DE2743654C3 - - Google Patents
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- DE2743654C3 DE2743654C3 DE2743654A DE2743654A DE2743654C3 DE 2743654 C3 DE2743654 C3 DE 2743654C3 DE 2743654 A DE2743654 A DE 2743654A DE 2743654 A DE2743654 A DE 2743654A DE 2743654 C3 DE2743654 C3 DE 2743654C3
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Description
A) in Säugetierlebern enthaltenen Enzymsystemen und von Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat
oder dessen reduzierter Form bei einer Temperatur 7wischen 20 und 42° C und einem
pH-Wert von 5,5 bis 10,5 oder von
B) Natriumborhydrid, Lithiumhydrid, Aluminiumhydriden
oder Lithiumaluminiumhydrid durchführt
und nach A) oder B) gebildetes Anthracyciinglycosid MA 144-N1 in an sich bekannter Weise gewinnt.
4. Verfahren zur Herstellung von Anthracyciinglycosid MA 144-Y, dadurch gekennzeichnet, daß man
Aclacinc-mycin A in Gegenwart von Enzymsystemen,
die aus der Kulturbrühe von Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces
galilaeus MA 144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces
cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus
ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens ATCC 25489 oder Mutanten davon erhalten worden sind,
bei einer Temperatur von 20 bis 50°C sowie bei einem pH-Wert von 4 bis 9 in Gegenwart von
Sauerstoff umsetzt und das gebildete Anthracyciinglycosid MA 144-Y in an sich bekannter Weise
gewinnt.
5. Verfahren zur Herstellung von Anthracyciinglycosid MA 144-Sl, dadurch gekennzeichnet, daß man
MA 144-M1 mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Mineralsäure partiell hydrolysiert.
6. Pharmazeutische Zubereitungen mit antibakterieller Wirkung oder Antitumorwirkuiig, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an Anthracyciinglycosid MA 144-G1.MA 144-G2.MA 144-LMA 144-N1,
MA 144-S1, MA 144-S2, MA 144-Ul, MA 144-U2 und/oder MA 144-Y oder nichttoxischen Säureadditionssalzen
davon gemäß Anspruch 1.
OH
CH3
und deren nichttoxischr Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Anthracyclinglycoside
MA 144- gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces
galilaeus MA 144-M1 (FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptomyces
cinereoruber ATCC 19740, Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus
ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens ATCC 25489 oder Mutanten davon unter aeroben
Verschiedene Typen von Anthracyclinglycosiden wurden in der Kulturbrühe von Mikroorganismen
gefunden und in der Literatur beschrieben. Von diesen Glycosiden wurden bereits Daunomycin und Adriamycin
klinisch zur Bekämpfung von Krebs beim Menschen eingesetzt. Aclacinomycin A, Carminomycin sowie Rubidazon
werden klinisch auf dem Gebiet der Krebschenotherapie getestet.
Anlhracyclinantibiotika mil einem Aklavinonaglyconanteil
werden in folgenden Literaturstcllen beschrieben:
(a) Adacinomyc in A und B in der US-PS 39 88 315
sowie von Oki et aL in »J. Antibiotics 28,830 (1975).
(b) Aklavin in »J. BacterioL 72,90 (1956).
Anthracyclinantibiotika mit einem ε-Pyrromycinoniglyconanteil
werden in folgenden l.iteraturstellen beschrieben:
(c) Musettamycin und Marcellomycin aus Bohemsäurekomp!ex
in »J. Antibiotics« 30,525 (1977).
(d) Pyrromycinin»Chem.Ber.«92,1904(1959).
(e) Cinerubin A und B in der GB-PS 8 46 130 (vgl. auch
die US-PS 38 64 460 sowie Keiler-Schierlein et al. »Antimicrobial Agents and Chemotherapy«, S. 68
(1970).
Andere Anthracyclinantibiotika mit einem anderen Agiycon als Aklavinon und ε-Pyrromycinon werden in
folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
(f) Nogalamycin in »J. Amer. Chem. Soc.« 99, 542 (1977),
(g) Steffimycin in »J. Antibiotics« 27,805,809 (1974),
(h) Carminomycin in »). Antibiotics« 27, 254 (1974)
sowie in der DE-PS 23 62 707 sowie in »]. Amer.
Chem. Soc.« 97.5955(1975),
(i) Trypanomycin in »Antimicrobial Agents and
(i) Trypanomycin in »Antimicrobial Agents and
Chemotherapy« 1,385(1972),
(j) Requinomycin in »J. Antibiotics« 25,393 (1972), (k) Galirubin A und B in »Naturwiss.« 52, 539 (1965)
(j) Requinomycin in »J. Antibiotics« 25,393 (1972), (k) Galirubin A und B in »Naturwiss.« 52, 539 (1965)
sowie »Chem. Abst.« 67,90573 ζ (1967).
Weitere Fundstellen für Anthracyclinantibiotika sind der »Index of Antibiotics form Actinomycetes«, Hamao
Umezawa, University Park Press, State College, Pennsylvania, USA (1967), wobei auf den nachfolgend
angegebenen Seiten die angegebenen Antibiotika erwähnt werden:
Antibiotikum | Seite |
Aklavin | 111 |
Cinerubin A | 220 |
Cinerubin B | 221 |
Danubomycin | 242 |
Daunomycin | 243 |
Pyrromycin | 524 |
Rhodomycin A, B | 561 |
Rubidomycin | 574 |
In dem Buch »Antibiotics«, Band 1, Mechanism of Action, herausgegeben von David Gottlieb und Paul D.
Shaw. Springer-Verlag, New York, Inc., N. Y., N. Y. (1967), ist auf den Seiten 190 bis 210 eine Zusammenfassung
von A. DiMarco zu finden, die »Daunomycin and Related Antibiotics« überschrieben ist. In dem ^Information
Bulletin« Nr. 10 des Internationa! Center of Information of Antibiotics, in Zusammenarbeit mit
WHO, Dezember 1972, BelL>k *. sind Anthracycline
sowie ihre Derivate beschrieben.
Durch die Erfindung werden neue Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144- gemäß Hauptanspruch zur
Verfügung gestellt. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie
diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, entsprechend den Ansprüchen 2 bis 6. Die erfindungsgemäßen
Anthracyclinglycoside sind zur Behandlung von bakteriellen Infektionen sowie zur Inhibierung von
Säugetiertumoren geeignet.
Die erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside werden als Anthracyclinglycoside MA 144-Gl, -G2, -L, -NI.
-S1, -S2, -U1, -U2 und -Y bezeichnet
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside MA 144- besteht darin, daß
man Streptomyces sp. ME505-HE1 (FERM P-3667) ATCC 31273, Streptomyces galilaeus MA 144-M1
(FERM P-2455) ATCC 31133, Streptomyces galilaeus ATCC 14969, Streptcmyces cinereoruber ATCC 19740,
Streptomyces niveoruber ATCC 14971, Streptomyces antibioticus ATCC 8663 oder Streptomyces purpurascens
ATCC 25489 oder Mutanten davon unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium bei einer
Temperatur zwischen 20 und 37° C sowie bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 züchtet, das gebildete
Anthracyclinglycosid-Gemisch, jeweils in an sich bekannter Weise, aus dem Kulturmedium gewinnt und
dazu den einzelnen Anthracyclinglycosiden gemäß Anspruch 1 fraktioniert und letztere gegebenenfalls in
ein nicht-toxisches Säureadditionssalz überführt.
Die Gewinnung aus dem Kulturmedium sowie die Fraktionierung zu den einzelnen Anthracyclinglycosiden
können beispielsweise aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentrierung,
einer Gelfiltration, einer Gegenstromverteilung, einer CHlierung mit Metallionen sowie aus
herkömmlichen Säulenchromatographiemethoden bestehen.
Die erfindungsgemäßen Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144- zeigen folgende Wirkungen:
(a) antimikrobielle Aktivitäten gegenüber grampositiven Bakterien,
(b) Hemmung des Wachstums von bösartigen Tumoren in Säugetieren und
(c) eine hohe Cytotoxizität und damit eine Hemmung des Wachstums sowie einer RNA-Synthese von
Säugetiertumorzellen in Kulturen.
Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt
Fig. 1 ei:i UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA 144-Gl in
90%igem Methanol;
Fig. 2 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-G2 in
90%igem Methanol;
Fig. 3 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-L in
90%igem Methanol;
Fig. 4 ein UV-Absorptionsspekturm sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-N1 in
90%igem Methanol;
Fig. 5 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-S1 in
90%igem Methanol;
Fig. 6 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-S2 in
90%igem Methanol;
Fig. 7 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spel-'rum in sichtbarem Licht von MA144-U1 in
90%igem Methanol;
Fig. 8 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-U2 in
90%igem Methanol;
Fig. 9 ein UV-Absorptionsspektrum sowie ein Spektrum in sichtbarem Licht von MA144-Y in
90%igem Methanol;
Fig. 10 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-C η Kaliumbromid;
Fig. 11 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-G2 in Kaliumbromid;
Fig. 12 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-Lin Kaliumbromid;
Fig. 13 ein Infrarotabsorptionsspektrum von in MA144-N1 in Kaliumbromid;
Fig. 14 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-S1 in Kaliumbromid;
Fig. 15 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-S2 in Kaliumbromid; r>
Fig. 16 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-U1 in Kaliumbromid;
Fig. 17 ein Infrarotabsorptionsspektrum von MA144-U2 in Kaliumbromid;
Fig. 18 ein Infrarotabsorptionsspektrum von 2ii
MA144-Y in Kaliumbromid;
Fig. 19 das NMR-Spektrum von MA144-G1 in CDClj(60MHz)
Fig. 20 das NMR-Spektrum von MA144-G2 in CDCl3(60MHz) 2 j
F i g. 21 das NMR-Spektrum von MA144-L in CDCl3
(60MHz)
Fig. 22 das NMR-Spektrum von MA144-N1 in CDCI3(IOOMHz)
F i g. 23 das NMR-Spektrum von MA144-S1 in CDCI3 w
(60 MHz)
F i e. 24 das NMR-Spektrum von MA144-S2 in CDCIj
(60 M~Hz)
Fig. 25 das NMR-Spektrum von MA144-U1 in CDCl3(60MHz) Η
Fig. 26 das NMR-Spektrum von MA144-U2 in CDCI3(OOMHz)
F i g. 27 das NMR-Spektrum von MA144-Y in CDCI3
(100 MHz)
Fig. 28 das UV-Absorptionsspektrum und das Ab- w
sorptionsspektrum in sichtbarem Licht des Methyldisaccharids,
das aus MA144-Y in Methanol (0,04 g/l) erhalten worden ist;
F i g. 29 das Infrarotabsorptionsspektrum des Methyldisaccharids,
das aus MA144-Y in Kaliumbromid v>
erhalten worden ist.:
Fig. 30 das NMR-Spektrum des Methyldisaccharids.
R1 O
COOCH3
i CH,CH.,
/\ /
■'' Y-(JH
■'' Y-(JH
das aus MA144-Y in CDCl3 (100 Mhz) erhalten worden
ist.
Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien,
hemmen das Wachstum von verschiedenen Säugetiertumoren, wie L1210- und P388-Leukemien in
Mäusen, und besitzen eine niedrige Toxizilät. Daher eignen sie sich als antibakterielle Mittel sowie als
Antitumormittel.
Die Herstellung dieser Verbindungen erfolgt in der vorstehend beschriebenen Weise in einem Nährmedium,
das bekannte Nahrungsmittelquellen für Strahlenpilze enthält, d. h. Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff
sowie anorganische Salze. Vorzugsweise wird eine aerobe Submerskultur eingesetzt, wie sie auch für die
Herstellung anderer Antibiotika verwendet wird. Die allgemeinen Methoden, die zur Züchtung anderer
Strahlenpilze anwendbar sind, lassen sich auch auf das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren anwenden. Das
Medium enthält vorzugsweise im Handel erhältliche Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Glycerin, Stärke,
Dextrin, Rohrzucker, Maltose, öle. Fette, und zwar entweder in gereinigter oder in roher Form, ferner im
Handel erhältliche Stickstoffquellen, wie Sojabohnenpulver, Hefeextrakt, Pepton, Baumwollsamenpulver,
getrocknete Hefe, Maiflüssigkeit oder anorganische Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumnitrat oder Ammoniumchlorid.
Anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Phosphate, werden vorzugsweise
verwendet. Gegebenenfalls können auch Spuren an Metallionen und Entschäumern zugesetzt werden. Die
Fermentationstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 25 und 300C. Nach maximal 2 bis 7 Tagen ist die
Hauptmenge der Anthracyclinglycoside angefallen.
MA 144-S1, -S2, -N1 oder ein Gemisch davon können
chemisch ausgehend von Aclacinomycin A, Cinerubin A, Rhodirubin A, MA 144-M1, Ma 144-M2, MA 144-N1,
MA 144-G1, MA 144-G2, MA144-U1, MA 144-U2, MA 144-Y oder einem Gemisch davon hergestellt
werden. Die Ausgangsmaterialien können in reiner Form, als Salze oder in unreiner Form verwendet
werden, beispielsweise in Form von Materialien, welche die Anthracyclinsubstanz enthalten, beispielsweise in
Form von Fermentationsbrühen oder Rohextrakten aus derartigen Brühen.
Die chemische Umwandlung läßt sich durch das folgende Reaktionsschema wiedergeben:
R1 O
COOCH.,
CH2CH3
Reduktion
HO O OH
CH3
1) Aclacinomycin A
R1H1R3O =--,CH3
R1H1R3O =--,CH3
Reduktion
2) Aclacinomycin A
MA 144-N 1
MA 144-G 1
MA 144-U I
MA 144-Y
MA 144-M 1
MA 144-N 1
MA 144-G 1
MA 144-U I
MA 144-Y
MA 144-M 1
HO
R1H, R3
R1H, R3
MA 144-G 2
MA 144-U 2
Rhodirubin A
MA 144-U 2
Rhodirubin A
z1
R1OH1R1' fCH3
HO
Cinerubin A
Hydrolyse
MA 144-N I
R'H.R·1 ((CH., /
HO
HO
MA 144-S 1
(R1H1R3H)
(R1H1R3H)
R1OH. R3O=(CH3
MA 144-M 2
HO
HO
Hydrolyse
MA144.S2
(R1OH1R3H)
(R1OH1R3H)
R1OH-R3' <CH3
MA 144-S1 und-Sl können durch eine Säurehydrolyse
von Aclacinomycin A (DE-OS 25 32 586), MA144-M1 (DE-OS 27 15255), MA 144-N1,
MA 144-M2 (DE-OS 27 15 255), Cinerubin A, MA 144-G1, MA 144-G2, MA 144-Ul, MA 144-U2,
MA 144-Y oder Rhodirubin A (US-PS 4127 714) hergestellt werden. Die Hydrolyse kann unter milden
Bedingungen unter Verwendung einer Mineralsäure, wie HCl, H2SO4, durchgeführt werden. Die Reaktion
kann entweder in einem die erfindungsgemäßen Verbindungen auflösenden Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch
durchgeführt werden. Die Reaktionsbedingungen, wie die Temperatur, die Substratkonzentration,
die Reaktionszeitspanne etc., hängen von dem Lösungsnittelsystem, dem Ausgangsmaterial ab.
O | COOCH3 | J | |
|| | γ | ||
/\ | CH2CH3 | ||
f | I ^ | ||
ο . ι |
|||
HO | O | ? | |
/τ— | |||
<ch | |||
I N- |
|||
/V | |||
T | |||
Y | |||
OH | |||
-Ox | |||
3
/ |
|||
-CH; |
wobei diejenigen Bedingungen gewählt werden, bei deren Einhaltung die höchste Ausbeute oder die höchste
Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden.
