JP2020502991A - 新規抗pcsk9抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列番号1、配列番号3および/または配列番号5を含む重鎖可変領域、
b)配列番号13、配列番号15および/または配列番号17を含む重鎖可変領域、
c)配列番号25、配列番号27、および/または配列番号29を含む重鎖可変領域、
d)配列番号37、配列番号39および/または配列番号41を含む重鎖可変領域、
e)配列番号13、配列番号49および/または配列番号17を含む重鎖可変領域、
f)配列番号55、配列番号57および/または配列番号59を含む重鎖可変領域、ならびに
g)配列番号1、配列番号67および/または配列番号69を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。
a)配列番号7、配列番号9および/または配列番号11を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号19、配列番号21および/または配列番号23を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号31、配列番号33および/または配列番号35を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号43、配列番号45および/または配列番号47を含む 軽鎖可変領域、
e)配列番号51、配列番号53および/または配列番号23を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号61、配列番号63および/または配列番号65を含む軽鎖可変領域、ならびに
g)配列番号7、配列番号9および/または配列番号71を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
a)配列番号1、配列番号3および/もしくは配列番号5を含む重鎖可変領域ならびに配列番号7、配列番号9および/もしくは配列番号11を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号13、配列番号15および/もしくは配列番号17を含む重鎖可変領域ならびに配列番号19、配列番号21および/もしくは配列番号23を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号25、配列番号27および/もしくは配列番号29を含む重鎖可変領域ならびに配列番号31、配列番号33および/もしくは配列番号35を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号37、配列番号39および/もしくは配列番号41を含む重鎖可変領域ならびに配列番号43、配列番号45および/もしくは配列番号47を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号13、配列番号49および/もしくは配列番号17を含む重鎖可変領域ならびに配列番号51、配列番号53および/もしくは配列番号23を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号55、配列番号57および/もしくは配列番号59を含む重鎖可変領域ならびに配列番号61、配列番号63および/もしくは配列番号65を含む軽鎖可変領域、または
g)配列番号1、配列番号67および/もしくは配列番号69を含む重鎖可変領域ならびに配列番号7、配列番号9および/もしくは配列番号71を含む軽鎖可変領域
を含む。
a)配列番号73を含む重鎖可変領域および配列番号75を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号77を含む重鎖可変領域および配列番号79を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号81を含む重鎖可変領域および配列番号83を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号85を含む重鎖可変領域および配列番号87を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号89を含む重鎖可変領域および配列番号91を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号93を含む重鎖可変領域および配列番号95を含む軽鎖可変領域、
g)配列番号97を含む重鎖可変領域および配列番号99を含む軽鎖可変領域、または
h)a)、b)、c)、d)、d)、f)もしくはg)に対して少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%)配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む。
用語「抗体」は、本明細書において、特異的抗原と結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性(二価)抗体を含む。天然の無傷の抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域ならびに第1、第2および第3の定常領域からなり、各軽鎖は、可変領域および定常領域からなる。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類され、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される。抗体は、「Y」型を有し、Yのステムは、ジスルフィド結合を介して一緒に結合している2つの重鎖の第2および第3の定常領域からなる。Yの各アームは、単一軽鎖の可変および定常領域と結合している単一重鎖の可変領域および第1の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖中の可変領域は、一般に、相補性決定領域(CDR)(LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む軽(L)鎖CDR、HCDR1、HCDR2、HCDR3を含む重(H)鎖CDR)と呼ばれる3つの高度可変ループを含有する。本明細書において開示される抗体および抗原結合断片のCDR境界は、Kabat、ChothiaまたはAl−Lazikaniの慣習(Al−Lazikani,B.、Chothia,C.、Lesk,A.M.、J.Mol.Biol.、第273巻(4号)、927頁(1997);Chothia,C.