JP5850860B2 - Ｃｄ１２７結合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトＩＬ−７受容体のα鎖（ＣＤ１２７）に特異的に結合する抗原結合タンパク質、特に免疫グロブリンに関する。また、本発明は、前記タンパク質を用いて疾患又は障害を治療する方法、前記タンパク質を含んでなる、医薬組成物、及びその製造方法に関する。本発明の他の態様は、以下の説明から明らかになるであろう。
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系に影響を与える慢性の炎症性脱髄疾患である。ＭＳでは、浸潤性炎症性免疫細胞が乏突起膠細胞の破壊に関与すると考えられており、前記乏突起膠細胞とは、ミエリン鞘として知られている脂肪層の形成及び維持に関与する細胞である。ＭＳは、ミエリンの薄膜化又は全損を引き起こす。ミエリンが失われると、ニューロンは、もはや電気信号を有効に伝えることができず、多くの神経機能障害が生じる。ＭＳ患者では、神経繊維のミエリン鞘に沿った炎症性病変の形成に関与する自己反応性Ｔ細胞が産生される。活動性ＭＳ患者の脳脊髄液は、活性化Ｔ細胞を含有しており、これが脳組織に浸潤し、特徴的な炎症性病変を引き起し、ミエリンを破壊する。多発性硬化症の症状及び疾病の経過は、人によって異なり得るが、前記疾患には再発寛解型ＭＳ、二次性進行型ＭＳ、及び一次性進行型ＭＳという３つの基本的な形態が存在する。
ＭＳの初期段階では、炎症発作が生じ、短い間隔で疾患活性が急速に高まる。これら症状発現の後に、回復及び寛解の期間が生じる。寛解期間中、神経系病変における局所的腫脹は消散し、免疫細胞は活性が低下するか又は不活化し、ミエリン産生細胞は軸索を再有髄化する。神経のシグナル伝達は改善し、炎症によって引き起こされる能力障害は重篤度が低下するか又は完全に消失する。前記疾患のこの相は、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。しかし、病変が全て完全に治癒する訳ではない。一部は「慢性の」病変として残り、これは、通常、免疫細胞を欠く脱髄芯領域を有する。経時的に、このような病変の中心にある細胞はほとんど死ぬが、多くの場合病変の縁部で炎症が継続する。脳は、一部のニューロンの喪失にうまく適合することができるので、長年にわたる永続的な能力障害は生じ得ない。しかし、ＭＳ患者の５０％超は、最終的に、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）と呼ばれる進行性劣化の病期に入る。この病期では、前記疾患は、もはや疾患を緩和する医薬品に対して十分に応答せず、患者の能力障害が確実に悪化する。ＭＳの自然経過の初期からのニューロンの破壊は、ＳＰＭＳの進行性能力障害が蓄積されたニューロン喪失の結果である可能性があり、それが最終的に脳の代償能を凌駕することを示唆する。一次性進行型ＭＳは、再発しないが、長期間にわたって身体機能及び認知機能が徐々に失われる種類の多発性硬化症である。
再発寛解型多発性硬化症の患者における治療目的は、前記疾患の再発の頻度及び重篤度を低減し（それによって憎悪を防ぐ）ことに加えて、前記疾患の進行性相の開始を防いだり遅らせたりすることである。この目的を達成するために、これまで特に免疫調節薬又は免疫抑制薬が用いられてきたが、これらは有効性が限られており且つ毒性が高いので広範囲に受け入れられるものではなかった。例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ、及びグラチラマー酢酸塩を用いた大規模な無作為対照化試験が成功裡に行われている。
自己免疫Ｔ細胞応答の変化及び免疫系の調節ネットワークの機能不全の両方が、ＭＳ及び関節リウマチ等のヒトの自己免疫疾患において重要な役割を果たしている（Ｋｕｃｈｒｏｏら，（２００２年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１０１−１２３；Ｓｏｓｐｅｄｒａ及びＭａｒｔｉｎ（２００５年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：６８３−７４７；Ｔｏｈ及びＭｉｏｓｓｅｃ（２００７年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９：２８４−２８８）。
ＭＳの病因及び発症機序は依然として不明であるが、一般に自己免疫病理であると考えられており、ここでは、ＴＨ１及びＴＨ１７細胞等の病因となる可能性のある自己反応性Ｔ細胞が重要な役割を果たしていると考えられる。これらエフェクターＴ細胞が疾患経過中にインビボで活性化され、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症の一因となり得るという証拠が存在する。また、前記疾患の活動期にこれらＴ細胞がＥＡＥ及びＭＳの病変におけるミエリン発現細胞の破壊を媒介するという証拠も存在する。他方、通常病原性ＴＨ１及びＴＨ１７細胞を抑制する調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がＭＳ患者では欠損しており、これによって免疫系が更に炎症促進性状態に傾く。
最近、３つの別々のグループが、ＭＳに罹患しているか又は罹患していない合計１７，９４７人のドナーにおいてゲノムワイドに一塩基変異多型（ＳＮＰ）をスキャンした結果を報告した。３３４，９２３のＳＮＰをスキャンした後、ヒトＩＬ−７受容体α鎖（ＩＬ−７Ｒα）における非同義コーディングＳＮＰがＭＳ感受性に非常に深く関連している（全体としてＰ＝２．９×１０−７）ことが見出された。前記ＳＮＰは、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒαとしても知られている）のエキソン６におけるＴからＣへの変化に相当している。この変化は、ＲＮＡスプライシング中にエキソン６をスキッピングする機会を増やして、可溶型のＣＤ１２７を生じさせる。更に、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＣＤ１２７及びＩＬ−７のＲＮＡ発現は、他の神経障害患者のＣＳＦに比べて有意に高い。
ＩＬ−７及びＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）は、Ｔ細胞及びＢ細胞の発生、並びに主として胸腺環境におけるホメオスタシスに重要な役割を果たすことが知られている。実際、胸腺間質細胞、胎児胸腺及び骨髄は、ＩＬ−７の産生部位である。ＩＬ−７受容体は、２つのサブユニット：ＣＤ１２７とＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の受容体で共有されている共通鎖（γ鎖又はａｃ）とからなる。
ＣＤ１２７は、ＩＬ−７受容体アルファ（ＩＬ−７Ｒα）及びｐ９０ ＩＬ−７Ｒとしても知られている。ヒトＣＤ１２７（Ｓｗｉｓｓ ＰｒｏｔアクセッションナンバーＰ１６８７１）は、合計４５９のアミノ酸（２０のシグナル配列）を有する。ヒトＣＤ１２７は、２１９アミノ酸の細胞外領域、２５アミノ酸の膜貫通領域、及び１９５アミノ酸の細胞内領域を含む。ＣＤ１２７内の残基の番号付けは、（例えば、抗体のエピトープについて説明するために）本発明で用いるとき、シグナル配列の残基を含む完全長タンパク質に基づく。ＣＤ１２７は、４つのアイソフォームで存在する場合があり、アイソフォームＨ２０（ＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッションナンバーＰ１６８７１−１）は、以下のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）を有する：
ＭＴＩＬＧＴＴＦＧＭ ＶＦＳＬＬＱＶＶＳＧ ＥＳＧＹＡＱＮＧＤＬ ＥＤＡＥＬＤＤＹＳＦ ＳＣＹＳＱＬＥＶＮＧ ＳＱＨＳＬＴＣＡＦＥ
ＤＰＤＶＮＴＴＮＬＥ ＦＥＩＣＧＡＬＶＥＶ ＫＣＬＮＦＲＫＬＱＥ ＩＹＦＩＥＴＫＫＦＬ ＬＩＧＫＳＮＩＣＶＫ ＶＧＥＫＳＬＴＣＫＫ
ＩＤＬＴＴＩＶＫＰＥ ＡＰＦＤＬＳＶＩＹＲ ＥＧＡＮＤＦＶＶＴＦ ＮＴＳＨＬＱＫＫＹＶ ＫＶＬＭＨＤＶＡＹＲ ＱＥＫＤＥＮＫＷＴＨ
ＶＮＬＳＳＴＫＬＴＬ ＬＱＲＫＬＱＰＡＡＭ ＹＥＩＫＶＲＳＩＰＤ ＨＹＦＫＧＦＷＳＥＷ ＳＰＳＹＹＦＲＴＰＥ ＩＮＮＳＳＧＥＭＤＰ
ＩＬＬＴＩＳＩＬＳＦ ＦＳＶＡＬＬＶＩＬＡ ＣＶＬＷＫＫＲＩＫＰ ＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫ ＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰ ＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰ
ＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲ ＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶ ＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱ ＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬ ＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰ ＳＥＤＶＶＶＴＰＥＳ
ＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬ ＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰ ＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣ ＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶ ＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴ ＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳ
ＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰ ＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳ ＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶ ＴＭＳＳＦＹＱＮＱ （配列番号１）
また、ＣＤ１２７は、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）の受容体においても見出されている。ＴＳＬＰ受容体は、ＣＤ１２７とサイトカイン受容体様因子２（ＣＲＬＦ２）とのヘテロダイマーである。
ＩＬ−７Ｒに対するＩＬ−７の結合は、ＪＡＫキナーゼ１及び３の活性化を含む、複数のシグナル伝達経路を活性化し、Ｓｔａｔ５のリン酸化及び活性化を導く。Ｓｔａｔ５の活性化は、抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２の誘導及びアポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘのミトコンドリアへの侵入を防ぐのに必要であるので、胸腺発生Ｔ細胞前駆体の生存にとって重要である。ＩＬ−７Ｒが媒介する別の経路は、ＰＩ３キナーゼの活性化であり、それによって、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｄがリン酸化され細胞質に保持される。ＣＤ１２７は、末梢の休止Ｔ細胞及び記憶Ｔ細胞で発現する。Ｔ細胞の生存及びホメオスタシスのＩＬ−７調節の機序並びに末梢におけるＩＬ−７の起源は、完全には解明されていない。更に、自己免疫疾患における病原性Ｔ細胞の分化及び機能におけるその潜在的な役割についてはそれほど研究が進んでおらず、大部分は未知である。ＩＬ−７が自己免疫疾患の発病の一因である可能性があることを示唆する報告はほとんど存在しない。
最近、Ｌｉｕら（Ｌｉｕら，（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６：１９１−１９７）は、ＴＨ１７の生存及び増殖におけるＩＬ−７の役割について報告した。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３１３６号には、マウスの抗ＣＤ１２７抗体（抗ＣＤ１２７抗体１Ａ１１及び６Ａ３を含む）、並びにＭＳ及び他の自己免疫疾患の治療におけるその役割について記載されている。
ヒトＣＤ１２７に結合する及び／又はヒトＣＤ１２７の生物学的作用を阻害する更なるモノクローナル抗体を単離及び開発することが望ましい。このような抗体は、ＭＳ並びに他の炎症性及び自己免疫性の疾患及び障害、特に、病原性ＴＨ１７細胞の関与するものの治療において治療上有用であり得る。
本発明は、ＣＤ１２７に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。前記抗原結合タンパク質は、治療方法、特に、病原性ＴＨ１７細胞が関与する疾患の治療又は予防において使用することができる。前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７に結合して、ＣＤ１２７の生物学的機能を阻害、例えば中和することができる。
第１の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４又は配列番号１３２〜配列番号１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３、
（ｉｖ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１、
（ｖ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２、
（ｖｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１〜６つを含んでなる、抗体又はその変異体等の抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号３９に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号４０に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４１に記載のＣＤＲＨ３、
（ｉｖ）配列番号４２に記載のＣＤＲＬ１、
（ｖ）配列番号４３に記載のＣＤＲＬ２、
（ｖｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１〜６つを含んでなる、抗体又はその変異体等の抗原結合タンパク質を提供する。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、場合によりキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。抗体は、アクセプター抗体フレームワークにおける（ドナー抗体由来の配列番号２〜７又は３９〜４４の）１以上のＣＤＲを含んでなり得る。アクセプター抗体フレームワークは、ヒト化抗体であり得る。
１つの態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４又は配列番号１３２〜配列番号１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３
のうちの１以上を含んでなる、重鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体であって、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）重鎖可変領域の位置６６におけるリシン残基、位置６９におけるフェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン又はバリン残基、及び位置７１におけるバリン、アルギニン、アラニン又はロイシン残基のうちの少なくとも１つを更に含んでなる、ヒト化抗体を提供する。
１つの実施形態では、ヒト化抗体は、位置６９にロイシンを含んでなる。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、位置７１にバリンを含む。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、位置６９にロイシン及び位置７１にバリンを含む。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、位置６６にリシン、位置６９にロイシン、及び位置７１にバリンを含む。上述の点突然変異を除いて、重鎖可変領域は、ヒト生殖細胞系可変領域のフレームワーク配列を有し得る。例えば、１つの実施形態では、重鎖可変領域は、ＩＧＨＶ１＿２ヒトフレームワーク（配列番号１１６）に由来する。
したがって、別の態様では、本発明は、ＶＨフレームワークにおいて以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４又は配列番号１３２〜配列番号１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３
のうちの１以上を含んでなる、抗体であって、
前記ＶＨフレームワークが、ヒト生殖細胞系ＶＨフレームワークに由来し、且つ（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）重鎖可変領域の位置６６におけるリシン残基、位置６９におけるフェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン又はバリン残基、及び位置７１におけるバリン、アルギニン、アラニン又はロイシン残基のうちの少なくとも１つを含んでなる、抗体を提供する。１つの実施形態では、ヒトＶＨフレームワークは、ＩＧＨＶ１＿２ヒトフレームワーク（配列番号１１６）である。
本発明の抗体は、ＣＤＲＨ１（配列番号２）及びＣＤＲＨ３（配列番号４）；ＣＤＲＨ２（配列番号３）及びＣＤＲＨ３（配列番号４）；ＣＤＲＨ１（配列番号２）及びＣＤＲＨ２（配列番号３）；又はＣＤＲＨ１（配列番号２）、ＣＤＲＨ２（配列番号３）及びＣＤＲＨ３（配列番号４）を含んでなる、重鎖可変領域を含んでなり得る。前記抗体は、配列番号１０〜１７のうちのいずれかの重鎖可変領域（１Ａ１１．Ｈ０ ＶＨ〜１Ａ１１．Ｈ７ ＶＨ）を含んでなり得る。１つの実施形態では、前記ヒト化抗体は、配列番号１３の重鎖可変領域（１Ａ１１．Ｈ３ ＶＨ）を含んでなる。これら実施形態のいずれかでは、配列番号４のＣＤＲＨ３を、配列番号１３２〜１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３で置換してもよい。あるいは、配列番号１３の重鎖可変領域は、Ｎ９８Ｄ、Ｎ９８Ｅ、Ｆ１００ｂＥ、Ｆ１００ｂＨ、Ｆ１００ｂＩ及びＦ１００ｂＶ（Ｋａｂａｔ）から選択される１以上の置換を含んでなり得る。別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、又は１３１のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１６の軽鎖可変領域と対合する。
また、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２、
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１以上を含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなる、抗体であって、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）可変領域軽鎖の位置４５におけるリシン残基、位置４６におけるプロリン残基、位置４７におけるトリプトファン残渣、位置５８におけるバリン残基、位置６０におけるバリン残基、位置７０におけるセリン残基、及び位置７１におけるチロシン又はフェニルアラニン残基のうちの少なくとも１つを更に含んでなる、抗体を提供する。
１つの実施形態では、抗体は、位置４６にプロリン残基を含んでなる。１つの実施形態では、抗体は、位置７１にチロシン残基を含んでなる。１つの実施形態では、抗体は、位置４６にプロリン残基及び位置７１にチロシン残基を含んでなる。
抗体は、ＣＤＲＬ１（配列番号５）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）；ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）；ＣＤＲＬ１（配列番号５）及びＣＤＲＬ２（配列番号６）；又はＣＤＲＬ１（配列番号５）、ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）を含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなり得る。前記抗体は、配列番号１８〜２７のうちのいずれかの軽鎖可変領域（１Ａ１１．Ｌ０ Ｖκ〜１Ａ１１．Ｌ９ Ｖκ）を含んでなり得る。１つの実施形態では、抗体は、配列番号２２の軽鎖可変領域（１Ａ１１．Ｌ４ Ｖκ）を含んでなる。
別の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４又は配列番号１３２〜配列番号１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３
のうちの１、２又は３つを含んでなる、重鎖可変領域を含んでなり、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）重鎖可変領域の位置６６におけるリシン残基、位置６９におけるフェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン又はバリン残基、及び位置７１におけるバリン、アルギニン、アラニン又はロイシン残基のうちの少なくとも１つを更に含んでなり；
且つ以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２、
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１、２又は３つを含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなり、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）可変領域軽鎖の位置４５におけるリシン残基、位置４６におけるプロリン残基、位置４７におけるトリプトファン残渣、位置５８におけるバリン残基、位置６０におけるバリン残基、位置７０におけるセリン残基、及び位置７１におけるチロシン又はフェニルアラニン残基のうちの少なくとも１つを更に含んでなる、抗体を提供する。
抗体は、１つの重鎖ＣＤＲ及び１つの軽鎖ＣＤＲから前記ＣＤＲの６つ全て（すなわち、３つの重鎖及び３つの軽鎖ＣＤＲの全て）までを含んでなる、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の任意の組合せを含んでなり得る。１つの実施形態では、抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の６つ全てを含んでなる。
１つの実施形態では、抗体は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４又は配列番号１３３〜配列番号１３８のいずれか記載のＣＤＲＨ３
を含んでなる、重鎖可変領域と、
以下の相補性決定領域：
（ｉｖ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１、
（ｖ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２、
（ｖｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３
を含んでなる、軽鎖可変領域とを含んでなり、
重鎖可変領域の位置６９におけるロイシン残基、及び軽鎖可変領域の位置４６におけるプロリン残基を更に含んでなる。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列（１Ａ１１．Ｈ３ ＶＨ）又は配列番号１３のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、重鎖可変領域、あるいは配列番号１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１のいずれか記載のアミノ酸配列を含んでなる、重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列（１Ａ１１．Ｌ４ Ｖκ）又は配列番号２２のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、軽鎖可変領域とを含んでなる。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１４のアミノ酸配列、又は配列番号１１４若しくは配列番号１１８のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、重鎖を含んでなる。特定の実施形態では、重鎖は、Ｎ９８Ｄ、Ｎ９８Ｅ、Ｆ１００ｂＥ、Ｆ１００ｂＨ、Ｆ１００ｂＩ及びＦ１００ｂＶ（Ｋａｂａｔ）から選択される１以上の置換を含んでなる。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１５のアミノ酸配列、又は配列番号１１５のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、軽鎖を含んでなる。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１４若しくは１１８のアミノ酸配列、又は配列番号１１４若しくは１１８のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、重鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列又は配列番号１１５のアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、軽鎖とを含んでなる。特定の実施形態は、配列番号１１８の重鎖アミノ酸配列と、配列番号１１５の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗原結合タンパク質を含んでなる。
別の態様では、本発明は：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲ、あるいは配列番号１３２〜１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３、
（ｉｖ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３又はその変異体ＣＤＲ
のうちの１以上を含んでなる、抗原結合タンパク質であって、以下の残基：
（ａ）位置２におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＧｌｙ
（ｂ）位置４におけるＬｅｕ又はＶａｌ
（ｃ）位置２０におけるＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
（ｄ）位置２２におけるＣｙｓ
（ｅ）位置２４におけるＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
（ｆ）位置２６におけるＧｌｙ
（ｇ）位置４７におけるＴｒｐ又はＴｙｒ
（ｈ）位置４８におけるＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＬｅｕ
（ｉ）位置６９におけるＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
（ｊ）位置７１におけるＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＬｅｕ
（ｋ）位置７８におけるＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅ
（ｌ）位置８０におけるＬｅｕ又はＭｅｔ
（ｍ）位置９０におけるＴｒｙ又はＰｈｅ
（ｎ）位置９２におけるＣｙｓ
（ｏ）位置９４におけるＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ又はＡｓｎ
のうちの少なくとも１つを有する重鎖フレームワーク及び／又は以下の残基：
（ｐ）位置２におけるＩｌｅ
（ｑ）位置４におけるＬｅｕ
（ｒ）位置２３におけるＣｙｓ
（ｓ）位置３５におけるＴｒｐ
（ｔ）位置３６におけるＴｒｙ
（ｕ）位置７１におけるＴｒｙ又はＰｈｅ
（ｖ）位置８８におけるＣｙｓ
（ｗ）位置９８におけるＰｈｅ
のうちの少なくとも１つを有する軽鎖フレームワークを更に含んでなり、ＣＤ１２７に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
抗原結合タンパク質は、１つのＣＤＲから６つの前記ＣＤＲ（配列番号２〜７）までを含んでなる、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の任意の組合せを含んでなり得る。１つの実施形態では、前記抗原結合タンパク質は、前記ＣＤＲの６つ全て（配列番号２〜７）を含んでなる。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、上記重鎖フレームワークと軽鎖フレームワーク領域とを両方とも含んでなる。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体であり、任意で、ヒト化抗体若しくはヒト化抗体、又はこれらの抗原結合断片である。
本発明のこの態様の１以上の変異体ＣＤＲは、以下を含んでなり得る：
（ａ）以下のＣＤＲＨ１（配列番号２）の変異体：
ｉ．位置３２におけるチロシン残基が、イソロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている；
ｉｉ．位置３３におけるトレオニン残基が、チロシン、アラニン、トリプトファン、グリシン、ロイシン又はバリンに置換されている；
ｉｉｉ．位置３４におけるメチオニン残基が、イソロイシン、バリン又はトリプトファンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置３５におけるアスパラギン残基が、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、チロシン又はトレオニンに置換されている；
（ｂ）以下のＣＤＲＨ２（配列番号３）の変異体：
ｉ．位置５０におけるロイシン残基が、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、アスパラギン、リシン又はアラニンに置換されている；
ｉｉ．位置５１におけるイソロイシン残基が、ロイシン、バリン、トレオニン、セリン又はアスパラギンに置換されている；
ｉｉｉ．位置５２におけるアスパラギン残基が、アスパラギン、ロイシン、セリン又はチロシンに置換されている；
ｉｖ．位置５３におけるチロシン残基が、アラニン、グリシン、セリン、リシン、トレオニン又はアスパラギンに置換されている；
ｖ．位置５４におけるアスパラギンが、セリン、トレオニン、リシン、アスパラギン又はグリシンに置換されている；
ｖｉ．位置５６におけるバリンが、チロシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、セリン又はアラニンに置換されている；及び／又は
ｖｉｉ．位置５８におけるセリンが、リシン、アスパラギン、トレオニン、アルギニン、グリシン、フェニルアラニン又はチロシンに置換されている；
（ｃ）位置１０２におけるバリンが、チロシン、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、アスパラギン酸又はグリシンに置換されているＣＤＲＨ３（配列番号４）の変異体；
（ｄ）以下のＣＤＲＬ１（配列番号５）の変異体：
ｉ．位置２９におけるセリンが、バリンに置換されている；及び／又は
ｉｉ．位置３３におけるメチオニンが、ロイシンに置換されている；及び／又は
（ｅ）以下の置換のうちの１以上を含んでなる、ＣＤＲＬ３（配列番号７）の変異体：
ｉ．位置８９におけるグルタミンが、ロイシンに置換されている；
ｉｉ．位置９０におけるグルタミン酸が、グルタミンに置換されている；
ｉｉｉ．位置９１におけるトリプトファンが、チロシンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置９３におけるチロシンが、セリン又はアルギニンに置換されている。
抗原結合タンパク質は、配列番号１０〜１７のいずれかの重鎖可変領域（１Ａ１１．Ｈ０ ＶＨ〜１Ａ１１．Ｈ７ ＶＨ）又は配列番号１２１、１２３、１２５、１２７、１２９若しくは１３１のいずれかの重鎖可変領域を含んでなり得る。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３の重鎖可変領域（１Ａ１１．Ｈ３ ＶＨ）を含んでなる。前記抗原結合タンパク質は、配列番号１８〜２７のいずれかの軽鎖可変領域（１Ａ１１．Ｌ０ Ｖκ〜１Ａ１１．Ｌ９ Ｖκ）を含んでなり得る。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号２２の軽鎖可変領域（１Ａ１１．Ｌ４ Ｖκ）を含んでなる。
