DE60220155T2

DE60220155T2 - Verfahren zur herstellung von teig mit einem enzym

Info

Publication number: DE60220155T2
Application number: DE60220155T
Authority: DE
Inventors: Kirsten Bojsen; Charlotte Horsmans Poulsen; J Rn Borch S E
Original assignee: Danisco AS; Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2022-05-18
Also published as: EP1387616B1; CA2444960A1; DK1387616T3; WO2002094123A2; EP1387616A2; WO2002094123A3; JP2005508609A; BR0209154A; ATE362315T1; DE60220155D1; JP4309137B2; USRE43135E1; ES2284897T3; AU2002339115B2; CN1646022A; NZ528260A; MXPA03010511A; CA2444960C; CN100591212C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Teigherstellung und auf Mehlteig basierende Produkte und insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, die Verbesserung der Festigkeit und Bearbeitbarkeit von Teig und das Volumen, die Weichheit und Krumenstruktur von Brot und anderen gebackenen Produkten.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Zusatzstoffe werden innerhalb der Nahrungsmittelindustrie breit eingesetzt, um die Qualität des Nahrungsmittelprodukts zu verbessern. Einer der am häufigsten verwendeten Nahrungsmittelzusätze ist der Emulgator und insbesondere Monoglycerid.
Monoglycerid wurde ursprünglich als ein Gemisch von Mono-, Di-, und Triglyceriden hergestellt. Später wurde jedoch eine Technologie entwickelt, um hochgereinigtes Monoglycerid durch molekulare Destillation herzustellen. Monoglycerid wird traditionsgemäß durch eine Glycerolyse-Reaktion hergestellt, in der Triglycerid und Glycerin bei hohen Temperaturen über 200 °C unter Verwendung von alkalischen Katalysatoren zur Reaktion gebracht wurden.
Als eine Alternative zur Verwendung von alkalischen Katalysatoren und hohen Temperaturen wurden bei der Herstellung von Monoglyceriden viele Versuche gemacht, Enzyme, wie Lipasen, zu verwenden. In einem Rezensionsartikel erwähnt Bornscheuer (Enzyme and Microbial Technology 17:578-585, 1995) die enzymatische Glycerolyse von Triglyceriden in Gegenwart oder Abwesenheit von Lösungsmitteln und, dass Monoglycerid in einer festen Phase durch enzymatische Glycerolyse hergestellt werden kann.
Monoglycerid kann in vielen Anwendungen bei Nahrungsmitteln als Emulgator verwendet werden. In der Backindustrie wurde Monoglycerid verwendet, um die Weichheit von Brot durch Komplexbildung mit Stärke zu verbessern, und dadurch die Kristallisierung von Amylopectin und den Beginn des Austrocknens des Brots zu verzögern.
Lipasen (E.C. 3.1.1.3) wurden ebenfalls direkt bei der Brotherstellung verwendet. Zum Beispiel wird in EP 0 585 988 beansprucht, dass die Zugabe von Lipase zu Teig eine Verbesserung der Wirkung gegen das Austrocknen ergab. Es wird angenommen, dass eine Lipase, gewonnen von Rhizopus arrhizus, beim Zusetzen zu Teig die Qualität des entstandenen Brots verbessern kann, wenn es in Kombination mit Backfett/Fett verwendet wird. WO94/04035 führt aus, dass eine verbesserte Weichheit durch Zusetzen einer Lipase zum Teig, ohne Zugeben eines zusätzlichen Fetts/Öls zu dem Teig, erreicht werden kann. Castello, P. ESEGP 89-10. Dez. 1999, Helsinki, zeigt, dass exogene Lipasen das Brotvolumen modifizieren können. Somit wurde bekannt, dass Lipasen (E.C. 3.1.1.3), die Triacylglycerine hydrolysieren, für die Verwendung in der Backindustrie von Vorteil sind.
In WO 98/45453 wurde gezeigt, dass die Menge an Monoglycerid in Teigen, die mit Lipase behandelt wurden, nur sehr geringfügig ansteigt, da die zum Teig zugesetzte Lipase Monoglycerid leicht in Glycerin und freie Fettsäuren spaltet. Dies wird durch die Tatsache erklärt, dass Lipasen den Fettsäureanteil des Moleküls in der aktiven Stelle leicht erkennen, und, es werden, da sich Monoglyceride und Diglyceride eher an der Schnittstelle befinden, wo die Lipase aktiv ist, die Monoglyceride und Diglyceride während des Zugebens der Lipase zu einer Matrix, die Fett/Öl-Emulsionen enthält, leicht gespalten. Sogar in Hinblick auf 1,3-spezifische Lipasen, die die Fettsäuren eines Triglycerids nur an der 1- und 3-Stelle hydrolysieren, wobei 2-Monoglycerid als Reaktionsprodukt übrigbleibt, reagiert das entstandene 2-Monoglycerid leicht zu 1-Monoglycerid zurück, das durch 1,3-spezifische Lipasen hydrolysiert werden kann.
Während der enzymatischen Spaltung von Triglyceriden durch herkömmliche Lipasen werden Monoglyceride, Diglyceride, freie Fettsäuren und Glycerin gebildet.
Typischerweise beträgt die Zunahme der Monoglyceride in Teig, der mit einer oder mehreren Lipasen behandelt wurde, mit oder ohne zugesetztem Fett oder Öl, weniger als 0,1 % (ausgehend von dem Gewicht des Mehls). Die herkömmliche Dosierung an Monoglycerid, das in einem Teig benötigt wird, um zum Beispiel eine Verbesserung der Weichheit des erhaltenen Brots zu ergeben, beträgt typischerweise etwa 0,3-0,8 %, ausgehend von dem Gewicht des Mehls (Krog, N., Cereal Food World, 24, 10, 1979). Demnach ist jegliche vorteilhafte Wirkung des Zugebens herkömmlicher Lipasen zu Teig, wie in EP 0 585 988 und WO94/04035 angenommen, nicht nur ein Ergebnis eines erhöhten Monoglycerid-Gehalts allein.
Einige Lipasen sind, zusätzlich dazu, dass sie eine Triglycerid-spaltende Wirkung haben, in der Lage, polare Lipide wie Glycolipide, z.B. Digalactosyldiglycerid (DGDG) und Phospholipide (vgl. zum Beispiel WO01/39602 ) zu hydrolysieren.
Das Substrat für Lipasen in Weizenmehl sind 2-3 % endogenes Weizenlipide, die ein komplexes Gemisch aus polaren und unpolaren Lipiden sind. Die polaren Lipide können in Glycolipide und Phospholipide unterteilt werden. Diese Lipide sind aus Glycerin aufgebaut, das mit zwei Fettsäuren und einer polaren Gruppe verestert ist. Die polare Gruppe trägt zur Oberflächenaktivität dieser Lipide bei. Die enzymatische Spaltung einer der Fettsäuren in diesen Lipiden führt zu Lipiden mit viel höherer Oberflächenaktivität. Es ist wohlbekannt, dass Emulgatoren, wie DATEM, mit hoher Oberflächenaktivität sehr gut funktionieren, wenn sie Teig zugesetzt werden.
Es wurde jedoch festgestellt, dass die Verwendung von Lipasen (E.C. 3.1.1.3) in Teig unter bestimmten Bedingungen nachteilige Konsequenzen, wie die Herstellung von Fremdaroma, eine nachteilige Auswirkung auf die Hefeaktivität und/oder eine negative Wirkung auf das Brotvolumen haben kann. Die negative Wirkung auf das Brotvolumen wird häufig Überdosierung genannt. Überdosierung kann zu einer Abnahme der Gluten-Elastizität führen, was einen Teig ergibt, der zu fest ist und somit zu einem reduzierten Volumen führt. Zusätzlich, oder alternativ, können solche Lipasen dem Teig zugegebenes Backfett, Öl, oder Milchfett spalten.
WO 00/32758 beschreibt lipolytische Enzymvarianten.
GB 2 358 784A beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Teig, umfassend das Zusetzen von Enzym zum Teig, das in der Lage ist, ein unpolares Lipid, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren.
WO 02/00852 A2 beschreibt eine Gruppe von Enzymgenen, die lipolytische Enzyme mit hoher Homologie codieren, isoliert aus Stämmen von Fusarium und Acremonium.
WO 02/03805 A beschreibt die Zugabe einer Kombination aus zwei lipolytischen Enzymen mit verschiedenen Substratspezifitäten zu Teig.
WO 02/065854 A2 beschreibt die Behandlung der Rohmaterialien stärkehaltiger Nahrungsmittelprodukte wie Nudeln, gebratenen Produkten und Snack-Produkten mit einem lipolytischen Enzym.
WO 02/066622 A2 beschreibt neue, isolierte Gene mit hoher Homologie zu dem Thermomyces-lanuginosus-Lipasegen.
ZUSAMMENFASSUNG
Ein ertragreiches Ergebnis der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Verwendung eines Enzyms, das unter Teigbedingungen in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, das jedoch unfähig, beziehungsweise im Wesentlichen unfähig ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren, vorteilhaft ist, und das die Nachteile, die mit der Verwendung von Lipasen einhergehen (E.C. 3.1.1.3), die in der Lage sind, unpolare Lipide in einem Teig zu hydrolysieren, überwiegt.
AUSFÜHRLICHE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt nach einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines Mehlteigs zur Verfügung, wobei das Verfahren die Zugabe zu den Teigbestandteilen einer wirksamen Menge eines Enzyms umfasst, welches unter Teigbedingungen in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym jedoch nicht in der Lage ist, im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren, und unter Erhalt des Teigs die Teigbestandteile mischt.
Nach einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Teigs oder ein gebackenes Produkt, hergestellt aus einem Teig, zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) Testen wenigstens eines Enzyms hinsichtlich seiner hydrolytischen Aktivität gegenüber einem Triglycerid, einem 1-Monoglycerid, einem Phospholipid und einem Glycolipid,
(b) Auswählen eines Enzyms mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und ohne hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 und
(c) Zugeben des ausgewählten Enzyms zu dem Teig.

Die vorliegende Erfindung stellt nach einer dritten Ausführungsform eine teigverbessernde Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Enzyms umfasst, das eine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid hat und das keine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 hat und optional eine weiteren Teigbestandteil zur Verfügung.
Nach einer vierten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Teig zur Verfügung, der durch das erfindungsgemäße Verfahren zu erhalten ist.
Nach einer fünften Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Teig zur Verfügung, der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird.
Nach einer shsten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein gebackenes Produkt zur Verfügung, das durch Backen eines Teigs gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten ist.
Nach einer siebten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein gebackenes Produkt zur Verfügung, das durch Backen eines Teigs gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin, nach einer achten Ausführungsform, ein Nudelprodukt zu Verfügung, das aus einem Teig gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht ist.
Nach einer neunten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Pastaprodukt zu Verfügung, das aus einem Teig gemäß der vorliegenden Erfindung gemacht ist.
Nach einer zehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer teigverbessernden Zusammensetzung zur Verfügung, wobei eine wirksame Menge eines Enzyms, das eine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid hat, und das keine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 hat, optional mit einem weiteren Teigbestandteil vermischt wird.
Nach einer elften Ausführungsform kann ein Verfahren zum Auswählen eines Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte umfassen:

(a) Testen wenigstens eines Enzyms hinsichtlich seiner hydrolytischen Aktivität gegenüber einem Triglycerid, einem 1-Monoglycerid, einem Phospholipid und einem Glycolipid,
(b) Auswählen eines Enzyms mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und ohne hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5.

Die vorliegende Erfindung stellt nach einer zwölften Ausführungsform davon ein Verfahren zur Herstellung oder Entwicklung eines Enzyms mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und ohne hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zur Verfügung, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Auswählen einer Lipase mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid,
(b) Modifizieren wenigstens einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz durch Insertion, Deletion oder Substitution, typischerweise nahe oder in der aktiven Stelle, um die Aktivität der Lipase in solch einer Weise zu verändern, dass die Lipase so modifiziert wird, dass sie keine, oder im Wesentlichen keine Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid aufweist.

Nach einer dreizehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines Enzyms zur Verfügung, das bei der Herstellung eines Teigs in der Lage ist, unter Teigbedingungen, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, um im Vergleich mit einem Teig ohne das Enzym einen Teig mit erhöhtem Brotvolumen und/oder erhöhter Glutenstärke zur Verfügung zu stellen.
Nach einer vierzehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entfernen polarer Lipide von einem Speiseöl zur Verfügung, wobei das Verfahren das Zugeben einer wirksamen Menge eines Enzyms, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, zu einem Speiseöl umfasst.
Nach einer fünfzehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Speiseöl, wie Soja- oder Rapsöl, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist oder erhalten wird, zur Verfügung.
Nach einer shszehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Protein zur Verfügung, das unter Teigbedingungen eine oder mehr der folgenden Eigenschaften hat:

i) es ist in der Lage, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren;
ii) es hat bei der Bestimmung durch SDS-PAGE-Analyse ein Molekulargewicht von 57 und/oder etwa 87 kDa;

