DE2839668A1

DE2839668A1 - Als antibiotika wirksame saframycine a, b, c, d und e und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2839668A1
Application number: DE19782839668
Authority: DE
Inventors: Tadashi Arai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-09-12
Filing date: 1978-09-12
Publication date: 1979-03-22
Also published as: GB2003853A; JPS5937952B2; DE2839668C2; IT1108793B; FR2402665B1; JPS5444098A; IT7869099A0; FR2402665A1; US4248863A; GB2003853B

Description

Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Substanzen, Saframycine A, B, C, D und E, sowie ein Verfahren zu ihrer Her- ^ Stellung.

Bisher viurde über die Isolierung von etwa 3000 verschiedenen Arten antibiotisch wirksamer Substanzen berichtet und es ist auf diesem Fachgebiet schwierig geworden, eine neue antibiotisch wirksame Substanz aufzufinden. Wegen des Auftretens von Mikroorganismen, die resistent gegen gebräuchliche Antibiotika sind, sowie durch das Auftreten von neuen Infektionskrankheiten, das durch die verbreitete Anwendung von Antibiotika mit breitem antibakteriellem Spektrum, von Steroidhormonen, Antitumormitteln oder Immunsuppressoren verursacht wird, besteht jedoch ein steigendes Bedürfnis nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen.

Die Anmelderin hat bereits gefunden, daß Streptomyces lavendulae befähigt ist, einige antibiotisch wirksame Substanzen, Mimosamycin und Chlcrocarcine A, B und C zu bilden (japanische Patentanmeldung Nr. 113289/1975, offengelegt unter der Nummer 38 094/1977; DT-OS 26 41 908).

Der Erfindung liegen nun weitere Untersuchungen über Produkte zugrunde, die durch Züchtung von Actinomyceten erhalten werden konnten, wobei gefunden wurde, daß Actinomyceten, die zur Bildung von bekannten antibiotisch wirksamen Substanzen befähigt sind, darüber hinaus neue und wertvolle antibiotisch v/irksame Substanzen, die Saframycine A,.Σ>C,Dund E bilden, und daß speziell Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 diese antibiotisch wirk-

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samen Substanzen mit hohem Aktivitätsgrad bildet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue antibiotisch wirksame Substanzen zur Verfügung zu stellen, die wertvolle biologische Aktivität zeigen.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieser Antibiotika zu schaffen. Diese und andere Aufgaben, Gegenstände und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich. *

Gegenstand der Erfindung ist eine neue Gruppe antibiotisch wirksamer Substanzen, die als Saframycine A, B, C, D und E bezeichnet werden und die antibakterielle Aktivität hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und Antitumoraktivität besitzen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieser antibiotisch wirksamen Substanzen, der Saframycine A, B, C, D und E, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 züchtet, den Komplex der Saframycine A, B, C, D und E aus der Kulturbrühe gewinnt und danach die Saframycine A, B, C, D und E aus diesem Komplex isoliert.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314, wurde aus einer bei Kyoto gewonnenen Bodenprobe isoliert und gehört dem Genus Streptomyces an. Dieser Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer 3218 bei dem Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan und unter der Hinterlegungsnummer NRRL-11002 bei dein Northern Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, United'States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, USA, hinterlegt worden.

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Die Beobachtung der Luftmycels und der Sporen von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 erfolgte durch Züchtung des Stammes auf den Medien gemäß den Methoden des International Streptomyces Project (ISP) (Shirling. E.B. & D. Gottlieb; International J. Systematic Bacteriol. 16, 313 - 340, 1966); nämlich durch Züchtung auf Agarplatten mit einem Hefe-Stärke-Agar-Medium, anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar-Medium und Maltose enthaltendem Basaljnedium für die Bestimmung des Kohlenstoffquellen-Ausnutzungsschemas (Agarmedium nach Pridham-Gottlieb) bei 27⁰C r— während 1 bis 2 Wochen. Außerdem wurde die Farbe des Mycels mit reifen Sporen, des vegetativen Mycels und anderer entsprechend der Farbplättchennummer bestimmt, die in "Descriptive Color Name Dictionary", Container's Corporation of America, 1950 und "Color Harmony Manual", Container's Corporation of America, 1958, angegeben ist.

Der Stamm Nr. 314 entwickelt ein wellenförmig gefaltetes Luftmycel mit langer Verästelung in einem Durchmesser von etwa 0,6 bis 1,0 u mit zahlreichen zylindrischen Sporen. Die Sporen hülsen eine Größe von 0,6 bis 1,0 ti χ 0,8 bis 2,0 p.. Hach dem Standard gemäß ISP wird ein Stamm mit den vorstehend angegebenen morphologischen Eigenschaften in die Abteilung Rectiflexibiles eingeordnet. Die Lufthyphen haben jedoch Schleifen oder unvollständige oder langgestreckte Spiralen, die in Form von Spulen mit 1 bis 2 Windungen aufgewickelt sind. Der Stamm ITr. 314 wurde daher morphologisch in die Abteilung Retinaculiaperti eingeordnet. Wenn die Sporenoberfläche a,uf diesen Medien unter dein Elektronenmikroskop beoachtet wird, so zeigt sich, daß die Sporen des Stammes eine glatte Oberfläche haben. Die Haupteigenschaften des Stammes Hr. 314 bestehen darin, daß die Lufthyphen morphologisch der Abteilung Retinaculiaperti entsprechen, die Farbe der Lufthyphen mit reifen Sporen rosa bis lavendelfarben auf verschiedenen Medien ist, die Farbe des vegetativen Mycels auf einem synthetischen Medium manchmal blau bis bläulich-braun ist und daß die Bildung

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von Melaninpigment positiv ist. Bei einem Vergleich mit den Stämmen des Genus Streptomyces, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Vol. 2, 1959 und "Bergey's Determinative Bacteriology", 8. Auflage, 1974, beschrieben sind, wurde angenommen, daß der Stamm weitgehende Ähnlichkeit mit Streptomyces lavendulaa hat. Der Stamm Nr. 314 wird in ein übliches

Medium zur Bildung einer antibiotisch wirksamen Substanz eingeimpft und die Sehüttelkultur wird bei 27⁰C während einer Ziichtungsdauer von 18 bis 72 Stunden durchgeführt. Dabei wird ein Kulturfiltrat erhalten, welches hohe Aktivität gegen coliforae Bazillen hat. Das so erhaltene Piltrat wird unter alkalischen Bedingungen mit Aktivkohle behandelt, mit angesäuertem Aceton eluiert oder an einem schwachen Kationenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite IRC-50 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co,, USA) adsorbiert und mit 0,1 η Chlorwasserstoffsäure deaorbiert, wobei eine gegen coliforme Bazillen wirksame antibalcterielle Substanz erhalten wird. Die so erhaltene Substanz wird dann durch Chromatographie, beispielsweise an Amberlite CG-50 (Warenzeichen der Rohm & Haas Co.) gereinigt und in Form ihres Reinecke-Salzes oder Picrats kristallisiert, wonach diese Substanz als Streptothrleln identifiziert werden kann.

