CN105248510A - 防止植物细胞壁材料溶解过程中提取物变暗和恶臭形成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及减少包含植物材料(例如谷麸)的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法，特别是在所述植物材料的溶解过程中。本发明还涉及优化的溶解方法，其中颜色和/或不悦味道和/或恶臭的形成受到控制。本发明还涵盖了溶解的植物材料、试剂盒、所述溶解的植物材料的用途，例如在食品或生物乙醇中。

Description

防止植物细胞壁材料溶解过程中提取物变暗和恶臭形成
本申请是申请号为201080018967.2的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及减少包含植物材料(例如谷麸)的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法，特别是在所述植物材料的溶解过程中。本发明还涉及优化的溶解方法，其中颜色和/或不悦味道和/或恶臭的形成受到控制。本发明还涵盖了溶解的植物材料、试剂盒、所述溶解的植物材料的用途(例如在食品或生物乙醇中)。
发明背景
除了在动物饲料中使用外，对来自植物材料加工或发酵残留物的副流(sidestream)(例如来自研磨的谷麸或含可溶物的干酒糟(DDGS))的利用得到了很少的关注。
大多数现有技术描述了酶在面粉和生面团(dough)中的用途，而没有描述对于副流或工业加工的副产品的用途。
最近，由例如Courtin等人在Journalofthescienceoffoodandagriculture.88.p2517-2522(2008)中以及Cloetens等人在JournaloftheAmericanCollegeofNutrition,Vol.27,No.4,512-518(2008)中显示了,在鸡中溶解的麸比不可溶的麸具有更好的营养效果。
Swennen等人的Journalofthescienceoffoodandagriculture,2006,vol.86,1722-1731涉及大规模生产和表征麦麸***糖基木聚寡糖。
WO2008000050涉及用于制备作为整粒谷物发酵的副产品的可溶性***糖基木聚糖的方法。
WO2008087167涉及用于在烘烤产品中原位增加水溶性***糖基木聚寡糖水平的方法。
对于保持产品的品质而言，防止食物和饲料产品的氧化性降解是非常重要的。产品中的氧化过程可引起颜色、气味、香气的变化或其它不可接受的感官性变化。此外，氧化可引起对必需氨基酸的损害并导致维生素的丧失。特别地，含有多不饱和脂肪酸的食品易于氧化，潜在地产生腐臭食品。
当食物分子(例如脂肪酸)在下列的存在下与氧结合时发生氧化反应：自由基；痕量金属(例如Fe和Cu)；或活性氧簇(例如单线态氧、过氧化物或过氧化氢)。抗氧化剂常常被用于抑制这些反应。普遍使用的抗氧化剂的实例是羟基苯甲醚(BHA)和对羟甲酚(BHT)(其大多用于高脂肪和高油的食物中)，以及亚硫酸盐(其主要用作抗氧化剂来防止或减少水果和蔬菜的变色)。然而，BHA和BHT对于人类健康可能不是安全的并且已知亚硫酸盐破坏维生素B。由于这些原因，通常优选的是生物的或天然的抗氧化剂，例如生育酚(维生素E)、L-抗坏血酸、柠檬酸、类黑精、类黄酮和没食子酸。由于其防止痕量金属引起氧化的能力，螯合剂(例如EDTA、siderohores(来自微生物的铁螯合剂)、柠檬酸和乳糖酸)也被用于解决氧化的问题。
本领域中需要更好的方法来减少氧化过程,特别是对于来自植物材料加工的副流(例如来自研磨的谷麸、来自精炼植物油的皂料、含可溶物的干酒糟(DDGS))的利用而言，其中更少的植物材料将用于低价的应用，例如牛饲料。此外，长久以来就需要能够在传统的、已经存在的谷物产品中利用来自谷物的麸级分，而不显著影响产品的外观/结构、颜色或味道，并使得能够增加现存产品的健康和营养效果。
发明目的
本发明的实施方式的目的是提供用于控制一般性的以及特别是来自工业副流的植物材料氧化过程的方法。本发明的目的还在于提供使得能够在食品(例如面包或谷物产品)中利用谷麸而不显著影响产品的外观/结构、颜色或味道，并使得能够增加现存产品的健康和营养效果的合适方法。
发明概述
发明人已发现，通过控制植物材料的氧化过程可实现减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭的形成。
因此，在广泛的方面，本发明涉及用于减少包含植物材料的组合物中不当感官特性(例如，坏的味道(如更少的苦味)、气味、颜色外观)形成的方法，其中所述方法包括一个或多个控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在第一个方面，本发明涉及用于减少包含植物材料的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法，其中所述方法包括一个或多个控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在第二个方面，本发明涉及用于减少包含至少部分溶解的植物材料的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法，其中所述方法包括一个或多个控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在第三个方面，本发明涉及溶解包含植物材料的组合物的方法，所述方法包括控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在第三个方面，本发明涉及通过溶解包含植物材料的组合物的方法而生产的溶解的谷麸,所述方法包括控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在又一个方面，本发明涉及溶解的谷麸用于生产食品的用途，所述溶解的谷麸是通过溶解包含植物材料的组合物的方法生产的,所述方法包括控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在又一个方面，本发明涉及通过溶解的谷麸用于生产食品的用途而获得的食品，所述溶解的谷麸是通过溶解包含植物材料的组合物的方法生产的,所述方法包括控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在又一个方面，本发明涉及溶解的谷麸用于生产生物乙醇的用途以及由所述用途生产的生物乙醇，所述溶解的谷麸是通过溶解包含植物材料的组合物的方法生产的,所述方法包括控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在又一个方面，本发明涉及试剂盒，其包括
i)一种或多种选自下列的化合物:氧化还原酶；抗氧化剂；脂质修饰酶；
ii)用于在根据本发明的方法中使用的说明书；以及任选地
iii)一种或多种如本专利申请中所定义的其它化合物。
在又一个方面，本发明涉及试剂盒，其包括
i)一种或多种选自下列的化合物:氧化还原酶；抗氧化剂；脂质修饰酶；
ii)包含下列的酶组合:一种或多种细胞壁修饰酶；一种或多种淀粉修饰酶,以及任选的一种或多种其它的酶；
iii)用于在根据本发明的方法中使用的说明书；以及任选地
iv)一种或多种用于食品的其它成分。
附图说明
图1:温育24小时后，麸悬浮物预沸腾的样品的颜色形成。1:空白；2:细胞壁和淀粉修饰酶；3:细胞壁和淀粉修饰酶+抗坏血酸；4:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶；5:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶和过氧化氢酶。
图2:没有起初预沸腾麸悬浮物，6小时后样品的颜色形成。1:空白；2:细胞壁和淀粉修饰酶；3:细胞壁和淀粉修饰酶+抗坏血酸；4:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶；5:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶和过氧化氢酶。
图3.来自实施例2的挥发物的顶空分析。试验1:空白；试验2:细胞壁和淀粉修饰酶；试验5:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶和过氧化氢酶。
图4.氧势随时间的形成。试验1,细胞壁和淀粉修饰酶。试验2,细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶。试验3,细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶+过氧化氢酶。
发明详述
本专利申请的发明人在麸的酶促溶解过程中观察到了所生成的可溶性提取物的显著变暗以及恶臭的形成。这些是溶解过程商业化的显著障碍，特别是对于食品中的利用而言。令人惊讶地，我们发现了用氧化还原酶(例如葡糖氧化酶(GOX))进行处理和/或加入抗氧化剂(例如抗坏血酸)消除了由氧化过程引起的所述可溶性提取物的变暗并且降低了氧势。这也将减少内源性化合物的氧化引起的恶臭。在本发明的某些方面，控制氧化过程和降低氧势的处理可与溶解过程同时进行,例如在麸的溶解中。
数个问题与在研磨中增加提取产量相关，所产生的粉的性能受到增加提取产量的影响。
增加提取产量或向谷物应用中添加更多麸材料的另外的问题是感官特性的改变。通过根据本发明修饰麸级分,有可能修饰所产生的粉的感官特性,给出较少苦的和更美味的感官特性。
此技术可应用于大多数谷物应用，例如烘烤、早餐谷物、意大利面食(pasta)等。
定义
如本申请中所使用的，短语“控制氧化过程”指使用任何方法或条件,其中修饰了植物材料内化合物的氧化。化合物的氧化可通过氧化过程整体上的减少而被修饰。备选地，化合物的氧化可通过使特别的化合物被氧化以避免其他化合物的氧化而被修饰。
术语“颜色形成”指在所述至少部分溶解的植物材料中随着时间形成对可见光谱内任何光的增加的吸收。在去除不可溶的组分后(例如通过沉淀或离心去除)测量颜色形成。可通过视觉或任何其它合适的光谱光度测量方法来测量颜色形成。
术语“恶臭形成”指如普通人所客观评价的，随时间形成增加的气味。所述增加的气味可以是在强烈度(强度)和/或性质(令人不快的程度)两方面。可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来测量恶臭，例如GC-SNIF或CHARM分析。
如本申请中所使用的，术语“不悦味道形成”指如普通人所客观评价的，随时间形成对不悦、尖刺或不喜欢味道(例如苦味)的增加的人类感知。
如本申请中所使用的，术语“抗氧化剂”指任何能够通过其自身被氧化而减慢或防止其它分子的氧化的化合物。所述术语包括但不限于抗坏血酸，抗坏血酸的脂肪酸酯，N-乙酰半胱氨酸，异硫氰酸苄酯，β胡萝卜素，绿原酸，柠檬酸，2,6-二-叔-丁基苯酚，乳酸，酒石酸，尿酸，抗坏血酸钠，抗坏血酸钙，磷酸钠(例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠)，磷酸钾(例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾)，卵磷脂，抗坏血酸钾，迷跌香提取物，绿茶提取物，红茶提取物，生育酚类(例如生育酚(维生素E)、例如混合的生育酚类、α-生育酚(任何立体异构体或其任意混合),β-生育酚,γ-生育酚,δ-生育酚),维生素K,丁羟甲苯(BHT),丁羟基茴香醚(BHA),erythorbinacid，anoxomer抗氧化剂,异抗坏血酸,异抗坏血酸钠,erythorbin钠,乙氧喹,单油酸甘油酯,过氧化氢酶,愈创树脂,苹果酸,没食子酸丙酯,没食子酸辛酯,没食子酸十二酯,棓酸乙酯,叔丁基氢醌(TBHQ),抗坏血酸硬脂酸酯,抗坏血酸棕榈酸酯,谷胱甘肽,脂肪酸的甘油单酯或甘油二酯的柠檬酸酯,硫代二丙酸,或鞣酸，或其组合。在优选的实施方式中，根据本发明所使用的抗氧化剂为食品级的抗氧化剂。在一些实施方式中所述抗氧化剂对于被处理的组合物为外源性的。然而,也可向具有少量相同内源性抗氧化剂的组合物中加入抗氧化剂以增加总体有效量。
在一些实施方式中，抗氧化剂是酶，例如过氧化氢酶,超氧化物歧化酶和各种过氧化物酶。
所使用的抗氧化剂的量可以是有效降低氧势的量,所述量可在50-50000ppm的范围内,优选在75-25000ppm的范围内并且更优选在100-10000ppm的范围内。
所使用的抗氧化剂的量可以是有效降低氧势的量,所述量可以在0.005-5％(w/w)的范围内,优选在0.008-2.5％(w/w)的范围内并且更优选在0.01-1％(w/w)的范围内。
如本申请中所使用的，术语“氧化还原酶”指任何能够催化电子从一个分子转移至另一个分子的酶。在一些实施方式中,根据本发明所使用的氧化还原酶能够与作为底物的糖反应。所述氧化还原酶可以是能够与作为底物(例如碳水化合物，如葡萄糖或麦芽糖)的电子供体反应的氧化酶或脱氢酶。
所述氧化酶可以是E.C.1.1.3.x组的任何合适的氧化酶。所述氧化酶可以是葡糖氧化酶,吡喃糖氧化酶,己糖氧化酶,甘油氧化酶,吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10),半乳糖氧化酶(EC1.1.3.9)或对于麦芽糖比对于葡萄糖具有更高活性的碳水化合物氧化酶。葡糖氧化酶(EC1.1.3.4)可源自黑曲霉(Aspergillusniger),例如,具有U.S.Pat.No.5,094,951中所描述的氨基酸序列。己糖氧化酶(EC1.1.3.5)可源自藻类物种，例如Iridophycusflaccidum,角叉菜(Chondruscrispus)和Euthoracristata。所述吡喃糖氧化酶可源自担子菌纲(Basidiomycete)的真菌,大隔孢伏革菌(Peniophoragigantean),多孔菌(Aphyllophorales),白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium),Polyporuspinsitus,Bierkanderaadusta或Phlebiopsisgigantean。所述对于麦芽糖比对于葡萄糖具有更高活性的碳水化合物氧化酶可源自微结节菌属(Microdochium)或支顶孢属(Acremonium),例如,来自雪霉叶枯病菌(M.nivale)(U.S.Pat.No.6,165,761),点枝顶孢(A.strictum),梭链枝顶孢(A.fusidioides)或A.potronii。
WO96/39851公开了己糖氧化酶的用途，其能够将D-葡萄糖和数种其它的还原糖(包括麦芽糖、乳糖、半乳糖、木糖、***糖和纤维二糖)氧化为其相应的内酯类，伴随着随后水解为相应的二糖醛酸。