MA144-N1, -Y oder Gemische davon können enzymatisch aus Aclacinomycin A, MA 144-N1 oder
einem Gemisch davon hergestellt werden. Die Ausgangsmaterialien können in gereinigter Form, in Form
von Salzen oder in unreiner Form eingesetzt werden, beispielsweise in Form von Materialien, welche die
Anthracyclinsubstrate enthalten, beispielsweise in Form von Fermentationsbrühen oder Rohextrakten aus
derartigen Brühen.
Die enzymatische Umwandlung läßt sich durch das folgende Reaktionsschema wiedergeben:
O COOCH3 ■
[ CH2CH3
OH
Enzym
Coenzym
CH3
I) Aclacinomycin A
ίο
MA 144-N
HO
2) Aclacinomycin A MA 144-N
R"
HO
MA 144-N 1 kann aus Aclacinomycin A durch Enzyme hergestellt werden, die aus Säugetieren und Mikroorganismen
gewonnen werden. Die zur Reduktion der Ketogruppe des Cinerulose Α-Anteils eingesetzen
Enzymsysteme können in einer Mikrosom-Fraktion vorliegen und aus bestimmten Mikroorganismen erhalten
werden, die zu dem Genus Streptomyces gehören, sowie aus verschiedenen Säugetiergeweben, beispielsweise
Geweben von Affen, Hunden, Kaninchen, Hamstern, Ratten oder Mäusen. Im Fall der aus
Mikroorganismen erzeugten Systeme können Stämme, die zu Streptomyces gehören, in Form von Kulturbrü- 2r>
hen, Zellensuspension, in Form getrockneter Zellen, eines Zellenhomogenats, eines teilweise gereinigten
Enzyms sowie eines immobilisierten Enzyms, verwendet werden. Im Falle der Säugetierenzyme können verschiedene
Enzymquellen eingesetzt werden, beispielsweise j» verschiedene Organe, Gewebestücke, Gewebehomogenate,
daraus hergestellte getrocknete Zubereitungen sowie teilweise gereinigte Enzyme, die durch Aussalzen,
Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Gelfiltration oder Absorptionschromatographie erhalten r,
werden. Immobilisierte Enzyme, die aus derartigen Säugetierquellen erhalten werden, sind ebenfalls zur
Durchführung dieser Verfahrensvariante geeignet.
Eine besonders bevorzugte Methode zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-N 1 durch Reduktion
von Aclacinomycin A besteht darin, daß man die Reduktion durch Einwirkung von
A) in Säugetierlebern enthaltenen Enzymsystemen und von Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat
oder dessen reduzierter Form bei einer Temperatur 4' zwischen 20 und 42°C und einem pH-Wert von 5,5
bis 10,5 oder von
B) Natriumborhydrid, Lithiumhydrid, Aluminiumhydriden
oder Lithiumaluminiumhydrid durchführt
und nach A) oder B) gebildetes Anthracyclinglycosid MA 144-N 1 in an sich bekannter Weise gewinnt
Bei der Durchführung dieser Verfahrensvariante wird in optimaler Weise ein pH von 6 bis 8 eingehalten, wobei
die Substratkonzentration unter 5% liegt Die Reaktior.szeitdauer beträgt vorzugsweise 20 bis 120 Minuten,
wobei unter aeroben Bedingungen gearbeitet wird. Cu+ +, Hg+ +, Fe+ +, Fe+ + +, p-Chlormercuribenzoesäure
sowie N-Äthylmaleimid üben eine hemmende Wirkung auf die Enzymreaktion aus. «,o
MA144-Y kann aus Aclacinomycin A oder MA 144-N 1 in Gegenwart von Enzymsystemen hergestellt
werden, die aus der Kulturbrühe von Streptomyces galilaeus MA144-M1 (FERM P-2455, ATCC 31133), St
galilaeus ATCC 14969, St cinereoruber ATCC19740, St bs
niveoruber ATCC 14971, St antibioticus ATCC 8633, St purpurascens ATCC 25489 oder Streptomyces sp. ME
505-HE1. ATCC 31273 sowie Mutanten davon erhalten
worden sind. Diese Mikroorganismen können in Form der Kulturbrühe, einer Zellensuspension, in Form
getrockneter Zellen, eines Zellenhomogenats, einer überstehenden Lösung, eines teilweise gereinigten
sowie eines gereinigten Enzyms sowie eines immobilisierten daraus erhaltenen Enzyms verwendet werden.
Die Bedingungen der Enzymreaktion, wie der pH, die Temperatur, die Substratkonzentration, die Reaktionszeit,
hängen von dem Zustand des Enzyms, dem eingesetzten Ausgangsmaterial ab (im allgemeinen ist es
vorzuziehen, solche Bedingungen auszuwählen, welche die Eiizymreaktion beschleunigen und nicht die
Enzymreaktion inhibieren). Im allgemeinen sind eine Temperatur von 20 bis 500C, ein pH von 4,0 bis 9,0, eine
Substratkonzentration unter 5% sowie eine Reaktionszeitspanne von 10 Minuten bis 5 Stunden, und zwar je
nach der Menge an gelöstem Sauerstoff, vorzuziehen. Die Enzymreaktion erfordert Sauerstoff, jedoch kein
Coenzym.
Die Enzymaktivitäi in verschiedenen Streptomyces, die zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden,
ist wie folgt:
Organismen
Enzymaktivilät. Einheiten/ml
Streptomyces galilaeus MA 144-M 1 100
(ATCC 31133)
(ATCC 31133)
St. galilaeus ATCC 14969 75
St. sp. ME 505-HE 1, ATCC 31273 25
SL cinereoruber ATCC 19740 85
St. niveoruber ATCC 14971 35
St Sntibioticus ATCC 8663 15
St purpurascens ATCC 25489 20
Zusammensetzung der EnzymrekationsmisLnung
(ImI)
Aclacinomycin A als Substrat 0,25 ml (0,4 μΜοΙ/ml)
0,2 m Citratpuffer (p H 5,5) 0,25 m!
Enzymlösung 0,50 ml
Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 37° C durchgeführt, in einem Eisbad
beendet, worauf 1 ml 0,2 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)
zugesetzt wird. Die Reaktionsprodukte verden mit 0,25 ml Toluol extrahiert auf einer Kieselsäuredünnschicht
entwickelt und unter Verwendung eines Dual-Wellenchromaloscanners bestimmt Eine Einheit
der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert die 0,001 μΜοΙ MA 144-Y pro Minute bildet
Zur Reinigung der Enzymsysteme, die aus den
Kulturbrühen der vorstehend beschriebenen Strep.tomyces-Stämme erhalten worden sind, können herkömmliche
Methoden zur Enzymreinigung angewendet werden.
Beispielsweise kann eine elektrophoretisch homogene Enzymzubereitung aus dem Kulturfiltrat durch
Ausfällen aus einer Ammoniumsulfatlösung mit einer 50%igen Sättigung sowie durch Chromatographie unter
Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex A-50 sowie Sephadex®G-75 erhalten werden. Die
allgemeinen Eigenschaften des aus Streptomyces galilaeus MA144-M1 (ATCC 31133) erhaltenen gereinigten
Enzyms sind wie folgt:
Molekulargewicht | 72 000 |
!soe'.ektrischer Punkt | pH Hfl |
Optimaler pH | 5,5 |
pH-Stabilität | 5,0 bis 8,0 |
Thermische Stabilität | unter 500C (neutraler |
PH) | |
Reaktion | sauerstoffabhängig |
Km | 0,125 mM |
Inhibitoren | Fe++, SO3- , S-O4-, |
S2O5--, NaNj, Ascor | |
binsäure, NADPH sowie | |
Wasserstoffdonatoren. |
Die Eigenschaften der Enzyme, die aus den vorstehend erwähnten sieben Streptomyces-Stämmen
erhalten worden sind, sind mit denen unter Einsatz von Streptomyces galilaeus MA144-M1 erzielten identisch.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus der Kulturbrühe oder aus dem Reaktionsgemisch
gewonnen und voneinander nach folgenden Methoden getrennt werden.