Außerdem wurde ein Vergleich der Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften unter Verwendung von Streptorayces lavendulae IFH 1031, eines Streptothricin-bildenden Staiames, Streptomyces racemochromogenes IPM 1081, der als identisch mit Streptomyces lavendulae angesehen wird und zur Bildung von Streptothricin befähigt ist, und des erfindungsgemäß verwendeten Stammes zur endgültigen Identifizierung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in !Tabellen 1, 2 und 3 zusammengefaßt. Dabei zeigte sich, daß der Stamm Hr. 314 in jeder charakteristischen Eigenschaft, die zur Zeit zur Identifizierung eines Stammes des Genus Streptomyces herangezogen v/ird, mit Streptoayces lavendulae identisch ist, wenn auch geringe Unterschiede in mancher

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Hinsicht beobachtet v/erden, beispielsweise im Hinblick auf die Ausnutzung von L-Arabinose und dergleichen. Der Stamm wurde daher als Streptoiayces lavendulae identifiziert. Auch Streptomyces ra.ce-Hochrorsogenes ka.nn Streptotliricin bilden, dieser Stamm ist jedoch aufgrund des vorher beschriebenen Yergleicasergebnisses offensichtlich verschieden von dem Stanua ITr. 314, der ein Streptoayces lavendulae-Stamm ist.

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Tabelle 1

	Medium	Stamm Nr. 314	j Streptomyces	Streptomyces race-
			] lavendulae	mochromogene s
			j IFM 1031	IFM 1081
	Saccharose-Nitrat-	LM reichlich, weiß bis	! LM reichlich, elfen-	LM reichlich, elfen
	Agar	elfenbein (2 db)	I bein (2 db) bis	bein (Z db) bis
CO			grau (3 dc)	grau (5 dc)
OO	(Medium nach	VM ausgebreitetes Wachs	VM ausgebreitetes Wachs	VM schwach braun bis
IO	Czapek)	tum, farblos bis schwach	tum, farblos bis :	purpur-braun (11
		oliv (11/2 ie)	schwach braun	nl)
O O		LP keines oder schwach	LP schwach braun	LP schwach braun
		braun
	Glucose-Asparagin-	LM reichlich, rosa bis	LM reichlich, rosa bis	LM reichlich, rosa
	Agar)	lavendel (5 ge)	lavendel (5 ge)	bis lavendel (5 ge/
	(Krainsky)	VM ausgebreitetes Wachs	VM ausgebreitetes Wachs	VM ausgebreitetes
		tum, farblos bis schwach	tum, gräulich blau	Wachstum, braun
		oliv (1 1/2 ie)	(10 pn)	bis blau (10 pn)
		LP keines oder schwach	LP keines oder schwach	LP keines oder schwach
		braun	braun	braun

an cn co

Glycerin-Asparagin Agar

(ISP)

LM mäßig, schwach "bräunlich-grau bis silbergrau (3 fe)

VM ausgebreitetes Wachs tum, farblos, manchmal blaue Kolonien

LP keines LM kleine Menge, silbergrau ( 3 fe)

VM oliv bis bläulich
grau (1 1/2 pn)

LP schwach braun

LM mäßig, silber grau (3 fe).

VM dunkel oliv
(1 1/2 pn)

LP schwach olivbraun

Calcium-maleat Agar

LM mäßig, pulverig, rosa (3 ba)

VM ausgebreitetes Wachs tum, dunkel oliv (1 1/2 nl)

LP keines oder schwach bläulich-braun LM keines

VM ausgebreitetes Wachs
tum, bläulich-braun
(3 pn)

LP schwach braun

LM keines

VM ausgebreitetes i Wachstum, bläu- ]. lich-braun (3 pn) I

LP schwach olivbraun

anorganische Salze enthaltender Stärke-Agar

(ISP)

LM reichlich, gelblich grau (3 de)

VM farblos LP keines LM reichlich, grau
(3 de)

VM farblos bis dunkel

oliv (2 po)
LP keines

LM reichlich, grau I co (3 de),bläulich- j cd grau (2 po) j O)

VM dunkel oliv (2 po)J JjJJ LP schwach olivbraun I

CO OO __x

Nähragar	LM	keines	LM	keines	LM	keines
	VM	ausgebreitetes Wachs tum, glänzende Ober fläche, kamelfarben (3 ie)'	VM	ausgebreitetes Wachs tum, glänzende Ober fläche , kamelfarben (3 ie)	VM	ausgebreitetes Wachs tum, glänzende Ober- j fläche (3 ie)
	LP	schwach braun ■	LP	schwach, braun	LP	schwach braun i
Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar	LM	reichlich, Spitzen rosa bis weiß (5 ge) .	LM	reichlich, rosa (5 ge)	LM	reichlich, rosa (5 ge) ■
(ISP)	VM	gefaltet, farblos bis schwach braun (5 ge)	VM	ausgebreitetes Wachs tum, farblos bis schwach braun	VM	gefaltet, schwach j braun f
	LP	dunkelbraun (4 pi)	LP	dunkelbraun (4 pi)	LP	dunkelbraun (4 pi)
Hafermehl-Agar	LM	mäßig, weiß bis rosa (4 ca)	■ LM	mäßig, rosa bis lavendel (5 ec)	LM	mäßig, rosa (3 ca) ;
(ISP)	VM LP	farblos keines	VM LP	blau (15 ni) keines oder bläu lich-braun	VM LP	bläulich-braun (15 ni) \ keines oder schwach f braun \

OO CO CJ3 CB OH» CO

CO OO

K)

O O

Ei-Medium	LM	keines	LM	gering, weiß	LM	wenig bis keines
	VM	stark gefaltet, schokoladenfarben (4 pi)	VM	stark gefaltet, schokoladenfarben (4 pl)	VM	stark gefaltet, schoko ladenfarben (4 pl)
	LP	schokoladenbraun	LP	schokoladenbraun	LP	schokoladenbraun j
Tyrosin enthal tendes synthe tisches Medium	i LM VM	reichlich, rosa (7 ge) ausgebreitetes Wachs tum, senfbraun (2 ni)	LM VM	reichlich, rosa (7 ge) ausgebreitetes Wachs tum, senfbraun (2 ni)	LM VM	reichlich, rosa (7 ge) ausgebreitetes Wachs tum, senfbraun (2 ni)
	LP	keines oder schwach braun	LP	keines oder schwach braun	LP	keines oder schwach braun

03 I

LM : Luftmycel VM : vegetatives Mycel LP : wasserlösliches Pigment (Farbe des Mediums)

OO Cl) CO

CO

Tabelle 2

Vergleich^der^h^siologischen^igenschafte^von

Physiologische Eigen schaft	Stamm Nr. 314	Streptomyces lavendulae IFM 1031	Streptomyces chromogenes IFM 1081	++ ++ 7,8
Nitratreduktion (14 Tage)	+	+	+	+
Verflüssigung von Gelatine (18OC, 21 Tage) Lösliches Pigment	+ braun	+ braun	+ braun I !
Hydrolyse von Cellu lose ( 21 Tage)	-	-	t
Lackniusmilch Koagulation Peptonisierung pH	++ ++ 8,0	++ ++ 7,8
Melaninbildung	+	+

