gpd）（参照62）のＮ−末端タンパク
質コード領域をまた同時形質転換のために使用した。さ
らに、このプラスミドは、A.ニジュランスのargB遺伝子
及びpBR322配列含む。原栄養性T.リーセイ（QM9414）
を、プラスミドp3SR2（amdS）及びpAN5−4IBにより同時
形質転換し、形質転換体をAmd+表現型について選択し、
そしてXgalを含むアセトアミドCsCl−プレート上でβ−
gal発現についてスクリーンした。グルコースが培地中
に存在し、そしてXaglプレートのpHが中性である場合、
内在性T.リーセイのβ−ガラクトシダーゼ活性は検出さ
れ得なかった。 １〜４日の増殖の後、青色が見られた。1.0/0.7のモ
ル比のプラスミド（p3SR2/pAN5−4IB）を形質転換に使
用する場合、13％の大きなAmd+クローン及び６％の小さ
なAmd+クローンがβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、そ
して1.0/2.6モル比で、39％及び７％のXgal+クローンが
それぞれ得られた。青色を示すAmd+形質転換体における
両プラスミドの存在は、サザンハイブリダイゼーション
によって確められた（データは示されていない）。 例 ６cbh １ トリコダーマ リーセイ株の構成。 記載された方法による異なったセルラーゼ遺伝子の活
性化は、特定の組合せのcbh1-株を産生する一連のT.リ
ーセイ株の構成を可能にする。cbh1-株または、cbh１プ
ロモーターを用いる場合、異質タンパク質の有効な産生
のためにも重要である。トリコダーマ リーセイ株QM94
14（ATCC 26921）は、cbh１特異性プローブを用いるサ
ザン ハイブリダイゼーションによってcbh１遺伝子の
１つの染色体コピーのみを含むことが示され、そしてそ
の結果、１回の組換え結果が、その遺伝子を不活性化す
べきである。不活性遺伝子を次のようにして構成した。
ベクターpUC8中のcbh１遺伝子の完全な長さのcDNAクロ
ーンを含むプラスミドpTT01（参照27）を、制限酵素Bgl
I及びBgl IIにより切断した。cbh１遺伝子の５′末端
領域からの0.8Kbフラグメントを、従来の技法によっ
て、アガロースゲルから単離した。そのフラグメント
を、S1ヌクレアーゼを用いてブラント末端化し、そして
それを、EcoR Iにより切断され、ブラント末端化された
pUC18ベクターに連結し、そしてE.コリ JM109に形質返
還した。cbh１遺伝子フラグメントを含むクローンから
のDNAを単離し、そしてcbh１のBgl I−Bgl IIフラグメ
ントの中間を切断する制限酵素EcoR Iにより消化した。
EcoR Iにより生成された末端をフィルインし、そしてバ
ック連結した。切断されたcbh１遺伝子フラグメントの
中間にフレームシフト変異を含むプラスミドpMS4を得た
（第２図）。 トリコダーマを、プラスミドpMS4及び３〜４倍のモル
過剰のプラスミドpM4と共にプラスミドp3SR2を含むA.ニ
ジュランス amdSにより同時形質転換した。 形質転換体を、例３に記載しているようにしてamdS ＋
表現型に基づいて選択し、そして単一の炭素源としてア
セトアミドを含む選択培地上で精製した。精製された形
質転換体を、炭素源として１％SolKa floc セルロース
及び窒素源として0.2％プロテオースペプトンを含むト
リコダーマ最少培地200μのマイクロタイタープレー
ト上で増殖した。そのセルラーゼ表現型を、参照59に記
載しているようにしてCBH I特異的抗血清（羊）に対す
る希釈されていない増殖培地を用いるオクテルロニーの
免疫拡散によって試験した。多くの形質転換体（正常な
量のCBH IIIを産生するが、しかし検出できるCBH Iを産
生しない）が同定された。 例 ７ I.プロモシン遺伝子を含むプラスミド285′proCの調製
（第３図）。 T.リーセイにおける異質タンパク質の例として、本発
明者は、プロキモシンcDNAを発現することを選択した
（第３図）。プレプロキモシン遺伝子を子牛の胃のcDNA
ライブラリィから単離し、そしてＧ−Ｃテイリング（参
照49及び50）によってpBR322のpst1部位中に挿入し、pR
26を得た。pUC9をSal Iにより切断し、そしてクレノウ
ポリマラーゼにより補充し、そしてT4リガーゼにより連
結した。その得られたプリスミドをBamH I−EcoR Iによ
り切断し、そして2.7Kbの大フラグメントを、pR26から
の0.47KbのBamH I−EcoR Iフラグメントと連結し、プロ
キモシン遺伝子のＮ−末端にHind III部位を含むpUC9′
を得た。pUC13をBamH I−Nar I及びNar I−Xma Iにより
切断し、そしてそれぞれ大小のフラグメントをpR26の0.
