DK149946B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af piperidin-derivater af 1,2- eller 1,3-(di-o-n-alkyl)propandiol eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

149946

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 1,2- eller l,3-(di-0-n- alkyl)-propandiol-derivater med den i krav 1 angivne almene formel X eller H eller farmaceutisk acceptable syre-5 additionssalte deraf, hvori R^ og R2 hver især betegner n-alkyl med 8-11 carbonatomer og Ph betegner phenyl, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at den tilsvarende forbindelse med formlen io f-\ /Ph ph CH--N X CH-N . )<Γ

I 2 \ / CN I \ / CN

R^O-CH >-' R20-CH2 '-' r2o-ch2

15 III eller IV

hvori R^, R2 og Ph har den ovenfor angivne betydning, reduceres, hvorefter den resulterende forbindelse med formlen I eller II om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

20 De omhandlede forbindelser er anvendelige som ikke-specifikke stimulanter af af celler fremkaldt immunitet hos varmblodede dyr. Specielt har de vist sig at være anvendelige til stimulering af antitumor-aktivitet, især når de anvendes i forbindelse med sædvanlig cytore-25 duktiv terapi. Forbindelserne er også anvendelige som vaccine-hjælpestoffer, dvs. de er anvendelige sammen med kendte immunologiske stoffer med henblik på at fremkalde eller forøge den immunogene reaktion på de sidstnævnte.

Det er kendt, at biologiske vacciner, såsom Cory-30 nebacterium parvum og BCG, en levedygtig stamme af Mycobacterium bovis, og syntetisk levamisol kan anvendes som immun-stimulanter af det reticuloendoteliale system og er i stand til at forøge varmblodede dyrs modstandsdygtighed mod tumorer. Imidlertid har anvendelsen af disse 35 midler været begrænset på grund af hepatisk og renal to-xicitet, granuloma-dannelse, neutropeni og upålidelige terapeutiske virkninger. Det vil således være af fortsat 2 149946 interesse at udvikle ikke-biologiske systemisk aktive immun-stimulanter. Det vil endvidere være af interesse at udvikle forbindelser, der er anvendelige som vaccinehjælpestoffer for at fremkalde eller forøge virkningerne 5 af sædvanlige vacciner. Stimulering af af celler fremkaldt immunitet og antitumor-aktivitet er omhandlet i Herberman, Adv. Cancer Res., 19, 207 (1971), Jordan og Merigan, Ann. Rev. Pharmacol., 1^5, 157 (1975), Levy og Wheelock, adv. Cancer Res., 20, 131 (1972) og Sinkovics, 10 Post Graduate Medicine, 59, 110 (1976).

USA-patent nr. 2.738.351 omhandler forbindelserne med den almene formel R, -X-CH- 1 i 2

CH-Z-ALK-B

15 R2-Y-Ah2 hvori R1 og R2 hver især kan betegne alkyl, usubstitue- ret eller substitueret aryl eller aralkyl, X, Y og Z hver især kan betegne oxygen, svovl eller sulfonyl, hvor ALK betegner ligekædet eller forgrenet alkylen med 1-6 20 carbonatomer, og B kan betegne di(lavere)-alkylamino , piperidino , morpholino , pyrrolidino , lavere alkyl-pyrrolidino , N1-alkyl-piperazino eller pipecolino , som lokal anestetiske midler. I omtalen af forskellige synteseveje beskrives i nævnte patentskrift irellenprodukter 25 med den ovennævnte formel, hvori B betegner amino eller lavere alkylamino. Imidlertid indeholder ingen af de forbindelser, som specielt er omtalt i den nævnte patentbeskrivelse, for eller R2 en alkyl-gruppe, der er større end n-pentyl. I ingen af disse forbindelser 30 betegner både R^ og R2 alkyl, og hverken X eller Y betegner oxygen.