所述脱氢酶可以是葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47,EC1.1.99.10),半乳糖脱氢酶(EC1.1.1.48),D-己醛糖脱氢酶(EC1.1.1.118,EC1.1.1.119),纤维二糖脱氢酶(EC1.1.5.1,例如,来自特异腐质霉(Humicolainsolens)),果糖脱氢酶(EC1.1.99.11,EC1.1.1.124,EC1.1.99.11),乙醛脱氢酶(EC1.2.1.3,EC1.2.1.4,EC1.2.1.5)。另一个实例是葡萄糖-果糖氧化还原酶(EC1.1.99.28)。
所使用的氧化还原酶的量可有效减少终产品中气味和/或产生颜色的经氧化化合物的量。对于葡糖氧化酶，所述量可以在50-20,000(例如,100-10,000或1,000-5,000)GODU/kg原材料中干物质的范围内。1GODU是使用20分钟的温育时间、以葡萄糖16.2g/l(90mM)作为底物、在30℃,pH5.6(乙酸盐缓冲剂)下，形成1微摩尔过氧化氢/分钟的酶的量。对于其它的酶，通过用合适的底物进行分析，可类似地发现剂量。
如本申请中所使用的，术语“含脂质植物材料”指包含大量源自含有内源性量脂质的植物的材料的任何植物材料(例如谷麸)。合适地，所述植物材料可被大量获得,含有大量的脂质并且可被用于工业加工中。
在一些实施方式中，所述含脂质植物材料是副流,或工业加工的副产品。在一些实施方式中所述植物材料也可含有非植物材料，例如来自发酵的可能含有酵母细胞的副产品。
在一些具体实施方式中，所述含脂质植物材料是谷麸,例如来自传统研磨的麦麸。
在一些实施方式中，至少约100mg(例如至少约200mg,例如至少约300mg)的量/100g含脂材料干重量是磷脂。
在一些实施方式中，至少约10mg(例如至少约20mg,例如至少约30mg)的量/100g含脂质植物材料干重量是磷脂酰肌醇(PI)。
如本申请中所使用的，短语“部分溶解的含脂质植物材料”指含有脂质、并且至少部分地通过酶促或机械作用而被溶解的植物材料。
如本申请中所使用的，术语“植物材料”指任何属于植物(plantae)这一生物界的物种。在一些其它的实施方式中，所述植物材料是水果。在一些具体实施方式中，所述植物材料适于人或动物消费。在其它的实施方式中，所述植物材料适于工业利用(例如食品制备)或适于生物乙醇的生产。优选地，所述植物材料为谷麸。
如本申请中所使用的，术语"谷物"指来自禾本(Poaceae)科植物的果实，此类种子至少含有包含糊粉粒的麸、以及淀粉性胚乳，另外存在或不存在果皮、种子外皮(备选地称为种皮)和/或胚。此术语包括但不限于例如下列的种：小麦、大麦、燕麦、斯佩耳特小麦(spelt)、黑麦、高梁、玉米和稻。
如本申请中所使用的，术语“麸”指源自谷物的研磨级分，其与相应的完整种子相比富含选自下列的任何或全部组织：糊粉粒、果皮和种子外皮。
如本申请中所使用的，术语“溶解”指在根据本发明的方法中溶解植物材料(例如谷麸)并且意在包括任何程度的溶解。因此，“溶解”可以是为了获得100％可溶的材料或可以是为了获得低于100％的溶解度，例如低于70％，例如在30％-60％的范围内。在一些实施方式中，所述溶解度是基于干物质相对于干物质麸而被测定的。
如本申请中所使用的，术语“至少部分溶解”指高于1％,例如高于5％,例如高于10％的溶解度。要理解，如果植物材料没有被溶解至某种程度，那么脂修饰酶的作用可能没有根据本发明最佳地起作用。在根据本发明的特定方面，其中加入脂修饰酶以与为了获得溶解的处理(例如与用一种或多种细胞壁修饰酶进行的处理)同时起作用,所述溶解和脂修饰酶的作用将同时发生。
如本申请中所使用的，术语"研磨级分"指由机械减小谷粒大小而产生的全部或部分级分，所述机械减小谷粒大小是通过例如但不限于：切削、轧制、压碎、破裂或研磨，伴随或不伴随通过例如(但不限于)筛析,筛选,筛分,吹制,抽气,离心筛分,风筛,静电分离,或电场分离而分级。
在本发明的情境中,“功能性脂质”指对其中使用了所述功能性脂质的产品有影响的脂质。在一些具体实施方式中，所述功能性脂质是乳化剂或其它食品改良剂。
在本发明的情境中,“细胞壁修饰酶”指任何能够水解或修饰植物细胞壁的复杂基质多糖的酶,例如任何将在本申请所包括的“细胞壁溶解测试”中具有活性的酶。在“细胞壁修饰酶”这一定义中所包括的有纤维素酶(例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II)、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶、木聚葡糖酶以及半纤维素降解酶(例如木聚糖酶)。
如在本申请中所使用的，术语"纤维素酶"或"纤维素降解酶"被理解为包含纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91),例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II,以及内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。
包括在纤维素酶定义中的有：随机切割纤维素链的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；从纤维素链末端切割纤维二糖基单元的纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和将纤维二糖及可溶性的纤维糊精转化为葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。在这三类涉及纤维素的生物降解的酶中，纤维二糖水解酶是降解天然结晶纤维素的关键的酶。术语"纤维二糖水解酶I"在本申请中被定义为纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶(也称为外切葡聚糖酶,外切纤维二糖水解酶或1,4-β-纤维二糖水解酶)活性,如在酶类别EC3.2.1.91中所定义的,其通过从链的非还原末端释放纤维二糖而催化纤维素和纤维四糖中1,4-β-D-葡萄糖苷连接的水解。术语"纤维二糖水解酶II活性"的定义是相同的,除了纤维二糖水解酶II从链的还原末端攻击之外。
纤维素酶可包含碳水化合物结合模块(CBM)，其提高酶与含有纤维素的纤维的结合并增加酶的催化活性部分的效力。CBM被定义为碳水化合物活性酶中连续的氨基酸序列，其含有具有碳水化合物结合活性的离散折叠(discreetfold)。关于CBMs的其它信息，参见CAZy因特网服务器(Supra)或Tomme等人(1995)，EnzymaticDegradationofInsolublePolysaccharides(Saddler和Penner,编辑),Cellulose-bindingdomains:classificationandproperties,pp.142-163,AmericanChemicalSociety,Washington。在优选的实施方式中，所述纤维素酶或纤维素降解酶可以是如美国专利申请号60/941,251(其在此通过引用而被并入)中所定义的纤维素降解制备物。在优选的实施方式中，所述纤维素降解制备物包含具有纤维素降解增强活性的多肽(GH61A),优选WO2005/074656中所描述的。所述细胞壁修饰酶还可以是β-葡糖苷酶,例如源自木霉属(Trichoderma)，曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)株系的β-葡糖苷酶，包括美国申请号60/832,511(Novozymes)中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是CBHII,例如太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A)。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是纤维素酶，例如源自瑞氏木霉(Trichodermareesei)的酶。
在一些实施方式中，纤维素降解活性可以源自真菌来源,例如木霉属的菌株,例如瑞氏木霉菌株；或腐质霉属(Humicola)的菌株,例如特异腐质霉(Humicolainsolens)菌株。
在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是WO2005/074656中所公开的具有纤维素降解增强活性的多肽(GH61A)；纤维二糖水解酶,例如太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A),β-葡糖苷酶(例如，美国申请号60/832,511中所公开的融合蛋白)和纤维素降解酶(例如源自瑞氏木霉的)。
在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是WO2005/074656中公开的具有纤维素降解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(例如，美国申请号60/832,511中公开的融合蛋白)以及纤维素降解酶(例如，源自瑞氏木霉的)。在一些实施方式中，细胞壁修饰酶是商业上可得的产品，例如可从Danisco的美国分支机构Genencor获得的GC220或者可从NovozymesA/S，丹麦获得的1.5L或CELLUZYMETM。
内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)催化下列的内切水解：纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷连接，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖)或木聚葡糖中的β-1,4键，以及含有纤维素部分的其它植物材料。经认可的名称是内切-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶,但是在本说明书中使用的是简称内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶活性可以根据Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法利用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定。
在一些实施方式中，内切葡聚糖酶可以源自木霉属菌株,例如瑞氏木霉菌株；腐质霉属菌株,例如特异腐质霉菌株；或者金孢子菌属(Chrysosporium)菌株,优选Chrysosporiumlucknowense菌株。
术语"纤维二糖水解酶"指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91),其催化纤维素、纤维素寡糖、或任何含有β-1,4连接的葡萄糖的聚合物中1,4-β-D-葡萄糖苷连接的水解,从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
上文中提及的纤维二糖水解酶的实例包括来自瑞氏木霉、特异腐质霉的CBHI和CBHII；和来自太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶(CELL6A)的CBHII。
纤维二糖水解酶活性可根据Lever等人,1972,Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等人,1982,FEBSLetters149:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288描述的方法确定。Lever等人的方法适于评估玉米秸秆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法适于在荧光二糖衍生物上确定纤维二糖水解酶活性。
术语"β-葡糖苷酶"指β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21),其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。为了本发明的目的，β-葡糖苷酶活性是根据由Venturi等人,2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66所描述的基本方法而确定的，除了如本申请中所述采用了不同的条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性被定义为在500℃、pH5，在100mM柠檬酸钠、0.01％20中，从作为底物的4mM对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷产生1.0μmole的对硝基苯/分钟。
在一些实施方式中β-葡糖苷酶是真菌来源的,例如木霉属,曲霉属或青霉属菌株。在一些实施方式中β-葡糖苷酶源自瑞氏木霉,例如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP562003)。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶源自米曲霉(Aspergillusoryzae)(根据WO02/095014，在米曲霉中重组产生的),烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(根据WO02/095014的实施例22在米曲霉中重组产生的)或者黑曲霉(Aspergillusniger)(1981,J.Appl.3:157-163)。
术语“半纤维素降解酶”或“半纤维素酶”,如在本申请中所使用的,指可降解半纤维素的酶。
可使用任何适合用于水解半纤维素(优选水解为***糖基木聚寡糖)的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶,***呋喃糖苷酶,乙酰木聚糖酯酶,阿魏酸酯酶,葡萄糖醛酸酶,半乳聚糖酶,内切-半乳聚糖酶,甘露聚糖酶,内切或外切***糖酶,外切半乳聚糖酶，果胶酶,木聚葡糖酶,或者其中两种或更多种的混合物。适合用于本发明的半纤维素酶的实例包括GrindamylPowerbake930(可从DaniscoA/S,丹麦获得)或VISCOZYMETM(可从NovozymesA/S,丹麦获得)。在一个实施方式中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方式中，所述木聚糖酶是微生物来源的,例如真菌来源的(例如木霉属,节毛菌属(Meripilus),腐质霉属,曲霉属,镰刀菌属(Fusarium))或来自细菌(例如芽孢杆菌(Bacillus))。在一些实施方式中，所述木聚糖酶源自丝状真菌(filamentousfungus),优选源自曲霉属菌株(例如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus))；或者腐质霉属菌株(优选柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa))。木聚糖酶可优选地是内切-1,4-β-木聚糖酶,更优选地是GH10或GH11的内切-1,4-β-木聚糖酶。商业上的木聚糖酶的实例包括来自DaniscoA/S,丹麦的GrindamylH121或GrindamylPowerbake930或者来自NovozymesA/S,丹麦的SHEARZYMETM和BIOFEEDWHEATTM。
***呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)催化α-L-***糖苷中末端非还原α-L-***呋喃糖苷残基的水解。半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、***半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶催化***半乳聚糖中1,4-D-半乳糖苷连接的内切水解。
果胶酶(EC3.2.1.15)催化果胶酸和其它聚半乳糖醛酸中1,4-α-D-半乳糖醛酸连接的水解。
木聚葡糖酶催化木聚葡糖的水解。
如本申请中所使用的，术语"木聚糖酶"指能够水解木聚糖或***糖基木聚糖的非末端β-D-吡喃木糖基-1,4-β-D-吡喃木糖基单元中β-1,4糖基键的酶。其它的名称包括1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶,1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶,β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶,(1-4)-β木聚糖4-木聚糖水解酶,内切-1,4-β-木聚糖酶,内切-(1-4)-β-木聚糖酶,内切-β-1,4-木聚糖酶,内切-1,4-β-D-木聚糖酶,内切-1,4-木聚糖酶,木聚糖酶,β-1,4-木聚糖酶,β-木聚糖酶,β-D-木聚糖酶。木聚糖酶可源自各种生物体，包括植物，真菌(例如，曲霉属、青霉属、Disporotrichum、链孢霉属(Neurospora)、镰刀菌属、腐质霉属、木霉属的种)或者细菌的种(例如，芽孢杆菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、嗜热真菌属(Thermomyces)的种)(参见，例如WO92/17573、WO92/01793、WO91/19782、WO94/21785)。
在本发明的一个方面,本发明的方法中所使用的木聚糖酶是归类为EC3.2.1.8的酶。官方的名称是内切-1,4-β-木聚糖酶。***化名称是1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。可使用其它的名称,例如内切-(1-4)-β-木聚糖酶；(1-4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶；内切-1,4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1,4-木聚糖酶；内切-1,4-木聚糖酶；内切-β-1,4-木聚糖酶；内切-1,4-β-D-木聚糖酶；1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶；β-木聚糖酶；β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶；内切-1,4-β-木聚糖酶；β-D-木聚糖酶。所催化的反应是木聚糖中1,4-β-D-木糖苷连接的内切水解。
在本发明的一个方面,本发明的木聚糖酶是糖苷水解酶(GH)家族11的木聚糖酶。术语“糖苷水解酶(GH)家族11的”是指所论及的木聚糖酶是或者可以被归类在GH家族11中。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的木聚糖酶是具有如在本申请中所描述的“木聚糖酶测试”中所测量的木聚糖酶活性的木聚糖酶。
根据Cazy(ModO)位点,家族11糖苷水解酶可被如下表征:
已知的活性:木聚糖酶(EC3.2.1.8)
机制:保留
催化性亲核物质/碱基:Glu(实验的)
催化性质子供体:Glu(实验的)
3D结构状态:折叠:β-胶冻卷
族群(Clan):GH-C
如本申请中使用的，"族群C"指享有共同的三维折叠和相同的催化机构(machinery)的家族组(参见，例如Henrissat,B.和Bairoch,A.,(1996)Biochem.J.,316,695-696)。
如本申请中所使用的，“家族11”指如由Henrissat和Bairoch(1993)BiochemJ.,293,781-788(也参见Henrissat和Davies(1997)CurrentOpinioninStructuralBiol.1997,&:637-644)所设立的酶家族。家族11成员的共同特征包括高的遗传同源性,约20kDa的大小和双重置换(doubledisplacement)催化机制(参见Tenkanen等人,1992；Wakarchuk等人,1994)。家族11木聚糖酶的结构包括由β-链和α-螺旋构成的两个大的β-折叠。
家族11木聚糖酶包括下列:黑曲霉XynA,白曲霉(Aspergilluskawachii)XynC,AspergillustubigensisXynA,环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)XynA,BacilluspunzilusXynA,枯草芽孢杆菌XynA,NeocalliniastixpatriciarumXynA,浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)XynB,浅青紫链霉菌XynC,StreptomycestherinoviolaceusXynII,褐色热单孢菌(Thermomonosporafusca)XynA,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)Xyn,瑞氏木霉XynI，瑞氏木霉XynII,绿色木霉(Trichodermaviride)Xyn。
在本发明的情境中,“淀粉修饰酶”，指任何催化葡萄糖苷中的α-1,3和/或α-1,6葡萄糖苷连接的水解的酶。包括在此术语中的是通常根据其所作用的底物而被命名的糖苷水解酶。在根据本发明的一些实施方式中，所述“淀粉修饰酶”选自乳糖酶,淀粉酶,支链淀粉酶,异淀粉酶,壳多糖酶,蔗糖酶,麦芽糖酶,神经氨酸酶,转化酶,透明质酸酶和溶菌酶。
在一些实施方式中，所述淀粉修饰酶是淀粉脱支酶。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的淀粉修饰酶是具有如本申请中所描述的“淀粉脱支活性测试”中所测量的淀粉脱支活性的酶。
淀粉脱支酶包括支链淀粉酶(EC3.2.1.41)和异淀粉酶(EC3.2.1.68)。它们水解支链淀粉,β-有限糊精和支链淀粉(pullulans)中的α-l,6-D-葡萄糖苷分支连接。可通过异淀粉酶不能够攻击支链淀粉以及通过对于α-有限糊精有限的作用而将异淀粉酶与支链淀粉酶(EC3.2.1.41)相区别。
"淀粉酶"意指包括任何淀粉酶，例如芽孢杆菌属的种(例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))的葡糖淀粉酶,α-淀粉酶,β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶。"淀粉酶"应该特别是指能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶是裂解淀粉中α-D-(I→4)O-糖苷连接的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC3.2.1.1；(α-D-(I→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为以随机的方式裂解淀粉分子内的α-D-(I→4)O-糖苷连接的内切-作用性酶。相反地,外切-作用性淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(EC3.2.1.2；α-D-(I→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)以及一些产物特异性淀粉酶(比如麦芽糖生成性α-淀粉酶(EC3.2.1.133))从底物的非还原末端裂解淀粉分子，β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20；α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α-D-(I→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)、和产物特异性淀粉酶可以由淀粉产生葡萄糖。
"α-淀粉酶变体","α-淀粉酶变体多肽"和"变体酶"指通过置换成熟α-淀粉酶蛋白氨基末端的氨基酸残基而经修饰的α-淀粉酶蛋白。如本申请中所使用的,"亲本酶"、"亲本序列"、"亲本多肽"、"野生型α-淀粉酶蛋白"和"亲本多肽"应指所述α-淀粉酶变体多肽所源自的酶和多肽。亲本酶可以是野生型的酶或之前经重组工程化的α-淀粉酶。所述α-淀粉酶变体还可包括在α-淀粉酶亲本多肽的信号序列中或α-淀粉酶亲本多肽的其它位置的突变。因此，所述α-淀粉酶多肽可以是经重组工程化的酶。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的α-淀粉酶是具有如在本申请中所描述的“α-淀粉酶测试”中所测量的α-淀粉酶活性的α-淀粉酶。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的β-淀粉酶是具有如在本申请中所描述的“β-淀粉酶测试”中所测量的β-淀粉酶活性的β-淀粉酶。
术语"支链淀粉酶"指特定种类的葡聚糖酶,其是降解支链淀粉的淀粉分解内切酶。其例如是由克雷伯杆菌(Klebsiella)属的革兰氏阴性细菌作为细胞外、细胞表面-锚定的脂蛋白而产生的。然而，***产生支链淀粉酶作为分泌的蛋白。I型支链淀粉酶特异性地攻击α-1,6连接,而II型支链淀粉酶还能够水解α-1,4连接。它也由一些其它的细菌和古细菌产生。在生物技术中，支链淀粉酶被用作去污剂。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)也已知为支链淀粉-6-葡聚糖水解酶(脱支酶)。支链淀粉被认为是由α-l,6-葡萄糖苷键连接的麦芽三糖单元的链。支链淀粉酶将水解裂解支链淀粉(α-葡聚多糖)。
术语"转葡萄糖基酶"指具有转葡糖苷酶活性的任何酶，例如转葡糖苷酶。术语"转葡糖苷酶"指将1,4-α-D-葡聚糖中的α-D-葡糖基残基转移至葡萄糖的伯羟基基团的酶，为游离的或是在1,4-α-D-葡聚糖中结合的。本申请中所描述的转葡糖苷酶具有作为EC2.4.1.24(根据IUBMB酶命名)而被描述的活性。本申请中所描述的转葡糖苷酶的***化名称是1,4-α-D-葡聚糖:l,4-α-D-葡聚糖(D-葡萄糖)6-α-D-葡糖基转移酶。在某些出版物中，此酶可被称作α-葡糖苷酶。
如上文所述，转葡糖苷酶通常具有被定义为EC2.4.1.24(根据IUBMB酶命名)的活性，所述活性将某些葡聚糖中的葡糖基残基转移至葡萄糖的伯羟基基团。在一些实施方式中,所述酶还可具有通过剪掉糖侧链或裂解内部的键来破坏多糖主链从而降解天然树胶多糖(例如，黄原胶，和含有半乳甘露聚糖的多糖(例如瓜尔豆胶或利马豆胶))的活性。任何适合的转葡糖苷酶可用于本发明中(参见例如，Pazur等人,Carbohydr.Res.1986149:137-47；andNakamura等人,J.Biotechnol.,53:75-84,1997)。在一些实施方式中,本发明中所用的转葡糖苷酶是商业上可得的(例如，包括但不限于从Megazyme,Wicklow,爱尔兰或DaniscoUSInc.,Genencor分支,PaloAlto,CA所获得的酶)。在一些实施方式中,所述酶是在瑞氏木霉细胞中产生的黑曲霉转葡糖苷酶。在一些其它的实施方式中，所述转葡糖苷酶是野生型真菌转葡糖苷酶(例如，包括但不限于具有在NCBI的数据库中以如下登录号被保有的氨基酸序列的真菌转葡糖苷酶:D45356(GID:2645159；黑曲霉),BAD06006.1(GID:4031328；泡盛曲霉(Aspergillusawamori)),BAA08125.1{GIO:\054565；米曲霉),XPJ)OI210809.1(GID:115492363；土曲霉(Aspergillusterreus)),XP_001271891.1(GID:121707620；棒曲霉(Aspergillusclavatus)),XPJ)01266999.1(GID:119500484；费氏新萨托(Neosartoryafischeri)),XP751811.1(GID:70993928；烟曲霉(Aspergillusfumigatus)),XP_659621.1(GID:67523121；构巢曲霉(Aspergillusnidulans)),XP_001216899.1(GID:115433524；土曲霉)和XPJ)01258585.1(GID:119473371；费氏新萨托)),或者它们的变体，所述变体具有的氨基酸序列与野生型真菌转葡糖苷酶至少约70％相同,至少约80％相同,至少约85％相同,至少约90％相同,至少约95％相同,或至少约98％相同。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的转葡糖苷酶是具有如在本申请中所描述的“转葡糖苷酶测试”中所测量的转葡糖苷酶活性的转葡糖苷酶。
根据本发明的酶活性测试:
细胞壁溶解测试:
优选地,利用下面的测试测量麸溶解性。
将(0.1M)-磷酸氢二钠(0.2M)缓冲液(pH5.0)中的麦麸悬浮液制备为1.33％麸(w/w)的浓缩液。将750μl的等分试样在搅拌下从此悬浮液中转移到eppendorph管中。将各个底物管在40℃下预加热5分钟。向其中加入250μl酶溶液,使得底物的最终浓度为1％。每次测定(0,30,60和240分钟)，由根据本发明的各个酶组合物制备三种稀释液(一式两份),其具有增加的酶浓度(例如0.33；1.0和3.0μg酶/克麸)。作为空白,使用了经热变性的酶组合物溶液。通过将所述管转移到设置为95℃的培养箱中，而在给定的时间终止反应。将经热变性的样品保持在4℃直至所有的酶反应终止。当所有的酶反应均被终止时，离心Eppendorph管以获得澄清的上清液。酶溶解麸的能力被表示为还原末端基团的增加(如使用PAHBAH(Lever,1972)所测定的)。