Die MA144-Komponenten, die durch Fermentation erzeugt werden, liegen sowohl intracellülar als auch
extracellular vor, werden jedoch hauptsächlich in dem Mycelium gefunden. Zur Gewinnung von MA144-Komponenten
aus der Kulturbrühe kann die Brühe filtriert und das Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat Toluol. Benzol, Butylacetat, n-Butanol, Methylpropylketon,
Methylenchlorid, in einem neutralen bis schwachsauren Zustand extrahiert werden. Die MA144-Komponentcn
in dem Mycelium können durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chlorofo;
m, Aceton, n-Butanaol, Methanol, Äthanol, Äthylac;-tat
oder einer wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder
Essigsäure, gewonnen werden. Wahlweise können MA144-Komponenten direkt aus der Kulturbrühe unter
Anwendung der vorsici-eiiu erwähnten Exirakiiunsrnethoden
ohne vorherige Abtrennung des Myceliums extrahiert werden. Nach einer Konzentration im
Vakuum können die MA144-Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei
einem pH zwischen 6 und 9 reextrahiert werden. Nach einer Konzentration unter vermindertem Druck werden
τ die MA-Konzentrate mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pH von weniger als 4 vermischt. Dann
werden die MA144-Komponenten in der sauren wäßrigen Lösung mit einem organischen Lösungsmittel
nach einer Einstellung auf einen schwachbasischen pH ίο reextrahiert. Durch Wiederholung der vorstehend
beschriebenen Methoden, falls erforderlich, können MA144-Komponenten in gereinigter Form hergestellt
werden. Als Alternative zu einer Lösungsmittelextraktionsgewinnungsmethode oder in Kombination mit
r, einer derartigen Methode kann MA144 aus der Kulturbrühe durch Säulcnchromatographie unter Einsatz
von Adsorbentien, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Kieselsäure oder eines modifizierten Dextrans, wie es
im Handel unter dem Warenzeichen Sephadex® LH-20 2(i erhältlich ist, durch Gegenstromverteilung oder durch
Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz geeigneter organischer Lösungsmittel gewonnen werden. Die nach
diesen Methoden erhaltenen aktiven Extrakte werden unter vermindei :em Druck konzentriert und als rotes
> oder gelbes Pulver von MA144-Komponenten erhalten. Die MA144-Komponenten in den chemischen und
enzymatischen Gemischen werden bei einem Zusatz von Wasser extr?hiert, gereinigt und in Form eines
rohen Pulvers nach den vorstehend beschriebenen Methoden erhalten. Di; Lösung, welche die MA144-Komponenten
enthält, kann ferner allein oder nach Zugabe einer organischen oder anorganischen Säure,
wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure oder Pantothensäure, gefriergetrocknet
werden.
Zur Gewinnung der einzelnen MA144-Komponenten MA144-G1, -G2, -L, -Nl. -Sl, -S2, -Ul, -U2 sowie -Y
kann eine weitere Reinigung und Abrennung unter Anwendung von Standardtrennmethoden durchgeführt
werden, beispielsweise einer Säulenchromatographie, unter Einsatz verschiedener Adsorbentien, wie Kieselsäure,
modifizierter Dextrane, schwachsaurer Ionenaustauscherharze oder Aktivkohle, ferner unter Anwendung
einer Gegenstromverteilung, Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz geeigneter organischer Lösungsmittel,
oder unter Anwendung einer Chelicrung mit verschiedenen Metallionen. Ferner kann man eine
Kombination aus einer oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Methoden anwenden.
Es wurden folgende physikalisch-chemischen Eigen schäften der MA 144-Komponenten ermittelt:
Die physiksüschchemischen Eigenschaft?™ von
M A144-G1, -G2, -L, -N1. -Sl, -S2, -U1 °-U2 sowie -Y sind
wie folgt:
MA 144 | G 1 | amorphes | gelbes | G2 | H | amorphes | rotes Pulver |
Aussehen | schwachbasisches | 6,21 | |||||
Pulver | N | O | scliwachbasisches | 6,45 | N | 0 | |
Elementaranalyse | C H | 1,44 | 28,93 | C42H53O16N | 1,75 | 30,58 | |
gefunden: | 61,45 6,31 | 1,73 | 29,56 | C | 827,9 | 1,69 | 30,92 |
berechnet: | 62,14 6,58 | 61,15 | |||||
Empirische Formel | C42H53O15N | 60,93 | |||||
Molekulargewicht | 811,9 | ||||||
Fortsetzung
MA 144
G 1
Schmelzpunkt, C
Spezifische Drehung
Spezifische Drehung
Löslichkeil
RpWerte**)
*) C : M = 20 : I
Reaktion
UV-Absorptionsspektrum sowie Absorptionsspektrum im Sichtbaren und max
141-145 152-156
+ 54°
(r = 0,33, CHCl3)
Löslich in saurem Wasser, Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat,
Chloroform, Benzol, Toluol, Dimethylsulfoxid, Methylcellosolve, Dimethylformamid.
Leicht löslich in Wasser, η-Hexan, Cyclohexan, Diäthyläther und Petroleum.
Das Hvdrochloridsalz ist löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, jedoch gering löslich
in Chloroform, Aceton und Äthylacetat.
0,38
Die saure wäßrige Lösung und Methanollösung ist gelb und schlägt in rötlich-purpur
in alkalischem Zustand um und nimmt eine rötlich-braune Farbe in konzentrierter H2SO4-Lösung an.
Diese saure wäßrige Lösung ist rot und schlägt in purpur-blau in alkalischem Zustand
um und nimmt eine Purpurfarbe in konzentrierter Schwefelsäurelösung an.
Fig. 1 | (537), | 259 | (330), | Fig. 2 | (580), | 259 | (295) |
230 | (140), | 432 | (165), | 235 | (101), | 492 | (175) |
290 | 292 | ||||||
(ausgezogene Linie)
in O.ln KCl-MeOH | 229,5 | (610), | 259 | (372), | 235 | L | H | N | gelbes | N 1 | (627), | 259 | H | CHCI3) | N | (300) |
(gestrichelte Linie) | 289 | (159), | 430 | (169), | 292 | 6,31 | 1,54 | (104), | 492 | 6,71 | 144-G 1 | 1,71 | (178) | |||
in 0,ln NaOH-MeOH | 239 | (521), | 285 | (151), | 242 | 6,44 | 1,76 | O | (575), | 565 | 6,82 | 1,72 | (230) | |||
(-.-.- Linie) | 317 | ( 96), | 522 | (144), | 605 | schwachbasisches amorphes | 5N | 30,13 | (198) | C42H55O15N | ||||||
Infrarotabsorptions | Fig. 10 | Fig. 11 | Pulver | 30,08 | 813,9 | |||||||||||
spektrum (KBr) | C | 146-147 | ||||||||||||||
NMR-Spektrum (PMR) | Fig. 19 | Fig. 20 | 61,39 | + 57,5° | ||||||||||||
*) C = Chloroform, M = | Methanol | 61,72 | (c = 0,4, | |||||||||||||
**) Dünnschichtchromatographiebedingungen: Kieselsäuredünnschicht 6OF154 (Merck ' | C41H51O1 | 144-G 1 | Co.) (bei | 27 C). | wie MA | |||||||||||
MA 144 | 797,9 | 0.21 | ||||||||||||||