Insecticide og miticide forbindelser med formlen R.-CH„ 1 I 2

CH-(CEL·) -A

35 I 2 q R2-ch2 hvori R^ og R2 blandt andet kan betegne lavere alkyl-thio; q er 0 til 5, og A blandt andet kan betegne 1-pi- 3 149946 peridino eller di-lavere alkylamino, er omtalt i japansk patent J7-6042-177.

I USA-patentskrift 4 166 132 oxnhandles blandt andet forbindelser med formlen 5 r1-o-ch2 V0-™ / \ CH2HH2 -2—\_J< m 10 hvori R^ og R2 hver især betegner n-alkyl med 12-20 carbonatomer. Disse forbindelser angives at være anvendelige som antivirale midler.

Af de omhandlede forbindelser med formel I eller 15 II foretrækkes de, hvori R^ og R2 begge betegner n-decyl.

Mest foretrukkket inden for denne gruppe er forbindelser med formlen I.

De i betragtning kommende 1,2-(di-O-n-alkyl)-propandiol-udgangsmaterialer kan fremstilles som be-20 skrevet af Kates et al., Biochemistry, 2, 394 (1963).

1,3-(di-O-n-alkyl)propandioludgangsmaterialerne kan fremstilles som beskrevet af Damico et. al., J. Lipid Res., 8, 63 (1967).

Forbindelser med formlen III eller IV kan frem-25 stilles ud fra passende 1,2- og 1,3-(di-O-n-alkyl)-propandio ler, f.eks. ved at man først fremstiller tosyl-derivatet af udgangsmaterialet ved omsætning med p-toluensulfonylchlorid og pyridin i et indifferent opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid, ved en temperatur 30 på fra ca. -10°C til 40°C, fortrinsvis fra ca. 10 til 20°C. Tosyl-derivatet omsættes derefter med 4-cyano- 4-phenyl-piperidin ved opvarmning af reaktanterne sammen ved ca. 75°C-250°C. Dette udføres hensigtsmæssigt uden tilsætning at et opløsningsmiddel, men hvis det ønskes, 35 kan man anvende et indifferent opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid.

Den resulterende nitril med formlen III eller IV reduceres derefter ifølge opfindelsen til den ønskede 149946 4 amin, f.eks. ved anvendelse af Raney-nikkel og hydrogen. Farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af de som ©venfor beskrevet fremstillede aminer, fremstilles ved sædvanlige fremgangsmåder, såsom ved blanding af 5 amin og syre i et indifferent opløsningsmiddel og udvinding af saltet ved afdampning af opløsningsmidlet eller ved udfældning. Hydrochloridsalte fremstilles nemt ved at lede gasformigt hydrogenchlorid gennem en opløsning af aminen i et indifferent opløsningsmiddel. De på denne 10 måde opnåede hydrochlorid- eller dihydrochlorid-salte har tendens til at indeholde krystalvand eller indesluttet vand. Dette er ikke en væsentlig ulempe ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og sådanne forbindelser kan anvendes i præparater og indgives uden yderligere 15 dehydratisering. Patentkravene og beskrivelsen omfatter således både de hydratiserede og uhydratiserede forbindelser. Egnede farmaceutisk acceptable syresalte omfatter vandopløselige og vanduopløselige salte, såsom hydrochlorid, hydrobromid, phosphat, nitrat, sulfat, ace-20 tat, hexafluorophosphat, citrat, gluconat, benzoat, pro-pionat, butyrat, sulfosalicylat, maleat, laurat, malat, furnerat, succinat, oxalat, tartrat, amsonat (d.v.s. 4,4'-diamino-stylbin-2,2'-disulfonat), pamoat (d.v.s. 1,1'-methylen-bis-2-hy3'roxy-3-naphthoat), stearat, 3-hydroxy-25 2-naphthoat, p-toluensulfonat, methansulfonat, lactat og suramin-salte.

Forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen med formlerne I og II har vist sig at være anvendelige som midler til ikke-specifik stimulering af af 30 celler fremkaldt immunitet hos varmblodede dyr, og specielt anvendelige til stimulering af det reticulo-endotheliale system. De ovenfor beskrevne forbindelser kan indgives til et varmblodet dyr ad forskellige sædvanlige veje, fortrinsvis intravenøst eller intraperitonealt, og doser på fra ca.

35 o,5 til 5 mg/kg legemsvægt af individet, som skal behand les, har vist sig at være egnet, når indgivelsen sker ad disse veje. Imidlertid kan lægen bestemme den dosis, som 5 149946 er mest egnet for den enkelte patient, hvilken dosis er afhængig af individet, som skal behandles, og hvilken speciel forbindelse, der anvendes. Sædvanligvis indgives først små doser, og disse kan forøges gradvis til be-5 stemmelse af den optimale dosis for det enkelte individ. Individets evne til opnåelse af immunitet måles sædvanligvis efter indgivelse ved sædvanlige fremgangsmåder, såsom de nedenfor beskrevne monocyt-aktiverings- og machrophag-aktiverings-forsøg. Typisk kan en maximal ak-10 tivering konstateres ca. 24-48 timer efter den første indgivelse, og undladelse af indgivelse af yderligere doser vil sænke denne til startniveauet i løbet af yderligere 24-48 timer. Indgift af en yderligere dosis ca.

24-72 timer efter den første indgift vil således opret-15 holde det ønskede niveau af evne til opnåelse af immunitet. Sædvanligvis indgives 2 til 4 doser på denne måde, og individets reaktion på behandlingen bestemmes. Yderligere doser kan derefter indgives, hvis det er nødvendigt, som beskrevet ovenfor.

20 Forbindelserne kan anvendes i farmaceutiske præ parater indeholdende en forbindelse eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, sammen med et farmaceutisk aktivt bærestof eller fortyndingsmiddel. En specielt foretrukket type farmaceutiske bærestoffer til dette for-25 mål er sterilt fedt eller et fedtemulsionsbærestof. Den sidstnævnte type bærestof har vist sig at være særligt egnet til parenteral og intravenøs indgift, idet det forøger det terapeutiske index til ca. 15-25, hvorimod der med Tween 80-glycerol-vand-præparater fås et terapeutisk 30 index på ca. 3 ved foreløbige forsøg med mus og rotter med de lavere alkylethere ifølge opfindelsen, f.eks. 4-aminomethyl-1-[2,3-di-n-octyloxy)-n-propyl]-4-phenylpi-peridin. Sådanne fordele er omtalt for andre forbindelser, der er anvendt sammen med sådanne fedtemulsionsbæ-35 restoffer, se for.eks. Fortner et. al., American Journal of Hospital Pharmacy, 32, 502 (1975) og Jeppsson et.al.,

First International Conference on Pharmaceutical technology, Faculty of Pharmacy, Paris-Sud, June 1977. Et eks- 6 149946 empel på et specielt egnet bærestof er intralipid (Cutter Laboratories, Berkely, California), en 10% fedtemul-sion, baseret på sojaolie. Imidlertid kan andre lignende bærestoffer være egnede, og de kan nemt fremstilles af 5 en fagmand.

De omhandlede forbindelser med formlerne I og II er også anvendelige som vaccinehjælpestoffer, og kan anvendes til dette formål og indgives på samme måde som kendte hjælpestoffer, se for eksempel "Immunological 10 Adjuvants", Wofld Health Organization Technical Report Series, No. 595. For eksempel er forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendelige sammen med vacciner mod influenza, mund- og klovsyge og difteritis. Forbindelserne kan inkorporeres i vacci-15 ne i mængde på fra ca. 1 til 20 mg pr. vaccinedosis, fortrinsvis i et farmaceutisk acceptabelt bærestof, såsom et fedtstof eller en fedtemulsion eller glycerol. Vaccinen og hjælpestof indgives derefter til individet ved en fremgangsmåde, der er sædvanlig for den specielle vaccine, sædvanligvis 20 som en enkelt dosis subcutant eller intramuskulært. Alternativt kan hjælpestoffet indgives uafhængigt af vaccinen, enten samtidigt med denne eller fortrinsvis ca.