Nach einer siebzehnten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mehlteigs zur Verfügung, wobei das Verfahren das Zugeben eines Enzyms zu den Teigbestandteilen umfasst, das die in SEQ ID Nr. 12 gezeigte Aminosäuresequenz, oder eine Variante, Homolog oder ein Derivat davon umfasst, und Vermischen der Teigbestandteile zum Erhalten des Teigs zur Verfügung.
Um die Bezugnahme zu erleichtern, werden diese und weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften erörtert. Die Ausführungen unter dem jeweiligen Abschnitt sind jedoch nicht notwendigerweise auf den jeweiligen Abschnitt beschränkt.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Vorzugsweise ist das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, eine lipolytische Acyl-Hydrolase (LAH) (E.C. 3.1.1.26).
Es ist zu bemerken, dass sich das Enzym Nummer E.C. 3.1.1.26, gemäß den Empfehlungen der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) für Enzymnomenklatur (1992), auf eine „Galactolipase" bezieht, die ebenfalls auf 2,3-Di-O-α-D-galaktosyl-β-D-galaktosyl)-D-Glycerin und Phosphatidylcholin und andere Phospholipide wirkt. In der Literatur (wie zum Beispiel Biochemica et Biophysica Acta 1215 (1994), 66-73) wurden Enzyme, die unter die Enzymnummer E.C. 3.1.1.26 fallen, als lipolytische Acylhydrolase n (LAHs) und mit anderen ähnlichen Namen bezeichnet. Die Begriffe Galactolipase und lipolytische Acylhydrolase (LAH), wie hierin verwendet, werden als Synonyme für dasselbe Enzym betrachtet, d.h., eines, das unter die E.C.-Klassifikation 3.1.1.26 fällt, und das sowohl eine Aktivität auf Galactolipide als auch auf Phospholipide hat.
Vorzugsweise wird das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, aus löslichem Augenbohnen-Blattextrakt isoliert und/oder es wird aus Weizenblatt-Thylakoiden isoliert.
Geeigneterweise kann das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, die Aminosäuresequenz enthalten, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, oder es kann eine Variante, Homolog oder ein Derivat davon sein.
Geeigneterweise kann das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, die Aminosäuresequenz enthalten, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, oder es kann eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens zu 75 %, stärker bevorzugt mindestens zu 85 %, stärker bevorzugt mindestens zu 90 % zu SEQ ID Nr. 1 homolog ist.
Geeigneterweise kann das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, von der Nucleotidsequenz codiert werden, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, oder sie kann eine Variante, ein Homolog oder ein Derivat davon sein.
Geeigneterweise kann das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, von der Nucleotidsequenz codiert werden, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, oder sie kann von einer Nucleotidsequenz codiert werden, die mindestens zu 75 %, stärker bevorzugt mindestens zu 85 %, stärker bevorzugt mindestens zu 90 % homolog zur SEQ ID Nr. 2 ist.
Geeigneterweise kann das Enzym, das in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, ein Protein sein, das bei Bestimmung durch SDS-PAGE-Analyse ein Molekulargewicht von etwa 57 kDa und/oder etwa 87 kDa hat, und das von Vigna unguiculata gewonnen werden kann.
Vorzugsweise wird das Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 57 und/oder etwa 87 kDa aufweist, unter Verwendung desselben Verfahrens, wie hierin detailliert beschrieben wird, isoliert.
Der Begriff „ein Enzym, das unter Teigbedingungen in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren", umfasst ein Enzym, das unter Teigbedingungen ein Glycolipid und ein Phospholipid hydrolysiert, das jedoch im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 kein Triglycerid und/oder 1-Monoglycerid hydrolysiert.
Für einige Ausführungsformen kann das Enzym in Form einer Zusammensetzung, die das Enzym enthält, zugegeben werden.
Eine wirksame Menge des Enzyms sollte zugegeben werden, so dass das Enzym unter Teigbedingungen oder unter degummierenden Bedingungen in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, und nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren. Alternativ, oder zusätzlich kann dem Teig eine wirksame Menge einer Zusammensetzung, die das Enzym enthält, entweder direkt zu einem vermischten Teig, oder als Bestandteil von einem oder mehreren Teigbestandteil/en zugegeben werden.
Der Begriff „wirksame Menge" bedeutet hierin eine Menge des zugegebenen Enzyms, die ausreicht, um unter Teigbedingungen, oder unter degummierenden Bedingungen, eine nachweisbare Hydrolyse von einem oder mehreren Glycolipiden und einem oder mehreren Phospholipiden, die in dem Teig vorliegen, zu bewirken, wohingegen das zugegebene Enzym die Triglycerid- und/oder 1-Monoglyceridmengen nicht signifikant beeinträchtigt. Genauer kann der Begriff eine Menge des zugegebenen Enzyms betreffen, das nicht nur zu einer nachweisbaren Hydrolyse eines Glycolipids und eines Phospholipids führt, während es die Menge an Triglyceriden und/oder 1-Monoglyceriden nicht beeinträchtigt, sondern das zusätzlich durch Hydrolyse von Glycolipiden und Phospholipiden im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zur Bildung enzymatischer Endprodukte führt, beziehungsweise durch die fehlende Wirkung auf Triglyceride und/oder 1-Monoglyceride zum Fehlen der Bildung von enzymatischen Endprodukten führt, in einer Menge, die zu verbesserten Eigenschaften des Teigs, oder, wenn der Teig gebacken wird, zu einer verbesserten Qualität des gebackenen Produkts, wie erhöhtem Brotvolumen, erhöhter Weichheit oder verbesserter Krumenstruktur, oder der Entfernung polarer Lipide aus einem Speiseöl, führt.
Vorteilhafterweise ist nur eines von dem Triglycerid, dem 1-Monoglycerid, dem Glycolipid und dem Phospholipid in dem Teig ein natürlich vorkommender Lipid-Bestandteil, der in Mehl, das für den Teig verwendet wird, vorkommt.
Geeigneterweise ist das Phospholipid Phosphatidylcholin (PC), und/oder das Glycolipid ist Digalactosyldiglycerid (DGDG).
Wenn es der Fall ist, dass ein polares Lipid zugegeben wird, sollte das polare Lipid geeigneterweise ein Phospholipid sein, wie zum Beispiel eines oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphotidylinositol (PI), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE).
Vorzugsweise ist der Teig ein Hefeteig. Obwohl bevorzugt wird, für die Herstellung von Hefebrot-Produkten, wie Brotlaibe, Brötchen oder Toastbrot, das erfindungsgemäße Verfahren anzuwenden, wird die Verwendung des Verfahrens für jeden anderen Teigtyp und für auf Teig basierende Produkte wie Nudel- und Pastaprodukte und Kuchen, deren Qualität durch Zugeben des erfindungsgemäßen Enzyms verbessert werden kann, ebenfalls in Betracht gezogen.
Vorzugsweise wird das Enzym in einer Menge zugegeben, die im Bereich von 0,1 bis 1000 Einheiten Enzym/kg Mehl liegt. Stärker bevorzugt wird das Enzym in einer Menge zugegeben, die im Bereich von 1 bis 100 Einheiten Enzym/kg Mehl liegt.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren, wenn der Teig ein Brotteig ist, als weiteren Schritt, dass der Teig gebacken wird, um ein gebackenes Produkt zu erhalten. Eine besonders erwünschte Eigenschaft von gebackenen Brotprodukten ist ein hohes spezifisches Volumen, wie in den Beispielen definiert. Dementsprechend ergibt die Zugabe des Enzyms der Erfindung vorzugsweise eine Zunahme des spezifischen Volumens des gebackenen Produkts, die bei mindestens 10 % im Vergleich zu einem gebackenen Produkt liegt, das unter identischen Bedingungen hergestellt wurde, mit der Ausnahme, dass das Enzym nicht zugegeben wird. Stärker bevorzugt liegt die Zunahme des spezifischen Volumens bei mindestens 20 %, wie etwa mindestens 30 %, zum Beispiel mindestens 40 %. Alternativ ist der Teig ein Teig, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Pastateig, einem Nudelteig, oder einem Kuchenteig oder Backteig.
Vorzugsweise wird das Enzym in einer Menge zugegeben, die zu einer Steigerung des spezifischen Volumens des gebackenen Produkts von mindestens 10 % führt, relativ zu einem gebackenen Produkt, das unter identischen Bedingungen hergestellt wurde, mit der Ausnahme, dass kein Enzym zugegeben wird.
Die Zugabe des erfindungsgemäßen Enzyms ergibt vorzugsweise eine Zunahme des Glutenindex im Teig von mindestens 5 % im Vergleich zu einem Teig ohne zugegebenes Enzym, wobei der Glutenindex durch eine Glutomatic 2200 Vorrichtung bestimmt wird.
Der Glutenindex kann durch einen Glutomatic 2200 von Perten Instruments (Schweden) unter Verwendung des im Folgenden ausführlich beschriebenen Verfahrens gemessen werden: direkt nach dem Gären sollten 15 g eines Teigs abgemessen und in den Glutamatic 2200 platziert, und mit 500 ml 2 % NaCl-Lösung 10 min gewaschen werden. Der gewaschene Teig sollte dann auf eine Gluten Index Centrifuge 2015 übergeführt werden, und die beiden Glutenfraktionen sollten abgemessen und der Glutenindex nach der folgenden Gleichung errechnet werden: Gluteinindex = (Gewicht des im Sieb verbleibenden Glutens × 100)/Gluten-Gesamtgewicht.
Es wurde festgestellt, dass das erfindungsgemäße Enzym gegen bestimmte Glycolipide, wie zum Beispiel Galactolipide, einschließlich Digalactodiglycerid (DGDG), das in Digalactomonoglycerid (DGMG) umgewandelt wird, welches ein wirksames oberflächenaktives Mittel ist, besonders aktiv sein kann. Vorzugsweise werden mindestens 25 % des Glycolipids, das anfänglich in dem Teig vorhanden ist, hydrolysiert, und vorzugsweise werden mindestens 35 % des Glycolipids hydrolysiert, stärker bevorzugt mindestens 50 %, mindestens 60 %, beziehungsweise mindestens 75 % davon.
Alternativ, oder zusätzlich dazu, wurde festgestellt, dass das erfindungsgemäße Enzym gegen bestimmte Phospholipide, die in Lysophospholipide umgewandelt wird, aktiv sein kann. Vorzugsweise werden mindestens 25 % des Phospholipids, das anfänglich in dem Teig vorhanden ist, hydrolysiert, und vorzugsweise werden mindestens 35 % des Phospholipids hydrolysiert, stärker bevorzugt mindestens 50 %, mindestens 60 %, beziehungsweise mindestens 75 % davon.
Die Aktivität einer Lipase auf Triglycerid kann von dem pH-Wert des Substrats abhängen. Das Enzym hat eine hydrolytische Aktivität gegen ein Phospholipid und ein Glycolipid, jedoch keine hydrolytische Aktivität gegen ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5-6,5.
Vorzugsweise ist das hierin definierte Enzym nicht in der Lage, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren.
Vorzugsweise ist das Enzym nicht in der Lage, sowohl ein Triglycerid als auch ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren. Alternativ kann das Enzym in der Lage sein, ein Triglycerid und ein Diglycerid zu hydrolysieren, jedoch nicht in der Lage sein, ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5-6,5 zu hydrolysieren. Geeigneterweise ist das Enzym nicht in der Lage, ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren.
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass andere Enzyme als Lipasen zu verbesserten Teigeigenschaften und der Qualität gebackener Produkte beitragen können. Es liegt innerhalb des Ziels der Erfindung, dass, zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Enzym, dem Teig mindestens ein weiteres Enzym zugegeben wird, oder in der teigverbessernden Zusammensetzung vorliegen kann. Solche weiteren Enzyme umfassen Stärke abbauende Enzyme, wie Endo- oder Exoamylasen, Pullulanasen, Stärke abbauende Enzyme, entzweigende Enzyme, Hemizellulasen, einschließlich Xylanasen, Zellulasen, Lipoxygenasen und Oxidoreduktasen, z.B. Glucoseoxidase, Phospholipasen und Hexoseoxidase.
Vorzugsweise wird der weitere Teigbestandteil in der Zusammensetzung, wenn eine vorhanden ist, aus der Gruppe ausgewählt, die aus Getreidemehl, Hefe, einem chemischen Triebmittel, einem Teig stärkenden Mittel, einem Emulgator, einem Zucker, einem Acylglycerin, einem Phospholipid, einem Glycolipid und einem Salz besteht.
Geeigneterweise kann der Teig ein frischer Teig sein, optional in einer kontrollierten Atmosphäre verpackt. Der Teig kann eingefroren sein.
Geeigneterweise können dem Teig, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein oder mehrere Enzyme zugesetzt werden und/oder in der teigverbessernden Zusammensetzung vorhanden sein und/oder dem Speiseöl zugegeben werden. Geeigneterweise können dem Teig zwei oder mehr, drei oder mehr, beziehungsweise vier oder mehr erfindungsgemäße Enzyme zugesetzt werden, und/oder in der teigverbessernden Zusammensetzung vorhanden sein und/oder können dem Speiseöl zugegeben werden.
Vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Auswahl von Enzymen das Screening der Aktivität von Enzymen auf Agarplatten umfassen, die jeweils entweder Galactolipide, Phospholipide, Triglyceride oder 1-Monoglyceride als Substrat enthalten. Enzyme, die gegenüber Phospholipiden und Glycolipiden aktiv sind, die jedoch keine oder im Wesentlichen keine Aktivität gegenüber Triglyceriden und/oder 1-Monoglyceriden haben, werden ausgewählt.
Geeigneterweise werden Schritt (a) und/oder (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens des Auswählens eines Enzyms bei einem pH-Wert von 4,5-6,5 durchgeführt.
Vorzugsweise ist das Enzym, das durch das erfindungsgemäßen Verfahren des Auswählens eines Enzyms getestet wird, eine Lipase (E.C. 3.1.1.3) oder eine Lipid-Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26).
Vorzugsweise erfolgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung oder Entwicklung eines Enzyms die Insertion, Deletion oder Substitution mindestens einer Aminosäure in der Deckelregion (lid region) am C-Terminus und/oder in der Nähe der aktiven Stelle und/oder am C-Terminus der Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise wird die Deckelregion deletiert.
Geeignete Enzyme können durch die Modifikation von Lipasen (E.C. 3.1.1.3) und lipolytischer Acylhydrolasen (E.C. 3.1.1.26) hergestellt werden, um Enzyme herzustellen, die gegenüber Phospholipiden und Glycolipiden aktiv sind, jedoch im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 keine Aktivität gegenüber Triglyceriden und/oder 1-Monoglyceriden besitzen.
Geeignete Aminosäuresubstitutionen umfassen Substitutionen von Aminosäuren in oder nahe der aktiven Stelle, die die hydrophilen Eigenschaften um die aktive Stelle herum verändern. Nur als Beispiel können die Aminosäuresubstitutionen die Anzahl an polaren Aminosäuren in oder nahe der aktiven Stelle erhöhen.
Vorzugsweise wird ein Enzym in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt, wobei das Enzym in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, und wobei das Enzym nicht in der Lage, oder im Wesentlichen nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5-6,5 zu hydrolysieren.
Geeigneterweise kann das erfindungsgemäße Enzym eine größere Aktivität gegenüber Glycolipiden im Vergleich zu Phospholipiden haben. Geeigneterweise kann das prozentuale Verhältnis der Hydrolyse der anfänglichen Glycolipide (d.h. DGDG) im Teig : der prozentualen Hydrolyse der anfänglichen Phospholipide (d.h. Phosphatidylcholin) im Teig mehr als 10:1, zum Beispiel mehr als 20:1, mehr als 30:1, oder mehr als 40:1 betragen.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Enzym eine größere Aktivität gegenüber den Phospholipiden im Vergleich zu den Glycolipiden haben. Zum Beispiel kann das prozentuale Verhältnis der Hydrolyse der anfänglichen Glycolipide (d.h. DGDG) im Teig : der prozentualen Hydrolyse der anfänglichen Phospholipide (d.h. Phosphatidylcholin) im Teig mehr als 1:3, wie zum Beispiel mehr als 1:5, mehr als 1:8, oder mehr als 1:15 betragen.
Die meisten Getreidemehle enthalten unpolare Lipide, einschließlich Triglyceriden und polare Lipide, einschließlich Phospholipiden und Glycolipiden. Die polaren Lipide können als Substrate für das erfindungsgemäße Enzym dienen. Entsprechend ist nach einer Ausführungsform des Verfahrens mindestens eines der Glycolipide, wie ein Galactolipid, einschließlich Digalactosyldiglycerid (DGDG) und eines der Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC) ein natürlich vorkommender (oder endogener) Lipidbestandteil, der in dem für den Teig verwendeten Mehl vorkommt.
Mehlteig kann jedoch für das erfindungsgemäße Enzym nicht ausreichende Mengen dieser Lipidsubstrate enthalten. Es liegt deshalb innerhalb des Ziels der Erfindung, den Teig mit mindestens einem Glycolipid und einem Phospholipid anzureichern, um ausreichende Substrate für das Enzym bereitzustellen. Es wird davon ausgegangen, dass der Begriff „ausreichendes Substrat" impliziert, dass keines dieser Lipidsubstrate zum Erhalten einer Wirkung zur Verbesserung des Teigs oder des gebackenen Produkts, limitierend ist, wie vorstehend beschrieben wurde.
Zusätzlich oder alternativ dazu kann ein ergänzendes unpolares Lipid, wie ein Acylglycerol, zugegeben werden. In Übereinstimmung mit der Erfindung können verschiedene derartige Lipide verwendet werden, wie z.B. pflanzliche Öle, pflanzliche Fette, tierische Öle, tierische Fette, wie zum Beispiel Butterfett und Backfett. In diesem Zusammenhang ist ein Öl oder Fett, das von Getreide abstammt, wie Haferöl, besonders geeignet. Haferöl enthält typischerweise zusätzlich zu Triglyceriden 5-25 % Phospholipide und 5-12 % Glycolipide. Haferöl kann fraktioniert werden, um Fraktionen zu erhalten, die einen hohen Gehalt an polaren Lipiden haben (E.G. Hammond in Lipid in Cereal Technology, herausgegeben durch P.J. Barnes, Academic Press).
So ist besteht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, dass dem Teig ein oder mehrere Phospholipide zugegeben werden können. In diesem Zusammenhang umfassen geeignete Phospholipide Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylcholin (PC), Lecithin und Phosphatidylethanolamin (PE).
Mindestens eines der Triglyceride, der 1-Monoglyceride, der Glycolipide und der Phospholipide können dem Teig zugegeben werden.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Zugabe einer wirksamen Menge eines Enzyms, das in der Lage ist, ein Glycolipid und Phospholipid zu hydrolysieren, wobei das Enzym nicht in der Lage ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, zusammen mit einem Glycolipid, insbesondere Digalactosyldiglycerid (DGDG) zu einem verbesserten Brotvolumen und/oder einer verbesserten Krumenstruktur führt. Die Verbesserungen, die mit dem Enzym plus dem Glycolipid beobachtet wurden, sind sogar größer als die Verbesserungen, die mit dem Enzym allein beobachtet wurden. Somit kann ein Enzym, das die spezifischen, hierin definierten Eigenschaften hat, geeigneterweise in Kombination mit einem Glycolipid verwendet werden.
Speiseöle, wie pflanzliche Öle, zum Beispiel Sojaöl oder Rapsöl, umfassen typischerweise Triglyceride mit einer geringeren Menge an polaren Lipiden, wie Phospholipiden und Glycolipiden. Es wird häufig gewünscht, die polaren Lipide aus dem pflanzlichen Öl zu entfernen, um ein klares, hochwertiges Ölprodukt zu erhalten. Das Verfahren zum Entfernen der polaren Lipide wird häufig als Degummieren bezeichnet. Somit kann, in Übereinstimmung mit der fünfzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, das Speiseöl, zum Beispiel ein pflanzliches Öl, durch ein erfindungsgemäßes Enzym degummiert werden. Degummieren ist der erste Schritt des Verfeinerungsverfahrens des Speiseöls, der die polaren Lipide, wie Phospholipide, aus dem rohen Öl entfernt. Normales Degummieren wird durch Wasser oder ein Nassverfahren durchgeführt. Die Phosphatide werden zum Beispiel durch eine enzymatisch katalysierte Hydrolyse in wasserlösliche Lyso-Phosphatide umgewandelt, die wasserlöslichen Lyso-Phosphatide werden dann durch Zentrifugation von dem Öl getrennt. Der restliche Phosphorgehalt in dem enzymatisch degummierten Öl kann in einem so geringen Bereich wie 2 ppm Phosphor liegen.
Vorzugsweise ist das Speiseöl gemäß der vierzehnten und fünfzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein pflanzliches Öl.
VORTEILE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass das Enzym der vorliegenden Erfindung, das gegen Glycolipide und Phospholipide aktiv ist, das jedoch nicht in der Lage ist, Triglyceride und/oder 1-Monoglyceride im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 zu hydrolysieren, bei der Verwendung in Teig mehrfach ungesättigte Fettsäuren produziert, da die endogenen Weizen-Glycolipide und -Phospholipide hohe Mengen (>70 %) Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3) enthalten. Diese Fettsäuren sind Substrate für Lipoxygenase und tragen zur Steigerung der Glutenstärke und einer weißeren Krume bei.
Ein weiterer beziehungsweise alternativer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass endogene polare Lipide ohne die Herstellung überschüssiger Fettsäuren modifiziert werden können. Somit wird verhindert, dass der Teig zu fest wird, und/oder das entstandene Brotvolumen kann erhöht werden und/oder die Herstellung von Fremdaromen kann verringert werden und/oder die negativen Auswirkungen auf die Hefe-Aktivität können vermieden oder überwunden werden. Ein noch weiterer oder alternativer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass Backfett, Öl- oder Milchfett, das dem Teig zugegeben wird, nicht hydrolysiert wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
ERFINDUNGSGEMÄSSE ENZYME
Das Enzym, das die hierin definierten Eigenschaften hat, kann von verschiedenen Quellen, einschließlich Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen wie Bakterien- und Pilzarten, einschließlich Hefearten abstammen. Das Enzym der Erfindung kann von einem Organismus abstammen, der natürlicherweise das Enzym produziert, oder es kann rekombinant durch Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Gen, das das Enzym codiert, hergestellt werden. Das Enzym kann ein Enzym sein, das in sich selbst aktive Stellen für alle seine Enzymaktivitäten umfasst, es ist jedoch auch möglich, Hybridenzyme zu konstruieren, die die hierin beschriebenen Enzymaktivitäten durch Synthese oder durch Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren haben.
Alternativ kann ein Enzym, das zumindest am Anfang die hierin definierten spezifischen Eigenschaften nicht hat, zum Beispiel durch Verändern der Aminosäuresequenz davon modifiziert werden, um ein Enzym bereitzustellen, das die hierin definierten Eigenschaften hat und das die gewünschte Substratspezifität besitzt. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, wie man Enzyme durch zufallsbestimmte Mutagenese modifiziert ( US 4,814,331 , WO 93/01285 und WO 95/22615 ) und wie man lipolytische Enzyme durch ortsspezifische Mutagenese modifiziert ( WO 97/04079 ), um eine verbesserte Leistung derselben zu erhalten. Das allgemein angewandte Konzept bestand darin, Aminosäuren innerhalb des strukturellen Teils der Aminosäurenkette eines lipolytischen Enzyms, das in Frage stand, einzufügen, zu deletieren oder zu substituieren. Ein geeignetes Enzym für die Modifizierung ist eines, das Esterbindungen hydrolysieren kann. Solche Enzyme umfassen zum Beispiel Lipasen wie Triacylglycerin-Lipase (E.C. 3.1.1.3), Lipoprotein-Lipase (E.C. 3.1.1.34), Monoglycerid-Lipase (E.C. 3.1.1.23), Lysophospholipase, Ferulasäure-Esterase und Esterase (E.C. 3.1.1.1, E.C. 3.1.1.2) und lipolytische Acylhydrolasen (E.C. 3.1.1.26) und Phosphatidylinositol-Deacylase (E.C. 3.1.1.52).
Geeignete Enzyme für die Modifikation können verschiedenen Quellen einschließlich Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen, wie Bakterien- und Pilzarten, einschließlich Hefearten, entstammen. Beispiele für geeignete Enzyme für die Modifikation sind die Pseudomonas-Lipasen, zum Beispiel von P. cepacia ( US 5,290,694 ), P. glumae (Frenken N. et al. (1992), Appl. Envir. Microbiol. 58, 3787-3791), P. pseudoalcaligenes ( EP 0 334 462 ), oder Pseudomonas sp. Stamm SD 705 ( WO95/06720 , EP 0 721 981 , WO 96/27002 , EP 0812910 ).
Alternativ können geeignete Enzyme für die Modifikation zum Beispiel pilzartige lipolytische Enzyme, wie lipolytische Enzyme der Humicola-Familie und der Zygomycetes-Familie und pilzartige Cutinasen sein. Die Humicola-Familie lypolytischer Enzyme besteht aus der Lipase des H. lanuginosa Stamms DSM 4109 und Lipasen, die mehr als 50 % Homologie mit dieser Lipase haben. Die Lipase von H. lanuginosa (Synonym Thermomyces lanuginosa) ist in EP 0 258 068 und EP 0 305 216 beschrieben und hat die Aminosäuresequenz, die in den Positionen 1-269 von SEQ ID Nr. 2 von US 5,869,438 gezeigt ist.
Withers-Martinez et al. (Structure 1996, 4:1363-1374) untersuchten ein pankreatisches, Lipase-verwandtes Protein 2 von Meerschweinchen (GPLRP2), das eine Aktivität auf Galactolipide und Phospholipide und eine verminderte Aktivität auf Triglycerid hat. Die Kristallstruktur dieses Enzyms wird gezeigt und mit einer menschlichen Pankreas-Lipase (HPL) mit ausschließlicher Aktivität auf Triglycerid und einer chimeren Mutante von Lipase-verwandtem Protein 2 (GPLRP2), bestehend aus der katalytischen Domäne von GPLRP2 und der C-terminalen Domäne von HPL (GPLRP2/HPL), verglichen. Die Mutante GPLRP2/HPL besitzt eine Aktivität gegen Phospholipide und Galactolipide, jedoch mit einer weiter verringerten Aktivität auf Triglycerid verglichen mit dem GPLRP2-Enzym. Auch Hornissengift (PLA 1) wurde zum Vergleich analysiert. Withers-Martinez et al. (Structure 1996, Nov. 15; 4(11): 1363-74) untersuchten die Schleifen, die oberhalb der aktiven Stelle des pankreatischen, Lipase-verwandten Meerschweinchen-Proteins 2 (GPLRP2), der menschlichen Pankreas-Lipase und Phospholipase A1 aus Hornissengift lokalisiert sind, und fand einen Zusammenhang zwischen der Schleifenkonfiguration und der Aktivität auf Triglyceride und Phospholipide.
In GPLRP2 ist die Deckel-Domäne verglichen mit HPL hinsichtlich ihrer Größe reduziert, und nur die β 9-Schleife wird beibehalten, und deshalb wird eine weniger hydrophobe Oberfläche rund um die aktive Stelle beobachtet. Dies könnte die verringerte Aktivität auf das Triglycerid von GPLRP2 und GPLRP2/HPL verglichen mit HPL erklären.
Nur als Beispiel kann eine Lipase-Variante ohne Aktivität auf Monoglycerid durch Substitution spezifischer Aminosäuren in oder rund um die katalytische Stelle einer Lipase erhalten werden. Zum Beispiel kann die Lipase von Aspergillus tubingensis, die die Aminosäuresequenz besitzt, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird und wie sie in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 977 869 vorgestellt wird, und die durch die in SEQ ID Nr. 4 gezeigte Nucleotidsequenz codiert wird, verändert werden, um eine derartige Lipase-Variante zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Die katalytische Triade von SEQ ID Nr. 3 besteht aus Serin 173 (Ser173), Asparaginsäure 228 (Asp228) und Histidin 285 (His285). Geeigneterweise können eine oder mehrere dieser Aminosäuren der katalytischen Triade substituiert werden, um die hydrophilen Eigenschaften der katalytischen Triade zu verändern.
Eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren in oder rund um die katalytische Stelle von SEQ ID Nr.3 kann substituiert werden, um die hydrophilen Eigenschaften rund um die aktive Stelle zu verändern: Phe107 – Phe123: Gly171 – Gly175; Tyr198 – Ile203; Thr224 – Gly239; Ser270 – Leu297.
Zum Beispiel kann das Verfahren zur Mutation einer „parentalen" Lipase zur Bereitstellung einer Lipase-Variante mit veränderter Substrataktivität in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte einschließen.
A. Konstruktion eines Expressionsvektors
Ein Vektor, zum Beispiel pYEL, kann durch Ersetzen des induzierbaren Promotors, Gal1_p, mit dem konstitutiven Promotor ADH_p und einem Lipasegen (zum Beispiel dem Lipasegen von Aspergillus tubigensis, wie in EP 0977 869 dargestellt) durch in vivo-Rekombination in S. cerevisiae eingeschlossen werden. 11 zeigt einen solchen Expressionsvektor, der von pYES2 abstammt.
B. Zufallsbestimmte Mutagenese durch zu Fehlern neigende PCR (EP-PCR)
Zufallsbestimmte Mutagenese-Banken können dann, zum Beispiel unter Verwendung von zwei EP-PCR-Verfahren, geschaffen werden; GeneMorph^TM – PCR-Mutagenesekit und Diversify^TM – PCR-Random-Mutagenesekit, im Folgenden bezeichnet als Genemorph, beziehungsweise Diversify.
Die Mutationsfrequenz kann optimiert werden, um 1-2 Aminosäuresubstitutionen pro Lipasegen, zum Beispiel pro LipA-Gen, zu erhalten. Die Optimierung der Mutationsfrequenz kann durch Variieren der Anfangsmengen an Matrizen-DNA (~0,65-40 ng) bei dem Genemorph EP-PCR-Verfahren und durch Variieren der Konzentrationen von MnSO₄ (0-640 μM) und dGTP (40-120 μM) bei dem Diversify EP-PCR-Verfahren durchgeführt werden. Die optimierten EP-PCR-Verfahren können enthalten: 0,65 ng DNA-Matrize, 2,5 U Mutazyme DNA-Polymerase, 125 ng von jedem Primer, 1× Mutazyme Reaktionspuffer und 200 μM dNTP-Gemisch beim Genemorph EP-PCR-Verfahren. Beim Diversify EP-PCR-Verfahren wurden 1 ng DNA-Matrize, 2 U Titan^TM Taq DNA-Polymerase, 10 μM von jedem Primer, 3,5 mM MgCl₂, 480 μM MnSO4, 200 μM dNTP-Gemisch und 40 μM dGTP angewendet. Beide EP-Verfahren wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl ausgeführt.