Aussehen | 134-136 | schwachbasisches amorphes | rotes Pulver | |||||||||||||
Elementaranalyse | C | O | ||||||||||||||
gefunden: | wie MA | 61,43 | 29,22 | |||||||||||||
berechnet: | 0,31 | 61,97 | 29,48 | |||||||||||||
Empirische Formel | ||||||||||||||||
Molekulargewicht | ||||||||||||||||
Schmelzpunkt, C | ||||||||||||||||
Spezifische Drehung | ||||||||||||||||
[al H' | ||||||||||||||||
Löslichkeit | ||||||||||||||||
RrWerte*·) | ||||||||||||||||
*) C : M = 20 : 1 |
15 | 144-G 1 | H | 27 | 43 654 | O | N 1 | 16 | H | 259 | (298), | |
6,45 | 29,36 | wie MA | 6,13 | 433 | (144) | ||||||
Fortsetzung | L | (480), | 6,84 | 29,72 | Fig. 4 | 6,34 | |||||
MA 144 | wie MA | (118), | jN | 229,5 | 144-G 1 | 4N | |||||
Reaktion | Fig. 3 | 290 | |||||||||
UV-Absorptionsspek- | 230 | (482), | 259 | (304), | |||||||
tpjm sowie Absorp | ?90 | 259 | (298), | (121), | 433 | (151) | |||||
tionsspektrum im Sicht | (530), | CHCl3) | 433 | (151) | 287 | (121), | |||||
baren und max | (128), | 144-G 1 | 229,5 | 144-G 1 | 525 | (133) | |||||
(EW) in MeOH | (412), | 290 | |||||||||
(ausgezogene Linie) | 230 | ( 68), | 239 | (488), | |||||||
in 0,ln HCl-MeOH | 290 | 144-G 1 | 259 | (324), | 318s | (123), | 144-G 2 | ||||
(gestrichelte Linie) | 238 | 433 | (156) | Fig. 13 | (450), | ||||||
in 0,ln NaOH-MeOH, | 318s | (638), | 287 | (100), | (371), | ( 76), | (607), | amorphes | rotes Pulver | ||
(-.-.- Linie) | Fig. 12 | (160), | 525 | (140) | (177) | Fig. 22 | (110), | ||||
Infrarotabsorptions | schwachbasisches | S2 | N | O | |||||||
spektrum (KBr) | Fig. 21 | Pulver | 1,88 | 30,94 | |||||||
NMR-Spektrum (PMR) | S 1 | C | 1,96 | 31,13 | |||||||
MA 144 | 61,37 | (652), | (380), | schwachbasisches | (629), | ||||||
Aussehen | 61,79 | (163), | amorphes gelbes | (192) | (IH), | ||||||
C36H45O | (553), | (141), | C | (606), | |||||||
Elementaranalyse | 699,8 | ( 90), | N | (161) | 60,09 | (210) | |||||
gefunden: | 144-147 | 1,97 | 60,41 | ||||||||
berechnet: | + 77° | 2,00 | C36H45O | ||||||||
Empirische Formel | (C= 1,0, | 715,8 | |||||||||
Molekulargewicht | wie MA | 154-158 | |||||||||
Schmelzpunkt, C | 0,14 | ||||||||||
Spezifische Drehung | - | ||||||||||
Ia] 1Ϊ | wie MA | wie MA | 258,5 | (306), | |||||||
Löslichkeit | Fig. 5 | 0,14 | 491 | (189) | |||||||
RpWerte**) | 230 | ||||||||||
*) C : M = 20 : 1 | 289,5 | wie MA | |||||||||
Reaktion | Fig. 6 | ||||||||||
UV-Absorptionsspek | 234,5 | 258,5 | (318), | ||||||||
trum sowie Absorp | 258,5 | 293 | 491 | (197) | |||||||
tionsspektrum im Sicht | 229,5 | 432 | 566 | (244), | |||||||
baren und max | 289,5 | ||||||||||
(£i:·™) in Methanol | 237,5 | ||||||||||
(ausgezogene Linie) | 320 | 234,5 | |||||||||
in 0,InHCl-MeOH | Fig. 14 | 258,5 | 293 | ||||||||
(gestrichelte Linie) | 431 | 242 | |||||||||
inO.ln in NaOH-MeOH | Fig. 23 | 286 | 606 | ||||||||
(-.-.- Linie) | 524 | Fig. 15 | |||||||||
Infrarotabsorptions | |||||||||||
spektrum (KBr) | Fig. 24 | ||||||||||
NMR-Spektrum (PMR) | |||||||||||
17 | H | CHCl3) | 27 | 43 654 | O | U 2 | 18 | H | amorphes | rotes Pulver | |
U 1 | 6,77 | 144-G 1 | 31,07 | 6,60 | |||||||
MA 144 | 6,68 | 30,85 | schwachbasisches | 6,55 | N | O | |||||
Aussehen | C42H55O16N | amorphes gelbes | I7N | 1,58 | 31,87 | ||||||
829,9 | 144-G 1 | C | 1,65 | 32,15 | |||||||
Elementaranalyse | schwachbasisches | 152-155 | N | 59,26 | |||||||
gefunden: | Pulver | + 31° | (531), | 1,74 | 59,64 | ||||||
berechnet: | C | (c= 1,0, | (135), | 1,69 | C42H55O | ||||||
Empirische Formel | 60,42 | wie MA | 845,9 | 144-G I | |||||||
Molekulargewicht | 60,79 | 0,07 | 160-164 | ||||||||
Schmelzpunkt, C | |||||||||||
Spezifische Drehung | wie MA | (602), | - | 144-G 2 | |||||||
MV | Fig. 7 | (150), | wie MA | ||||||||
Löslichkeif | 230 | (520), | (325), | 0,07 | (452), | ||||||
RrWerte**) | 290 | ( 94), | (164> | (104), | |||||||
*) C : M = 20 : 1 | wie MA | 259 | (247), | ||||||||
Reaktion | Fig. 8 | 492 | (150) | ||||||||
UV-Absorptionsspek | 235 | ||||||||||
trum sowie Absorp | 229,5 | 259 | (365), | 292 | (465), | ||||||
tionsspektrum im Sicht | 289 | 432 | (168) | (103), | |||||||
baren und max | 239 | C.43) | (448), | 259 | (250), | ||||||
(EW) in MeOH | 3(7 | (144) | (164) | 492 | (152 | ||||||
(ausgezogene Linie) | Fig. 16 | 235 | 566 | (200), | |||||||
in 0,ln HCl-MeOH | 259 | 292 | |||||||||
(gestrichelte Lime) | Fig. 25 | 430 | 242 | ||||||||
in OJn NaOH-MeOH | 285 | 606 | |||||||||
(-.-.- Linie) | 522 | Fig. 17 | |||||||||
Infrarotabsorptions | |||||||||||
spektrum (KBr) | Fig. 26 | ||||||||||
NMR-Spektrum (PMR) | |||||||||||
ΜΛ 144
Aussehen Elcmenlaranalyse
gefunden:
berechnet: Empirische Formel Molekulargewicht Schmelzpunkt, C Spezifische Drehung
IaI η
Löslichkeit Ri-Werte**) *) C : M - 20 : 1
Reaktion
schwuchbusischcs | 11 | l) | amorphes | gelbes Pulve |
C | 6,30 | 1 | N | C) |
61,98 | 6,35 | 1,70 | 30,02 | |
62,29 | 1 | 1,73 | 29,63 | |
C4jll,,Ο | ||||
810 | ||||
153-155 | ||||
+ 66° | CIICI | |||
(<■ 1,0, | 144-Ci | |||
wie MΛ | ||||
(1.17 | 144-Ci | |||
wie MA | ||||
Fortsetzung
MA 144
UV-Absorptionsspektrum sowie Absorptionsspektrum im Sichtbaren und max
(£!:·.) in MeOH
(ausgezogene Linie)
in 0,In HCl-MeOH (gestrichelte Linie)
in 0,ln NaOH-MeOH (-.-.- Linie)
Infrarotabsorotionsspektrum (KBr)
NMR-Spektrum (PMR)
Die Struktur der erfindungsgemäßen Substanzen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2, -Ul, -U2 sowie -Y
wird wie folgt bestimme
Bei der sauren Hydrolyse mit 0,1m Chlorwasserstoffsäure
während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei : 85°C werden physikalisch-chemische Eigenschaften
ermittelt, wie die Absorptionsspektren im UV, im Sichtbaren und im Infraroten, die Massenresonanz und
die kernmagnetische Resonanz, der Schmelzpunkt, die Elementaranalyse und die Rr-Werte auf eine kieselsäu- s<
redünnschicht, des Aglyconteils, erhalten aus MA144-G1. -L, -NI, -Sl, -Ul sowie -Y, die mit den
physikalisch-chemischen Eigenschaften von Aklavinon (Tetrahedron Lett. Nr. 8, 28-34, 1960) zusammenfallen.