8-24 timer før denne.

Den immun - stimulerende virkning og antitumor-25 virkning af de omhandlede forbindelser kan bestemmes ved farmakologiske forsøg. Egnede forsøg omfatter sådanne til bestemmelse af peritoneal macrophag-aktivering, tumor-afstødning (sarcoma 180J model), forsinket cutan-hypersensitivitet og periferisk monocyt-aktivering. Så-30 danne forsøg, samt de resultater, der herved er opnået for de omhandlede forbindelser, er nærmere be skrevet nedenfor. Endvidere er beskrevet egnede forsøg til vurdering af aktiviteten som vaccine-hjælpestof.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de føl-35 gende eksempler. Alle temperaturer er i °C.

f49946 7

Eksempel 1 (udgangsforbindelse) 4-Cyano-l-[2,3-(di-n-decyloxy)-n-propyl]-4-phenyl-pipe-ridin.

5 20 g (0,0189 mol) 1,2-(Di-O-n-decyl)-3-0-(p-tosyl) -glycerol, fremstillet ud fra l,2-di-0-(n-decyl)-glyce-rol-chlorid, og 4,5 g (0,024 mol) 4-cyano-4-phenylpipe-ridin blev sammenført og opvarmet til 180°C i 20 minutter. 50 ml vand og 100 ml ether blev sat til det afkøle-10 de produkt. Etherlaget blev isoleret og vasket med 2 x 100 ml mættet natriumbicarbonatopløsning, 100 1 IN saltsyre, 2 x 100 ml vand, 100 ml mættet natriumbicarbonat og 100 ml vandi Etheropløsningen blev derefter tørret over magnesiumsulfat, behandlet med aktivt kul, filtre-15 ret og koncentreret til 10 g olie. Olien blev absorberet på silicagel, som derefter blev vasket med 3 x 200 ml hexan, 3 x 200 ml toluen, 3 x 200 ml chloroform og 3 x 200 ml ethylacetat. Ethylacetaten blev koncentreret, hvorved der opnåedes den rene cyano-forbindelse i form 20 af en olie.

IR(ren) 2220 cm-1.

Eksempel 2 4-Aminomethyl-l-[2,3-(di-n-decyloxy)-n-propyl]-4-phenyl-25 piperidin.

1,2 g (0,0022 mol) af den ifølge eksempel 1 fremstillede nitril blev opløst i 50 ml ethanol, og opløsningen blev mættet med gasformig ammoniak. Hydrogenering heraf blev derefter udført ved et tryk på 50 p.s.i. i 3 30timer ved anvendelse af 0,7 g Raney-nikkel som katalysator. Efter afslutning af reduktionen blev blandingen filtreret, og filtratet blev koncentreret under reduceret tryk til 1,1 g olie. Denne blev chromatograferet på silicagel elueret med benzen/ethanol, omdannet til hydro-35chloridsaltet og omkrystalliseret fra ethylacetat til opnåelse af 0,32 g rent hydrochlorid (24% udbytte). Smp.: 138-140°C.

8 149946

Analyse:

Beregnet for: C35H64N2°2'2HC·*·'2/4 H20: C 66,59, H 10,78 N 4,44. Fundet: C 66,46 H 10,56 N 4,43.