Die Primer, die für die beiden EP-Verfahren hergestellt wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Der Primer JOM1 führt zusätzlich drei As (unterstrichen) stromaufwärts des Startcodons ein.

Primer	Nucleotidsequenz	T_m [°C]	Primerstelle [Bp]
JOM1	5'CAAGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCAAAATGTTCTCTGGACGGTTTG3'	77.6	380-398 (ADH_p)→ 1-20 (LipA)	SEQ ID No. 5
JOM2	5'CAAACCTCTGGCGAAGAAGTCCAAAGCTG3'	69.3	400→428 (ADH3')	SEQ ID No. 6

EP-PCR kann unter Verwendung eines programmierbaren Thermocyclers unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden; GeneMorph^TM-PCR-Mutageneskit: 94 °C über 30 Sekunden, gefolgt von 30 Zyklen bei 94 °C über 30 Sekunden, 55 °C über 30 Sekunden und 72 °C über 2 Minuten. Schließlich wurde eine zusätzliche Verlängerung von 10 Minuten bei 72 °C angewendet. Diversify^TM PCR Random-Mutagenesekit: 94 °C über 30 Sekunden, gefolgt von 25 Zyklen von 94 °C über 30 Sekunden und 68 °C über 1 Minute.
C. Transformation und Expression
Transformierte und kompetente Zellen können zum Beispiel durch eine Modifikation des Transformationsverfahrens, das im pYES2-Protokoll beschrieben wird (Katalog Nr. V825-20, Invitrogen, CA, USA), hergestellt werden. Eine einzelne Kolonie von Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D kann in 20 ml YPD beimpft und unter Schütteln bei 200 UpM bei 30 °C gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann mit YPD auf einen OD₆₀₀ von 0,2-0,3 verdünnt und zusätzliche drei Stunden bei 30 °C und 200 UpM inkubiert werden. Die Zellen können durch Zentrifugation bei 4750 g und 20 °C über 5 Minuten geerntet werden. Das Pellet kann durch erneute Suspension in 1 ml 1 × TrisEDTA (1 × TE), pH-Wert 8,0 gewaschen und 5 Minuten bei 10000 g zentrifugiert werden. Die Zellen wurden durch Zusetzen von 0,5 ml 1 × TE und 100 mM Lithiumacetat, pH-Wert 7,5, kompetent gemacht.
Die Transformation kann durch vorsichtiges Vermischen von 100 μg DNA mit 50 μl kompetenten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, 5 μl Yeastmaker Träger-DNA und 300 μl 100 mM Lithiumacetat, 40 % Polyethylenglycol 3350 und 1 × TE durchgeführt werden. Das Gemisch kann bei 30 °C unter Schütteln bei 1000 UpM über 30 Minuten, gefolgt von Inkubation bei 42 °C über 15 Minuten inkubiert werden. Danach können die Zellen auf Eis übergeführt werden und dann bei 11300 g über 5 Sekunden pelletiert werden. Das Pellet kann in 1 ml YPD erneut suspendiert und 45 Minuten bei 30 °C und 200 UpM inkubiert werden. Ein Suspensionsvolumen von 150 μl wurde auf Platten, die SC-ura enthielten, übergeführt und 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Die Transformation in kompetente Saccharomyces cerevisiae-Zellen wurde weiterhin zu Klonierungszwecken unter Verwendung von in vivo – Rekombination verwendet, bei der 100 ng der Lipase (zum Beispiel LipA), oder Varianten davon mit 50 ng BamHI, das mit pYEA linearisiert wurde, co-transformiert werden können.
D. DNA-Isolierung
Plasmid-DNA von Escherichia coli kann durch alkalische Lyse unter Verwendung von hochreinem Plasmid-Isolierungskit isoliert werden.
Plasmid-DNA von Saccharomyces cerevisiae kann wie folgt isoliert werden: Zellen können durch Zentrifugation bei 1100 g über 15 Minuten pelletiert und erneut in 1 ml STET und 1,5 ml Glas-Siedesteinchen (425-600 Micron) suspendiert werden. Zusätzlich wurde ein Volumen von 1 ml STET zugegeben und das Gemisch wurde bei 100 °C 5 Minuten inkubiert. Die Lösung kann dann 15 Minuten bei 6500 g zentrifugiert werden und der Überstand kann auf ein Eppendorf-Röhrchen übergeführt werden, das zusätzliche 15 Minuten bei 27000 g zentrifugiert wurde. DNA kann unter Verwendung von Qiagen-tip 20 des Plasmid Mini Purification Kits vom Überstand extrahiert und gereinigt werden.
E. DNA-Sequenzierung
Lipase (zum Beispiel LipA)-Varianten können gemäß des Didesoxy-Kettenterminations-Verfahrens [Sanger et al., 1977] sequenziert werden. Plasmid-DNA für die Sequenzierung kann unter Verwendung einer Modifizierung des Plasmid Mini Purification Kits hergestellt werden. Hierbei kann an Statt von Qiagen-tip 20 a eine alkalische Standard-Lyse durchgeführt werden. Wenn durch PCR amplifizierte DNA für die Sequenzierung verwendet wurde, wurde DNA durch das Wizard^® PCR Preps DNA-Reinigungsverfahren isoliert.

Die Sequenzierungsreaktion kann unter Verwendung des ABI Prism^® Big Dye^TM-Terminators v3.0 Cycle Sequencing Kits (Danisco Biotechnology) oder des ABI Prism^TM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (AAU) mit DNA-Matrizen- und Primer-Konzentrationen von 500 ng beziehungsweise 3,2 pMol durchgeführt werden. Die Sequenzierungsreaktionen können unter Verwendung eines programmierbaren Thermocyclers unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden: 25 Zyklen bei 96 °C über 30 Sekunden, 50 °C über 15 Sekunden und 60 °C über 4 Minuten. Die Reinigung von PCR-Produkten kann durch Ethanol-Präzipitation durchgeführt werden, und das Pellet kann erneut in 12 μl HIDI-Formamid (Danisco Biotechnology) oder 12 μl Matrizen-Suppressionsreagens (AAU) suspendiert werden und kann in eine Genetic Analyser Probenröhre mit Septen übergeführt werden. Die Proben kann man dann auf einem ABI Prism^® 3100 Genetic Analyser (Danisco Biotechnology) oder einem ABI Prism^® Genetic Analyzer (AAU) laufen lassen. Geeignete Primer für die Sequenzierung einer LipA-Variante sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Diese Primer heften intern in LipA an.

Primer	Nucleotidsequeuz	Primerstelle [Bp]	T_m [°C]
JOM3	5' GCTCGTGGTCGCCTTCCGGGG 3' (SEQ ID No. 7)	306-326 (LipA)	68.2
JOM4	5' GCCGGTGCAGAGGTCGTCG 3' (SEQ ID No. 8)	399-381 (LipA)	58.1
JOM5	5' CCTCGAATCGGAAACTATGCGC 3' (SEQ ID No. 9)	601-622 (LipA)	61.6
JOM13	5' TGTCACGGCGTCGGATATCG 3' (SEQ ID No. 10)	768-787 (LipA)	78
JOM14	5' CTCATCCAACGTGGAAGTCG 3' (SEQ ID No. 11)	108-89 (LipA)	77