如果所使用的麸含有残留的淀粉,副活性(例如淀粉酶活性)可干扰上述测试,麸溶解测试应该只在纯化的细胞壁修饰酶(没有淀粉酶活性)上进行。
木聚糖酶测试(内切-β-1,4-木聚糖酶活性)
在柠檬酸(0.1M)-磷酸氢二钠(0.2M)缓冲液(pH5.0)中稀释样品,以在此测试中获得大约OD590＝0.7。在40℃将样品的三种不同的稀释液预温育5分钟。在时间＝5分钟时，将1片木聚糖酶(交联的,经染色的木聚糖底物,Megazyme,Bray,爱尔兰)加入1ml反应体积的所述酶溶液中。在时间＝15分钟时，通过加入10ml的2％TRIS/NaOH(pH12)而终止反应。使用1000μl的缓冲液代替酶溶液而制备空白。离心(1500xg,10分钟,20℃)反应混合物并且在590nm处测量上清液的OD。一个木聚糖酶单位(XU)被定义为以0.025/分钟增加OD590的木聚糖酶活性。
α-淀粉酶活性:
α-淀粉酶水解α-D-1,4-葡萄糖苷连接，并且其活性可作为淀粉-碘溶液由于α1,4-D-连接的水解而改变颜色的速率而被检测。
β-淀粉酶活性:
β-淀粉酶活性可作为麦芽糖从淀粉溶液的非还原末端的释放而被检测。
转葡糖苷酶活性:
转葡糖苷酶在用α-D-寡聚葡萄糖温育时催化水解和转移反应。转葡糖苷酶活性可在用麦芽糖或麦芽糊精温育时作为寡聚异麦芽糖(例如异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖)的形成而被检测。
淀粉脱支活性测试:
特异于淀粉中的α-D-1,6葡萄糖苷连接的酶目前包括异淀粉酶(EC3.2.1.68)和支链淀粉酶(EC3.2.1.41)。作用于淀粉的α-D-1,6葡萄糖苷连接的酶也通过其对支链淀粉的作用而被分类并且其活性是作为对淀粉和支链淀粉的α-D-1,6葡萄糖苷连接的特异性水解而被测量的。
如本申请中所使用的，术语“脂修饰酶”指能够修饰脂质的任何酶。
在一些优选的实施方式中，所述脂修饰酶是脂解酶,例如脂肪酶。
如本申请中所使用的，术语“脂解酶”指水解一种或多种来自存在于植物材料(例如谷物副流)中的脂质的脂肪酸的任何酶,其可引起在所述谷物副流中形成功能性脂质，这提供了商业价值。贡献最显著的功能性效果的分子是具有乳化剂特征的分子，其为部分水解产物，例如溶血磷脂,溶血糖脂,和单甘油酯分子。在面包制作中，极性脂水解产物(例如溶血磷脂和溶血糖脂)是特别有优势的，并且能提供与乳化剂(例如DATEM)等同的功能。
谷物副流中脂肪酶的底物是麸脂，其为极性和非极性脂质的复杂混合物。极性脂质可被分为糖脂和磷脂。这些脂质是由以两个脂肪酸酯化的甘油和极性基团构成的。所述极性基团促成这些脂质的表面活性。酶促切割这些脂质中的脂肪酸之一导致具有高得多的表面活性的脂质。公知的是具有高表面活性的乳化剂(例如DATEM)当被加入食品时是功能很强的。
在生面团产品中使用脂肪酶(E.C.3.1.1.X)可能对酵母活性有有害的影响,和/或对面包体积有负面影响。对面包体积的负面影响通常通过过量使用而得到解释。过量使用可导致面筋弹性的下降，这产生过硬的生面团并因此引起减小的面包体积。此外或备选地，此类脂肪酶可降解加入生面团中的起酥油、油或乳脂,引起生面团和烘烤产品的异味。过量使用和异味被归因于生面团中游离脂肪酸的累积。与本发明相关的，这些不希望的影响可被避免，因为脂肪酶被加入谷物副流(例如作为谷麸悬浮液)中，然后在所述谷麸悬浮液中生成功能性脂质,其经过或不经过进一步的加工而被用作生面团改良剂。进一步的加工可以是所述功能性脂质的稀释、纯化。此外，所述功能性脂质可被加工以作为液体产品或作为干燥配制的产品(例如冻干的产品)而被供应。
在EP1193314,EP0977869,WO02/094123,WO00/32758以及WO01/39602中，报导了使用作用于糖脂的脂解酶在面包制作的应用中是特别有益的，因为部分水解产物溶血糖脂被发现具有非常高的乳化剂功能，这与有害的游离脂肪酸累积相比，显然产生了更高比例的积极的乳化剂功能。然而,也发现所述酶对于甘油三酯具有显著的非选择性活性，这产生不必要地高的游离脂肪酸。在面包制作中应用脂肪酶后，向生面团中加入脂肪酶后在所述生面团中原位生成乳化剂。
脂肪酶可以是任何来源的，例如动物来源(例如哺乳动物),例如来自胰腺(例如牛或猪的胰腺),或者蛇毒或蜂毒。备选地,所述脂肪酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌,例如下列属或种：曲霉，例如黑曲霉；盘基网柄菌(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；稻瘟菌(Magnaporthe)，例如稻瘟病菌(M.grisae)；毛霉菌(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、高大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉(Rhizopus)，例如无根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、葡枝根霉(R.stolonifer)；核盘霉(Sclerotinia)，例如白腐核盘霉(S.libertiana)；毛癣菌(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏盘核菌(Whetzelinia),例如维氏盘核菌(W.sclerotiorum)；芽孢杆菌(Bacillus),例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；硝化菌(Citrobacter),例如柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌(Enterobacter),例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、迟缓爱德华氏菌(EdwardsiellaE.tarda)；欧文氏菌(Erwinia),例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌(Escherichia),例如大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌(Klebsiella),例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌(Proteus),例如普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登菌(Providencia),例如斯氏普罗威登菌(P.stuartii)；沙门氏菌(Salmonella),例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌(Serratia),例如S.liquefasciens,粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏杆菌(Shigella),例如福氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌(Streptomyces),例如S.violeceoruber；耶尔森菌(Yersinia),例如肠炎耶氏菌(Y.enterocolitica)。因此,所述脂肪酶可以是真菌的,例如来自核菌(Pyrenomycetes)纲,例如镰刀菌(Fusarium)属,例如大刀镰孢菌(F.culmorum)、异孢镰刀菌(F.heterosporum),茄病镰刀菌(F.solani)的种,或者尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的种。磷脂酶也可以来自曲霉属的丝状真菌菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株。
脂解酶的商业上优选的来源是微生物的脂肪酶或酰基转移酶。
在一些实施方式中,脂肪酶来自丝状真菌,例如曲霉属的种和镰刀菌属的种。已发现分离自丝状真菌的脂肪酶具有工业上可应用的特征，并且也发现其在异源性生产***(例如米曲霉、瑞氏木霉、镰刀菌和酵母)中表达是常规的。
在一些实施方式中,脂肪酶来自如EP1433852中所公开的塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)，此专利在此通过引用而并入。
在一些实施方式中,脂肪酶来自如EP1722636中所公开的异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum),此专利在此通过引用而并入。
在一些实施方式中,脂肪酶来自如EP0130064中或Hoshino等人(1992)Biosci.Biotech.Biochem56:660-664中所鉴别的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。
在一些实施方式中,脂肪酶是猪胰腺磷脂酶A2，例如在黑曲霉中表达的(Cakezyme(TM),DSM)。
在一些实施方式中,脂肪酶是如EP0869167中所描述的,其中公开了克隆和表达尖孢镰刀菌脂肪酶及其在烘烤中的用途。所述酶被描述为具有磷脂酶活性。此酶现在由NovozymesA/S(丹麦)作为LipopanFTM而销售。
在一些实施方式中,脂肪酶是如WO02/00852中所描述的,其公开了五种脂肪酶以及它们的编码多核苷酸,分离自F.venenatum,硫色镰刀菌(F.sulphureum),A.berkeleyanum,大刀镰孢菌(F.culmorum)和茄病镰刀菌(F.solani)。所有五种酶被描述为具有三酰甘油水解活性,磷脂酶和半乳糖脂肪酶活性。所述酶中的三种具有与EP0869167中所教导的尖孢镰刀菌酶等同的活性:F.venenatum,硫色镰刀菌,大刀镰孢菌。
在一些实施方式中,脂修饰酶是脂解酶变体。产生了具有特定氨基酸置换和融合的脂解酶变体,与野生型亲本酶相比，其中的一些对于极性脂质具有增强的活性。WO01/39602描述了此类变体，称为SP979，其为嗜热棉毛菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶与EP0869167中所描述的尖孢镰刀菌脂肪酶的融合。与甘油三酯相比，发现此变体对磷脂和糖脂具有显著的高活性比率。
在一些实施方式中,脂修饰酶为脂质酰基转移酶。
如本申请中所使用的，术语“脂质酰基转移酶”指具有脂肪酶活性(根据生物化学与分子生物学国际联盟命名委员会的酶命名推荐(1992)通常归类为E.C.3.1.1.x)也具有酰基转移酶活性(通常归类为E.C.2.3.1.x)的酶,从而所述酶能够从脂质向一种或多种接受者底物转移酰基，所述接受者底物为例如下列的一种或多种:甾醇；甾烷醇；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油。
在一些实施方式中,用于本发明的方法和/用途的脂质酰基转移酶能够从脂质(如本申请中所定义的)向下列一种或多种酰基接受者底物转移酰基基团:甾醇,甾烷醇,碳水化合物,蛋白质或其亚基,或者甘油。
对于某些方面，所述酰基接受者可以是任何包含羟基(-OH)的化合物,例如多价醇(包括甘油)；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟基酸(包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸)；蛋白质或其亚基，例如氨基酸,蛋白质水解产物和肽(部分水解的蛋白质)；以及它们的混合物和衍生物。
在一些实施方式中,根据本发明所使用的脂质酰基转移酶所作用的脂质底物是下列脂质的一种或多种:磷脂,例如卵磷脂,例如磷脂酰胆碱,三酰甘油,心磷脂,甘油二酯或糖脂,例如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。如本申请中所用的，术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
对于某些方面,优选地，所述脂质酰基转移酶所作用的脂质底物是磷脂,例如卵磷脂,例如磷脂酰胆碱或磷脂酰肌醇。
在一些实施方式中，所述脂质底物是食品脂质,也就是说食品的脂质组份。
合适地,根据本发明所使用的脂质酰基转移酶可显示一种或多种下列脂肪酶活性:糖脂肪酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰基甘油脂酶活性(E.C.3.1.1.3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。如本申请中所使用的，术语“糖脂肪酶活性”包括“半乳糖脂肪酶活性”。
合适地,根据本发明所使用的脂质酰基转移酶可具有至少一种或多种下列活性:糖脂肪酶活性(E.C.3.1.1.26)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)和/或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)。
对于某些方面,优选地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶能够从糖脂和/或磷脂向甾醇和/或甾烷醇转移酰基基团以至少形成甾醇酯和/或甾烷醇酯。
合适的甾醇酰基接受者包括胆固醇和植物甾醇,例如α-谷甾醇,β-谷甾醇,豆甾醇,麦角固醇,菜油甾醇,5,6-二氢甾醇,菜子甾醇,α-菠菜甾醇,β-菠菜甾醇,γ-菠菜甾醇,δ菠菜甾醇,岩藻甾醇,黑海甾醇,子囊甾醇,serebisterol,表甾醇(episterol),anasterol,hyposterol,范菜甾醇,链甾醇,chalinosterol,多孔甾醇,穿贝海绵甾醇,甾醇糖苷,以及其它天然或合成的异构形式和衍生物。
在一个方面,优选地，所述酰基接受者是下列的一种或多种:α-谷甾醇,β-谷甾醇,豆甾醇,麦角固醇,β-谷甾烷醇,ss-谷甾烷醇或菜油甾醇。
对于某些方面,优选地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶能够从糖脂和/或磷脂向甘油转移酰基基团以至少形成甘油二酯和/或单甘油酯。
对于某些方面,在根据本发明加入脂质酰基转移酶之前或与之同时，存在于含脂质植物材料中的一种或多种甾醇可被转化为一种或多种甾烷醇。可采用将甾醇转化为甾烷醇的任何合适的方法。例如,可通过化学氢化作用而进行所述转化。所述转化可在根据本发明加入脂质酰基转移酶之前进行或者与之同时进行。WO00/061771教导了用于将甾醇转化为甾烷醇的合适的酶。
合适地，可利用本发明来在脂质植物材料中产生植物甾烷醇酯。植物甾烷醇酯具有增加的穿过脂膜的可溶性、生物利用率和提高的健康益处(参见例如WO92/99640)。