64KbのXma I−Bcl Iフラグメントと連結し、プロキモシ
ン遺伝子のＣ−末端のXba I−部位を含むプラスミドpUC
13′を得た。pUC13′からの0.65KbのXam I−Xba Iフラ
グメントを、第５図に示されているようにしてpU9′の
0.46KbのHind III−Xma Iフラグメント及びp285の11Kb
のXba I−Hind IIIフラグメントと連結し、プロキモシ
ン遺伝子を含むプラスミドp285′proCを得た。 II.プラスミドpAMG/Termの構成。 pCAMG91をSal I及びPst I制限エンドヌクレアーゼに
より消化する。そのような消化物から698bpのフラグメ
ントをアガロースゲル上に単離した。このSal I−Pst I
フラグメントは、グルコアミラーゼmRNAの140bp3′非翻
訳部＋540bpの３′〜ポリ（Ａ）付加部位をコードする
領域を含む。Xba Iリンカーの添加及びXba I制限酵素に
よる消化の前、この３′フラグメントをT4−DNAポリマ
ラーゼにより処理し、その制限部位を“ブラント末端”
にした。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端を、Xb
a Iにより線状にされたpUC13に連結し、グルコアミラー
ゼ遺伝子poly（Ａ）付加領域を含むプラスミドｐAMG/Te
rmを得た。 III.プラスミドpMT837の構成。 プロモーター及びグリコアミラーゼ（AMG）シグナル
及びリーダーペプチドをコードする配列を含むpCAMG91
の0.5KbのSma II−BssH IIフラグメントを、Sma I−Bam
H Iにより消化されたpUC13及びプロキモシンの最初の６
個のアミノ酸をコードする合成BssH II−BamH Iアダプ
ターに連結した。この得られたプラスミド、pMT626か
ら、0.8KbのNde I−BamH Iフラグメントを単離し、そし
てproCのＮ末端半分についての配列を含むp285′proCか
らの0.5kbのBamH I−EcoR Iフラグメント及びproCにつ
いての配列のＣ末端部を含むpMT622の3.0KbのEcoR I−N
de Iフラグメントに連結した。（pMT622は単に、pUC13
においてp285′proCのEcoR I−Xba Iサブクローンであ
る）。その得られたプラスミドpMT648（第４図を参照の
こと）は、完全なプロモキシン遺伝子、その先にAMGプ
ロモーター及びシグナル／リーダーコード配列を含む。
pMT648は、A.ニジュランスのargB遺伝子を含むようにさ
らに変性された（参照51）。1.8KbのNar I−フィルイン
されたpMT648のXba Iフラグメントを、6.8kbのCla I−
フィルインされたpSal43のEcoR Iフラグメントに連結
し、pMT651を得た。AMGプロモーターのさらに上流の配
列（上流の活性化配列;UAS）をさらに挿入した。これ
は、元のクローンpCAMG91からの3.7KbのCla I−BssH II
フラグメントを、proC配列を含むpMT648からの1.1KbのB
ssH II−フィルインされたXba Iフラグメント及びpMT81
3からの3.1KbのCla I−フィルインされたEcoR Iフラグ
メントとしてargB遺伝子（pMT813は、EcoR V−Bgl IIに
より切断されたpiC19R中にクローンされた3.1KbのBamH
I−Nru IフラグメントとしてクローンされたargB遺伝子
である）に連結することによって達成された。その得ら
れたプラスミドpMT830は、AMGからのUAS、プロモータ
ー、シグナル及びリーダー配列及びporCのための完全な
遺伝子を含む発現ユニットを有する。最後に、AMGのタ
ーミネーター配列は、プラスミドpAMG/Termから0.6Kbの
Xba I−Xba Iフラグメントとして取られ、そしてXba I
により切断され、そして脱リン酸化されたpMT830中に挿
入され、pMT837が得られた。pMT837の構成が第５図に例
示される。 例 ８ pMT837を用いてキモシンの産生。 T.リーセイ株QM9414及びRUT−Ｃ−30を、プラスミドp