^ Eksempel 3

Ved fremgangsmåderne ifølge eksempel 1-2 blev følgende forbindelser fremstillet: 10 ?H2 f* CH2 N\ /^-Ph OR2 OR^ λ-/ 15 Smp.°C Formel Beregnet % Fundet %

CnH. - 176-17.8 (d) C-.Ης,Ο,Ν, C 65,24 C 65,27 8 17 31 56 2 2 h 10,42 H 9,90 ,2HC1,1/2H20 N 4,90 N 4,95 20 / R1°“"H2 • / \__— ch9nh.

ch0-n z z I \ / -Ph r2o-ch2 \-f 25

RlR2 Smp. C Formel Beregnet % Fundet %

ClnH_. 190-192 C,,-H^.N^O«,2HC1 C 66,58 C 66,70 10 21 35 64 2 2>3/4H20 H 10,78 H 10,20 N 4,43 N 4,27 30

Forsøg med sarcoma 180J til undersøgelse af tumorafstødning.

Grupper med hver 6 hunmus CD-I (20-25 g) modtog 106 S-180J celler, som var 5-8 dage gamle, ved intraperi-35 toneal-administrering. Dagen efter tumor-innokulationen modtog musene 0,1 ml af prøve-forbindelsen, oparbejdet i fedtemulsions-bæreren "Intralipid" (Cutter Laboratories) 9 149946 i den ønskede dosis, og de blev derefter iagttaget, indtil de døde eller i 40 dage, hvis de ikke var døde i løbet af dette tidsrum. Resultaterne er udtrykt som forøget levetid i procent (%ILS), defineret på følgende måde: 5 g.-p.q _ Gennemsnitlig levetid for behandlede mus ,00

Gennemsnitlig levetid for ubehandlede kontrolmus

De ved ovennævnte forsøg opnåede resultater var følgende:

Tabel 1 10 R -0-CHo 1 I 2 R -O-CH ___ _ CH0NH0 2 i \ 2 2 CH - N ><^1 X5

R R MM

KlfK2 _dosis (mg/kg)_ 0,25 1 4 16 n-CgH17 113 109 154(1) 192(4) 20 n-C10H21 127 139(1) 110 108

Forsøg med peritoneal macrophag-aktivering.

Mus blev injiceret intraperitonealt med saltvand 25 eller med prøve-forbindelse. Macrophager blev udvundet 72 timer senere ved intraperitoneal injektion af 3 ml 8% kalvefoster-serum - 92% RPMI 1640 medium (RPMI er en forkortelse af Roswell Park Memorial Institute, mediet var leveret af Grand Island Biological Co., N.Y) 30 (1640^2 FCsg) Plus 5 enheder heparin pr. ml, idet temperaturen af hele mediet blev holdt på 37°C, og efter 1-2 minutters forløb blev musene åbnet, og al peritoneal-væske blev udtaget med en steril silicoli-seret pipette til et 50 ml plasticrør i is. Macropha-35 gerne blev talt ved anvendelse af et hemocytometer r og indstillet til en koncentration på 1,5*10 /ml med 164092FCSg. Cellerne blev derefter anbragt i en plade med mange fordybninger, 1,5*106 celler pr. fordyb- 149946 10 ning, og inkuberet i 1-2 timer ved 37°C i en 5% carbondioxid-a tmosfære. Den overstående væske blev fjernet, og cellerne blev vasket en gang med medium, idet macro-phagerne klæbede til bunden af fordybningerne. L 1210 cel-5 ler (opnået fra bughule af DBA-mus ca. 5 dage efter in-nokulation) i 1640^ FCSg blev derefter tilsat, 1 ml med 1*105 celler/ml til hver fordybning, og inkuberet ved 37°C i 24-30 timer i en 5% carbon-dioxid atmosfære. Cellerne blev derefter udsat for en pulserende bevægelse 3 10 med H-Tdr (1,0 Ci/ml; Amersham/