Ferner fallen die Eigenschaften des Aglyconteils, der aus ι MA144-G2, -S2 und -U2 erhalten wird, vollständig mit
denjenigen von ε-Pyrromycinon (Chem. Ber. 92.
Ri-Werte des Zuckeranteils von MA 144-Komponenten
Fig. 9 | (580), | 259 | (320) |
229,5 | (126), | 432 | (158) |
290 | |||
229,5 | (590), | 259 | (334) |
290,5 | (130), | 433 | (160) |
239 | (497), | 287 | (133) |
320s | ( 82), | 524 | (138) |
Fig. 18 | |||
Fig. 27 |
1880-1903, 1959) zusammen. Ferner werden die Zuckeranteile, die in der wasserlöslichen Fraktion der
vorstehend beschriebenen Hydrolysate vorliegen, durch Kieselsäuredünnschichtchromatographie (Merck Co.
6OF254 Kieselsäureplatte, n-Butanol zu Essigsäure zu
Wasser =4:1:1) nach einer Neutralisation und Konzentration bestimmt, wobei die Rf-Werte mit
denjenigen der authentischen Zucker verglichen werden, die aus \clacinomycin A (J. Antibiotics, 28,
830-834, 1975) und Streptolydizin (). Amer. Chem. Soc. 86, 3592-3594, 1972) erhalten werden. Die
Rr-Werte der Zuckeranteile, die aus MA144-Komponenten erhalten werden, sind in der folgenden Tabelle
zusammengefaßt. Es liegen drei Arten von Zuckern in MA144-G1, -G2, -L, -Y und -Nl und zwei Arten von
Zuckern in MA144-S1, -S2, -Ul und -U2 vor.
Verbindungen
RrWcrt 0,16
0,20 0.60
0,72
0,83
0,78
MA 144-G 1
-G 2
-L
-G 2
-L
-N 1
-S 1
-S 2
-U I
-U 2
-Y
-S 1
-S 2
-U I
-U 2
-Y
Ein Vergleich mit den Rf-Werten, verschiedenen
Farbreaktionen sowie der optischen Drehung der authentischen Zucker zeigt, daß ein Zuckcrantcil
entsprechend Ri = 0,16 als I.-Rhodosamin identifiziert
werden kann. R( = 0,60 ><·-ι ?-Desoxy-1.-fucose. Rt = 0.72
ist l.-Rhodinosc und ;.( —u.rfj ist L-Cincrulosc. Demgegenüber
sind die Zucker mil R. = 0.20 und 0.78 unbekannt.
f.ine partielle Methanolyse von MA 144-Komponcnten
in Methanol mit Zimmertemperatur, das 0,01η Chlorwasscrstoffsäiire einhalt, liefern MA144-G1, -Nl,
-Sl, -Ul und -Y 1-Desoxypyrromycin (L-Rhodosaminylaklavinon,
|. Antibiotics, 28, 830-834, 1975), das
auf der Grundlage seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie seines Rf-Wertes bei der Durchführung
einer Kieselsäuredünnschichtchromatographie, des Schmelzpunktes, der Absorptionsspektren im iR,
UV und sichtbaren Licht sowie des NMR-Spektmms, identifiziert wird, und die entsprechenden Methylsaccharide
MA144-G2, -S2 und -IJ2 ergeben Pyrromycin
(Chem. Ber. 92. 1880-1903. 1959) sowie die entsprechenden Methyl.iaccharide, und MA144-L ein unbekanntes
Anthracyclinglycosid sowie das entsprechende Methyldisacchand.
Die folgende allgemeine Formel beruht auf der Tatsache, daD D-Cinerulosyl-2-desoxy-L-fuxosyl-L-rho-
dosaminyl-aklavinon und -ε-pyrromycinon von MA144-G1 und -G2 anhand der NMR-Spektren,
13C-NMR-Spektren sowie IR-Spektren dieser Verbindungen
sowie der Methyldisaccharide davon untersucht werden:
R O COOCH.,
j CH2CH.,
^ OH
O=;
CH,
MA144-S1 und -S2 enthalten zwei Arten von Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin und 2-Desoxy-L-fucose.
Methyl-2-desoxy-L-fucosid und 1-Desoxypyrromycin oder Pyrromycin werden durch Methanolyse
gebildet. Auf diese Weise wird die folgende 2-Desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl-aklavinon-
oder -e-pyrromycinonstruktur für MA144-S1 und -S2 ermittelt.
R O
HO
COOCH., ! CH2CH.,
OH
OH
MAl 44-Gl :R = H MA144-G2:R = O
MA144-SI :R = H MA144-S2:R = O
MA144-L besteht aus Aklavinon und drei Zuckeranteilen,
und zwar einem unbekannten Aminozucker mit einem Rr-Wert von 0.20, 2-Desoxy-L-fucose und
L-Cinerulose. Eine Analyse der NMR- und 13C-NMR-Spektren
von Aklavinonglycosid sowie dem Methyldisaccharid, das aus MA144-L durch Methanolyse
erhalten wird, zeigt, daß es sich urn N-Monodimethyl-L-rhodosaminylaklavinon
sowie Methylcinerulosyl-2-desoxy-L-fucosid,
jeweils erhalten aus Aclacinomycin A, handelt.
Die chemische Struktur von MA144-L wird wie folgt ermittelt:
Ci)OCH3 ; CH2CHj
7 —OH
O OH
MA144-N1 besteht aus Aklavinon und drei Arten von
Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin, 2-Desoxy-L-fucose und L-rhodinose. Zur Bestimmung der Zuckersequenz
wird eine milde Hydrolyse in einer 0.5%igen Chlorwasserstoffsäure bei Zimmertemperatur während
einer Zeitspanne von 10 Minuten nach der Methode von Biedermann et al. (Pharmazie, 27. 782-789, 1972]
durchgeführt. L-Rhodinose wird freigesetzt. Gleichzeitig wird MA144-S1 gebildet. Daher läßt sich die
chemische Struktur von MA144-N1 wie folgt ermitteln:
COOCH3
CH2CH3
OH
CH,
MAI44-L
CH3
MAl 44-Nl
MA144-U1 und -U2 enthalten zwei Arten von
Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin und 2- Desoxy-L-fucose. Bei der Methanolyse wird durch NMR- und
l3C-NMR-Spektren Methyl^-desoxy-L-fucosyl^-desoxy-L-fucosid
ermittelt. Ferner wird 1-Desoxypyrromycin oder Pyrromycin gebildet, so daß folgende Struktur
vorgeschlagen wird.
COOCH,
CH2CH.,
OH
CH3
gefunden: | C 57,77%. H 7,31% |
berechnet: | C 57,34%, H 7,40% |
Molekulargewicht: | 272 |
Schmelzpunkt: | 109bisll0"C |
Optische Drehung: | [«]? =65° |
(C=IACHCl3) | |
Absorptionsspektren im | |
UV und sichtbaren Licht | |
in Methanol: | Fig.2Ml\OH nm |
(ε)=209 (6726) | |
Infrarotabsorptions | |
spektrum in KBr: | Fig. 29 |
NMR-Spektrum in CDCI3: | F ig. 30 (100 MHz) |
Wie aus den Fig.28 und 29 hervorgeht, weist das
Methyldisaccharid von MA144-Y eine Absorption bei 1680 cm-' auf. λ^"" nm (ε): 209 (6726) woraus das
Vorliegen einer «^-ungesättigten Ketogruppe in der Struktur hervorgeht
Gemäß dem Protonen-NMR in Fig. 30 wird ein 3-Protondublett bei
<5 1,26 (J =6,8 Hz), ein 2-Protonen bei 6 1,9, ein doppeltes 1 -Proton-Dublett bei ό 3,74 (J = 1
und 3Hz), ein 1-Protonen-Quartett bei ό 3,94 (J =6,8),
ein 1-Proton bei (5 4,07 und 1-Proton bei 0 4,8 den 9
Protonen von 2-Desoxy-L-fucose und ein 3-Protonen-Dublett bei ό 1,4 (J =6,8 Hz) und ein symmetrisches
1-Protonen-Quartett bei 04,73 (J=6,8Hz), wobei die
Abschirmung durch das Äthersauerstoffatom beseitigt wird, und wobei eine Kupplung untereinander erfolgt,
den Methylprotonen bei C-6' bzw. dem Proton bei C-5' zugeordnet. Spinnentkupplungsversuche zeigen, daß ein
Dublett bei δ 6,86 (J = 3,5 und 10,0 Hz) und zwei Dubletts
bei 0 6,11 (J = IO1OHz) und ό 5,26 (J = 3,5 Hz) den
Vinylprotonen des ABM-Systems entsprechend den Protonen bei C-2', C-3' bzw. C-Γ zugeordnet werden
können. Auf diese Weise kann ein Zuckeranteil, der nicht aus 2-Desoxy-L-fucose in dem Methyldisaccharid
besteht, als 2,3,6-Tridesoxyhex-2-enopyranos-4-ulose, die mit dem C-4 von 2-Desoxy-L-fucose verknüpft ist,
identifiziert werden.