ら、J Mol Biol.12月5日;第186巻(3号):651〜63頁(1985年);Chothia,C.およびLesk,A.M.、J.Mol.Biol.、第196巻、901頁(1987年);Chothia,C.ら、Nature.12月21〜28日;第342巻(6252号):877〜83頁(1989年);Kabat E.A.ら、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年))によって定義または同定され得る。3つのCDRは、CDRよりもより高度に保存され、超可変ループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域(FR)として知られる、両端に位置するストレッチの間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の5種の主要なクラスまたはアイソタイプとして、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらは、α、δ、ε、γおよびμ重鎖それぞれの存在を特徴とする。主要な抗体クラスのうちいくつかは、IgG1(γ1重鎖)、IgG2(γ2重鎖)、IgG3(γ3重鎖)、IgG4(γ4重鎖)、IgA1(α1重鎖)またはIgA2(α2重鎖)などのサブクラスに分割される。
特定の実施形態では、本開示は、例示的完全ヒトモノクローナル抗体11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8、40409を提供し、そのCDR配列は、以下の表1に示されており、重鎖または軽鎖可変領域配列も以下に示されている。
本開示は、抗PCSK9抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、表1に提供されるCDR配列をコードする、表1に示されるような1種または複数のヌクレオチド配列を含む。
本開示は、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、生体サンプルにおいてPCSK9の存在またはレベルを検出するために有用である。生体サンプルは、血清を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識とコンジュゲートしている抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片を含む。特定のその他の実施形態では、キットは、未標識抗PCSK9抗体または抗原結合断片を含み、未標識抗PCSK9抗体と結合可能である二次標識抗体をさらに含む。キットは、使用の説明のおよびキット中の成分の各々を分離するパッケージをさらに含み得る。
本開示は、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片および1種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本開示は、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片を使用する方法をさらに提供する。
抗体およびその他のタンパク質作製
1.1 ヒトおよびマウスPCSK9
C末端に6−HisタグまたはマウスFc(mFc)を融合した発現ベクターpcDNA3.3に、ヒトおよびマウスPCSK9遺伝子を挿入した。次いで、PlasFect(Bioline USA、BIO−46026)を使用して、このプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトした。Niカラム(Qiagen Inc)を使用して、回収された上清からHisタグタンパク質を精製した。プロテインAカラム(MabSelect SuRe、GE)を使用してmFc融合タンパク質を精製した。
C末端6−Hisタグを有するベクターpcDNA3.3に、LDL受容体細胞外ドメインの遺伝子を挿入した。PlasFect(Bioline USA、BIO−46026)を使用して、このプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトした。Niカラム(Qiagen Inc)を使用して、回収された上清からLDL−Rタンパク質を最初に精製し、続いて、イオン交換カラムを使用して精製した。
参照抗体BMK.115を、米国特許第8889834B2号中の21B12の配列をベースとして作製した。VHおよびVL遺伝子を含有するプラスミドを、HEK293細胞に同時トランスフェクトした。プロテインAカラム(MabSelect SuRe、GE)を使用して回収された上清から抗体を精製した。
抗体作製
2.1 免疫処置
ヒト免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含有するOmniRat(登録商標)(OMT)を使用して、完全ヒトVHおよびVLを有する抗体を作製した。OmniRat(登録商標)を足蹠を介してヒトPCSK9タンパク質とともに、およそ3日毎に注射した。6回の注射後に最初の力価試験を実施した。その後、2週間毎にラットに注射した。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用して、ラット血清中の抗体の力価を測定した。ELISAプレート(Nunc)を、1μg/mlのヒトPCSK9を用いて4℃で一晩コーティングし、次いで、ブロッキングバッファー(1×PBS/2%BSA)を用いて室温で1時間ブロッキングした。ラット血清は、ブロッキングバッファーでの1:100希釈で出発して1:3力価測定し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットIgG1 HRP(Bethyl)およびヤギ抗ラットIgG2b HRP(Bethyl)とともに45分間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を添加し、2M HClによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して450nMでの吸光度を読み取った。
無菌条件下で免疫処置したマウスからリンパ節および脾臓を採取し、Ficoll−Paque PLUS勾配遠心分離を使用してリンパ球を調製した。次いで、電気融合デバイス(BTX ECM2001)を使用して、単離された細胞を1:1の比で骨髄腫細胞P3と融合した。融合後に細胞を1/2HA培地に移した。96ウェルプレートあたり5×105個細胞を播種した。