MT837及びp3SR2により同時形質転換した。プラスミドpM
T837は、プロキモシン遺伝子の先にAMGプロモーター及
びシグナル／リーダー配列を含む。プラスミドpMT837の
構成法は例７に記載されている（また第３〜５図を参照
のこと）。同時形質転換及び選択を例５におけるように
して行なった。 キモシン産生のためには、１％Solka flocセルロース
及び0.2％プロテオースペプトンを含む最少培地上で形
質転換体を培養した。 その菌糸体を集め、そして必要な場合、TCA沈殿法に
よってその上清液を濃縮し、そして2MのNaOH、10mMのTr
is溶液（pH8.5）中に希釈した。そのサンプルをSDS−ペ
ージ（7.5％〜15％のポリアクリルアミドグラジェン
ト）上で分別し、そしてニトロセルロースフィルターに
エレクトロブロットした。そのフィルターを、ウサギプ
ロキモシン抗血清と共にインキュベートし、そしてシグ
マから購入されたα−ウサギ−IgG−ペルオキシダーゼ
接合体を用いて４−クロロ−１−ナフトールにより染色
した。 キモシンは、および１μg/のレベルで培地中に分泌
されることを示された。AMGプロモーターは、明らかに
T.リーセイにおいて非能率的に機能するので、相同のT.
リーセイプロモーター−ターミネーターベクターが、キ
モシンの産生レベルを改良するために構成された。 例 ９ cbh1プロモーターを用いて、T.リーセイ中において子牛
プロキモシンの産生のための異質発現ベクターの構成。 I.cbh１ターミネーター領域へのプロキモシン遺伝子の
連結。 子牛プロキモシ遺伝子を、プラスミドpR27から得た
（第６図）。ほとんど全体の遺伝子を含むPst I−Pst I
フラグメント（約1110bp）を、従来の技法によってアガ
ロースゲルから単離し、そしてpUC19のPst1部位に連結
した。 このプラスミドをPst Iにより一部消化し、末端をS1
ヌクレアーゼによりブラント化し、そしてcbh１遺伝子
（クレノウフラグメントによるブラント末端）のAva II
ターミネーターフラグメント（〜750bp）をこのプラス
ミドに連結した。cbh１遺伝子のターミネーター領域
を、pBR322（参照24）中にサブクローンされたcbp1 cDN
Aの末端の1.8KbBamH Iフラグメントから得た。pUC19に
おいて、cbh１遺伝子のターミネーター領域と連結したp
roCフラグメントを含むこのプラスミドをpAMH100（第７
図）と言及した。 II.Bal I−Sac IIアダプターを用いて、CBH Iプロモー
ター領域及びプロキモシンコード領域の融合。 プロキモシンのＮ−末端領域をコードするSac II−Ps
t Iフラグメント（80bp）を、プラスミドpR27（第６図
を参照のこと）から単離した。ゲノムクローンλ44Aか
らcbh1プロモーター領域をまず、2.8Kbの長さEcoR I−E
coR IフラグメントとしてpUC18（プラスミドpUA01、第
８図）中にサブクローンし、そして次に約2.2Kbの長さ
のEcoR I−Bgl Iフラグメントをこのサブクローンから
単離した。Bal I部位は、cbh1遺伝子のシグナル配列の
中間に配置される。cbh1遺伝子のプロモーター及びシグ
ナルペプチドのコード領域の約半分を含む、約2.2Kbの
長さのEcoR I−Bgl Iフラグメントの約80bpのSac II−P
st Iプロキモシン フラグメントへの正確な連結は、Bg
l I−Sac IIアダプター（NOR202＋NOR203、第10図）に
よって仲介される。アダプターと共にこれらのフラグメ
ントを、EcoR I−Pst Iにより消化されたpUC19中に連結
した。このプラスミドは、プロキモシンの第１アミノ酸
に融合されたCBH Iの完全なシグナル配列、次にそのＮ
−末端配列のいくらかをコードする。最後に、この構造
体からEcoR I−ｐcbh1ss−proC−Pst Iフラグメントを
単離し、Sal I及びPst Iにより消化されたpAMH100中に
その３′末端から連結した。そのフラグメントの５′末
端及びプラスミドpAMH100のEcoR I末端をクレノウによ
りフィルインし、そして連結した。cbh１遺伝子のプロ