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３の重鎖可変領域（１Ａ１１．Ｈ３ ＶＨ）及び配列番号２２の軽鎖可変領域（１Ａ１１．Ｌ４ Ｖκ）を含んでなる。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１４又は配列番号１１８、特に配列番号１１８の重鎖と、配列番号１１５の軽鎖とを含んでなる。重鎖は、以下の置換のいずれかを更に含んでなり得る：Ｎ９８Ｄ、Ｎ９８Ｅ、Ｆ１００ｂＥ、Ｆ１００ｂＨ、Ｆ１００ｂＩ及びＦ１００ｂＶ（Ｋａｂａｔ）。
別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３内に１以上の点突然変異を含んでなり、前記抗原結合タンパク質は、前記突然変異を欠く抗原結合タンパク質よりもＩＬ−７Ｒに対して高い結合親和性を有する。例えば、１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３２〜１３７に記載のＣＤＲＨ３を含んでなる。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１に記載の重鎖可変領域を含んでなる。
別の態様では、本発明は、以下に記載の重鎖可変ドメイン：
（ａ）配列番号１１
（ｂ）配列番号１２
（ｃ）配列番号１３
（ｄ）配列番号１４
（ｅ）配列番号１５
（ｆ）配列番号１６
（ｇ）配列番号１７
（ｈ）配列番号１２１
（ｉ）配列番号１２３
（ｊ）配列番号１２５
（ｋ）配列番号１２７
（ｌ）配列番号１２９
（ｍ）配列番号：１３１、
又は配列番号１１〜１７のうちの１つに対して７０％以上の同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質であって、ＣＤ１２７に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
１つの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１〜１７のうちの１つに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する。
１つの実施形態では、前記抗原結合タンパク質は、配列番号１３に記載の重鎖可変ドメイン、又は配列番号１３に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる。
１つの実施形態では、前記抗原結合タンパク質は、配列番号１１５又は配列番号１１８に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する重鎖を有する。
１つの実施形態では、重鎖、又は重鎖可変ドメインは、配列番号１１〜１７、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１のうちの１つの変異体であり、変異の程度は、以下のうちの１以上からなる：
ｉ．位置２におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＧｌｙ
ｉｉ．位置４におけるＬｅｕ又はＶａｌ
ｉｉｉ．位置２０におけるＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
ｉｖ．位置２４におけるＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
ｖ．位置４７におけるＴｒｐ又はＴｙｒ
ｖｉ．位置４８におけるＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＬｅｕ
ｖｉｉ．位置６９におけるＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
ｖｉｉｉ．位置７１におけるＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＬｅｕ
ｉｘ．位置７８におけるＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅ
ｘ．位置８０におけるＬｅｕ又はＭｅｔ
ｘｉ．位置９０におけるＴｒｙ又はＰｈｅ、及び
ｘｉｉ．位置９４におけるＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ又はＡｓｎ。
別の態様では、本発明は、以下に記載の軽鎖可変ドメイン：
（ａ）配列番号１９
（ｂ）配列番号２０
（ｃ）配列番号２１
（ｄ）配列番号２２
（ｅ）配列番号２３
（ｆ）配列番号２４
（ｇ）配列番号２５
（ｈ）配列番号２６
（ｉ）配列番号２７
又は配列番号１９〜２７のうちの１つに対して７０％以上の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗原結合タンパク質であって、ＣＤ１２７に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号２２に記載の軽鎖可変ドメイン、又は配列番号２２に対して７０％以上の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。
１つの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１９〜２７のうちの１つに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１１５に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する軽鎖を有する。
本発明は、記載する重鎖及び軽鎖の可変ドメインの任意の対合を意図する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、また、以下の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの組合せのうちの任意の１つを含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する：配列番号１１の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１３の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１４の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１５の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１６の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；配列番号１７の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２１の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２３の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２５の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２７の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号１２９の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；あるいは、
配列番号１３１の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３に記載の配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、重鎖可変ドメインと、配列番号２２に記載の配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３に記載の重鎖可変ドメインと配列番号２２に記載の軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
別の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲ、あるいは配列番号１３２〜１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３、
（ｉｖ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３又はその変異体ＣＤＲ、
のうちの１以上を含んでなり、前記ＣＤＲのうちの少なくとも１つが変異体ＣＤＲであり、ＣＤ１２７に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号６に記載のＣＤＲＬ２又はその変異体を少なくとも含んでなる。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号４に記載のＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲを少なくとも含んでなる。本発明のこの態様の変異体ＣＤＲは、以下を含んでなり得る：
（ｆ）以下のＣＤＲＨ１（配列番号２）の変異体：
ｉ．位置３２におけるチロシン残基が、イソロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている；
ｉｉ．位置３３におけるトレオニン残基が、チロシン、アラニン、トリプトファン、グリシン、ロイシン又はバリンに置換されている；
ｉｉｉ．位置３４におけるメチオニン残基が、イソロイシン、バリン又はトリプトファンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置３５におけるアスパラギン残基が、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、チロシン又はトレオニンに置換されている；
（ｇ）以下のＣＤＲＨ２（配列番号３）の変異体：
ｉ．位置５０におけるロイシン残基が、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、アスパラギン、リシン又はアラニンに置換されている；
ｉｉ．位置５１におけるイソロイシン残基が、ロイシン、バリン、トレオニン、セリン又はアスパラギンに置換されている；
ｉｉｉ．位置５２におけるアスパラギン残基が、アスパラギン、ロイシン、セリン又はチロシンに置換されている；
ｉｖ．位置５３におけるチロシン残基が、アラニン、グリシン、セリン、リシン、トレオニン又はアスパラギンに置換されている；
ｖ．位置５４におけるアスパラギンが、セリン、トレオニン、リシン、アスパラギン又はグリシンに置換されている；
ｖｉ．位置５６におけるバリンが、チロシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、セリン又はアラニンに置換されている；及び／又は
ｖｉｉ．位置５８におけるセリンが、リシン、アスパラギン、トレオニン、アルギニン、グリシン、フェニルアラニン又はチロシンに置換されている；
（ｈ）位置１０２におけるバリンが、チロシン、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、アスパラギン酸又はグリシンに置換されているＣＤＲＨ３（配列番号４）の変異体；
（ｉ）以下のＣＤＲＬ１（配列番号５）の変異体：
ｉ．位置２９におけるセリンが、バリンに置換されている；及び／又は
ｉｉ．位置３３におけるメチオニンが、ロイシンに置換されている；及び／又は
（ｊ）以下の置換のうちの１以上を含んでなる、ＣＤＲＬ３（配列番号７）の変異体：
ｉ．位置８９におけるグルタミンが、ロイシンに置換されている；
ｉｉ．位置９０におけるグルタミン酸が、グルタミンに置換されている；
ｉｉｉ．位置９１におけるトリプトファンが、チロシンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置９３におけるチロシンが、セリン又はアルギニンに置換されている。
別の態様では、本発明は、
重鎖可変ドメインフレームワークに：
（ｉ）配列番号２に記載のＣＤＲＨ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉ）配列番号３に記載のＣＤＲＨ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲ、あるいは配列番号１３２〜１３７のいずれか記載のＣＤＲＨ３
を含んでなり、
（ａ）位置２におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、又はＧｌｙ
（ｂ）位置４におけるＬｅｕ又はＶａｌ
（ｃ）位置２０におけるＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
（ｄ）位置２２におけるＣｙｓ
（ｅ）位置２４におけるＴｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
（ｆ）位置２６におけるＧｌｙ
（ｇ）位置４７におけるＴｒｐ又はＴｙｒ
（ｈ）位置４８におけるＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＬｅｕ
（ｉ）位置６９におけるＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＶａｌ
（ｊ）位置７１におけるＡｒｇ、Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＬｅｕ
（ｋ）位置７８におけるＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、又はＰｈｅ
（ｌ）位置８０におけるＬｅｕ又はＭｅｔ
（ｍ）位置９０におけるＴｒｙ又はＰｈｅ
（ｎ）位置９２におけるＣｙｓ
（ｏ）位置９４におけるＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ又はＡｓｎ、
のうちの少なくとも１つを含んでなる、重鎖可変ドメインと、
軽鎖可変ドメインフレームワークに：
（ｉｖ）配列番号５に記載のＣＤＲＬ１又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖ）配列番号６に記載のＣＤＲＬ２又はその変異体ＣＤＲ、
（ｖｉ）配列番号７に記載のＣＤＲＬ３又はその変異体ＣＤＲ
を含んでなり、
（ａ）位置２におけるＩｌｅ
（ｂ）位置４におけるＬｅｕ
（ｃ）位置２３におけるＣｙｓ
（ｄ）位置３５におけるＴｒｐ
（ｅ）位置３６におけるＴｒｙ
（ｆ）位置７１におけるＴｒｙ又はＰｈｅ
（ｇ）位置８８におけるＣｙｓ
（ｈ）位置９８におけるＰｈｅ
のうちの少なくとも１つを含んでなる、軽鎖可変ドメインとを含んでなり、ＣＤ１２７に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
本発明のこの態様の変異体ＣＤＲは、以下を含んでなり得る：
（ａ）以下のＣＤＲＨ１（配列番号２）の変異体：
ｉ．位置３２におけるチロシン残基が、イソロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン、システイン、グルタミン酸又はアスパラギン酸に置換されている；
ｉｉ．位置３３におけるトレオニン残基が、チロシン、アラニン、トリプトファン、グリシン、ロイシン又はバリンに置換されている；
ｉｉｉ．位置３４におけるメチオニン残基が、イソロイシン、バリン又はトリプトファンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置３５におけるアスパラギン残基が、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、チロシン又はトレオニンに置換されている；
（ｂ）以下のＣＤＲＨ２（配列番号３）の変異体：
ｉ．位置５０におけるロイシン残基が、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、アスパラギン、リシン又はアラニンに置換されている；
ｉｉ．位置５１におけるイソロイシン残基が、ロイシン、バリン、トレオニン、セリン又はアスパラギンに置換されている；
ｉｉｉ．位置５２におけるアスパラギン残基が、アスパラギン、ロイシン、セリン又はチロシンに置換されている；
ｉｖ．位置５３におけるチロシン残基が、アラニン、グリシン、セリン、リシン、トレオニン又はアスパラギンに置換されている；
ｖ．位置５４におけるアスパラギンが、セリン、トレオニン、リシン、アスパラギン又はグリシンに置換されている；
ｖｉ．位置５６におけるバリンが、チロシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、セリン又はアラニンに置換されている；及び／又は
ｖｉｉ．位置５８におけるセリンが、リシン、アスパラギン、トレオニン、アルギニン、グリシン、フェニルアラニン又はチロシンに置換されている；
（ｃ）位置１０２におけるバリンが、チロシン、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、アスパラギン酸又はグリシンに置換されているＣＤＲＨ３（配列番号４）の変異体；
（ｄ）以下のＣＤＲＬ１（配列番号５）の変異体：
ｉ．位置２９におけるセリンが、バリンに置換されている；及び／又は
ｉｉ．位置３３におけるメチオニンが、ロイシンに置換されている；及び／又は
（ｅ）以下の置換のうちの１以上を含んでなる、ＣＤＲＬ３（配列番号７）の変異体：
ｉ．位置８９におけるグルタミンが、ロイシンに置換されている；
ｉｉ．位置９０におけるグルタミン酸が、グルタミンに置換されている；
ｉｉｉ．位置９１におけるトリプトファンが、チロシンに置換されている；及び／又は
ｉｖ．位置９３におけるチロシンが、セリン又はアルギニンに置換されている。
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体であり、任意で、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又はこれらの抗原結合断片である。
別の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号３９に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号４０に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４１に記載のＣＤＲＨ３
のうちの１、２、又は３つを含んでなる、重鎖可変領域を含んでなる、抗体であって、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）重鎖可変領域の位置２４におけるバリン、位置２７におけるチロシン、位置２８におけるセリン、位置２９におけるイソロイシン、位置３０におけるトレオニン、位置４８におけるメチオニン、位置４９におけるグリシン、位置６７におけるイソロイシン、位置６８におけるセリン、位置７１におけるアルギニン、位置７３におけるトレオニン、及び位置７８におけるフェニルアラニンのうちの少なくとも１つを更に含んでなる、抗体を提供する。
１つの実施形態では、抗体は、位置２７におけるチロシン、位置３０におけるトレオニン、位置４８におけるメチオニン、位置６７におけるイソロイシン及び位置７１におけるアルギニンのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全てを含んでなる。
抗体は、ＣＤＲＨ１（配列番号３９）及びＣＤＲＨ３（配列番号４１）；ＣＤＲＨ２（配列番号４０）及びＣＤＲＨ３（配列番号４１）；ＣＤＲＨ１（配列番号３９）及びＣＤＲＨ２（配列番号４０）；又はＣＤＲＨ１（配列番号３９）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０）及びＣＤＲＨ３（配列番号４１）を含んでなる、重鎖可変領域を含んでなり得る。抗体は、配列番号４８〜５６（６Ａ３ＩＧＨＶ４＿６１．Ｈ１ ＶＨ〜６Ａ３ＩＧＨＶ４＿６１．Ｈ９）又は配列番号５８〜６８（６Ａ３ＩＧＨＶ３−３３．Ｈ１ ＶＨ〜６Ａ３ ＩＧＨＶ３−３３．Ｈ１１）のうちのいずれかの重鎖可変領域を含んでなり得る。
また、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉｖ）配列番号４２に記載のＣＤＲＬ１、
（ｖ）配列番号４３に記載のＣＤＲＬ２、
（ｖｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１つ、２つ、又は３つを含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなる、抗体であって、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）
（ａ）可変領域軽鎖の位置４５におけるグルタミン残基、及び位置７０におけるリシン残基の一方又は両方、あるいは
（ｂ）位置４におけるロイシン、位置３１におけるチロシン、位置７０におけるメチオニン、位置８５におけるトレオニン、位置９４におけるチロシン、位置１００におけるグリシン、及び位置１０４におけるバリンのうちの１以上
を更に含んでなる、抗体を提供する。
１つの実施形態では、抗体は、位置４５におけるグルタミン残基及び位置７１におけるリシン残基を両方とも含んでなる。別の実施形態では、抗体は、位置４におけるロイシン、位置３１におけるチロシン、位置７０におけるメチオニン、位置８５におけるトレオニン、位置９４におけるチロシン、位置１００におけるグリシン、及び位置１０４におけるバリンの各々を含んでなる。
抗体は、ＣＤＲＬ１（配列番号４２）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）；ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）；ＣＤＲＬ１（配列番号４２）及びＣＤＲＬ２（配列番号４３）；又はＣＤＲＬ１（配列番号４２）、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）を含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなり得る。抗体は、配列番号７０〜７２及び１３８のうちのいずれかの軽鎖可変領域（６Ａ３．Ｌ１ Ｖκ、６Ａ３．Ｌ２ Ｖκ、６Ａ３．Ｌ３ Ｖκ及び６Ａ３．Ｌ２７ Ｖκ）を含んでなり得る。
別の態様では、本発明は、以下の相補性決定領域：
（ｉｖ）配列番号３９に記載のＣＤＲＨ１、
（ｖ）配列番号４０に記載のＣＤＲＨ２、
（ｖｉ）配列番号４１に記載のＣＤＲＨ３
のうちの１、２、又は３つを含んでなる、重鎖可変領域を含んでなり、
重鎖可変領域の位置２４におけるバリン、位置２７におけるチロシン、位置２８におけるセリン、位置２９におけるイソロイシン、位置３０におけるトレオニン、位置４８におけるメチオニン、位置４９におけるグリシン、位置６７におけるイソロイシン、位置６８におけるセリン、位置７１におけるアルギニン、位置７３におけるトレオニン、及び位置７８におけるフェニルアラニンのうちの少なくとも１つを更に含んでなり、
以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号４２に記載のＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号４３に記載のＣＤＲＬ２、
（ｉｉｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲＬ３
のうちの１つ、２又は３つを含んでなる、軽鎖可変領域を含んでなり、
（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）
（ａ）可変領域軽鎖の位置４５におけるグルタミン残基及び位置７０におけるリシン残基の一方又は両方；あるいは
（ｂ）位置４におけるロイシン、位置３１におけるチロシン、位置７０におけるメチオニン、位置８５におけるトレオニン、位置９４におけるチロシン、位置１００におけるグリシン、及び位置１０４におけるバリンのうちの１以上
を更に含んでなる、抗体を提供する。
抗体は、１つの重鎖ＣＤＲ及び１つの軽鎖ＣＤＲから前記ＣＤＲの６つ全てまでを含んでなる、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の任意の組合せを含んでなり得る。
１つの実施形態では、抗体は、以下の相補性決定領域：
（ｉ）配列番号３９に記載のＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号４０に記載のＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号４１に記載のＣＤＲＨ３、
（ｉｖ）配列番号４２に記載のＣＤＲＬ１、
（ｖ）配列番号４３に記載のＣＤＲＬ２、
（ｖｉ）配列番号４４に記載のＣＤＲＬ３
を含んでなる、重鎖可変領域を含んでなり、
前記抗体は、以下のうちの少なくとも１つを更に含んでなる：
（ａ）重鎖可変領域の位置２４におけるバリン、位置２７におけるチロシン、位置２８におけるセリン、位置２９におけるイソロイシン、位置３０におけるトレオニン、位置４８におけるメチオニン、位置４９におけるグリシン、位置６７におけるイソロイシン、位置６８におけるセリン、位置７１におけるアルギニン、位置７３におけるトレオニン、及び位置７８におけるフェニルアラニン、及び／又は
（ｂ）（Ｋａｂａｔに従って番号付けされる）
ａ．可変領域軽鎖の位置４５におけるグルタミン残基及び位置７０におけるリシン残基のうちの少なくとも１つ、又は
ｂ．位置４におけるロイシン、位置３１におけるチロシン、位置７０におけるメチオニン、位置８５におけるトレオニン、位置９４におけるチロシン、位置１００におけるグリシン、及び位置１０４におけるバリンのうちの１以上。
本発明は、記載する重鎖及び軽鎖の可変ドメインの任意の対合を意図する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、また、以下の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの組合せのうちの任意の１つを含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する：配列番号４７の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号４８の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号４９の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（また配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５０の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５１の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５２の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５３の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５４の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５５の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５６の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５７の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５８の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号５９の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６０の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６１の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６２の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６４の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６４の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６５の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６６の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；
配列番号６７の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）；並びに、
配列番号６８の重鎖可変ドメイン（又はそれに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有する配列）と、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれか１つの軽鎖可変ドメイン（又は配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、又は配列番号１３８のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する配列）。
特定の実施形態では、配列番号５３、５４、５５、又は５６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。
結合タンパク質は、抗体、特に、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又はこれらの抗原結合断片であり得る。
別の態様では、本発明は、配列番号２８の可変重鎖ドメインと配列番号２９の可変軽鎖ドメイン、又は配列番号７３の可変重鎖ドメインと配列番号７４の可変軽鎖ドメインを含んでなる、キメラ抗体を提供する。
本発明の抗原結合タンパク質は、ＴＳＬＰシグナル伝達を阻害することはできない。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質はＴＳＬＰシグナル伝達を阻害しない。
また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。１つの実施形態では、本発明は、配列番号３０〜３８、配列番号７５〜１１３、配列番号１１９〜１２０、並びに配列番号１２２、１２４、１２６、１２８、及び１３０の核酸分子を提供する。また、本発明は、本明細書に定義する核酸分子を含んでなる、発現ベクター、及び本明細書に定義する発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を提供する。発現ベクターは、配列番号３０〜３８、配列番号７５〜１１３、及び配列番号１１９〜１２０、並びに配列番号１２２、１２４、１２６、１２８、及び１３０のうちの任意の１以上の核酸分子を含んでなり得る。１つの実施形態では、発現ベクターは、上記抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる。別の実施形態では、本発明は、上記発現ベクターを含んでなる、宿主細胞を提供する。更なる実施形態では、本発明は、上記宿主細胞によって発現される抗体を提供する。
また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法であって、上に定義した宿主細胞を培養する工程と、前記抗原結合タンパク質を回収する工程とを含んでなる、方法を提供する。
また、本発明は、本発明に係る抗体又は抗原結合タンパク質をコードする核酸配列又は配列を含んでなる、宿主細胞により発現される本発明に係る抗体又は抗原結合タンパク質を提供する。
また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質と、薬学上許容される担体又は賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
また、本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に罹患している被験体を治療する方法であって、本発明の抗原結合タンパク質を被験体に投与する工程を含んでなる、方法を提供する。
また、本発明は、病原性ＴＨ１７細胞が関与する疾患に罹患している被験体を治療する方法であって、本発明の抗原結合タンパク質を被験体に投与する工程を含んでなる、方法を提供する。
また、本発明は、アップレギュレートされたＩＬ−１７の発現に関連する疾患に罹患している被験体を治療する方法であって、本発明の抗原結合タンパク質を被験体に投与する工程を含んでなる、方法を提供する。
具体的には、自己免疫疾患又は炎症性疾患、病原性のＴＨ１７細胞が関与する疾患、あるいはアップレギュレートされたＩＬ−１７の発現に関連する疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、ＳＬＥ、関節リウマチ、ベーチェット病、又は喘息であり得る。１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、多発性硬化症を治療する方法において有用である。本発明の抗原結合タンパク質の投与によって治療することができる他の疾患を本明細書に記載する。
また、本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患；病原性のＴＨ１７細胞が関与する疾患；あるいはアップレギュレートされたＩＬ−１７の発現に関連する疾患に罹患している被験体の治療において使用するための、本明細書に記載する抗原結合タンパク質を提供する。
また、本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患；病原性のＴＨ１７細胞が関与する疾患；あるいはアップレギュレートされたＩＬ−１７の発現に関連する疾患に罹患している被験体の治療において使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の使用を提供する。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。