ELISAによる結合アッセイ:プレート(Nunc)を、1μg/mlのストレプトアビジンを用いて4℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、250ng/mlのPCSK9−ビオチンを添加し、1時間インキュベートした。次いで、ハイブリドーマ上清をプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットIgG1 HRP(Bethyl)およびヤギ抗ラットIgG2b HRP(Bethyl)とともに45分間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を添加し、2M HClによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して450nMでの吸光度を読み取った。
選択された各株のハイブリドーマ細胞を、0.5、1および5個細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレーティングした。単一クローンを選び取り、結合ELISAで試験した。各ハイブリドーマ株の3つのサブクローンを選択し、凍結した。
抗体アイソタイプをELISAによって同定した(表2を参照のこと)。プレート(Nunc)を、1μg/mlのヤギ抗ラットIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2cおよびIgM抗体(Bethyl)を用いて4℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、ハイブリドーマ上清を、コーティングされたプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、二次抗体ヤギ抗ヒトκHRPまたはヤギ抗ヒトλHRP(Southern Biotech)とともに45分間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を添加し、2M HClによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して450nMでの吸光度を読み取った。
回収されたハイブリドーマ上清を、pHを7.0に調整した後にプロテインAカラム(MabSelect SuRe、GE)にロードした。抗体をグリシンによって溶出し、続いて、1M Trisを使用して直ちに中和した。Nano Drop(Thermal−Fisher)によって抗体濃度を調べた。SDS−PAGE (Invitrogen、NuPAGE 4%〜12% Bis−Trisゲル)およびHPLC−SEC(Agilent)によってタンパク質の純度を評価した。
完全ヒト抗体の作製
3.1 ハイブリドーマシーケンシング
Trizol試薬(Invitrogen−15596018)を使用してハイブリドーマ細胞からRNAを抽出する。5’−RACEキット(Takara−28001488)を使用してcDNAを増幅し、続いて、3’縮重プライマーおよび3’アダプタープライマー(ExTaq:Takara−RR001B)を使用してPCR増幅した。PCR断片をpMD18−Tベクター(Takara−D101C)に挿入し、シーケンシング(Shanghai Biosune)のために送った。選択された抗体11.4、18.156.8、15.14.2、17.72.3、18.136.7、19.3.8および40409の可変領域配列(アミノ酸配列および核酸配列)は、配列番号73〜100として示されている。
各抗体(ヒト−ラットキメラ抗体)のV領域DNAを、ヒト定常領域遺伝子を含有するpcDNA3.3ベクターにクローニングした。HEK293細胞を、抗体重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞を除去することおよび濾過によって、トランスフェクトされた細胞から上清を採取した。プロテインAカラム(MabSelect SuRe、GE)によって抗体を精製し、PBSにバッファー交換した。Nanodropによって抗体濃度を検出した。SDS−PAGE(Invitrogen、NuPAGE4%〜12% Bis−Trisゲル)およびHPLC−SEC(Agilent)によって純度を評価した。
11.4重鎖(HC)−CDR3ライブラリーの飽和変異誘発を作製し、結合ELISAアッセイによってスクリーニングし、親クローンと比較してPCSK9結合を増大する単一変異を選択した。次いで、選択された変異のコンビナトリアルライブラリーを作製した。ELISA結合およびSPR koffランキング結果に基づいて特定の変異組合せを有するクローンを選択した。
3.4.1 18.156.8(hIgG4)
完全ヒト抗体18.156.8(hIgG4)は、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図2を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように99.6%である(図3)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
完全ヒト抗体18.156.8(hIgG4)は、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図4を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように98%である(図5を参照のこと)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
完全ヒト抗体15.14.2−uAb−IgG4Lは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図6を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように99.8%である(図7を参照のこと)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
完全ヒト抗体17.72.3−uAb2−IgG4Kは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図8を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように98.9%である(図9を参照のこと)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
完全ヒト抗体18.136.7−IgG4Kは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図10を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように99.2%である(図11を参照のこと)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