モーター多びproＣ′フラグメントを、cbp１ターミネー
ター領域の前の′proCの前に移した。この構成体を、pA
MH102（第11図）と名付けた。 III.クロモシン発現プラスミドへの選択マーカーの付
加。 発現プラスミドおよび選択マーカーとして、A.ニジュ
ランスのamdS遺伝子（参照42,30）又はA.ニジュランス
のargB遺伝子（参照48）にいづれかを使用することがで
きる。 amdS遺伝子を、p3SR2からPvu I−Sal Iフラグメント
として単離し、そしてpAMH102の6Kbの長さのPvu I−Sal
Iフラグメントに連結する。 この選択可能なベクターを、pAMH104（第11図）とし
て命名した。 IV.オリゴヌクレオチドを用いてcbh1プロモーター及び
プレロキモシンコード酸列の正確な融合。 プレプロキモシンのアミノ末端Pst Iフラグメント
（約150bp）を、pBR322においてPst I部位に挿入された
ATGから12bp上流で始まる、完全なプレプロキモシンcDN
Aクローンを含むpR26（第３図）から単離した。このフ
ラグメントを、pTZ19Rのポリリンカー中に、cbh I（第
８図）のシグナル配列のコードする領域も含む、cbh I
EcoR I−Sac I（約2.6Kb）プロモーターフラグメントと
共にサブクローンした。cbh I EcoR I−Sac Iフラグメ
ントを、元のλ44Aクローン（参照24）の、pUC18（pUA0
1、第８図）における2.8KbのEcoR I−EcoR Iサブクロー
ンから得た。pTZ19R（Pharmacia）は、複製のF1起源及
びオリゴヌクレオチドの突然変異生成のために単鎖鋳型
の使用を可能にするT7プロモーターを含む、pUC19基礎
プラスミドである。この得られたプラスミド（pAMH10
5）の構成法は第８図に例示されている。このプラスミ
ドから、cbh１プロモーター領域とproC ATGとの間の配
列を、特定のオリゴヌクレオチド、OAMH3（第10図）を
用いてループ−突然変異生成によって削除した。オリゴ
ヌクレオチド指図の突然変異生成の実施は第９図に例示
されている。問題のオリゴヌクレオチドをリン酸化し、
それぞれモル比20:1でpAMH105の単鎖DNA（参照60、単鎖
DNAは、Pharmaciaによって記載されているようにしてJM
103/pAMH105から単離された）にアニールした。オリゴ
ヌクレオチド プライマーを、参照60に記載しているよ
うにしてクレノウポリマラーゼ及びT4リガーゼを用いて
延長した。その延長された混合物を、Sma I（pTZ19Rの
ポリリンカーに存在する、第９図を参照のこと）により
消化し、その後、E.コリのmutL不適正修復欠失性株、BM
H71.18中に形質転換した。形質転換体のプールを、5ml
の液体培養（100μg/mlのアンピシリンを含む、参照62
に記載のようなLuriaブイヨン）中で１晩増殖した。プ
ラスミドDNAを、形質転換体のプールから単離し、そし
てそれをSma Iにより再消化し、そしてE.コリ JM109株
中に再形質転換した。可能性ある欠失クローンのスクリ
ーニングを異なった。制限酸素を用いる消化によって行
ない、そして欠失の特異性をさらに、配列決定すること
によって確認した。その得られたプラスミドをpAMH1101
（第12図）と呼ぶ。このプラスミドを、さらにEcoR I及
びPst Iにより消化し、そしてその得られたpcbh１−pre
proCフラグメントを単離し（第14図）、そしてPst I及
びSal Iにより消化されたpAMH100プラスミドにそのPst
I末端で連結した。その得られた連結フラグメントの末
端を、クレノウによってフラントし、そして連結した。
その得られたプラスミドをpAM101と呼び、そしてそれ
は、プロキモシンのシグナル配列に融合されたcbh1のプ
ロモーター及びcbh1遺伝子のターミネーター領域に融合
された全プロキモシンコード領域を含む（第14図）。 V.オリゴヌクレオチドを用いることによって行なわれた
シグナル配列融合による、cbh1プロモーター及びprepro
C遺伝子の正確な融合。 前のチャプターIVに詳しく記載されたpAMH101の構成