用于测定％酰基转移酶活性的方案:
根据本发明向其中加入了脂质酰基转移酶的含脂质植物材料可按照以CHCl3:CH3OH2:1进行的酶促反应而被提取，并且分离了含有脂质材料的有机相且根据本申请下文中详述的过程通过GLC和HPLC进行了分析。由GLC和HPLC分析，测定了游离脂肪酸和一种或多种甾醇/甾烷醇酯；碳水化合物酯,蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。以相同的方式分析了未向其中加入酶的含脂质植物材料对照。
计算:
由GLC和HPLC分析的结果，可以计算游离脂肪酸和甾醇/甾烷醇酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或单甘油酯的增加:
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量；
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中，Δ％甾醇酯＝％甾醇/甾烷醇酯(酶)-％甾醇/甾烷醇酯(对照)以及Mv甾醇酯＝甾醇/甾烷醇酯的平均分子量)-当酰基接受者为甾醇和/或甾烷醇时适用；
B＝Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中，Δ％碳水化合物酯＝％碳水化合物酯(酶)-％碳水化合物酯(对照)以及Mv碳水化合物酯＝碳水化合物酯的平均分子量)-当酰基接受者为碳水化合物时适用；
C＝Δ％蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中，Δ％蛋白质酯＝％蛋白质酯(酶)-％蛋白质酯(对照)以及Mv蛋白质酯＝蛋白质酯的平均分子量)-当酰基接受者为蛋白质时适用；以及
D＝甘油二酯和/或单甘油酯/Mv双/单甘油酯的绝对值(其中，Δ％甘油二酯和/或单甘油酯＝％甘油二酯和/或单甘油酯(酶)-％甘油二酯和/或单甘油酯(对照)以及Mv双/单甘油酯＝甘油二酯和/或单甘油酯的平均分子量)-当酰基接受者为甘油时适用。
转移酶活性被计算为总酶活性的百分比:
(*-适当时删除)。
在优选的方面，本发明提供含脂质植物材料，其中脂质通过脂解酶的作用被修饰成为功能性脂质。其可伴有或不伴有所述功能性脂质的纯化而被用作食品成分。
合适地,如本申请中所使用的，术语“食物”或“食品”可指随时可被消费的形式的食品。然而，备选地或此外,如本申请中所使用的，术语食品可指一种或多种用于食品制备的食物材料。仅以示例的方式,术语食品包括由生面团生产的烘烤产品以及用于制备所述烘烤产品的生面团。
合适地,如本申请中所使用的，术语“食品”指适于人和/或动物消费的物质。
另一方面,根据本发明的食品可以是动物饲料。
在一些实施方式中,根据本发明所使用的食品选自下列的一种或多种:蛋,基于蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱,沙拉酱,调味料,冰激凌,蛋粉,经修饰的蛋黄以及由之制作的产品；烘烤产品,包括面包,蛋糕,甜的生面团产品,分层的生面团,液体面糊,松饼,甜甜圈(doughnut),饼干,薄脆饼干和小饼(cookies)；糖果,包括巧克力,糖,焦糖,halawa,口香糖(包括无糖和加糖增甜的口香糖,泡泡糖,软泡泡糖,咀嚼口香糖)和布丁；冷冻产品，包括雪糕,优选冷冻的乳制品,包括冰激凌和冰牛奶；乳制品,包括奶酪,黄油，牛奶,咖啡奶(coffeecream),生奶油,乳蛋糕乳脂(custardcream),奶饮品和酸奶，慕斯,搅打的植物奶油(whippedvegetablecream)；肉制品,包括经加工的肉制品；食用油和脂肪,充气和未充气的搅打产品,水包油型乳剂,油包水型乳剂,人造黄油,起酥油和糊状食品(包括低脂和极低脂的糊状食品)；调味品,蛋黄酱,蘸酱,基于奶油的调味料,基于奶油的汤,饮料,香料乳剂和调味料。
合适地根据本发明的食品可以是“精制食物”,包括蛋糕,油酥点心(pastry),糖果,巧克力,软糖等。
在一个方面，根据本发明的食品可以是生面团产品或烘烤产品例如面包,油炸产品,零食,蛋糕,派,核仁巧克力饼(brownies),小饼,面条,方便面,墨西哥面饼,零食类(例如薄脆饼干,全麦酥饼(grahamcracker),椒盐卷饼,和土豆片)以及意大利面食(pasta)和早餐谷物。
在其它方面，根据本发明的食品可以是源自植物的食品，例如面粉,预混料,油,脂肪,可可脂,咖啡增白剂,沙拉酱,人造黄油,糊状食品,花生酱,起酥油,冰激凌,烹调油。
在另一方面,根据本发明的食品可以是乳制品,包括黄油、牛奶、奶油、奶酪(例如各种形式(包括碎片、块、薄片或搓碎的)的天然、加工的和仿奶酪),奶油乳酪,冰激凌,冷冻甜品,酸奶,酸奶饮品,乳脂(butterfat),无水乳脂，其它乳制品。根据本发明所使用的酶可改善乳制品中的脂肪稳定性。
在另一方面,根据本发明的食品可以是含有源自动物的成分的食品,例如经过加工的肉制品,烹调油,起酥油。
在又一方面,根据本发明的食品可以是饮料，水果、混合水果，蔬菜或葡萄酒。在某些情况下，所述饮料可含有最多20g/l的添加的源自本发明的植物甾醇。
在另一方面,根据本发明的食品可以是动物饲料。所述动物饲料可富含植物甾醇和/或植物甾烷醇,优选富含β-谷甾醇/甾烷醇。合适地,所述动物饲料可以是家禽饲料。当所述食物是家禽饲料时,本发明可被用于降低蛋的胆固醇含量，所述蛋是由以根据本发明的食品饲养的家禽生产的。
在一个方面，优选地，所述食品选自下列的一种或多种:蛋,基于蛋的产品,包括蛋黄酱,沙拉酱,调味料,冰激凌，蛋粉,经修饰的蛋黄和由它们制造的产品。
优选地，根据本发明的食品是含水的食品。合适地，所述食品可以包含10-98％的水,合适地14-98％的水,合适地18-98％的水,合适地20-98％的水,合适地40-98％的水,合适地50-98％的水,合适地70-98％的水,合适地75-98％的水。
在本发明的一个方面，由含脂质植物材料产生的所述功能性脂质是乳化剂。优选地,在所述含脂质植物材料中生成至少一种乳化剂。
在本发明的一个方面，在含脂质材料中至少生成两种不同的乳化剂。
在本发明的一个方面，在含脂质材料中至少生成三种不同的乳化剂。
在本发明的一个方面，在含脂质材料中至少生成四种乳化剂。
合适地,根据本发明的乳化剂可以是，例如下列的一种或多种:甘油二酯,单甘油酯(例如1-单甘油酯)或溶血卵磷脂(例如溶血磷脂酰胆碱或磷脂酰肌醇),例如双半乳糖单甘油酯(DGMG)。所述乳化剂优选地是在从脂质酰基供体去除一个或多个酰基基团后由所述脂质酰基供体产生的。如本申请中所使用的，术语溶血卵磷脂包括溶血磷脂酰胆碱,溶血磷脂酰乙醇胺,溶血磷脂酰肌醇,溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰甘油。如本申请中所使用的，术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂是同义词并且这些术语在本申请中可被互换地使用。
当所述乳化剂之一是蛋白质酯和/或甘油二酯和/或单甘油酯时,第二种乳化剂可以是例如下列的一种或多种:甘油二酯,单甘油酯,例如1-单甘油酯,溶血磷脂酰胆碱,或双半乳糖单甘油酯(DGMG)。第二种乳化剂优选地是在从脂质酰基供体去除一个或多个酰基基团后由所述脂质酰基供体产生的。
在一个实施方式中，本申请所产生的功能性脂质可被用于制备食品的过程中。
根据本发明的功能性脂质可与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此，下述在本发明的范围内：除了本发明的功能性脂质外,向食品中加入至少一种其它的酶。此类其它的酶包括淀粉降解酶(例如内切或外切淀粉酶,支链淀粉酶,脱支酶)，半纤维素酶(包括木聚糖酶)，纤维素酶，氧化还原酶(例如葡糖氧化酶,吡喃糖氧化酶,巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶,例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶，磷脂酶，葡糖脂酶和己糖氧化酶,以及蛋白酶。
根据本发明用脂解酶处理以产生功能性脂质的含脂质植物材料(未纯化或者有限地纯化所述功能性脂质)可与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此，下述在本发明的范围内：除了本发明的经纯化或未纯化的功能性脂质外,向食品中加入至少一种其它的酶。此类其它的酶包括淀粉降解酶(例如内切或外切淀粉酶,支链淀粉酶,脱支酶)，半纤维素酶(包括木聚糖酶)，纤维素酶，氧化还原酶(例如葡糖氧化酶,吡喃糖氧化酶,巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶,例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶，磷脂酶，葡糖脂酶和己糖氧化酶,以及蛋白酶。
在优选的实施方式中，所述脂解酶具有下列的一种或多种脂肪酶活性:糖脂肪酶活性(E.C.3.1.1.26),三酰甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3),磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。合适地,所述脂肪酶是本领域公知的并且例如包括下列脂肪酶:GrindamylPowerbake4070或4080(DaniscoA/S),LysomaxOil(DaniscoA/S),F和/或ULTRA(NovozymesA/S,丹麦),磷脂酶A2(例如来自Biocatalysts的LIPOMODTM22L的磷脂酶A2,来自Genencor的LIPOMAXTM),(NovozymesA/S,丹麦),WO03/97835、EP0977869或EP1193314中教导的脂肪酶。本领域技术人员将能够结合脂解酶的部分。
传统上，蛋糕工业使用蛋糕改良剂来生产蛋糕并确保在味道、结构、食用质量和外观方面高品质的蛋糕。这些蛋糕改良剂通常是基于在载体(例如淀粉和麦芽糖糊精)上干燥的乳化剂喷雾。一些蛋糕改良剂也以基于乳化剂、糖和水的凝胶形式。这些蛋糕改良剂对于蛋糕工业生产高品质的蛋糕而言是非常重要的。然而，蛋糕改良剂含有乳化剂和其它带有E-数字的“非天然”的成分。由于消费者对于减少E-数字的数目的需求,蛋糕工业寻求了备选的方式来生产高品质的蛋糕而不使用此类乳化剂。
根据本发明用脂解酶处理以产生功能性脂质的含脂质植物材料可被用作食物改良剂，未纯化或有限地纯化所述功能性脂质或者作为完全纯化的功能性脂质。
在本发明的一个方面，所述食物改良剂是蛋糕改良剂。
在本发明的一个方面，所述食物改良剂是面包改良剂。
根据本发明所生成的食物改良剂可以合适地包含一种或多种下列添加剂:
大豆蛋白材料；类胡萝卜素,类黄酮,抗氧化剂和植物素(特别是花青素类(anthocyanonide),类胡萝卜素,生物类黄铜,谷胱甘肽,儿茶素,异黄酮,番茄红素,人参皂苷,碧罗芷,生物碱,臀果木植物甾醇,萝卜硫素,白藜芦醇,葡萄籽提取物或含有甾烷醇酯的食物),维生素(特别是维生素C,维生素A,维生素B3,维生素D,维生素E,硫胺素,核黄素,尼克酸,吡多辛,氰钴氨,叶酸,生物素,泛酸或维生素K),矿物质(特别是钙,碘,镁,锌,铁,硒,锰,铬,铜,钴,钼或磷),脂肪酸(特别是γ-亚油酸,ucospentaenoicacid或者二十二碳六烯酸),油(特别是玻璃苣油,高类胡萝卜素，菜籽油或亚麻籽油),glucerol,山梨醇,氨基酸(特别是色氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丙氨酸,精氨酸,天冬氨酸,胱氨酸,半胱氨酸,谷氨酸,谷氨酰胺,甘氨酸,组氨酸,脯氨酸,羟脯氨酸,丝氨酸,牛磺酸或酪氨酸),如上文所定义的酶(特别是菠萝蛋白酶,木瓜蛋白酶,淀粉酶,纤维素酶或者辅酶Q),木质素,甾烷醇酯或友好的细菌(特别是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus),双歧杆菌(Lactobacillusbifidus),胚芽乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或屎链球菌(Streptococcusfaecium)),叶酸,不可溶和/或可溶性纤维。
本发明可在蛋产品(特别是蛋黄酱)中提供一种或多种下列出乎意料的技术效果:在巴氏灭菌过程中改善的热稳定性；改善的感官特性,改善的一致性。
本发明可在生面团和/或烘烤产品中提供一种或多种下列出乎意料的技术效果:生面团或烘烤产品(例如面包和/或蛋糕)的改善的比体积；改善的生面团稳定性；改善的面***评分(例如更薄的和/或更脆的面***),改善的面包心评分(例如更均一的面包心分布和/或更精细的面包心结构和/或更软的面包心)；改善的外观(例如没有鼓包或洞或基本上没有鼓包或洞的光滑表面)；减少的陈化；增强的柔软性；改善的气味；改善的味道。
本发明可由所述功能性脂质提供有益的效果，因为所述功能性脂质在食品中作为高度表面活性的材料起作用而不形成大量的游离脂肪酸,这降低了所述食物在存储时氧化的能力,因为游离脂肪酸比相应的脂肪酸酯更易于氧化。
在其它方面，本发明提供了脂解酶根据本发明在含脂质植物材料中生成其它功能性化合物的用途。
要理解，脂修饰酶(例如脂解酶)对于含脂质植物材料的作用可能不仅生成功能性脂质,也生成其它的功能性化合物,例如随着脂质转移酶的作用,酰基基团从脂质被转移至一种或多种其它接受者底物,例如下列的一种或多种:甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚基和甘油。
在一些具体实施方式中，在根据本发明的方法中生成的功能性化合物是功能性酯。
在一些实施方式中,通过根据本发明的方法生成了功能性脂质和其它功能性化合物。
通过根据本发明的方法生成的这些功能性化合物然后可被用于生面团和/或烘烤产品的制作(包括向生面团中加入所述功能性化合物,和(任选地)烘烤所述生面团以制作烘烤产品)，以提供下列的一项或多项:降低生面团的粘度；改善生面团的机械可加工性；减少烘烤产品在烘烤过程中的起泡；改善面包体积和/或柔软性；延长烘烤产品和/或生面团的架存期；改善烘烤产品和/或生面团的抗陈化效果；改善烘烤产品的面包心结构；降低烘烤产品的孔异质性；改善烘烤产品的孔均一性；减小烘烤产品的平均孔尺寸；增强生面团的面筋指数；改善烘烤产品的风味和/或气味,改善烘烤产品外皮的颜色。
在一个方面，由根据本发明的方法生成的功能性化合物是纯化的或部分纯化的。
在一个方面，由根据本发明的方法生成的功能性化合物在用于食品中之前是未经进一步纯化的。
在一个方面，由根据本发明的方法生成的功能性化合物被配制成干燥的产品。
在一个方面，所述功能性化合物在用于食品中之前是经浓缩或稀释的。
在本发明的另一方面,提供了制作面条，或面条生面团或基于面条的产品的方法，所述方法包括向面条、面条生面团或基于面条的产品中加入根据本发明的功能性化合物。