完全ヒト抗体19.3.8−uAb1−IgG4Lは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でSDS−PAGEにおいて25kDaおよび55kDaの見かけの分子量で移動する(図12を参照のこと)。非還元条件下での主なバンドは、約150KDのM.W.を有する全IgGである。純度は、HPLC−SECによって決定されるように99.9%である(図3)。内毒素は、<0.5EU/mgである。
リード抗体特性決定
4.1 完全ヒト抗体の結合および遮断活性
PCSK9との完全ヒト抗体結合の活性を、ELISAによって確認した(図14)。PCSK9のLDL−Rとの結合を遮断する完全ヒト抗体の活性を、競合的ELISA法によって確認した(図15)。結合EC50および遮断IC50値を、表5および6にまとめた。リード抗体18.156.8(hIgG4)、40409(hIgG4)、15.14.2−uAb−IgG4Lおよび17.72.3−uAb2−IgG4Kは、比較可能な結合を示し、遮断活性はBMK.115およびレパーサを用いた。
HepG2またはHuh−7細胞を、10% FBSを含有するDMEM培地中、96ウェルプレートに1×105個細胞/ウェルの密度で播種した。プレートを、37℃のインキュベーター中で一晩維持した。培地を、FBSを含まないDMEMと置換した。ヒトPCSK9および種々の濃度の抗体の混合物を細胞に添加した。野生型PCSK9および変異体PCSK9(D374Y)の最終濃度は、それぞれ20μg/mlおよび1.3μg/mlとした。1時間後、細胞に、Bodipy FL標識LDL(Invitrogen L−3483)を添加して、1.5μg/mlの最終濃度とした。37℃のインキュベーター中で3時間インキュベートした後、プレート中のLDLを含有する培地を廃棄した。細胞をトリプシン処理し、2回洗浄した。LDL取り込みを、FACSによって決定される、細胞におけるBodipy FL標識LDLの蛍光によって特性決定した。次式:LDL取り込み回復(%)=(MFIサンプル−MFILDL+Ag1H)/(MFILDLのみ−MFILDL+Ag1H)×100%に従って、LDL取り込み回復率を算出した。
4.3.1 SPRによる結合動態学
ヒトおよびアカゲザルPCSK9との抗体結合親和性を、Biacore T200を使用するSPRアッセイによって検出した。各抗体を、プロテインAまたは抗ヒトIgG Fc抗体固定化CM5センサーチップ(GE)で捕獲した。種々の濃度のヒトまたはアカゲザルPCSK9を、180秒の会合相、続いて、1200秒の解離の間30μL/分の流速でセンサーチップ上に注入した。各結合サイクル後に2M MgCl2によってチップを再生した。
ELISAプレート(Nunc)を、1μg/mlの抗His抗体(Genscript)を用いて4℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後1μg/mlのアカゲザルPCSK9−His(Sino Biological)を添加し、1時間インキュベートした。プレートに抗体サンプルを添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットIgG1 HRP(Bethyl)およびヤギ抗ラットIgG2b HRP(Bethyl)とともに45分間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を添加し、2M HClによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して450nMでの吸光度を読み取った。
抗体を、新たに単離されたヒト血清(血清含量>95%)中、37℃で、それぞれ0、1、3、7、14日間インキュベートした。37℃でのインキュベーション後、サンプルを、ドライアイスエタノール浴中で迅速に凍結し、−80℃で維持した。安定性試験の前にサンプルを迅速に解凍した。プレートを、Na2CO3/NaHCO3(pH9.2)バッファー中でストレプトアビジンを用いて、4℃で一晩コーティングした。プレートを、0.1% Tween−PBSを用いて1回洗浄し、その後、2% BSA/PBSを用いてブロッキングした。ビオチン標識PCSK9を添加し、1時間インキュベートした。次いで、洗浄後、希釈した血清サンプルをプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。ウェルにヤギ抗ヒトHRP抗体を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質を添加し、2M HClによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して450nMでの吸光度を読み取った。
動物研究
5.1 非ヒト霊長類における単回用量有効性
LDLCおよびHDLC3キット(Roche)を使用するRoche/Hitachi cobas cシステムで、サル血清中のLDL−CおよびHDL−C濃度を試験した。総コレステロール(TCHO)を、コレステロールFSキット(DiaSys)によって試験した。
全身曝露(TK)を調べるために、BMK.115、18.156.8−hIgG4、40409−hIgG4、15.14.2、17.72.3、18.136.7および19.3.8の血清濃度を調べた。0(投与前)、投与後0.5、1、2、4、24、48、96、168、336、504、672、744および840時間で、すべての入手可能なサルから血液サンプルを採取した。
0(投与前)、投与後336、672および840時間に、動物から頭部または大腿静脈を介して血液を採取した。
死亡率/瀕死:研究の間、各動物の健康状態を、動物を1回検査した動物開放時およびインライフ完了日を除いて、1日に2回、朝に1回および午後に1回報告した。
抗体18.156.8および参照抗体間の活性比較
1. 参照抗体作製
参照抗体12H11.1.uIgG4Kおよび24B9.1.uIgG4Lを、実施例1および実施例2に記載される方法を使用して、特許CN101932607中の12H11.1および24B9.1の配列をベースとして作製した。
実施例2の節2.4ハイブリドーマスクリーニングに記載される方法に従って、ELISAによって、参照抗体12H11.1.uIgG4Kおよび24B9.1.uIgG4LのヒトPCSK9との結合の活性が確認された(図29)。結合EC50値を表12にまとめた。参照抗体12H11.1.uIgG4Kは、18.156.8およびBMK.115よりも低い結合活性を示した。参照抗体24B9.1.uIgG4Lは、ヒトPCSK9と結合しない。