Aus den vorstehenden Analyseergebnissen geht hervor, daß das Methyldisaccharid ein neuer Zucker der
folgenden Struktur ist:
OCH3
OH
MAI44-U1 :R = H MA144-U2:R = OH
MA144-Y besteht aus Aklavinon und drei Arten von
Zuckeranteilen, und zwar L-Rhodosamin, 2-Desoxy-L-fucose und einem unbekannten Zucker. Ferner werden
1-Desoxypyrromycin und ein unbekanntes Methyldisaccharid aus MA144-Y durch Methanolyse erhalten.
Dieses Methyldisaccharid wird mit Äther extrahiert und durch Säulenchromatographie unter Einsatz von Kieselsäure
und Sephadex LH-20 (Warenzeichen) gereinigt und dann in Form von weißen Nadeln aus Benzol
auskristallisiert. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des methylierten Disaccharids sind wie folgt:
Elementaranalyse für C13H20O6:
Der endständige Zucker wird als Aculose bezeichnet. Die chemische Struktur von Ma 144-Y gemäß
vorliegender Erfindung wird wie folgt ermittelt:
COOCH3
CH2CH3
OH
CH3
Einige Anthracyclinglycosidantibiotika mit Aklavinon- und ε-Pyrromycinonaglyconanteilen sind bekannt
Der Verbindungen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl, -S2,
-Ul, -U2 und -Y unterscheiden sich deutlich von allen diesen Verbindungen im Hinblick auf die Formel des
Moleküls, die Abbauprodukte bei der Säurehydrolyse,
die Spektren im UV, sichtbaren und Infrarotbereich od. dgl., wie vorstehend erläutert worden ist. Von den
bekannten Anthracyclinglycosiden bestehen Aklavin und Pyrromycin aus Alkavinon oder e-Pyrromycinon
und einem Zucker, und zwar L-Rhodosamin, wodurch sie sich von den erfindungsgemäßen Verbindungen
unterscheiden. Aclacinomycin A und Cinerubin A bestehen aus drei Zuckeranteilen, und zwar L-Cinerulosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl.
MA144-M1 und -M2 (DE-OS 27 15 255) bestehen ebenfalls aus drei ι
Zuckeranteilen, und zwar L-Amicetosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl,
während Rhodirubin B (US-PS 4127 714) aus L-Rhodinosyl-L-rhodinosyl-L-rhodosaminyl)
besteht. Diese drei bekannten Antibiotika unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Verbin- ι
düngen auf der Grundlage des Zuckeranteils. Der
Antimikrobielles Spektrum der MA 144-Komponenten
Zuckeranteil von Rhodirubin A besteht aus L-Rhodinosyl-2-desoxy-L-fucosyl-L-rhodosaminyl
wie im Falle des Zuckeranteils von MA144-N1 gemäß vorliegender
Erfindung, das Aglycon von MA144-N1 besteht jedoch
aus Aklavinon und unterscheidet sich von dem e-Pyrromycinon von Rhodirubin A.
Daraus geht hervor, daß die Verbindung MA144-G1,
-G2, -L, -NI, -Sl, -S2, -Ul, -U2 und -Y gemäß vorliegender Erfindung neue Substanzen sind.
MA144-G1, -G2, -L, -Sl, -S2, -Nl, -UI, -U2 und -Y zeigen antimikrobielle Aktivitäten gegenüber verschiedenen
Arten von Mikroorganismen. Die minimale inhibierende Konzentration der erfindungsgemäßen
Antibiotika, ermittelt nach der Methode der Verdünnung der Brühe, gehen aus der folgenden Tabelle
hervor.
Testmikroorganismus
Minimal inhibierende Konzentration, mcg/ml
MA 144-
Gl G2 L Nl Sl
S 2
U 1
U2
Staph. aureus FDA 209 P | 6,25 | 3,12 | 6,25 | 6,25 | 6,25 | 6,25 | 6,25 | 3,1 | 0,4 |
Staph. aureus, Smith | 1,56 | 1,56 | 1,56 | 0,78 | 3,1 | 0,78 | 3,1 | 0,78 | 0,2 |
Bac. subtilis ATCC 6633 | 3,12 | 1,56 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 0,2 |
Bac. cereus ATCC 9634 | 1,56 | 0,78 | 1.56 | 0,78 | 1,56 | 0,78 | 1,56 | 1,56 | 0,1 |
Bac. megaterium NRRL B-938 | 6,25 | 6,25 | 6,25 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 3,1 | 1,56 | 0,2 |
Sar. lutea ATCC 9341 | 0,78 | 0,78 | 0,78 | 0,78 | 1,56 | 1,56 | 1,56 | 1,56 | 0,2 |
Mic. flavus | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 1,56 | 0,78 | 1,56 | 0,78 | 0,1 |
Cory, bovis 1810 | 1,56 | 0,78 | 1,56 | 0,78 | 0,78 | 0,78 | 6,25 | 6,25 | 0,2 |
Ps. fluorcscens NIHJB-254 | 100 | 100 | 100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 |
Pr. morganii | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >10& | >100 | >100 |
Mycobact. smegmatis | 3,12 | 3,12 | 3,1 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | 3,1 |
ATCC 607 | |||||||||
Can. albicans IAM 4905 | 100 | >100 | 100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 |
Can. tropicalis IAM 4942 | 100 | >I00 | 100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 |
Wie aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, besitzen die MA144-Komponenten gemäß vorliegender
Erfindung eine antimikrobielle Aktivität insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien. Sie sind daher
therapeutisch geeignet zur Behandlung von Säugetieren, und zwar zur Behandlung von Diphtherie,
Tuberkulose, Lungenentzündung, Tetanus sowie anderen Infektionskrankheiten, die durch grampositive
Bakterien verursacht werden.
Die erfindungsgemäßen MA144-Komponenten zeigen eine ausgeprägte Antitumoraktivität bei geringer
Toxizität bei der Durchführung von Tiertests. Sie sind daher therapeutisch wertvoll zur Inhibierung des
Wachstums von Säugetiertumoran. Insbesondere besitzen
die erfindungsgemäßen Verbindungen eine ausge-
Verlängerung der Überlebenszeit (% T/C)
prägt inhibierende Wirkung auf die Mäuseleukämie L1210. So wurden BDFi-Mäuse mit einem Gewicht von
19 bis 22 g intraperitoneal mit IxIO6 L1210-Zellen/
Maus beimpft. 24 Stunden nacii der Beimpfung wird die jeweilige Verbindung intraperitoneal einmal täglich
während 9 aufeinanderfolgenden Tage eingespritzt. Am 30. Tag wird der Prozentsatz der Verlängerung der
Überlebenszeit gegenüber Vergleichstieren ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tahelle hervor,
und zwar zusammen mit den LD50-Werten nach einer einfachen intraperitonealen Injektion.