と本質的に同じようにしてプラスミドpAMH1103（第12
図）の構成を行なった。但し、この構成のために使用さ
れた特異的オリゴヌクレオチドはOAMH1（第10及び９
図）であった。その得られたプラスミドpAMH1103は、pr
oC遺伝子のコード領域のアミノ末端部分（〜140bp）の
先のpreproCシグナル配列からのaa12〜16に融合され
た、cbh１シグナル配列からのアミノ酸（aa）１〜12を
含むシグナル配列融合体を含む（第12図）。プラスミド
pAMH1103からのｐcbh１−sso−proＣ′（０＝融合）フ
ラグメントを、本質的に前のチャプターIVに記載してい
るようにしてpAMH100にサブクローンした（第12図を参
照のこと）。この得られたプラスミドpAMH103は、chb１
ターミネータ領域に融合されたproCコード領域の先のcb
h１のプロモーター領域及びcbh１及びpreproＣのシグナ
ル配列融合体を含む。 VI.オリゴヌクレオチドを用いることによるproＣのコー
ド領域へのcbh１コード領域の正確な融合。 プラスミドpAMH1106（第13図）の構成を、本質的に前
のチャプターIVに詳しく記載されたpAMH1101の構成と同
じようにして行なった。但し、この構成のために使用さ
れた特異的オリゴヌクレオチドはOAMH2（第10及９図）
であった。cbh１のプロモータ領域、cbh１のシグナル配
列及びporCのコード領域に融合された、成熟CHB Iの初
めの１〜20のaaのコード領域を含むその得られたプラス
ミドpAMH1106からの、ｐobh１成熟ｏ−porC′を含むフ
ラグメントを、本質的に前のチャプターIVに記載してい
るようにしてpAMH100中にサブクローンした（第12
図）。その得られたプラスミドpAMH106は、cbh１のプロ
モーター領域、cbh１のシグナル配列、proＣのコード領
域に融合された成熟CBH Iのアミノ酸１〜20のコード領
域を含む。 例10 pAMH102及びpAMH104を用いてキモシンの産生。 T.リーセイ株QM9414及びRUT−Ｃ−30を、それぞれ5:1
のモル比でラスミドpAMH102及びp3SR2により同時形質転
換した。プラスミドpAMH102の構成法は例９のチャプタ
ーIIに記載された。同時形質転換及び選択を例５におけ
るようにして行なった。その形質転換体を、例３に記載
されたようにして、選択性アセトアミドプレート上で精
製した。 キモシン産生のために、形質転換体を、１％Solk flo
c セルロース及び0.2％プロテオースペプトンを含む最
少培地（10〜50ml）上で培養した。その菌糸体を集め、
そしてその上清液をTCAを沈殿法によって濃縮し、そし
て2MのNaOH、10mMのTris（pH8.5）の溶液中に希釈し
た。その菌糸体を液体窒素の存在下で破壊し、その破壊
された細胞をペレット化し、そしてその上清液を、前記
培養培地と同じ方法で処理した。そのサンプルを、SDS
−page（7.5％〜15％のポリアクリルアミド グラジェ
ント）上で画分し、そしてニトロセルロースフィルター
にエレクトロブロットした。そのフィルターを、ウサギ
プロキモシン抗血清及びα−ウサギ−IgG−AP（アルカ
リホスファターゼ）接合体と共にインキュベートし、そ
してPromega Biotecから購入されたニトロプル−テトラ
ゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
により染色した。菌糸体の内部及び外部のキモシンの量
を比較した（第17図）。菌糸染色体DNA中に組込まれた
プラスミドpAMH102の高い数のコピィーに含むクローン
がまたよりキモシンを産生したことが、サザン ハイブ
リダイゼーションによって示された。１つのコピィーの
形質転換体を用いつ場合、分泌されたキモシンの量は１
の培養培地当り100μｇであった（ウェスターンゲル
から近づいた場合）（第17図）。分泌されたプロキモシ
ンは、ウェスターンゲルによって及び凝乳活性（β−カ
セイン決定基の切断によるキモシン凝乳）によって活性
キモシンにプロセスされることが示された（参照63）。
菌糸体の内部の種々の形のキモシン（preproC,proC,C及