参照抗体12H11.1.uIgG4Kおよび24B9.1.uIgG4Lの、PCSK9のLDLRとの結合を遮断する活性を、実施例2の節2.4 ハイブリドーマスクリーニングに記載される方法に従って、競合的ELISA法によって評価した(図30)。IC50値を表13にまとめた。抗体24B9.1.uIgG4Lは、遮断活性を示さなかった。抗体12H11.1.uIgG4Kは、18.156.8に対して同様のIC50を示したが、PCSK9とLDLRの結合を完全に遮断できなかった。
抗体12H11.1.uIgG4Kの動態学的親和性は、実施例4の節4.3.1 SPRによる結合動態学に記載される同一方法を使用して試験されるように、18.156.8よりもかなり低い。結果は、表14に示されている。
抗体18.156.8および12H11.1.uIgG4Kを、実施例4の節4.2 完全ヒト抗体のLDL取り込みアッセイに記載される方法に従って、HepG2細胞におけるLDL取り込みアッセイにおいて評価した(表15および図31を参照のこと)。12H11.1.uIgG4Kは、HepG2細胞において細胞性LDL取り込みを回復させるわずかに低い活性を示した。
Claims (37)
- 配列番号1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39、41、49、55、57、59、67および69からなる群から選択される重鎖CDR配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号7、9、11、19、21、23、31、33、35、43、45、47、51、53、61、63、65および71からなる群から選択される軽鎖CDR配列を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- a)配列番号1、配列番号3および/または配列番号5を含む重鎖可変領域、
b)配列番号13、配列番号15および/または配列番号17を含む重鎖可変領域、
c)配列番号25、配列番号27および/または配列番号29を含む重鎖可変領域、
d)配列番号37、配列番号39および/または配列番号41を含む重鎖可変領域、
e)配列番号13、配列番号49および/または配列番号17を含む重鎖可変領域、
f)配列番号55、配列番号57および/または配列番号59を含む重鎖可変領域、ならびに
g)配列番号1、配列番号67および/または配列番号69を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。 - a)配列番号7、配列番号9および/または配列番号11を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号19、配列番号21および/または配列番号23を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号31、配列番号33および/または配列番号35を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号43、配列番号45および/または配列番号47を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号51、配列番号53および/または配列番号23を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号61、配列番号63および/または配列番号65を含む軽鎖可変領域、ならびに
g)配列番号7、配列番号9および/または配列番号71を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。 - a)配列番号1、配列番号3および/もしくは配列番号5を含む重鎖可変領域ならびに配列番号7、配列番号9および/もしくは配列番号11を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号13、配列番号15および/もしくは配列番号17を含む重鎖可変領域ならびに配列番号19、配列番号21および/もしくは配列番号23を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号25、配列番号27および/もしくは配列番号29を含む重鎖可変領域ならびに配列番号31、配列番号33および/もしくは配列番号35を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号37、配列番号39および/もしくは配列番号41を含む重鎖可変領域ならびに配列番号43、配列番号45および/もしくは配列番号47を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号13、配列番号49および/もしくは配列番号17を含む重鎖可変領域ならびに配列番号51、配列番号53および/もしくは配列番号23を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号55、配列番号57および/もしくは配列番号59を含む重鎖可変領域ならびに配列番号61、配列番号63および/もしくは配列番号65を含む軽鎖可変領域、または
g)配列番号1、配列番号67および/もしくは配列番号69を含む重鎖可変領域ならびに配列番号7、配列番号9および/もしくは配列番号71を含む軽鎖可変領域
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 配列番号73、配列番号77、配列番号81、配列番号85、配列番号89、配列番号93および配列番号97ならびにそれらの少なくとも80%配列同一性のある相同配列からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号75、配列番号79、配列番号83、配列番号87、配列番号91、配列番号95および配列番号99ならびにそれらの少なくとも80%配列同一性のある相同配列からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- a)配列番号73を含む重鎖可変領域および配列番号75を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号77を含む重鎖可変領域および配列番号79を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号81を含む重鎖可変領域および配列番号83を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号85を含む重鎖可変領域および配列番号87を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号89を含む重鎖可変領域および配列番号91を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号93を含む重鎖可変領域および配列番号95を含む軽鎖可変領域、