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Tabelle 3

Vergleich_des_Kohlenstoffquellen-Ausnutzungsschemas

ter Stämme

Kohlenstoffquelle} Stamm Nr. 314] Streptomyces Streptomyces t

py lavendulae

IFM 1031

racemochromo- \ genes

IFM 1081

ί D-Xylose* §	+	I ±	+	j	-	I I I	+	[
I \ L-Arabinose* \| +	±	- ■	-		-	t
L-Rhamnose*	+	-	+	i
D-Glucose*	-		-
D-Fructose*	+		+
Saccharose*	-	ι +
Lactose	-
Maltose	-
Raffinose*	+
Mannit*	+
i-Inosit*	+
Natriumacetat	-
Natriumc itrat
Natriumsuccinat
Kontrollversuch
		-
⁺
-
-
-
⁺
⁺

—

* In ISP beschriebene Kohlenstoffquelle

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Der Saframycin-Komplex, der erfindungsgemäß hergestellt werden kann, ist bisher noch nicht aus einer Kulturbrühe der vorstehend beschriebenen, gut bekannten Mikroorganismen von Streptomyces lavendulae isoliert worden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Saframycin-Komplex durch Züchtung von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 gebildet werden.

Die Züchtung kann prinzipiell nach üblichen Kulturverfahxen für einen Mikroorganismus durchgeführt werdendes ist jedoch gev/Öim— lieh günstig, eine Submerskultur in einem flüssigen Medium durchzuführen. Als Medium, welches sich für die Zwecke der Erfindung eignet, kann jedes beliebige Medium eingesetzt v/erden, welches die !Fährstoffe enthält, die der Stamm ITr. 314 des Genus Streptoiayces ausnutzen kann. Genauer gesagt, lassen sich synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien einsetzen und als Beispiele für die Bestandteile des Mediums sind folgende Substanzen au- erwähnen : Eine Kohlenstoff quelle, wie Glucose, Maltose, 3?ruc~ tose, Xylose, Stärke, Glycerin und dergl.; eine Stickstoffquelle, wie Fleischextrakt, Pepton, Glutenmshl, Bauiawollsamenöl, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeii;, Trockenhefe, Hefeextrakt,-Ammoniuinsulfat, Ammonitunchlorid, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen.Carbonate,Phosphate oder andere Salze von Metallen können zusätzlich dem Medium einverleibt-.werden. Falls während der Züchtung übermäßiges Schäumen beobachtet wird, ist es vorteilhaft, dem Medium ein Antischaummittel zuzusetzen, wie ein Pflanzenöl, beispielsweise Sojabohnenöl, oder ein Siliconöl, Polyoxyalkylene oder deren Derivate, Mineralöle und dergl.

Die Züchtungstemperatur liegt gewöhnlich innerhalb eines Bereiches von 27 bis 30⁰C. Da das Volumen des Mediums sich erhöht, ist es vorteilhaft, eine Impflcultür anzulegen und danach die Impfkultür in ein Medium einzuimpfen. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich etwa 18 Stunden bis etwa 24 Stunden.

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Die vorstehend angegebenen Kulturbedingungen können in Abhängigkeit von dem zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika verwendeten Mikroorganismen im Hinblick auf optimale Ergebnisse ausgewählt und angewendet v/erden.

Die bei diesem Verfahren in der Kulturbrühe angare ich arten anti— biotisch wirksamen Substanzen befinden sich gev/öhnlich innerhalb des Mycels und in der Kulturflüssigkeit und werden aus dem durch Zentrifugieren oder- Filtration gewonnenen Mycel und dem so erhaltenen FiItrat extrahiert. Dabei können im einzelnen die erfindungsgeinäßen antibiotisch wirksamen Substanzen mit Hilfe üblicher Verfahrensweisen isoliert, gewonnen und gereinigt werden, die gewöhnlich zur Herstellung eines Naturprodukts angewendet werden, beispielsweise durch Ausnutzung der Löslichkeit und der Löslichkeitsunterschiede in geeigneten Lösungsmitteln, der Abtrennbarkeit und des Unterschiedes der Abtrennungsrate aus einer Lösung, der Differenz in der Adsorption an und der Affinität gegenüber verschiedenen Adsorptionsmitteln, der Differenz in der Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen und dergl. Diese Verfahren können gewünschtenfalls jeweils einzeln oder v/ahlweise in Kombination mehrerer Verfahren oder auch wiederholt angewendet v/erden. Ein beispielhaftes Verfahren wird nachstehend erläutert.

Each Beendigung der Züchtung wird die Eulturbrühe filtriert, um die IOy cell en von dem Filtrat abzutrennen. Das Filtrat wird mit 10 η Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Vfert von 8,0 eingestellt. Das Filtrat kann vorher auf die Hälfte bis ein Drittel seines Volumens konzentriert werden, um eine bessere Extrakt! onswir !es as— keit bei der Extraktion mit einem Lösungsmittel zu erreichen. Bei der vorstehend erwähnten Lösungsmittelextraktion verbleiben basische wasserlösliche Antibiotika, beispielsweise Streptothricin, welches gleichzeitig durch den Stamm Nr. 314 gebildet wird, in dem Filtrat, während der Saframycin-Komplex und dergleichen in die Lösungsmittelphase extrahiert wird. Die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, das Konzentrat wird in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst,

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die Lösung wird mit wässrigem Natriumcarbonat geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt, wobei die sauren Substanzen in die wässrige Phase übergehen. Die Lösungsmittelphase wird mit 1 η Chlorwasserstoffsäure extrahiert, mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 9 bis 10 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Diese Stufe wird mehrere Male wiederholt und die Lösungsmittelphase wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei eine rohe basische Komponente erhalten wird, welche den Saframycin-Komplex enthält. Diese Komponente wird der Säulenchromatographie an Silicagel mit Hilfe eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat unterworfen, wobei eine überwiegend Saframycin A enthaltende Fraktion erhalten wird. Die so erhaltenen Fraktionen werden der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 (Produkt der Pharmacia Co., Ltd., Schweden) mit Methanol als Elutionsmittel unterworfen, wobei Saframycin A in Form eines gelben Sirups erhalten wird, welches dann mit kaltem Äther behandelt wird und dabei in Form eines gelben Pulvers gewonnen wird.

Die zuerst eluierte Chromatographiekolonne wird weiter mit einem Gemisch aus Äthylacetat und Methanol eluiert, wobei eine Fraktion erhalten wird, die hauptsächlich die Saframycine B, C, D und E enthält. Die so erhaltenen Fraktionen werden zur Trockene eingedampft, wobei ein Gemisch der Saframycine B, C, D und E erhalten wird. Dieses wird dann durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt und schließlich der nachfolgenden Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, wobei die Saframycine B, C, D und E in Form eines gelben Pulvers erhalten werden. Aus der Lösung in Äther werden die Saframycine B, C und D in Form von orange-gelben Prismen, orange-roten Nadeln bzw. gelben Nadeln erhalten. Saframycin E wird durch Elution mit Aceton in Form eines gelben Pulvers erhalten.