在本发明的一个方面,提供了根据本发明的功能性化合物在制作面条或基于面条的产品中的用途，用于下列的一项或多项：改善颜色/黄色,稳定颜色特征,降低明亮度,降低脂肪含量,改善质地和咬食(咀嚼性),降低水活度,降低脆碎度(breakage),增加芯的硬度和改善加工过程中的形状保持。
在本发明的另一方面,提供了制作墨西哥面饼或墨西哥面饼生面团的方法,所述方法包括向墨西哥面饼或墨西哥面饼生面团中加入根据本发明生成的食物改良剂。
在本发明的另一个方面,提供了制作意大利面食或全谷意大利面食或意大利面食生面团的方法,所述方法包括向意大利面食或意大利面食生面团中加入根据本发明生成的食物改良剂。
本发明的另一方面提供了根据本发明生成的食物改良剂在制作墨西哥面饼或墨西哥面饼生面团中的用途，用于改善墨西哥面饼的可卷性(rollability),增加墨西哥面饼的柔软性，改善墨西哥面饼和/或墨西哥面饼生面团的抗陈化特性,改善墨西哥面饼和/或墨西哥面饼生面团的柔软性和/或减少墨西哥面饼和/或墨西哥面饼生面团中的异味。
所述食物改良剂的功能可通过与乳化剂(例如DATEM)结合而被改善。
合适地,本发明可在食品中提供一种或多种下列出乎意料的技术效果:改善的外观,改善的口感,改善的稳定性,特别是改善的热稳定性,改善的味道,改善的柔软性,改善的弹性,改善的乳化作用。
合适地,本发明可在乳制品(例如冰激凌)中提供一种或多种下列出乎意料的技术效果:改善的口感(优选更奶油状的口感)；改善的味道；改善的熔融。
合适地,本发明可在蛋或蛋产品中提供一种或多种下列出乎意料的技术效果:改善的乳剂稳定性；乳剂的热稳定性；改善的风味；减少的臭味；改善的增厚特性,改善的一致性。
与本申请中所定义的食物改良剂在制备食品中的用途相关的特定技术效果列于下表中:
在另外的方面，本发明提供脂解酶在制备功能性脂质的方法中的用途。
在本发明的另一方面，提供了制备溶血磷脂(例如溶血卵磷脂)的方法,所述方法包括根据本发明用脂解酶处理含脂质植物材料。
在本发明的其它方面提供了脂解酶在通过根据本发明用脂解酶处理含脂质植物材料而制备溶血糖脂(例如双半乳糖单甘油酯(DGMG)或单半乳糖单甘油酯(MGMG))的方法中的用途。
半乳糖脂肪酶活性的测定(糖脂肪酶活性测试):
底物:
将0.6％双半乳糖甘油二酯(SigmaD4651),0.4％Triton-X100(SigmaX-100)和5mMCaCl2溶于0.05MHEPES缓冲液(pH7)中。
测试过程:
将400μL底物加入1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf恒温混合器(Thermomixer)中，于37℃放置5分钟。在时间t＝0min时,加入50μL酶溶液。还分析了代替酶而含有水的空白。将样品以10*100rpm在Eppendorf恒温混合器中，于37℃混合10分钟。当时间t＝10min时，将Eppendorf管在另一个恒温混合器中于99℃放置10分钟以终止反应。
利用来自WAKOGmbH的NEFAC试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
pH7时的酶活性GLU被计算为在测试条件下所产生的脂肪酸(微摩尔)/分钟。
磷脂酶活性的测定(磷脂酶活性测试):
使用给出相当的结果的两种不同的方法测量磷脂酶活性。可使用这些方法中的任一种来测定根据本发明的磷脂酶活性。
“PLU测试”用于测定磷脂酶活性
底物:
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％植物(Avanti#441601),0.4％Triton-X100(SigmaX-100)和5mMCaCl2溶于0.05MHEPES缓冲液(pH7)中。
测试过程:
将400μL底物加入1.5mLEppendorf管中并在Eppendorf恒温混合器中于37℃放置5分钟。当时间t＝0min时,加入50μL酶溶液。还分析了代替酶而含有水的空白。将样品以10*100rpm在Eppendorf恒温混合器中于37℃混合10分钟。当时间t＝10min时，将Eppendorf管在另一个恒温混合器中于99℃放置10分钟以终止反应。
利用来自WAKOGmbH的NEFAC试剂盒分析样品中的游离脂肪酸。
pH7时的酶活性PLU-7被计算为在测试条件下所产生的脂肪酸(微摩尔)/分钟。
“TIPU测试”用于测定磷脂酶活性
1TIPU(滴定磷脂酶单位)被定义为在测试条件下，释放1μmol游离脂肪酸/分钟的酶的量。
磷脂酶A1和A2催化卵磷脂向溶血卵磷脂的转化，分别伴随着游离脂肪酸从位置1和2的释放。可通过连续滴定在酶促作用过程中从卵磷脂释放的脂肪酸来测定磷脂酶活性,因为消耗的碱等于释放的脂肪酸的量。
底物:
将4％卵磷脂,4％Triton-X100,和6mMCaCl2:12g卵磷脂粉末(Avanti极性脂质#44160)以及12gTriton-X100(Merck108643)在磁力搅拌下分散在大约200ml去矿物质水中。加入3.0ml0.6MCaCl2(p.a.Merck1.02382)。用去矿物质水将体积调节为300mL并且使用UltraThurax对乳剂进行均质化。每天新鲜制备底物。
测试过程:
加入300μL的酶来制备酶溶液，使得滴定曲线的斜率在0.06和0.18ml/min之间。
包括了已知活性的对照样品。
将样品溶解在去矿物质水中并以300rpm搅拌15min。
将25.00ml底物在37.0℃保持恒温10-15分钟，然后用0.05M的NaOH将pH调节到7.0。将300μL酶溶液加入底物中，并使用pH-Stat滴定仪(Phm290,MettlerToledo)用0.05MNaOH进行连续滴定。在各个标度上进行两次活性测定。
8分钟后终止滴定，并计算5至7分钟之间的滴定曲线的斜率。检测极限是3TIPU/ml酶溶液。
计算：
以下列方式计算磷脂酶活性(TIPU/g酶):
T I P U / g = α · N · 10 6 μ m o l m o l · 10 - 3 l m l · V 1 m · V 2 = α · N · 10 3 · V 1 m · V 2
其中：
α是5至7分钟的反应时间之间滴定曲线的斜率(ml/min)。
N是所使用的NaOH的当量浓度(mol/l)。
V1是酶溶解于其中的体积(ml)。
m是加入V1中的酶的量(g)。
V2加入底物中的酶溶液的体积(ml)。
三酰甘油脂肪酶活性的测定:基于甘油三酯(三丁酸甘油酯)作为底物的测试(LIPU):
根据食品化学品集,第四版,科学院出版社,1996,p803测量基于三丁酸甘油酯的脂肪酶活性,进行了下述改变：将样品溶解于去离子水中而非甘氨酸缓冲液中,并且pHstat设置点为5.5而非7。
1LIPU被定义为在测试条件下可释放1mol丁酸/分钟的酶的量。
在本发明的一个方面,根据本发明所使用的脂解酶可以获得自丝状真菌。更优选地,真菌脂解酶可获得自(优选是获得自)镰刀菌属的种。优选地，根据本发明所使用的真菌脂解酶可获得自(优选是获得自)异孢镰刀菌或半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)。合适地,根据本发明所使用的脂解酶可获得自(优选是获得自)异孢镰刀菌(CBS782.83)或半裸镰刀菌(IBT9507)。
因此在一个方面,优选根据本发明所使用的脂解酶是丝状真菌脂解酶,优选丝状真菌野生型脂解酶。
在本申请中所提及的一些应用、特别是食物应用(例如烘烤应用)中,根据本发明生成的食物改良剂可以与一种或多种常规的乳化剂(包括例如单甘油酯,脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯,硬脂酰乳酸钠(SSL)和卵磷脂)一起使用。
由根据本发明的方法所生成的食物改良剂在添加脂肪的面包配方中是特别优选的。
此外或备选地,由根据本发明的方法所生成的食物改良剂可与一种或多种其它合适的食品级酶一起使用。因此,下述也在本发明的范围内:除了本发明的脂解酶外,还可向烘烤产品和/或生面团中加入至少一种其它的酶。此类其它的酶包括淀粉降解酶(例如内切或外切淀粉酶,支链淀粉酶,脱支酶)，半纤维素酶(包括木聚糖酶)，纤维素酶，氧化还原酶(例如葡糖氧化酶,吡喃糖氧化酶,巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶,例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶，磷脂酶，半乳糖脂肪酶和己糖氧化酶,蛋白酶以及酰基转移酶(例如WO04/064987中所描述的那些)。
特别优选的是，根据本发明所使用的脂解酶与α淀粉酶相组合而被用于生产食品。特别地，所述淀粉酶可以是非－麦芽糖生成性淀粉酶,例如具有非－麦芽糖生成性外切淀粉酶活性(特别是葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)活性)的多肽(如WO05/003339中所公开的)。合适的非－麦芽糖生成性淀粉酶是商业上可得的PowersoftTM(可获得自DaniscoA/S,丹麦)。也可使用麦芽糖生成性淀粉酶例如NovamylTM(NovozymesA/S,丹麦)。在一个实施方式中,α淀粉酶与本发明的食物改良剂的组合使用可被用于生面团中,和/或烘烤产品(例如面包,蛋糕,甜甜圈,蛋糕甜甜圈或圈饼)的生产中。α淀粉酶与本发明的食物改良剂的组合也被认为是优选地用于生产墨西哥面饼(例如小麦和/或玉米墨西哥面饼)的方法中。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明生成的食物改良剂可与木聚糖酶相组合而被用于生产食品。GRINDAMYLTM和POWERBake7000是商业上可得的木聚糖酶的实例，可获得自DaniscoA/S。木聚糖酶的其它实例可在WO03/020923和WO01/42433中找到。
优选地，根据本发明生成的食物改良剂可与木聚糖酶及α淀粉酶相组合使用。合适地，所述α淀粉酶可以是麦芽糖生成性的或非－麦芽糖生成性的α淀粉酶(例如GRINDAMYLTM或POWERSoft,商业上可获得自DaniscoA/S),或其组合。
本发明的食物改良剂也可以优选地与氧化酶(例如麦芽糖氧化酶(MOX),例如己糖氧化酶(HOX))相结合而被使用。合适的方法描述于WO03/099016中。商业上可得的麦芽糖氧化酶GRINDAMYLTM和SUREBake可获得自DaniscoA/S。
任选地，α-淀粉酶(例如非－麦芽糖生成性外切淀粉酶和/或麦芽糖生成性淀粉酶),和/或麦芽糖氧化酶(MOX)与所述酶相结合可被用于根据本发明的方法中，以制备生面团、烘烤产品、墨西哥面饼、蛋糕、意大利面食、方便面/油炸零食、或乳制品(例如奶酪)。
根据本发明生成的食物改良剂通常通过本领域中已知的方法被包括在食品或其它组合物中。此类方法包括向所述食品或组合物中直接加入所述食物改良剂,将所述食物改良剂与稳定剂和/或载体相组合而加入,以及加入包含所述食物改良剂和稳定剂和/或载体的混合物。
用于本发明的合适的稳定剂包括但不限于无机盐(例如NaCl,硫酸铵),山梨醇,乳化剂和去污剂(例如Tween20,Tween80,不含甘油三酯的PanodanAB100,聚甘油酯,山梨聚糖单油酸酯(sorbitanmonoleate)),油(例如油菜籽油,葵花籽油和豆油),果胶,海藻糖,山梨醇和甘油。
用于本发明的合适的载体包括但不限于淀粉、谷物粉、研磨的小麦,小麦面粉,NaCl和柠檬酸盐。
例如,对于烘烤产品(例如面包,馒头(steambuns)和美国白盘式面包)，加入本发明的食物改良剂可产生下列的一种或多种:改善的面包体积和柔软性,延长的架存期和/或抗陈化效果,改善的面包心结构,降低的孔异质性,减小的平均孔径,增强的面筋指数,改善的风味和/或气味,以及改善的外皮颜色。
有利地，根据本发明生成的食物改良剂可被用于替代食品(例如生面团和/或烘烤产品)中的乳化剂。
根据本发明生成的食物改良剂可与乳化剂(例如DATEM,SSL,CSL,单甘油酯,聚山梨醇酯和Tween)协同作用。因此，根据本发明生成的食物改良剂可与一种或多种乳化剂组合使用。有利地,与不使用根据本发明生成的食物改良剂而所需的量相比，将根据本发明生成的食物改良剂与一种或多种乳化剂组合使用可减少所使用的乳化剂的总量。
根据本发明生成的食物改良剂也可与下列协同作用：水胶体,瓜尔豆胶,黄多糖胶和果胶,以及麦芽糖氧化酶，例如己糖氧化酶。
例如，对于甜甜圈、蛋糕甜甜圈、圈饼、零食蛋糕和松饼，当与下列的一种或多种相组合而使用本发明的食物改良剂时，可产生协同效果：α-淀粉酶,麦芽糖生成性α-淀粉酶和非－麦芽糖生成性α-淀粉酶。
例如，对于蛋糕、海绵蛋糕和掌形蛋糕(palmcake),当与一种或多种水胶体(例如瓜尔豆胶)和/或一种或多种乳化剂(例如DATEM)相结合而使用本发明的食物改良剂时，可产生协同效果。
例如，对于饼干,使用根据本发明生成的食物改良剂赋予其改善的可卷性和操作特性,特别是冷的时候(冷可卷性(coldrollability))。
有利地,例如在蛋黄酱和其它基于蛋的产品中,使用根据本发明生成的食物改良剂可引起改善的质地,减小的平均颗粒大小,和/或减小的平均颗粒分布,改善的热稳定性,改善的微波表现和/或稳定性。
在蛋糕中,使用本发明有利地引起改善的柔软性、体积、改善的保存特性和存架期。
例如，对于面条或面条产品(例如方便面)，本发明的食物改良剂可赋予其一种或多种下列特性:改善的颜色/黄色,更稳定的颜色特征,降低的明亮度,降低的脂肪含量,改善的质地和咬食(咀嚼性),降低的水活度,降低的脆碎度,增加的芯硬度和在加工过程中改善的形状保持。
优选地,本发明的食物改良剂可被用于降低面条或面条产品(例如方便面)的脂肪含量。
例如，在墨西哥面饼中,使用根据本发明生成的食物改良剂可产生下列一种或多种:墨西哥面饼降低的可卷性(例如通过增加柔软性),改善的抗陈化特性,增强柔软性和/或减少异味。
有利地,改善的可卷性和/或柔软性可在卷起墨西哥面饼时，引起减小的破裂可能性。
根据本发明生成的食物改良剂在烘烤产品的制备中特别有用,所述烘烤产品为例如由生面团制备的那些,包括面包、蛋糕、甜的生面团产品、分层的生面团、液体面糊、松饼、甜甜圈、饼干、薄脆饼干和点心。
根据本发明生成的食物改良剂在早餐谷物(例如由生面团制备的那些)的制备中特别有用。
食物改良剂还可用于面包-改善性添加剂中，例如生面团组合物,生面团添加剂,生面团调节剂,预混合料和制作面包或其它烘烤产品的过程中被常规地加入面粉和/或生面团中以为所述面包或其它烘烤产品提供改善的特性的类似制备物。
因此,本发明还涉及面包-改善性组合物和/或生面团-改善性组合物，其包含根据本发明生成的食物改良剂；并且也涉及包含此类面包-改善性和/或生面团-改善性组合物的生面团或烘烤产品。
除了根据本发明的真菌脂解酶之外，所述面包-改善性组合物和/或生面团-改善性组合物可包含其它物质,所述物质被常规地用于烘烤中以改善生面团和/或烘烤产品的特性。
所述面包-改善性组合物和/或生面团-改善性组合物可包含一种或多种常规的烘烤剂,例如一种或多种下列组分:
奶粉、面筋、乳化剂、粒状脂肪、氨基酸、糖、盐、面粉或淀粉。
