KR100748061B1

KR100748061B1 - 큐티나제 변이체

Info

Publication number: KR100748061B1
Application number: KR1020017006924A
Authority: KR
Inventors: 아보마사노부; 후쿠야마시로; 스벤드젠알란; 마츠이도모코
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2007-08-09
Also published as: KR20010081059A; JP2003520016A; EP1137761A1; JP4615723B2; EP1137761B1; WO2000034450A1; AU1503800A

Abstract

균류 큐티나제의 변이체는 향상된 열안정성을 가진다. 변이체는 아미노산 서열 또는 큐티나제 3-차원 구조상의 N-말단 근처의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.

큐티나제의 변이체

Description

큐티나제 변이체{CUTINASE VARIANTS}

본 발명은 큐티나제 변이체, 더욱 구체적으로는 향상된 열안정성을 가지는 큐티나제 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변이체를 암호화하는 DNA 서열, DNA 서열을 포함하는 벡터, DNA 서열 또는 벡터를 수용한 형질전환된 숙주 세포, 변이체 제조 방법, 및 변이체의 이용에 관한 것이다.

큐티나제는 큐틴 기질을 가수분해할 수 있는 지방가수분해 효소이다. 큐티나제는 다양한 균류(P.E.Kolattukudy in "Lipases", Ed.B.Borgstrom and H.L.Brockman, Elsevier 1984, 471-504) 로부터 공지된다. 푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi) 큐티나제의 아미노산 서열 및 결정 구조가 개시되었다. (S.Longhi et al., Journal of Molecular Biology, 268(4), 779-799(1197)). 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)로부터의 큐티나제의 아미노산 서열이 또한 공개되었다. (US 5,827,719)

푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi) 큐티나제의 다양한 변이체가 WO94/14963; WO 94/14964; Appl.Environm. Microbiol.64,2794-2799,1998; Proteins :Structure, Function and Genetics 26, 442-458, 1996;J., Computational Chemistry 17,1783-1803,1996; Protein Engineering 6,157-165,1993; Proteins: Structure, Function, and Genetics 33,253-264,1998; J., Biotechnology 66, 11-26,1998; Biochemistry 35,398-410,1996 에 공개되었다.

균류 큐티나제는 예를 들어, 얀 또는 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 섬유로부터의 직물의 끝손질에서 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)의 고리형 올리고머의 효소적 가수분해에 사용될 수 있다(WO 97/27237). 그러나, 더 높은 가공처리 온도를 허용하도록, 공지된 균류 큐티나제의 열안정성을 향상시키는 것이 바람직하다.

발명의 개요

본 발명자는 향상된 열안정성을 가지는 균류 큐티나제의 어떤 변이체를 발견했다.

따라서, 본 발명은 a) N-말단 아미노산의 위치로부터 17 Å 의 범위내( 결정 구조에서 아미노산 잔기로부터 계산될 때) , 및/또는 b) N-말단 아미노산으로부터 20 위치의 범위내에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 모 균류 큐티나제의 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한 변이체를 암호화하는 DNA 서열 , DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, DNA 서열 또는 발현 벡터를 수용한 형질전환된 숙주세포, 변이체를 제조하는 방법, 변이체를 이용하는 방법 및 변이체를 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

도 1 은 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens)의 큐티나제의 3D 구조에 대한 좌표를 보여준다.

도 2 는 푸사리움 솔라니 피시(F. solani pisi)(왼쪽) 및 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens)(오른쪽)로부터의 큐티나제의 3-차원 구조를 보여주는 컴퓨터 모델이다. N-말단 아미노산 및 이 주위의 12 Å 및 17 Å 직경 대를 확인하기 위해 다른 색상이 사용되었다.

도 3-6 은 c3ET 의 가수분해를 도시한다. 상세한 설명은 실시예에서 제공된다.

균류 큐티나제

모 큐티나제는 예를 들어, 균주 휴미콜라(Humicola) 또는 푸사리움(Fusarium) , 구체적으로는 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 또는 푸사리움 솔라니 피시(F. solani pisi), 더욱 구체적으로는 휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 균주 DSM 1800 에 고유한 사상균 큐티나제와 같은 균류 큐티나제이다.

휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 균주 DSM 1800 의 큐티나제의 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 DNA 서열은 US 5,827,719 의 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:1 으로 보여진다. H.insolens 큐티나제에 대해 여기에서 사용된 넘버링 시스템은 상기 SEQ ID NO:2 에 보여진 대로 성숙한 펩티드에 기초한다.

푸사리움 솔라니 피시(F.solani pisi)의 큐티나제의 아미노산 서열은 WO 94/14964 의 도 1D 에서 성숙한 펩티드로서 보여진다. 푸사리움 솔라니 피시(F.solani pisi) 큐티나제에 대한 여기에 사용된 넘버링 시스템은 WO 94/14964 에 사용된 것이고; 그것은 상기 도 1D에서 보여진 프로-서열을 포함하고 ; 따라서, 성숙한 큐티나제는 16-214에 위치한다.

모 큐티나제는 휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 균주 DSM 1800 의 큐티나제와 적어도 50%(구체적으로는 적어도 70 % 또는 적어도 80 %)의 상동성이 있는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 모 큐티나제는 구체적으로 휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 균주 DSM 1800 의 큐티나제와 정렬될 수 있다.

아미노산 명명법 및 변형

명세서 및 청구항은 그들의 1 문자 코드에 의한 아미노산을 언급한다. 서열내의 구체적인 아미노산은 그것의 1 문자 코드 및 그것의 위치, 예를 들어, Q1 은 Gln (위치 1, 즉 N-말단에서 글루타민)을 나타내는 것에 의해 확인된다.

치환을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된 명명법은 기본적으로 WO 92/05249 에 개시된것이다. 따라서, R51P는 위치 51 에서 R(Arg)을 P(Pro)로 치환한 것을 나타낸다.

상동성 및 정렬

본 발명의 목적을 위해서, 상동성의 정도는 폴리펩티드 서열 비교를 위한 셋팅: 3.0의 GAP 생성 페널티 및 0.1 의 GAP 신장 페널티을 통해 Needleman, S.B. and Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-45에 개시된 방법에 따라 적당하게 결정될 수 있다. 결정을 GCG 프로그램 패키지에서 제공된 GAP 와 같은 공지된 컴퓨터 프로그램 수단으로 할 수 있다. (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

두개의 주어진 서열을 같은 매개변수를 사용하여 Needleman(상기참조)에 개시된 방법에 따라 정렬할 수 있다. 이것은 GAP 프로그램(상기참조)을 이용하여 할 수 있다.

큐티나제의 3 차 구조

휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 의 큐티나제의 구조는 예를 들어, X-Ray 구조 결정, Stout, G. K. and Jensen, L. H., John Wiley & Sons, Inc. NY,1989 에서와 같은 X-레이 결정학적 방법에 관한 원칙에 따라 해결되었다. 이질동상 치환 방법을 사용하여 2.2 Å 분해능으로 해석된 결정 구조에 대한 구조 좌표가 표준 PDB 포맷으로 도 1 에서 보여진다. (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory,Brookhaven, CT).

푸사리움 솔라니 피시(F.solani pisi)의 큐티나제 구조는 Martinez et al.(1992) Nature 356,615-618 에 개시된다. 푸사리움 솔라니 피시(F. solani pisi) 및 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens)의 큐티나제의 3D 구조는 도 2에서 컴퓨터 모델로 비교된다.

균류 큐티나제의 전체적인 3-차원 구조가 매우 유사하고, X-레이 결정학상 보여진 구조가 매우 상동성이 있다는 것이 나타났다. 푸사리움 솔라니 피시(F. solani pisi) 및 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens)로부터의 큐티나제 사이의 유사성은 도 2의 컴퓨터 모델로부터 명백하게 분명하다. 따라서, 하나의 균류 큐티나제에 대해 나타난 형태의 변형은 또한 다른 균류 큐티나제에 대해 기능적일 것이다.

N-말단 근처에서 치환

본 발명의 변이체는 N-말단 근처에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가진다. 치환은 N-말단의 17Å 거리내의 범위(예를 들어, 12 Å 내) 및 /또는 20 위치 (예를 들어, 15 위치내) 범위내이다. N-말단으로부터의 거리는 아미노산의 C_α원자사이에서 계산되고, 결정 구조내의 아미노산으로부터 계산된다. (즉, X -레이 구조내에서 가시적임).

휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 균주 DSM 1800 의 큐티나제에서, 두 N-말단 아미노산 (Q1 및 L2 즉,위치 1 및 2 에서 Gln 및 Leu) 이 X-레이 구조에서 가시적이지 않으므로, 거리는 아미노산 G3 로부터 계산된다. 17 Å 범위 내의 아미노산은 위치 3-12,18,20-60,62-64,82,85-86,100-108,110-111,130-132,174,176-182,184-185,188, 및 192 를 포함한다. 12 Å 범위 내에 포함된 아미노산은 위치 3-8, 22-27,30-47,53-59,102,177, 및 180-181 을 포함한다.

푸사리움 솔라니 피시(F. solani pisi)의 큐티나제에서, N-말단 아미노산 G17 은 X-ray 구조에서 가시적이다. 17 Å 범위 내의 아미노산은 위치 17-26,34-75,77-79, 101,115,117-119,147,191-197,199-200, 및 203 을 포함한다. 12 Å 범위 내의 아미노산은 위치 17-22,38,40,45-58,60,65, 및 70-72를 포함한다.

본 발명의 변이체는 모 효소와 비교하여 향상된 열안정성을 가졌다.열안정성은 예를 들어, 90 K/hr 의 스캔 속도로 pH 8.5 에서, 실시예에 개시된 대로 DSC (다른 스캐닝 열량측정법)에 의해 변성 온도로부터 결정될 수 있다. 변이체는 모효소보다 적어도 5 ℃ 높은 변성 온도를 가질 수 있다.

상기 부위에서 총 치환 수는 전형적으로 1-10 , 예를 들어, 상기 부위에서 1-5 치환이다. 게다가, 본 발명의 큐티나제 변이체는 모효소의 다른 변형, 전형적으로는 10 이하, 예를 들어, 상기 부위 바깥쪽의 5 이하의 변형 (치환, 결실 또는 삽입)을 선택적으로 포함할 수 있다. 따라서, 변이체의 총 아미노산 서열은 전형적으로, 예를 들어, 모 큐티나제와 비교하여 1-10 변형을 가진 1-20 이다.

용매 접근가능한 표면

하나 이상의 치환은 노출된 아미노산 잔기 즉, 용매 접근가능한 표면을 가지는 아미노산 잔기에서 만들어질 수 있다. 이것은 W. Kabsch 및 C. Sander, Biopolymers, 22 (1983) pp. 2577-2637 에 개시된 "dssp"프로그램 (version October 1988) 으로 계산될 수 있다.

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 균주 DSM 1800 의 큐티나제에서, 하기의 아미노산은 N-말단에서 G3 의 17 Å 범위 내에 놓이고 0 보다 큰 용매 접근가능한 표면을 가진다 :3-12,18,26-33,36-38,40-45,47-56,59-60,62-64,82,85-86,104-105,174, 176-179,181-182,192.

특정 치환

N-말단 근처의 치환은 구체적으로는 전기 전하를 증가시키는 치환, 즉 중성 또는 양성으로 하전된 아미노산으로 음성으로 하전된 아미노산의 치환 또는 양성으로 하전된 아미노산으로 중성 아미노산의 치환일 수 있다. 따라서, 휴미콜라 ㅇ이인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 큐티나제의 위치 E6, E10, E30, E47 D63, E82 및/또는 E179 에 상응하는 위치에서 음성 아미노산 잔기는 예를 들어, R, K, Y, H, Q 또는 N 과 같은 중성 또는 양성 아미노산으로 치환될 수 있다. 어떤 특정한 치환은 E6Q/N, E10Q/N, E47K/R 또는 E179Q/N에 상응하는 치환이다. 또한, 휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 큐티나제에서 N7, S11, N44 또는 N52 에 상응하는 위치에서 중성 아미노산 잔기가 양성 아미노산으로 치환될 수 있다. (R, K 또는 H).

N-말단 근처에서의 치환의 또다른 예는, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800의 큐티나제에서 A14P 또는 R51P에 상응하는 치환인 Pro 잔기로의 치환이다.

특정 변이체

하기에 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제에서의 몇가지 예의 변이체가 있다.

상응하는 변이체는 다른 모 큐티나제에 기초하여 만들어질 수 있다.

R51P

E6N/Q+ L138I

A14P+ E47K

E47K

E179N/Q

E6N/Q+ E47K+ R51P

A14P+ E47K+ E179N/Q

E47K+ E179N/Q

E47K+ D63N

E6N/Q+ E10N/Q+ A14P+ E47K+ R51P+ E179N/Q

E6N/Q+ A14P+ E47K+ R51P+ E179N/Q

Q1P+ L2V+ S11C+ N15T+ F24Y+ L46I+ E47K

큐티나제 변이체의 용도

본 발명의 큐티나제 변이체가 예를 들어, 약어로 c3ET 인 고리형 트리(에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 폴리(에틸렌 프탈레이트)의 고리형 올리고머의 효소적 가수분해를 위해 사용될 수 있다.

구체적으로는, 이것은 큐티나제 변이체를 가지고 직물 또는 얀을 처리하는 단계, 선택적으로 뒤이어 약 pH 7 내지 약 pH 11 범위의 pH 를 가지는 수용액으로 직물 또는 얀을 린스하는 단계에 의해 직물 또는 얀을 포함하는 폴리에스테르로부 터 이러한 고리형 올리고머 제거에 사용될 수 있다. 폴리에스테르의 처리는 편리하게도 c3ET 의 유리 전이 온도(약 55 ℃)이상 및 폴리에스테르의 유리 전이 온도(약 70 ℃)이하에서 행해진다. 따라서, 처리는 50-80 ℃, 예를 들어, 60-75 ℃ 에서 적당하게 수행될 수 있다. 공정은 WO 97/272737 과 유사하게 수행될 수 있다.

큐티나제 변이체는 예를 들어,PET (에틸렌글리콜 및 테레프탈산의 중합체), P3GT (1,3-프로판디올 및 테레프탈산의 중합체) 또는 폴리에스테르/면 혼방과 같은 폴리에스테르-함유 직물을 처리하는 데 사용될 수 있다. 처리는 향상된 착용 및 편안함, 향상된 수분 침투력, 감소된 정전기 방지 성질과 같은 잇점을 폴리에스테르 직물에 제공할 수 있고, 감촉 및 부드러움, 변화된 재석출 성질 및/또는 색조 청정화를 향상시킬 수 있다.

큐티나제 변이체는 큐티나제 변이체의 처리에 연이어 연화제, 주름방지수지 , 정전기 방지제, 방오제 또는 링클-프리제, 영구적인 다림질 압력 내성 효과와 같은 끝손질제로 처리하여 PET 함유 얀 또는 직물의 기능적인 끝손질을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 큐티나제 변이체로의 처리는 표면의 많은 기능기를 증가시킬 수 있고, 이것은 기능적인 끝손질제를 부착시키는 데 사용될 수 있다. 끝손질제의 예는 Nihon Seni Sentaa KK 에 의해 1998-10-15 일 공개된 "SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN" 에 개시된다.

본 발명의 큐티나제가 WO 94/03578 및 WO 94/14964 에 개시된 대로, 또한 세제로서 사용되는 경우에, 지방 오염의 제거를 개선하기 위해 구체화될 수 있다. 세탁 세제에 다양한 큐티나제 변이체의 첨가는 몇 번의 세척/착용-사이클동안 축적될 수 있는 악취를 옷에서 감소시킬 수 있다.

큐티나제 변이체는 예를 들어, JP-A 5-344897 에 개시된 필름 및 병과 같은 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리-에틸렌글리콜-테레프탈레이트 (PET), 폴리락트산, 폴리부틸렌숙신네이트, 및 폴리(히드록시부티르산)-코-(히드록시발에르 산)과 같은 폴리에스테르의 분해 및 재활용에 사용될 수 있을 것이다.

큐티나제 변이체는 예를 들어, 제빵 산업 (예를 들어, WO 94/04035 및 EP 585988 에 개시됨), 제지 산업 (예를 들어, 피치 제거를 위해, EP 374700 참조), 및 가죽, 울 및 관련 산업 (예를 들어,동물가죽, 양가죽, 또는 울의 탈그리스를 위해), 및 탈그리스/탈지방을 포함하는 다른 이용분야를 위해 사용될 수 있다. 유기 합성에서의 촉매와 같이 지방 및 오일 산업에서 고정된 형태로 사용될 수 있다. (예를 들어, 에스테르화, 트랜스에스테르화 또는 에스테르 가수분해 반응)

폴리에스테르 염색

본 발명은 폴리에스테르 직물 또는 얀을 염색하는 공정을 제공한다. 이 공정에서, 직물 또는 얀을 예를 들어, 50-70 ℃ 또는 65-70 ℃, pH 7-10 에서 12-48 시간 큐티나제로 예비 처리한 후, 연이어, 예를 들어, 반응 염료 또는 분산 염료 또는 양이온 염료와 같은 염료로 염색한다. 반응 염료는 예를 들어, 구조 발색단-NHPh-S0₂CH₂CH₂OSO₃Na 를 가지는 OH 또는 COOH 기와 반응할 수 있는 염료일 수 있다. 염색은 40-80 ℃ 에서 예를 들어, 20-60 분 동안에서 수행될 수 있다.