Die Saframycine A, B, C, D und E sind basische antibiotisch wirksame Substanzen und sind somit zur Bildung von entsprechenden

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Säureadditionssalzen "befähigt, die ebenfalls von der Erfindung umfaßt werden. Zu typischen Beispielen für solche Säureadditionssalze gehören Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure und ähnlichen Säuren. Wie zu erwarten ist, "besitzen derartige Salze die gleiche antibiotische Wirksamkeit wie die freien antibiotisch wirksamen Substanzen, wenn auch gewöhnlich Unterschiede im Hinblick auf die Aktivität und die Löslichkeitseigenschaften bestehen.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Saframycine A, B, C, D und E werden nachstehend zusammengefaßt.

1,) Farbe und Aussehen : Gelbes Pulver in Form der Base Safra mycin A

2.) Schmelzpunkt : 122 - 126°C 3.) Elementaranalyse :

C : 61,47 %, H : 5,41 % N : 9,33 %

4.) Molekulargewicht (Massenspektrum) : 562 5.) Empirische Formel :

C₂₉H₃₀N₄O₈ . 2/5 H₂O

6.) Spezifische Drehung :

[a]^° = +18,2° (C = 1,0, Methanol)

7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 1 gezeigt)

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Methanol

λ nm (log c) _: 267 (4,34)

max

Methanol

λ nm (log E) ; 230 (3,88)

^K min

8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 2 gezeigt) : το >r^CHC13 cm"¹ : 3400, 1716, 1685, 1660, 1615 ^IR y max

9.) NMR-Spektrum (CDCl₃)(In Fig. 3 gezeigt) :

Sx 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,24 (3H, s), 2,30 (3H, s), 4,04 (6H, s), 6,65 (3H, bs).

10.)Löslichkeit :

leicht löslich in Estern, Chloroform, Aceton, Alkoholen; mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser und n-Hexan

11. )Fart»reaktion :

positive Dragendorff-Reaktion; negative Mnhydrin-, Perchlor-Eisen- und Anthron-Reaktion.

B. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin B-Base

1.) Farbe und Aussehen : Orangegelbe Prismen 2.) Schmelzpunkt : 108 - 109°C

3.) Elementaranalyse : C : 62,36 %, H : 5,71 %, N : 7,66 %

4.) Molekulargewicht (Massenspektrum) :

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5.) Empirische Formel : ^C28^H31^N3°8

6.) Spezifische Drehung :

[cc]ß = -54,4 (C = 1,0, Methanol)

7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 4 gezeigt)

Methanol ^UV'^lmax ^{m (log ?) : 269} ^⁴'³⁵)' ^3β8 (3,13)

Methanol

^{(log ε) : 232} i³»⁸⁶)' ³³° C3,10)

8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 5 gezeigt) : CHCl,

IRv> ^D cm"' : 3430, 1720, 1690, 1660, 1620 max

9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 6 gezeigt) :

61 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,23 (3H, s), 2,28 (3H, s), 4,00 (6h, s), 6,28 (1H, bs).

10.)Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern,

Aceton, Benzol mäßig löslich in Äthyläther, unlöslich in Wasser, n-Hexan

11.)Farbreaktion : positive Dragendorff- und Meyer-Reaktion; negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion.

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C. Physikalisch-chemische Eigenschaften von Saframycin C-Base

1.) Farbe und Aussehen : Orangerote Nadeln 2.) Schmelzpunkt : 143 - 146°C 3.) Elementaranalyse :

C : 61,61 %, H : 5,96 %, N : 7,39 %

4.) Molekulargewicht (Massenspektrum) :

5.) Empirische Formel : C₂₉H₃₃N₃O₉

6.) Spezifische Drehung :

£a]2° = -20,8° (C = 1,0, Methanol)

7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 7 gezeigt)

Methanol

, 368 (3,19)

Methanol

>_v nm (log £) : 230 (3,86), 330 (3,16) min

8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 8 gezeigt):

CHCl, _Λ

° cm"' : 3400, 1720/ 1685, 1655, 1615

9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 9 gezeigt) :

6 : 1,86 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,38 (3H, s), 2,44 (3H, s), 3,46 (3H, s), 3,96 (3H, s), 6,60 (1H, bs)

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10.) Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern,

Aceton, Benzol,

mäßig löslich in Äthyläther,

unlöslich in Wasser, n-Hexan

11.) Farbreaktion :

Positive Dragendorff- und Meyer-Reaktion, ~~

negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion

D^_PhYsikalisch-chemische_Eigenschaften_von_SaframYCin__D

1.) Farbe und Aussehen : Gelbe Nadeln 2.) Schmelzpunkt : 150 - 154⁰C 3.) Elementaranalyse :

C : 60,48 %, H : 5,68 %, N :7,59 %

4.) Molekulargewicht (Massenspektrum) :

5.) Empirische Formel : C₂₈H₃₁N₃O₉

6.) Spezifische Drehung :

fa] ²⁰= +141° ( C = 1,0, Methanol)

7.) Ultraviölett-Absorptionsspektrum (in Fig. 10 gezeigt) :

369 (3,75)

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Methanol

^λπι1η ^{m (log} ^&) ^{: 231} ^⁴

319 (3,30)

8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 11 gezeigt) :

IR ^ S^-V cm"¹ : 3560, 3400, 1720, 1685, 1660, I63O

9.) NMR-Spektrum (CDCl₃) (in Fig. 12 gezeigt) :

S : 1,91 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,28 (3H, s), 2,45 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,06 (3H, s)

10.) Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Pyridin, mäßig löslich in Estern, Aceton, Äthyläther, unlöslich in Wasser, n-Hexan

11.) Farbreaktion : Positive Dragendorff-Reaktion

_νοη_33ΪΓ§2γο1η Ε

1.) Farbe und Aussehen : Gelbes Pulver 2.) Schmelzpunkt : 146 - 148°'

3.) Elementaranalyse : C : 58,52 %, H : 5,89 %, N : 7,36 %

4.) Molekulargewicht (umgerechnet aus dem aus dem Massenspektrum

erhaltenen Wert des entsprechenden Triacetylderivats) : 555

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5.) Empirische Formel :

H₂O

6.) Spezifische Drehung :

[α] ²⁰ = -37,3° (C = 0,53, Methanol)

7.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Fig. 13 gezeigt) mS¹¹™⁰¹ ^ (¹⁰S-) ^{: 272} (⁴»¹°)» 368 (2,93)

nm (log £) : 241 (3,84), 340 (2,96) 8.) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Fig. 14 gezeigt) :

cm"¹ : 3380, 1720, 1685, 1655, 1620

9.) NMR-Spektrum (d-5-Pyridin) (in Fig. 15 gezeigt) :

6: 1,83 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,48 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,95 (3H, s), 5,22 (1H, s)

10.) Löslichkeit ι

leicht löslich in niederen Alkoholen, Pyridin, mäßig löslich in Aceton, Estern, Chloroform, unlöslich in Wasser, n-Hexan

11.) Farbreaktion :

Positive Dragendorff-Reaktion

Die biologischen Aktivitäten der Saframycine A, B, C, D und E bestehen in einer antibakteriellen und Antitumor-Aktivität; diese Verbindungen können daher als Arzneimittel verwendet werden. Die

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antibakteriellen Spektren der Saframycine A, B, C, D und E sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Antibiotika zeigen antibakterielle Aktivität hauptsächlich gegen ■grampositive Bakterien, jeoch in geringem Maß gegen die meisten gramnegativen Bakterien. Bei kultivierten Zellen der L 1210-Leukämie der Maus kann Saframycin A das Zellwachstum in einer Konzentration von 0,02 pg/ml, Saframycin B in einer Konzentration von 5 pg/ml und die Saframycine C, D und E bei 20 ug/ml vollständig inhibieren.