図１は、ｈＩＬ−７Ｒを発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗ＩＬ７Ｒ ｍＡｂ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の補体依存性細胞傷害を示す。 図２は、末梢血単核細胞の存在下における、ｈＩＬ−７Ｒを発現するＨＥＫ２９３細胞に対するヒト化抗ＩＬ７Ｒ ｍＡｂ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及びＦｃ不能抗ＩＬ７Ｒ ｍＡｂ（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃ）の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す。 図３Ａ及び３Ｂは、２人の別々のドナーによって提供されたヒトＰＢＭＣにおける１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４によるＩＬ−７誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を示す。 図４Ａ〜４Ｄは、（４人の異なるドナーにおける）１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４による分化したヒトＴｈ１７細胞におけるＩＬ−７誘導性ＩＬ−１７産生の阻害を示す。 図５Ａ〜５Ｅは、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４がＴＡＲＣ（胸腺及び活性化制御ケモカイン）のＴＳＬＰ誘導に影響を与えないことを示す。
ＩＬ−７／ＩＬ−７Ｒシグナル伝達は、マウス及びヒトの両方の系において関係するＴＨ１７細胞の生存及び増殖にとって必須であるが、ＴＨ１７分化におけるその役割は、ＩＬ−６に比べて本質的ではない（Ｌｉｕら，（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６：１９１−１９７）。驚くべきことに、ＩＬ−７Ｒの拮抗作用による免疫系に対するインビボにおける効果は、多発性硬化症の動物モデルであるＥＡＥにおいて高度に選択的であり、ＴＨ１７細胞に影響を与え、それよりも低い程度ではあるが主に記憶表現型のＴＨ１細胞に影響を与え、Ｔｒｅｇ細胞には影響を与えない。この選択性が、ＥＡＥにおけるＩＬ−７Ｒ拮抗作用による病原性のＴＨ１７細胞とＴｒｅｇ細胞との比のリバランシングにおいて重要な役割を果たしていると考えられ、また、治効に寄与している。
ＴＨ１７細胞の生存及び増殖におけるＩＬ−７／ＩＬ−７Ｒシグナル伝達の役割は、ＭＳ等のヒト自己免疫疾患におけるＩＬ−７Ｒ拮抗作用の治効を補助することである。ＩＬ−７の中和又はＩＬ−７Ｒの拮抗作用は、独自の治療上の利点を有する可能性がある。一方では、この治療は、病原性のＴＨ１及びＴＨ１７細胞とＴｒｅｇ及び無関係な免疫細胞を区別する選択性を付与する。他方では、ＩＬ−７Ｒ拮抗作用の更なる治療上の利点は、ＴＨ１７の分化とは対照的に、分化したＴＨ１７の生存及び増殖に対するその選択的効果を含んでなる。ＴＨ１７分化に対する関係するＴＨ１７のインビボにおける維持を標的とすることが、治療の状況においてより効率的であると考えられる。したがって、ＩＬ−７受容体媒介性シグナル伝達の阻害は、自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療するための有望な治療的介入を提供する。
本発明で使用するＩＬ−７Ｒ媒介性シグナル伝達という用語は、そのリガンドであるＩＬ−７が結合したときにＩＬ−７受容体複合体によって引き起こされる生物学的作用を意味する。したがって、ＩＬ−７Ｒ媒介性シグナル伝達は、必ずしも限定される訳ではないが、ＳＴＡＴ−５のＩＬ−７誘導性リン酸化、ＴＨ１７細胞のＩＬ−７誘導性増殖、及びＴＨ１７細胞のＩＬ−７誘導性生存のうちの１以上又は全てを含んでなる。
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３１３６号（国際出願第２０１０／０１７４６８号パンフレット）には、マウス抗体１Ａ１１及び６Ａ３が記載されている。これら抗体は、ヒトＩＬ−７受容体のα鎖であるＣＤ１２７（配列番号１）に特異的に結合する。これら抗体の可変ドメインは、配列番号８及び９（それぞれ、ＶＨ、Ｖκ１Ａ１１）、並びに配列番号４５及び４６（それぞれＶＨ、Ｖκ６Ａ３）に記載されている。
本発明は、１Ａ１１又は６Ａ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１以上を含んでなる、抗原結合タンパク質、及びその変異体を提供する。抗原結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒに結合し、ＩＬ−７Ｒのシグナル伝達を中和することができる。１つの実施形態では、本発明は、ヒトアクセプタ抗体においてマウス抗体１Ａ１１又は６Ａ３（ドナー抗体）由来のＣＤＲのうちの１つ〜６つを含んでなる、ヒト化抗体を提供する。
本発明で使用する用語「抗原結合タンパク質」は、ＣＤ１２７に結合することができる抗体、抗体断片、及びドメイン等のタンパク質構造を指す。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体である。
本発明で使用する用語「抗体」は、最も広い意味で、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指し、例えば、モノクローナル抗体、組換え型抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、単鎖Ｆｖ、ダイアボディ、Ｔａｎｄａｂｓ（商標）等が挙げられる（別の「抗体」フォーマットの概要については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５年，２３巻，９号，１１２６−１１３６を参照されたい）。
語句「単一可変ドメイン」とは、異なる可変領域又はドメインとは独立に、抗原又はエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質の可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。
「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」は、抗原に結合することができる「単一可変ドメイン」と同一であると考えてよい。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、げっ歯類（例えば、国際公開第００／２９００４号パンフレットに開示されている）、テンジクザメ及びラクダ科のＶＨＨｄＡｂ等の他の種に由来する単一抗体可変ドメインも含んでなる。ラクダ科のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ及びグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖が欠けている重鎖抗体を産生する。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野において利用可能な標準技術に従ってヒト化することができ、このようなドメインは、「ドメイン抗体」であると考えられる。本発明で使用するＶＨとしては、ラクダ科のＶＨＨドメインが挙げられる。
本発明で使用する用語「ドメイン」は、タンパク質の残りとは無関係の三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残りの機能を失うことなく付加、除去、又は他のタンパク質に転移することができる。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる、折り畳まれたポリペプチドドメインである。したがって、それは、完全な抗体可変ドメイン及び、例えば、抗体可変ドメインに特徴的ではない配列、切頭されているか又はＮ末端若しくはＣ末端に伸長を含んでなる、抗体可変ドメイン、並びに完全長ドメインの結合活性及び特異性を少なくとも保持する可変ドメインの折り畳まれた断片によって１つ以上のループが置換されている改変可変ドメインを含んでなる。ドメインは、異なる可変領域又はドメインとは無関係に抗原又はエピトープに結合することができる。
抗原結合断片は、ドメイン等の非抗体タンパク質スカフォールドに１以上のＣＤＲを配置することにより提供することができる。非抗体タンパク質スカフォールド又はドメインは、例えば、以下から選択されるスカフォールドの誘導体であるドメイン等の天然リガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学に供されたものである：ＣＴＬＡ−４（エヴィボディ）；リポカイン；プロテインＡのＺドメイン等のプロテインＡに由来する分子（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａドメイン（アヴィマー／マキシボディ）；ＧｒｏＥｌ及びＧｒｏＥＳ等の熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ−型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ−クリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒素クニッツ型ドメイン（アドネクチン）；これらは、その天然リガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学に供されている。
ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合性を付与してもよい。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１−２），３１−４５（２００１年）を参照されたい。
リポカインは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパクのファミリーである。これは、異なる表現抗原に結合するように改変することができるカノニカルな構造の開放端に多くのループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンの長さは１６０〜１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７−３５０（２０００年）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号明細書及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号明細書を参照されたい。
アフィボディは、抗原に結合するように改変することができる黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来するスカフォールドである。ドメインは、約５８アミノ酸の３つのへリックス束からなる。表面残基のランダム化によりライブラリが作製されている。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５−４６２（２００４年）及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号を参照されたい。
アヴィマーは、Ａドメインスカフォールドファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定の二硫化物結合構造を有する。Ａドメインのファミリーの示す自然変動をシャッフルすることにより多様性が生じる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５年）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６），９０９−９１７（２００７年７月）を参照されたい。
トランスフェリンは、モノマー性血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、１以上のＣＤＲ等のペプチド配列を許容表面ループに挿入することにより異なる標的抗原に結合するように改変することができる。改変されたトランスフェリンスカフォールドの例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４，２４０６６−２４０７３（１９９９年）を参照されたい。
設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する不可欠な膜タンパク質の結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一アンキリン反復は、２つのα−へリックス及びβ−ターンからなる３３残基のモチーフである。これらは、各反復の最初のα−へリックス及びβ−ターンにおける残基をランダム化するか、又は１以上のＣＤＲ等のペプチド配列を挿入することにより、異なる標的抗原に結合するように改変することができる。これらの結合界面は、モジュール数を増加させることにより増加し得る（親和性成熟の方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３年），ＰＮＡＳ １００（４），１７００−１７０５（２００３年）、及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５−１０２８（２００７年）、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号明細書を参照されたい。
フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変することができるスカフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５の反復単位のうちの１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。β−サンドイッチの一端における３つのループは、対象となる治療標的をアドネクチンが特異的に認識できるように改変することができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５年）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号明細書、国際公開２００５０５６７６４号パンフレット、及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号明細書を参照されたい。
ペプチドアプタマーは、定常スカフォールドタンパク質、典型的には、活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアルな認識分子である。更なる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，７８３−７９７（２００５年）を参照されたい。
ミクロボディーは、３〜４つのシステイン架橋を含有する長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来し；微小タンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢ１及びコノトキシン及びノッティンが挙げられる。微小タンパク質は、微小タンパク質の折り畳み全体に影響を与えることなく、最高２５アミノ酸を含んでなるように改変することができるループを有する。改変されたノッティンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号パンフレットを参照されたい。
他の結合ドメインとしては、異なる標的抗原結合特性を改変するためにスカフォールドとして用いられているタンパク質が挙げられ、例えば、ヒトγ−クリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒素（カリブドトキシン）、Ｃ−型レクチンドメイン（テトラネクチン）が挙げられ、これらは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓの第７章Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（２００７年，Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ編）及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７（２００６年）に概説されている。本発明の結合ドメインは、これら代替タンパク質ドメインのいずれか、及び前記ドメインにグラフトされた本発明のＣＤＲの任意の組み合わせに由来し得る。
抗原結合断片又は免疫学的に有効な断片は、部分的に重鎖又は軽鎖の可変配列を含んでなり得る。断片の長さは、少なくとも５、６、８、又は１０アミノ酸である。あるいは、断片の長さは、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５、又は少なくとも１００アミノ酸である。
抗原結合タンパク質に関連して本明細書全体で用いる用語「特異的に結合する」は、抗原結合タンパク質が、他の（例えば、無関係の）タンパク質には全く結合しないか又は殆ど結合しないがＣＤ１２７には結合することを意味する。すなわち、本明細書に記載する抗原結合タンパク質及び抗体は、ＣＤ１２７に特異的に結合し得る。しかし、この用語は、抗原結合タンパク質が、マウスＣＤ１２７、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、又はマーモセットのＣＤ１２７等の他の種に由来するＣＤ１２７と交差反応し得るという事実を除外するものではない。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、カニクイザル及びマーモセットのの両方ＣＤ１２７に結合する。本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、他の種に由来するＣＤ１２７に結合するよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００、又は１０００倍高い親和性でヒトのＣＤ１２７に結合し得る。
抗原結合タンパク質−ＣＤ１２７相互作用の結合親和性又は平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下又は１ｎＭ以下であり得る。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭ；又は１〜２ｎＭであってもよい。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭ；又は５００ｐＭ〜１ｎＭであってもよい。抗原結合タンパク質の結合親和性は、会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）によって決定される（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）により、例えば、一級アミンカップリングによってＣＭ５チップにカップリングされたＣＤ１２７による抗原捕捉及びこの表面上における抗原捕捉により測定することができる。実施例４に記載のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）法を使用して、結合親和性を測定することができる。あるいは、結合親和性は、ＦＯＲＴＥｂｉｏにより、例えば、一級アミンカップリングによってＣＭ５針にカップリングされたＣＤ１２７による抗原捕捉及びこの表面上における抗原捕捉により測定することができる。
ｋｄは、１×１０−３ｓ―１以下、１×１０−４ｓ−１以下、又は１×１０−５ｓ−１以下であり得る。ｋｄは、１×１０−５ｓ−１〜１×１０−４ｓ−１；又は１×１０−４ｓ−１〜１×１０−３ｓ−１であり得る。ｋｄが遅いと、抗原結合タンパク質−リガンド複合体の解離を遅らせ、リガンドの中和を改善することができる。
用語「由来する」は、その意味における源が、物質の物理的起源であることを定義するだけでなく、物質と構造的に同一であるがレファレンス源を起源とする物質も定義することを意図することが、当業者には明らかであろう。したがって、「ドナー抗体でみられる残基」は必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
単離するとは、抗原結合タンパク質等の分子が、自然界で前記分子を見出すことができる環境から取り出されることを意図する。例えば、前記分子は、通常自然界において共に存在する物質から精製され得る。例えば、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含有する培養培地に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上に精製することができる。本発明の抗原結合タンパク質及び抗体は、単離された抗原結合タンパク質及び抗体であってもよい。
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体由来の軽鎖及び重鎖定常領域に会合しているドナー抗体由来の天然に存在する可変領域（軽鎖及び重鎖）を含有する改変抗体の種類を指す。
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲのうちの１以上を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１以上のヒト免疫グロブリンに由来する改変抗体の種類を指す。更に、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保つように変化させることができる（例えば、Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３２（１９８９年），Ｈｏｄｇｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１年）を参照されたい）。好適なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸の配列に対する相同性によって、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース、及びＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから選択される抗体であってもよい。（アミノ酸に基づいて）ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性により特徴付けられるヒト化抗体は、ドナーＣＤＲを挿入するために重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに好適であり得る。軽鎖の定常又は可変フレームワーク領域を供与することができる好適なアクセプター抗体は、同様の方法で選択することができる。アクセプタ抗体の重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源とする必要はないことに留意すべきである。先行技術には、このようなヒト化抗体を産生する幾つかの方法が記載されている。例えば、欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書及び欧州特許出願公開第０５４９５１号明細書を参照されたい。
用語「ドナー抗体」は、その可変領域、１以上のＣＤＲ、若しくは他の機能性断片、又はこれらのアナログのアミノ酸配列を第１の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体を指す。したがって、ドナーは、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性及び中和活性を有する免疫グロブリンコーディング領域及びそれから生じる発現した改変抗体を提供する。
用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体とは異種の抗体であって、その重鎖及び／若しくは軽鎖のフレームワーク領域並びに／又はその重鎖及び／若しくは軽鎖の定常領域をコードするアミノ酸配列の全て（又は任意の部分）を第１の免疫グロブリンパートナーに付与する抗体を指す。ヒト抗体は、アクセプター抗体であり得る。
用語「ＶＨ」及び「ＶＬ」は、それぞれ、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を指すために本発明で用いられる。また、Ｖκは、可変軽鎖ドメインを指すために使用される。
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超変異領域である。免疫グロブリンの可変部分には３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ領域）が存在する。したがって、本発明で使用する「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲ全て、３つの軽鎖ＣＤＲ全て、重鎖及び軽鎖のＣＤＲの全て、又は少なくとも２つのＣＤＲを指すために本発明で用いられる。
本明細書全体にわたって、可変ドメイン配列及び完全長抗体配列におけるアミノ酸残基は、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔの番号付け規則に従って番号付けされる。同様に、実施例で用いられる用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」は、Ｋａｂａｔの番号付け規則に従う。更なる情報については、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７年）を参照されたい。
可変ドメイン配列及び完全長抗体配列におけるアミノ酸残基について別の番号付け規則が存在することが当業者には明らかであろう。また、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら．（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３に記載の通り、ＣＤＲ配列についての別の番号付け規則も存在する。抗体の構造及びタンパク質の折り畳みは、他の残基をＣＤＲ配列の一部とみなすことを意味する場合があり、当業者にはそのように理解される。したがって、本発明で使用する用語「対応するＣＤＲ」は、例えば、表１に記載の通り、任意の番号付け規則を用いるＣＤＲ配列を指す。
当業者が利用可能なＣＤＲ配列についての他の番号付け規則としては、「ＡｂＭ」法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）及び「ｃｏｎｔａｃｔ」（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）法が挙げられる。少なくともＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びｃｏｎｔａｃｔ法のうちの少なくとも２つを用いる最小重複領域が、「最小結合単位」を提供すると定めることができる。最小結合単位は、ＣＤＲのサブ部分であってもよい。
以下の表１は、各ＣＤＲ又は結合単位について各番号付け規則を用いた１つの定義を表す。可変ドメインのアミノ酸配列を番号付けするために表１ではＫａｂａｔの番号付けスキームを使用する。ＣＤＲの定義のうちの一部は、使用される個々の刊行物によって異なる場合があることに留意するべきである。
Figure 0005850860

本発明で使用する用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合することができる抗原結合タンパク質上の部位を指す。これは単一ドメイン（例えば、エピトープ結合ドメイン）であっても単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインであってもよく、又は標準抗体で見出すことができるように対号ＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。
本発明で使用する用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触する抗原の部分を指す。エピトープは、抗原に由来する本質的に直鎖状のアミノ酸配列を含む直鎖状であってよい。あるいは、エピトープは、立体構造的であってもよく不連続であってもよい。例えば、立体構造的エピトープは、構造制御の元素を必要とするアミノ酸残基を含む。不連続なエピトープは、他の配列によって分離されるアミノ酸残基を含む、すなわち、抗原の一次配列における配列ではない。抗原の三次構造及び四次構造では、不連続エピトープの残基は、抗原結合タンパク質が結合するのに十分な程度互いに近接している。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列について、用語「同一」又は、「配列同一性」は、必要に応じて、最適に整列させ、適切に挿入又は欠失したものと比較したときの、２つの核酸又は２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適に整列させるために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列が共有している同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。下記の通り、数学アルゴリズムを使用して、配列を比較し、２つの配列間の同一性パーセントを求めることができる。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるギャッププログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、並びにギャップ重み付け４０、５０、６０、７０、又は８０、及びギャップ長重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して求めることができる。２つのヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いて求めることもできる。更に、ＧＣＧソフトウェア・パッケージにおけるギャッププログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８又は４、及びギャップ長重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを求めることができる。
１つの方法では、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載するレファレンスポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３０〜３９、配列番号７６〜１０５を参照されたい）と同一である、すなわち、１００％同一であってもよく、レファレンス配列と比べて、特定の整数以下のヌクレオチドの変化を含んでもよい、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であってもよい。このような変化は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、転位及び転換を含む置換、又は挿入から選択され、前記変化は、レファレンスヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置、又はこれら末端位置間のいずれの位置に生じてもよく、レファレンス配列中のヌクレオチドの中に個々に点在してもよく、又はレファレンス配列内の１以上の連続する群に生じてもよい。ヌクレオチドの変化の数は、本明細書に記載するレファレンスポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３０〜３９、配列番号７６〜１０５を参照されたい）におけるヌクレオチドの総数に、それぞれの同一性パーセントの数値的パーセント（１００で除された数）を乗じ、本明細書に記載するレファレンスポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３０〜３９、配列番号７６〜１０５を参照されたい）におけるヌクレオチドの総数からその積を減じることにより求められる、すなわち：
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
（式中、ｎｎは、ヌクレオチド変化の数であり、ｘｎは、本明細書に記載するレファレンスポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３０〜３９、配列番号７６〜１０５を参照されたい）におけるヌクレオチドの総数であり、ｙは、５０％の場合０．５０、６０％の場合０．６０、７０％の場合０．７０、７５％の場合０．７５、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５、９８％の場合０．９８、９９％の場合０．９９、又は１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子の記号であり、ｘｎ及びｙの非整数積は、ｘｎからそれを減じる前に最も近い整数に切り捨てられる）。