び細胞の内部の分解精製物に由来したキモシン）の量
は、菌糸体の合計タンパク質の0.04％であることが測定
され（第17図）、そして分泌されたキモシンの量は、産
生された合計キモシンの60％であった。これは菌糸体の
外部でさえ異質遺伝子生成物を分泌するT.リーセイの能
力を示す。 プラスミドpAMH104（第11図）のいくつかのコピィー
を有する形質転換体（多量のプロキモシンを分泌でき
る）を、増殖培地の凝乳活性を決定することによって、
スクリーンした。研究された40のうち最良の形質転換体
は、ウェスターンゲル上で及び凝乳活性によって測定さ
れる場合、培養培地１当り500μｇを分泌することが
見出された。 培養物が小規模な培養（10〜50ml）と比べて、51ラボ
ラトリィファーメンター中において増殖される場合、分
泌される、活性キモシンの量は、200倍増大されるの
で、この型の菌株によって産生されたキモシンの量は、
約100mg/である。 例11T.リーセイ における同質及び異質のタンパク質の産生の
ための一般的発現ベクターの構成。 T.リーセイにおける種々のタンパク質の産生のための
ベクターを構成するために、cbh１遺伝子のプロモータ
ー及びターミーネータ領域を含む一般的発現ベクターを
構成した。cbh１ターミネーターを、３個の読み枠が整
合してSTOPコドンTAAを含むアダプターと共に、pUC19の
pst I部位にサブクローンし、プラスミドpAMH110′（第
15図）を得た。pst IターミネーターフラグメントをpAM
H110′から単離し、cbh１プロモーターを、proＣ遺伝子
のアミノ末端を含むEcoR I−Pst Iフラグメントとしてp
AMH102から単離し、そしてこれらのフラグメントを、Ec
oR I−Pst Iにより消化されたpUC19＊（これから、この
サブクローン段階の前、１つのNde I部位がクレノウに
よりブラントされた）中にサブクローンした。その得ら
れたプラミドpAMH110は、cbh１遺伝子のプロモーター及
びターミネーター及びこれらの配列の間に、Sac II及び
Nde Iによる消化によって除去され得るスタファー（stu
ffer）フラグメントを含む。末端がブラントされた後、
遺伝子のcDNA又は染色体コピィーを、プロモーター及び
ターミネーターの間に挿入することができる（第15
図）。 例12cbh １プロモーター下で、T.リーセイエンドグルカナー
ゼＩの発現。 産生されるエンドグルカナーゼの量を増大せしめるた
めに、egl1遺伝子を、より強力なcbh１プロモーターに
連結した。T.リーセイエンドグルカナーゼＩのためのcD
NAを、スタファーフラグメントを削除するためにまずSa
c II−Nde Iにより消化された一般的な発現ベクターpAM
H110（例11に記載された）中にEcoR I−BamH Iフラグメ
ントとしてサブクローンした（第16図）。cbh１遺伝子
のプロモーター及びターミネーターの間にegl１遺伝子
を含む、その得られたプラスミドpAMH111を、それぞれ
5:1のモル比でp3SR2と共にT.リーセイQM9414（ATCC 269
21）に同時形質転換した。形質転換体を、AmdS+表現型
について選択し、そしてさらに選択培地上で精製した。
６個の個々の形質転換体を、50mlの液体培養において、
セルラーゼ含有培地（炭素源としてSolka floc,1％）中
で４日間、増殖せしめた。次にその培養上清液を、ヒド
ロキシエチルセルロース（0.1％、参照12）からの還元
性糖の放出を測定することによってエンドグルカナーゼ
活性について試験した。形質転換体のEG I活性を対照
（QM9414）と比較し、そして最良の形質転換体は、対照
菌株のエンドグルカナーゼ活性の４倍分泌することが示
された。この例は、それぞれのプロモーターを変えるこ
とによって、T.リーセイにおいて、異なったセルロース
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taminen,MSc Thesis.Biotechnical Laboratory,VTT,Tie
totie 2,02150 Espoo,Finland.