큐티나제는 pH 8.5에서 모 큐티나제보다 적어도 5°높은, 예를 들어, 7-10° 높은, 온도 65°이상의 열 변성 온도, T_d 를 가지는 열안정성 큐티나제일 수 있다. 측정을 본 명세서의 실시예에 개시된 대로 DSC 에 의해 할 수 있다.

계면활성제

직물 또는 얀의 처리에서, 종래의 습윤제 및/또는 분산제는 효소와의 접촉을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 습윤제는 예를 들어, 에톡시화된 지방 알콜과 같은 비이온성 계면활성제일 수 있다. 매우 유용한 습윤제는 Berol 087 (Akzo Nobel 제품, Sweden)과 같은 에톡시화 및 프로폭실화된 지방 산 에스테르이다.

분산제는 비이온성, 음이온, 양이온, 양쪽성 또는 쌍이온성 계면활성제로부터 적당하게 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 분산제는 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 알킬 아릴 술포네이트, 긴-사슬 알콜 설페이트 (1 차 및 2 차 알킬 술페이트) , 술폰화된 올레핀, 술페이트 모노글리세라이드, 술페이트 에테르, 술포숙신네이트, 술폰화된 메틸 에테르, 알칸 술포네이트, 포스페이트 에스테르, 알킬 이소티오네이트, 아실사르코사이드, 알킬타우라이드, 형광계면활성제, 지방 알콜 및 알킬페놀 축합물, 지방산 축합물, 아민을 가진 에틸렌 옥사이드의 축합물, 아마이드를 가진 에틸렌 옥사이드 축합물, 수크로스 에스테르, 솔비탄 에스테르, 알킬로아미드, 지방 아민 옥사이드, 에톡시화된 모노아민, 에톡시화된 디아민, 알콜 에톡실레이트 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 매우 유용한 분산제는 Berol 08 (product of Akzo Nobel, Sweden) 과 같은 알콜 에톡시레이트이다.

큐티나제 변이체의 제조 방법.

본 발명의 큐티나제 변이체는 예를 들어, WO 94/14963 또는 WO 94/14964 (Unilever) 에 개시된 대로 당업계에서 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기에 큐티나제-암호화 DNA 서열을 클론닝하는 방법, 연이어, 큐티나제 암호화 서열내의 특정 위치에서 돌연변이를 유발하는 방법을 개시한다.

큐티나제를 암호화하는 DNA 서열의 클론닝

모 큐티나제를 암호화하는 DNA 서열은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여, 문제의 큐티나제를 생산하는 어느 세포 또는 미생물로부터 분리될 수 있다 먼저, 연구할 큐티나제를 생산하는 유기물의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA 를 사용하여 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리를 제조해야한다. 그 때, 큐티나제의 아미노산 서열을 안다면, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 합성될 수 있고, 문제의 유기물로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 큐티나제-암호화 클론을 확인하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 알려진 큐티나제 유전자에 상동성이 있는 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 낮은 긴축도의 혼성화 및 세척 조건을 사용하여, 큐티나제 암호화 클론을 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.

그러나, 큐티나제-암호화 클론을 확인하기 위한 다른 방법은 플라스미드와 같은 발현 벡터에 게놈 DNA 의 단편을 삽입하는 단계, 결과적인 게놈 DNA 라이브러리로 큐티나제-음성 세균을 형질전환시키는 단계, 및 그 다음, 형질전환된 세균을 큐티나제에 대한 기질을 함유하는 한천(즉, 말토스)에 플레이팅하여 큐티나제를 발현하는 클론의 확인을 허용하는 단계를 포함한다.

대안적으로, 효소를 암호화하는 DNA 서열은 예를 들어, S. L. Beaucage and M. H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, p.1859-1869 에 개시된 포스포 로아미다이트 방법 , 또는 Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p. 801-805 에 개시된 방법과 같은 확립된 표준 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있을 것이다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동화 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐되고, 연결되고 적당한 벡터에 클론된다.

최종적으로, DNA 서열은 표준 기법에 따라, 합성, 게놈 또는 cDNA 개시 단편(적당하게는, 전 DNA 서열의 다양한 부분에 상응하는 단편)을 연결하여 제조된, 혼합된 게놈 및 합성 개시, 혼합된 합성 및 cDNA 개시 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 개시일 수 있다. DNA 서열은 또한, 예를 들어, US 4,683,202 또는 R. K. Saiki et al., (1988), Science 239,1988, pp. 487-491에 개시된 것과 같은 특정 프라이머를 사용하여, 폴리머아제 사슬 반응 (PCR)으로 제조될 수 있다.

부위-특이적 돌연변이유발

일단 큐티나제-암호화 DNA 서열이 분리되었고, 돌연변이를 위한 원하는 위치가 확인되었다면, 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이 위치의 측면에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적인 방법에서, 큐티나제를 암호화하는 서열인 단일 가닥 갭의 DNA 가 큐티나제 유전자를 운반하는 벡터에서 생산된다. 그 때, 원하는 돌연변이를 포함하는 합성 뉴클레오티드는 단일 가닥 DNA 와 상동성이 있는 부분에 어닐된다. 그 때, 남아있는 갭은 DNA 폴리머아제 I (클레노우 단편) 으로 채워지고 구조체는 T4 리가제를 사용하여 연결된다. 이러한 방법의 구체적인 예는 Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639 에 개시된다. US 4,760,025 는 카세트의 마이너 변형을 수행하여 복합 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, 다양한 길이의 다수의 올리고뉴클레오티드가 도입될 수 있기 때문에, Morinaga 방법에 의해 훨씬 다양한 돌연변이 조차도 한 번에 어느 위치에도 도입될 수 있다.

큐티나제-암호화 DNA 서열에 돌연변이를 도입하는 또다른 방법은 Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p.147-151 에 개시된다. 그것은 PCR 반응에서 하나의 프라이머로 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 사용하여 도입된, 원하는 돌연변이를 포함하는 PCR 단편의 3 -단계 생산을 포함한다. PCR-생산 단편으로부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 분리될 수 있고, 발현 플라스미드에 재삽입될 수 있다.

큐티나제 변이체의 발현

본 발명에 따라서, 상기에 개시된 방법에 의해, 또는 당업계에 공지된 어느 대안적인 방법에 의해 제조된 변이체를 암호화하는 DNA 서열은 전형적으로 프로모토, 오퍼레이터, 리보솜 결합 위치, 번역 개시 신호, 및, 선택적으로 억제 유전자 또는 다양한 활성 유전자를 암호화하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.

발현 벡터

본 발명의 큐티나제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 재조합 발현 벡터는 용이하게 재조합 DNA 과정에 놓일 수 있는 어느 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 숙주 세포에 도입될 때, 벡 터는 숙주 세포 게놈에 삽입되고 삽입된 염색체와 함께 복제된다. 적당한 발현 벡터의 예는 pMT838 을 포함한다.

프로모터

벡터에서, DNA 서열은 조절가능하게 적당한 프로모터 서열에 연결된다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보이는 어느 DNA 서열일 수 있고 숙주세포에 대해 상동의 또는 비상동의 단백질을 암호화하는 유자자로부터 유도될 수 있다.

구체적으로는 세균 숙주에서, 본 발명의 큐티나제 변이체를 암호화하는 DNA 서열의 전사를 지시하는 적당한 프로모터의 예는 E.coli 의 lac 오페론의 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가라제 유전자 dag A 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자 (amyL) 프로모터, Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM) 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제 (amyQ) 프로모터, Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자등의 프로모터이다. 균류 숙주에서의 전사를 위해서, 유용한 프로모터의 예는 A. oryzae TAKA 아밀라제, S.cerevisiae 로부터의 TPI (트리오스 포스페이트 이소머아제) 프로모터(Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p. 419-434), Rhizomucor miehei 아스파르트산 프로테인아제, A. niger 중성 α-아밀라제, A. niger 산 안정성 α-아밀라제, A. niger 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파제, A. oryzae 알카라인 프로테아제, A. oryzae 트리오스 포스페이트 이소머아제 또는 A. nidulans 아세타미다제를 암호화하는 유전자로부터 유도된 프로모터이다.