Searies) i 6 timer ved 37°C. (Forkortelsen ^H-Tdr be- 3 tegner tritireret thymidin. H er symbolet for den radioaktive hydrogen-3-isotop, tritium. Thymidin er en precursor for nucleinsyre, der metaboliseres af celler-15 ne og anvendelse af den pågældende forbindelse medfører, at cellerne optager radioaktiv isotop under dannelse af mærkede celler, der giver de scintillationstal, som anføres nedenfor. Ci er forkortelsen for Curie, enheden for radioaktivitet. Ci/ml er antallet af Curie 20 pr. ml). Den ovenstående væske blev fjernet ved hjælp af en cellehøster: Reeve-Angel-filter, og vasket fem gange med saltvand. Filterpladerne blev henstillet til tørring og anbragt i scintillationsflasker med LSC-scintilla-tionsvæske (5,0 g PPO (2,5-diphenyloxazol) og 0,2 g 25 POPOP (l,4-bis-2-(5-phenyloxazolyl)benzen)/liter toluen; Yorktown Research). Der blev talt i 2 minutter ved anvendelse af en Beekman LS-250-tæller. De ved denne fremgangsmåde opnåede resultater var følgende: 30 35 149946 11

Tabel 2 R-ι -0-CH„ I 2 r2-o-ch

I / V CH NH

5 CB;—HVJ><Cph2 % hæmning af R1R2 Dosis(mg/kg) DNAsyntese n—C1qH21 1,25 76 10 n-C10H21 0,625 94 n-C^QH21 0,313 56

Forsøg med perifer blod-monocyt-aktivering.

15 Rotter blev injiceret intravenøst med prøveforbin delsen, eller med saltvand for kontroldyrenes vedkommende. Monocyterne blev opnået 72 timer senere ved tapning af 2 ml blod til et EDTA rør og fortynding med 2 ml saltvand. Dette blev derefter omhyggeligt forsynet med lag 20 af 3 ml LSM (lymphocyt-adskillelsesmedium-bionetics) og centrifugeret 800 omgange pr.minut i 40 minutter ved stuetemperatur. Det uigennemsigtige centrale lag indeholdende monocyterne og lymphocyterne blev udtaget ved anvendelse af en pipette. Disse celler blev vasket to 25 gange med Hanks Balanced Salt Solution, resuspenderet i 1640^2 FCSø, aflejret i plader med mange fordybninger og inkuberet ved 37°C i 5% carbon-dioxid i 1,5 timer. Cellerne blev derefter vasket kraftigt med medium til fjernelse af celler, som ikke klæbede til fordybningerne. De 30 tilbageværende monocyter blev gentilført medium, og der blev tilsat L1210 celler i et Effector:Target forhold på 15:1. Som ved den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde blev cellerne udsat for en pulserende bevægelse med 3H-Tdr og talt ved hjælp af en scintillationstæller.

35 Ved denne fremgangsmåde resulterede 1,25 mg/kg 4- aminomethyl-1-[2,3-di-n-decyloxy)-n-propyl]-4-phenylpi-peridin i en 80% hæmning af DNA syntese.

12 149946

Forsøg med vaccine-hjaelpestof-egnethed og hemagglutina-tionshæmning.

Influenza-virus reagerer med røde blodlegemer, således at der bevirkes sammenklumpning. Hvis der er anti-5 virus-antistoffer til stede i en serumprøve, modvirkes reaktionen mellem virus og røde blodlegemer, som fører til sammenklumpning. Fravær af sammenklumpning af røde blodlegemer angiver således tilstedeværelse af anti-vi-rus-antistoffer, bestemmelse af hemagglutinationsværdien, 10 der er beskrevet i det følgende, giver et mål for antistofniveauet .

De ønskede doser af prøveforbindelserne oparbejdes ved fortynding i 0,3 ml ethanol, hvorefter der blev tilsat 0,1 ml "Tween 80", og den resulterende blanding blev 15 sat til 4,6 ml intralipid (Cutter Laboratories). Tilsvarende bærere uden prøveforbindelsen blev også fremstillet. Fluogen-influenzavirus (Parke-Davis & CO.) blev iblandet alle bærerne til opnåelse af 250 CCA antigen pr.

0,5 ml injektionsvolumen. (CCA er en forkortelse for 20 chick cell agglutinin (eller agglutination) titer.