【図面の簡単な説明】 本発明は、添付図面に関してより詳しく下記に説明され
ている。 第１図は、染色体セルラーゼ遺伝子の不活性化の原理を
示す。 第２図は、Ｔ．リーセイの染色体CBH I遺伝子座の挿入
突然変異生成のために使用されるプラスミドpMS4の構成
を示す。EcoR I部位の不活性化によって生成されたフレ
ームシフト突然変異の位置は＊によりマークされてい
る。 第３図は、プラスミドp285′proCの構成法を示す。 第４図は、プラスミドpMT648及び15pMT813の構成法を示
す。 第５図は、プラスミドpMT837の構成法を示す。 第６図は、プラスミドpR27の制限地図を示す。 第７図は、プラスミドpAMH100の制限地図を示す。 第８図は、プラスミドpAMH105の構成法を示す。 第９図は、合成されたオリゴヌクレオチド、OAMH1,OAMH
2及びOAMH3を用いてループー突然変異生成することによ
るプラスミドpAMH1103,pAMH1106及びpAMH1101の構成法
を示す。 第10図は、リンカーNOR202,NOR203,OAMH1,OAMH2及びOAM
H3を示す。 第11図は、プラスミドpAMH102及びpAMH104の制限地図を
示す。 第12図は、プラスミドpAMH1103の制限地図及びpAMH103
の構成法を示す。 第13図は、プラスミドpAMH1106の制限地図及びpAMH106
の構成法を示す。 第14図は、プラスミドpAMH1101の制限地図及びpAMH101
の構成法を示す。 第15図は、プラスミドpAMH110の構成法を示す。 第16図は、CGH Iプロモーター機能下でEG Iの発現のた
めに使用されるプラスミドpAMH111の構成法を示す。 第17図は、T.リーセイにおけるキモシンの発現を示す。
ウェスターンブロットレーン1;精製されたプロキモシン
の対照、微量のプスウドウキモシン及びキモシンを含
む、レーン2;pAMH102を含む株の増殖からの培養上清
液、レーン3;プラスミドを含まない株からの培養上清
液、レーン4;pAMH102を含む株からの菌糸体。これは、
図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メルヤ ペントティレ フィンランド国，00390 ヘルシンキ, ファンハ ヘムゼンキレンティー，５− ７アー (72)発明者 モゲンズ トリエル ハンセン デンマーク国，デーコー−3650 エール スティゲ，ビンケルベイ 21 (56)参考文献 特開 昭62−175183（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−149387（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．37，（1985） Ｐ．207−214

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．ａ）目的とするタンパク質産物をコードする遺伝
    子、 ｂ）上記の目的とする産物の発現を制御するために作用
    可能な状態で上記遺伝子に結合されたプロモーター／エ
    ンハンサーを含んでいる成るDNA配列を含む遺伝子発現
    を促進する機能、及び ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択できる、ネ
    ウロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）Pry−４遺伝
    子に由来しない選択マーカーを含んで成るベクター系に
    より安定して形質転換されたトリコダーマ（Trichoderm
    a）菌株。 ２．請求項１に記載の菌株であって、そのベクター系
    が、目的とするタンパク質産物のための遺伝子の５′末
    端の上流に融合されたシグナル／リーダー配列をさらに