g)配列番号97を含む重鎖可変領域および配列番号99を含む軽鎖可変領域、または
h)a)、b)、c)、d)、d)、f)もしくはg)に対して少なくとも80%の配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 表面プラズモン共鳴結合アッセイによって測定されるものとして、10−7M以下、10−8M以下、10−9M以下または10−10M以下のKD値でヒトPCSK9と特異的に結合可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 10−8M以下、10−9M以下または10−10M以下のKD値でサルPCSK9と結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 2.1nM以下のIC50で、ヒトPCSK9のそのリガンドとの結合を阻害可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 0.15nM以下のEC50でヒトPCSK9と結合可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 115nM以下、106nM以下、80nM以下、77nM以下、66nM以下または40nM以下のIC50で、細胞性LDL取り込みを回復可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 血清中で、少なくとも1日または少なくとも14日安定である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- ADCCまたはCDCまたはその両方を媒介しない、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 完全ヒトモノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 完全ヒトモノクローナル抗体が、トランスジェニック動物によって生成される、請求項16に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 動物においてLDL−コレステロールを最大84%低減可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 少なくとも165時間、少なくとも250時間、少なくとも360時間、少なくとも390時間または少なくとも450時間の血清半減期を有する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と同一のエピトープについて競合する、抗体またはその抗原結合断片。
- ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、scFv、scFv二量体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv−dsFv’、Fv断片、Fab、Fab’、F(ab’)2、dsダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- コンジュゲートをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1から22に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項24に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項25に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から22のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法であって、請求項26に記載の宿主細胞を、請求項24に記載のポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む、方法。
- 請求項1から22のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
- 個体においてPCSK9によって媒介される疾患または状態を処置する方法であって、個体に、請求項1から23のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む、方法。
- 個体が、PCSK9阻害剤に応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている、請求項29に記載の方法。
- 個体が、個体から得られた試験生体サンプルにおける血清LDLコレステロール、総コレステロールおよび/または非HDLコレステロールの上方制御されたレベルとして同定されている、請求項30に記載の方法。
- 請求項1から23のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片および1種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
- 免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう対象における状態を処置する方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項1から23のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
- 対象が、血清LDLコレステロール、総コレステロールおよび/または非HDLコレステロールの上方制御されたレベルを有する、請求項29に記載の方法。
- 免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう状態を処置するための医薬の製造における、請求項1から23のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
- 状態が、心血管疾患、炎症性疾患および感染性疾患である、請求項35に記載の使用。
- 感染性疾患が敗血症である、請求項36に記載の使用。
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