발현 벡터

본 발명의 발현 벡터는 또한 적당한 전사 종결자 및, 진핵생물에서, 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화된 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 같은 공급원으로부터 적당하게 유도될 수 있다.

벡터는, 벡터를 문제의 숙주 세포에서 복제가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702 의 복제 기점이다. .

벡터는 예를 들어, B. subtilis 또는 B. licheniformis 로부터의 dal 유전자와 같은 숙주세포의 결점을 보완할 수 있는 유전자 산물, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 유전자 산물과 같은 선택적인 마커를 또한 포함한다. 더욱이, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 sC 와 같은 Aspergillus 선택 마커, 히그로마이신 내성을 일으키는 마커를 포함할 수 있거나, 또는 선택은 예를 들어 WO 91/17243 에 개시된 것과 같은 공-형질전환에 의해 달성될 수 있다.

큐티나제 변이체, 프로모터, 종결자 및 다른 요소를 각각 암호화하는 본 발명의 DNA 구조체를 연결시키고, 그들을 복제에 필요한 정보를 포함하는 적당한 벡터에 삽입시키는데 사용되는 과정은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진다.(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 참조).

숙주 세포

상기에 정의된 대로, DNA 구조체 또는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 유리하게도 본 발명의 큐티나제 변이체의 재조합 생산에서 숙주 세포로서 사용된다. 세포는 숙주 염색체에 DNA 구조체(하나이상의 카피로)를 삽입하는 것에 의해 용이하게 변이체를 암호화하는 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환될 수 있다. 이 삽입은 일반적으로 DNA 서열이 세포에 안정하게 유지하려는 경향이 강할 때 유리한 것으로 여겨진다. DNA 구조체의 숙주 염색체로의 삽입은 예를 들어, 상동 또는 비상동 재조합과 같은 종래의 방법에 따라서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 세포는 다른 형태의 숙주 세포와 관련되어, 상기에 개시된 대로 발현벡터로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 세포는 포유동물 또는 곤충과 같은 고등 유기물의 세포일 수 있으나, 바람직하게는 예를 들어, 세균 또는 균류(효모 포함) 세포와 같은 미생물 세포이다.

적당한 세균의 예는 Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinu 와 같은 그람 양성 세균, 또는 E. coli 와 같은 그람 음성 세균이다. 세균의 형질전환은 그 자체로 공지된 방법으로 예를 들어, 원형질체 형질전환 또는 수용능력있는 세포를 사용하여 실행될 수 있다.

효모 유기물은 예를 들어, Saccharomyces cerevisiae와 같은 종 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 로부터 유리하게 선택될 수 있다.

숙주 세포는 Aspergillus 종, 가장 바람직하게는 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger 또는 Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (완벽한 상태에서 Gribberella zeae 으로 명명, 본래는 Sphaeria zeae, Gibberella roseum 및 Gibberella roseum f. sp. cerealis 의 이명)또는 Fusarium sulphureum (완벽한 상태에서 Gibberella puricaris 로 명명, Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum, and Fusarium roseum var. graminearum 와 이명), Fusarium cerealis (Fusarium crokkwellnse 와 이명), 또는 Fusarium venenatum 균주와 같은 균주 Fusarium 에 속하는 균주와 같은 사상균일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 프로테아제 결핍 또는 프로테아제 마이너스 균주이다.

이것은 예를 들어, 축약하여 "alp" 로 명명된 알칼라인 프로테아제 유전자를 가지는 프로테아제 결실 균주 Aspergillus oryzae JaL 125 일 수 있다. 이 균주는 WO 97/35956 (Novo Nordisk) 에 개시된다.

사상균 세포는 원형질체 형성 및 형질전환에 뒤이어 그 자체로 공지된 방법으로 세포벽의 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환될 수 있다. 숙주 미생물로서 Aspergillus 의 사용은 EP 238 023 (Novo Nordisk A/S) 에 개시되고, 그것의 내용은 여기에 참고로서 수록된다.

형질전환체 배양에 의한 큐티나제 변이체의 제조

본 발명은 그중에서도 특히, 변이체의 생산에 기여하는 조건하에서 숙주세포를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배양물 배지로부터 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 큐티나제 변이체의 제조 방법에 관한 것이다.

세포 배양에 사용되는 배지는 문제의 숙주세포를 배양하고 본 발명의 큐티나제 변이체의 발현을 얻기에 적합한 종래의 어느 배지일 수 있다. 적당한 배지는 상업적 공급자로부터 이용가능하거나 공개된 방법에따라 제조될 수 있다.(예를 들어, the American Type Culture Collection 의 카탈로그에 개시됨)

숙주 세포로부터 분비된 큐티나제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하는 단계, 및 황산 암모늄과 같은 염에 의해 배지의 단백질성 성분을 침전시키는 단계에 뒤이어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피등과 같은 크로마토그래피 과정을 사용하는 단계를 포함하는 잘 알려진 과정에 의해 배양물 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.

식물에서 변이체의 발현

본 발명은 또한 회수가능한 양으로 효소를 발현하고 생산하기 위하여 본 발명의 변이체를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에 관한 것이다. 효소는 식물 또는 식물 부분으로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, 재조합 효소를 포함하는 식물 또는 식물 부분은 그 자체로 사용될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 쌍자엽식물 또는 단자엽식물, 약하여, 쌍자엽류 또는 단자엽류일 수 있다. 단자엽 식물의 예는 포아풀과의 풀(blue grass, Poa)과 같은 풀, 페스추카같은 마초식물, 로리움, 아그로스티스와 같은 온대성 풀, 및 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 당밀 및 옥수수(콘)과 같은 곡물이다.

쌍떡잎식물의 예는 담배, 루핀과 같은 콩과 식물, 감자, 사탕무우, 완두콩, 콩 및 대두, 및 콜리플라워와 같은 평지과(과 Brassicaceae)식물, 채종유종자 및 유기물 Arabidopsis thaliana 와 밀접하게 관련있는 모델이다.

식물 부분의 예는 줄기, 칼루스, 잎, 뿌리, 과실, 종자, 및 괴경이다. 본 발명의 명세서에서, 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 퍼옥시좀 및 세포질과 같은 구체적인 식물 조직이 식물부분으로 고려된다. 더욱이, 조직 기원이 무엇이던간에, 어느 식물 세포라도 식물 부분으로 고려된다.

본 발명의 범위내에 또한 포함되는 것은 이러한 식물, 식물 부분 및 식물 세포의 자손이다.

본 발명의 변이체를 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 당업계에서 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 간단하게, 식물 또는 식물 세포는 본 발명의 효소를 암호화하는 하나 이상의 발현 구조체를 식물 숙주 게놈에 삽입하고, 결과적으로 변형된 식물 또는 식물 세포를 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포로 번식시키는 것에 의해 제조된다.

종래에는, 발현 구조체는 식물 또는 식물의 선택적인 부분에서 유전자의 발현에 필요한 적당한 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 본 발명의 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 구조체이다. 더욱이, 발현 구조체는 발현 구조체가 숙주 세포에 삽입되었는지 확인하기에 유용한 선택 마커 및 문제의 식물에 구조체의 도입에 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다. (후자는 사용된 DNA 도입 방법에 의존한다.)

프로모터 및 종결자 서열 및 선택적으로 신호 또는 트랜싯 서열과 같은 조절 서열의 선택은 예를 들어, 효소가 언제, 어디서 그리고 어떻게 발현되기를 원하는 가에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 효소를 암호화하는 유전자의 발현은 구성성분 또는 유도가능하거나, 발생학적일 수 있고, 단계 및 조직 특이적이고, 유전자 산물은 종자 또는 잎과 같은 특정 조직 또는 식물 부분에 표적화될 수 있다. 조절 서열은 Tague et al,Plant, Phys.,86,506,1988 에 개시된다.

구성적 발현을 위해, 35S-CaMV 프로모터가 사용될 수 있다.(Franck et al.,1980.Cell 21:285-294). 기관-특이적 프로모터는 예를 들어, 종자, 포테이토 괴경, 및 과실과 같은 저장 수용부 조직으로부터의 프로모터이거나(Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), 또는 분열조직과 같은 대사 수용부로부터의 프로모터(Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24: 863-878),겔라틴, 프로라민, 쌀로부터의 글로불린 또는 알부민과 같은 종자 특이적 프로모터(Wu et al.,Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), Conrad U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp. 708-711 (1998)에 개시된, 레구민 B4 및 Vicia faba 로부터 알려지지않은 종자 단백질 유전자로부터의 Vicia faba 프로모터, 종자 유체 단백질로부터의 프로모터(Chen et al., Plant and cell physiology vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1998)), Brassica napus 로부터의 저장 단백질 napA, 또는 예를 들어, WO 91/14772 에 개시된 대로 당업계에 알려진 어는 다른 종자 특이적 프로모터이다. 더욱이, 프로모터는 쌀 또는 토마토로부터의 rbcs 프로모터와 같은 잎 특이적 프로모터(Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp. 991-1000 (1993)), 콜레라 바이러스 아데닌 메틸트랜스퍼아제 유전자 프로모터(Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1 pp. 85-93 (1994)), 또는 쌀로부터의 aldP 유전자 프로모터 (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp. 668-674 (1995)), 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처로 유도될 수 있는 프로모터(Xu et al, Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp. 573-588 (1993)) 일 수 있다.