同様に、ポリペプチド配列は、本明細書に記載するレファレンスポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜２９、配列番号４０〜７５を参照されたい）と同一である、すなわち、１００％同一であってもよく、レファレンス配列と比べて、同一性％が１００％未満、例えば少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一になるように、特定の整数以下のアミノ酸の変化を含んでもよい。このような変化は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入からなる群より選択され、前記変化は、レファレンスポリペプチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端位置、又はこれら末端位置間のいずれの位置に生じてもよく、レファレンス配列中のアミノ酸の中に個々に点在してもよく、又はレファレンス配列内の１以上の連続する群に生じてもよい。所与の同一性％のアミノ酸の変化の数は、本明細書に記載するポリペプチドレファレンス配列（例えば、配列番号１〜２９、配列番号４０〜７５を参照されたい）によりコードされるポリペプチド配列におけるアミノ酸の総数に、それぞれの同一性パーセントの数値的パーセント（１００で除された数）を乗じ、次いで、本明細書に記載するポリペプチドレファレンス配列（例えば、配列番号１〜２９、配列番号４０〜７５を参照されたい）におけるアミノ酸の総数からその積を減じることにより求められる、すなわち：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
（式中、ｎａは、アミノ酸の変化の数であり、ｘａは、本明細書に記載するレファレンスポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜２９、配列番号４０〜７５を参照されたい）におけるアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％の場合０．５０、６０％の場合０．６０、７０％の場合０．７０、７５％の場合０．７５、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５、９８％の場合０．９８、９９％の場合０．９９、又は１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子の記号であり、ｘａ及びｙは、ｘａからそれを減じる前に最も近い整数に切り捨てられる）。
同一性％は、任意の挿入又は欠失を含むか又は含まない、配列の完全長又はその任意の断片に対して求めることができる。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、それぞれ、２以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。
特定のアミノ酸置換を「保存的」であるとみなすことは、当技術分野において十分認識されている。アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けされ、抗原結合タンパク質の結合親和性の全て又は実質的に全てを維持するグループ内の置換は、保存的置換であるとみなされる。以下の表２を参照されたい。
Figure 0005850860

本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号４のＣＤＲＨ３；その変異体ＣＤＲＨ３、又は配列番号１３２〜１３７のＣＤＲＨ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７に特異的に結合することができ、また、ＩＬ−７Ｒ活性を中和することができる。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号３のＣＤＲＨ２；又はその変異体ＣＤＲＨ２を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７に特異的に結合することができ、また、ＩＬ−７Ｒ活性を中和することができる。
前記抗原結合タンパク質は、上記ＣＤＲＨ３又はＣＤＲＨ２の配列に加えて、以下から選択される１以上のＣＤＲ又は全てのＣＤＲを任意の組み合わせで更に含んでもよい：ＣＤＲＨ１（配列番号２）、ＣＤＲＨ２（配列番号３）、ＣＤＲＨ３（配列番号４、又は配列番号１３２〜配列番号１３７のいずれか）、ＣＤＲＬ１（配列番号５）、ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）；又は前記ＣＤＲのいずれかの変異体。
例えば、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４）及びＣＤＲＨ１（配列番号２）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４）及びＣＤＲＨ２（配列番号３）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号２）及びＣＤＲＨ２（配列番号３）及びＣＤＲＨ３（配列番号４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号５）及びＣＤＲＬ２（配列番号６）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号５）、ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。前記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４）、ＣＤＲＨ２（配列番号３）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４）、ＣＤＲＨ２（配列番号３）、ＣＤＲＬ２（配列番号６）、及びＣＤＲＬ３（配列番号７）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号２）、ＣＤＲＨ２（配列番号３）、ＣＤＲＨ３（配列番号４）、ＣＤＲＬ１（配列番号５）、ＣＤＲＬ２（配列番号６）及びＣＤＲＬ３（配列番号７）を含んでなり得る。あるいは、変異体ＣＤＲが存在してもよく、配列番号４のＣＤＲＨ３を配列番号１３２〜１３７のＣＤＲのうちのいずれかで置換してもよい。
本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号４１のＣＤＲＨ３；又はその変異体ＣＤＲＨ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。また、前記抗原結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒ活性を中和することができる。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号４０のＣＤＲＨ２；又はその変異体ＣＤＲＨ２を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。また、前記抗原結合タンパク質は、ＩＬ−７Ｒ活性を中和することができる。
抗原結合タンパク質は、上記ＣＤＲＨ３又はＣＤＲＨ２の配列に加えて、以下から選択される１以上のＣＤＲ又は全てのＣＤＲを任意の組み合わせで更に含んでもよい：ＣＤＲＨ１（配列番号３９）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０）、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）、ＣＤＲＬ１（配列番号４２）、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又は前記ＣＤＲのいずれかの変異体。
例えば、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）及びＣＤＲＨ１（配列番号４０）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）及びＣＤＲＨ２（配列番号４０）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。前記抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号３９）及びＣＤＲＨ２（配列番号４０）及びＣＤＲＨ３（配列番号４１）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号４２）及びＣＤＲＬ２（配列番号４３）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号４２）、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０）、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）、及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）、又はこれらの変異体を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号３９）、ＣＤＲＨ２（配列番号４０）、ＣＤＲＨ３（配列番号４１）、ＣＤＲＬ１（配列番号４２）、ＣＤＲＬ２（配列番号４３）及びＣＤＲＬ３（配列番号４４）を含んでなり得る。あるいは、変異体ＣＤＲが存在してもよい。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つヒトアクセプターフレームワークに配列番号８の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲＨ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７活性を中和することができる。抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であっても、キメラ抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。
抗原結合タンパク質は、配列番号８及び／又は配列番号９の可変ドメイン配列から選択される対応するＣＤＲのうちの１以上又は全て、あるいはこれらの変異体を更に含んでもよい。
また、本発明は、ＣＤ１２７に特異的に結合し、且つヒトアクセプターフレームワークに配列番号４５の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３又はその変異体ＣＤＲＨ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７活性を中和することができる。抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であっても、キメラ抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。
抗原結合タンパク質は、配列番号４５及び／又は配列番号４６の可変ドメイン配列から選択される対応するＣＤＲのうちの１以上又は全て、あるいはこれらの変異体を更に含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３及び対応するＣＤＲＨ１、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３及び対応するＣＤＲＨ２、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２、及び対応するＣＤＲＨ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ１及び対応するＣＤＲＬ２、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ２及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２、及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２、及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＬ２、及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２、及び対応するＣＤＲＬ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。
対応するＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９）、ＡｂＭ、又はｃｏｎｔａｃｔ法を参照することにより定義することができる。前記方法の各々の１つの定義は、表１に見出すことができ、対応するＣＤＲを決定するためにレファレンス重鎖可変ドメイン（配列番号８又は配列番号４５）及びレファレンス軽鎖可変ドメイン（配列番号９及び配列番号４６）に適用することができる。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号８のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる、結合単位Ｈ３、又は変異体Ｈ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、抗体等のヒト抗原結合タンパク質、ヒト化抗原結合タンパク質、又はキメラ抗原結合タンパク質であってよい。
抗原結合タンパク質は、以下から選択される１以上又は全ての結合単位を更に含んでもよい：配列番号８のＫａｂａｔ残基３１〜３２を含んでなる、Ｈ１、配列番号８のＫａｂａｔ残基５２〜５６を含んでなる、Ｈ２、配列番号９のＫａｂａｔ残基３０〜３４を含んでなる、Ｌ１、配列番号９のＫａｂａｔ残基５０〜５５を含んでなる、Ｌ２、及び配列番号９のＫａｂａｔ残基８９〜９６を含んでなる、Ｌ３；又は変異体結合単位。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号４５のＫａｂａｔ残基９５〜１０１を含んでなる、結合単位Ｈ３、又は変異体Ｈ３を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、抗体等のヒト抗原結合タンパク質、ヒト化抗原結合タンパク質、又はキメラ抗原結合タンパク質であってよい。
抗原結合タンパク質は、以下から選択される１以上又は全ての結合単位を更に含んでもよい：配列番号４５のＫａｂａｔ残基３１〜３２を含んでなる、Ｈ１、配列番号４６のＫａｂａｔ残基５２〜５６を含んでなる、Ｈ２、配列番号４６のＫａｂａｔ残基３０〜３４を含んでなる、Ｌ１、配列番号４６のＫａｂａｔ残基５０〜５５を含んでなる、Ｌ２、及び配列番号４６のＫａｂａｔ残基８９〜９６を含んでなる、Ｌ３；又は変異体結合単位。
例えば、抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、及び結合単位Ｈ１、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、及び結合単位Ｈ２、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ１、結合単位Ｈ２及び結合単位Ｈ３；又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ１、及び結合単位Ｌ２、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ２、及び結合単位Ｌ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｌ１、結合単位Ｌ２及び結合単位Ｌ３；又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、及び結合単位Ｌ３、又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、結合単位Ｈ２及び結合単位Ｌ３；又はこれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ３、結合単位Ｈ２、結合単位Ｌ２、及び結合単位Ｌ３；又はこれらの変異体を含んでもよい。
抗原結合タンパク質は、結合単位Ｈ１、結合単位Ｈ２、結合単位Ｌ２、結合単位Ｈ３、結合単位Ｌ１、結合単位Ｌ２、及び結合単位Ｌ３；又はこれらの変異体を含んでもよい。
ＣＤＲ変異体又は変異体結合単位は、少なくとも１つのアミノ酸によって改変されたアミノ酸配列を含み、前記改変は、（例えば、１０以下のアミノ酸による）アミノ酸配列の化学的又は部分的変化であり得、この改変により、変異体が未改変配列の生物学的特徴を保持することが可能になる。例えば、前記変異体は、ＣＤ１２７に結合する機能的変異体である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変化は、（例えば、１０以下のアミノ酸による）１つ〜幾つかのアミノ酸の欠失又は置換、あるいは１つ〜幾つかのアミノ酸の付加又は挿入、あるいはこれらの組合せによるものであり得る。ＣＤＲ変異体又は結合単位変異体は、アミノ酸配列で、１、２、３、４、５又は６アミノ酸の置換、付加、又は欠失を任意の組合せで含有し得る。ＣＤＲ変異体又は結合単位変異体は、アミノ酸配列で、１、２、又は３アミノ酸の置換、挿入、付加、又は欠失を任意の組合せで含有し得る。アミノ酸残基における置換は、例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する保存的置換であってよい。例えば、ロイシンは、バリン又はイソロイシンで置換することができる。
ＣＤＲのＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３は、有限数の主鎖高次構造のうちの１つ（基準構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌｓ））を構造的に示す傾向がある。ＣＤＲの特定の基準構造クラスは、ＣＤＲの長さと、ＣＤＲ及びフレームワーク領域の両方において重要な位置に存在する残基（構造決定残基又はＳＤＲ）により決定されるループパッキングとによって定義される。Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６年；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００−８１５）は、「重要な残基の」基準テンプレートを自動的に定義する方法を作成した。クラスター分析を使用してＣＤＲのセットの基準クラスを定義し、次いで、埋もれている疎水物、水素結合残基、並びに保存されているグリシン及びプロリンを分析することにより基準テンプレートを同定する。抗体のＣＤＲの配列は、前記配列を重要な残基のテンプレートと比較し、同一性又は類似性のマトリクスを使用して各テンプレートをスコア付けすることにより基準クラスに割り当てることができる。
１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４抗体（配列番号１３（１Ａ１１．Ｈ３ ＶＨ）又は配列番号２２（１Ａ１１．Ｌ４ Ｖκ））の基準クラスに基づいて、機能的抗体の結合は、以下のＣＤＲ置換（Ｋａｂａｔ番号の前のアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸配列であり、Ｋａｂａｔ番号の後のアミノ酸配列は、置換されたアミノ酸である）の存在下で維持されると予測することができる：
ＣＤＲＨ１の基準：
Ｙ３２Ｉ、Ｙ３２Ｈ、Ｙ３２Ｆ、Ｙ３２Ｔ、Ｙ３２Ｎ、Ｙ３２Ｃ、Ｙ３２Ｅ、Ｙ３２Ｄ
Ｔ３３Ｙ、Ｔ３３Ａ、Ｔ３３Ｗ、Ｔ３３Ｇ、Ｔ３３Ｌ、Ｔ３３Ｖ
Ｍ３４Ｉ、Ｍ３４Ｖ、Ｍ３４Ｗ
Ｎ３５Ｅ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ３５Ｓ、Ｎ３５Ｙ、Ｎ３５Ｔ
ＣＤＲＨ２の基準：
Ｌ５０Ｒ、Ｌ５０Ｅ、Ｌ５０Ｗ、Ｌ５０Ｙ、Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｑ、Ｌ５０Ｖ、Ｌ５０Ｎ、Ｌ５０Ｋ、Ｎ５０Ａ
Ｉ５１Ｌ、Ｉ５１Ｖ、Ｉ５１Ｔ、Ｉ５１Ｓ、Ｉ５１Ｎ
Ｎ５２Ｄ、Ｎ５２Ｌ、Ｎ５２Ｓ、Ｎ５２Ｙ
Ｙ５３Ａ、Ｙ５３Ｇ、Ｙ５３Ｓ、Ｙ５３Ｋ、Ｙ５３Ｔ、Ｙ５３Ｎ
Ｎ５４Ｓ、Ｎ５４Ｔ、Ｎ５４Ｋ、Ｎ５４Ｄ、Ｎ５４Ｇ
Ｖ５６Ｙ、Ｖ５６Ｒ、Ｖ５６Ｅ、Ｖ５６Ｄ、Ｖ５６Ｇ、Ｖ５６Ｓ、Ｖ５６Ａ
Ｓ５８Ｋ、Ｓ５８Ｎ、Ｓ５８Ｔ、Ｓ５８Ｄ、Ｓ５８Ｒ、Ｓ５８Ｇ、Ｓ５８Ｆ、Ｓ５８Ｙ
ＣＤＲＨ３の基準：
Ｖ１０２Ｙ、Ｖ１０２Ｈ、Ｖ１０２Ｉ、Ｖ１０２Ｓ、Ｖ１０２Ｄ、Ｖ１０２Ｇ
ＣＤＲＬ１の基準：
Ｓ２９Ｖ
Ｍ３３Ｌ
ＣＤＲＬ３の基準：
Ｑ８９Ｌ
Ｅ９０Ｑ
Ｗ９１Ｙ
Ｙ９３Ｓ、Ｙ９３Ｒ
したがって、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲ位置内に上記置換のいずれかを有していてもよく、有していなくてもよい。変異体ＣＤＲ１つ当たり、対応するＣＤＲ１つ当たり、結合単位１つ当たり、重鎖又は軽鎖の可変領域１つ当たり、重鎖又は軽鎖１本当たり、及び抗原結合タンパク質１つ当たり複数の置換が存在してもよく、したがって、ＣＤＲの基準構造が維持されている限り、本発明の抗原結合タンパク質中に任意の組合せの置換が存在し得る。
疑念を取り除くために、上記置換は、抗ＣＤ１２７抗体の機能を保持しながら実施することができる可能なＣＤＲ置換を限定するものであると解釈すべきではない。
記載するＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、結合単位、又は変異体結合単位を含んでなる、抗原結合タンパク質は、ＥＣ５０により立証される通り、１Ａ１１ｃ（キメラ、ＶＨ−配列番号２８、Ｖκ−配列番号２９）又は６Ａ３ｃ（キメラ、ＶＨ−配列番号７４、Ｖκ−配列番号７５）が示す結合能の１０倍以内又は５倍以内のＣＤ１２７に対する結合能を示すことができる。ＣＤ１２７に対する結合能は、（例えばＢＩＡｃｏｒｅによる）結合親和性、又は（例えばＥＬＩＳＡアッセイによる）ＥＣ５０等の様々な方法により立証することができる。
上述の通り、ＣＤＲの特定の基準構造クラスは、ＣＤＲの長さと、ＣＤＲ及びフレームワーク領域の両方において重要な位置に存在する残基により決定されるループパッキングとによって定義される。したがって、配列番号２〜６に列挙されているＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、対応するＣＤＲ、結合単位、又はこれらの変異体に加えて、機能的抗体を保持しながら、基準クラスに基づいて、本発明の抗原結合タンパク質のフレームワーク残基において置換を行い得る。このような置換としては、以下が挙げられる（Ｋａｂａｔの番号付けを用いる）：
重鎖：位置２におけるＶ、Ｉ又はＧ；位置４におけるＬ又はＶ；位置２０におけるＬ、Ｉ、Ｍ又はＶ；位置２２におけるＣ；位置２４におけるＴ、Ａ、Ｖ、Ｇ又はＳ；位置２６におけるＧ；位置２９におけるＩ、Ｆ、Ｌ又はＳ；位置３６におけるＷ；位置４７におけるＷ又はＹ；位置４８におけるＩ、Ｍ、Ｖ又はＬ；位置６９におけるＩ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＶ；位置７１におけるＶ、Ａ、Ｒ又はＬ；位置７８におけるＡ、Ｌ、Ｖ、Ｙ又はＦ；位置８０におけるＬ又はＭ；位置９０におけるＹ又はＦ；位置９２におけるＣ；及び／又は位置９４におけるＲ、Ｋ、Ｇ、Ｓ、Ｈ又はＮ；及び／又は
軽鎖：位置２におけるＩ、Ｌ又はＶ；位置３におけるＶ、Ｑ、Ｌ又はＥ；位置４におけるＭ又はＬ；位置２３におけるＣ；位置３５におけるＷ；位置３６におけるＹ、Ｌ又はＦ；位置４６におけるＳ、Ｌ、Ｒ又はＶ；位置４９におけるＹ、Ｈ、Ｆ又はＫ；位置７１におけるＹ又はＦ；位置８８におけるＣ；及び／又は位置９８におけるＦ。
上記フレームワーク位置のうちのいずれか１つ、任意の組合せ、又は全てが、本発明の抗原結合タンパク質中に存在し得る。重鎖又は軽鎖可変領域１つ当たり、重鎖又は軽鎖１本当たり、及び抗原結合タンパク質１つ当たり複数の可変フレームワーク基準位置が存在し得るので、フレームワークの基準構造が維持されている限り、本発明の抗原結合タンパク質中に任意の組合せが存在してもよい。
例えば、重鎖可変フレームワークは、位置２にＶ、位置４にＬ、位置２０にＶ、位置２２にＣ、位置２４にＡ、位置２６にＧ、位置２９にＦ、位置３６にＷ、位置４７にＷ、位置４８にＭ、位置６９にＬ、位置７１にＲ、位置７８にＡ、位置８０にＭ、位置９０にＹ、位置９２にＣ、及び位置９４にＲを含んでなり得、また、例えば、軽鎖可変フレームワークは、位置２にＩ、位置４にＬ、位置２３にＣ、位置３５にＷ、位置３６にＹ、位置７１にＦ、位置８８にＣ、位置９０にＥ、及び位置９３にＹを含んでなり得る。
本明細書に記載するＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲ又は結合単位のうちの１以上は、例えば、ヒト化又はキメラ可変ドメインとして、ヒトフレームワークの状況において存在してもよい。
ヒト化重鎖可変ドメインは、配列番号２〜４又は配列番号３９〜４１に列挙されているＣＤＲ；その変異体ＣＤＲ；対応するＣＤＲ；結合単位；又はこれらの変異体を、配列番号１１６のヒトアクセプタ可変ドメイン配列に対して、フレームワーク領域において７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有するアクセプタフレームワーク内に含んでもよい。
ヒト化軽鎖可変ドメインは、配列番号５〜７又は配列番号４２〜４４に列挙されているＣＤＲ；その変異体ＣＤＲ；対応するＣＤＲ；結合単位；又はこれらの変異体を、配列番号１１７のヒトアクセプタ可変ドメイン配列に対して、フレームワーク領域において７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有するアクセプタフレームワーク内に含んでもよい。
また、本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１のうちのいずれか１つから選択される重鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。前記抗原結合タンパク質は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変領域を含んでなる。前記重鎖可変領域のいずれかを前記軽鎖可変領域のいずれかと組合せてもよい。また、前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７を中和することができる。
また本発明は、ＣＤ１２７に結合し、且つ配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８又は６９のうちのいずれか１つから選択される重鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。前記抗原結合タンパク質は、配列番号７０、７１、７２、７３又は１３８のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。前記重鎖可変領域のいずれかを前記軽鎖可変領域のいずれかと組合せてもよい。また、前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７を中和することができる。
抗体重鎖可変領域は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１；あるいは配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８又は６９のうちのいずれか１つに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有し得る。
抗体軽鎖可変領域は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７；あるいは配列番号７０、７１、７２、７３又は１３８のうちのいずれか１つに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一性を有し得る。
配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１の変異体の同一性パーセントは、配列の完全長全体に対して求めることができる。
抗体重鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６の、５、４、３、２又は１アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含有する配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１のうちのいずれか１つの変異体であってよい。
抗体軽鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含有する配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７のうちのいずれか１つの変異体であってよい。
例えば、上記基準ＣＤＲ及び基準フレームワーク残基の置換は、少なくとも７５％同一であるか又は３０アミノ酸以下の置換を含有する変異体配列として変異体の重鎖又は軽鎖可変領域中に存在してもよい。
別の実施形態では、抗体重鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含有する配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８又は６９のうちのいずれか１つの変異体であってもよい。抗体軽鎖可変領域は、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含有する配列番号７０、７１、７２又は７３のうちのいずれか１つの変異体であってもよい。
例えば、上記基準ＣＤＲ及び基準フレームワーク残基の置換は、少なくとも７５％同一であるか又は３０アミノ酸以下の置換を含有する変異体配列として変異体の重鎖又は軽鎖可変領域中に存在してもよい。
本発明の重鎖可変領域のいずれかを好適なヒト定常領域と組み合わせてもよい。本発明の軽鎖可変領域のいずれかを好適な定常領域と組み合わせてもよい。
また本発明は、ＣＤ１２７に特異的に結合し、且つ任意の以下の重鎖及び軽鎖可変ドメインの組合せ：１Ａ１１．Ｈ３．Ｌ４（配列番号１３及び配列番号２２）を含んでなる、抗原結合タンパク質、又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の同一性を有する重鎖可変ドメインと配列番号２２に対して少なくとも７５％の同一性を有する軽鎖可変ドメインとを有する抗原結合タンパク質を提供する。また、前記抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７を中和することができる。
上記の抗原結合タンパク質、例えば、１以上のアミノ酸残基の化学的修飾及び／又は挿入、欠失、若しくは置換により配列が部分的に変化している変異体、あるいは、上記配列のうちのいずれかに対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する変異体は、ＥＣ５０又はＢＩＡｃｏｒｅによって実証される通り、１Ａ１１又は６Ａ３が示す結合能の１０倍以内又は５倍以内のＣＤ１２７に対する結合能を示すことができる。ＣＤ１２７に対する結合能は、ＥＣ５０により立証することもでき（ＥＬＩＳＡアッセイによって実行される）、結合能によって立証することもできる（ＢＩＡｃｏｒｅによって実行される）。
本発明者らは、ＣＤＲＨ３内の特定の位置を置換して結合親和性を低下させる（すなわち、より強く結合させる）ことがｄけいることを実験的に見出した。このようなＣＤＲＨ３アナログを表４に記載する。位置Ｎ９８及びＦ１００ｂ（Ｋａｂａｔの番号付け）における置換が、親和性を増加させるのに特に有効であることが分かった。具体的な置換としては、Ｎ９８Ｄ、Ｎ９８Ｅ、Ｆ１００ｂＥ、Ｆ１００ｂＩ及びＦ１００ｂＶが挙げられる。これら置換を表すＣＤＲＨ３配列は、それぞれ、配列番号１３２、１３３、１３４、１３５、１３６及び１３７である。
本発明は、本明細書に記載する抗体のいずれかにこのような置換を組み込むことを意図する。
１つの実施形態では、本発明の抗体は、位置１００にＷ（Ｔｒｐ）残基を有する。
抗原結合断片のこのようなエフェクター機能を改変する、例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ、半減期等を増強することが望ましい場合がある。
１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、Ｆｃが不能であってもよい。Ｆｃを不能にする１つの方法は、重鎖定常領域の位置２３５及び２３７（ＥＵインデックスの番号付け）におけるアラニン残基の置換を含んでなる。あるいは、抗原結合タンパク質は、Ｆｃの機能を有し、位置２３５及び２３７にアラニン置換を含まなくてもよい。
抗原結合タンパク質は、ヒト、又はマウス動物モデルにおいて、少なくとも６時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日又は少なくとも９日のインビボ半減期を有し得る。
抗原結合タンパク質は、ラット、マウス、霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界サル、又は類人猿）又はヒトに由来し得る。抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であっても、ヒト化抗体であっても、キメラ抗体であってよい。抗原結合タンパク質は、いずれのアイソタイプ又はサブクラスであってもよい定常領域を含み得る。定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はこれらの変異体の定常領域であってもよい。抗原結合タンパク質の定常領域は、ＩｇＧ１であってもよい。
抗体のＦｃエフェクター部分に対する突然変異変化を使用して、ＦｃＲｎと抗体との間の相互作用の親和性を変化させて、抗体のターンオーバーを調節することができる。抗体の半減期は、インビボで延長され得る。より長時間にわたってインビボＩＣ５０を維持する結果、最大用量及び最高投与頻度を達成することができるので、これは患者集団にとって有益であり得る。ＣＤ１２７を発現する細胞を殺すことは望ましくない場合があるので、抗体のＦｃエフェクター機能の全体又は一部を除去してもよい。この除去により安全性プロフィールを高めることができる。