F. Screening auf Lipase (geeigneterweise Lipase 3)-Varianten: Veränderte Substratspezifität
Varianten, die DGDG- und Phospholipase-Aktivität zeigen, jedoch keine Triglycerid-Aktivität, können zum Beispiel unter Verwendung eines Plattenscreenings mit vorläufigem hohem Durchlauf, gefolgt von einem quantitativen Screening identifiziert werden, in dem die Verstärkung geprüft und quantifiziert wird.
G. Herstellung und Reinigung von verbesserten Varianten
Eine einzelne Kolonie ausgewählter Varianten kann in 50 ml Sc-ura-Medium beimpft und bei 30 °C und 250 UpM über zwei Tage inkubiert werden, wonach 25 ml zu 500 ml YPD-Medium übergeführt und zusätzliche zwei Tage bei 30 °C und 200 Upm inkubiert werden. Die hergestellte Lipase kann durch 15-minütige Zentrifugation von der Kultur getrennt werden. Der Überstand kann bis zur weiteren Verwendung bei –18 °C gelagert werden.
Hydrophobe Interaktionschromatographie
Ein Volumen von 250 ml Überstand kann mit (NH₄)₂SO₄ äquilibriert werden, um eine Endkonzentration von 1,0 M (NH₄)₂SO₄ zu erhalten. Die Suspension wurde auf eine SOURCE15PHE-Säule gegeben, die hydrophobe Phenyl-Liganden enthielt, die an eine starre Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix gekoppelt wurde. Die Säule kann auf ein finales Bettvolumen von 5,1 ml gepackt werden. Die Elution kann mit 20 mM NaAc-Puffer, pH-Wert 5,5 und einem linear abnehmenden Gradienten von 1,0 M-0 M (NH₄)₂SO₄, in einer Rate von 5 ml/min über 20 min durchgeführt werden.
Die Identifizierung von Fraktionen, die Lipase (zum Beispiel Lipase 3) und Varianten davon enthalten, können durch Aufbringen von 15 μl jeder Fraktion in Vertiefungen auf einer Platte, die geeignete Substrate enthalten, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, um auf Phospholipase-Aktivität, Galactolipase-Aktivität und Triglycerid-Hydrolysen abzusuchen.
Entsalzen
Ausgewählte Fraktionen können unter Verwendung von PD-10-Entsalzungssäulen, die eine Sephadex G-25-Matrix enthalten, die auf ein Endbettvolumen von 8,3 ml gepackt ist, entsalzen werden. Die Säule kann mit 20 mM TEA-Puffer, pH-Wert 7,3, prä-äquilibriert werden, wonach ein Probenvolumen von 2,5 ml aufgebracht wurde. Die Elution kann durch Aufbringen von 3,5 ml 20 mM TEA-Puffer, pH-Wert 7,3, durchgeführt werden.
Anionenaustauscherchromatographie
Ausgewählte Fraktionen können auf eine SOURCE15Q-Säule aufgetragen werden, die quarternäre Ammonium-Liganden enthält, die an eine monodispergierte, starre Polystyrol/Divinylbenzol-Matrix von 15 μm gekoppelt ist. Die Säule kann auf ein Endbettvolumen von 5,1 ml gepackt werden. Die Elution kann mit 20 mM TEA-Puffer, pH-Wert 7,3 und einem linear ansteigenden Gradienten von 0 M-1,0 M NaCl, in einer Rate von 2 ml/min über 20 min durchgeführt werden.
H. Charakterisierung von verbesserten Varianten
SDS-PAGE/Natives Gel
Die Proteine können unter Verwendung von 1 × Laufpuffer, einem 12 % Trenngel und 4 % Sammelgel, hergestellt nach Lämmli (1970) nach ihrer Größe getrennt werden.
Äquivalente Mengen von Proben und SDS-Probenpuffer, die 2-Mercaptoethanol enthalten, können bei 95 °C über 5 min inkubiert werden. Als Standard wurde ein Niedrigmolekulargewichtsmarker verwendet, der 0,64 μg Phosphorylase b, 0,83 μg Rinderserumalbumin, 1,47 μg Ovalbumin, 0,83 μg Kohlensäure-Anhydrase, 0,88 μg Sojabohnentrypsin-Inhibitor und 1,21 μg αLactalbumin enthielt. Die Proteinbande wurden unter Verwendung von Coomassie^® G250 Färbung sichtbar gemacht.
Für die native PAGE: Proteine können gemäß ihrer Mobilität durch native PAGE, in der kein SDS verwendet wurde, getrennt werden.
Lipasen mit ausschließlicher Aktivität gegen Galactolipide und Phospholipide wurden früher nicht zum Backen verwendet. Diese Lipasetypen werden in der Literatur selten erwähnt. Matos A.R. et al., (FEBS Lett, 2. März 2001; 491 (3):188-92) isolierten jedoch ein Protein von 43 kDa von durch Trockenheit gestressten Augenbohnen, das in einem Baculovirus-System exprimiert wurde. Dieses Enzym zeigte vorzugsweise eine Acylhydrolase-Aktivität und eine gewisse Phospholipid-Aktivität, jedoch keine Aktivität auf Triacylglycerin (Triglycerid). Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms wird in SEQ ID Nr. 1 gezeigt, und die Nucleotidsequenz, die dieses Enzym codiert, wird in SEQ ID Nr 2 gezeigt. Diese Enzymtypen unterscheiden sich von normalen Lipasen (E.C. 3.1.1.3) und der Begriff lypolytische Acylhydrolase (LAH) (E.C. 3.1.1.26) wird üblicherweise bei diesen Enzymen angewandt, wobei die Enzyme nur im Pflanzenreich beschrieben wurden. Die Galactolipid-Acylhydrolase, die in Matos et al. beschrieben wird, ist für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geeignet.
Das erfindungsgemäße Enzym kann entweder eine Lipase sein (E.C. 3.1.1.3), oder eine lipolytische Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26), solange sie die aufgeführten Eigenschaften besitzt.
Sahsah et al. (Biochem Biophys Acta, 17. Nov 1994; 1215 (1-2):66-73) isolierten eine lipolytische Acylhydrolase aus löslichem Augenbohnen-Blattextrakt. Die hydrolytische Aktivität dieses Enzyms auf verschiedene Substrate zeigte die folgende relative Aktivität Digalaktosyldiglycerid>Monogalaktosyldiglycerid>Phosphatidylcholin>Phosphatidylglycerin. Das Enzym zeigte keine Aktivität auf Triacylglycerin (Triglycerid). Das bei Sahsah et al. vorgestellte Enzym ist für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geeignet.
O'Sullivan et al. (J. Plant Physiol., Band 131, S. 393-404, 1987) offenbarten eine membrangebundene Galaktolipase, die mit Thylakoiden von Weizenblättern assoziiert ist.
Die vorstehenden Beispiele veranschaulichen Lipasen, beziehungsweise lipolytische Acylhydrolasen mit ausschließlicher Aktivität auf Phospholipide und Galactolipide, die, obwohl offensichtlich selten, in der Natur vorkommen und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zusätzlich oder alternativ kommen andere Verfahren zur Herstellung einer Lipase mit Aktivität gegen Phospholipide und Galactolipide, jedoch ohne Aktivität gegen Triglyceride und/oder 1-Monoglyceride vor.
Wie vorstehend erwähnt, zeigte Withers-Martinez (Structure 1996, 4:1363-1374), dass ein mit Meerschweinchen-Lipase verwandtes Protein 2 (GPLRP 2) eine Aktivität auf Phospholipide und Galactolipide und eine verminderte Aktivität auf Triglyceride aufwies. Er gibt auch an, dass die Hydrophilie um die aktive Stelle herum die Aktivität auf Triglycerid kontrollieren kann. Dies zeigt die Möglichkeit von Substitutionen von Aminosäuren in oder nahe der aktiven Stelle auf, die die Triglycerid-Aktivität durch Verändern der hydrophilen Eigenschaften rund um die aktive Stelle weiter reduzieren würden.
Es ist wohlbekannt, dass die Aktivität von Lipasen durch Verändern spezifischer Aminosäuren im Enzym verändert werden kann. Cordle et al. (J. Lipid Res., Sept. 1998, 39(9): 1759-67) substituierten Tyrosin mit der polareren Asparaginsäure und erhielten eine verringerte Aktivität an den langkettigen Fettsäuren.
Carriere et al. (Biochemistry, 7. Jan. 1997, 36(1): 239-48) entfernten den Deckel einer menschlichen Pankreaslipase, um eine Aktivierung zwischen den Flächen zu beseitigen und fanden heraus, dass ihre spezifische Aktivität gegenüber Triglyceriden dramatisch verringert war. Dieser Artikel berichtet auch, dass der C-Terminus einer menschlichen Pankreaslipase für die Zwischenflächen-Stabilität wichtig ist.
Eine bevorzugte Lipase zum Backen, mit Aktivität auf Phospholipide und Galactolipide, jedoch ohne Aktivität auf Triglyceride, kann auch durch Modifizieren des pH-Wert-Optimums für die Triglycerid-Aktivität erhalten werden. Unter normalen Bedingungen liegt der pH-Wert in einem Teig im Bereich von 4,5-6,5. Ching T. Hou (Journal of Industrial Microbiology, 13 (1994), 242-248) suchte eine Anzahl verschiedener Lipasen ab und fand eine Anzahl an Lipasen, die eine Triglycerid-Aktivität bei pH-Wert 7,5, jedoch keine Aktivität bei pH-Wert 5,5 zeigten.
Durch Auswählen eine Lipase ohne Aktivität bei dem besagten pH-Wert 5,5 und Modifizieren des Bereichs rund um die aktive Stelle durch ortsgerichtete oder lokalisierte, zufallsbestimmte Mutagenese, um die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche rund um die aktive Stelle zu verändern und um den Deckel (lid) durch ortsgerichtete oder lokalisierte, zufallsbestimmte Mutagenese zu modifizieren, ist es möglich, eine Lipase mit einer Aktivität auf Phospholipide und Galactolipide zu erhalten, wobei die übriggebliebene Triglycerid-Aktivität bei einem pH-Wert von 7,5 oder darüber aktiv ist, jedoch ohne Aktivität bei pH6,5 oder darunter, wie zum Beispiel bei pH-Wert 5,5.
Lipasen können verschiedene Spezifitätstypen besitzen (Inform Band 8, Nr. 6 640-650). Die Fettsäurespezifität einer Lipase besitzt einen Einfluss auf den Typ der hergestellten Fettsäure. Einige Lipasen sind für ungesättigte Fettsäuren sehr spezifisch, was bei einem Teigsystem vorzuziehen ist, da die mehrfach ungesättigte Fettsäure ein Substrat für endogene oder zugegebene Lipoxygenase ist. Vorzugsweise hydrolysiert das erfindungsgemäße Enzym bevorzugt ungesättigte Fettsäuren. Geeigneterweise verändert bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung oder Entwicklung eines Enzyms die Insertion, Deletion oder Substitution die Fettsäurespezifität des Enzyms, so dass das Enzym vorzugsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren im Lipidgemisch produziert.
Geeignete Beispiele für Enzyme, die eine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und keine, oder im Wesentlichen keine hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid aufweisen, werden in dem hier folgenden Beispiele genannten Abschnitt dargestellt.
KLONIERUNG EINER NUCLEOTIDSEQUENZ, DIE EIN ERFINDUNGSGEMÄSSES ENZYM CODIERT
Eine Nucleotidsequenz, die entweder ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, oder ein Enzym, das für die Modifizierung geeignet ist, kann aus einer beliebigen Zelle oder einem beliebigen Organismus, die/der das Enzym produzieren, isoliert werden. Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Verfahren zur Isolierung von Nucleotidsequenzen wohlbekannt.
Zum Beispiel kann, unter Verwendung von chromosomaler DNA oder von Messenger-RNA aus dem Organismus, der das Enzym produziert, eine genomische DNA- und/oder cDNA-Bank konstruiert werden. Ist die Aminosäuresequenz des Enzyms bekannt, können markierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert und verwendet werden, um Enzym-codierende Klone aus der Genom-Bank, die aus dem Organismus hergestellt wurde, zu identifizieren. Alternativ könnte eine markierte Oligonucleotid-Sonde, die homologe Sequenzen zu einem anderen bekannten Enzymgen enthält, verwendet werden, um Enzym-codierende Klone zu identifizieren. Im letzteren Fall werden Bedingungen von niedriger Stringenz zur Hybridisierung und zum Waschen verwendet.
Alternativ könnten Enzym-codierende Klone durch Einfügen genomischer DNA-Sequenzen in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, identifiziert werden, wodurch Enzym-negative Bakterien mit der entstehenden genomischen DNA-Bank transformiert werden, und Ausstreichen der transformierten Bakterien auf Agar, der ein Substrat für Enzym enthält (d.h. Phospholipide oder Galactolipide), wodurch man die Klone, die das Enzym exprimieren, identifizieren könnte.
Bei noch einer weiteren Alternative kann die Nucleotidsequenz, die das Enzym codiert, synthetisch, durch etablierte Standardverfahren, z.B. das Phosphoramidit-Verfahren, beschrieben durch Beucage S.L. et al. (1981), Tetrahedron Letters 22, S. 1859-1869, oder das durch Matthes et al. (1984), EMBO J. 3, S. 801-805, beschriebene Verfahren, hergestellt werden. Beim Phosphoramidit-Verfahren werden Oligonucleotide, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesegerät, synthetisiert, gereinigt, angeheftet, ligiert und in geeignete Vektoren Kloniert.
Die Nucleotidsequenz kann gemischten genomischen und synthetischen Ursprungs, gemischten synthetischen und cDNA-Ursprungs beziehungsweise gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet) in Übereinstimmung mit Standardverfahren. Jedes ligierte Fragment entspricht verschiedenen Teilen der gesamten Nucleotidsequenz. Die DNA-Sequenz kann ebenfalls durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer, zum Beispiel wie in US 4,683,202 , oder in Saiki R.K. et al. (Science (1988) 239, S. 487-491), beschrieben, hergestellt werden.
NUCLEOTIDSEQUENZEN
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Nucleotidsequenzen, die Enzyme codieren, die die spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, haben. Der Begriff „Nucleotidsequenz", wie hierin beschrieben, betrifft eine Oligonucleotidequenz, oder eine Polynucleotidsequenz und Varianten, Homologe, Fragmente und Derivate davon (wie Abschnitte davon). Die Nucleotidsequenz kann genomischen, oder synthetischen, oder rekombinanten Ursprungs sein, die doppelsträngig oder einzelsträngig ist und entweder den Sense- oder den Antisense-Strang darstellt.
Der Begriff „Nucleotidsequenz" umfasst in Bezug auf die vorliegende Erfindung genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und RNA. Er bedeutet bevorzugt DNA, stärker bevorzugt cDNA für die Codierungssequenz der vorliegenden Erfindung.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nucleotidsequenz, die per se ein Enzym codiert, das die spezifischen Eigenschaften besitzt, wie hierin definiert, nicht die native Nucleotidsequenz in ihrer natürlichen Umgebung, wo sie mit ihrer natürlicherweise assoziierten Sequenz/ihren natürlicherweise assoziierten Sequenzen verbunden ist, die sich ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung befinden. Um die Bezugnahme zu erleichtern, werden nennen wir diese bevorzugte Ausführungsform die „nicht-native Nucleotidsequenz". In diesem Sinne bedeutet der Begriff „native Nucleotidsequenz" eine gesamte Nucleotidsequenz, d. h. in ihrer natürlichen Umgebung und operativ verknüpft mit einem ganzen Promotor, mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist, wobei sich der Promotor ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung befindet. Somit kann das erfindungsgemäße Enzym durch eine Nucleotidsequenz in ihrem natürlichen Organismus exprimiert werden, wobei sich die Nucleotidsequenz jedoch nicht unter der Kontrolle des Promotors befindet, mit dem sie innerhalb dieses Organismus natürlicherweise assoziiert ist.
Vorzugsweise ist das Enzym kein natives Enzym. In diesem Sinne bedeutet der Begriff „natives Enzym" ein ganzes Enzym, das sich in seiner natürlichen Umgebung befindet und das durch seine native Nucleotidsequenz exprimiert wurde.
Typischerweise wird die Nucleotidsequenz, die Enzyme codiert, die die hierin beschriebenen spezifischen Eigenschaften haben, unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren (d.h. rekombinanter DNA) hergestellt. Jedoch könnte die Nucleotidsequenz nach einer alternativen Ausführungsform der Erfindung im Ganzen oder teilweise, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten chemischen Verfahren (vgl. Caruthers MH et al., (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 und Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232), synthetisiert werden.
AMINOSÄURESEQUENZEN
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Aminosäuresequenzen von Enzymen mit den hierein definierten spezifischen Eigenschaften.
Wie hierin verwendet ist der Begriff „Aminosäure" mit dem Begriff „Polypeptid" und/oder dem Begriff „Protein" synonym. in einigen Beispielen ist der Begriff „Aminosäuresequenz" mit dem Begriff „Peptid" synonym. In einigen Beispielen ist der Begriff „Aminosäuresequenz" mit dem Begriff „Enzym" synonym.
Die Aminosäuresequenz kann aus einer geeigneten Quelle hergestellt/isoliert werden, oder sie kann synthetisch oder unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden.
Geeigneterweise können die Aminosäuresequenzen von den isolierten Enzymen erhalten werden, die hierin durch Standardverfahren vorgestellt werden.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuresequenzen aus isolierten Enzymen ist wie folgt:
Gereinigtes Enzym kann gefriergetrocknet werden, und 100 μg des gefriergetrockneten Materials kann in 50 μl eines Gemischs aus 8 M Harnstoff und 0,4 M Ammoniumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,4, gelöst werden. Das gelöste Protein kann denaturiert und 15 Minuten bei 500 °C reduziert werden, gefolgt von einer Überlagerung mit Stickstoff und Zugeben von 5 μl 45 mM Dithiothreitol. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur können 5 μl 100 mM Jodacetamin zugegeben werden, so dass die Cysteinreste 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Stickstoff derivatisiert werden.
135 μl Wasser und 5 μg Endoproteinase Lys-C in 5 HI Wasser können dem oben genannten Reaktionsgemisch zugegeben werden, und die Spaltung kann bei 37 °C in Stickstoff über 24 Stunden durchgeführt werden.
Die entstehenden Peptide können durch Umkehrphasen-HPLC über eine VYDAC C18-Säule (0,46 × 15 cm; 10ym; The Separation Group, Kalifornien, USA) unter Verwendung von Lösungsmittel A: 0,1t TFA in Wasser und Lösungsmittel B: 0,1 k TFA in Acetonitril aufgetrennt werden. Ausgewählte Peptide können vor der N-terminalen Sequenzierung über eine Develosil C18-Säule, unter Verwendung desselben Lösungsmittelsystems, erneut einer Chromatographie unterzogen werden. Die Sequenzierung kann unter Verwendung eines 476A-Sequenzierungsgeräts von Applied Biosystems, unter Verwendung von gepulsten schnellen Flüssigkeitszyklen (pulsed liquid fast cycles) gemäß den Anordnungen des Herstellers (Applied Biosystems, Kalifornien, USA) durchgeführt werden.
VARIANTEN/HOMOLOGE/DERIVATE
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Varianten, Homologen und Derivaten jeder Aminosäuresequenz eines Enzyms, die die spezifischen Eigenschaften haben, die hierin oder in jeder anderen Nucleotidsequenz definiert sind, die ein solches Enzym codiert. Hier bedeutet der Begriff „Homologe" eine Gesamtheit, die eine gewisse Homologie mit den betreffenden Aminosäuren und Nucleotidsequenzen aufweisen. Hier kann der Begriff „Homologie" mit „Identität" gleichgesetzt werden.
Die variante, homologe und derivative Aminosäuresequenz und/oder Nucleotidsequenz sollte ein Enzym bereitstellen und/oder codieren, das die funktionale Aktivität beibehält und/oder die Aktivität des Enzyms verstärkt.
Im vorliegenden Zusammenhang wird eine homologe Sequenz verwendet, um eine Aminosäure einzuschließen, die zu mindestens 75, 85 oder 90 %, vorzugsweise 95 oder 98 %, zur betreffenden Sequenz identisch ist. Typischerweise werden die Homologe dieselben aktiven Stellen, etc. umfassen wie die betreffende Aminosäuresequenz. Obwohl Homologie auch in Bezug auf Ähnlichkeit (d.h. Aminosäurereste, die ähnliche chemische Eigenschaften/Funktionen) betrachtet werden kann, wird es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorgezogen, Homologie in Bezug auf Sequenzidentität auszudrücken.
Im vorliegenden Zusammenhang wird eine homologe Sequenz herangezogen, um eine Nucleotidsequenz einzuschließen, die mindestens zu 75, 85 oder 90 %, bevorzugt mindestens zu 95 oder 98 % identisch zu einer Nucleotidsequenz ist, die ein Enzym der vorliegenden Erfindung (die betreffende Sequenz) codiert. Typischerweise umfassen die Homologe dieselben Sequenzen, die die aktiven Stellen etc. codieren, wie die betreffende Sequenz. Obwohl Homologie auch in Bezug auf die Ähnlichkeit betrachtet werden kann (d.h. Aminosäurereste, die ähnliche chemische Eigenschaften/Funktionen haben), wird es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorgezogen, Homologie in Bezug auf Sequenzidentität auszudrücken.
Homologievergleiche können mit dem Auge, oder häufiger, mit Hilfe von leicht erhältlichen Sequenzvergleichs-Programmen, vorgenommen werden. Diese im Handel erhältlichen Computerprogramme können die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen errechnen.
Die prozentuale Homologie kann über fortlaufende Sequenzen errechnet werden, d.h. eine Sequenz ist mit der anderen Sequenz angeordnet und jede Aminosäuresequenz in einer Sequenz wird direkt mit der entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz, ein Rest auf einmal, verglichen. Dies wird „lückenlose" Anordnung genannt. Typischerweise werden solche lückenlosen Anordnungen nur entlang einer relativ kurzen Anzahl von Resten durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfaches und einheitliches Verfahren ist, zieht es nicht in Betracht, dass zum Beispiel bei einem ansonsten identischen Sequenzpaar, eine Insertion oder Deletion dazu führen wird, dass die folgende Aminosäurereste aus der Anordnung herausgenommen werden, wodurch möglicherweise eine große Verringerung der prozentualen Homologie entsteht, wenn eine Gesamt-Ausrichtung durchgeführt wird. In der Folge sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so angelegt, dass sie optimale Anordnungen erstellen, die mögliche Insertionen und Deletionen in Betracht ziehen, ohne das gesamte Homologie-Ergebnis zu benachteiligen. Dies wird durch Einfügen von „Lücken" in der Sequenzanordnung erreicht, um die lokale Homologie möglichst zu maximieren.
Diese komplexeren Verfahren weisen jeder Lücke, die in der Anordnung auftritt, „Lücken-Benachteiligungen" zu, so dass für dieselbe Anzahl an identischen Aminosäuren eine Sequenzanordnung mit so wenigen Lücken wie möglich – betrachtet man den höheren Verwandtschaftsgrad zwischen den beiden verglichenen Sequenzen – ein besseres Ergebnis erreichen wird als eines mit vielen Lücken. „Affine Lückenkosten" werden typischerweise verwendet, die relativ hohe Kosten für die Existenz einer Lücke und eine geringere Benachteiligung für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke verhängen. Dies ist das am häufigsten verwendete Lücken-Zählsystem. Hohe Lücken-Benachteiligungen werden natürlich optimierte Anordnungen mit weniger Lücken produzieren. Die meisten Anordnungsprogramme lassen zu, dass die Lücken-Benachteiligungen modifiziert werden. Es ist jedoch vorzuziehen, die Fehlerwerte zu verwenden, wenn man eine derartige Software für die Sequenzvergleiche verwendet. Zum Beispiel beträgt die Fehler-Lücken-Benachteiligung für Aminosäuresequenzen bei Verwendung des GCG Wisconsin Bestfit Package –12 für eine Lücke und –4 für jede Verlängerung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert deshalb zuerst die Herstellung einer optimalen Anordnung, wobei die Lücken-Benachteiligungen berücksichtigt werden. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung einer derartigen Anordnung ist das GCG Wisconsin Bestfit Package (Devereux et al., 1984, Nuc. Acids Research 12, S. 387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das BLAST-Package (vgl., Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4. Ausg. – Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) und die GENEWORKS – Reihe an Vergleichs-Werkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind bei der offline und online Suche erhältlich (vgl. Ausubel et al., 1999, Seiten 7-58 bis 7-60). Für einige Anwendungen wird jedoch vorgezogen, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden. Ein neues Werkzeug, BLAST 2 – Sequences genannt, ist ebenfalls für den Vergleich von Protein und Nucleotidsequenz verfügbar (vgl., FEMS Microbiol. Lett. 1999, 174(2): 247-50; FEMS Microbiol. Lett. 1999, 177(1): 187-8 und [email protected]).
Obwohl die finale prozentuale Homologie hinsichtlich ihrer Identität gemessen werden kann, basiert der Anordnungsprozess selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine abgestufte Ähnlichkeits-Punktmatrix verwendet, die, basierend auf der chemischen Ähnlichkeit, beziehungsweise der evolutionären Distanz, Punkte für jeden paarweisen Vergleich vergibt. Ein Beispiel für eine solche herkömmlich verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Fehlermatrix für die BLAST Programmreihe. Die GCG Wisconsin-Programme verwenden im Allgemeinen entweder die öffentlichen Fehlerwerte oder eine Vergleichstabelle mit herkömmlichen Symbolen, wenn diese mitgeliefert wird (für weitere Details vgl. die Gebrauchsanleitung). Bei einigen Anwendungen ist es bevorzugt, für das GCG-Package die öffentlichen Fehlerwerte zu verwenden, oder, im Fall von anderer Software, wie zum Beispiel BLOSUM62, die Fehler-Matrix zu verwenden.
Sobald die Software eine optimale Anordnung produziert hat, ist es möglich, die prozentuale Homologie, vorzugsweise die prozentuale Sequenzidentität zu berechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs durch und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Die Sequenzen können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stille Veränderung hervorrufen und eine funktional äquivalente Substanz ergeben. Absichtliche Aminosäure-Substitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeiten der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität, und/oder der amphipathischen Natur der Reste vorgenommen werden, solange die sekundäre Bindungsaktivität der Substanz erhalten wird. Zum Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitäts-Werte haben, umfassen Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Konservative Substitutionen können, zum Beispiel gemäß der folgenden Tabelle, durchgeführt werden. Aminosäuren in demselben Block in der zweiten Säule und vorzugsweise in derselben Linie in der dritten Säule können miteinander substituiert werden:

ALIPHATISCH nicht polar GAP

ILV

polar-ungeladen CSTM

NQ

polar-geladen DE

KR

AROMATISCH HFWY
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die homologe Substitution (Substitution und Ersetzung werden beide hierin so verwendet, dass sie den Austausch eines bestehenden Aminosäurerests durch einen alternativen Rest bedeuten), die auftreten kann, d.h., Substitution durch Gleiches wie basisch durch basisch, sauer durch sauer, polar durch polar, etc. Nicht-homologe Substitution kann ebenfalls auftreten, d.h., zwischen einer Klasse von Resten und einer anderen, oder, alternativ, unter Beteiligung das Einschlusses von unnatürlichen Aminosäuren wie Ornithin (im Folgenden als Z bezeichnet), Diaminobutyrinsäure-Ornithin (im Folgenden als B bezeichnet), Norleucin-Ornithin (im Folgenden als O bezeichnet), Pyriylalanin, Thienylalanin, Naphthylalanin und Phenylglycin.
Ersetzungen können auch durch unnatürliche Aminosäuren vorgenommen werden, welche umfassen: Alpha*- und Alpha-disubstituierte*-Aminosäuren, N-Alkyl-Aminosäuren*, Milchsäure*, Halogenid-Derivate natürlicher Aminosäuren, wie Trifluortyrosin*, p-Cl-Phenylalanin*, p-Br-Phenylalanin*. p-I-Phenylalanin*, L-Allyl-Glycin*, β-Alanin*, L-α-Amino-Butansäure*, L-χ-Amino-Butansäure*, L-α-Amino-Isobutansäure*, L-ε-Aminokapronsäure^#, 7-Amino-Heptansäure*, L-Methionin-Sulfon^#*, L-Norleucin*, L-Norvalin*, p-nitro-L-Phenylalanin*, L-Hydroxyprolin^#, L-Thioprolin*, Methylderivate von Phenylalanin (Phe) wie zum Beispiel 4-Methyl-Phe*, Pentamethyl-Phe*, L-Phe (4-Amino)^#, L-Tyr(methyl)*, L-Phe(4-Isopropyl)*, L-Tic (1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carboxylsäure)*, L-Diaminopropionsäure^# und L-Phe(4-Benzyl)*. Die Notation * wurde zum Zweck der vorstehenden Diskussion verwendet (in Bezug auf homologe oder nicht homologe Substitution), um die hydrophobe Natur des Derivats anzuzeigen, während # verwendet wurde, um die hydrophile Natur des Derivats anzuzeigen, #* zeigt amphipathische Eigenschaften an.
Verschiedene Aminosäuresequenzen können geeignete Spacer-Gruppen enthalten, die zwischen zwei beliebigen Aminosäureresten der Sequenz eingefügt werden können, einschließlich Alkylgruppen wie Methyl-, Ethyl-, oder Propylgruppen zusätzlich zu den Aminosäure-Spacern, wie zum Beispiel Glycin- oder β-Alaninreste. Bei einer weiteren Form der Variation ist die Gegenwart von einem oder mehreren Aminosäureresten in Peptoidform beteiligt, die dem Fachmann wohlbekannt sein wird. Um jeden Zweifel zu vermeiden wird „die Peptoidform" verwendet, um sich auf variable Aminosäurereste zu beziehen, worin sich die α-Kohlenstoff substituierende Gruppe eher auf dem Stickstoffatom des Rests befindet als der α-Kohlenstoff. Verfahren zu Herstellung von Peptiden in Peptoidform sind auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel Simon RJ et al., PNAS (1992), 89(20), 9367-9371 und Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995), 13(4), 132-134.
Nucleotidsequenzen, die ein Enzym codieren, das die spezifischen Eigenschaften hat, die hierin definiert werden, können darunter synthetische oder modifizierte Nucleotide umfassen. Mehrere verschiedene Typen der Modifikation von Oligonucleotiden sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat und Phosphorthionat und/oder die Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten an den 3'- und/oder 5'-Ketten des Moleküls. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass die hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen durch jedes Verfahren, das auf dem Fachgebiet verfügbar ist, modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die Aktivität in vivo beziehungsweise die Lebensdauer von Nucleotidsequenzen zu verstärken.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nucleotidsequenzen, die zu den hierin diskutierten Sequenzen, oder jedem Derivate, Fragment oder Derivat davon komplementär sind. Ist die Sequenz zu einem Fragment davon komplementär, kann diese Sequenz als Sonde verwendet werden, um ähnliche Codierungssequenzen in anderen Organismen etc. zu identifizieren.
Polynucleotide, die nicht zu 100 % zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung homolog sind, jedoch innerhalb des Bereichs der Erfindung liegen, können auf verschiedene Arten erhalten werden. Andere Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen können zum Beispiel durch Sondieren von DNA-Banken erhalten werden, die von verschiedenen Individuen, zum Beispiel von Individuen verschiedener Populationen, erstellt wurden. Zusätzlich können andere virale/bakterielle, oder zelluläre Homologe erhalten werden, insbesondere zelluläre Homologe, die in Säugerzellen (z.B. Ratten-, Mäuse-, Rinder- und Primatenzellen) zu finden sind, und solche Homologe und Fragmente davon sind im Allgemeinen dazu fähig, selektiv mit den Sequenzen in der hierin gezeigten Sequenzauflistung zu hybridisieren. Solche Sequenzen können durch Sondierung von cDNA-Banken, die aus oder von genomischen DNA-Banken, die aus anderen Tierarten hergestellt wurden, und Sondieren dieser Banken mit Sonden, die alle oder einen Teil einer der Sequenzen in den angehängten Sequenzauflistungen umfassen, unter Bedingungen von Medien mit hoher Stringenz, erhalten werden. Ähnliche Betrachtungen betreffen das Erhalten von artspezifischen Homologen und allelischen Varianten der Polypeptid- oder Nucleotidsequenzen der Erfindung.
Varianten und Stamm/Art-Homologa können auch unter Verwendung von degenerierter PCR erhalten werden, bei der Primer verwendet werden, die so hergestellt sind, dass sie auf Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologe abzielen, die konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der Sequenzen der vorliegenden Erfindung codieren. Konservierte Sequenzen können zum Beispiel durch Aneinanderreihen der Aminosäuresequenzen verschiedener Varianten/Homologe vorhergesagt werden. Sequenz-Anordnungen können unter Verwendung von Computer-Software, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden. Zum Beispiel wird das GCG Wisconsin PileUp-Programm häufig verwendet.
Die Primer, die bei der degenerierten PCR verwendet werden, enthalten eine oder mehrere degenerierte Positionen und werden unter weniger stringenten Bedingungen verwendet als jene, die für die Klonierung von Sequenzen mit einzelnen Sequenzprimern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Alternativ können solche Polynucleotide durch ortsgerichtete Mutagenes charakterisierter Sequenzen erhalten werden. Dies kann zum Beispiel dort geeignet sein, wo stille Veränderungen in der Codonsequenz benötigt werden, um die Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynucleotid-Sequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzveränderungen können erwünscht sein, um Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme einzuführen, oder um die Eigenschaft oder Funktion der Polypeptide zu verändern, die von den Polynucleotiden codiert werden.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide (Nuzcleotidsequenzen) können verwendet werden, um einen Primer herzustellen, z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, eine Sonde, die z.B. durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen mit einer deutlichen Markierung markiert ist, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente sind mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, zum Beispiel mindestens 25, 30 oder 40 Nucleotide lang und sind ebenfalls in den Begriff Polynucleotide der Erfindung, wie hierin verwendet, eingeschlossen.
Polynucleotide, wie zum Beispiel erfindungemäße DNA-Polynucleotide und Sonden, können rekombinant, synthetisch oder durch alle Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Sie können ebenfalls durch Standardverfahren kloniert werden.
Allgemein werden Primer durch synthetische Verfahren hergestellt, wobei eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz, ein Nucleotid auf einmal, beteiligt ist. Verfahren, um dies unter Verwendung automatisierter Verfahren zu erreichen, sind auf dem Fachgebiet ausreichend verfügbar.
Längere Polynucleotide werden im Allgemeinen unter Verwendung von rekombinanten Verfahren hergestellt, zum Beispiel unter Verwendung von PCR (Polymerasekettenreaktions)-Klonierungsverfahren. Dabei ist die Herstellung eines Primerpaars (z.B. etwa 15 bis 30 Nucleotide) beteiligt, das eine Region der Lipid-Targeting-Sequenz flankiert, die kloniert werden soll, wobei die Partner mit mRNA oder cDNA, die von einer tierischen oder menschlichen Zelle gewonnen wird, in Kontakt gebracht werden sollen, wodurch eine Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen durchgeführt wird, die mit der Amplifikation der gewünschten Region, Isolation des amplifizierten Fragments (z.B. durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA einhergeht. Die Primer können so hergestellt werden, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
HYBRIDISIERUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Sequenzen, die zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung komplementär sind, oder Sequenzen, die in der Lage sind, entweder mit den Sequenzen der vorliegenden Erfindung, oder mit Sequenzen, die dazu komplementär sind, zu hybridisieren.
Der Begriff „Hybridisierung", wie hierin verwendet, soll „das Verfahren, durch das ein Nucleinsäurestrang sich durch Basenpaarung mit dem komplementären Strang verbindet", sowie das Amplifikationsverfahren, das bei Polymerasekettenreaktionsverfahren durchgeführt wird, umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nucleotidsequenzen, die in der Lage sind, mit den Sequenzen zu hybridisieren, die zu den hierin erörterten, in Frage stehenden Sequenzen, oder jeglichem Derivat, Fragment oder Derivat davon, komplementär sind.
Der Begriff „Variante" umfasst auch Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die in der Lage sind, mit den hierin erörterten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleotidbindenden Komplexes, wie in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA) gelehrt wird, und verleihen eine definierte „Stringenz", wie nachstehend erklärt.
Eine maximale Stringenz tritt typischerweise etwa bei Tm –5 °C (5 °C unter dem Tm der Sonde); hohe Stringenz bei etwa 5 °C bis 10 °C unterhalb des Tm; mittlere Stringenz bei etwa 10 °C bis 20 °C unterhalb des Tm; und geringe Stringenz bei etwa 20 °C bis 25 °C unterhalb des Tm auf. Wie es der Fachmann versteht, kann eine Hybridisierung mit maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Nucleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, während eine Hybridisierung mit mittlerer (oder geringer) Stringenz verwendet werden kann, um ähnliche oder miteinander verwandte Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen.
Vorzugsweise umfasst der Begriff „Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die in der Lage sind, unter hohen oder mittleren Stringenzbedingungen mit Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die Enzyme codieren, die die spezifischen, hierin definierten Eigenschaften besitzen.
Stärker bevorzugt umfasst der Begriff „Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die in der Lage sind, unter hohen Stringenzbedingungen (z.B. 65 °C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat, pH-Wert 7,0} mit Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die Enzyme codieren, die die spezifischen, hierin definierten Eigenschaften besitzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleotidsequenzen, die mit den hierin erörterten Nucleotidsequenzen hybridisieren können (einschließlich komplementäre Sequenzen zu den hierin erörterten).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleotidsequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die mit den spezifischen, hierin erörterten Nucleotidsequenzen hybridisieren können (einschließlich komplementären Sequenzen zu den hierin diskutierten).
Ebenfalls in den Gegenstand der Erfindung eingeschlossen sind Polynucleotidsequenzen, die in der Lage sind, unter mittleren bis maximalen Stringenzbedingungen mit den hierin erörterten Nucleotidsequenzen zu hybridisieren.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen, die mit den hierin erörterten Nucleotidsequenzen, oder dem Komplement davon, unter stringenten Bedingungen hybridisieren können (z.B. 50 °C und 0,2 × SSC).
Nach einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Nucleotidsequenzen, die mit den hierin erörterten Nucleotidsequenzen, oder dem Komplement davon, unter hohen stringenten Bedingungen hybridisieren können (z.B. 65 °C und 0,1 × SSC
ORTSGERICHTETE MUTAGENESE
Sobald eine Enzym-codierende Nucleotidsequenz und/oder Aminosäuresequenz des Enzyms isoliert ist, kann es wünschenswert sein, die Sequenz zu mutieren, um ein Enzym mit den geeigneten erfindungsgemäßen Eigenschaften herzustellen oder die natürlichen Eigenschaften des Enzyms zu verstärken.
Mutationen können unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide eingeführt werden. Diese Oligonucleotide enthalten Nucleotidsequenzen, die die gewünschten Mutationsstellen flankieren.
Ein geeignetes Verfahren wird in Morinaga et al. (Biotechnology (1984)2, S. 646-649) offenbart, worin eine einzelsträngige DNA-Lücke, die Enzym codierende Sequenz, in einem Vektor erzeugt wird, der das Enzymgen trägt. Das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation enthält, wird dann an den homologen Abschnitt der einzelsträngigen DNA angeheftet. Die restliche Lücke wird dann mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, und das Konstrukt wird unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Andere geeignete Verfahren umfassen das Mega-Prima-Mutageneseverfahren von Sarkar G. & Sommer S.S. (1990, BioTechniquesl 8, 404-407) und das QuickChange-Verfahren von Papworth et al. (1985 Nucleic. Acids Res. 13:8765-8785).
US 4,760,025 offenbart die Einführung von Oligonucleotiden, die durch Durchführen kleinerer Veränderungen der Kassette mehrere Mutationen codieren. Durch das vorstehend erwähnte Morinage-Verfahren können jedoch zu jeder Zeit sogar mehrere verschiedene Mutationen eingeführt werden, da eine Vielzahl von Oligonucleotiden verschiedener Länge eingeführt werden kann.
Ein anderes Verfahren zum Einführen von Mutationen in Enzym-codierende Nucleotidsequenzen wird in Nelson und Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, S. 147-151) beschrieben. An diesem Verfahren ist die dreistufige Erzeugung eines PCR-Fragments beteiligt, das die gewünschte Mutation, eingeführt durch Verwenden eines chemisch synthetisierten DNA-Strangs als einen der Primer in den PCR-Reaktionen, enthält. Von dem durch PCR erzeugten Fragment kann durch Spaltung mit Restriktionsendonucleasen ein DNA-Fragment isoliert werden, das die Mutation trägt, und erneut in ein Expressionsplasmid inseriert werden.
Weiterhin beschreiben Sierks et al. (Protein Eng (1989) 2, 621-625 und Protein Eng (1990) 3, 193-198) die ortsgerichtete Mutagenese in Aspergillus-Glucoamylase.
Geeigneterweise kann eine Nucleotidsequenz, die entweder eine Lipase codiert (E.C. 3.1.1.3) oder eine lipolytische Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26) codiert, einer ortsgerichteten Mutagenese in der Deckelregion und/oder nahe der aktiven Stelle und/oder am C-Terminus der Aminosäuresequenz unterzogen werden.
Vorzugsweise kann die Nucleotidsequenz, die entweder eine Lipase (E.C. 3.1.1.3), oder eine lipolytische Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26) codiert, einer ortsgerichteten Mutagenese nahe der aktiven Stelle unterzogen werden, um die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche rund um die aktive Stelle zu verändern.
ZUFALLSBESTIMMTE MUTAGENESE
Fehlerbehaftete PCR kann, zum Beispiel unter Verwendung des Diversify^TM-PCR-Random-Mutagenese-Kit von KLONTECH durchgeführt werden.
LOKALISIERTE ZUFALLSBESTIMMTE MUTAGENESE
Ein mutagener Primer (Oligonucleotid) kann synthetisiert werden, der dem Teil der DNA-Sequenz entspricht, der mutagenisiert werden soll, mit Ausnahme des Nucleotids/der Nucleotide, die dem/den Aminosäurecodon(s) entsprechen, das/die mutagenisiert werden soll(en). Der Primer enthält, im 5'- und 3'-Ende, Nucleotide, die der Sequenz entsprechen, die die Sequenz umgibt, die mutagenisiert werden soll. In den Codons, die mutagenisiert werden sollen, werden an jeder Position verschiedene prozentuale Anteile der vier verschiedenen Nucleotide vorhanden sein, wenn man die Möglichkeit annimmt, dass Codons verschiedener Aminosäuren in den ausgewählten Positionen sind, vorliegen.
Im Folgenden können die entstandenen mutagenen Primer in einer PCR-Reaktion mit einem geeigneten gegenüberliegenden Primer verwendet werden. Das entstandene PCR-Fragment kann, eventuell nach zusätzlicher Modifikation, in einen geeigneten Vektor kloniert werden, der den Rest der codierenden Region des Gens von Interesse enthält.
Geeigneterweise kann eine Nucleotidsequenz, die entweder eine Lipase (E.C. 3.1.1.3), oder eine lipolytische Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26) enthält, lokalisierter zufallsbestimmter Mutagenes in der Deckelregion und/oder nahe der aktiven Stelle und/oder am C-Terminus der Aminosäuresequenz unterzogen werden.
Vorzugsweise kann die Nucleotidsequenz, die entweder eine Lipase (E.C. 3.1.1.3), oder eine lipolytische Acylhydrolase (E.C. 3.1.1.26) codiert, lokalisierter zufallsbestimmter Mutagenese nahe der aktiven Stelle unterzogen werden, um die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche um die aktive Stelle zu verändern.
EXPRESSION VON ENZYMEN
Eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym codiert, das die spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, besitzt, kann in einen replizierbaren rekombinanten Vektor eingeschlossen werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleotidsequenz in Enzymform, in und/oder von einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren und zu exprimieren. Die Expression kann unter Verwendung von Kontrollsequenzen kontrolliert werden, die Promotoren/Verstärker und andere, die Expression regulierende Signale umfassen. Prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in eukaryotischen Zellen funktionieren, können verwendet werden. Es können gewebespezifische oder reizspezifische Promotoren verwendet werden. Auch können chimere Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehreren verschiedenen, vorstehend beschriebenen Promotoren umfassen.
Das Enzym, das durch Expression der Nucleotidsequenz von einer rekombinanten Wirtszelle hergestellt wird, kann sezerniert werden, oder es kann in der Zelle verbleiben, abhängig von der verwendeten Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor. Die Codierungssequenz kann mit Signalsequenzen mit direkter Sezernierung der die Substanz codierenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran hergestellt werden.
EXPRESSIONSVEKTOR
Der Begriff „Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das zur in vivo oder in vitro Expression fähig ist.
Vorzugsweise ist der Expressionsvektor in das Genom des Organismus eingeschlossen. Der Begriff „eingeschlossen" umfasst vorzugsweise den stabilen Einschluss in das Genom.
Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein erfindungsgemäßes Konstrukt. Anders ausgedrückt, ist vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, in einem Vektor vorhanden, wobei die Nucleotidsequenz operativ mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, so dass die regulatorischen Sequenzen in der Lage sind, die Expression der Nucleotidsequenz durch einen geeigneten Wirtsorganismus bereitzustellen, d.h., der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können wie nachstehend beschrieben in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, um die Expression eines Polypeptids oder Enzyms bereitzustellen, die die spezifischen Eigenschaften haben, wie hierin definiert. Somit stellt die Erfindung nach einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden für die nachfolgende erfindungsgemäße Verwendung zur Verfügung, das das Züchten einer Wirtszelle umfasst, die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, unter Bedingungen transformiert oder transfiziert wird, die die Expression durch den Vektor einer Codierungssequenz, die die Polypeptide codiert, bereitstellen und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide umfasst.
Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, optional mit einem Promotor für die Expression des Polynucleotids und optional mit einem Regulator des Promotors ausgestattet sind. Die Auswahl des Vektors hängt häufig von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll.
Die Vektoren können ein oder mehrere auswählbare Marker-Gene enthalten. Die am meisten geeigneten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind diejenigen, die durch die Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation im Wirtsorganismus benötigen. Geeignete Selektions-Marker können die dal-Gene von B. subtilis oder B. lichenformis sein, oder eines, das Antibiotikaresistenz, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol-, oder Tetracyclinresistenz verleiht. Alternative Selektionsmarker können die Aspergillus-Selektionsmarker sein, wie amdS, argB, niaD und sC, beziehungsweise ein Marker, der eine Hygromycin-Resistenz hervorruft. Beispiele für andere pilzartige Selektionsmarker sind die Gene für die ATP-Synthetase-, Untereinheit 9 (oliC)-, Orotidin-5'-phosphat-decarboxylase (pvrA)-, Phleomycin- und Benomyl(benA)-Resistenz. Beispiele für nicht pilzartige Selektionsmarker sind das bakterielle G418-Resistenzgen (dies kann auch bei Hefe, jedoch nicht bei filamentösen Pilzen verwendet werden), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus), und das E. coli uidA-Gen, das β-Glucuronidase (GUS) codiert. Weitere geeignete Selektionsmarker umfassen die dal-Gene von B. subtilis oder B. lichenformis. Alternativ kann die Selektion durch Co-Transformation vervollständigt werden (wie in WO91/17243 ) beschrieben.
Vektoren können in vitro verwendet werden, zum Beispiel für die Herstellung von RNA, oder sie können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Somit können Nucleotidsequenzen, die Enzyme codieren, die die spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, haben, in einen rekombinanten Vektor (typischerweise einen replizierbaren Vektor), zum Beispiel einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, eingeschlossen werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Somit stellt die Erfindung, nach einer weiteren Ausführungsform, durch Einführen einer Nucleotidsequenz, die ein derartiges Enzym codiert, in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Vektors mit sich bringen, ein Verfahren zur Herstellung von Nucleotidsequenzen zur Verfügung, die Enzyme mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codieren. Der Vektor kann von der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden nachstehend in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben.
Die Verfahren, die verwendet werden, um ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt, das ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, und die regulatorischen Sequenzen zu ligieren, und sie in geeignete Vektoren zu inserieren, die die für die Replikation notwendige Information enthalten, sind dem Fachmann wohlbekannt (zum Beispiel vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989)).
Der Vektor kann weiterhin eine Nucleotidsequenz umfassen, die es dem Vektor ermöglicht, in der in Frage stehenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für solche Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
REGULATORISCHE SEQUENZEN
Bei einigen Anwendungen kann eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, operativ mit einer regulatorischen Sequenz verbunden sein, die in der Lage ist, die Expression der Nucleotidsequenz, wie zum Beispiel durch die ausgewählte Wirtszelle, bereitzustellen. Über die Beispiele deckt die vorliegende Erfindung einen Vektor ab, der die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, der operativ mit einer solchen regulatorischen Sequenz verbunden ist, d.h., der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff „operabel verknüpft" betrifft eine nebeneinanderliegende Position, wobei die beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die es ihnen ermöglicht, auf ihre beabsichtigte Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die mit einer Codierungssequenz „operabel verknüpft" ist, ist auf eine Weise ligiert, so dass die Expression der Codierungssequenz unter einer Bedingung erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel ist.
Der Begriff „regulatorische Sequenzen" umfasst Promotoren und Verstärker und andere, die Expression regulierende Signale.
Der Begriff „Promotor" wird im normalen Sinn der Technik, z.B. einer RNA-Polymerase-Bindungsstelle verwendet.
Eine verstärkte Expression der Nucleotidsequenz, die das Enzym codiert, das die spezifischen Eigenschaften besitzt, wie hierin definiert, kann auch durch die Auswahl heterologer regulatorischer Regionen erreicht werden, z.B. Promotor, Sekretions-Leader- und Terminatorregionen, die dazu dienen, die Expression und, wenn erwünscht, die Sekretionsmengen des Proteins von Interesse von dem ausgewählten Expressions-Wirt zu erhöhen und/oder die induzierbare Kontrolle der Expression des Enzyms, das die spezifischen Eigenschaften hat wie hierin definiert, bereitzustellen. Bei Eukaryoten können Polyadenylierungssequenzen mit der Nucleotidsequenz, die das Enzym codiert, operabel verknüpft sein.
Die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz kann mindestens mit einem Promotor operabel verknüpft sein.
Abgesehen von den natürlichen Promotoren für das Gen, das die Nucleinsäure codiert, das ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des Enzyms zu steuern. Der Promotor kann hinsichtlich seiner Wirksamkeit bei der Lenkung der Expression der Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung im gewünschten Wirt ausgewählt werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression der gewünschten Nucleotidsequenz zu steuern. Ein solches Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile erbringen, da es die Notwendigkeit umgeht, die Expressionswirte auf einem Medium zu züchten, das ein induzierendes Substrat hat.
Beispiele für streng konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die für die Verwendung in pilzartigen Expressionswirten bevorzugt werden, sind jene, die von den pilzartigen Genen für Xylanase (xInA)-, Phytase-, ATP-Synthetase-, Untereinheit 9 (oliC)-, Triosephosphatisomerase (tpi)-, Alkoholdehydrogenase (AdhA)-, α-Amylase (amy)-, Amyloglucosidase (AG – von dem glaA-Gen)-, Acetamidase (amdS)- und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (gpd)-Promotoren gewonnen werden können. Andere Beispiele für geeignete Beispiele für die Transkription in einem pilzartigen Wirt sind jene, die von dem Gen abstammen, das A. oryzae-TAKA-Amylase, den TPI (Triosephosphatisomerase)-Promotor von S. cerevisiae (Alber et al., (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, S. 419-434), Rhizomucor miehei-Asparaginsäureproteinase, A. niger-neutrale α-Amylase, A. niger-säurestabile α-Amylase A. niger-Glucoamylase, Rhizomucor miehei-Lipase, A. oryzae-Triosephosphatisomerase oder A. nidulans-Acetamidase codiert.
Beispiele für starke Hefe-Promotoren sind diejenigen, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglycerat-Kinase und Triosephosphatisomerase gewonnen werden können.
Beispiele für starke Bakterien-Promotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren sowie Promotoren von extrazellulären Proteasegenen. Beispiele für andere geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der Nucleotidsequenz insbesondere in einem Bakterien-Wirt, sind die Promotoren des lac-Operons von E.coli, die Streptomyces coelicolor-Agarase-Gen dagA-Promotoren, die Promotoren des Bacillus licheniformis α-Amylasegens (amyL), die Promotoren des maltogenen Amylasegens von Bacillus stearothermophilus (amyM), die Promotoren der Bacillus amyloliquefaciens α-Amylase-(amyQ), die Promotoren der Bacillus subtilis xylA- und xylB-Gene.
Auch Hybrid-Promotoren können verwendet werden, um die induzierbare Regulierung des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Der Promotor kann zusätzlich Merkmale einschließen, um die Expression in einem geeigneten Wirt sicherzustellen. Die Merkmale können zum Beispiel konservierte Regionen wie die Pribnow-Box oder eine TATA-Box sein. Der Promotor kann sogar noch andere Sequenzen enthalten, um die Expressionsmengen der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz zu beeinträchtigen (zum Beispiel zu erhalten, zu verstärken, zu verringern). Andere geeignete Sequenzen umfassen zum Beispiel das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron. Andere Sequenzen umfassen induzierbare Elemente – wie die Temperatur, chemische, durch Licht oder Stress induzierbare Elemente. Es können auch geeignete Elemente vorhanden sein, um die Transkription oder die Translation zu verstärken. Ein Beispiel für das letztere Element ist die TMV 5'-Signalsequenz (vgl. Sleat, 1987, Gene 217, 217-225 und Dawson, 1993, Plant Mol. Biol. 23:97).
KONSTRUKTE
Der Begriff „Konstrukt" – der zu Begriffen wie „Konjugat", „Kassette" und „Hybrid" synonym ist – umfasst eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, zur Verwendung, gemäß der vorliegenden Erfindung, direkt oder indirekt verknüpft mit einem Promotor. Ein Beispiel für eine indirekte Verknüpfung ist die Bereitstellung einer geeigneten Spacer-Gruppe, wie einer Intronsequenz, wie dem Sh1-Intron oder dem ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz. Dasselbe gilt für den Begriff „fusioniert" in Bezug auf die vorliegende Erfindung, der direkte oder indirekte Verknüpfung umfasst. In einigen Fällen decken die Begriffe die natürliche Kombination der Nucleotidsequenz, die das Protein codiert, das normalerweise mit dem Gen-Promotor des Wildtyps in Verbindung steht, und wenn beide in ihrer natürlichen Umgebung sind, nicht ab.
Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, der die Selektion des genetischen Konstrukts zum Beispiel in einem Bakterium, vorzugsweise der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis, oder Pflanzen, in die es übergeführt wurde, gewährleistet. Es gibt verschiedene Marker, die verwendet werden können, wie zum Beispiel jene, die Mannose-6-phosphatisomerase (insbesondere für Pflanzen) codieren, oder jene Marker, die eine Antibiotikaresistenz verleihen – z.B. Resistenz gegen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
Für einige Anwendungen umfasst das Konstrukt vorzugsweise mindestens eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, und operabel an einen Promotor angeheftet ist.
WIRTSZELLEN
Der Begriff „Wirtszellen" – umfasst in Bezug auf die vorliegende Erfindung jede Zelle, die entweder eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, oder einen wie vorstehend beschriebenen Expressionsvektor umfasst, und die bei der rekombinanten Herstellung eines Enzyms mit den spezifischen, hierin definierten Eigenschaften verwendet wird.
Somit stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Wirtszellen zur Verfügung, die mit einer Nucleotidsequenz transformiert oder transfiziert sind, die ein Enzym mit den spezifischen, hierin definierten Eigenschaften exprimiert. Vorzugsweise wird die Nucleotidsequenz in einem Vektor zur Replikation und Expression der Nucleotidsequenz getragen. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können zum Beispiel prokaryotische (zum Beispiel bakterielle), Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
Das gram-negative Bakterium E. coli wird häufig als Wirt für die heterologe Genexpression verwendet. Jedoch tendieren große Mengen an heterologem Protein dazu, in der Zelle zu akkumulieren. Die spätere Aufreinigung des gewünschten Proteins aus der Masse an intrazellulären E. coli-Proteinen kann häufig schwierig sein.
Im Gegensatz zu E. coli können gram-positive Bakterien der Gattung Bacillus, wie B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, B. thuringiensis, Streptomyces lividans oder S. murinus auf Grund ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sezernieren, als heterologe Wirte sehr geeignet sein. Andere Bakterien, die als Wirte geeignet sein können, sind jene der Gattungen Pseudomonas.
Abhängig von den Eigenschaften der Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, und/oder dem Wunsch, das exprimierte Protein weiter zu prozessieren, können eukaryotische Wirte wie Hefen oder andere Pilze bevorzugt werden. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch entweder von der Hefezelle kaum sezerniert, oder in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Beispielen sollte ein anderer pilzartiger Wirtsorganismus ausgewählt werden.
Geeignete Hefe-Organismen können aus den Arten von Kluyveromyces, Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Hansenula ausgewählt werden (offenbart in der Patentanmeldung des VK Nr. 9927801.2).
Ein geeigneter filamentöser Pilz kann zum Beispiel ein Stamm sein, der zu einer Art von Aspergillus gehört, wie zum Beispiel Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, oder ein Stramm von Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (im ausgebildeten Zustand Gibberella zeae, früher Sphaeria zeae, synonym mit Gibberella roseum und Gibberella roseum f. sp. cerealis genannt), oder Fusarium sulphureum (im ausgebildeten Zustand Gibberella puricaris, synonym mit Fusarium trichothercioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum und Fusarium roseum var. graminearium genannt), Fusarium cerealis (synonym mit Fusarium crokkwellnse) oder Fusarium venenatum.
Über Beispiele können typische Expressionswirte von Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus otyzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacullus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae und Hansenula polymorpha ausgewählt werden.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen – wie Hefe-, Pilz- und Pflanzenzellen – können posttranslationale Modifikation zur Verfügung stellen (z.B. Myristoylierung, Glykosylierung, Trunkierung, Lapidation und Tyrosin-, Serin-, oder Threonin-Phosphorylierung), wie benötigt wird, um den rekombinanten Expressionsprodukten der vorliegenden Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen.
Die Wirtszelle kann ein Protease-Mangel- oder ein Protease-Minus-Stamm sein. Es kann zum Beispiel der Protease-Mangel-Stamm Aspergillus oryzae JaL 125 sein, bei dem das alkalische Proteasegen, „alp" genannt, deletiert ist. Dieser Stamm wird in WO97/35956 beschrieben.
ORGANISMEN
Der Begriff „Organismus" umfasst in Bezug auf die vorliegende Erfindung jeden Organismus, der eine Nucleotidsequenz umfassen kann, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert und/oder Produkte, die davon gewonnen werden.
Geeignete Organismen können einen Prokaryonten, einen Pilz, eine Hefe oder eine Pflanze umfassen.
Der Begriff „transgener Organismus" umfasst in Bezug auf die vorliegende Erfindung jeden Organismus, der eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen, hierin definierten Eigenschaften codiert, und/oder die erhaltenen Produkte davon umfasst, und/oder worin ein Promotor die Expression der Nucleotidsequenz, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, in dem Organismus gewährleisten kann. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz in dem Genom des Organismus eingeschlossen.
Der Begriff „transgener Organismus" deckt native Nucleotid-Codierungssequenzen in ihrer natürlichen Umgebung nicht ab, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors sind, der sich ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung befindet.
Deshalb umfasst der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus, der jede Nucleotidsequenz, oder Kombinationen davon, die ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert, Konstrukte wie hierin definiert, Vektoren, wie hierin definiert, Plasmide, wie hierin definiert, Zellen, wie hierin definiert, oder die Produkte davon umfasst. Zum Beispiel kann der transgene Organismus auch eine Nucleotidsequenz umfassen, die, unter der Kontrolle eines heterologen Promotors, ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, codiert.
TRANSFORMATION VON WIRTSZELLEN/ORGANISMEN
Wie früher erwähnt, kann der Wirtsorganismus ein prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryontische Wirte umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Informationen über die Transformation von prokaryontischen Wirten sind auf dem Fachgebiet gut dokumentiert, vgl. zum Beispiel Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Wenn ein prokaryontischer Wirt verwendet wird, kann es notwendig sein, dass die Nucleotidsequenz vor der Transformation auf geeignete Weise modifiziert wird – zum Beispiel durch Entfernen der Introns.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus eine Hefe sein. Diesbezüglich wurde Hefe häufig als Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet. Die Art Saccharomyces cerevisiae besitzt in der industriellen Verwendung eine lange Geschichte, einschließlich ihrer Verwendung bei der heterologen Genexpression. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae wurde durch Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., Hrsg., S. 401-429, Allen und Unwin, London) und durch King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Hrsg., S. 107-133, Blackie, Glasgow) rezensiert.
Aus verschiedenen Gründen passt Saccharomyces cerevisiae für die heterologe Genexpression gut. Erstens ist sie für Menschen nicht pathogen und nicht in der Lage, bestimmte Endotoxinde herzustellen. Zweitens hat sie durch Jahrhunderte der kommerziellen Ausnutzung zu verschiedenen Zwecken eine lange Geschichte der sicheren Verwendung. Dieses führte zur weitgehenden öffentlichen Akzeptanz. Drittens ergab die extensive kommerzielle Verwendung und Forschung, die auf den Organismus verwandt wurde, eine Vielfalt an Wissen über die Genetik und Physiologie sowie Fermentationseigenschaften im großen Maßstab von Saccharomyces cerevisiae.
Eine Rezension der Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sezernierung der Genprodukte wird in E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Band 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, Hrsg., 2. Ausgabe, Academic Press Ltd.) zur Verfügung gestellt.
Verschiedene Typen von Hefevektoren sind erhältlich, einschließlich integrativer Vektoren, die hinsichtlich ihrer Aufrechterhaltung die Rekombination mit dem Wirtsgenom benötigen, und autonom Plasmidvektoren replizieren.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen, werden durch Einfügen der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz in ein Konstrukt, das für die Expression in Hefe hergestellt wurde, Expressionskonstrukte hergestellt. Verschiedene Typen von Konstrukten, die für die heterologe Expression verwendet werden, wurden entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen Promotor, der in Hefe aktiv ist, der mit der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz fusioniert ist, in der Regel wird ein Promotor, der aus Hefe stammt, wie der GAL1-Promotor, verwendet. Normalerweise wird eine Signalsequenz, die aus Hefe stammt, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein Terminator, der in Hefe aktiv ist, beendet das Expressionssystem.
Für die Transformation von Hefe wurden verschiedene Transformations-Protokolle entwickelt. Zum Beispiel kann eine transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung durch Folgen der Instruktionen von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J.D. (1978), Nature, London, 275, 104); und Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168) hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker ausgewählt. Unter den Markern, die für die Transformation verwendet werden, sind einige auxotrophe Marker wie LEU2, HIS4 und TRP1, sowie dominante Antibiotikaresistenz-Marker wie antibiotische Aminoglycosid-Marker, z. B. G418.
Filamentöse Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, bei dem die Protoplasten-Bildung und die Transformation der Protoplasten nach Regeneration der Zellwand auf bekannte Weise beteiligt ist. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus wird in EP 0 238 023 beschrieben.
Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanzen. Das Grundprinzip bei der Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen ist das Einfügen von genetischer Information in das Pflanzengenom, um eine stabile Aufrechterhaltung des inserierten genetischen Materials zu erhalten. Es gibt mehrere Verfahren zum Einfügen der genetischen Information, wobei die beiden Hauptprinzipien die direkte Einführung der genetischen Information und die Einführung der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Ein Rückblick der allgemeinen Verfahren ist in Artikeln von Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. [1991], 42:205-225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, März/April 1994, 17-27) zu finden. Weitere Informationen über Transformation bei Pflanzen ist in EP-A-0449375 zu finden.
Wirtszellen, die mit der Nucleotidsequenz transformiert sind, können unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Produktion des codierten Systems förderlich sind und die die Gewinnung des Enzyms von den Zellen und/oder dem Kulturmedium erleichtern.
Das Medium, das verwendet wurde, um die Zellen zu züchten, kann jedes herkömmliche Medium sein, das zum Züchten der betreffenden Wirtszelle, und zum Erhalten einer Expression des Enzyms geeignet ist. Geeignete Medien sind im Handel erhältlich, oder sie können nach veröffentlichten Rezepten hergestellt werden (z.B. wie in Katalogen der American Type Culture Collection beschrieben).
Das Protein, das durch eine rekombinante Zelle hergestellt wird, kann auf der Oberfläche der Zelle gezeigt werden. Wenn gewünscht und wie vom Fachmann zu verstehen sein wird, können Expressionsvektoren, die Codierungssequenzen enthalten, mit Signalsequenzen hergestellt werde, die die Sezernieung der Codierungssequenz durch eine bestimmte prokaryontische oder eukaryontische Zellmembran lenkt. Andere rekombinante Konstruktionen können die Codierungssequenz mit einer Nucleotidsequenz verbinden, die eine Polypeptid-Domäne codiert, die die Reinigung löslicher Proteine erleichtern wird (Kroll, D.J. et al. (1993), DNA Cell Biol. 12:441-53).
Das Enzym kann von den Wirtszellen sezerniert werden und kann praktischerweise durch wohlbekannte Verfahren, einschließlich dem Trennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, und Präzipitieren proteinischer Bestandteile von dem Medium durch Salz wie Ammoniumsulfat, von dem Kulturmedium gewonnen werden, gefolgt von der Verwendung von Chromatographieverfahren wie Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, oder Ähnlichem.
SEKRETION
Häufig ist es wünschenswert, dass das Enzym von dem Expressionswirt in das Kulturmedium sezerniert wird, von wo aus das Enzym leichter gewonnen werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Leader-Sequenzen der Sekretion auf Basis des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Hybrid-Signalsequenzen können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Typische Beispiele für heterologe Sekretions-Leader-Sequenzen sind jene, die vom Pilz-Amyloglucosidase (AG)-Gen(glaA – sowohl die 18 als auch die 24 Aminosäureversion, z.B. von Aspergillus), dem a-Faktor-Gen (Hefen, z.B. Saccharomyces, Kluveromyces und Hansenula), oder dem α-Amylasegen (Bacillus) abstammen.
FUSIONSPROTEINE
Ein Enzym mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, kann als Fusionsprotein, zum Beispiel um dessen Extraktion und Reinigung zu unterstützen, hergestellt werden. Beispiele für Partner von Fusionsproteinen umfassen Glutathion-S-transferase (GST), 6×His, GAL4 (DNA-Bindungs- oder Transkriptions-Aktivierungs-Domänen) und β-Galaktosidase. Es kann auch praktisch sein, eine proteolytische Spaltungsstelle zwischen den Fusionsprotein-Partnern und der Proteinsequenz von Interesse einzuschließen, um die Entfernung von Fusionsprotein-Sequenzen zu gewährleisten. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität der Proteinsequenz nicht beeinträchtigen.
Das Fusionsprotein kann ein Antigen oder eine antigenische Determinante umfassen, die mit dem Enzym fusioniert ist. In dieser Ausführungsform kann das Fusionsprotein ein nicht-natürlich vorkommendes Fusionsprotein sein, das eine Substanz enthält, die als Adjuvans in dem Sinne wirken kann, dass es eine allgemeine Stimulation des Immunsystems bereitstellt. Das Antigen oder die antigenische Determinante kann entweder am Amino- oder am Carboxylende des Enzyms angeheftet sein.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Aminosäuresequenz eines Enzyms mit den spezifischen Eigenschaften, wie hierin definiert, mit einer heterologen Sequenz ligiert sein, um ein Fusionsprotein zu codieren.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung kann nun, lediglich über Beispiele, beschrieben werden, worin auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird:
1, die ein natives PAGE-Gel zeigt;
2, die ein Galactolipid (DGDG)-Zymogramm zeigt;
3, die ein SDS-PAGE-Gel zeigt;
4, die eine Graphik der Wirkung von Augenbohnen-LAH 1 in Teig zeigt;
5, die eine Graphik der HPLC-Analyse von Galactolipiden in Teig zeigt, der mit Augenbohnen-LAH behandelt wurde;
6, die eine Graphik der HPLC-Analyse von Phospholipiden in Teig zeigt, der mit Augenbohnen-LAH behandelt wurde;
7, die eine Graphik einer GLC-Analyse unpolarer Lipide in Teig zeigt, der mit Augenbohnen-LAH behandelt wurde;
8, die eine Fotografie von Minibroten zeigt, wobei bei Laib 142 % Sojaöl und bei Laib 15 2 % Sojaöl + 1,07 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH zugegeben worden war;
9, die eine Fotografie von Minibroten zeigt, wobei Laib 9 die Kontrolle ist; bei Laib 10 waren 1,07 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH zugegeben worden; bei Laib 11 waren 1,07 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH + 0,1 % Galactolipid zugegeben; bei Laib 12 waren 1,07 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH + 0,2 % Galactolipid zugegeben; und bei Laib 13 waren 1,07 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH + 0,4 % Galactolipid zugegeben;
10, die eine Fotografie von Minibroten zeigt, wobei Laib 1 die Kontrolle ist; bei Laib 2 war 0,4 % DGDG zugegeben; bei Laib 3 waren 0,4 % DGDG + 0,4 Einheiten/g Augenbohnen-LAH zugegeben; und bei Laib 4 waren 0,4 Einheiten/g Augenbohnen-LAH zugegeben;
11, die einen Expressionsvektor zeigt, der von pYES2 abstammt. Der Gal1-Promotor von pYES2 wurde entfernt und durch den konstitutiven ADH-Promotor ersetzt. LipA wurde durch Rekombination in vivo in Saccharomyces cerevisiae eingeschlossen. Abkürzungen: Amp, Ampicillin-resistentes Gen; ADH3'-Alkoholdehydrogenase 3'-Region; ADHp, Alkoholdehydrogenase-Gen-Promotor; bps, Basenpaare; CYCI, Transkriptions-Terminator; f1 ori, f1-Ursprung; Gal1p, Galactosegen-Promotor; LipA, Lipasegen von Aspergillus tubigensis; MCS, multiple Klonierungsstelle; pMB1 ori, von pUC abgeleitenden Ursprungs, ura3, Gen, das Uracil codiert; 2μ ori, 2μ Ursprung;
12, die ein Maldi-TOF-Profil von dem lipolytischen Acylhydrolase-Enzym von Augenbohnen zeigt, das unter Verwendung des hierin ausgeführten Verfahrens identifiziert wurde; und
13, die ein Peptidprofil für VUPAT 1 (Matos et al., FEBS Letters 491 (2001) 188-192) zeigt.
Material und Methoden
Enzyme:

Gereinigte Augenbohnen-Lipid-Acylhydrolase (LAH)
Isolierte membrangebundene Galactolipase aus Weizenthylakoiden

Mehl:

Dänisches Mehl ,Sølvmel' Nr. 2001084

Substrat:

Digalaktosyldiglycerid, DGDG (55 % rein), Charge KGL01013 von Lipid Technologies Provider, Karlshamn, Schweden.

Verfahren
Lypolytisches Augenbohnen-Acylhydrolase-Enzym (E.C. 3.1.1.26)
Pflanzenmaterial
Eine lipolytische Acylhydrolase (LAH), die in der Lage ist, ein Glycolipid und ein Phospholipid zu hydrolysieren, jedoch unfähig, oder im Wesentlichen unfähig ist, ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid zu hydrolysieren, wurde aus Augenbohnen isoliert. Die lipolytischen Acylhydrolasen wurden durch ein Verfahren erhalten, das auf dem bei Sahsah et al. (Biochimica et Biophysika Acta 1215 (1994) 66-73) beschriebenen Verfahren beruhte. Ein alternatives geeignetes Verfahren kann dasjenige sein, das bei Matos et al. (FEBS Letters 491 (2001) 188-192) beschrieben ist.
Augenbohnen wurden aus Morelos, Mexiko, bezogen. Die Pflanzen wurden auf Leca-Steinen gezüchtet und mit einer mineralischen Nährstofflösung nach Ellfolk, Biochim. Biophys. Acta 192 (1969), 486-493 (angereichert mit 6 mM Kaliumnitrat) in einer Wachstumskammer, in Gefäßen mit Ausmaßen von 35 × 50 cm (etwa 50 Pflanzen in jedem Gefäß) unter Temperatur- und lichtkontrollierten Bedingungen (16 Stunden Tageslicht bei 22 °C und 8 Stunden Dunkelheit bei 18 °C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 72 % gewässert. Die Blätter wurden nach 21 Tagen Züchtung geerntet. Zum Erntezeitpunkt hatten die Pflanzen 4-7 voll ausgedehnte reife Blätter und 3-8 junge Blätter.
Extraktion von lipolytischem Acylhydrolase-Enzym aus den Blättern
215 g frische Blätter, gefroren in Flüssigstickstoff, wurden in einem Industriemixer homogenisiert und in 500 ml 5 mM TRIS-Puffer (pH-Wert 7,0), unter Verwendung eines Industriemixers (3-minütiges Mischen) extrahiert. Die unlöslichen Materialien wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 15000 g entfernt. Der entstandene Überstand wurde schließlich durch einen Filter von 0,45 μm filtriert (605 ml Rohüberstand wurden aufgefangen).
Reinigung der lipolytischen Acylhydrolasen-Enzyme
Schritt 1. Ultrafiltration
Dieser Schritt wurde unter Verwendung einer Amicon Ultrafiltrationseinheit von 50 kDa ausgeführt. 122 ml konzentrierter Rohextrakt wurde aufgefangen.
Schritt 2. Ammoniumsulfat-Präzipitation
Festes Ammoniumsulfat (68,5 g) wurde zu einer Endkonzentration von 80 % Sättigung zu dem Rohextrakt zugegeben. Man ließ das Gemisch 60 Minuten bei Raumtemperatur (25 °C) durchrühren. Das präzipitierte Protein wurde durch Zentrifugation bei 15000 g 20 Minuten lang aufgefangen. Der Niederschlag wurde in 30 ml 20 mM TEA-Puffer (pH-Wert 7,3) erneut gelöst. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 15000 über 20 Minuten entfernt.
Schritt 3. Entsalzen (GFC)
Der Überstand wurde auf einer Sephadex G-25-Säule (5 × 25 cm, Pharmacia, Schweden), die mit 20 mM TEA (pH-Wert 7,3) bei einer Durchflussrate von 15 ml/min äquilibriert war, entsalzt. Die Fraktionen, die Galaktolipase-Aktivität enthielten (Protein-Peak), wurden vereinigt (100 ml).
Schritt 4. Ionenaustauscherchromatographie (IEC)
Die entsalzene Probe wurde dann auf eine Q-Sepharose Fast Flow (5 × 6 cm, Pharmacia, Schweden) aufgebracht, die mit 20 mM TEA (pH-Wert 7,3) bei einer Durchflussrate von 16 ml/min äquilibriert war. Um die ungebundenen Protein zu entfernen, wurde die Säule mit 250 ml desselben Puffers gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden durch einen linearen Gradienten von 0-0,6 M NaCl in demselben Puffer eluiert. Fraktionen von 16 ml wurden aufgefangen und auf Galaktolipase-Aktivität getestet. Die Fraktionen, die Galaktolipase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt (128 ml).
Schritt 5. Ultrafiltration
Dieser Schritt wurde wie in Schritt 1 beschrieben ausgeführt.
Eine entsalzene/aufkonzentrierte Probe von 16 ml wurde aufgefangen (V_max: 5,6 mOD/min oder 0,010 U/ml).
Die Backversuche wurden mit einer Probe aus diesem Schritt durchgeführt.
Schritt 6. Ionenaustauschchromatographie (IEC)
Die entsalzene/aufkonzentrierte Probe (11 ml) wurde dann auf eine Poros Q10 (0,5 × 5 cm, Applied Biosystem, USA), die mit demselben Puffer wie in Schritt 4 verwendet, äquilibriert war, bei einer Durchflussrate von 1,5 ml/Minute aufgebracht. Die gebundenen Proteine wurden durch einen lineraren Gradienten von 0-0,65 M NaCl in demselben Puffer eluiert. Fraktionen von 1,5 ml wurden aufgefangen und auf Galaktolipase-Aktivität getestet. Die Fraktionen, die Galaktolipase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt (6 ml).
Charakterisierung von lipolytischem Augenbohnen-Acylhydrolase-Enzym
SOS-PAGE-Analysis, Bestimmung von Reinheit und Molekulargewicht:
Gereinigte lipolytische Acylhydrolase von IEC (Schritt 6) wurde auf ein Gel (NU-PAGE, 4-12 %, MES-Puffer, Novex, USA) aufgebracht, und das Gel wurde dann Coomassie-gefärbt. Das Gel zeigte das Vorhandensein mehrerer Bande (vgl. 1). Versuche, die lipolytische Acylhydrolase unter Verwendung verschiedener Chromatographie-Verfahren wie Gelfiltrations-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Chromatofocusing etc., weiter aufzureinigen, verbesserten die Reinheit der lipolytischen Acylhydrolase nicht.
Bestimmung des Molekulargewichts und Elektro-Elution der lipolytischen Acylhydrolase nach nativer PAGE.
Lipolytische Acylhydrolase wurde nach Sahsah et al. (Biochem Biophys Acta, 1215 (1994), 66-73) aus Augenbohnen (Vigna unguiculata) aufgereinigt. Durch Diffusion eluierte lipolytische Acylhydrolase wurde dann einem SDS-PAGE-Gel unterzogen. Das Gel war Coomassie-gefärbt. Dieses Gel zeigte 2 Hauptbande bei 57 und 84 kDa (vgl. 3).
Diese Herstellung wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls einer Trypsin-Spaltung unterzogen:

1. Zugabe von 50 μl 8M Harnstoff in 0,4 M Ammonium-Bicarbonat-Puffer, pH-Wert 8,1 (24,04 g Harnstoff, 1,581 g Ammonium-Bicarbonat pro 50 ml)
2. Überlagern mit Stickstoff und Inkubieren bei 50 °C über 5 Minuten
3. Zugabe von 5 μl 50 mM DTT (8 mg/ml Wasser)
4. Gut Vermischen, Überlagern mit Stickstoff und Inkubieren bei 50 °C über 5 Minuten
5. Abkühlen auf Raumtemperatur
6. Zugabe von 5 μl 100 mM Jodacetamid (19 mg/ml Wasser)
7. Gut Vermischen, Überlagern mit Stickstoff und Inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur über 15 Minuten
8. Zugabe von 140 μl Wasser, gut Vermischen und Zugabe von Trypsin in einer Konzentration von 1:25 (Trypsin wird bei –20 °C in einer Konzentration von 1 μg/ml in 0,1 % TFA gelagert).
9. Überlagern mit Stickstoff und Inkubieren über Nacht bei 37 °C
10. Beenden der Reaktion durch Einfrieren bei –20 °C.
11. Gewinnen der Peptide durch R.P.-Phasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule

Nach der Spaltung folgt ein Peptid-Screening unter Verwendung von ZipTip^TM C18 Entsalzungs-Tips:

A. Anfeuchten des Tips durch Absaugen in 4 × 10 μl Methanol.
B. Äquilibrieren des Tips durch Waschen in 5 × 10 μl mit 0,1 % TFA in Wasser.
C. Binden der Peptide durch 20× Absaugen in der Proteinspaltungs-Lösung.
D. Entfernen der Salze durch Waschen mit 10 × 10 μl 0,1 % T.F.A. in Wasser
E. Eluieren der Peptide direkt auf einer Maldi-TOF-Zielplatte mit 2μl einer α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure von 10 mg/ml in 0,1 % T.F.A. in 60 % Acetonitril/Wasser.
F. Bestimmen des Molekulargewichts der Peptide unter Verwendung eines Voyage DE Maldi-TOF-Massenspektrometers.

Die Ergebnisse der Maldi-TOF-Analyse sind in 12 dargestellt.
Ein Vergleich zwischen dem theroretischen Peptid-Profil (vgl. 13) für VUPAT 1 (wie in Matos et al., FEBS Letters 491 (2001), 188-192 vorgestellt) und dem experimentell erhaltenen Peptidprofil für die lypolytische Acylhydrolase von Augenbohnen, das hierin erhalten wurde, zeigt, dass die hierin aufgereinigte lypolytische Acylhydrolase ein anderes Protein ist als das in Matos et al. vorgestellte. Dies wird auch durch die Molekulargewichte bestätigt, die durch SDS-PAGE bestimmt wurden. In dieser Untersuchung wird ein Molekulargewicht von 57 und 84 kDA bestimmt, im Gegensatz zu einem Molekulargewicht von 40 kDa, das von Sahsah et al. berichtet wurde.
Eine membrangebundene lypolytische Acylhydrolase von Thylakoiden aus Weizenblättern
Pflanzenmaterial
Weizen (Herward) wurde von Pajbjergfonden, Odder, Dänemark, bezogen. Die Weizenkörner wurden auf Papier bei 25C °C gezüchtet und regelmäßig bewässert. Nach einer Woche wurden die Weizenkörner geerntet.
Homogenisierungspuffer:
50 mM HEPES, 350 mM Sorbitol, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂ aus 1 mM DTT, pH-Wert 8,3/NaOH). Der Puffer wurde vor der Verwendung auf Eis gehalten.
Extraktion von membrangebundener lypolytischer Acylhydrolase
26 g Weizenblätter wurden in kleine Stücke (1/2 cm) geschnitten. 78 ml eiskalter Homogenisierungspuffer wurde zugegeben. Die Blätter wurden in einem Ultra Turrax Hochgeschwindigkeitsmixer 12 Sekunden homogenisiert.
Die großen Partikel wurden durch Filtration durch 3 Schichten von Kleenex-Tüchern entfernt. Das Filtrat wurde bei 250 g über 1 Minute zentrifugiert und der Überstand wurde isoliert.
Die Chloroplasten wurden durch Zentrifugation über 5 Minuten bei 1000 g isoliert. Die Pellets (einschließlich membrangebundener lypolytischer Acylhydrolase) wurden in 1 ml Homogenisierungspuffer erneut suspendiert (die mikroskopische Analyse zeigte deutlich die Chloroplasten).
Die Pellets wurden zum Testen im Weizen-Modellteig-System verwendet.
Miniatur-Backtest
Folgende Zutaten wurden einer Grabender-Mischschüssel von 50 g zugegeben und 5 Minuten bei 30 °C geknetet: 50 g Mehl, 1,0 g Trockenhefe, 0,8 g Zucker, 0,8 g Salz, 70 ppm Ascorbinsäure und Wasser (für eine Teigkonsistenz von 400 Grabender-Einheiten). Die Ruhezeit betrug 10 Minuten bei 34 °C. Der Teig wurde in 15 g pro Teig eingeteilt. Dann auf einem speziellen Gerät geformt, wobei der Teig zwischen einer Holzplatte und einem Plexiglasrahmen ausgerollt wurde. Die Teige ließ man 45 Minuten bei 34 °C auf Blechen gären, und sie wurden in einem Voss-Haushaltsherd bei 225 °C 8 min gebacken.
Nach dem Backen wurden die Brote auf Umgebungstemperatur abgekühlt und nach 20 min wurden die Brote gemessen und das Volumen wurde durch das Rapssamen-Auslenkungsverfahren bestimmt.
Die Brote wurden auch geschnitten und Krume und Kruste bewertet.
Modellteig
10 g Mehl und 0,020 g Natriumchlorid wurden in einer Farinograph-Mischschüssel von 10 g entweder mit oder ohne Enzyme 1 Minute geknetet. Daraufhin wurde Wasser (500 Brabender-Einheiten) zugegeben und 5 Minuten bei 30 °C vermischt. Nach dem Mischen wurde der Teig 1 Stunde 32 °C ausgesetzt und dann, vor der weiteren Analyse, eingefroren und gefriergetrocknet.
Backtests (Dänische Röllchen)
1500 g Mehl, Danish Reform, 90 g gepresste Hefe, 24 g Zucker, 24 g Salz, 400 Brabender-Einheiten + 2 % Wasser wurden in einem Hobart^TM-Mixer mit Haken 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und 9 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Die Teigtemperatur betrug 26 °C. Der Teig wurde auf 1350 g abgewogen, 10 min bei 30 °C ruhen gelassen und auf einer Fortuna Form geformt. Man ließ den Teig 45 min bei 34 °C gären. Der Teig wurde 18 min bei 220 °C in einem Bago-Herd gebacken und 12 s bedampft.
Nach dem Abkühlen wurden die Röllchen gemessen, und das Volumen der Röllchen wurde durch das Rapssamen-Verdrängungsverfahren gemessen.
Spezifisches Brotvolumen

Spezifisches Volumen = Volumen des Brots, ml/Gewicht des Brots, g

Auch die Qualitätsparameter des Teigs wurden bewertet.

Teig-Elastizität 1-10
Klebrigkeit 1-10

Backtests (Toastbrot)
2000 g Mehl, Danish Reform, 30 g Trockenhefe, 30 g Zucker, 30 g Salz, 400 Brabender-Einheiten + 3 % Wasser wurden in einem Hobart^TM-Mixer mit Haken 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und 10 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Die Teigtemperatur betrug nach dem Mischen 25 °C. Die Ruhezeit betrug 10 min bei 30 °C. Der Teig wurde auf 750 g pro Teig eingeteilt. Dann wurde er wiederum 5 min bei 33 °C und 85 % RH ruhen gelassen. Der Teig wurde auf einer Glimik Form geformt. Die Teige ließ man 50 min bei 33 °C in Blechen gären, und sie wurden 40 min bei 220 °C in einem Bago-Herd, mit einer Dampfinjektion von 16 s gebacken.
Nach dem Abkühlen wurden die Brote gemessen und das Volumen der Brote wurde durch das Rapssamen-Auslenkungs-Verfahren gemessen.
Auch die Krume wurde subjektiv auf einer Skala von 1 bis 10 bewertet, wobei 1 = grob-homogen und 10 = gut-homogen war.
Drei Brote, die in Blechen mit Deckeln gebacken wurden, wurden bei 20 °C gelagert und zu Festigkeitsmessungen verwendet.
Festigkeit
Die Festigkeit des Brots wurde auf einem Instron^TM M Modell 4301, das mit einem Computer verbunden war, gemessen.
Bedingungen für die Messung der Brot-Festigkeit:

Ladungszelle max. 100 N
Kolbendurchmesser 50 mm
Traversengeschwindigkeit 200 mm/min
Kompression 25 %
Brotscheibendicke 11 mm

Die Kraft wird in N/dm² umgewandelt.
Das Ergebnis der Messung lag durchschnittlich bei 10 Brotscheiben für jedes Brot.
Lipidextraktion und Fettsäureanalysen
10 g völlig gegärten Teigs wurden sofort eingefroren und gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Teig wurde in einer Kaffeemühle gemahlen und durch eine Leinwand von 800 Mikrons passiert. 1,5 g gefriergetrockneter Teig wurde in einer Zentrifugenröhre von 15 ml mit einem Schraubdeckel am oberen Ende gemessen. 7,5 ml mit Wasser gesättigtes Butanol (WSB) wurde zugegeben. Die Zentrifugenröhre wurde für 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad platziert. Die Röhren wurden in einen Rotamix platziert und bei 45 Upm 20 Minuten lang bei Umgebungstemperatur rotiert, und dann wiederum für weitere 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad platziert, bevor sie weitere 30 Minuten bei Umgebungstemperatur auf dem Rotamix rotiert wurden. Die Röhren wurden 5 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. 5 ml Überstand wurde in ein Gefäß übergeführt und das WSB wurde unter Stickstoffdampf bis zur Trockenheit evaporiert.
Die freien Fettsäuren im Extrakt wurden in Isooctan als Cu-Salze analysiert, bei 715 nm gemessen und gemäß einer Kalibirierungskurve basierend auf Oleinsäure quantifiziert (Kwon D.Y. und Rhee J.S. (1986), A simple and rapid Colourimetric Method for Determination of Free Fatty Acids for Lipase Assay, JAOCS 63:89).
Bestimmung von Glycolipiden und Phospholipiden durch HPLC.

1. Chromatographiebedingungen

System	Waters 600
Säule	(LiChrospher^® 100 DIOL 5μm) LiChroCART^®			L × D: 250*4.0 mm id.		Temp: 50°C
Injector	Waters 717plus Autosampler					Voll: 15 μl
Detector	Alltech 500 ELSD, evaporative Lichtstreuung					Temp: 80°C Gasfluss: 1.50 L/min m/MFC
Integrator	Waters Millennium
mobile Phase	A: 1000 Heptan/15 CH₃COOH B: 500 Heptan/500 Isopropanol/15 CH₃COOH C: 300 Heptan/500 Isopropanol/100 H₂O/15 CH₃COOH					Fluss: 1.25 ml/min Druck: 1000-2500 psi
Gradient	Fluss	Zeit (min)	% A	% B	% C	Anmerkungen
	1.25	0	100	0	0
	1.25	10	60	40	0
	1.25	25	20	30	50
	1.25	35	0	0	100
	1.25	38	0	90	10
	1.25	40	30	70	0
	1.25	45	100	0	0
	125	55	100	0	0	Neuinjektion

2. Ausgangslösung
ILPS*-Standard wurde in CHCl₃/CH₃OH (75/25) ~ 2 mg/ml PC gelöst
Verdünnung der Ausgangslösung: 0,7, 0,14, 0,028,

*Phosphatidinsäure PA 5,13 %

Phosphatidylethanolamin PE 12,74 %

Phosphatidylcholin PC 14,76 %

Phosphatidylinositol PI 10,13 %

* Der ILPS (International Lecithin and Phospholipid Society)-Standard wird vom Spectral Sevice GmbH Köln, Deutschland, erhalten.

3. Probenherstellung
Die Proben wurden in CHCl₃/CH₃OH (75/25) gelöst, mit Ultraschall behandelt und durch einen Filter von 0,45 μm filtriert.
4. Kalibirierungsmodell

Kalibirierungsmodell: lineare log-log-Kalibirierung

Die Kalibirierungskurve für PC wurde verwendet, um die Mengen der Glycolipiede und Phospholipide zu berechnen.
Gaschromatographie

Kapillar-Gaschromatographie 8240 von Perkin Elmer, ausgestattet mit einer fusionierten WCOT Siliziumsäule 12,5 m × 0,25 mm ID × 0,1μm 5 % Phenyl-Methyl-Silikon (CP Sil 8 CB von Crompack).

Träger: Helium
Injektion: 1,5 μl mit Split
Detektor: FID, 385 °C
Herd-Programm:	12	3	4
Herdtemperatur, °C:	80	200	240	360
Isothermale Zeit, min	20	0	10
Temperaturrate, °C/min	20	10	12

Probenherstellung: 50 mg Weizenlipid wurde in 12 ml Heptan:Pyridin 2:1, das einen internen Standard von 2 mg/ml Heptadekan enthielt, gelöst. 500 μl der Probe wurden in ein gewelltes Gefäß übergeführt. 100 μl MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid) wurde zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten bei 90 °C inkubiert.
Berechnung: die Reaktionfaktoren von Mono-Di-Triglyceriden und freien Fettsäuren wurden über Referenzgemische aus diesen Bestandteilen bestimmt. Basierend aus diesen Reaktionsfaktoren wurden die Mono-Di-Triglyceride und freie Fettsäuren in Weizenlipiden errechnet.

Galaktolipid(DGDG)-Zymogramm (Tüpfelplatten)-Test
Herstellung der Platten.
Lösung 1.
2 g Agarose wurde durch Aufheizen auf 90-100 °C in 110 ml Wasser gelöst.
Lösung 2.
1,2 g Galaktolipid wurde in 40 ml entmineralisiertem Wasser dispergiert. 50 ml 0,1M Phosphatpuffer, pH-Wert 7, wurde zugegeben, daraufhin wurden auch 0,6 ml 0,2 % Rhodamin B zugegeben.
Lösung 1 wurde auf etwa 70 °C abgekühlt und Lösung 2 wurde unter Rühren zugegeben. 12 ml des Endgemischs wurde auf eine Petrischale von 7 cm übergeführt.
Die Platten wurden bis zu Verwendung bei 5 °C gelagert.
Test.
Kleine Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm wurden aus dem Gel gestochen und 10 μl Enzymlösung wurde in das Loch übergeführt. Die Bildung von Höfen in den Agarosegelen wurde als Funktion der Zeit verfolgt.
Ein Blindwert ohne Enzym wurde zum Vergleich ebenfalls einem der Löcher zugegeben.
Test auf Enzymaktivität

Herstellung von Substrat für den enzymatischen Test: Das Substrat, pNP-Caprat (C10) wurde in Ethanol gelöst und in 100 mM Na-Phosphatpuffer (pH-Wert 6,3) auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml Substrat beziehungsweise 30 % Ethanol verdünnt und bei Raumtemperatur gelagert.
Testverfahren: Das Enzymgemisch bestand aus 30 μl Probe/Blindwert und 250 μl Substrat. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 35 °C inkubiert (420 nm), während gleichzeitig ein kinetisches ELISA-Leseprogramm (420 nm) laufen gelassen wurde. Der V_max-Wert wurde für die Berechnung der Enzymaktivität (U/ml) verwendet. V_max wurde über eine Standardkurve für Lösungen von pNP, die unter denselben Bedingungen gemessen wurden wie die Probe, in μMol umgewandelt. Die Enzymaktivität wird als die Menge an Enzym definiert, die bei 35 °C 1 μMol pNP pro min produziert.

Screening-Verfahren für zufallsbestimmte Mutagenese
Enzymbanken, die über zufallsbestimmte Mutagenese oder ortsgerichtete zufallsbestimmte Mutagenese erhalten wurden, können auf Zelluloseacetat-Filter auf Agarplatten, die Wachstumsmedium enthalten, verteilt und inkubiert werden.
Die Zelluloseacetat-Filter werden dann auf die Selektionsplatten übergeführt und 2-6 Stunden bei 37 °C inkubiert. Zellen, die unter den gegebenen Bedingungen aktives Enzym beherbergen, werden rund um die Kolonien freie Zonen entwickeln. Die positiven Varianten können dann weiter gereinigt und getestet werden.
Ergebnisse
Beispiel 1
In den ersten Reihen von Teigversuchen wurde gereinigte Augenbohnen-LAH in 10g Teig in verschiedenen Konzentrationen getestet, um die Aktivität des Enzyms in Teig zu testen, und um eine geeignete Dosierung für die Backversuche zu finden. Die Aktivität des Enzyms wurde durch Analysieren der Menge an freien Fettsäuren im Teig gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 4 gezeigt. Tabelle 1. Wirkung von Augenbohnen-LAH in Modellteig

Augenbohnen-LAH Fettsäure in Teig

Einheiten/kg Mehl ‰

3 3.44

0.6 2.55

0.12 2.13

0.024 1.78

0.0048 1.66

0 1.77
Die in Tabelle 1 und 4 ausgeführten Ergebnisse zeigen deutlich, dass LAH aus Augenbohnen während der Produktion von freien Fettsäuren in Teig aktiv ist.
Lipide, die aus dem Teig extrahiert wurden, wurden weiter durch HPLC analysiert, um die Wirkung auf polare Lipide im Teig zu untersuchen.