프로모터 인핸서 구성요소는 식물에서 효소의 더 많은 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모토 인핸서 구성요소는 프로모터와 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하는 인트론 일 수 있다. 예를 들어, Xu et al. op cit 는 발현을 증가시키기 위한 쌀 액틴 1 의 제 1 의 인트론의 사용을 개시한다.

선택 마커 유전자 및 발현 구조체의 다른 어느 부분은 당업계에서 이용가능한 것으로부터 선택될 수 있다.

DNA 구조체는 아가로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질 전환, 바이러스-매개 형질전환, 미세 주입, 입자 충격, 바이오리스틱 형질전환, 전기천공법을 포함하는 당업계에 주지된 종래의 기법에 따라 삽입된다.(Gasser et al, Science, 244,1293; Potrykus, Bio/Techn. 8,535,1990; Shimamoto et al, Nature, 338,274,1989).

현재에는, Agrobacterium tumefaciens 매개 유전자 전이는 트랜스제닉 쌍떡잎류 생성을 위한 선택적인 방법(개관을 위해 Hooykas & Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38)이나, 일반적으로 다른 형질전환 방법이 쌍떡잎류 식물에 바람직하기는 하지만, 그것은 또한 외떡잎류를 형질전환시키기 위해서도 사용될 수 있다. 현재에는, 트랜스제닉 외떡잎류 생성을 위한 선택적인 방법은 배아 세포 또는 발생하는 배아의 입자 충격(형질전환 DNA 로 미세 금 또는 텅스텐 피복)이다. (Christou, 1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992.Bio/Technology 10: 667-674). 외떡잎류 형성을 위한 선택적인 방법은 Omirulleh S, et al., Plant Molecular biology Vol. 21, No. 3 pp. 415-428 (1993) 에 개시된 원형질체 형질전환에 기초한다.

이어서, 형질전환, 삽입된 발현 구조체를 가진 형질전환체가 선택되고 당업계에서 잘 알려진 방법에 따라 전 식물로 재생성된다.

물질 및 방법

플라스미드

pJS0026

이것은 WO 97/07205 및 J. S. Okkels (1996)에 개시된 (" pYES 벡터에서 URA3-프로모터 결실은 Saccharomyces cerevisiae 에서 균류 리파제의 발현 수준을 증가시킨다" 재조합 DNA 생물공학 III: Annals of the New York Academy of Sciences 의 생물 및 공학 과학의 통합, vol. 782) S. cerevisiae 발현 플라스미드이다.

pFuku83

이것은 pJSOO26 으로부터 제조된 TPI 프로모터의 조절하에 H.insolens 큐티나제의 발현을 위한 효모 및 E. coli 셔틀 벡터이다.

기질

BETEB

테레프탈산 비스(2-히드록시에틸) 에스테르 디벤조에이트는 여기에서 BETEB (벤조일-에틸렌-테레프탈산-에틸렌-벤조에이트)로 축약된다. 그것을 테레프탈산 비스(2-히드록시에틸) 에스테르 및 벤조 산으로부터 제조하였다.

리파제 활성 (LU)

리파제에 대한 기질을 유화제로서 아라비아 검을 사용하여 트리부틸린 (글리세린 트리부틸레이트)를 유화시켜서 제조한다. 30 ℃, pH 7 에서 트리부틸린의 가수분해는 pH-스태트 적정 실험에 따른다. 리파제 활성의 한 단위(1 LU)는 표준 조건에서 1μ몰 부틸 산/분을 용해할 수 있는 효소의 양과 같다.

다른 스캐닝 열량측정법 (DSC)

샘플을 칼로리측정기에 로딩하기 전에 샘플 및 기준 용액을 조심스럽게 탈개스한다. (기준: 효소 부재의 완충액). 샘플 및 기준 용액( 대략 0.5 ml)을 5℃ 에서 20 분동안 열로 예비-평형화한다. DSC 스캔을 대략 90 K/hr 의 스캔 속도로 5 ℃ 내지 95 ℃ 에서 수행한다. 변성 온도를 대략 +/-1 ℃ 의 정확성으로 결정한다. MicroCal Inc. 로부터의 VP-DSC 가 실험에 적합하다.

방법

PCR 조건

단계 1: 94 ℃, 120 초.

단계 2: 94 ℃, 60 초

단계 3: 50 ℃, 60 초

단계 4: 72 ℃, 150 초.

단계 2 로 가서, 35 사이클.

단계 5: 72 ℃, 480 초.

단계 6: 지속적으로 4 ℃

실시예 1: 큐티나제 변이체의 제조

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제를 암호화하는 DNA 서열이 US 5,827,719 (Novo Nordisk) 에 개시된 대로 얻어졌고, 그 서열내에 SEQ ID NO:1 에서 보여진 DNA 서열을 가진것으로 밝혀졌다.

변이체를 국부화된 랜덤 돌연변이화 단계 및 BETEB 플레이트상에서 1 일 동안 60℃ 에서 인큐베이션하여 양성 클론을 선택하는 단계에 의해 제조했다. BETEB 플레이트는 200 ml/l 의 500 mM 글리신 완충액(pH 8.5), 1.25 g/l 의 BETEB (뜨거운 에탄올에서 용해) 및 20 g/l 의 한천을 포함했다.

3 개의 양성 변이체를 분리했고, 그들의 아미노산 서열을 결정했다. 그들은 모 휴미콜라 인솔렌스(H.insolens) 큐티나제와 비교하여 하기의 변형을 가지는 것으로 밝혀졌다.

A14P + E47K

E47K

E179Q

실시예 2: 부위 특이적 돌연변이

치환 E6Q+ E47K+ R51P 를 가지는 휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제의 변이체를 하기에 따라 제조했다:

한 쌍의 PCR 프라이머를 근처에 존재하는 제한 효소 위치를 이용하여 하기와 같은 아미노산 치환을 도입하기 위해 설계했다.(별표는 도입된 돌연변이를 나타낸다):

상부 프라이머: E6Q F

cgg cag ctq gga gcc atc c*ag aac

Pvu II

하부 프라이머: E47K, R51P

cgc cct gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg act t*aa ggc

Bam H I

상기에 개시된 PCR 조건 하에서 주형으로서 이러한 프라이머 및 pFukuNL83 을 사용하여 PCR 을 수행했다.

얻어진 PCR 단편을 Clontech Spincolumn 에서 정제했고 Pvu II 및 BamH I 으로 분해했다.

결과적인 단편을 겔-정제했고 같은 제한 효소 위치로 분해된 pFukuNL83 에 연결했다.

실시예 3: 큐티나제 변이체의 열안정성

변이체

열 안정성을 H.insolens 큐티나제 및 이의 하기의 변이체에 대해 하기에 개시된 대로 시험했다:

A14P+ E47K

E47K

E179Q

E6Q+ E47K+ R51P

A14P+ E47K+ E179Q

E6Q+ A14P+ E47K+ R51P+ E179Q

E6Q+ E10Q+ A14P+ E47K+ R51P+ E179Q

다른 스캐닝 열량측정법(DSC)

큐티나제 변이체의 열안정성을 pH 4.5 (50 mM 아세테이트 완충액) 및 pH 8.5 (50 mM 글리실-글리신 완충액)에서 DSC 를 사용하여 조사했다. 일정하게 프로그램화된 가열 속도에서, 효소 용액의 가열 후에 얻어진 온도기록도(Cp 대 T) 에서 최고의 변성 피크(주요한 흡열 피크)로 열 변성 온도, T_d 를 취했다.

모 큐티나제는 pH 8.5에서 63 ℃ T_d를 가진 것을 밝혀냈다. 상기의 변이체 A14P+E47K; E47K; E179Q; E6Q+E47K+R51P; A14P+E47K+E179Q; E6Q+A14P+E47K+R51P+ E179Q; E6Q+E10Q+A14P+E47K+R51P+E179Q는 70-73 ℃ 의 T_d , 즉 7-10^。향상된 온도를 가진 것을 밝혀냈다.