定常領域を含んでなる、抗原結合タンパク質は、ＡＤＣＣ及び／又は補体活性化若しくはエフェクター機能を低下させることができる。定常領域は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの生来不能である定常領域、あるいは突然変異型ＩｇＧ１定常ドメインを含んでもよい。好適な修飾の例は、欧州特許第０３０７４３４号明細書に記載されている。Ｆｃを不能にする１つの方法は、重鎖定常領域の位置２３５及び２３７（ＥＵインデックスの番号付け）におけるアラニン残基の置換を含んでなる。
抗原結合タンパク質は、抗体のエフェクター機能／ＡＤＣＣ及び／又は補体活性化が増強されるように、突然変異型定常領域から選択される１以上の修飾を含んでもよい。好適な修飾の例は、Ｓｈｉｅｌｄｓら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２００１年）２７６：６５９１−６６０４，Ｌａｚａｒら．ＰＮＡＳ（２００６年）１０３：４００５−４０１０、及び米国特許第６７３７０５６号明細書、国際公開第２００４０６３３５１号パンフレット、及び国際公開第２００４０２９２０７号パンフレットに記載されている。
抗原結合タンパク質のエフェクター機能／ＡＤＣＣ及び／又は補体活性化が増強されるように、抗原結合タンパク質は、変化したグリコシル化プロファイルを有する定常領域を含んでもよい。変化したグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質を産生するのに好適な方法の例は、国際公開第２００３／０１１８７８号パンフレット、国際公開第２００６／０１４６７９号パンフレット、及び欧州特許第１２２９１２５号明細書に記載されている。
抗原結合タンパク質が結合するＣＤ１２７ポリペプチドは、組換え型ポリペプチドであってもよく、Ｆｃドメイン等の別のタンパク質に任意で融合している細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んでもよく、完全長ＣＤ１２７タンパク質を含んでもよい。ＣＤ１２７は、溶液中に存在してもよく、固体表面に付着していてもよい。例えば、ＣＤ１２７は、磁気ビーズ等のビーズに付着していてもよい。ＣＤ１２７は、ビオチン化されてもよい。ＣＤ１２７にコンジュゲートするビオチン分子を用いて、固体表面上でビオチンとストレプトアビジンとをカップリングさせることにより固体表面上にＣＤ１２７を固定化することができる。
また、本発明は、本明細書に記載する抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。前記核酸分子は、（ｉ）及び（ｉｉ）が同じ核酸分子上に存在するように、（ｉ）１以上のＣＤＲＨ、重鎖可変配列又は完全長重鎖配列；及び（ｉｉ）１以上のＣＤＲＬ、軽鎖可変配列、又は完全長軽鎖配列をコードする配列を含んでもよい。あるいは、本明細書に記載する抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、（ａ）及び（ｂ）が別々の核酸分子上に存在するように、（ａ）１以上のＣＤＲＨ、重鎖可変配列、若しくは完全長重鎖配列；又は（ｂ）１以上のＣＤＲＬ、軽鎖可変配列、又は完全長軽鎖配列をコードする配列を含んでもよい。
重鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号３０〜３６を含んでなり得る。軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号１０〜１１３を含んでなり得る。
重鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号７５〜９６を含んでなり得る。軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子は、配列番号９７〜１００を含んでなり得る。
また、本発明は、本明細書に記載する核酸分子を含んでなる、発現ベクターを提供する。また、本明細書に記載する発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を提供する。
本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、好適な宿主細胞において産生することができる。本明細書に記載する抗原結合タンパク質を産生するための方法は、本明細書に記載する宿主細胞を培養する工程と、抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでよい。組換え型の形質転換、トランスフェクト、又は形質導入された宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含んでよく、前記発現カセットは、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなり、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを更に含んでなる。あるいは、組換え型の形質転換、トランスフェクト、又は形質導入された宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含んでよく、第１の発現カセットは、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなり、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、第２の発現カセットを更に含んでなる。安定的に形質転換された宿主細胞は、本明細書に記載する抗原結合タンパク質の重鎖及び／又は軽鎖をコードする１以上の発現カセットを含んでなる、ベクターを含んでなり得る。例えば、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクターと、重鎖をコードする第２のベクターとを含んでなり得る。
宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞であってよい。このような細胞株の例としては、ＣＨＯ又はＮＳ０が挙げられる。宿主細胞は、非ヒト宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、非胚宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、培養培地、例えば、無血清培養培地中で培養することができる。抗原結合タンパク質は、宿主細胞により培養培地中に分泌され得る。抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含有する前記培養培地に対して、少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）に精製することができる。
抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物も本発明により提供される。使用説明書と共に医薬組成物を含んでなる、キットオブパーツが更に提供される。便宜上、キットオブパーツは、使用説明書と共に所定の量の試薬を含んでよい。
抗体の構造
インタクトな抗体
大部分の脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基いてカッパ及びラムダと呼ばれる２種類のうちの１つに帰属し得る。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は、５つの異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに帰属し得る。ＩｇＧ及びＩｇＡは、サブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に細分化することができる。種による変異体が存在し、マウス及びラットは少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有する。
可変領域のより保存されている部分をフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ。インタクトな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＣＤＲによって連結されている４つのＦＲを含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域に極近接して保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
定常領域は、抗体の抗原に対する結合に直接関与する訳ではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγ受容体への結合を介する食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介する半減期／クリアランス速度、及び補体カスケードのＣ１ｑ成分を介する補体依存性細胞傷害への関与等の様々なエフェクター機能を示す。
ヒトＩｇＧ２定常領域は、古典的経路によって補体を活性化するか又は抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を本質的に欠くことが報告されている。ヒトＩｇＧ４定常領域は、古典的経路によって補体を活性化する能力を欠き、且つ抗体依存性細胞性細胞傷害をほんのわずかしか媒介しないことが報告されている。これらエフェクター機能を本質的に欠く抗体を「非溶解性」抗体と呼ぶ場合もある。任意でエフェクター機能を本質的に有しない程度まで、本発明に係る抗体のエフェクター機能を低下させることが望ましい場合もある。１つの実施形態では、本発明に係る抗体は、非溶解性である。１つの実施形態では、本発明に係る抗体は、エフェクター機能を本質的に有しない。抗体は、別の分子、例えば、細胞傷害性部分又は放射活性部分等のエフェクター機能を改変することを意図する分子にコンジュゲートしてもよく、しなくてもよい。１つの実施形態では、抗体は、放射標識又は細胞傷害性分子等の別の分子にコンジュゲートしない。この実施形態では、抗体は、直接細胞を殺す作用によってではなく、天然の生物学的相互作用をブロックすることにより、その機能効果を発揮する。
ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に公知の多数の方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株を用いてハイブリドーマ法により作製することができる。Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３，３００１，及びＢｒｏｄｅｕｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９８７年）を参照されたい。別の方法としては、ファージライブラリ又はトランスジェニックマウスの使用が挙げられ、これらは両方ともヒト可変領域レパートリーを利用する（Ｗｉｎｔｅｒ（１９９４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３−４５５；Ｇｒｅｅｎ（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３）。
マウスの免疫グロブリン遺伝子座がヒトの免疫グロブリン遺伝子セグメントに置換されている幾つかの系統のトランスジェニックマウスが現在入手可能である（Ｔｏｍｉｚｕｋａ（２０００年）ＰＮＡＳ ９７：７２２−７２７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１；Ｍｅｎｄｅｚ（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６）。抗原チャレンジの際、このようなマウスは、ヒト抗体のレパートリを産生することができ、それから対象となる抗体を選択することができる。
ファージディスプレー技術を使用して、ヒト抗原結合タンパク質（及びその断片）を作製することができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓら．（１９９４年）ＥＭＢＯ １３：３２４５−３２６０を参照されたい。
親和性成熟の技術（Ｍａｒｋｓ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２年）１０：７７９−７８３）を用いて結合親和性を改善することもでき、一次ヒト抗体の親和性は、順次Ｈ及びＬ鎖の可変領域を天然に存在する変異体で置換し、改善された結合能に基づいて選択することにより改善される。「エピトープインプリンティング」等のこの技術の変形例も現在利用可能である。例えば、国際公開第９３／０６２１３号パンフレット；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ（１９９３年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６を参照されたい。
キメラ及びヒト化抗体
キメラ抗体は、典型的に、組換えＤＮＡ方法を使用して作製される。抗体（例えばｃＤＮＡ）をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体のＨ及びＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの典型的な起源として機能する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、次いで、発現ベクターが存在しなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされて、抗体を合成する。ヒトのＬ及びＨ鎖のコーディング配列を対応する非ヒト（例えば、マウス）のＨ及びＬ定常領域の代わりに用いることによりＤＮＡを改変してもよい。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８４年）ＰＮＡＳ ８１：６８５１を参照されたい。
非ヒト（例えば、マウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみをヒトフレームワーク（「アクセプタフレームワーク」）及び定常領域にグラフトして、ヒト化抗体を作製することにより免疫原性を大きく低下させることができる（Ｊｏｎｅｓら．（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）。しかし、ＣＤＲのグラフト自体は、抗原結合特性を完全に保持させることはできないので、多くの場合、有意な抗原結合親和性を回復させたい場合、ドナー抗体のうち幾つかのフレームワーク残基をヒト化分子中に保存しておく必要がある（「復帰突然変異」とも呼ばれる）ことが見出されている（Ｑｕｅｅｎら．（１９８９年）ＰＮＡＳ ８６：１０，０２９−１０，０３３：Ｃｏら．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：５０１−５０２）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、非ヒトドナー抗体に対して最も高い配列相同性を示すヒト可変領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲの選択は、ヒトのコンセンサス又は個々のヒト抗体のいずれかから作製することもできる。必要な場合、ＣＤＲの高次構造を保存するために、ヒトアクセプタフレームワークにドナー抗体由来の重要な残基を置換して入れることができる。抗体のコンピュータモデリングを用いて、このような構造的に重要な残基を同定するのに役立てることができる。国際公開第９９／４８５２３号パンフレットを参照されたい。
あるいは、ヒト化は、「ベニアリング」のプロセスにより行うことができる。独自のヒト及びマウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域を統計分析することにより、露出残基の正確なパターンはヒト抗体とマウス抗体とで異なり、そして、大部分の個々の表面位置は少数の異なる残基に対して強い偏好性を有することが明らかになった（Ｐａｄｌａｎら．（１９９１年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８；及びＰｅｄｅｒｓｅｎら．（１９９４年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５９−９７３）。したがって、ヒト抗体で通常みられるものとは異なるフレームワーク領域の露出残基を置換することにより、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることが可能である。タンパク質の抗原性は表面の接近可能性と相関している場合があるので、表面残基の置換は、マウス可変領域をヒト免疫系に「見えない」ようにするのに十分であり得る（Ｍａｒｋら．（１９９４年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１１３：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１０５−１３４も参照されたい）。このヒト化の手順は、抗体の表面だけを改変し、支持残基はそのまま保つので、「ベニアリング」と呼ばれる。更なる別のアプローチとしては、国際公開号０４／００６９５５号パンフレットに記載されているもの、及び細菌の発現系を使用して配列がヒト生殖細胞系に近い抗体を産生するＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）（Ｋａｌｏｂｉｏｓ）の手順が挙げられる（Ａｌｆｅｎｉｔｏ−Ｍ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２００７年１月，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
二重特異性抗原結合タンパク質
二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。このような抗原結合タンパク質を作製する方法は、当技術分野において公知である。従来より、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え体作製は、２本のＨ鎖が異なる結合特異性を有する２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の共発現に基づいている。Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら．（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９；国際公開号９３／０８８２９号パンフレット；及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら．（１９９１年）ＥＭＢＯ １０：３６５５−３６５９を参照されたい。Ｈ鎖及びＬ鎖のランダムな組合せによって、１０種の異なる抗体構造の混合物が産生される可能性があり、そのうち１つのみが望ましい結合特異性を有する。別のアプローチは、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域に、望ましい結合特異性を有する可変ドメインを融合させることを含む。軽鎖との結合に必要な部位を含有するＣＨ１領域は、融合物のうちの少なくとも１つに存在し得る。これら融合物及び望ましい場合Ｌ鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、次いで、好適な宿主生物にコトランスフェトする。しかし、１つの発現ベクターに２つ又は３つの鎖のコーディング配列を挿入することも可能である。１つのアプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕に第１の結合特異性を有するＨ鎖とＨ鎖−Ｌ鎖対とから構成されるが、但し、他の腕は第２の結合特異性を有する。国際公開第９４／０４６９０号パンフレットを参照されたい。また、Ｓｕｒｅｓｈら．（１９８６年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照されたい。
抗原結合断片
定常領域を欠く断片は、古典的経路によって補体を活性化するか又は抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する能力を欠く。従来より、このような断片は、例えば、パパイン消化によりインタクトな抗体のタンパク質を分解することにより作製されるが（例えば、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットを参照されたい）、組換え技術により形質転換された宿主細胞から直接産生してもよい。ＳｃＦｖの産生については、Ｂｉｒｄら．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６を参照されたい。更に、抗原結合断片は、下記のような様々な改変技術を使用して作製してもよい。
Ｆｖ断片は、２本の鎖の相互作用エネルギーがＦＡｂ断片よりも低いと考えられる。ＶＨ及びＶＬドメインの会合を安定化させるために、これらをペプチド（Ｂｉｒｄら．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら．（１９８８年）ＰＮＡＳ ８５（１６）：５８７９−５８８３）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら．（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−１３６７）及び「ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ」突然変異（Ｚｈｕら．（１９９７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６：７８１−７８８）で連結させてもよい。ＳｃＦｖ断片は、当業者に周知の方法により作製することができる。Ｗｈｉｔｌｏｗら．（１９９１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２：９７−１０５及びＨｕｓｔｏｎら．（１９９３年）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：１９５−２１７を参照されたい。ＳｃＦｖは、大腸菌等の細菌細胞又は真核細胞で産生させることもできる。ＳｃＦｖの１つの問題点は、生成物が一価性であるので多価結合により結合活性を高めることができないこと及び半減期が短いことである。これら問題点を克服する試みとしては、化学的カップリング（Ａｄａｍｓら．（１９９３年）Ｃａｎ．Ｒｅｓ ５３：４０２６−４０３４；及びＭｃＣａｒｔｎｅｙら．（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：３０１−３１４）により、又は不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの自然発生的部位特異的二量体化により、更なるＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから二価の（ＳｃＦｖ’）２を作製することが挙げられる。あるいは、ペプチドリンカーを３〜１２残基まで短くすることによりＳｃＦｖに多量体を形成させて「ダイアボディ」を形成することもできる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら．（１９９３年）ＰＮＡＳ ９０：６４４４−６４４８を参照されたい。リンカーを更に短くすることによりＳｃＦｖの三量体（「トリアボディ」、Ｋｏｒｔｔら．（１９９７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：４２３−４３３を参照されたい）及び四量体（「テトラボディ」、Ｌｅ Ｇａｌｌら．（１９９９年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４５３：１６４−１６８を参照されたい）を生じさせることもできる。また、タンパク質を二量体化させるモチーフと遺伝的に融合させて、「ミニ抗体」（Ｐａｃｋら．（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９−１５８４を参照されたい）及び「ミニボディ」（Ｈｕら．（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１）を形成することにより二価ＳｃＦｖ分子を構築することができる。また、ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦｖ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結させることにより作製することができる。Ｋｕｒｕｃｚら．（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．１５４：４５７６−４５８２を参照されたい。二重特異性ダイアボディは、短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに接続されている、ある抗体に由来するＶＨドメインからなる２つの単鎖融合生成物の非共有結合を通じて作製することができる。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ ７７：７６３−７７２を参照されたい。上記のようなジスルフィド架橋又は「ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ」突然変異の導入により、又は２つのハイブリッドＳｃＦｖ断片がペプチドリンカーを通して接続されている単鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）の形成により、このような二重特異性ダイアボディの安定性を高めることができる。Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら．（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２６：１７９−１８８を参照されたい。四価の二重特異性分子は、例えば、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメイン又はヒンジ領域を通してＦａｂ断片にＳｃＦｖ断片を融合させることにより入手可能である。Ｃｏｌｏｍａら．（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−１６３を参照されたい。あるいは、四価の二重特異性分子は、二重特異性単鎖ダイアボディの融合により作製することができる（Ａｌｔら．（１９９９年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５４：９０−９４を参照されたい）。また、より小さな四価の二重特異性分子は、ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムを、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを含有するリンカー（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒら．（１９９８年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４３２：４５−４９）又は４つの抗体可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を含む単鎖分子のいずれかと、分子内の対合を防ぐ配向で二量体化させることにより形成することができる（タンデムダイアボディ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら．（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６を参照されたい）。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片の化学的カップリングにより、又はロイシンジッパーを通じたヘテロ二量体化により作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら．（１９９２年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５；及びＫｏｓｔｅｌｎｙら．（１９９２年），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３）。また、単離ＶＨ及びＶＬドメインも利用可能である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ ｐｌｃ）、米国特許第６，２４８，５１６号明細書；米国特許第６，２９１，１５８号明細書；及び米国特許第６，１７２，１９７号明細書を参照されたい。
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法を使用して形成される、２つの共有結合した抗体で構成される。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい。
他の改変
本発明の抗原結合タンパク質は、そのエフェクター機能を強化するか又は変化させるために他の改変を含んでもよい。本発明で使用する用語「エフェクター機能」は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）媒介性反応、Ｆｃ媒介性食作用、及びＦｃＲｎ受容体を介した抗体の再利用のうちの１以上を指すことを意味する。ＩｇＧ抗体については、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを含むエフェクター機能は、免疫細胞の表面に存在するＦｃγ受容体のファミリーと重鎖定常領域との相互作用によって媒介される。ヒトでは、これらは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む。抗原結合している抗原結合タンパク質とＦｃ／Ｆｃγ複合体の形成との間の相互作用により、細胞傷害、免疫細胞活性化、食作用、及び炎症性サイトカインの放出を含む一連の作用が誘導される。
抗原結合タンパク質の定常領域と様々なＦｃ受容体（ＦｃＲ）との間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考える。有意な生物学的作用は、エフェクター機能、特に、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体の固定（補体依存性細胞傷害又はＣＤＣ）、及び抗原結合タンパク質の半減期／クリアランスの結果であり得る。通常、エフェクター機能を媒介する能力は、抗原に対する抗原結合タンパク質の結合を必要とし、全ての抗原結合タンパク質が全てのエフェクター機能を媒介するとは限らない。
例えば、ナチュラルキラー細胞に対するＦｃγＲＩＩＩの結合を介して、又は単球／マクロファージに対するＦｃγＲＩの結合を介してＡＤＣＣエフェクター機能を測定する等の多数の方法でエフェクター機能を測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質のＡＤＣＣエフェクター機能は、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて評価することができる。このようなアッセイの例は、Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００１年 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，ｐ６５９１−６６０４；Ｃｈａｐｐｅｌら，１９９３年 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２６８，ｐ２５１２４−２５１３１；Ｌａｚａｒら，２００６年 ＰＮＡＳ，１０３；４００５−４０１０に見出すことができる。
ＣＤＣの機能を測定するためのアッセイの例としては、１９９５年 Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈ １８４：２９−３８に記載されているものが挙げられる。
ヒト定常領域の幾つかのアイソタイプ、特にＩｇＧ４及びＩｇＧ２アイソタイプは、ａ）古典的経路による補体の活性化；及びｂ）抗体依存性細胞性細胞傷害の機能を本質的に欠く。望ましいエフェクター特性に応じて、抗原結合タンパク質の重鎖定常領域に対する様々な改変を行ってもよい。特異的突然変異を含有するＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体に対する結合を減少させ、ひいてはＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下させることが独立に報告されている（Ｄｕｎｃａｎら．Ｎａｔｕｒｅ １９８８年，３３２；５６３−５６４；Ｌｕｎｄら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１年，１４７；２６５７−２６６２；Ｃｈａｐｐｅｌら．ＰＮＡＳ １９９１年，８８；９０３６−９０４０；Ｂｕｒｔｏｎ及びＷｏｏｆ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２年，５１；１−８４；Ｍｏｒｇａｎら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５年，８６；３１９−３２４；Ｈｅｚａｒｅｈら．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１年，７５（２４）；１２１６１−１２１６８）。