Det pågældende udtryk er en angivelse af, hvormeget man kan fortynde kyllingeerythrocytter til opnåelse af agglutination). En gruppe Hartley hunmarsvin (Camm Laboratories) blev injiceret intramuskulært med 0,5 25 ml af bæreren indeholdende fluogen og prøveforbindelse.

En kontrolgruppe af marsvin blev injiceret med bæreren indeholdende fluogen, men ingen prøveforbindelse. Tredive dage efter den første sensitisering blev dyrene udsat for en yderligere intramuskulær injektion af det homolo-30 ge antigen, med hvilket de var blevet immuniseret. Dyrene blev afblødt ved intracardial punktur flere gange efter den første sensitisering. Serum blev isoleret ved anvendelse af CORVAC Integrated Serum Separator Tube (Corning Glass Works) og lagret ved -20°C, indtil det 35 blev filtreret ved hemagglutinationsforsøg.

Prøvesera, behandlet med 0,011 M kaliumiodat til fjernelse af ikke-specifikke serum-faktorer, som hæmmer 13 149946 agglutination, blev doseret i tofolds seriefortyndinger i volumener på 0,025 ml til mikrotiter-fordybninger (Linbro Scientific Company, New Haven, Conn., type IS-MRC-96) indeholdende 0,025 ml 0,01 M phosphat-pufferet 5 fysiologisk saltvand (i det følgende benævnt PBS) pH-værdi 7,2. Suspensionen af prøvevirus indeholdende 4 HA-enheder (HA er en forkortelse for homologt antigen) pr. 0,025 ml PBS blev sat til hver fordybning: celle-(kun PBS) og antigen-kontroller (PBS og virus-an-10 tigen) blev medtaget. Efter inkubering af pladerne ved stuetemperatur i 30 minutter blev der til hver fordybning sat 0,05 ml af med 0,5% saltvand vaskede kyllinge-erythrocyter (Flow Laboratories, Rockville, Md.). Inku-beringen fortsattes, indtil celle-kontrollen viste nor-15 mal afsætning. Periodat-behandlede sera fra normale marsvin blev medtaget for at fastslå niveuaet for den ikke-specifikke agglutinationshæmning, som var tilbage i de kaliumiodat behandlede prøvesera. Hemagglutinationshæm-ningsværdien blev defineret som den højeste fortynding 20 af serum, som fuldstændigt hæmmede hemagglutination, korrigeret for ikke-specifik hæmning.

Resultater opnået ved forsøg med 4-aminomethyl-l-[2,3-(di-n-decyloxy)-n-propyl]-4-phenylpiperidin er vist i tabel 3. De højere hemagglutinationsværdier, som blev 25 konstateret efter genpåvirkning i de dyr, til hvilke prøveforbindelsen blev administreret, viser forbindelsens aktivitet som hjælpemiddel.

Claims (3)

149946 Tabel 3 Antigen Hemagglutinationsværdi administreret dagx^ 15 303°^ 44 65 0 0 40 40 5 0 0 160 80 0 0 40 10 Fluogen 10 0 80 10 10 0 80 80 10 0 160 160 10 10 10 80 1280 10 10 640 2560 Fluogen og 4-amino- 10 40 640 1280 15 methyl-l-[2,3-(di-n- 0 10 640 1280 decyloxy)-n-propyl]- 0 20 640 160 4-phenylpiperidin 10 10 10 20 (5 mg) 0 10 40 10 10 10 10 10 20 10 0 10 10 0 0 - - x) Dag efter første sensitisering. xx) Genpåvirket 30 dage efter første sensitisering.

25 Ovennævnte resultater er de, der er konstateret for hvert dyr i de respektive grupper.

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 30 piperidin-derivater af 1,2- eller l,3-(di-0-n-alkyl) -propandiol med formlen /-V . Ph Rio-ch2 !-V . Ph 35 iH2~N\ T~\ R.O-CH \——/ CH2NH2 r o-CH, \ J CH2NH2 X I ^2 r20-ch2 1 eller II