合适的乳化剂的实例是:单甘油酯、脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸钠(SSL)和卵磷脂。
所述面包和/或生面团改善性组合物还可包含其它的酶,例如一种或多种其它合适的食品级酶,包括淀粉降解酶(例如内切或外切淀粉酶,支链淀粉酶,脱支酶)，半纤维素酶(包括木聚糖酶)，纤维素酶，氧化还原酶(例如葡糖氧化酶,吡喃糖氧化酶,巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶，例如氧化麦芽糖的酶,例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶，磷脂酶，半乳糖脂肪酶和己糖氧化酶,蛋白酶以及酰基转移酶(例如WO04/064987中所描述的那些)。
如本申请中所使用的，术语“烘烤产品”包括由生面团制备的产品。可以是有利地通过本发明生产的烘烤产品(白色的,浅型或深型)的实例包括下列的一种或多种:面包(包括白面、粗面粉和黑麦面包)、通常是以大块或卷或吐司的形式，法棍型面包，皮塔面包，墨西哥面饼，玉米饼，蛋糕，薄饼，饼干，脆面包，意大利面食，面条等。
根据本发明的生面团可以是已发酵的生面团或将被发酵的生面团。所述生面团可以各种方式被发酵，例如通过加入碳酸氢钠等,或通过加入合适的酵母培养物(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(面包酵母)的培养物)。
根据本发明的生面团可以是用于制备干谷物产品、脆面包、饼干或薄脆饼干的生面团。
在本发明的另一方面,根据本发明所使用的任何特定的酶的量可以例如为：在0.005-100mg酶蛋白/kg麸的范围内,例如0.0550mg酶蛋白/kg或例如0.1-20mg/kg。在一些实施方式中,根据本发明所使用的酶的总量在0.01-1g酶蛋白/kg麸的范围内,例如0.05－100mg/kg酶蛋白或例如0.1-100mg/kg。
本发明的具体实施方式
如上文所述，本发明涉及用于减少包含至少部分溶解的植物材料的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法,其中所述方法包括一个或多个控制所述植物材料的氧化过程的步骤。
在一些实施方式中所述方法为用于减少颜色形成的方法。在一些实施方式中所述方法用于减少不悦味道的形成。在一些实施方式中所述方法用于减少恶臭形成。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是其中所述植物材料为谷麸的方法。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中所述谷麸选自：小麦,大麦,燕麦,黑麦,黑小麦,稻和玉米。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法，其中所述控制氧化过程的步骤是在溶解所述植物材料之前或在溶解所述植物材料的过程中进行的。在一些实施方式中，用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中所述控制氧化过程的步骤与溶解所述植物材料同时进行。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中所述氧化过程是通过使用一种或多种酶控制的。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法包括一个或多个选自下列的控制氧化过程的步骤:
i)用氧化还原酶处理所述组合物；
ii)用抗氧化剂处理所述组合物；
iii)用一种或多种脂质酰基转移酶处理所述组合物；
iv)在减少组合物与氧接近的条件下处理所述组合物；
v)在抑制或破坏内源性氧化酶的酶活性的条件下处理所述组合物；和
vi)在从组合物中物理地或化学地去除氧的条件下处理所述组合物。
要理解，可通过i)至vi)中所示特定步骤的任何一步、两步、三步、四步、五步或全部来处理所述组合物。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法不包括加入外源性抗氧化剂。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法不包括加入外源性碱,例如选自氢氧化钠(NaOH)和氢氧化钾的(KOH)碱。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法不包括加入外源性臭氧和/或过氧化氢。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法不包括加入外源性酸和/或通过窑烧的方法,和/或通过使用微波加热。
在一些实施方式中，在步骤i)下所使用的氧化还原酶为氧化酶。在一些实施方式中，所述氧化酶为己糖氧化酶。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中步骤iii)中的脂质酰基转移酶减少使稻产生颜色和/或不悦味道和/或恶臭的脂质和/或酚类化合物的量。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法，其中步骤v)中的内源性氧化酶氧化使稻产生颜色和/或不悦味道和/或恶臭的化合物。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法，其中氧势被降低。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法，其中相对于其中没有一个或多个控制氧化过程的步骤的方法中的氧势而言，氧势降低至少约20％,例如至少约30％,例如至少约40％,例如至少约60％,例如至少约80％。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法，其中减少了脂质的氧化。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中减少了一种或多种烷基羧酸(例如丁酸,异丁酸,戊酸,异戊酸和己酸之一)的产生。在一些实施方式中,相比于未处理的组合物，一种或多种烷基羧酸的量减少了至少约20％,例如至少约30％,例如至少约40％,例如至少约50％,例如至少约60％,例如至少约70％,例如至少约80％,例如至少约90％,例如至少约95％,例如至少约99％。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中酚类化合物(例如多酚类化合物)的氧化减少了。在一些实施方式中,相对于未处理的组合物，被氧化的酚类化合物的量减少了至少约20％,例如至少约30％,例如至少约40％,例如至少约50％,例如至少约60％,例如至少约70％,例如至少约80％,例如至少约90％,例如至少约95％,例如至少约99％。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中愈创木酚的产生减少了。在一些实施方式中,相对于未处理的组合物，愈创木酚的量减少了至少约20％,例如至少约30％,例如至少约40％,例如至少约50％,例如至少约60％,例如至少约70％,例如至少约80％,例如至少约90％,例如至少约95％,例如至少约99％。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中通过施用氮毯(nitrogenblanket)或氮吹扫(nitrogenflushing)来处理所述组合物。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中抗氧化剂选自：抗坏血酸，抗坏血酸的脂肪酸酯，N-乙酰半胱氨酸，异硫氰酸苄酯，β胡萝卜素，绿原酸，柠檬酸，2,6-二-叔-丁基苯酚，乳酸，酒石酸，尿酸，抗坏血酸钠，抗坏血酸钙，磷酸钠(例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠)，磷酸钾(例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾)，卵磷脂，抗坏血酸钾，迷跌香提取物，绿茶提取物，红茶提取物，生育酚类(例如生育酚(维生素E)、例如混合的生育酚类、α-生育酚(任何立体异构体或其任意混合),β-生育酚,γ-生育酚,δ-生育酚),维生素K,丁羟甲苯(BHT),丁羟基茴香醚(BHA),erythorbinacid，anoxomer抗氧化剂,异抗坏血酸,异抗坏血酸钠,erythorbin钠,乙氧喹,单油酸甘油酯,过氧化氢酶,愈创树脂,苹果酸,没食子酸丙酯,没食子酸辛酯,没食子酸十二酯,棓酸乙酯,叔丁基氢醌(TBHQ),抗坏血酸硬脂酸酯,抗坏血酸棕榈酸酯,谷胱甘肽,脂肪酸的甘油单酯或甘油二酯的柠檬酸酯,硫代二丙酸,或鞣酸，或其组合。在优选的实施方式中，所述抗氧化剂为抗坏血酸,酚类化合物和/或维生素。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中所述抗氧化剂是酶，例如选自下列的酶：过氧化氢酶,超氧化物歧化酶和过氧化物酶。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中所述氧化还原酶选自：选自组E.C.1.1.3.x的氧化酶，例如，选自下列的氧化酶：葡糖氧化酶(EC1.1.3.4),吡喃糖氧化酶,己糖氧化酶(EC1.1.3.5),甘油氧化酶,吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10),半乳糖氧化酶(EC1.1.3.9)和/或对于麦芽糖比对于葡萄糖具有更高活性的碳水化合物氧化酶。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中氧化还原酶为葡糖氧化酶。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法修饰感官特性,例如组合物的气味特性。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其可见地减少组合物的颜色强烈度。
在一些实施方式中，所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是以工业规模进行的,例如用超过10升的组合物,例如超过20升,例如超过50升,例如超过100升,例如超过200升,例如超过400升,例如超过600升,例如超过1000升。
在一些实施方式中所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其包括热灭活内源酶活性的步骤,例如通过煮沸或巴氏消毒所述组合物。
在一些实施方式中所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中用一种或多种脂质酰基转移酶处理所述组合物。
在一些实施方式中所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中用一种或多种酰基转移酶处理所述组合物。
在一些实施方式中所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中用一种或多种如本文中所定义的其它的酶来处理所述组合物。
要理解，此类其它的酶可以是任何能够在所述组合物中原位产生氧化酶的底物的酶。此类其它的酶可以是任何合适的如本文中所定义的淀粉修饰酶,例如淀粉酶,或任何如本文中所定义的细胞壁修饰酶。
此外或备选地，可向组合物中加入氧化酶的此类底物。因此，在一些实施方式中,可向组合物种加入任何合适的氧化酶底物。在一些实施方式中，所加入的底物为碳水化合物,例如己糖(例如葡萄糖)或二糖(例如麦芽糖)。
作为备选的方面，本发明涉及溶解包含植物材料的组合物的方法,所述方法包括控制植物材料的氧化过程的步骤。
在一些实施方式中溶解的方法是这样的方法,其中根据本发明的用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法来控制氧化过程。
在一些实施方式中溶解的方法是这样的方法,其中所述组合物是至少部分溶解的含脂质植物材料。
在一些实施方式中溶解的方法是这样的方法,其中所述组合物是通过超声处理(例如超声波处理)和/或挤压而被溶解的。
在一些实施方式中所述溶解的方法还包括用一种或多种细胞壁修饰酶处理所述组合物的步骤。
在一些实施方式中所述溶解的方法还包括用一种或多种淀粉修饰酶处理所述组合物的步骤。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述组合物含有不可溶的植物材料。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法,其中还用一种或多种其它的酶处理所述组合物。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述其它的酶是一种或多种转葡萄糖基酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述其它的酶是蛋白酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中用一种或多种脂修饰酶处理所述组合物，所述脂修饰酶选自:三酰甘油脂肪酶、磷脂酶、和半乳糖脂肪酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述一种或多种脂修饰酶含有两种或三种活性，所述活性选自:三酰甘油脂肪酶活性,磷脂酶活性,和半乳糖脂肪酶活性。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述一种或多种脂修饰酶是一种、两种、三种、四种或五种不同的脂修饰酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法还包括溶解谷麸之后分离可溶性级分的步骤。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述一种或多种细胞壁修饰酶选自木聚糖酶,纤维素酶(例如纤维二糖水解酶),内切-葡聚糖酶，木聚葡糖酶和β-葡聚糖酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述纤维素酶选自：内切-纤维素酶,外切-纤维素酶,纤维二糖酶,氧化纤维素酶,纤维素磷酸化酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述一种或多种淀粉修饰酶选自：α-淀粉酶,支链淀粉酶、异淀粉酶和β-淀粉酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述一种或多种转葡萄糖基酶选自酶分类EC3.2.1.20的酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中以颗粒形式提供植物材料,其中所述颗粒植物材料的平均粒径为低于3000μm,例如低于1000μm,例如低于500μm。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述植物材料是谷麸。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述谷麸选自小麦、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、稻和玉米。