    含む菌株。 ３．請求項１又は２に記載の菌株であって、そのベクタ
    ー系のプロモーターが、トリコダーマにおいて機能する
    ことができる菌株。 ４．請求項１に記載の菌株であって、ベクター系のプロ
    モーターが、トリコダーマと異質のタンパク質のための
    遺伝子に由来する菌株。 ５．請求項２に記載の菌株であって、そのベクター系の
    シグナル／リーダー配列がトリコダーマによって分泌さ
    れるタンパク質のための遺伝子に由来する菌株。 ６．請求項２に記載の菌株であって、そのベクター系の
    シグナル／リーダー配列が、トリコダーマと異質の分泌
    タンパク質に由来する菌株。 ７．請求項５又は６に記載の菌株であって、そのベクタ
    ー系のシグナル／リーダー配列が、目的とするタンパク
    質のシグナル／リーダー配列に由来する菌株。 ８．請求項５に記載の菌株であって、そのベクター系の
    シグナル配列が、トリコダーマ・リーセイ（Trichoderm
    a reesei）のcbh Iシグナル配列である菌株。 ９．請求項６に記載の菌株であって、そのベクター系の
    シグンル配列がアスペルジラス（Aspergillus）のグル
    コアミラーゼ・シグナル配列である菌株。 １０．請求項１に記載の菌株であって、その目的とする
    タンパク質が、トリコダーマと同質である菌株。 １１．請求項１に記載の菌株であって、その目的とする
    タンパク質が、トリコダーマと異質である菌株。 １２．請求項11に記載の菌株であって、その目的とする
    産物が、プロキモシンである菌株。 １３．請求項10に記載の菌株であって、その目的とする
    タンパク質が、T.リーセイのエンドグルカナーゼ（EG
    I）である菌株。 １４．請求項３に記載の菌株であって、そのベクター系
    のプロモーターがトリコダーマ・リーセイのcbh Iプロ
    モーターである菌株。 １５．請求項４に記載の菌株であって、そのベクター系
    のプロモーターが、アスペルジラスのグリコアミラーゼ
    ・プロモーターである菌株。 １６．請求項１に記載の菌株であって、そのベクター系
    の選択マーカーが、アスペルジラス・ニジュランス（As
    pergillus nidulans）のamd S遺伝子、アスペルジラス
    ・ニジュランス又はトリコダーマ・リーセイのargB遺伝
    子に由来する菌株。 １７．請求項１に記載の菌株であって、そのベクター系
    が少なくとも２のプラスミド又はベクターを含んで成る
    菌株。 １８．請求項17に記載の菌株であって、そのベクター系
    の選択マーカーを、１のプラスミド上に配置し、そして
    宿主ゲノム内に導入されるべき残りのDNA−配列を他の
    プラスミド上に配置する菌株。 １９．請求項１に記載の菌株であって、そのベクター系
    が、１のプラスミド又はベクターを含んで成る菌株。 ２０．トリコダーマの安定した形質転換体を調製するた
    めの方法であって、以下の段階： （１）ａ）目的とするタンパク質産物をコードする遺伝
    子、 ｂ）上記の目的とする産物の発現を制御するために作用
    可能な状態で上記遺伝子に結合されたプロモーター／エ
    ンハンサーを含んで成るDNA配列を含む遺伝子発現を促
    進する機能、及び ｃ）安定したトリコダーマ形質転換体を選択でき、そし
    てネウロスポラ・クラサPry−４遺伝子に由来しない選
    択マーカーを含むベクター系により、好適なトリコダー
    マ菌体を形質転換させ、そして （２）上記選択マーカーの存在中、全窒素源としてニト
    レートを含まない培地上で安定して形質転換されたトリ
    コダーマを選択する、 を含むことを特徴とする方法。
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