본 큐티나제는 pH 4.5에서 61 ℃의 T_d를 가진 것을 밝혀냈다. 상기의 변이체 E179Q; E6Q+E47K+R51P; A14P+E47K+E179Q; E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q; E6Q+ E10Q+A14P+E47K+R51P+E179Q는 64-66 ℃ 의 T_d, 즉 3-5^。향상된 온도를 가진 것을 밝혀냈다.

BETEB 의 가수분해

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제 및 변이체 E47K 및 E179Q의 열안정성을 높은 온도에서 BETEB의 가수분해에 의해 측정했다. 각각의 큐티나제에 대해, 하기의 혼합물을 55-70℃의 범위에서 다양한 온도로 17 시간동안 인큐베이션했다:

0.1 ml 0.5 M 글리실-글리신 완충액 (pH 8.5)

에탄올에서 용해된 0.1 ml 0.5 % BETEB

0.1 ml 효소 용액(대략 25 LU/ml)

0.7 mi Milli Q 물

가수분해의 정도를 인큐베이션 후에 측정했다. 결과를 하기의 표에서 보여준다.

이러한 결과는 변이체가 모 큐티나제에 비해 향상된 열안정성을 가진다는 것을 분명하게 보여준다.

BETEB 의 가수분해

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제 및 변이체 E6Q+A14P+E47K+R51P+ E179Q; E6Q+E10Q+A14P+E47K+R51P+E179Q; A14P+E47K의 열안정성을 2시간 동안 60℃ 에서 BETEB 가수분해에 의해 측정했다. 온도가 60 ℃ 에서 고정되고 큐티나제 투여량을 다양하게 한 것을 제외하고는, 가수분해를 상기의 온도에서 수행했다. 하기의 결과가 하기의 표에서 보여진다.

결과는 모 큐티나제를 가진 것보다 변이체를 가진 것이 60 ℃ 에서 훨씬 빠른 가수분해를 보인다.

실시예 4: c3ET 의 가수분해

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제 및 변이체 E6Q+E10Q+A14P+E47K+ R51P+E179Q; E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q; A14P+E47K+E179Q; E6Q+E47K+R51P; E47K를 더 높은 온도에서 c3ET 의 가수분해로 시험했다. 각각의 큐티나제의 경우에, 하기의 혼합물을 다양한 온도에서 2 시간동안 인큐베이션했다.

0.115mg c3ET (HFIP 에서 용해된 0.1 ml 의 2mM c3ET 를 반응용기에서 취했다. 용매를 진공상태에서 제거한 후 하룻밤동안 70 ℃ 에서 건조시켰다)

0.1 ml 0.5M 글리실-글리신 완충액 (pH8.5)

0.1ml 효소 용액(대략. 600LU/ml)

0.8mi Milli Q 물

인큐베이션 후에, 2ml 의 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFIP) 을 각 반응 혼합물에 첨가한 후, 가수분해 비율을 HPLC 로 측정했다. 도 3 에서 보여 진 결과는 변이체가 모 큐티나제에 비하여 향상된 열안정성을 가진다는 것을 분명하게 나타낸다.

실시예 5: 얀에서 c3ET 의 가수분해

휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제 및 변이체 E6Q+E10Q+A14P+E47K+ R51P+E179Q; E6Q+A14P+E47K+R51P+E179Q; A14P+E47K+E179Q; E6Q+E47K+R51P; E47K의 열안정성을 제품으로 c3ET를 포함하는 폴리에스테르 얀을 사용하여 시험했다. 하기의 기질 혼합물을 60 또는 65 ℃ 에서 예비-인큐베이션했다 :

0.1 g 폴리에스테르 얀

0.2ml 0.5M 글리실-글리신 완충액 (pH8.5)

1.7ml Milli Q 물

예비인큐베이션 후에, 0.1ml 효소 용액 (대략. 1000 LU/ml) 을 각 반응 용기에 첨가했고 17 시간동안 인큐베이션했다. 그 때, 2ml HFIP 를 첨가했고, 폴리에스테르 얀 표면상의 c3ET 가 추출되고 가수분해되도록 30 분동안 방치했고, 그때, 가수분해 비율을 측정했다. 결과는 도 4 에서 보여진다.

변이체가 폴리에스테르 얀상의 c3ET 를 가수분해하기에 모 큐티나제보다 더욱 효과적임을 나타낸다. 하나의 변이체는 60 ℃ 보다 65 ℃ 에서 높은 가수분해 비율을 부여한다.

실시예 6: 큐티나제 변이체로 얀의 처리

서로 다른 온도 또는 투여량에서 폴리에스테르 얀 상에서 c3ET 가수분해의 시간 코스를 검사했다. 다른 온도에서 시간 코스는 도 5 에서 보여진다. 적정 온도는 65 ℃ 를 보인다. 여전히 70 ℃ 에서 약 반정도의 활성이 남아있다. 증가된 효 소 투여량을 가진 시간 코스가 도 6 에서 보여진다. 투여량 275 및 550 LU/ml 에서의 코스는 100 내지 275 LU/ml 의 투여량 사이에서 가수분해 비율이 플래토에 도달했다는 것을 나타내는 것과 같게 나타난다. 아마도 200 LU/ml 이 충분하다.

실시예 7: 반응 염료로 폴리에스테르 염색

하기의 폴리에스테르 직물을 처리했다:

짠 직물; ca. 2 x 2 cm, 34mg

니트 직물; ca.1.5 ×1.5 cm, 50mg

각 직물을 0.9 ml, 50 mM GlyGly (글리실-글리신) 완충액 (pH 8.5) 및 0.1ml 용액의 H.insolens 큐티나제 변이체(1100LU/ml)에 담구웠고, 65 또는 70 ℃ 에서 인큐베이션했다. 하루 후에, 다른 0.1 ml 의 효소 용액을 첨가했고, 인큐베이션을 이틀 이상 지속했고, 그 다음, 직물을 꺼내어 물에서 린스했다. 비교 실험을 모 큐티나제로 하여 만들었고, 블랭크를 효소 부재하에서 같은 방법으로 처리했다.

직물을 60 ℃, 30 분동안, 3 리터 탈이온화된 물에서 9 g 120 g Na₂SO₄ 및 60 g Na₂CO₃ 의 혼합물에서 교반했고, 그 다음에 흐르는 따뜻한 물로 린스했다. 반응 염료는 구조, 발색단-NHPh-S0₂CH₂CH₂OSO₃Na 를 가지는 Celmazol Brilliant Blue B (Mitsui Chemical Co.의 제품,Japan) 였다.

모든 4 실험에서, (짠직물 및 니트직물, 65 및 70 ℃) 직물을 균일하게 염색했다.

실시예 8: 니트 직물로부터 폴리에스테르 단편의 용해도

1x1 cm 샘플의 니트 폴리에스테르 직물을(PET, 에틸렌글리콜 및 테레프탈산의 중합체)를 0.01 mg 의 H.insolens 큐티나제 변이체를 가지고 pH 10, 60℃ 에서 1 ml 의 완충액에서 1 시간동안 인큐베이션했다. 반응 혼합물을 분리했고, 테레프탈산의 용해를 250 nm 에서 OD 를 측정하여 확인했다. (OD₂₅₀/mg PET 로 표현될 때). 비교 실험을 효소 부재 및 모 큐티나제를 가지고 만들었다. 결과:

결과는 변이체가 폴리에스테르를 용해시키는 데 효과적이라는 것을 보여준다.

다른 실험에서, 0.5 내지 200 LU/ml 의 다양한 양의 변이체를 사용하여, 큐티나제 변이체를 비-이온 계면활성제(name Softanol 50의 제품, 옥실레이트)의 첨가 및 부재하에서 65 ℃ 로 2 시간동안 시험했다. 결과는 비-이온 계면활성제의 존재하에서 더욱 용해성이 증가한다는 것을 나타냈다.

실시예 9 : 폴리카프로락톤 및 폴리에스테르 필름의 가수분해

약 0.1 g 의 폴리카프로락톤 또는 폴리에스테르 필름을 튜브에 넣었다. 그것들을 H.insolens 큐티나제 변이체(450 LU)의 존재 또는 부재하에 5ml 의 50mM GIyGly 완충액에(pH 8.5) 담궜다. 그것을 5 시간동안 70 ℃ 에서 인큐베이션했다. 반응후에, 폴리카프로락톤 및 폴리에스테르 필름 모두를 가진 효소를 가지고 튜브의 표면상의 가수분해물의 얇은 층을 관찰했다. 반면, 효소가 없는 대조군에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 폴리카프로락톤의 경우에, 10 % 의 중량 손실이 있었다. 우리는 폴리에스테르의 어떤 중량 변화도 관찰하지 못했다.