Die Ergebnisse aus den HPLC-Analysen von Teiglipiden sind in Tabelle 2 und den 5 und 6 gezeigt. Tabelle 2: HPLC-Analyse von polaren Lipiden in Teig

Augenbohnen-LAH	‰	‰	‰	‰
Einheiten/kg Mehl	DGDG	PC	DGMG	LPC
0	2.11	0.37	0.19	1.36
0.0048	2.22	0.52	0.20	1.50
0.024	2.12	0.48	0.23	1.51
0.12	1.84	0.35	0.26	1.37
0.6	1.08	0.29	0.30	1.30
3.0	0.30	0.00	0.11	1.19

Die unpolaren Lipide wurden durch GLC analysiert. Die Ergebnisse aus diesen Analysen sind in 7 gezeigt.
Die HPLC-Analyse zeigt die Wirkung von Augenbohnen-LAH auf Galaktolipide deutlich, und bei hoher Dosierung des Enzyms wird Digalaktosyldiglycerid (DGDG) fast vollständig hydrolysiert.
Die Ergebnisse zeigen auch einen kleinen Anstieg der Konzentration des entsprechenden Monoesters, DGMG. Bei einer erhöhten Konzentration an Augenbohnen-LAH wird DGMG jedoch auch hydrolysiert. Dasselbe Bild ist auch bei Phosphatidylcholin (PC) zu beobachten, das hydrolysiert wird, gefolgt von einem geringen Anstieg des entsprechendenden Lysophopshatdiylcholins. Bei einer erhöhten Konzentration von Augenbohnen-LAH wird Lysophopshatdiylcholins ebenfalls im Teig hydrolysiert.
Schlussfolgernd wird beobachtet, dass sowohl Galactolipide als auch Phospholipide im Teig durch Augenbohnen-LAH abgebaut werden.
Die GLC-Analyse zeigt im Vergleich zu ihrer Aktivität auf polare Lipide keine Aktivität der Augenbohnen-LAH auf Triglycerid und die Bildung von freien Fettsäuren.
Es ist sehr deutlich, dass 3 Einheiten/kg Augenbohnen-LAH eine starke Überdosierung dieses Enzyms darstellen, die eine fast vollständige Hydrolyse aller Galaktolipide im Teig verursacht.
Beispiel 2
Augenbohnen-LAH wurde in der Minibrot-Analyse in zwei verschiedenen Konzentrationen getestet und mit einer Kontrolle (ohne Zugabe von Augenbohnen-LAH) verglichen. Das Volumen des Brots wurde, ebenso wie Krumenstruktur und Erscheinungsform, bewertet. Vollständig gegärter Teig aus diesem Test wurde eingefroren und gefriergetrocknet und das Teiglipid wurde extrahiert. Die isolierten Teiglipide wurden durch HPLC- und GLC-Analyse analysiert.
Die Ergebnisse aus dem Backtest sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Backtest mit Augenbohnen-LAH

Test Augenbohnen-LAH Brotvolumen Fettsäure

Nr. % in Teig ml/g in Teig, ‰

1 0 3.09 2.63

2 0.05 3.11 2.75

3 0.15 3.3 2.96
Augenbohnen-LAH trug, im Vergleich zur Kontrolle deutlich zu einem erhöhten Volumen des gebackenen Brots bei, und das Enzym trug auch zu einer verbesserten Kruste, mit homogenerer Struktur und besserer Erscheinungsform bei.
Ergebnisse der Lipid-Analyse der extrahierten Lipide sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. GLC und HPLC-Analyse von Teiglipiden.

Test Monoglycerid Diglycerid Triglycerid DGDG DGMG

Nr. ‰ ‰ ‰ ‰ ‰

1 0.43 0.99 4.94 2.09 0.22

2 0.43 0.95 4.98 2.03 0.27

3 0.43 0.96 5.11 1.92 0.28
Die Lipid-Analyse zeigt an, dass Augenbohnen-LAH die unpolaren Lipide nicht hydrolysiert. Die Menge des Triglycerids scheint etwas anzusteigen, dies liegt jedoch innerhalb des experimentellen Fehlers. Jedoch hat das Enzym, durch den Abbau von Digalaktosyldiglycerid (GDGD) deutlich eine Wirkung auf das Galaktolipid im Teig. Eine Zunahme der entsprechenden DGMG-Menge wird beobachtet. Der Grad der Hydrolyse von Galaktolipid ist nicht sehr hoch, jedoch ausreichend, um eine Verbesserung der Backqualitäten des Enzyms zu erklären.
Beispiel 3
LAH, die aus Augenbohnen isoliert wurde, wurde in Backtests wie folgt bewertet. Die LAH wurde in Röllchen mit harten Krusten bewertet.
Die LAH wurde in einer Dosierung von 0, 0,25, 0,5, 1 beziehungsweise 1,5 Einheiten Enzym/kg Mehl getestet. Die anfänglichen Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von 1,5 mg LAH das Laibvolumen des Brots im Vergleich mit Brot ohne Enzym um mehr als 10 % erhöhte und die Verarbeitungseigenschaften des Brots verbessert.
Beispiel 4
LAH wurde in Brot gemäß dem Verfahren des Dänischen Toastbrots unter Verwendung von dänischem Reformmehl getestet. Die LAH wurde in 0, 0,25, 0,5, 1 beziehungsweise 1,5 Einheiten Enzym/kg Mehl getestet. Als Bezugnahme wurde ein Teig ohne Enzymzugabe hergestellt. Nach dem Backen wurden die Laibe abgekühlt und das Laibvolumen gemessen.
Brot, das in Blechen mit Deckel gebacken wurde, wurde bei Umgebungstemperatur gelagert und die Weichheit der Krume nach 1, 3 und 7 Tagen Lagerung bei 22 °C, eingewickelt in doppelten Plastiktüten, bewertet.
Die anfänglichen Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von 1-1,5 Einheiten LAH das Laibvolumen erhöht.
Die anfänglichen Ergebnisse hinsichtlich Festigkeit und Elastizität, zeigen, dass die LAH nach 7 Tagen Lagerung im Vergleich zur Kontrolle (ohne Enzyme) eine signifikant weichere Krume verleiht.
Vorläufige Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass LAH ein Brot mit sehr guter und homogener Krumenstruktur ergibt.
Beispiel 5
Augenbohnen-LAH wurde in Minibroten in verschiedenen Konzentration, gemäß Tabelle 5, getestet. Tabelle 5. Backtest mit Augenbohnen-LAH und Fettsäureanalyse des Teigs

Augenbohnen-LAH spezifisches freie Fettsäure

Einheiten/kg Brotvolumen, ml/g im Teig, ‰

0 3.09 2.57

0.1195 3 2.72

0.239 3.2 2.81

0.478 3.15 3.07

0.956 3.15 3.28

Augenbohnen-LAH trägt deutlich zum erhöhten Volumen bei niedriger Konzentration (bis zu 0,239 Einheiten/kg) bei. Bei höherer Dosierung gab es keine Volumenzunahme, jedoch wurde die Krumenstruktur homogener. Teige aus diesem Versuch wurden extrahiert und die Teiglipide isoliert und durch HPLC und GLC, wie in Tabelle 6 gezeigt, analysiert. Tabelle 6. GLC- und HPLC-Analyse der Teiglipide

Augenbohnen-LAH	Monoglycerid	Diglycerid	Triglycerid	DGDG	DGMG
%	‰	‰	‰	‰	‰
0	0.43	0.99	4.94	2.15	0.21
0.1195	0.40	0.96	5.04	2.08	0.23
0.239	0.41	1.23	5.21	2.01	0.20
0.478	0.43	0.90	5.09	1.89	0.24
0.956	0.41	1.01	5.23	1.60	0.20

Die Lipidanalyse bestätigt deutlich, dass Augenbohnen-LAH auf die unpolaren Teiglipide (Mono-, Di- und Triglyceride) nicht wirkt, jedoch ist die Funktionalität durch die Wirkung auf polare Lipide wie Digalaktosyldiglycerid (DGDG) zu erklären, die deutlich hydrolysiert werden. Die Ergebnisse zeigen einige Variationen der Werte von Di- und Triglyceriden, jedoch sind die Variationen zufällig und keine Indikation der Enzymaktivität.
Beispiel 6
Augenbohnen-LAH wurde durch Minibrot-Analyse bewertet. In diesem Versuch wurde das Enzym allein und auch in Kombination mit einem aus Hafer isolierten Galaktolipid getestet. Die Ergebnisse aus dem Backtest und die Bestimmung der freien Fettsäuren sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7. Augenbohnen-LAH und Galaktolipid (DGDG) in Minibrot

Test-Nr. DGDG, 55% rein Augenbohnen-LAH spez. Brotvolumen freie Fettsäure

% Ml/g ‰

1 0 0 3 2.39

2 0.2 0 3.28 2.50

3 0 0.357 3.22 3.07

4 0.2 0.357 3.69 3.00
In diesem Versuch wird gezeigt, dass sowohl Augenbohnen-LAH als auch Galaktolipid (55 % DGDG) eine positive Wirkung auf das Brotvolumen haben. Die Kombination beider Zutaten trägt zu einem deutlichen synergistischen Effekt bei, wie in Tabelle 7 veranschaulicht ist. Sowohl das Brotvolumen als auch die Krumenstruktur werden signifikant verbessert, wenn Augenbohnen-LAH und DGDG zugegeben werden.

Teig von diesem Backversuch wurde eingefroren und gefriergetrocknet, und das Teiglipid wurde mit wassergesättigtem Butanol extrahiert. Die isolierten Lipide wurden GLC und HPLC-Analysen unterzogen. Die Ergebnisse aus diesen Analysen sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8. GLC- und HPLC-Analysen von Teiglipiden.

Test-Nr.	DGDG, 55% rein	Augenbohnen-LAH	DGDG	DGMG	Triglycerid
	%	Einheiten/kg Mehl	‰	‰	‰
1	0	0	2.07	0.15	5.94
2	0.2	0	2.89	0.15	5.60
3	0	0.357	1.93	0.23	nicht nachgewiesen
4	0.2	0.357	2.4	0.25	5.82

Wenn dem Teig Galaktolipide zugegeben werden (Test Nr. 2), werden auch mehr Galaktolipide (DGDG) durch HPLC-Analyse nachgewiesen. Augenbohnen-LAH hat eine starke hydrolysierende Wirkung auf DGDG.
Die hydrolysierende Wirkung wird sehr deutlich, sowohl ohne Zugabe von DGDG (Test Nr. 3) und insbesondere, wenn DGDG zugegeben wird (Test Nr. 4). Es wird auch beobachtet, dass sie Menge des Hydrolyseprodukts, nämlich DGMG, ansteigt, wenn Augenbohnen-LAH zugegeben wird. Wie in den anderen Versuchen zu sehen ist, hat Augenbohnen-LAH keine hydrolysierende Wirkung auf Triglycerid.
Beispiel 7
Augenbohnen-LAH wurde bei der Minibrot-Analyse in Kombination mit Sojaöl bewertet (Tabelle 9). Tabelle 9. Augenbohnen-LAH und Sojaöl in Minibroten

Test-Nr. Sojaöl Augenbohnen-LAH spez. Brotvolumen freie Fettsäure

% Einheiten/kg Mehl Ml/g ‰

14 2 0 3.3 2.00

15 2 1.07 3.3 3.35

16 2 2.14 3.12 3.75
In diesem Versuch trug die LAH im Vergleich zu Brot, das allein mit Sojaöl gebacken wurde, nicht zur Verbesserung des Brotvolumens bei, jedoch verbesserte Augenbohnen-LAH deutlich die Krumenstruktur und Erscheinungsform des Brots (8).
Beispiel 8

Augenbohnen-LAH wurde bei der Minibrot-Analyse in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen von Galaktolipid (55 % rein) bewertet (Tabelle 10). Tabelle 10. Augenbohnen-LAH und Galaktolipid (55 % rein) in Minibrot.

Test-Nr.	DGDG, 55% rein	Augenbohnen-LAH	spez. Brot-volumen	freie Fettsäure
	%	Einheiten/kg Mehl	ml/g	‰
9	0	0	3.03	2.60
10	0	1.07	3.11	3.52
11	0.1	1.07	3.3	3.42
12	0.2	1.07	3.73	3.64
13	0.4	1.07	4.13	3.92

Tabelle 10 zeigt, dass die Zugabe von Galaktolipid in Kombination mit 1,07 Einheiten/kg Galaktolipid zu einer starken Verbesserung sowohl des Brotvolumens als auch der Krumenstruktur beiträgt (9).
Beispiel 9
Gereinigtes LAH aus Augenbohnen wurde in Kombination mit dem Galaktolipid DGDG getestet.
Die Zugabe der Zutaten zum Teig sowie das Brotvolumen von Brot aus diesen Backversuchen wird in Tabelle 1 ausgeführt. Tabelle 11. Backtest mit Augenbohnen-LAH und dem Galaktolipid DGDG

Test-Nr. DGDG, 55% rein Augenbohnen-LAH spez. Brotvolumen

% Einheiten/kg Mehl ml/g

1 0 0 2.92

2 0.4 0 4.11

3 0.4 0.71 4.36

4 0 0.71 3.14
Aus den Ergebnissen in Tabelle 11 zeigt sich deutlich, dass DGDG eine sehr positive Wirkung auf das Brotvolumen des gebackenen Brots hat. Augenbohnen-LAH trägt ebenfalls zu einem verbesserten Brotvolumen bei. Die Kombination von Augenbohnen-LAH und DGDG ergab eine weitere Verbesserung des Brotvolumens und es wurde eine bessere Krumenstruktur beobachtet (10).
Beispiel 10
In diesem Versuch wurde isolierte, membrangebundene LAH aus Weizenblatt-Chloroplasten in einem Modellteigsystem von 10 g getestet. Man ließ den Teig 1 Stunde bei 26 °C ruhen, dann wurde er eingefroren und gefriergetrocknet.

Der gefriergetrocknete Teig wurde mit wassergesättigtem Butanol (WSB) extrahiert, und die isolierten Teiglipide wurden GLC- und HPLC-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse der Lipidanalyse sind in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12. Wirkung von membrangebundener LAH aus Weizenchloroplasten in Teig. GLC-Analyse von Lipiden.

Membrangebundene LAH	freie Fettsäure	Monoglycerid	Diglycerid	Triglycerid	DGDG
% in Teig	‰	‰	‰	‰	‰

0.1	3.06	0.32	0.84	4.20	0.82
0.5	4.40	0.30	0.57	3.80	0.00
1	4.83	0.30	0.51	3.96	0.00
2	5.7	0.27	0.37	4.12	0.00

Die Ergebnisse in Tabelle 12 bestätigen die lipolytische Aktivität des membrangebundenen LAH-Enzyms von Weizenchloroplasten in Teig, die als starker Anstieg der freien Fettsäuren im Teig gemessen werden. Die Ergebnisse zeigten auch, dass das membrangebundene LAH-Enzym aus Weizenchloroplasten fast keine Wirkung auf unpolare Lipid hat, und die Konzentration der Triglyceride bleibt unverändert. Die Ergebnisse zeigen auch eine starke hydrolytische Wirkung des membrangebundenen LAH-Enzyms aus Weizenchloroplasten auf die Hydrolyse von Galaktolipiden, wie Digalaktosyldiglycerid (DGDG), an, das bei höheren Dosierungen des membrangebundenen LAH-Enzyms vollständig hydrolysiert wird.
Beispiel 11
In diesem Versuch wurde ein isoliertes LAH-Enzym, umfassend die in SEQ ID Nr. 12 gezeigte Sequenz, in einem Modellteigsystem von 10 Gramm getestet. Man ließ den Teig 1 Stunde bei 26 °C ruhen, dann wurde er eingefroren und gefriergetrocknet.
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass das Enzym, das die in SEQ ID Nr. 12 gezeigte Sequenz umfasst, die Menge an polaren Lipiden im Öl verringert, während sie die Triglycerid-Mengen des Öls nicht signifikant beeinträchtigt.
Schlussfolgerung:
LAH-Enzyme aus Augenbohnen wurden isoliert und charakterisiert und in Modellteig und Miniback-Versuchen getestet. Dieses Enzym wirkt auf die polaren Galaktolipide und Phospholipide in Teig, es wurde jedoch keine Aktivität auf Triglyceride in Teig beobachtet. Eine an Chloroplasten gebundene LAH aus Weizenblättern wurde ebenfalls isoliert und in Modellteig getestet. Dieses Enzym ist auch gegen Galaktolipide und Phospholipide in Teig aktiv, zeigte jedoch keine Aktivität auf Triglyceride.
Beispiel 12
Pflanzliches Öl, insbesondere Rapsöl, wurde mit LAH behandelt, das aus Augenbohnen isoliert wurde, um eine Degummierung des Öls zu bewirken. Das verwendete Verfahren war im Wesentlichen so wie das enzym-katalysierte Degummierungsverfahren von Pflanzenöl, allgemein beschrieben in Buchold, H. (Fat Sci. Technol. 95, Jahrgang Nr. 8, 1993, S. 300-305), mit der Ausnahme, dass LAH verwendet wurde.
Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass LAH die Mengen an polaren Lipiden im Öl verringert, während es die Triglyceridmengen des Öls nicht signifikant verändert.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Mehlteigs, wobei das Verfahren umfaßt, daß man zu den Teigbestandteilen eine wirksame Menge eines Enzyms zugibt, welches unter Teigbedingungen ein Glycolipid und ein Phospholipid hydrolysiert, welches jedoch ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert, und unter Erhalt des Teigs die Teigbestandteile mischt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wirksame Menge des Enzyms sowohl ein Triglycerid als auch ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wirksame Menge des Enzyms ein Triglycerid und ein Diglycerid hydrolysiert, jedoch ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei wenigstens eines unter dem Triglycerid, dem 1-Monoglycerid, dem Glycolipid und dem Phospholipid ein natürlich vorkommender Lipidbestandteil ist, der in dem für den Teig verwendeten Mehl vorhanden ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Phospholipid Phosphatidylcholin (PC) ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Glycolipid Digalactosyldiglycerid (DGDG) ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei wenigstens eines unter dem Triglycerid, dem 1-Monoglycerid, dem Glycolipid und dem Phospholipid zu dem Teig zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Triglycerid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem pflanzlichen Öl, einem pflanzlichen Fett, einem tierischen Fett, Backfett und Milchfett.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das pflanzliche Öl ein natürlich vorkommendes Getreideöl, einschließlich Haferöl, ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das zugegebene polare Lipid ein Phospholipid ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE).
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Teig ein Hefeteig ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Enzym in einer Menge zugegeben wird, die im Bereich von 0,1 bis 1000 Einheiten Enzym/kg Mehl liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Enzym in einer Menge zugegeben wird, die im Bereich von 1 bis 100 Einheiten Enzym/kg Mehl liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Teig ein Brotteig ist und das Verfahren als weitere Stufe umfaßt, daß der Teig unter Erhalt eines gebackenen Produkts gebacken wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Teig ein Teig ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pastateig, Nudelteig und Kuchenteig oder Backteig.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Enzym in einer Menge zugegeben wird, die zu einer Steigerung des spezifischen Volumens des gebackenen Produkts von wenigstens 10% führt, relativ zu einem gebackenen Produkt, das unter identischen Bedingungen hergestellt wird, mit der Ausnahme, daß kein Enzym zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei ein weiteres Enzym zu dem Teig zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das weitere Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Lipase, einem Stärke abbauenden Enzym, einer Hemizellulase, einer Zellulase, einer Lipoxygenase und einer Oxidoreduktase.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei wenigstens 25% des anfangs in dem Teig vorliegenden Glycolipids hydrolysiert werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei wenigstens 25% des anfangs in dem Teig vorliegenden Phospholipids hydrolysiert werden.
Verfahren zur Herstellung eines Teigs oder eines gebackenen Produkts, hergestellt aus einem Teig, welches folgendes umfaßt: (a) Testen wenigstens eines Enzyms hinsichtlich seiner hydrolytischen Aktivität gegenüber einem Triglycerid, einem 1-Monoglycerid, einem Phospholipid und einem Glycolipid, (b) Auswählen eines Enzyms mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und ohne hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 und (c) Zugeben des ausgewählten Enzyms zu dem Teig.
Teigverbessernde Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines Enzyms, das unter Teigbedingungen ein Glycolipid und ein Phospholipid hydrolysiert, welches jedoch ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert, und optional einen weiteren Teigbestandteil umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die wirksame Menge des Enzyms sowohl ein Triglycerid als auch ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die wirksame Menge des Enzyms ein Triglycerid und ein Diglycerid hydrolysiert, jedoch ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Zusammensetzung ein weiteres Enzym umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Lipase, einem Stärke abbauenden Enzym, einer Hemizellulase, einer Zellulase, einer Lipoxygenase und einer Oxidoreduktase.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei der weitere Teigbestandteil aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Weizenmehl, Hefe, einem chemischen Treibmittel, einem Teigverstärkungsmittel, einem Emulgiermittel, einem Zucker, einem Acylglycerol, einem Phospholipid, einem Glycolipid und einem Salz.
Teig, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
Teig nach Anspruch 27, wobei der Teig in einer kontrollierten Atmosphäre eingefroren oder verpackt wird.
Gebackenes Produkt, erhältlich durch Backen eines Teigs nach einem der Ansprüche 27 oder 28.
Nudelprodukt, hergestellt aus einem Teig nach einem der Ansprüche 27 oder 28.
Pastaprodukt, hergestellt aus einem Teig nach einem der Ansprüche 27 oder 28.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid und einem Glycolipid und ohne hydrolytische Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: i) Auswählen einer Lipase mit hydrolytischer Aktivität gegenüber einem Phospholipid, einem Glycolipid und einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid, ii) Modifizieren wenigstens einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz durch Einfügung, Deletion oder Substitution, um die Aktivität der Lipase in solch einer Weise zu verändern, daß die Lipase so modifiziert wird, daß sie keine Aktivität gegenüber einem Triglycerid und/oder einem 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Einfügung, Deletion oder Substitution wenigstens einer Aminosäure in der Deckelregion (lid region) der Aminosäuresequenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Einfügung, Deletion oder Substitution wenigstens einer Aminosäure in der Nähe der aktiven Stelle der Aminosäuresequenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Einfügung, Deletion oder Substitution wenigstens einer Aminosäure am C-Terminus der Aminosäuresequenz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Deckelregion (lid region) deletiert wird.
Teigzusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines Enzyms, welches unter Teigbedingungen ein Glycolipid und ein Phospholipid hydrolysiert, welches jedoch ein Triglycerid und/oder ein 1-Monoglycerid im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 6,5 nicht hydrolysiert, und optional einen weiteren Teigbestandteil umfaßt.