In der nachstehenden Tabelle 4 sind die inhibierenden Mindestkonzentrationen der Saframycine gezeigt.

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Tabelle 4

Antimikrobielles Spektrum der Saframycine A. B, C, D und E

Testorganismus	•A	MIC	(mcg/ml)	D	E
Staphylococcus		B	C
aureus 209P	0,1			25,0	100,0
Staphylococcus		12,5	25,0
aureus Smith.	0,05			50,0	50,0
Staphylococcus albus	0,1	1,56	6,25	50,0	100,0
Stap_hy_loc occus citreus	0,1	12,5	25,0	50,0	100,0
Streptococcus		12,5	25,0
faecalis	6,25			—	>100, 0
Streptococcus		>100,0	>1OO,O
pyogenes Streptococcus	0,78				>100,0
pyogenes O9OB Staphylococcus	6,25	12,5	25,0		25,0
salivarius	6,25	25,0	12,5		100,0
Kicrococcus luteus	0,05	100,0	>1OO,O	50,0	12,5
Bacillus subtilis	0,1	1,56	6,25	50,0	100,0
Bacillus cereus	12,5	25,0	25,0	100,0	25,0
Corynebacterium		100,0	100,0
dephtheriae Corynebacterium xerosis	<0,003 < 0,003			0,195 6,25	100,0 25,0
Mycobacterium	12,5 25,0	12,5	3,125 25,0	50,0 50,0	100,0 25,-0
sp. buy liycobacterium pille i	12,5	100,0 50,0	>100, 0 > 100,0	50,0	100,0
liycobacterium avium	100,0	>100,0

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	A	MIC	(mcg/inl)	D	E
Testorganismus	6,25	B	C	50,0	25,0
Wocardia asteroides'	50,0	50,0	50,0	>100,0	>100,0
Escherichia coli		>1OO,O	>1OO,O
Salmonella	100,0			>1OO,O	>100,0
typhimiirium Shigella dysenteriae	25,0	>1OO,O	>100,0	>100,0	>100,0
Shiga Klebsiella	6,25 6,25	>100, 0	>100,0	100,0 25,0	50,0 25,0
pneumomae Brucella abortus		12,5 50,0	50,0 50,0
Serratia	> 100,0			>100,0	>100,0
marcescens		>1OO,O	>100,0
Pseudomonas	>100,0 > 100,0			>100,0 >100,0	>1OO,O >100,0
aerugmosa Mucor mucedo	>100,0	>100,0 >100,0	>1OO,O >1OO,O	>100,0	>100, 0
Saccharomyces cerevxsiae		>1OO,O	>1OO,O
Rhodotorula	>100,0 > 100,0 >100,0			>100,0 >100,0 >100,0	>100,0 >100,0 >100, 0
glutinis Aspergillus niger Aspergillus oryzae. Penicillium	50,0	>100,0 >100,0 >1OO,O	>1OO,O >100,0 >100,0	>100,0	>100,0
glaucum	> 100 ,0 >100,0	>100,0	>1OO,O	>100,0 >100,0	>100,0 >100,0
Tri chophyt on mentagrophytes Candida albicans	>100,0 >100,0	>100,0 >100,0

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Verwendetes Medium und Kulturbedingungen :

1 % Glucose enthaltender Nähragar (3 % Glycerin enthaltender Nähragar für säurefeste Bakterien, Blutagar für Streptococcus pyogenes und Bruceila abortus); 37°C, 24 oder 48 Stunden.

Sabouraud-Dextrose-Agar für Fungi, 27°C, 48 Stunden (72 Stunden für Trichophyton mentagrophytes).

Die Saframycine A, B, C, D und E sind Substanzen mit relativ geringer Toxizität, die von Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 18 bis 20 g bei intravenöser Injektion von Saframycin A toleriert werden und bei der genannten Verabreichung einen Wert LDcn =12 mg/kg, bei intraperitonealer Injektion einen Wert LDg₀ = 40 mg/kg und bei intraperitonealer Injektion von Saframycin B, C, D oder E einen Wert LDeq ^VO3Q ^50 mg/kg zeigen.

Da Saframycin A die Substanz mit der stärksten biologischen Aktivität darstellt, mirde ihre Antitumor-Wirksamkeit weiter untersucht, wie nachstehend erläutert wird. Mäusen des Stammes DDY wurden 1 χ 10 Zellen von Ehrlich-Ascites-Tumor implantiert und die so behandelten Mäuse wurden 4 Tage lang, beginnend 24 Stunden nach der Tumor-Implantation, durch tägliche intraperitoneale Behandlung mit Saframycin A in einer Dosis von 0,5 mg/kg behandelt. Dabei wurden 30 % der Mäuse geheilt und überlebten länger als 30 Tage. Bei einer Dosis von 1,0 mg/kg wurden 60 % der Mäuse geheilt.

Die Wirkung von Saframycin A durch intraperitoneale Behandlung der lymphozytischen Leukämie L 1210 der Maus und der lymphoiden Leukämie P 388 der Maus wurden an BDF₁ -Mäusen untersucht. Wenn die Behandlung mit Saframycin A 3 Stunden nach der intraperi-

5
tonealen Implantation von 1x10 Zellen des L 1210-Tumors begonnen wurde, führte Saframycin A in einer Tagesdosis von 1,5 mg/kg während zwei Tagen zu einem Wert T/C (Überlebens-Zeit der behan-

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delten Gruppe zur Überlebenszeit der Kontrollprobe) von 183 %. Bei P 388-Tumor wurde ein Implantat von 1x10 Zellen angewendet und die Behandlung wurde nach 24 Stunden begonnen. Saframycin A in einer Tagesdosis von 0,75 mg/kg während 10 Tagen führte zu einem Wert T/C von 219 %·

Danach wurde die Wirkung von Saframycin A gegen menschliche Tumoren geprüft, wofür zwei Linien des Cervixkarzinoms des Uterus, Meianom, Oat-Cell-Karzinom und Magenkarzinom verwendet wurden, die durch Heterotransplantation auf Nacktmäuse übertragen wurden. Es wurde gefunden, daß Saframycin A selektive Aktivität gegenüber Cervixkarzinom und Magenkarzinom besitzt und eine Inhibierung des Tumorwachstums und wesentliche histologische Veränderungen des Tumorgewebes verursacht.