在一些实施方式中所述溶解的方法还包括先前的步骤i)将谷粒分级以获得胚乳、麸和胚芽；ii)分离和分配所述胚乳、麸、和胚芽以允许它们被处理；以及iii)研磨所述麸。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中所述谷麸是由工业研磨方法获得的，并且被进一步研磨以获得低于500μm,例如低于400μm,例如低于200μm的平均粒径。
在一些实施方式中所述用于减少颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法是这样的方法,其中植物材料是来自谷麸加工的谷麸副流(sidestreams)，例如来自精炼植物油的皂料，酿酒者的酒糟(spentgrain)或含可溶物的干酒糟(DDGS)。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中植物材料是来自谷麸加工的谷麸副流(sidestream)，例如来自精炼植物油的皂料，酿酒者的酒糟(spentgrain)或含可溶物的干酒糟(DDGS)。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中进一步处理溶解的植物材料以使进一步的酶活性失活。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中基于干物质相对于干物质植物材料测定的、所获得的所述植物材料的溶解度为高于15％,例如高于25％,例如高于35％,例如高于40％,例如高于50％,例如在40％-60％的范围内,例如在50％-60％的范围内。
麸溶解方法2:
可在具有密闭盖的容器/反应器中将麦麸悬浮于50mMNaPi(pH5)(13％w/w)中。任选地,在搅拌下将所述麸悬浮液加热至100℃，并煮沸2分钟。在搅拌下(以150rpm)将样品置于50℃并使其关于温度平衡。加入酶并在50℃下使反应继续进行。在所示的时间点将样品转移至试管并离心(5min,1500rpm,室温)。将所获得的上清液冻干并称量所产生的固体。计算相对于所悬浮的麸的量,由冻干可溶物获得的干物质的量，有可能获得溶解度。可根据麸悬浮于其中的缓冲液的量相对于由离心获得的可溶物的量来进行校正,因为可假设在整个可溶相中可溶物的浓度是相同的。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中基于干物质相对于干物质谷麸测定的、所获得的可溶性级分中的脂质和经修饰的脂质(例如功能性脂质)的总含量为至少约0.05％,例如至少约1.0％,例如在0.05-5％的范围内。
在一些实施方式中，所述溶解的方法还包括干燥所获得的溶解的组合物的步骤。
在一些实施方式中，所述溶解的方法还包括喷雾干燥所获得的溶解的组合物的步骤。
在一些实施方式中，所述溶解的方法还包括冻干所获得的溶解的组合物的步骤。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中用一种或多种脂修饰酶进行的所述处理生成功能性脂质，例如乳化剂或具有改善的健康益处的脂质。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中用一种或多种脂修饰酶进行的所述处理生成其它的功能性化合物，例如功能性甾醇酯。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中用一种或多种脂修饰酶进行的所述处理使得超过5％,例如超过10％,例如超过25％,例如超过50％的磷脂酰肌醇被转化为溶血磷脂酰肌醇(溶血PI)。
在一些实施方式中所述溶解的方法包括以下步骤:
a)制备含有大量淀粉的颗粒谷麸的悬浮液；
b)用下列物质以任何顺序顺次(不去除任何组分)，或者同时处理悬浮液中的所述含有大量淀粉的颗粒谷麸:一种或多种细胞壁修饰酶；一种或多种淀粉修饰酶；和任选地一种或多种其它的酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中用包含下列的酶组合同时处理所述颗粒谷麸:一种或多种细胞壁修饰酶；和一种或多种淀粉修饰酶；以及任选地一种或多种其它的酶。
在一些实施方式中所述溶解的方法还包括收获从步骤b)获得的可溶性级分的步骤。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中基于干物质相对于干物质谷麸所测定的、从步骤b)获得的可溶性级分中***糖基木聚寡糖(AXOS)的含量为高于2％,例如高于5％,例如高于10％,例如高于12.5％。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中谷麸中超过10％的***糖基木聚糖(AX),例如谷麸中超过20％的AX,例如谷麸中超过30％的AX,例如谷麸中超过40％的AX,例如谷麸中超过50％的AX在从步骤b)获得的可溶性级分中被转化为***糖基木聚寡糖(AXOS)。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中谷麸中超过2％的淀粉,例如谷麸中超过5％的淀粉,例如谷麸中超过10％的淀粉,例如谷麸中超过15-50％的淀粉在从步骤b)获得的可溶性级分中被转化为异麦芽寡糖(IMO)。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中基于干物质相对于干物质麸所测定的、从步骤b)获得的可溶性级分中经修饰的脂质含量为至少约0.05％,例如至少约1.0％,例如在0.05-5％的范围内。
在一些实施方式中所述溶解的方法是这样的方法，其中在从步骤b)获得的可溶性级分中，修饰并获得了谷麸中超过2％的脂质,例如谷麸中超过5％的脂质,例如谷麸中超过10％的脂质,例如谷麸中超过15-50％的脂质。
在一些实施方式中，所述溶解的方法还在步骤a)之前包括步骤i)将谷粒分级以获得胚乳、麸和胚芽；ii)分离和分配所述胚乳、麸、和胚芽以允许它们被处理；和iii)研磨所述麸。
在一些实施方式中，在根据本发明的方法中所获得的溶解的谷麸作为可溶和不可溶的谷麸材料的混合物而在食品生产中被直接加入。
在一些实施方式中，所述食品选自面包,早餐谷物,意大利面食,饼干,小饼(cookies),点心,和啤酒。
实施例1
在麸的溶解过程中预防提取物变暗
麸:
使用的是获得自商业磨坊的麦麸级分。所述级分由精细麸级分和粗制麸级分组成。在使用之前，所述粗制麸级分被研磨以获得更小的粒径,这将增加麸的比表面积，最终增加麸的酶促溶解的效率。研磨是在Retch磨粉机上进行的，以获得500μm的平均粒径。然而，应注意到关于溶解度，较小的粒径可能是优选的。
所应用的酶列于表1中，并且实验是根据表2中所示的方案进行的。表3列出了不同的实例以及所使用的材料的量。
酶:
表1.用于麦麸溶解的酶
方案:
表2.用于麸溶解的方案。
在具有密闭盖的容器/反应器中将麦麸悬浮于50mM的NaPi(pH5)(13％w/w)中任选地，在搅拌下将所述麸悬浮液加热至100℃，并煮沸2分钟在搅拌下(以150rpm)将样品置于50℃并使其关于温度平衡加入酶并在50℃下使反应继续进行。
在所示的时间点将样品转移至玻璃试管并以1000rpm离心5min。拍摄照片。
所述方案包括在加入外源性酶之前，任选地预煮沸麸悬浮物以使内源性酶失活。
表3:所使用的材料。详细说明了在不同的试验中所使用的量(克)。
结果:
如表2中所列出的方案进行实验，包括或不包括任选地预煮沸麸悬浮物。图1显示了包括在加入酶之前预煮沸麸悬浮物时，24小时后5种不同样品(表1)的颜色形成。抗坏血酸,葡糖氧化酶和过氧化氢酶的加入(试验3-5)显著减少了麸提取物的变暗。
如表2中所述进行另一个实验，其中在加入酶之前没有预煮沸麸悬浮物(表3)。在此，我们也见到了颜色形成的显著减少(图2)。
实施例2
在麸溶解的过程中加入葡糖氧化酶和过氧化氢酶对pH、葡糖酸形成和挥发物形成的影响
麸:
使用的是获得自商业磨坊的麦麸级分。所述级分由精细麸级分和粗制麸级分组成。在使用之前，所述粗制麸级分被研磨以获得更小的粒径,这将增加麸的比表面积，最终增加麸的酶促溶解的效率。研磨是在Retch磨粉机上进行的，以获得500μm的平均粒径。然而，应注意到关于溶解度，较小的粒径可能是优选的。
酶:
表4.用于麦麸溶解的酶
方案:
表5.用于麸溶解的方案
在具有密闭盖的容器/反应器中将麦麸悬浮于50mM的NaPi(pH5)(13％
w/w)中
在搅拌下(以150rpm)将样品置于50℃并使其关于温度平衡
加入酶并在50℃下使反应继续进行。
24小时后取出样品
表6:所使用的材料。详细说明了在不同的试验中所使用的量(克)。
根据表5中所列的方案准备表6中所列的各试验。
结果:
如表5中所述，在50℃温育24小时后，测量了各样品的pH(表7)。在试验4和5中，观察到了pH的显著下降，这是由葡糖氧化酶催化的葡糖酸的形成引起的，产生了更低的pH。
表7.pH测量。1:空白；2:细胞壁和淀粉修饰酶；3:细胞壁和淀粉修饰酶+抗坏血酸；4:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶；5:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶和过氧化氢酶。
试验 pH
1 5.1
2 5.9
3 5.5
4 5.3
5 4.2
使用高效阴离子交换色谱法测量了温育24小时后葡糖酸的含量(表8)。
表8.葡糖酸含量；2:细胞壁和淀粉修饰酶；4:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶；5:细胞壁和淀粉修饰酶+葡糖氧化酶和过氧化氢酶。
试验 葡糖酸,％W/W
2 <0.02
4 0.8
5 0.7
为了测试挥发物成分的形成,使用顶空分析分析了来自试验1,2和5的样品(图3)。
通过比较图3中的结果可见，通过加入氧化还原酶来控制氧化对氧化产物的形成有巨大的影响。
实施例3
通过在麸溶解过程中加入葡糖氧化酶来降低氧势
在催化过程中，葡糖氧化酶利用氧而产生更低的氧势。所述更低的氧势将减少内源性化合物的氧化，并从而减少恶臭的形成。
麸:
使用的是获得自商业磨坊的麦麸级分。所述级分由精细麸级分和粗制麸级分组成。在使用之前，所述粗制麸级分被研磨以获得更小的粒径,这将增加麸的比表面积，最终增加麸的酶促溶解的效率。研磨是在Retch磨粉机上进行的，以获得500μm的平均粒径。然而，应注意到关于溶解度，较小的粒径可能是优选的。
表9和11列出了根据表10中给出的方案应用的酶和量。随时间测量相对于试验1的氧势。
酶:
表9.用于麦麸溶解的酶
方案:
表10.用于麸溶解的方案。
在具有密闭盖的容器/反应器中将麦麸悬浮于50mM的NaPi(pH5)(13％w/w)中
在搅拌下(以150rpm)将样品置于50℃并使其关于温度平衡
加入酶并在50℃下使反应继续进行。
表11:所使用的材料.详细说明了在不同的试验中所使用的量(克)。
结果:
使用氧传感器(MettlerToledo)随时间测量氧势，其中将试验1设置为100％。如在图4中可见，含有葡糖氧化酶的样品中的氧势随时间显著下降，使内源性麸化合物的氧化最小化。
对于试验2和3观察到了pH随时间下降，显示葡糖酸的形成，这引起了更低的pH(表12)。
表12.pH随时间的形成。在试验2和3中观察到了pH的下降，这是由葡糖酸的形成引起的。

Claims (21)

1.用于减少包含至少部分溶解的谷麸的组合物中颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成的方法，所述方法包括通过下列来控制氧化过程的步骤:
i)用氧化还原酶处理所述组合物；和
ii)用抗氧化剂处理所述组合物，其中所述抗氧化剂选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶；
其中所述控制氧化过程的步骤是在所述谷麸溶解前或在所述谷麸溶解的过程中进行的。
2.根据权利要求1的方法，其中所述谷麸选自小麦，大麦，燕麦，黑麦，黑小麦、稻和玉米。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法,其中氧势被降低。
4.根据权利要求1-2中任一项的方法,其中所述方法是以工业规模进行的,其中用超过10升的组合物。
5.根据权利要求4的方法，其中用超过20升的组合物。
6.根据权利要求4的方法，其中用超过50升的组合物。
7.根据权利要求4的方法，其中用超过100升的组合物。
8.根据权利要求4的方法，其中用超过200升的组合物。
9.根据权利要求4的方法，其中用超过400升的组合物。
10.根据权利要求4的方法，其中用超过600升的组合物。
11.根据权利要求4的方法，其中用超过1000升的组合物。
12.根据权利要求1-2中任一项的方法,其中所述方法包括热灭活内源酶活性的步骤。
13.根据权利要求12的方法，其中所述热灭活内源酶活性的步骤是通过煮沸或巴氏消毒所述组合物。
14.根据权利要求1－2中任一项的方法，其中氧化还原酶选自：选自组E.C.1.1.3.x的氧化酶和/或对于麦芽糖比对于葡萄糖具有更高活性的碳水化合物氧化酶。
15.根据权利要求14的方法，其中选自组E.C.1.1.3.x的氧化酶是选自下列的氧化酶：葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)，吡喃糖氧化酶，己糖氧化酶(EC1.1.3.5)，甘油氧化酶，吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10)，半乳糖氧化酶(EC1.1.3.9)。
16.根据权利要求1-2中任一项的方法,其中所述方法还包括用一种或多种细胞壁修饰酶处理所述组合物的步骤。
17.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述方法还包括用一种或多种淀粉修饰酶处理所述组合物的步骤。
18.包含至少部分溶解的谷麸的组合物，其通过权利要求1-15任一项的方法减少了颜色和/或不悦味道和/或恶臭形成。
19.根据权利要求18的组合物用于生产食品或生物乙醇的用途。
20.由根据权利要求19的用途所获得的食品或生物乙醇。
21.由根据权利要求19的用途获得的动物饲料。
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