望ましい特性に応じて、抗体のＦｃ領域に対する様々な改変を行ってよい。例えば、溶解性抗体を非溶解性にするためのＦｃ領域における特異的突然変異は、欧州特許第０６２９ ２４０号及び欧州特許第０３０７ ４３４号明細書に詳述されている。あるいは、血清半減期を延長するために抗体にサルベージ受容体結合エピトープを組み込んでもよい。米国特許第５，７３９，２７７号明細書を参照されたい。ヒトＦｃγ受容体としては、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及び新生児ＦｃＲｎが挙げられる。Ｓｈｉｅｌｄｓら．（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４は、ＩｇＧ１残基の共通のセットは、全てのＦｃγＲの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、この共通のセットの外側の異なる部位を利用することを立証した。以下に記載するＩｇＧ１残基の１つの群は、アラニンに変更されたとき全てのＦｃγＲに対する結合を減少させる：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７及びＰｒｏ−２３９。全てＩｇＧ ＣＨ２ドメインに存在し、ＣＨ１及びＣＨ２を連結するヒンジの近傍でクラスタを形成する。ＦｃγＲＩは、結合のためにＩｇＧ１残基の共通のセットのみを利用するが、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、前記共通のセットに加えて異なる残基とも相互作用する。幾つかの残基を変化させると、ＦｃγＲＩＩ（例えばＡｒｇ−２９２）又はＦｃγＲＩＩＩ（例えばＧｌｕ−２９３）に対する結合のみが減少する。幾つかの変異体では、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合が改善されたが、他の受容体に対する結合は影響を受けなかった（例えば、Ｓｅｒ−２６７ Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩに対する結合を改善したが、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合には影響を与えなかった）。他の変異体は、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善すると共に、他の受容体に対する結合を減少させた（例えば、Ｓｅｒ−２９８ Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善し、ＦｃγＲＩＩに対する結合を減少させた）。ＦｃγＲＩＩＩａの場合、最も優れた結合を示すＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３及びＬｙｓ−３３４におけるアラニン置換の組合せを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体のクリアランスと組織を横断するトランスサイトーシスとの両方に関与していると考えられる（Ｊｕｎｇｈａｎｓ（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ １６：２９−５７；及びＧｈｅｔｉｅら．（２０００年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが見出されているヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５が挙げられる。この段落に記載する位置のいずれかにおける置換は、血清半減期を延長する及び／又は抗体のエフェクター特性を変化させることができる。
他の改変としては、抗体のグリコシル化変異体が挙げられる。これらの定常領域の保存部位における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に、上記のようなエフェクター機能に対する重要な作用を有することが知られている。例えば、Ｂｏｙｄら．（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８を参照されたい。１以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失、又は修飾されている抗体又はその抗原結合断片のグリコシル化変異体が考えられる。アスパラギン−Ｘ−セリン又はアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフを導入すると酵素的に結合する可能性のある部位が炭水化物部分に作製されるので、抗体のグリコシル化を操作するために用いることができる。Ｒａｊｕら．（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８−８８７６では、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化が、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はα，２，３シアリルトランスフェラーゼを用いる再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化のプロセスを通して増加した。末端のシアリル化を増加させることは、免疫グロブリンの半減期を延長すると考えられる。ほとんどの糖タンパク質と同様に、抗体は、典型的に、グリコフォームの混合物として産生される。抗体が真核生物、特に哺乳類細胞において産生されるとき、この混合物は特に明らかである。規定のグリコフォームを製造するために様々な方法が開発されている。Ｚｈａｎｇら．（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１：Ｓｅａｒｓら．（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｗａｃｋｅｒら．（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｄａｖｉｓら．（２００２年）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；Ｈａｎｇら．（２００１年）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ ３４：７２７を参照されたい。本明細書に記載する抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１）は、規定の数（例えば、７以下、例えば、５以下、例えば、２つ又は１つ）のグリコフォームを含んでよい。
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキルエン等の非タンパク質性ポリマーにカップリングしてもよく、しなくてもよい。ＰＥＧに対するタンパク質のコンジュゲート化は、タンパク質の抗原性及び免疫原性を低下させることに加えて、タンパク質の半減期を延長するために確立されている技術である。Ｆａｂ’断片に加えてインタクトな抗体でも、様々な分子量及び形状（直鎖又は分岐鎖）のＰＥＧ化の使用について研究されている。Ｋｏｕｍｅｎｉｓら．（２０００年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１９８：８３−９５を参照されたい。
産生方法
抗原結合タンパク質は、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋら．（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７−１５７を参照されたい）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ（２０００年）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ２０：１−５５を参照されたい）、マウス（Ｐｏｌｌｏｃｋらを参照されたい）又は植物（Ｄｏｒａｎ（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１９９−２０４；Ｍａ（１９９８年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：６０１−６０６；Ｂａｅｚら．（２０００年）ＢｉｏＰｈａｒｍ １３：５０−５４；Ｓｔｏｇｅｒら．（２０００年）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：５８３−５９０）等のトランスジェニック生物で産生させることができる。
また、抗原結合タンパク質は、化学合成によって作製することもできる。しかし、抗原結合タンパク質は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を使用して作製される。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、更にクローニング（増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入する。特に宿主細胞がＣＨＯ又はＮＳＯである場合、１つの発現系は、グルタミン酸合成系（例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより販売されている）である。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、従来の手順（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を使用して容易に単離され、配列決定される。使用することができるベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が挙げられ、この中でも典型的にプラスミドが使用される。一般的に、このようなベクターは、発現を促進するために抗原結合タンパク質に機能的に連結しているシグナル配列、複製開始点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列を更に含む。軽鎖及び重鎖をコードするポリヌクレオチドを別々のベクターに挿入し、同時に又は順次、（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は形質導入により）同じ宿主細胞に導入してもよく、必要に応じて、前記導入前に重鎖及び軽鎖の両方を同じベクターに挿入してもよい。
野性型配列でトランスフェクトされたときの量と比べて、コドンを最適化した遺伝子でトランスフェクトしたときに宿主細胞によって産生されるタンパク質の総量が増えることを意図して、コドンの最適化を使用してもよい。幾つかの方法が公開されている（Ｎａｋａｍｕｒａら．（１９９６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２１４−２１５；国際公開第９８／３４６４０号パンフレット；国際公開第９７／１１０８６号パンフレット）。遺伝子コードの冗長性により、本明細書に開示するものとは別のポリヌクレオチド（特に、所与の宿主細胞で発現させるためにコドンが最適化されたポリヌクレオチド）も、本明細書に記載する抗原結合タンパク質をコードすることができる。本発明の抗原結合タンパク質のコドン使用頻度を変化させて、転写物及び／又は生成物の収率を高めるように宿主細胞のコドンバイアスを適応させてもよい（例えば、Ｈｏｅｋｅｍａら Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８７年 ７（８）：２９１４−２４）。コドンの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づいてよい。
シグナル配列
抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のＮ末端に、特異的な切断部位を有する異種のシグナル配列を含む融合タンパク質として作製してもよい。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、プロセシングされなければならない。原核生物の宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーであってよい。酵母分泌物については、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー又は酸性ホスファターゼリーダーであってよい。例えば、国際公開第９０／１３６４６号パンフレットを参照されたい。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナル及びネイティブな免疫グロブリンシグナル配列等のウイルス分泌リーダーが好適であり得る。典型的に、シグナル配列は、リーディングフレームにおいて抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
複製開始点
複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適なｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母に好適な２μプラスミド、ほとんどの哺乳類細胞好適なＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ等の様々なウイルス開始点が当技術分野において周知である。一般的に、複製開始点の成分は、哺乳類の発現ベクターには必要ないが、ＳＶ４０は、初期プロモータを含有しているため用いてもよい。
選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリン等の抗生物質又は他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、又は（ｂ）栄養要求性の欠損を補完したり複合培地では入手不可能な栄養素を供給したりするタンパク質をコードするか、又は（ｃ）これら両方の組合せである。選択スキームは、宿主細胞の増殖を妨げることを含んでいてもよい。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子による形質転換が成功した細胞は、例えば、同時に送達された選択マーカーにより付与された薬剤耐性により生存する。一例は、形質転換体がメトトレキセートの存在下で培養されるＤＨＦＲ選択マーカーである。対象となる外来遺伝子のコピー数を増幅させるために増量したメトトレキセートの存在下で細胞を培養してもよい。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞株である。更なる例は、グルタミン酸合成酵素発現系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）である。酵母で使用される選択遺伝子の一例は、ｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら．（１９７９年）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３８を参照されたい。
プロモーター
抗原結合タンパク質を発現させるのに好適なプロモータは、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結される。原核生物の宿主のプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン、及びＴａｃ等のハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母細胞で発現させるのに好適なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフクルトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、及びグルコキナーゼが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、及び窒素代謝又はマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素が挙げられる。
哺乳類細胞系で発現させるためのプロモーターとしては、ポリオーマ、鶏痘、及びアデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウィルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及び初期又は後期シミアンウイルス４０等のウイルスプロモータが挙げられる。無論、プロモータの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づいてよい。第１のプラスミドは、ＲＳＶ及び／又はＳＶ４０及び／又はＣＭＶプロモーター、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡ、κＣ領域をネオマイシン及びアンピシリン耐性選択マーカーと共に含んでよく、第２のプラスミドは、ＲＳＶ又はＳＶ４０プロモーター、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域をコードするＤＮＡ、ＤＨＦＲ及びアンピシリン耐性マーカを含む。
エンハンサーエレメント
適切な場合、例えば、高等真核生物で発現させるために、ベクター中のプロモータエレメントに機能的に連結しているエンハンサーエレメントを使用することができる。哺乳類のエンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテイン及びインスリン由来のエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュウイルスエンハンサー又はマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座等の真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを用いてもよい（国際公開第０４／００９８２３号パンフレットを参照されたい）。エンハンサーは、ベクターにおいてプロモータの上流の部位に位置してもよい。あるいは、エンハンサーは、例えば、非翻訳領域内、又はポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択及び配置は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づいてよい。
ポリアデニル化／終結
真核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結される。このようなシグナルは、典型的に、オープンリーディングフレームの３’に位置する。哺乳類系では、非限定的な例としては、成長ホルモン、伸長因子１アルファ及びウイルスの（例えば、ＳＶ４０）遺伝子、又はレトロウイルスの長い末端反復配列に由来するシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化／終結シグナルの非限定的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）及びアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核細胞系では、ポリアデニル化シグナルは、典型的には必要とされず、代わりに、より短く且つより明確なターミネーター配列が通常使用される。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づいてよい。
収率を高めるための他の方法／エレメント
上記に加えて、収率を高めるために使用することができる他の機構としては、クロマチンリモデリングエレメント、イントロン、及び宿主細胞に特異的なコドン修飾が挙げられる。
宿主細胞
抗原結合タンパク質をコードするベクターをクローニング又は発現させるのに好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞である。好適な原核細胞としては、真性細菌が挙げられ、例えば、腸内細菌科、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、ＡＴＣＣ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）等のセラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）に加えて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びリケニホルミス菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）（旧東独国特許第２６６ ７１０号明細書を参照されたい）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等である。酵母宿主細胞の中でも出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、***酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号明細書）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３ ０７０号明細書、また、Ｐｅｎｇら．（２００４年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０８：１８５−１９２を参照されたい）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４ ２３４号明細書）、ペニシリン、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、並びに偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の宿主も考えられる。
高等真核宿主細胞としては、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５０）ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎臓系統２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ６１、ＤＧ４４等のＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株（Ｕｒｌａｕｂら．（１９８６年）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５−５５６を参照されたい）、特に懸濁培養に適したＣＨＯ細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎培養細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、Ｈｅｐ Ｇ２及び骨髄腫又は、リンパ腫細胞、例えばＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）、Ｓｐ２／０、Ｙ０等の哺乳類細胞が挙げられる。
また、このような宿主細胞は、抗原結合タンパク質の品質、機能、及び／又は収率を改良するために更に改変又は適応させてもよい。非限定的な例としては、特異的修飾（例えば、グリコシル化）酵素及びタンパク質ホールディングシャペロンの発現が挙げられる。
細胞培養方法
抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の任意の方法により培養することができる。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、又は中空ファイバー系で培養することができるが、大規模に産生させる場合、特に懸濁培養には撹拌槽型反応器が使用される。撹拌槽は、例えば、スパージャー、バッフル、又は低剪断インペラ等を用いるエアレーションに適応し得る。気泡塔及びエアリフト反応器については、空気又は酸素の気泡を用いて直接エアレーションを行ってもよい。宿主細胞を無血清培地で培養する場合、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８等の細胞保護剤を培地に添加して、エアレーションプロセスに起因する細胞の損傷を防ぐのを補助する。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性細胞株に対する成長基材としてマイクロキャリアを使用してもよく、細胞を懸濁培養に適応させてもよい（これが典型的である）。宿主細胞、特に無脊髄宿主細胞の培養は、フェッドバッチ、反復バッチ処理（Ｄｒａｐｅａｕら．（１９９４年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１０３−１０９を参照されたい）、延長バッチ処理、又は灌流培養等の様々な操作方式を利用してよい。組換え技術を用いて形質転換された哺乳類宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）等の血清含有培地で培養してもよいが、例えば、このような宿主細胞は、Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１５３−１６３に開示されているような合成無血清培地、又はＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭ若しくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ ＮＪ，ＵＳＡ）等の市販培地で培養され、これら培地には、必要な場合、グルコース等のエネルギー源及び組換えインスリン等の合成成長因子が添加される。宿主細胞の無血清培養は、これら細胞が無血清条件における成長に適応していることを必要とする場合がある。１つの適応アプローチは、血清含有培地中でこのような宿主細胞を培養し、宿主細胞が無血清条件に適応できるようになるように培地の８０％を無血清培地に繰り返し交換することである（例えば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇら．（１９９５年）ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ（Ｂｅｕｖｅｒｙら編，６１９−６２３，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。
培地に分泌される抗原結合タンパク質は、意図する用途に好適な精製度を得るために様々な技術を用いて回収及び精製することができる。例えば、ヒト患者を治療するための抗原結合タンパク質の使用には、典型的に、（粗培養培地と比較して）少なくとも純度９５％、より典型的には９８％若しくは９９％又はそれ以上の純度が要求される。培地の細胞残屑は、典型的に、遠心分離し、次いで、例えば、精密濾過、限外濾過、及び／又は深層濾過等の清澄化工程を用いて除去する。透析及びゲル電気泳動、並びにハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（任意でポリヒスチジン等の親和性タギング系を含む）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照されたい）等のクロマトグラフィー技術等の様々な他の技術が利用可能である。抗体は、以下の様々な清澄化工程に従って、プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して、捕捉することができる。この後、イオン交換及び／又はＨＡクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー、及び硫安分画等の更なるクロマトグラフィー工程を行ってもよい。様々なウイルス除去工程を使用してもよい（例えば、ＤＶ−２０フィルタを用いるナノ濾過等）。これら様々な工程後、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ以上又は１００ｍｇ／ｍＬ以上の抗原結合タンパク質を含む精製された（例えば、モノクローナル）調製物が得られる。このような調製物は、抗原結合タンパク質の凝集形態を実質的に含まない。
抗原結合断片を発現させるために細菌系を使用してもよい。このような断片は、細胞内の周辺細胞質内に局在するか、又は細胞外に分泌され得る。当業者に公知の方法に従って不溶性タンパク質を抽出及びリフォールディングして、活性タンパク質を形成することができる。Ｓａｎｃｈｅｚら．（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：１３−２０；及びＣｕｐｉｔら．（１９９９年）Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９：２７３−２７７を参照されたい。
医薬組成物
疾患、障害及び病状という用語は、互換的に使用される。本明細書に記載する抗原結合タンパク質の精製調製物を、本明細書に記載するヒトの疾患の治療において使用するための医薬組成物に配合してもよい。前記医薬組成物は、ＩＬ−７が疾患の一因であるか、又はＩＬ−７Ｒ媒介性シグナル伝達の阻害／中和が有益である疾患の治療において使用することができる。前記医薬組成物は、治療上有効な量の本明細書に記載する抗原結合タンパク質を含む。
医薬調製物は、薬学上許容される担体と組合せて抗原結合タンパク質を含んでなり得る。抗原結合タンパク質は、単独で投与してもよく、医薬組成物の一部として投与してもよい。
典型的に、このような組成物は、公知であり且つ許容し得る薬務により要求される薬学上許容される担体を含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照されたい。このような担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、又はデキストロース溶液等の無菌担体が挙げられ、これら担体は、任意で好適なバッファによりｐＨ５〜８に緩衝される。
医薬組成物は、（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、門内に）注射又は持続注入することにより投与することができる。このような組成物は、目に見える粉粒体を含まないことが好ましい。医薬組成物は、１ｍｇ〜１０ｇの抗原結合タンパク質、例えば、５ｍｇ〜１ｇの抗原結合タンパク質を含んでなり得る。あるいは、前記組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば、５ｍｇ〜５０ｍｇを含んでなり得る。
このような医薬組成物を調製する方法は、当業者に周知である。医薬組成物は、単位剤形中に抗原結合タンパク質を１ｍｇ〜１０ｇ含んでなり得、任意で使用説明書を共に含む。医薬組成物は、当業者に周知であるか又は当業者に明らかである方法に従って、投与前に再構成するために凍結乾燥（フリーズドライ）してもよい。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する場合、このアイソタイプの抗体の銅触媒による分解の程度を低下させるために医薬組成物にクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）又はＥＤＴＡ又はヒスチジン等の銅のキレート化剤を添加してもよい。欧州特許第０６１２２５１号明細書を参照されたい。また、医薬組成物は、アルギニン塩基、ポリソルベート８０等の洗剤／抗凝集剤、及びバイアルのヘッドスペースの酸素を置換するための窒素等の不活性ガス等の可溶化剤を含んでなり得る。
抗原結合タンパク質を投与するための有効量及び治療レジメンは、一般的に、経験的に決定され、患者の年齢、体重、及び健康状態、並びに治療される疾患又は障害等の要因に依存し得る。このような要因は、主治医の理解の範囲内である。適切な用量の選択における指針は、例えば、Ｓｍｉｔｈら（１９７７年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出すことができる。したがって、本発明の抗原結合タンパク質を治療上有効な量で投与することができる。
被験体に投与される抗原結合タンパク質の投薬量は、一般的に、被験体の体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．５ｍｇ〜５０ｍｇ、１〜２５ｍｇ、又は１〜１０ｍｇである。例えば、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ又は６０ｍｇ／ｋｇであり得る。抗原結合タンパク質は、例えば、皮下、静脈内、又は筋肉内等、非経口的に投与してもよい。
望ましい場合、有効な日用量の治療組成物は、任意で単位剤形にて、適切な間隔で別々に２、３、４、５、６又はそれ以上のサブ用量で投与してもよい。例えば、１４日又は２８日に１回、各投与日に複数のサブ用量の形態で用量を皮下投与してもよい。
典型的に、１５分〜２４時間、例えば、２〜１２時間、又は２〜６時間の期間にわたって静脈内注入により用量を投与してよい。これは、有毒な副作用を低減することができる。
用量の投与は、必要に応じて１回以上、例えば、１日３回、毎日１回、２日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は１２ヶ月に１回繰り返してもよい。抗原結合タンパク質は、維持療法により、例えば、６ヶ月以上の期間にわたって１週間に１回投与してもよい。抗原結合タンパク質は、間欠療法により、例えば、１周期において、３〜６ヶ月間抗原結合タンパク質を投与し、次いで、３〜６ヶ月間投与せず、次いで、３〜６ヶ月間再度抗原結合タンパク質を投与してもよい。