PRÜFUNG

Die antibakterielle Aktivität während der Züchtungs- und Extraktionsverfahren wird mit Hilfe der Agarplatten-Scheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 geprüft. Die Prüfung von Streptothricin erfolgt unter Verwendung von Escherichia coli Stamm F., da der Stamm Nr. 314 dieses Antibiotikum in großer Menge bilden kann. Das gemeinsame Vorliegen von Streptothricin läßt sich leicht durch Bestimmung der antibakteriellen Aktivität gegenüber E. coli nachweisen, da der Saframycin-Komplex, d.h. die in ein Lösungsmittel extrahierte Fraktion, keine Aktivität gegen E. coli zeigt.

Einige Ausführungsformen des Herstellungsverfahrens der erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Substanzen werden nachstehend anhand der Beispiele gezeigt, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt sein soll.

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- 3ο -

Beispiel 1
Schüttelkultur in Kolben

Eine Suspension eines gefriergetrockneten Präparats von Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314 in physiologischer Kochsalzlösung wurde hergestellt und auf Schrägagar mit der nachstehenden Zusammensetzung aufgeimpft:

Glucose	10	g
L-Asparagin	VJl	g
KH₂PO₄	5	g
Agar	15	g
Leitungswasser	1000	ml
pH-Wert	6,8	- 7,0

Die Züchtung wurde eine Woche lang bei 27⁰C durchgeführt, wobei eine Impfkultur mit reichlichem Wuchs und zahlreichen Sporen erhalten wurde.

100 Schüttelkolben, die Jeweils ein Fassungsvermögen von 500 ml hatten und 100 ml des nachstehend definierten Kulturmediums enthielten, wurden unter aseptischen Bedingungen mit den aus der vorstehenden Impfkultur gewonnenen Sporen in einer Menge von zwei Ösen pro Flasche beimpft.

Glucose 1,0 g

Stärke 10,0 g

Polypepton (Produkt 10,0 g der Wako Pure Chemical
Industries, Ltd., Japan)

Fleischextrakt ( " ) 5,0 g NaCl 3,0 g

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Silicon KM 72 (Shin-Etsu 10 ml

Chemical Co., Ltd., Japan)

Leitungswasser 1000 ml

pH-Wert 7,0

Die Züchtung wurde 40 Stunden lang bei 27°C mit Hilfe einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung (125 Ausschläge pro Minute, Amplitude 8 cm) durchgeführt.

Nach beendigter Züchtung wurde der Inhalt der Kolben kombiniert *- und das Mycel wurde mit Hilfe eines kontinuierlichen Zentrifugalabscheiders abgetrennt. Der so erhaltene überstehende Anteil (10 1) wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann 3 mal mit je einem drittel Volumteil Chloroform extrahiert.

Die Extrakte wurden kombiniert, durch Filterpapier filtriert und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,8 g einer dunkelbraunen festen Substanz erhalten wurden. Eine Lösung der Substanz in 50 ml Äthylacetat wurde mit 25 ml 1 η Natriumcarbonat geschüttelt, um saure Substanzen zu entfernen. Die organische Schicht wurde 5 mal mit Anteilen von je 25 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde zur Trockene konzentriert, wobei 220 mg eines neutralen Rohextrakts erhalten wurden. Die kombinierten wässrigen Schichten wurden mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 bis eingestellt und 5 mal mit jeweils gleichen Anteilen an Chloroform extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert und erneut unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 91 mg eines basischen Rohextrakts erhalten wurden, der den Saframycin-Komplex enthielt.

Der neutrale Rohextrakt (220 mg) wurde unter Verwendung von 6 g Silicagel (Siebgröße 70 - 230 Maschen; 62 um bis 210 um; Produkt der Merck & Co., Deutschland) unterworfen und die Elution erfolgte mit Äthylacetat : Benzol (1:4), wobei 110 mg der Fraktionen erhalten wurden, die vorherrschend Saframycin A enthielten.

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Diese wurden der Saulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und von Methanol als Blutionsmittel unterworfen, wobei 18 mg Saframycin A als rohe pulverförmige Substanz erhalten wurde.

Der basische Rohextrakt (91 mg) wurde an 3 g Silicagel (Siebgröße 70 - 230 Maschen; 62 pm bis 210 pm; Produkt der Merck & Co., Deutschland) der Saulenchromatographie unterworfen und die Säule wurde nacheinander mit Äthylacetat : Benzol (1:4), (1:1), Äthylacetat und 5 % Methanol enthaltendem Äthylacetat entwickelt, wobei nacheinander die Saframycine A, D, C, B und E erhalten wurden. Jede Fraktion wurde der Saulenchromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, um den Hauptteil der Verunreinigungen zu entfernen. Die Saframycin A-Fraktion und das vorstehend erwähnte rohe Pulver von Saframycin A wurden kombiniert und wiederholt der Saulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 230 Maschen entsprechend 62 pm; Merck & Co.) unterworfen, wobei 11 mg reines pulverförmiges Saframycin A erhalten wurden. DLe Fraktionen, welche jeweils die pulverförmigen rohen Saframycine B, C und D enthielt en, wurden wiederholt der SäulenchromatograpKe am Silicagel (230 Maschen entspr. 62 μΐη, Merck & Co. ) unterworfen, woba. 41 mg Saframycin B, 18 mg Saframycin C und 6 mg SaframycinD jeweils in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz erhalten wurden. Die pulverförmigen Rohsubstanzen wurden aus kaltem Äther umkristallisiert, wobei 21 mg, 8 mg bzw. 3 mg der kristallinen Saframycine B, C bzw. D erhalten wurden. Die Saframycin E enthaltende Fraktion wurde erneut der Saulenchromatographie an Sephadex LH-20 und der anschließenden Saulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 230 Maschen entsprechend 62 pm; Merck & Co.) mehrmals unterworfen, wobei 18 mg Saframycin E in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz erhalten wurden, die dann aus Aceton umkristallisiert wurde, so daß 3 mg reines Saframycin E in Form eines Pulvers erhalten wurden.

Beispiel 2

Fermentation in Krug-Fermentern

A. Eine Impfkultur wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Abänderung, daß die Züchtung 24 Stunden lang

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durchgeführt wurde.

B. Vier Krug-Fermenter, die jeweils ein Volumen von 20 1 hatten und 15 1 des nachstehend angegebenen Kulturmediums enthielten, wurden unter Druck in üblicher Weise sterilisiert.