실시예 10: cPET 가수분해

큐티나제 변이체의 실행을 모 효소 (휴미콜라 인솔렌스(H. insolens) 큐티나제)와 비교했다. 시험을 하기와 같이 했다 :

올리고머-염색된 PET-직물(검정)의 견본(대략4 cm × 13 cm)을 소위 미니테르지토미터(minitergitometer) 장치에서 상대적으로 낮은 교반으로 효소-처리하에 놓았다. PET-직물을 실린더의, 관통된 홀더(반지름 ca.2 cm, 높이 ca 6 cm)위에 탑재하고, PET 직물의 올리고머-염색된 측면이 실린더의 외부와 접하도록 축주위를 회전시킨다.

직물을 허여 온도 (여기서는 65 ℃) 에서 100 ml 의 처리 용액을 포함하는 150 ml 의 글래스-비이커에 담군다. 허여된 처리 시간 후에 (여기서는 90 분), PET 견본을 욕으로부터 꺼내어 탈이온화된 물에서 린스하고 공기중에서 건조시킨다.

컨디션닝 후에 견본을 올리고머-염색을 가진 측면상에서 (올리고머 염색 제거에 관하여) 가시적으로 등급을 매긴다. 등급은 하기와 같다:

-2: 블랭크보다 훨씬 나쁜 샘플 (무(無)효소)

-1: 블랭크보다 약간 나쁜 샘플 (무(無)효소)

0: 샘플을 블랭크로부터 구별할 수 없다.

1: 블랭크보다 약간 향상된 샘플

2: 블랭크보다 훨씬 향상된 샘플

또한, 견본은 색상 강도 (600 nm 에서 K/S-값)를 정량화하기 위해 분광광도적(장치: Hunterlab Reflectometer)으로 해독한다.

하기의 표는 유사한 조건하에서 효소 수행을 비교하는 시험을 위한 시험-조건을 요약한다:

온도: 65 ℃

완충액/pH: 50 mM 글리신 완충액, pH 10.3

처리 시간 (min) 90

효소의 투여량(LU/g) 30000

시험으로부터의 결과를 하기에 요약한다.

따라서, 이러한 실험 셋트로부터 모 효소가 허여 시험 조건하에서 단지 거의 제한된 효과 또는 효과의 부재를 제공한 반면에(아마도 온도가 효소에 대해 너무 높아서 활성을 유지하기 어렵기 때문이다.) 큐티나제 변이체는 PET-직물로부터 올리고머 염색의 상당한 제거를 제공한다.

Example 11: cPET 가수분해

H.insolens 큐티나제의 변이체의 pH 및 시간 프로파일을 분산 염색 실험 모 델에서 시험했다. 시험은 하기와 같았다 :

PET-직물의 올리고머-염색 견본(검정)을 Werner Mathis Labomat 에서 전형적인 분산 염색 서열 조건에 놓는다. 공정의 전체적인 개관은, 견본을 완충액 용액에 첨가하고, 130 ℃ 까지 가열하고, 처리온도까지 냉각시킨다. 효소 또는 완충액을 첨가한 후 30 분 동안 원하는 온도에서 유지한다. 용액을 실내온도로 냉각하고, 세척액의 혼탁도를 측정한다. 혼탁도의 환원이 가수분해된 cPET 올리고머에 상응하는 큐티나제 활성의 직접적인 측정이다.

실험의 상세한 설명:

검정 PET (대략 4cm x 13cm) 견본을 0.2 g/l Lutensol AT11 (BASF) 를 포함하는 140 ml 100 mM Britton Robinson 완충액에 첨가하고 Labomat (분당 32 회전)에 놓았다.

Labomat 를 9 ℃/ 분의 변화도로 130 ℃ 까지 가열하고, 10 분동안 유지한다.

비이커를 9 ℃/ 분의 변화도로 (하기 표에 따라) 급하강 온도로 냉각시키고, 1 분간 유지한다.

적당한 pH 에서 10 mL 효소 용액(변이체의 100 LU/ml) 또는 완충액 용액(0 LU/ml) 을 비이커에 주입한다.

Labomat 를 2 ℃/분의 변화도에서 재가열시키고, 30 분동안 유지시킨다.

견본을 제거하고, 세척액을 실내온도로 냉각시킨다.

세척액의 혼탁도를 측정한다.

평가 : 혼탁도를 Hach 18900 Ratio Turbidimeter ( 1.8,18, 및 180 NTU 혼탁도 표준으로 표준화됨) 상에서 측정한다. 효소 수행을 블랭크 액(효소 부재)의 혼탁도 및 효소 처리 액의 혼탁도 사이의 차이로서 블랭크에 상대적으로 계산한다.

큐티나제 변이체의 상대적인 수행(혼탁도의 환원)을 계산하고, 결과는 하기에 보여진다. 음성적인 숫자가 얻어질 때는 결과는 "음성" 으로 표시된다. 음성적인 숫자는 셋업의 다양성에 의해 야기된 인위물로 추측된다.

결과는 큐티나제 변이체가 광범위한 pH 및 온도 범위에 걸쳐 활성을 나타내며, 통상의 셋업에서는, pH 9 주변 및 75 ℃ 에서 최적의 올리고머 제거를 보인다는 것을 나타낸다. 불활성은 85 ℃ 이상에서 발생하는 것 같다.

실시예 12: cPET 가수분해

처리 시간의 효과를 분산 염색 실험 모델에서 H.insolens 큐티나제 변이체에 대해 조사했다. 시험을 하기와 같이 수행한다 :

PET- 직물의 올리고머-염색된 견본(검정) 을 Werner Mathis Labomat 의 전형적인 분산 염색 조건하에 놓는다. 공정의 개관은, 견본을 완충액 용액에 첨가하고, 130 ℃ 로 가열하고, 처리 온도까지 냉각한다. 효소 또는 완충액(100 mM Britton Robinson pH 9) 을 첨가한 후, 0-40 분동안 75 ℃ 에서 유지시킨다. 용액을 실내 온도로 냉각시키고 세척액에서의 혼탁도를 측정한다. 혼탁도의 환원은 가수분해된 cPET 올리고머에 상응하는 큐티나제 활성의 직접적인 측정이다.

실험의 상세한 설명:

검정 PET (대략 4cm x 13cm) 견본을 0.2 g/l Lutensol AT11 (BASF) 를 포함하는 140 ml 100 mM Britton Robinson 완충액에 첨가하고 Labomat (분당 32 회전)에 로딩했다.

Labomat 를 9℃/분의 변화도로 130 ℃ 까지 가열하고, 온도를 10 분동안 유지한다.

비이커를 9 ℃/분의 변화도로 75 ℃ 까지 냉각시키고, 1 분동안 유지시킨다.

10 mL 효소 용액(변이체의 100 LU/ml) 또는 100 mM Britton-Robinson 완충액 pH 9.0 (0 LU/ml) 을 비이커에 주입한다.

Labomat 를 2℃/ 분의 변화도에서 75 ℃ 까지 재-가열하고, 적당한 시간동안 유지한다. (0-40 분,하기 표 참조).

견본을 제거하고, 세척액을 실내 온도까지 냉각시킨다.

세척액의 혼탁도를 측정한다.

평가: 혼탁도를 Hach 18900 Ratio Turbidimeter ( 1.8,18, 및 180 NTU 혼탁도 표준으로 표준화됨)상에서 측정한다. 효소 수행은 0 과 같은 시간에서 블랭크에 상대적으로 계산한다: 시간 0 에서(효소 부재) 블랭크액의 혼탁도는 (허여 시간에서) 효소 처리된 액체의 혼탁도를 제외한다.

큐티나제 변이체의 상대적인 수행(혼탁도에서 환원)을 계산했고, 결과는 하 기의 표에 보여진다.

결과는 효소의 효과가 시간이 증가할 수록 증가한다는 것을 보여준다. 통상의 효소 투여량 및 올리고머 농도에서, 대략 20 분이상에서 동등해지는 것 같다.

실시예 13: 섬유 변형

분산 염색된 폴리에스테르 직물의 습윤 특성에 대한 효과를 염색전에 직물을 H.insolens 큐티나제 변이체로 처리하여 조사했다. 따라서, 실험을 실제 섬유 변형 및 분산 염색 과정 두 페이즈로 구성했다.