生体サンプル中のＩＬ−１７の量を測定することにより、投薬量を決定又は調節することができる。投薬量を決定又は調節する他の手段を用いてもよく、例えば、薬理学の生物学的マーカー（「バイオマーカー」）、筋肉量の測定、並びに／又は機能、安全性、耐容性及び治療反応が挙げられるがこれらに限定されない。抗原結合タンパク質は、被験体におけるＩＬ−７媒介性シグナル伝達活性をダウンレギュレートするのに有効な量及び期間投与してよい。
抗原結合タンパク質は、特定の部位に対する標的療法を行うように被験体に投与してよい。例えば、筋肉、例えば骨格筋に抗原結合タンパク質を局所的に注射してもよい。
抗原結合タンパク質は、１以上の他の治療活性剤、例えば、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ―１ａ又はＩＦＮβ―１ｂ）及び酢酸グラチラマー等の免疫調節物質、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチオプリン、クラドリビン、シクロスポリン及びミトキサントロン等の免疫抑制物質、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）、血漿補充及びスルファサラジン等の他の免疫療法と併用してもよい。更なる治療剤は、医師に指示される方法（投薬量、タイミング、機序）で投与し得る。１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質と同時に又は順次又は別々に更なる治療剤を投与してもよい。１つの実施形態では、患者に対する薬理効果が重複するように、言い換えれば、患者に対して同時に生物学的作用発揮するように、更なる治療剤と抗原結合タンパク質とを投与する。
抗原結合タンパク質を他の治療活性剤と併用する場合、個々の成分を、一緒に又は別々に、順次又は同時に、別個の医薬製剤又は複合医薬製剤で、任意の適切な経路により投与してよい。別々に又は順次投与する場合、抗原結合タンパク質及び治療活性剤は、任意の順序で投与してよい。
上記組合せは、任意で薬学上許容される担体又は賦形剤と共に、上に定義する組合せを含む単一医薬製剤の形態で使用するために提示してもよい。
同じ製剤中で組合せる場合、成分が安定であり且つ互いに及び製剤の他の成分と適合しなくてはならず、投与用に製剤化できることが認識される。別々に製剤化する場合、例えば当技術分野の抗原結合タンパク質について公知のように、任意の便利な製剤で提供してよい。
同じ疾患に対する第２の治療活性剤と組合せる場合、各成分の用量は、抗原結合タンパク質を単独で使用するときと異なってもよい。当業者は適切な用量を容易に認識する。
抗原結合タンパク質及び治療活性剤は、相乗的に作用する場合もある。言い換えれば、抗原結合タンパク質と治療活性剤とを組合せて投与すると、本明細書に記載する疾患、障害、又は病状に対する効果が、それぞれの単独の効果の合計よりも大きい場合がある。
医薬組成物は、任意で使用説明書と共に、抗原結合タンパク質と他の薬剤とのキットオブパーツを含んでよい。便宜上、キットは、使用説明書と共に所定の量の試薬を含んでよい。
用語「個体」、「被験者」及び「患者」は、本発明において互換的に使用される。被験体は、典型的にヒトである。また、被験体は、マウス、ラット又は霊長類（例えばマーモセット又はサル）等の哺乳類であってもよい。被験体は、非ヒト動物であってもよい。また、抗原結合タンパク質は、獣医学的に使用してもよい。治療される被験体は、家畜、例えば、雌ウシ又は雄ウシ、ヒツジ、ブタ、雄ウシ、ヤギ又はウマ等の家畜であってもよく、イヌ又はネコ等のペットであってもよい。動物は、任意の年齢であってよく、成熟した成体動物であってもよい。
治療は、治療的、予防的、又は防止的であってよい。被験体は、それを必要としている被験体であってよい。治療を必要としている被験体は、特定の医学的疾患に既に罹患している個体に加えて、将来その疾患を発現する可能性のある個体を含んでなり得る。
したがって、本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、予防的又は防止的治療に用いることができる。この場合、本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、疾患の１以上の局面又は症状の発生を防止するか又は遅らせるために、個体に投与される。被験体は、無症候性であり得る。被験体は、その疾患に対する遺伝性素因を有し得る。このような個体には、予防上有効な量の抗原結合タンパク質が投与される。予防上有効な量は、本明細書に記載する疾患の１以上の局面又は症状の発生を防止するか又は遅らせる量である。
また、本明細書に記載する抗原結合タンパク質を治療の方法で用いてもよい。用語「治療」は、疾患の少なくとも１つの局面又は症状の緩和、低減、又は防止を包含する。例えば、本明細書に記載する抗原結合タンパク質を用いて、本明細書に記載する疾患の１以上の局面又は症状を寛解又は低減することができる。
本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、治療的、予防的、又は防止的治療に有効な量で用いられる。本明細書に記載する抗原結合タンパク質の治療上有効な量は、疾患の１以上の局面又は症状を寛解又は低減するのに有効な量である。また、本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する疾患を治療、防止、又は治癒させるために用いることができる。
本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、一般的に、被験体の健康に対して有益な効果を有し得、例えば、被験体の予測寿命を延ばすことができる。
本明細書に記載する抗原結合タンパク質は、生存可能な治療的治療を行うために疾患の全ての症状又は徴候を完全に治癒させる又は根絶する必要がある訳ではない。適切な分野で認識されている通り、治療剤として使用される薬物は、所与の疾患状態の重篤度を低下させることができるが、有用な治療剤であるとみなされるために疾患の全ての徴候を消失させる必要がある訳ではない。同様に、予防的に投与される治療は、生存可能な予防剤を構成するために疾患の発症を防止するのに完全に有効である必要はない。単に、（例えばその症状の数又は重篤度を減らすことにより、又は別の治療の有効性を高めることにより、又は別の有益な効果を生じさせることにより）疾患の影響を低下させるか又は（例えば疾患の発症を遅らせることにより）被験体において疾患が生じたり悪化したりする可能性を低下させることで十分である。
本発明の抗原結合タンパク質は、多発性硬化症、及び他の自己免疫疾患又は炎症性疾患、特に病原性ＴＨ１７細胞が関与するものの治療において使用することができる。このような疾患は、高レベルのＩＬ−１７発現を伴う。ＭＳ患者の血清及びＣＳＦ（Ｍａｔｕｓｅｖｉｃｉｕｓ，Ｄ．ら．；Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．５，１０１−１０４；１９９９年）、並びに関節リウマチ患者から得られた滑液で高レベルのＩＬ−１７が報告されている。また、ＩＬ−１７は乾癬にも関与しており（Ｈｏｍｅｙら．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１２）：６６２１−３２；２０００）、一方では、ベーチェット病における高レベルのＩＬ−１７もＨａｍｚａｏｕｉらにより報告されている（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｕｅｍａｔｏｌ．；３１：４，２０５−２１０；２００２年）。また、高レベルのＩＬ−１７は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）でも観察されている（Ｗｏｎｇら．；Ｌｕｐｕｓ ９（８）：５８９−９３；２０００年）。
また、ＩＬ−７受容体媒介性シグナル伝達の阻害は、喘息等のＩＬ−１７の増加が関与している炎症性（非自己免疫）疾患の治療においても有用であり得る。
したがって、本発明の炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患としては、乾癬及びアトピー性皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；クローン病；潰瘍性大腸炎；外科的組織再潅流傷害、心筋梗塞、心停止、心臓手術後の再灌流、並びに経皮経管冠動脈形成術後の狭窄、卒中及び腹部大動脈瘤等の心筋虚血状態を含む虚血再灌流障害；卒中に続発する脳浮腫；頭蓋外傷、循環血液量減少性ショック；窒息；成人型呼吸窮迫症候群；急性肺障害；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；皮膚炎；脳膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；狼瘡腎炎；関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、脈管炎等の自己免疫性疾患；白血球漏出を含む疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、敗血症又は外傷に続発する多臓器損傷症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原抗体複合体媒介性疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的応答；肋膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）及び嚢胞性線維症を含む肺の炎症；乾癬性関節炎；視神経脊髄炎、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、ＣＯＰＤ、１型糖尿病等が挙げられる。
特に、本発明のアンタゴニストは、視神経脊髄炎を含む全ての形態の多発性硬化症の治療に有用であり得る。活動性炎症性疾患の状況で投与されたとき、すなわち、臨床的に孤立した症候群又は再発型のＭＳの治療において使用されるとき、本発明のアンタゴニストによる治療が最も効果的であると予測される。これら疾患の病期は、臨床的に、及び／又はガドリニウム増強若しくはより高感度な技術等の画像診断基準により、及び／又は活動性疾患の未だ定義されていないバイオマーカー等の他の方法により確定することができる。特に、本発明のアンタゴニストを用いて、患者が再発しつつあるか又は再発している場合に（静脈内、皮下、経口、筋肉内への送達を介して）ＲＲＭＳを治療することができる。１つの実施形態では、再発の発生時に、又は再発の発生から１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日以内に本発明のアンタゴニストを投与する。
本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤ１２７に結合することができる。１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＩＬ−７受容体の生物学的作用に拮抗することができる。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＨ１７受容体媒介性増殖、及びＩＬ−７受容体媒介性生存のうちの少なくとも１つに拮抗することができる。
阻害、拮抗、中和という用語は、本発明において同義的に用いられる。これら用語はいずれも、完全な中和の必要性を示唆することを意図するものではなく；部分的な中和（生物学的作用の低下に相当するが、完全に消失させる訳ではない）も考えられる。
ＩＬ−７受容体媒介性のＴＨ１７の増殖及び／又は生存は、ＴＨ１７細胞数の増加若しくは維持によって、又は他のＣＤ４＋Ｔ細胞数と比較したＴＨ１７細胞数の比率の増加によって、又はより具体的には、ＴＨ１７：ＴＨ１細胞の比、ＴＨ１７：Ｔｒｅｇ細胞の比、（ＴＨ１７＋ＴＨ１）：Ｔｒｅｇ細胞の比、及び／又はＴＨ１７：（ＴＨ１＋Ｔｒｅｇ）の比の増加によって細胞レベルで観察することができる。
分子レベルでは、ＴＨ１７の増加及び／又は生存は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団による（又はＴＨ１７細胞の集団による）ＩＬ−１７産生の増加によって観察することができる。したがって、１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団によるＩＬ−１７産生を減少させる。また、ＩＬ−７受容体媒介性のＴＨ１７の増殖及び生存は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団による（又はＴＨ１７細胞の集団による）ＴＦＮ−γの産生の増加によって観察することもできる。したがって、１つの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団によるＩＦＮ−γ産生に拮抗する（減少させる）。分子レベルでは、本発明の抗原結合タンパク質は、ＩＬ−７受容体媒介性のＳＴＡＴ−５リン酸化を阻害することができる。
分子レベルでは、ＩＬ−７誘導性のＰ−ＳＴＡＴ５又はＢｃｌ−２等のアッセイにより本発明の抗原結合タンパク質のブロッキング効果を観察及び測定することができる。細胞レベルでは、ＩＬ−１７又はＩＦＮγのＴｈ１７分泌等のアッセイによりブロッキング効果を観察及び測定することができる。例示的なアッセイは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３１３６号（国際出願第２０１０／０１７４６８号パンフレット）に記載されている。
例示的なｐＳＴＡＴ−５アッセイでは、試験剤の存在下及び不在下にて、ＩＬ−７でＰＢＭＣを刺激する。次いで、例えば、（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マウス抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４，ＢＤ［＃６１２５９９］）等の標識された抗ｐＳＴＡＴ−５抗体を用いて）ｐＳＴＡＴ−５を染色し、次いで、蛍光活性化細胞選別を行うことにより、細胞のｐＳＴＡＴ−５の量を定量的に評価する。また、リン酸化型ＳＴＡＴ−５の量は、ＥＬＩＳＡによって測定することもできる。リン酸化型ＳＴＡＴ−５の量を減少させる剤は、自己免疫疾患に対する潜在的な治療剤の候補である可能性がある。
アンタゴニストの不在下におけるＳＴＡＴ−５量と比較したとき、又はネガディブコントロール、すなわち未処理細胞と比較したとき、アンタゴニストは、リン酸化型ＳＴＡＴ−５の量を少なくとも２０％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％減少させることができる。アンタゴニストは、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、又は２μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を有し得る。１つの実施形態では、アンタゴニストは、１μｇ／ｍＬ以下、０．７５μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．２５μｇ／ｍＬ以下、又は０．１μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を有する。
本発明のアンタゴニストは、ＴＨ１７細胞の増殖を阻害において特に有効である。ＴＨ１７細胞の増殖は、ＴＨ１７増殖アッセイにおいて測定することができ、これは、試験剤の存在下及び不在下でナイーブなＴ細胞の集団を刺激して増殖させ、次いで、前記細胞を刺激してＩＬ−１７を産生させ、試験剤の存在下及び不在下で前記細胞により産生されるＩＬ−１７の量を評価することを含む。
例示的なアッセイでは、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−２３の存在下でＴ細胞の受容体を活性化を用いて刺激することにより、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＴＨ１７に分化させる。５日間分化させた後、ＣＣＲ６＋細胞を分離して、ＴＨ１７の濃縮された集団を作製する。次いで、この集団をヒトＩＬ−７で刺激し、上清中におけるＩＬ−１７及びＩＦＮ−γの増加を測定する。インキュベート期間中にＩＬ−７とＣＤ１２７とのの相互作用のアンタゴニストが存在すれば、ＴＨ１７細胞の増殖を防ぎ、ＩＬ−７及びＩＦＮ−γ産生を減少させるはずであることから、本発明の抗原結合タンパク質等の試験剤がこの相互作用をブロックする能力を測定することができる。
本発明の抗原結合タンパク質は、ネガディブコントロールに対して、このようなアッセイにおけるＩＬ−１７分泌を２０％以上阻害することができる。より典型的には、抗原結合タンパク質は、対照に対してＩＬ−１７分泌を５０％、７５％、８５％、又は９０％以上阻害することができる。抗原結合断片は、幾つかの実施形態では、前記アッセイにおいて５０μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を示し得る。他の実施形態では、ＩＣ５０は、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬ以下であり得る。
したがって、別の態様では、本発明は、患者においてＴＨ１７細胞数を減少させるのに十分な量の中の本発明の抗原結合タンパク質を患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患又は炎症性障害を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＩＬ−７受容体の媒介するＳＴＡＴ−５リン酸化を減少させるのに十分な量の抗原結合タンパク質を被験体に投与することを含んでなる、ヒト被験体における自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、患者に本発明の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、患者の多発性硬化症を治療する方法であって、前記患者が再発寛解型多発性硬化症に罹患している方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＨ１細胞に対するＴＨ１７細胞の比率を低下させるのに有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を被験体に投与することを含んでなる、ヒト被験体における自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、（Ｆｏｘｐ３＋）Ｔｒｅｇ細胞に対するＴＨ細胞の比率を低下させるのに有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を被験体に投与することを含んでなる、ヒト被験体における自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療する方法を提供する。
診断的使用方法
本明細書に記載する抗原結合タンパク質を使用して、診断目的のためにインビトロ又はインビボにおける生体サンプル中のＣＤ１２７を検出することができる。例えば、抗ＣＤ１２７抗原結合タンパク質を使用して、培養細胞、組織又は血清中のＣＤ１２７を検出することができる。前記組織は、ヒト又は動物の身体から最初に除去されてもよい（例えば生検）。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織化学又は免疫沈降を含む従来のイムノアッセイを使用することができる。
抗原結合タンパク質は、１以上の抗原結合タンパク質、検出可能な標識、及びキットの使用説明書を含む診断キットを提供することができる。便宜上、前記キットは、使用説明書と共に所定の量の試薬を含んでよい。
遺伝子治療
本明細書に記載する抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を、それを必要としている被験体に投与してもよい。また、核酸分子は、適切なスカフォールド又はドメインにおけるＣＤＲ、可変ドメイン又は完全長抗体を発現することができる。核酸分子は、ヒト又は動物の細胞中で発現させるためのベクターに含まれてもよい。上記の通り薬学上許容される賦形剤及び／又は１以上の治療活性剤を投与するために核酸分子又はベクターを製剤化してもよい。
１．０ １Ａ１１のヒト化
１．１ １Ａ１１ ハイブリドーマ可変領域のクローニング
１Ａ１１ハイブリドーマの細胞ペレットから全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、可変領域のｃＤＮＡを作製した。各ハイブリドーマの重鎖及び軽鎖の増幅された可変領域をｐＣＲ２．１クローニングベクターにクローニングした。各ハイブリドーマの重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を得た。配列分析により、ペプチド配列は以下の通り予測された（相補性決定領域を強調する）：
Figure 0005850860
重鎖及び軽鎖の可変領域をそれぞれヒトＩｇＧ１Ｆｃ及びカッパ定常領域に融合させることにより、組み換えキメラ型の抗体を作製した。
１．２ １Ａ１１ 重鎖ヒト化ストラテジ
ヒトＶ遺伝子生殖細胞系データベースのＢＬＡＳＴ分析に従って、ヒト化に好ましいアクセプターフレームワークとして、マウス１Ａ１１可変重鎖配列と６４％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１＿２を選択した。生殖細胞系のＶ領域を、配列相同性に基いて好適なＦＲ４、この場合、ＪＨ６ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ Ｖｏｌ．ＩＩ）とインシリコで組合せた。ＷＧＱＧモチーフに先行するＪＨ６ミニ遺伝子残基の最初の６つの残基は、ドナー抗体由来のＣＤＲに置換されるＣＤＲ３領域内に含まれる。配列比較及び抗体機能に影響を及ぼす可能性に基づいて、８つのヒト化重鎖変異体を作製した。コンストラクトＨ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに（Ｋａｂａｔの定義を使用する）１Ａ１１由来のマウスＣＤＲをグラフトしたストレートグラフトであった。コンストラクトＨ１〜Ｈ３は、Ｈ０に基づき；各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異（それぞれ、位置７１、６６及び６９）が組み込まれている。Ｈ４〜Ｈ７には、上記の復帰突然変異のうちの２、３、４又は５つが組み込まれている。
１．３ １Ａ１１ フレームワークＩＧＨＶ１−２の重鎖ヒト化の原理
Figure 0005850860
１．４ １Ａ１１ 軽鎖ヒト化ストラテジ
ヒトＶ遺伝子生殖細胞系データベースのＢＬＡＳＴ分析に従って、ヒト化に好ましいアクセプターフレームワークとして、マウス１Ａ１１可変軽鎖配列と５３％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３＿１１を選択した。生殖細胞系のＶ領域を、配列相同性に基いて好適なＦＲ４、この場合、Ｊ領域カッパ４ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ Ｖｏｌ．ＩＩ）とインシリコで組合せた。ＪＫ−４ミニ遺伝子残基の最初の３つの残基は、ドナー抗体由来のＣＤＲに置換されるＣＤＲ３領域内に含まれる。配列比較及び抗体機能に影響を及ぼす可能性に基づいて、１０個のヒト化軽鎖変異体を作製した。コンストラクトＬ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに（Ｋａｂａｔの定義を使用する）１Ａ１１由来のマウスＣＤＲをグラフトしたストレートグラフトであった。コンストラクトＬ１、Ｌ２、Ｌ４は、Ｌ０に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異（それぞれ、位置４７、７１及び４６）が組み込まれている。コンストラクトＬ３には、上記の復帰突然変異４７及び７１が両方とも組込まれている。コンストラクトＬ５には、上記の復帰突然変異４７及び７１及び４６のうちの３つが組込まれている。コンストラクトＬ６〜Ｌ９は、Ｌ５に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１、２、３、及び４つの更なるフレームワーク突然変異（それぞれ、位置５８、４５、７０及び６０）が組み込まれている；。
１．５ １Ａ１１ フレームワークＩＧＫＶ３−１１の軽鎖ヒト化の原理
Figure 0005850860
２．０ ６Ａ３のヒト化
２．１ ６Ａ３ 重鎖ヒト化ストラテジ
ヒトＶ遺伝子生殖細胞系データベースのＢＬＡＳＴ分析に従って、ヒト化に好ましいアクセプターフレームワークとして、マウス６Ａ３可変重鎖配列と７１％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ４＿６１、及び５１％の同一性を有するヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３＿３３（これはＩＧＫＶ１＿３９と共によく発現することが既に知られている）を選択した。生殖細胞系のＶ領域を、配列相同性に基いて好適なＦＲ４、この場合、ＪＨ６ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ Ｖｏｌ．ＩＩ）とインシリコで組合せた。ＷＧＱＧモチーフに先行するＪＨ６ミニ遺伝子残基の最初の２つの残基は、ドナー抗体由来のＣＤＲに置換されるＣＤＲ３領域内に含まれる。配列比較及び抗体機能に影響を与える可能性に基づいて、フレームワークＩＧＨＶ４＿６１を含む１０個のヒト化重鎖変異体及びフレームワークＩＧＨＶ３＿３３を含む１２個のヒト化重鎖変異体を作製した。コンストラクトＨ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに（Ｋａｂａｔの定義を使用する）６Ａ３由来のマウスＣＤＲをグラフトしたストレートグラフトであった。フレームワークＩＧＨＶ４＿６１を有するＨ１〜Ｈ５コンストラクトは、Ｈ０に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異（それぞれ、位置７１、２７、３０、６７、及び４８）が組み込まれている。Ｈ６〜Ｈ９コンストラクトには、上記の復帰突然変異のうちの２、３、４又は５つが組み込まれている。フレームワークＩＧＨＶ３−３３を有するＨ１〜Ｈ１１コンストラクトは、Ｈ０に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異が組み込まれている（それぞれ、位置２７、３０、２８、２９、６７、７３、７８、４９、６８、２４及び４８）。
２．２ ６Ａ３ フレームワークＩＧＨＶ４＿６１についての重鎖ヒト化の原理
Figure 0005850860
Figure 0005850860
２．３ ６Ａ３フレームワークＩＧＨＶ３＿３３についての重鎖ヒト化の原理
Figure 0005850860
Figure 0005850860
２．４ ６Ａ３ 軽鎖ヒト化ストラテジ
ヒトＶ遺伝子生殖細胞系データベースのＢＬＡＳＴ分析に従って、ヒト化に好ましいアクセプターフレームワークとして、マウス６Ａ３可変軽鎖配列と７２％の同一性（ＣＤＲを含む）を有するヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１＿３９を選択した。生殖細胞系のＶ領域を、配列相同性に基いて好適なＦＲ４、この場合、Ｊ領域カッパ２ミニ遺伝子（Ｋａｂａｔ Ｖｏｌ．ＩＩ）とインシリコで組合せた。ＪＫ−２ミニ遺伝子残基の最初の２つの残基は、ＣＤＲ３領域内に含まれ、マウス６Ａ３軽鎖ＣＤＲ３の最後の２つの残基と同一である。配列比較及び抗体機能に影響を与える可能性に基づいて、５個のヒト化軽鎖変異体を作製した。コンストラクトＬ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに（Ｋａｂａｔの定義を使用する）６Ａ３由来のマウスＣＤＲをグラフトしたストレートグラフトであった。コンストラクトＬ１、Ｌ２は、Ｌ０に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異が組み込まれている（それぞれ、位置４５、７０）。コンストラクトＬ３には、上記の復帰突然変異が両方とも組込まれている。
６Ａ３ フレームワークＩＧＫＶ１＿３９の軽鎖ヒト化の原理
Figure 0005850860
配列比較及び抗体機能に影響を与える可能性に基づいて、５個のヒト化軽鎖変異体を作製した。コンストラクトＬ０は、上で選択されたヒトアクセプターフレームワークに（Ｋａｂａｔの定義を使用する）６Ａ３由来のマウスＣＤＲをグラフトしたストレートグラフトであった。コンストラクトＬ１、Ｌ２は、Ｌ０に基づき、各々に、各コンストラクトで異なる１つの更なるフレームワーク突然変異が組み込まれている（それぞれ、位置４５、７０）。コンストラクトＬ３には、上記復帰突然変異が両方とも組込まれている。コンストラクトＬ２７には、Ｔ４Ｌ、Ａ３１Ｙ、Ｄ７０Ｍ、Ｖ８５Ｔ、Ｔ９４Ｙ、Ｑ１００Ｇ、Ｌ１０４Ｖ（配列番号１３８）を含むより多くの突然変異が組み込まれている。
Figure 0005850860

２．５ Ｆｃ不能可変重鎖の構築
１Ａ１１ Ｈ３コンストラクトに対して２つのアミノ酸置換Ｌ２３７Ａ及びＧ２３９Ａを行った。これら修飾により、分子は免疫エフェクター細胞又は補体をそれほど動員できなくなる。得られたＶＨコンストラクトは、１Ａ１１ Ｈ３−Ｆｃであると同定され、（配列番号１１９の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる）配列番号１１８に示す配列を有する。以下の実施例４に記載する通り、１Ａ１１ Ｈ３−Ｆｃ及び１Ａ１１．Ｌ４軽鎖（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃ）を含む抗体を更に分析した。
２．６ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の親和性成熟
２．６．１ 組換え型抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体の構築
ヒト化抗ＩＬ７Ｒモノクローナル抗体１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の多数の変異体を作製した。これらは全て、配列番号１１４に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｈ３）及び配列番号１１５に記載の軽鎖アミノ酸配列（Ｌ４）を有する抗体の重鎖のＣＤＲＨ３領域においてアミノ酸置換１つしか異なっていなかった。
部位特異的変異誘発を使用して、ｐＬＥＦＤ哺乳類発現ベクター内の１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４のヒト化ＣＤＲＨ３変異体を作製した。
２．６．２ ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の小規模抗体発現
１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及びＣＤＲＨ３変異体の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするｐＬＥＦＮ及びｐＬＥＦＤプラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を使用して９６ウェルスケール（発現体積５００μＬ）でＨＥＫ ２９３ ６Ｅの細胞へ一過的にコトランスフェクトした。１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより上清を収集した。次いで、０．４５μｍ濾過プレートを使用して、抗体を含有する上清を濾過した。組織培養上清から直接抗体を評価した。
２．６．３ 抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体のＰｒｏｔｅｏｎ分析
ＣＤＲＨ３抗体変異体（これらはＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞における小規模抗体発現に由来し、実施例２．６．２に記載の通り組織培養上清から直接評価された）の結合親和性を決定するための初期スクリーニングをＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏｒａｄ）において実行した。方法は以下の通りであった；一級アミンカップリングによりＧＬＣチップ上にプロテインＡを固定化し、次いで、ＣＤＲＨ３突然変異体抗体をこの表面に捕捉し、結合曲線のダブルレファレンスのために用いられる０ｎＭ注入（すなわち、バッファのみ）と共に２５６、６４、１６、４、１ｎＭのＩＬ７Ｒを通した。５０ｍＭのＮａＯＨを使用して捕捉表面を再生し、結合しているＣＤＲＨ３突然変異体抗体を除去して、捕捉及びアナライト注入の別のサイクルの準備を整えた。機械に固有の解析ソフトウェアを使用して、１：１モデルにデータを適合させた。組織培養上清から直接突然変異体抗体の結合解析を行った。
スクリーニングにより、親分子（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４）よりも優れた動態プロファイルを有すると考えられる幾つかの抗体を同定した。この分析から得られたデータを４．２．３に示す。このデータは、Ｎ９８及びＦ１００ｂの残基における幾つかのＣＤＲＨ３突然変異がＩＬ７Ｒに対する結合親和性を改善すると考えられることを示す。このデータセットから、更なる分析（実施例２．６．４）のために６つの分子を選択した。
２．６．４ ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞の大規模抗体発現