Glucose	5,0	g
Stärke	5,0	g
Polypepton (Produkt der Wako Pure Che mical Industries, Ltd., Japan)	10,0	g
Fleischextrakt ( » )	5,0	g
NaCl	3,0	g
Leitungswasser	1000	ml
pH-Wert	7,0	- 7,2

Die Züchtung wurde 18 Stunden lang unter folgenden Bedingungen fortgesetzt :

Impfkultur 1 %

Züchtungstemperatur 27⁰C

Rühren 550 Upm

Strömungsrate der· 1 Volumen Medium pro Minuaseptisehen Luft te

Antischaummittel bei Bedarf zugesetzt (Silicon KM 72)

Nach Ablauf der vorstehend angegebenen Zeit war die Maximalkonzentration des gebildeten Saframycin-Komplexes erhalten worden und danach nahm der Titer rasch ab. Der pH-Wert der Kulturbrühe fiel unter 6,0 ab und stieg danach auf etwa 6,8 an. Das Volumen des Mycels nahm rasch zu und die Glucose war zu diesem Zeitpunkt nahezu aufgebraucht. Bei der Maximalkonzentration an Saframycin zeigte die Verdünnungsmethode xinter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus 512 Verdünnungseinheiten und bei der Agarplatten-Diffusionsmethode wurde ein Hemmhof von etwa 40 mm erhalten. Die Maximalproduktion von Streptothricin wurde

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später, nach etwa 30 Stunden, erreicht. Aus der aus den Krug-Fermsntern gesammelten Kulturbrühe (etwa 240 1) wurde das Mycel mit Hilfe eines kontinuierlichen Zentrifugalabscheiders abgetrennt und danach wurde die Kulturflüssigkeit mit Hilfe einer Contro-Konzentriervorrichtung (augenblicklich wirksame Konzentriervorrichtung unter vermindertem Druck)' auf ein Drittel des Volumens konzentriert.

Das Filtrat wurde mit einer 1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid auf einen pH-¥ert von 8,0 eingestellt. Danach wurde das eingestellte Filtrat 3 mal mit dem gleichen Volumen an Methylendichlorid unter Rühren in Zeitabständen von 1 Stunde extrahiert. Die organischen Schichten wurden abgetrennt, kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 16,4 g des rohen Saframycin-Komplexes erhalten wurden. Der Komplex wurde 3 mal einer Gegenstromverteilung unter Verwendung von Methanol-n-Hexan unterworfen. Die Methanolschichten wurden kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in 200 ml Benzol gelöst und 2 mal durch Schütteln mit 100 ml 1 η Natriumcarbonat gut gewaschen. Die gewaschene Benzolschicht wurde 5 mal mit jeweils 60 ml-Anteilen 1 η Chlorwasserstoffsäure geschüttelt, um basische Substanzen in die Chlorwasserstoffsäure überzuführen. Die Chlorwasserstoffsäure-Schichten wurden kombiniert, mit wässrigem Ammoniak wieder auf einen pH-¥ert von 8 bis 9 eingestellt und danach 5 mal mit dem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,7 g eines rohen basischen Extrakts erhalten wurden. Die Benzolschicht wurde zur Trockene eingedampft, wobei 2,7 g eines neutralen Rohextrakts erhalten wurden. Die Gesamtmenge des so aus vier Krug-Fermentern hergestellten Rohprodukts schwankte im Bereich von etwa 0,2 g bis 1,2 g.

Die Züchtung wurde 20 mal unter Verwendung von vier Krug-Fermentern und einer Gesamtmenge der Kulturbrühe von 1200 1 wiederholt, wobei 12,4 g eines rohen neutralen Extrakts und 12,6 g des rohen

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basischen Extrakts gebildet wurden.

Die Isolierung und Reinigung der Saframycine A, B, C, D und E aus den so erhaltenen Extrakten erfolgte z.B. in der nachstehend erläuterten Weise.

Der neutrale Rohextrakt (12,4 g) wurde der Säulenchroraatographie an 120 g Silicagel (Siebgröße 70 - 230 Maschen; 210 - 62 um, Merck & Co.) unter Verwendung von Äthylacetat : Benzol (1:4) als Elutionsraittel unterworfen, wobei 1,2 g der Saframycin A enthal-" tenden Fraktion gebildet wurden. Diese wurde dann der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und von Methanol als Elutionsmittel unterworfen, bei der 220 mg rohes pulverförmiges Saframycin erhalten wurde.

Der basische Rohextrakt (12,8 g) wurde der Säulenchromatographie an Silicagel (Siebgröße 70 - 230 Maschen entsprechend 210 - 62 um; Merck & Co.) unter Verwendung von Äthylacetat : Benzol (1:1) als Elutionsmittel unterworfen, wobei der Hauptanteil der Verunreinigungen an der Säule adsorbiert wurde. Das den Saframycinkomplex enthaltende Eluat wurde erneut der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 unterworfen, um den größten Anteil der Verunreinigungen zu entfernen, wobei 6,3 g der Fraktion verblieben, die 6,3 g des Saframycin-Komplexes enthielt. Die Fraktion wurde an 180 g Silicagel (Siebgröße 70 230 Maschen entsprechend 62 - 210 pm; Merck & Co.) chromatograpliert bei der nacheinander mit Äthylacetat : Benzol (1:4), Äthylacetat : Benzol (1:1), Äthylacetat und 5 % Methanol enthaltendem Äthylacetat entwickelt wurde, wobei nacheinander die Saframycine A, B, C, D und E erhalten wurden. Jede Fraktion wurde an Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel der Säulenchromatographie unterworfen, wobei der größte Anteil der Verunreinigungen entfernt wurde und auf diese Weise wurden 52 mg der Fraktion von Saframycin Λ erhalten. Diese Fraktion und 220 rag" des vorstehend gis Rohpulver erhaltenen Saframycins wurden kombiniert und wie- ' -

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derholt an Silicagel (230 Maschen entsprechend 62 pn, Merck & Co.) der Säulenchromatographie unterworfen, wobei 142 mg rohes pulverförmiges Saframycin A erhalten wurden, welches dann aus kaltem Äther umkristallisiert wurde, wobei 72 mg reines Saframycin A erhalten wurden.

Die Fraktionen, welche die Saframycine B, C, D und E enthielten, wurden gesondert wiederholte Male an Silicagel (230 Maschen, 62 um, Merck & Co.) der Säulenchromatographie unterworfen und an einer Sephadex LH-20-Säule chromatographiert, wobei 590 mg Saframycin B, 60 mg Saframycin C, 29 mg Saframycin D bzw. 29 mg Saframycin E in Form der rohen pulverförmigen Substanzen erhalten wurden. Diese wurden jeweils aus kaltem Äther umkristallisiert, wobei 411 mg Saframycin B, 32 mg Saframycin C und 12 mg Saframycin D erhalten wurden. Die Umkristallisation des rohen Safraraycins E aus Aceton ergab 9 mg Saframycin E in Form der reinen pulverförmigen Substanz.