페이즈 1-섬유 변형:

장비: Atlas Launder-O-meter LP2

직물: 시험 직물로부터 100 % 정련된 폴리에스테르 니트

pH: 50 mM 칼륨 인산염 완충액, pH 7

연마제 : 5 big 스틸 볼

비이커 부피: 120 mL

처리: 65 ℃ 에서 2 시간후에 90 ℃ 까지 증가시키고 1 시간동안 유지

견본 제조: 직물의 3* 1.5 g 견본 컷, 비이커당 3 = 4.5 g

린스:

탈이온화된 물에서 린스.

페이즈 2-염색-분산 염료:

염색 용액:

탈이온화된 물과 함께 첨가하여 액체 비율을 1:20 으로 만든다.

0.4 % Dianix Red (DyStar) SE-CB (owf)

4.5-5 이하의 pH

염색 절차:

1. 섬유 변형으로부터 처리당 하나의 견본을 염색을 위해 사용한다. (1.5 g/견본을 액체비율 계산을 위해 사용한다.).

2. 상기의 방법에 따라 염색욕을 만든다. Labomat 비이커에 찬 염료액을 첨가하고 3.5 ℃/분의 변화도로 55 ℃ 까지 가열한다. 일단 온도에 도달한 후에 5 분동안 유지한다.

3. 직물을 비이커에 첨가한다.

4. 1.5 ℃/ 분의 변화도로 130 ℃ 온도로 증가시킨다. 30 분동안 염색한다.

5. 5℃/분의 변화도로 70 ℃ 이하로 냉각시킨다. 욕에 담군채, 수거하지 않고, 직물을 10 분동안 뜨거운 물(60 ℃) 에서 린스한다. 모든 색의 번짐이 멈출때까지 실내온도의 따뜻한 린스로 처리한다.

6. 공기중에서 하룻밤동안 건조시킨다.

시험/분석:

AATCC 시험 방법 61- 세척에 대한 염색견뢰도

염색욕 소모의 비율-분광광도계

K/S 및 L*-반사계

AATCC TM-79 액적 시험

결과 :

섬유 변형으로부터의 결과가 하기의 표로부터 보여진다.

결과는 변이체로 폴리에스테르의 처리가 습윤성을 상당히 증가시킨다는 것을 보여준다. 통상의 셋업에서 분산 염료의 염색력에 대한 역효과는 없었다.

실시예 14 : 세척에서 큐티나제 변이체 사용에 의한 인간 땀/피지로 오염된 직물에서의 악취 환원

악취 환원에 관하여 큐티나제의 성능은 Terg-O-tometer 에서 수행되는 1-순환의 세척 시험에서 시험될 수 있다.

실험 조건:

세척액: 비어커 당 1000 ml

견본: 100 % 폴리에스테르 (Soxhlet 추출로 예비 클린닝된 인터락(interlock) 니트). 비이커 당 24 견본 (3.3 x 3.5 cm)

오염: 운동후에 겨드랑이를 닦음으로서 묻은 남성 겨드랑이 땀 및 피지.

세제: 표준 색조 세제의 5 g/L. pH 조정 없음.

물 경도: 3.2 mM Ca²⁺/Mg²⁺ ( 5: 1 의 비율)

세척 온도: 30 ℃

세척 시간: 30 min

린스: 흐르는 수돗물에서 15 분

평가:

세척 후에, 습윤 견본을 폐쇄되고,엷은 색을 띤 200 ml 글래스에 놓는다. 훈련받은 감각기관 패널(9-11 감정가)이 습윤 샘플이 담긴 글래스의 상부를 후각에 의해 악취를 평가한다. 악취강도는 각 말단에 워드(스케일의 개시점에는 '무' 및 말단에는 '매우 강함')가 고정된, 15 cm 를 측정하는 체계화되지 않은 라인 스케일에 표지하는 것에 의해 표시된다. 모든 평가를 2 번씩 수행한다. 견본을 세척(견본은 내내 글래스에 유지시킨다.)후에 1, 2 및 3 일에 평가한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

SEQ ID NO:1의 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래의 모 균류 큐티나제의 변이체로서, 상기 변이체는 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800의 큐티나제에서 다음 중 하나에 해당하는 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.

a) R51P

b) E6N/Q + L138I

c) A14P + E47K

d) E47K

e) E179N/Q

f) E6N/Q + E47K + R51P

g) A14P + E47K + E179N/Q

h) E47K + E179N/Q

i) E47K + D63N

j) E6N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q

k) E6N/Q + E10N/Q + A14P + E47K + R51P + E179N/Q, 또는

l) Q1P + L2V + S11C + N15T + F24Y + L46I + E47K
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제 1 항에 있어서, 테레프탈산 에스테르에 대하여 가수분해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항에 있어서, 고리형 트리(에틸렌 테레프탈레이트) 또는 테레프탈산 비스(2-히드록시에틸)에스테르 디벤조에이트(BETEB) 또는 이들 둘 다에 대한 가수분해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항에 있어서, 모 큐티나제보다 5℃ 이상 높은 변성 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 11 항에 있어서, 변성 온도는 pH 8.5에서 측정되는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1 항의 변이체를 코딩하는 DNA 서열.
제 13 항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
제 13 항의 DNA 서열을 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
제 14 항의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
a) 변이체가 발현하도록 제 15 항의 세포를 배양하는 단계, 및

b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는

제 1 항의 변이체를 생산하는 방법.
제 17 항에 있어서, 변이체가 발현하여 분비되도록 하기 위해서 단계 a)에서 제 15 항의 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 모 균류 큐티나제를 선택하는 단계,

b) 모 큐티나제 내의 위치 E6, E10, E30, E47, D63, E82 또는 E179 중에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 식별하는 단계, 및

c) 각각의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 또는 치환의 변형을 만드는 단계,

d) 단계 b) 및 c)로부터 얻어지는 변이체를 제조하는 단계,

e) 변이체의 열안정성을 시험하는 단계, 및

f) 모 큐티나제보다 높은 열안정성을 갖는 변이체를 선택하는 단계를 포함하는 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 제조하는 방법.
제 19 항에 있어서, 제 19 항의 단계 b)에서 열거된 위치를 제외한 하나 이상의 위치에서 각각 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 또는 치환의 변형을 도입하는 것을 특징으로 하는, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 제조하는 방법.
제 19 항에 있어서, 단계 b) 내지 e)를 반복하는 것을 특징으로 하는 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 제조하는 방법.
a) 모 균류 큐티나제를 선택하는 단계,

b) 모 큐티나제 내의 위치 E6, E10, E30, E47, D63, E82 또는 E179 중에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 식별하는 단계, 및

c) 각각의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환의 변형을 만드는 단계,

d) 단계 b) 및 c)로부터 얻어지는 변이체를 제조하는 단계,

e) 변이체의 열안정성을 시험하는 단계,

f) 모 큐티나제보다 높은 열안정성을 갖는 변이체를 선택하는 단계, 및

g) 변이체를 생산하여 큐티나제 변이체를 얻는 단계를 포함하는

휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 생산하는 방법.
제 22 항에 있어서, 제 22 항의 단계 b)에서 열거된 위치를 제외한 하나 이상의 위치에서 각각 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 또는 치환의 변형을 도입하는 것을 특징으로 하는, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 제조하는 방법.
제 22 항에 있어서, 단계 b) 내지 e)를 반복하는 것을 특징으로 하는 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 균주 DSM 1800 유래 큐티나제의 변이체를 제조하는 방법.
제 1 항의 균류 큐티나제의 변이체로 고리형 올리고머를 처리하는 단계를 포함하는 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)의 고리형 올리고머의 효소적인 가수 분해 방법.
제 25 항에 있어서, 고리형 올리고머는 고리형 트리(에틸렌 테레프탈레이트)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 처리는 60-80℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 처리는 65-75℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 고리형 올리고머는 폴리에스테르 함유 직물 또는 얀의 섬유중에 그리고 섬유상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 직물 또는 얀을 연속적으로 린스하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30 항에 있어서, 린스하는 단계는 pH 7 내지 pH 11 범위의 pH를 갖는 수용액으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 제 1 항의 균류 큐티나제 변이체로 직물 또는 얀을 처리하는 단계; 및

b) 처리된 직물을 반응성 염료 또는 분산 염료로 염색하는 단계를 포함하는 폴리에스테르 직물 또는 얀을 염색하는 방법.
계면활성제 및 제 1 항의 변이체를 포함하는 세제 조성물.
a) 직물 또는 얀을 제 1 항의 변이체로 처리하는 단계, 및

b) 연속적으로, 연화제, 주름방지 수지, 정전기 방지제, 방오제로 구성되는 군으로부터 선택된 끝처리제로 얀 또는 직물을 처리하는 단계를 포함하는 PET-함유 얀 또는 직물의 기능적인 끝손질을 향상시키는 방법.