上記データは、Ｎ９８及びＦ１００ｂ残基における幾つかのＣＤＲＨ３突然変異がＩＬ７Ｒに対する結合親和性を改善すると考えられることを強調した（４．２．３にデータを示す）。したがって、これら６つのＣＤＲＨ３変異体について精製抗体を作製した。１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体の重鎖及び軽鎖をコードするコンストラクトを、ｐＬＥＦＤ及びｐＬＥＦＮのプラスミドから大規模ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ発現に最適なｐＴＴベクターにサブクローニングした。２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３４７０１９）を使用して、５０〜１００ｍＬのＨＥＫ ２９３ ６Ｅ（プラスミドの詳細は表７に要約する）にプラスミドを一過的にコトランスフェクトした。２４時間後トリプトンフィードを細胞培養物に添加し、更に７２時間後細胞を収集した。次いで、固定化されたプロテインＡカラムを用いて抗体を親和性精製し、２８０ｎｍにおける吸光度を読み取ることにより定量した。
３．０ ヒト化ベクターの構築
ヒト化可変領域のＤＮＡ配列は、ＬＥＴＯ １．０ソフトウェア（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ ＧｍｂＨ）を用いて最適化された配列であり、重複するオリゴヌクレオチドの構築及びＰＣＲ増幅によりデノボ合成された。プライマーは、哺乳類発現ベクターにクローニングするための制限酵素部位及び分泌のためのヒト免疫グロブリンシグナル配列を含んでいた。Ａｇｅ１／Ｋａｓ１を使用して、ヒトガンマ１定常領域を含有する哺乳類発現ベクターにヒト化可変重鎖領域をクローニングした。並行して、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩを使用して、ヒトカッパ定常領域を含有する哺乳類発現ベクターにヒト化可変軽鎖領域をクローニングした。
４．０ ヒト化抗体の特性評価
４．１ １Ａ１１及び６Ａ３コンストラクトの結合動態の測定：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ヒトＣＤ１２７ ＥＣＤについての抗ＣＤ１２７抗体の結合動態を評価した。供給されたカップリングバッファを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１００８−３９）抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）モノクローナル抗体が既に固定化されているＣＭ５バイオセンサーチップにヒト化６Ａ３又は１Ａ１１コンストラクトを捕捉した。様々な濃度（５１２、２５６、１２８、６４、３２、１６ｎＭ）のヒトＣＤ１２７ ＥＣＤを３０μＬ／分間の流速で２４０秒間注入した。
１）対象となるＭＡｂを捕捉する
２）捕捉されたＭＡｂに対してアナライトを会合させる
３）アナライトを解離させる（バッファ）
４）ＢＩＡｃｏｒｅに最適化されたバッファにより再生する。共有結合している抗Ｈ Ａｂを除いて全て除去する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態ランサイクル：バッファ、５１２、２５６、１２８、６４、３２、１６ｎＭのＩＬ７Ｒ ＥＣＤ；ダブルレファレンスのためにバッファサイクルを用いた。
３ＭのＭｇＣｌ２で抗体表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１ラングミュアモデルにデータを全体的に適合させることにより動態を測定した。実施例４．２．１（１Ａ１１）及び４．２．２（６Ａ３）に結果を示す。
４．１．１ 選択された１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体の結合動態の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、精製ＣＤＲＨ３突然変異体抗体（実施例２．６．４に記載した通り、ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞における大規模抗体発現から得られた）の結合親和性を測定した。
４．１．１．１ 方法１：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００
一級アミンカップリングにより、約１３００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでＣＭ３チップに抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＢＲ−１００８−３９）を固定化し、次いで、ＣＤＲＨ３突然変異体抗体をこれに捕捉し、全ての抗体を同レベル（４４〜５６ＲＵ）で捕捉し、結合曲線のダブルレファレンスのために用いられる０ｎＭ注入（すなわち、バッファのみ）と共に２５６、６４、１６、４、１ｎＭのＩＬ−７Ｒを通し、３ＭのＭｇＣｌ２を使用してこの表面を再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００解析ソフトウェアに固有の１：１モデルに結合データを適合させた。ランニングバッファとしてＨＢＳ−ＥＰを使用してランを実行し、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００上にて２５℃で実行した。結果を４．２．４に示す。
４．１．１．２：方法２：ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００
一級アミンカップリングにより、約５４００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでＣＭ５チップに抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＢＲ−１００８−３９）を固定化し、次いで、ＣＤＲＨ３突然変異体抗体をこの表面に捕捉し、全ての抗体を同レベル（１７５〜２０５ＲＵ）で捕捉し、結合曲線のダブルレファレンスのために用いられる０ｎＭ注入（すなわち、バッファのみ）と共に、２５６、６４、１６、４、１ｎＭのＩＬ７Ｒを通し、３ＭのＭｇＣｌ２を使用してこの表面を再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００解析ソフトウェアに固有の１：１モデルに結合データを適合させた。ランニングバッファとしてＨＢＳ−ＥＰを使用してランを実行し、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００上にて２５℃で実行した。結果を４．２．５に示す。
４．１．２ カニクイザル及びマーモセットにおける１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の種交差反応性の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を使用して、カニクイザル及びマーモセットのＣＤ１２７ ＥＣＤについて１Ａ１１Ｈ３Ｌ４の結合動態を評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１００８−３９）抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）モノクローナル抗体が既に固定化されているＣＭ５バイオセンサーチップに１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４を捕捉した。３ＭのＭｇＣｌ２で抗体表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１ラングミュアモデルにデータを全体的に適合させることにより動態を測定した。結果を４．３に示す。
４．１．３ ＩＬ７受容体阻害アッセイ
ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析を用いて、精製ＣＤＲＨ３突然変異体抗体（実施例２．６．４に記載した通り、ＨＥＫ ２９３ ６Ｅ細胞における大規模抗体発現から得られた）がＩＬ７とＩＬ７Ｒとの間の相互作用を阻害できることを実証した。
一級アミンカップリングによりＣＭ５チップ上にＩＬ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定化した；１０ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）で表面をコンディショニングして、中和アッセイのための安定な表面を得た。ラン１では２５６ｎＭ、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ及び１ｎＭ、及びラン２では２５６ｎＭ、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ及び０．２５ｎＭの濃度の試験抗体と共に６４ｎＭのＩＬ７Ｒをインキュベートした。次いで、ＩＬ７／ＣＭ５チップに対するランの前に３時間室温でサンプルをインキュベートし、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）を使用して、次の相互作用のための表面を再生した。Ｒｏｂｏｓａｇｅを使用してＩＣ５０値を計算した。それによって、０ｎＭ抗体と共に６４ｎＭのＩＬ７Ｒを使用して得られた最大シグナルに基づいて結合シグナルを百分率値に変換した。結果を４．７に示す。
４．２ 結合動態結果
４．２．１ １Ａ１１
Figure 0005850860

４．２．２ ６Ａ３
Figure 0005850860

４．２．３ ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析による１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の様々な抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体の選択
Figure 0005850860
Figure 0005850860

４．２．４ 選択された１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＲＨ３変異体のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００分析
表８は、４．１．１．１試験から得られたデータを示す。これは、ＣＤＲＨ３突然変異が全て、親分子よりも優れた親和性を有すると考えられ、最良のコンストラクトはＢＰＣ４３９８（抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｎ９８Ｄ）であると思われることを示す。
Figure 0005850860

４．２．５ 選択された１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ ＣＤＨＲ３変異体のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００分析
表９は、４．１．１．２試験から得られたデータを示す。これは、ＣＤＲＨ３突然変異が全て、親分子よりも優れた親和性を有すると考えられ、最良のコンストラクトはＢＰＣ４３９８（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｎ９８Ｄ）及びＢＰＣ４３９９（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｎ９８Ｅ）であると思われることを示す。
Figure 0005850860

２つの方法間で計算された全体的な親和性において差がみられた。これは、ＩＬ７Ｒがホモダイマーであるという事実に起因する可能性があり、したがって、結合活性及び抗体と抗原との架橋の量は、２つのアッセイで用いられる異なる捕捉表面に固定化されているＩＬ７Ｒの様々な密度に依存して増加又は減少する場合がある。２回のラン間で異なる親和性がみられたにもかかわらず、２つの実験におけるランキングは、ＢＰＣ４３９８（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｎ９８Ｄ）が親分子１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４よりも改善された親和性を有することを示す。
４．３ 種交差反応性
１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４（野性型）は、Ｂｉａｃｏｒｅ系によって同等のレベルで試験されたマーモセット及びカニクイザルＩＬ−７Ｒと交差反応することが観察された（表１０）。
Figure 0005850860

４．４ Ｘ線結晶学によるエピトープ結合
観察される機能中和に推定機構を提供するのに役立てたり、抗体成熟についての合理的な選択を行ったりするために、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｆａｂを使用して、インシリコモデリングとＸ線結晶学とを併用してｍＡｂの結合界面を予測した。
１Ａ１１Ｈ３Ｌ４ Ｆａｂ／ヒトＩＬ７受容体複合体の高解像度（２．０８Ａ）構造を確立した。ヒトＩＬ７受容体細胞外ドメイン及び１Ａ１１Ｈ３Ｌ４をＣＨＯ ｌｅｃ細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。パパイン開裂により１Ａ１１Ｈ３Ｌ４のＦＡｂ断片を作製した。Ｆａｂ１Ａ１１Ｈ３Ｌ４とＩＬ７受容体ＥＣＤとを１：１．２のモル比で混合することにより、Ｆａｂ１Ａ１１Ｈ３Ｌ４／ＩＬ７Ｒ ＥＣＤ複合体を作製した。懸滴蒸気拡散方法を使用して、タンパク質を濃縮し結晶化させた。Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅでＸ線回折データを収集した。回折データにインデックスを付け、ＨＫＬ２０００ソフトウェアを使用して比較した。プログラムＸ−ＰＬＯＲにおける分子置換により構造を決定した。初期分子置換溶液を、ＣＮＸ中の分子動力学精製、及びプログラムＷｉｎＣｏｏｔによる再構築に複数ラウンド供した。
高解像度２．０８Ａ結晶構造に基いて、１Ａ１１Ｈ３Ｌ４がＩＬ−７Ｒの細胞外のループのうちの４つでＩＬ７受容体に結合し、それによって、ＩＬ７リガンド結合をブロックすると予測される：
ループ２：５５Ｇｌｙ ５６Ａｌａ ５７Ｌｅｕ ５８Ｖａｌ ５９Ｇｌｕ ６０Ｖａｌ ６１Ｌｙｓ
ループ３：８０Ｌｅｕ ８１Ｌｅｕ ８２Ｉｌｅ ８３Ｇｌｙ ８４Ｌｙｓ １００Ｌｙｓ
ループ４：１３８Ｌｙｓ １３９Ｔｙｒ １４２Ｖａｌ
ループ５：１９２Ｔｙｒ １９３Ｐｈｅ。
これら所見は、１Ａ１１と６Ａ３との間で観察された、ｈＩＬ７について観察された競合と一致している。
４．５ エフェクター機能の分析
４．５．１ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４は補体媒介性細胞傷害を欠く
合計６つの別々の実験により、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４（野性型）が測定可能な補体媒介性細胞傷害を有しないことが示された。標的として用いられるｈＩＬ−７ｒ ＢａｃＭａｍが形質導入されたＨＥＫ ２９３ ＭＳＲ ＩＩ細胞株でこれら実験を実施した。Ｔ１７５培養フラスコにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で約２１時間これら細胞に形質導入した（ｍｏｉ ７５）。次いで、ＴｒｙｐＬＥを使用して、フラスコから付着細胞を除去し、数回洗浄した後、１×１０５細胞／５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした。３７℃、５％ＣＯ２で３０分間かけて２５μＬの抗体を添加した。このインキュベート後、ウサギ補体２０μＬを添加し、次いで、プレートを２時間インキュベータに戻した。多重チャネルのピペットを使用して穏やかに混合しながら、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを添加することにより、細胞の生存率の評価を行った。次いで、Ｖｉｃｔｏｒ Ｖプレートリーダでプレートの蛍光シグナルを読み取った（生細胞はシグナルを増加させる）。図１にこれら実験のうちの１例を示す。
上記実験において使用されるポジティブコントロール抗体（Ｇｒｉｔｓ３２０９２）は、ｈＩＬ−７Ｒαを発現していた標的細胞と同じ細胞において共発現していたＨＥＲ３についての細胞表面受容体に対して特異的であった。この制御抗体を、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４と同濃度で用い（１０μｇ／ｍＬ）、同じ２つの供給元（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウサギ補体と組み合わせた。これら結果は、アッセイにおいて使用された標的細胞及び補体の両方が補体依存細胞傷害を誘導できることを示した。
４．５．２ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させた。
ＡＤＣＣアッセイにおけるエフェクター細胞として、７人のヒトドナー由来の精製末梢血単核細胞を解析した。標的細胞として用いられるｈＩＬ−７ｒ ＢａｃＭａｍが形質導入されたＨＥＫ ２９３ ＭＳＲ ＩＩ細胞株でこれら実験を実施した。Ｔ１７５培養フラスコにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で約２１時間これら細胞を形質導入した（ｍｏｉ ７５）。次いで、Ｔｒｙｐｌｅを使用してフラスコからこれら付着細胞を除去し、数回洗浄した後、ユーロビウムを「ロード」した。これらロードされた細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、抗−ＩＬ−７Ｒ抗体を含有する９６ウェルプレート（２×１０４細胞／２５μＬ／ウェル）に組合せた。インキュベート後、２００、１００、５０及び２５：１の比率でエフェクター細胞を添加し（１００μＬ／ウェル）、３７℃、５％ＣＯ２に２時間戻した。このインキュベート後、２５μＬの上清を除去し、１００μＬ／ウェルのＤｅｌｆｉａ増強溶液を含有する９６ウェルプレートに添加した。次いで、室温のプレートシェーカーで５分間プレートをインキュベートし、次いで、Ｖｉｃｔｏｒ Ｖプレートリーダで読み取った。溶解細胞により周囲の上清に放出された任意のユーロビウム（細胞の細胞傷害）を蛍光単位として測定した。
これらアッセイにより、「野生型」１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及びＦｃ不能分子１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ＦｃがＦｃ受容体を介してヒトエフェクター細胞に結合し、ＩＬ−７受容体陽性標的細胞を殺傷する能力と比較した。これら実験の結果は、全体的に、Ｆｃ不能分子１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃが、「野生型」１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４よりも抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を開始させる能力が少なくとも２倍低いことを示した。また、これら結果は、７人ドナーのうちの６人のドナーにおいて、不能抗体がＡＤＣＣ活性をある程度誘導できることを示した（１人のドナーは、野生型及び不能の１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の両方で僅かな活性しか示さなかった）を誘導することができたことを示した。結果を図２に示す。
４．５．３ Ｆｃ受容体結合
複数のＦｃエフェクター受容体（ＦｃガンマＩ、ＩＩａ及びＩＩＩａ）及び多数の種のＦｃＲｎに結合する能力について１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及び１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃを評価し、対照の野生型及びＦｃ機能不全抗体と比較した。ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６表面プラズモン共鳴装置（ＢｉｏＲａｄ）でこの実験を行った。一級アミンカップリングにより、試験される抗体をＧＬＭバイオセンサーチップにカップリングした。ランニングバッファとしてＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．４）を使用し、アナライトとして２０４８ｎＭ、５１２ｎＭ、１２８ｎＭ、３２ｎＭ及び８ｎＭの様々なＦｃγ受容体を使用した。ＦｃＲｎ受容体の結合については、アナライトとして２０４８ｎＭ、５１２ｎＭ、１２８ｎＭ、３２ｎＭ及び８ｎＭのヒト、カニクイザル、マウス及びラットのＦｃＲｎを使用し、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でランを実行した。０ｎＭ注入（すなわちバッファのみ）で全ての結合センサグラムをダブルレファレンスした。ＰｒｏｔｅＯｎ解析ソフトウェアに固有の平衡モデルにデータを適合させた。
表１１は、この研究で評価した様々なＦｃ受容体に対する抗体結合について得られた親和性を示し、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及び１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃがこれらの対照抗体相当物と同様に挙動したことを示す。不能Ｆｃ抗体（１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４Ｆｃ）は、Ｆｃγ受容体に結合しないか又は結合が非常に少なかったので、正確な分析を実施することができなかった。ＦｃＲｎ結合についてのデータは、Ｆｃ不能及びＦｃ野性型が、試験した全ての種に対して同様の親和性を有することを示した。表中のデータはｐＨ６．０におけるアッセイのデータであり、ｐＨ７．４では予想通り結合しないか又は結合が非常に少なかった。
Figure 0005850860

４．６ インビトロにおける効力アッセイ
４．６．１ ＩＬ−７に刺激されるＳＴＡＴ５リン酸化の１Ａ１１及び１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４による阻害
ＩＬ−７Ｒαに対する機能的抗体をスクリーニングするために、ＩＬ−７で刺激する前に３０分間、ハイブリドーマ培養培地、ポジティブコントロール抗体又は試験する上清サンプルをＰＢＭＣ細胞と共にインキュベートした。未処理細胞をバックグラウンドシグナルとして分析し、一方、ＩＬ−７処理細胞をネガディブコントロールとして設定した。対照又は試験サンプルと共に３０分間インキュベートした後、３７℃にて１５分間ＩＬ−７で細胞を刺激した。次いで、３７℃で１０分間、１．６％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで細胞を固定し、２０〜３０分間１００％メタノールで透過性処理した。次いで、細胞を染色バッファ（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ−６４７で標識されている抗ｐＳｔａｔ５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ ＃６１２５９９）で１時間染色した。ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ ＦＡＣＳ機器でサンプルを分析した。
親１Ａ１１モノクローナル抗体は、０．０８８μｇ／ｍＬのＩＣ５０でヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−７のＳＴＡＴ５リン酸化誘導をブロックする（データは示さない）。２つのヒトＩＬ−７濃度（０．１ｎｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬ）で２人のドナー由来のＰＢＭＣを使用して、同アッセイで１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４を試験した。１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４は、１Ａ１１と比較して非常に類似するＩＣ５０（平均＝０．０８７μｇ／ｍＬ）を示し、これは、抗体がＩＬ−７誘導性ｐＳＴＡＴ５を阻害する能力にヒト化プロセスが影響を与えないことを示す（図３Ａ及び３Ｂ）。
４．６．２ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４によるＩＬ−７誘導性ＩＬ−１７産生の阻害
Ｔｈ１７増殖を阻害する能力を決定するために以下のプロトコールに従って１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４をアッセイした。マニュアル（＃１３０−０９１−１５５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従ってＣＤ４＋細胞を単離した。１００μＬ中約１×１０６／ｍＬのＣＤ４＋細胞を等体積の２×濃度のＴｈ１７分化培地（２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γ＋１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−４＋１２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β＋２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２３＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。Ｔｈ１７培地中の様々なサイトカイン及び成長因子による処理は、優先的にＣＤ４＋細胞をＴｈ１７細胞に分化させた。ＢＤ ＦＡＣＳ ＳＯＲＰ Ａｒｉａ ＩＩを使用して、５日目の分化した培養細胞からＣＣＲ６＋細胞を選別した。次いで、ＩＬ−１７産生アッセイのためにＣＣＲ６＋細胞を２×１０６／ｍＬに調節した。
ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ量を測定するために、１００μＬのＣＣＲ６＋細胞を３７℃で１時間試験抗体と共にプレインキュベートし、次いで、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７ １００μＬと混合した。５％のＣＯ２を添加して３７℃で２４〜４０時間細胞を培養した。１００μＬの培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７量を、それぞれ２４時間及び４０時間ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）により測定した。
合計４つのヒトＣＤ４＋細胞サンプル中のＴｈ１７増殖アッセイにおいて１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４を試験した（図４Ａ〜Ｄ）。ヒト化抗体は、２つのサンプルではＩＬ−１７産生の有意な阻害を示し、他の２つのサンプルでは阻害の傾向を示した。このアッセイにおけるドナー間変動を考慮して、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４がＩＬ−７媒介性Ｔｈ１７細胞増殖をブロックできると結論付けた。
４．６．３ ＴＳＬＰシグナル伝達に対する効果
ＩＬ−７Ｒαサブユニットは、ＩＬ−７Ｒ及びＴＳＬＰ受容体複合体（ＴＳＬＰＲ）の両方で共有されている。ＴＳＬＰシグナル伝達に対する１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４の効果を、ヒト血中単球によるＴＡＲＣ産生のＴＳＬＰ誘導に基いてインビトロアッセイで試験した。市販の抗ＩＬ−７Ｒα抗体であるＲ３４．３４を、ＴＡＲＣのＴＳＬＰ誘導のブロッキングについてのポジティブコントロールとして使用した。更に、Ｆｃ不能ヒト化ＩｇＧ１（ＨｕＩｇＧ１；ＧＲＩＴＳ３９６３３）をネガディブコントロールとして使用した。５人のドナー由来の単球を使用し、１ｎｇ／ｍＬのＴＳＬＰを用い、０．００１〜３０μｇ／ｍＬの用量の１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４及びＨｕＩｇＧ１を使用し、０．４、２及び１０μｇ／ｍＬのＲ３４．３４を使用した。また、細胞計数により細胞生存を評価した。
１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４は、図５Ａ〜Ｅに示す通り、ＴＡＲＣのＴＳＬＰ誘導に影響を与えなかったが、同じ５人のドナーについて、Ｒ３４．３４はＴＡＲＣ産生を実質的に阻害した。ヒト化ネガディブコントロール抗体は、ＴＡＲＣ産生に効果を有していなかった。このデータセットは、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４がヒト単球におけるＴＳＬＰシグナル伝達を中和しないことを示す。したがって、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４は、ＩＬ−７Ｒを通じたＩＬ−７Ｒシグナル伝達の中和に対して特異的であり、ＴＳＬＰＲを通じたＴＳＬＰシグナル伝達には影響を与えないことが予測される。
４．７ ＩＬ７受容体阻害試験
表１２Ａは、ラン１で得られたＩＣ５０値を示す。この表は、全てのコンストラクトが親１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４分子について得られた最高の値よりも優れたＩＣ５０値を有し、且つ上位２分子がＢＰＣ４４０１（抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｆ１００ｂＨ）及びＢＰＣ４３９８（１Ａ１１ ＶＨ３ Ｎ９８Ｄ Ｌ４）であったことを示す。表１２Ｂは、ラン２で得られたＩＣ５０値を示す。これも、両方のコンストラクトＢＰＣ４４０１（抗ＩＬ７Ｒ １Ａ１１ Ｈ３Ｌ４ Ｆ１００ｂＨ）及びＢＰＣ４３９８（１Ａ１１ ＶＨ３ Ｎ９８Ｄ Ｌ４）が親１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４分子について得られた最高の値よりも優れたＩＣ５０値を有していたことを示す。ラン１及び２は、別々のＩＬ７Ｒ／ＣＭ５表面上で行った。
Figure 0005850860
Figure 0005850860

４．８ ＩＬ−７Ｒ多形結合アッセイ
ＩＬ−７Ｒは２つの多形相、すなわち変異体１：Ｔｈｒ６６−Ｉｌｅ１２８、変異体２：Ｉｌｅ６６−Ｔｈｒ１２８として存在する。両方の多形相に対する１Ａ１１Ｈ３Ｌ４の結合をアッセイした。一級アミンカップリングにより、約９０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでＣＭ５チップに抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＢＲ−１００８−３９）を固定化し、次いで、１Ａ１１Ｈ３Ｌ４をこの表面に捕捉し、結合曲線のダブルレファレンスのために用いた０ｎＭ注入（すなわち、バッファのみ）と共に、５１２ｎ、２５６ｎ、１２８ｎ、６４ｎｎＭ、３２ｎＭ、及び１６ｎＭのＩＬ７Ｒを通し、３ＭのＭｇＣ２を使用してこの表面を再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００解析ソフトウェアに固有の１：１モデルに結合データを適合させた。ランニングバッファとしてＨＢＳ−ＥＰを使用してランを実行し、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００において実行した。表１３に得られたデータを示す。この表は、１Ａ１１ Ｈ３Ｌ４が両方の多形変異体に対して同一又は類似する結合親和性を有する（すなわち、両方の多形に結合する）ことを示した。
Figure 0005850860

本明細書中では、本発明は、明確且つ簡潔に説明を記載することができるように、実施形態を参照して記載される。実施形態は、本発明から逸脱することなく様々に組合せたり分離させたりできることを意図しており、またそのように認識されるべきである。

Claims (12)

  1. 配列番号１３、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９又は１３１の重鎖可変領域と、配列番号２２の軽鎖可変領域を含んでなる抗ＣＤ１２７抗体。
  2. 配列番号１３の重鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
  3. 配列番号１１４又は配列番号１１８の重鎖を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
  4. 配列番号１２１又は配列番号１２３の重鎖可変領域を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
  5. 配列番号１１５の軽鎖を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸分子。
  7. 請求項６に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
  9. 請求項８に記載の宿主細胞により発現される抗体。
  10. 培地中で請求項８に記載の宿主細胞を培養して抗体を産生させる工程と、前記培地から前記抗体を単離又は精製する工程とを含んでなる、抗体を製造する方法。
  11. 請求項１〜５又は９のいずれか１項に記載の抗体と、薬学上許容される担体又は賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
  12. 請求項１〜５又は９のいずれか１項に記載の抗体を含んでなる、自己免疫疾患又は炎症性疾患に罹患している被験体の治療に使用するための医薬組成物。
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