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DEA-13 171

12. September 1978

Als Antibiotika wirksame Saframycine A, B, C, D und E und Verfahren zu ihrer Herstellung

PATENTANSPRÜCHE

Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin A, g e k e η η zeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften :

Farbe und Aussehen : Gelbes Pulver in Form der Saframycin A-Base;

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ORIGINAL INSPECTED

Schmelzpunkt : 122 - 126°C; Elementaranalyse :

C : 61,47 %, H : 5,41 % N : 9,33 %;

Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht : 562;

Empirische Formel :

C₂₉H₃₀N₄O₈ - 2/5 H₂O;

Spezifische Drehung :

[α] J5° = +18,2° (C = 1,0, Methanol);

Das in Fig. 1 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten :

^{nm (1}°g t) ^{: 267 (4}

(^1ο§ε) : 230 (3,88);

Das in Fig. 2 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten :

cm"*¹ : 3400, 1716, 1685, 1660, 1615;

Das in Fig. 3 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl,) mit den Werten :

6 : 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,24 (3H, s),

2,30 (3H, s), 4,04 (6H, s), 6,65 (3H, bs); Löslichkeitsverhalten :

leicht löslich in Estern, Chloroform, Aceton, Alkoholen; mäßig löslich in Äthyläther;
unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion :

Dragendorff-Reaktion : positiv;

Ninhydrin-, Perchlor-Eisen- und Anthron-Reaktion:negativ.

9O9S1:>/1QQ1

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2. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin B, gekenn zeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften :

Farbe und Aussehen : Orange-gelbe Prismen; Schmelzpunkt : 108 - 109°C; Elementaranalyse :

C : 62,36 %, H : 5,71 %, N : 7,66 %;

Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht : 537;

Empirische Formel :

^C28^H31^N3°8'·
Spezifische Drehung :

[a]_D° = -54,4 (C = 1,0, Methanol);

Das in Fig. 4 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten :

nm (logg) : 269 (4,35), 368 (3,13)
£) ^{: 232} (3,86), 330 (3,10);

Das in Fig. 5 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten :

cm"¹ : 3430, 1720, 1690, 1660, 1620;

Das in Fig. 6 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl,) mit den Werten : ύ : 1,90 (3H, s), 1,98 (3H, s), 2,23 (3H, s),
2,28 (3H, s), 4,00 (6H, s), 6,28 (1H, bs);

12/1001

Loslichkeitsverhalten :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;

mäßig löslich in Äthyläther; unlöslich in Wasser, n-Hexan; Farbreaktion :

Dragendorff- und Meyer-Reaktion : positiv; Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ.
3. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin C, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften :

Farbe und Aussehen : Orange-rote Nadeln; Schmelzpunkt : 143 - 146°C; Elementaranalyse :

C : 61,61 %, H : 5,96 %, N : 7,39 %', Durch Massenspektrum bestimmtes Molekulargewicht : 567; Empirische Formel :

C₂₉H₃₃N₃O₉;

Spezifische Drehung :

Γα^⁰= -20,8° (C = 1,0, Methanol);

Das in Fig. 7 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten :

^UV^m2^{han01 m (1}°g^ ^{: 266}'^{5 (4}'³²⁾' ^{368 (3}'¹⁹>

(log c) : 230 (3,86), 330 (3,16);

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_ 5 —

Das in Fig. 8 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten :

cm"¹ : 3400, 1720, 1685, 1655, 1615;

Das in Fig. 9 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl^) mit den Werten : Sx 1,86 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,38 (3H, s),

2,44 (3H, s), 3,46 (3H, s), 3,96 (3H, s),

6,60 (1H, bs);
Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Estern, Aceton, Benzol;

mäßig löslich in Äthyläther; unlöslich in Wasser, n-Hexan; Farbreaktion :

Dragendorff- und Meyer-Reaktion : positiv; Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion : negativ.
4. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin D, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften :

Farbe und Aussehen : Gelbe Nadeln;

Schmelzpunkt : 150 - 154⁰C;

Elementaranalyse :

C : 60,48 %, H : 5,68 %, N : 7,59 %·

Durch Masssnspektrum bestimmtes Molekulargewicht : 553;

• 909812/1Ö01

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Empirische Formel :
C₂₈H₃₁N₃O₉;

Spezifische Drehung :

^° = +141° (C = 1,0, Methanol);

Das in Fig. 10 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten :

nm (log S) : 243 (4,14), 274 (4,24), 369 (3,75)

nm (log£) : 231 (4,08), 253 (4,06), 319 (3,30);

Das in Fig. 11 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten :

cm"¹ : 3560, 3400, 1720, 1685, 1660, 1630;

Das in Fig. 12 gezeigte NMR-Spektrum (CDCl₃) mit den Werten: 61 1,91 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,28 (3H, s), 2,45 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,06 (3H, s); Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Chloroform, Pyridin; mäßig löslich in Estern, Aceton, Äthyläther; unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion :

Dragendorff-Reaktion : positiv.
5. Antibiotisch wirksame Substanz, Saframycin E, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaf-

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Farbe und Aussehen : Gelbes Pulver; Schmelzpunkt : 146 - 148°C; Elementaranalyse :
C : 58,52 %, H : 5,89 % N : 7,36 %;

Molekulargewicht (errechnet aus dem Massenspektrum des 555 Triacetylderivats)

Empirische Formel :
C₂₈H₃₃N₃O₉ . H₂O;

Spezifische Drehung :

[α]²⁰ = -37,3° (C = 0,53, Methanol);

Das in Fig. 13 gezeigte Ultraviolett-Absorptionsspektrum mit den Absorptionswerten :

mn (log c) . 272 (4,10), 368 (2,93) ^Methanol ^ _(lQg _£) . _{241 (3>84)>
34o (2>g6)}.

Das in Fig. 14 gezeigte Infrarot-Absorptionsspektrum mit den Werten :

^cm~^{1 : 3380}' ¹⁷²⁰' ¹⁶⁸⁵» ¹⁶⁵⁵' ^162O;

Das in Fig. 15 gezeigte NI-¹IR-Spektrum (d-5-Pyridin) mit den Werten :

6' 1,83 (3H, s), 2,17 (3H, s), 2,30 (3H, s), 2,48 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,95 (3H,s), 5,22 (1H, s);

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Löslichkeit :

leicht löslich in niederen Alkoholen, Pyiridin; mäßig löslich in Aceton, Estern, Chloroform;

unlöslich in Wasser, n-Hexan;
Farbreaktion :

Dragendorff-Reaktion : positiv.
6. Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen Substanzen, Saframycin A, B, C, D und E sowie ihrer Säure-Additionssalze, dadurch gekennzeichnet , daß man Streptomyces lavendulae Stamm Nr. 314, NRRL-11002 in einem üblichen Kulturmedium züchtet, den gebildeten Komplex der Saframycine A, B, C, D und E aus der Kulturbrühe gewinnt und danach die Saframycine A, B, C, D und E aus dem Komplex isoliert und sie gegebenenfalls in ein gewünschtes Säure-Additionssalz überführt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,' daß man die Züchtung durch Submerskultur in einem flüssigen Medium vornimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 37 bis 30⁰C durchführt.
9. Arzneimittel, enthaltend einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Exzipienten und gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe

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sowie einen oder mehrere Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet ,daß es als Wirkstoff eine oder mehrere der antibiotisch wirksamen Substanzen, Saframycin A, B, C, D und E und/oder deren Säure-Additionssalze mit pharmazeutisch geeigneten Säuren enthält.

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