Die therapeutische Wirkung gegenüber Mäuseleukämie L1210 sowie die Toxizität der MA144-Komponenten
sind nachfolgend aufgefüh"L
Verbindungen
MA 144-Gl G 2
N S2
U 1
U2
Anti-L 1210-Aktivitätsdosis,
mg/kg/Tag
mg/kg/Tag
135
108
65
143
143
Fortsetzung | MA 144- | G 2 | 27 43 | 654 | S 1 | S2 | 28 | U 2 Y | |
27 | Verbindungen | G 1 | |||||||
Anti-L 1210-Aktivitätsdosis, | 90 | 140 | 85 | U 1 | 86 127 | ||||
mg/kg/Tag | 187 | 130 | L | N 1 | 168 | 110 | 86 115 | ||
5 | 215 | 164 | 133 | 145 | 112 | ||||
2,5 | 145 | 140 | 114 | 130 | 127 | 135 | |||
1,25 | 130 | 108 | 128 | 200 | 96 | 118 | 165 | 129 | |
0,6 | 118 | 97 | 114 | 184 | - | 97 | 157 | 110 | |
0,3 | 101 | 95 | 137 | 129 | |||||
0,15 | LDs0 | 17 | - | 123 | 24,4 | 12,5 | 114 | 4,5 40-50 | |
Toxizität (Maus) | 28,5 | - | 110 | - | |||||
Intraperitoneale Verabreichung, | - | - | |||||||
mg/kg | 30,2 | ||||||||
,0 45,5 | 32,5 | ||||||||
Die erfindungsgemäßen MA144-Komponenlen inhibieren
das Wachstum von Säugetiertumorzellen in Kultur, insbesondere bei geringer Konzentration, und
inhibieren vollständig eine RNA-Synthese. Zur Durchführung dieses Experiments werden LI210-Zellen auf
ein RPMI 1640-Medium (Nissui, Rosewell Park Memorial Institute 1640) aufgeimpft, das 20% Kalbsserum
enthält. Das Züchten erfolgt bei 37°C während einer Zeitspanne von 3 Tagen in einem COi-lnkubator.
In einer Konzentration von 0,1 ng/ml werden die
erfindungsgemäßen Verbindungen am Tag 1 zugesetzt. Bei der Durchführung des uC-lnkorporationsversuchs
werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 0,5 »g/ml zur Durchführung einer
RNA-Synthese und 1,0ng/ml zur Durchführung einer DNA-Synthese zugesetzt, ferner wird !4C-Thymidin
oder -Uridin dem Medium während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei 37°C zugegeben. Die Wirkungen auf
das Wachstum sowie die Synthese von DNA und RNA gehen aus dem Prozentsatz der Inhibierung im
Vergleich zu einer Vergleichsprobe hervor. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle zusammengefaßt. Aus den Ergebnissen ist zu ersehen, daß MA144-Komponenten merklich das
Wachstum up^ die RNA-Synthese von gezüchteten
L1210-Zellen bei geringer Konzentration inhibieren. Diese Ergebnisse untermauern die therapeutische
Wirksamkeit, die bei der Behandlung von Tiertumoren festgestellt worden ist.
Wirkungen von MA144-Komponenten auf das Wachstum und die makromolekulare
Synthese von gezüchteten L1210-Zellen
Verbindungen | % Inhibierung | Synthese von | DNA |
Wachstum | RNA | 69,6 | |
(am Tag 2) | 81,6 | 40,9 | |
Aclacinomycin | 89,7 | 65,6 | 39,4 |
MA 144-G 1 | 80,7 | 57,8 | 11,3 |
-G 2 | 82,1 | 39,7 | 57,4 |
-L | 27,4 | 74,4 | 76,5 |
-N 1 | 79,2 | 74.1 | 48,8 |
-S 1 | 86,0 | 65,6 | 27,7 |
-S 2 | 88,1 | 67,2 | 30J |
-U 1 | 78,5 | 71,5 | 99,6 |
-U 2 | 80,5 | 93,9 | |
-Y | 90,2 | ||
Wie vorstehend erwähnt, sind die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen MA144-G1, -G2, -L, -Nl, -Sl,
-S2, -Ul, -U2 sowie -Y neue Antibiotika, die sich als wertvolle Substanzen in der Human- und Veterinärmedizin
einsetzen lassen und auch eine ausgeprägte inhibierende Wirkung gegenüber bösartigen Säugetiertumoren
sowie gegenüber grampositiven Bakterien zeigen.
In den Rahmen der Erfindung fallen daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die wenigstens eines
der Anthracyclinglycoside gemäß Anspruch 1 mit einem
verträglichen pharmazeutischen Träger enthalten. Die Zubereitungen können in jeder pharmazeutischen Form
hergestellt werden, die der jeweiligen Verabreichung angepaßt ist Beispiele für derartige Zubereitungen sind
feste Zubereitungen für eine orale Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate,
flüssige Zubereitungen für eine orale Verabreichung, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere sowie
Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung, wie sterile Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden nicht-
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden nicht-
toxische Säureadditionssalze mit einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren. Daher können
Säureadditionssalze, die mit derartigen pharmazeutisch verträglichen Säuren gebildet werden, wie Schwefelsäure,
Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäure. Zitronensäure.
Bernsteinsäure, Weinsäure. Glutaminsäure, Pantothensäure in der gleichen Weise wie die MA144-Verbindungen
per se eingesetzt werden.
Die bevorzugten Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen hängen von der jeweils eingesetzten
Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung, der Verabreichungsart sowie der jeweiligen Stelle, dem
Krankheitsträger und der zu behandelnden Krankheit ab. Im allgemeinen werden die MA144-Verbindungen
intraperitoneal, intravenös, subkutan oder lokal eingespritzt oder oral an Tiere verabreicht. Ferner ist eine
intravenöse, intraperitoneale, lokale oder orale Verabreichung an Menschen möglich. Viele Faktoren, welche
die Wirkung des Wirkstoffes modifizieren, sind zu berücksichtigen, beispielsweise das Alter, das Körpergewicht,
das Geschlecht, die aufgenommene Nahrung, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Ausscheidungsmenge,
der Zustand des Patienten, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeit sowie
die Schwere der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch unter Berücksichtigung
der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Die optimalen Verabreichungsmengen für bestimmte Zustände
lassen sich unter Anwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests ermitteln.
Bei einer Verwendung als antibakterielle Mittel werden die MA144-Verbindungen im allgemeinen in der
Weise verabreicht, daß die Konzentration des Wirkstoffs größer ist als die minimal inhibierende Konzentration
für den jeweils zu behandelnden Organismus.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
A) Ein Nährmittelmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
Glukose | 2% |
Kartoffelstärke | 2% |
Sojabohnenpulver | 2% |
K2HPO4 | 0,1% |
MgSO4 · 7 H2O | 0,1% |
NaCl | 0,3% |
MnCl2 · 4 H2O | 0,0008% |
CuSO4 · 7 H2O | 0,0007% |
FeSO4 · 7 H2O | 0,0001% |
ZnSO4 · 7 H2O | 0,0002% |
pH | 7,2 |
50 ml dieses Mediums werden bei 1200C während
einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500-ml-Kolben
sterilisiert, der mit 1 ml einer gefrorenen Kultur von Streptomyces galilaeus MA144-M1 (FERM P-2455)
ATCC 31133 beimpft worden ist. Die Bebrütung erfolgt
während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 300C auf
einem Rotationsschüttler. 101 des in der vorstehend beschriebenen Weise sterilisierten Mediums in einem
20-1-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl werden aseptisch mit 200 ml der vorstehend beschriebenen
Impfkultur beimpft. Die Fermentation wird bei 28°C während einer Zeitspanne von 18 Stunden unter Rühren
(300 UpM) und Belüftung (5 l/min) durchgeführt. Dann werden 101 dieser Kultur zu 6001 des vorstehend
beschriebenen sterilisierten Mediums in einem Stahltank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen
von 20001 gegeben und bei 28° C während einer Zeitspanne von 36 Stunden unter Rühren (180UpM)
und Belüftung (300 l/min) gezüchtet.
580 1 der erhaltenen Kulturbrühe werden auf einen pH von 5,0 mit Schwefelsäure eingestellt und unter
Einsatz von Diatomeenerde filtriert. Der erhaltene Filterkuchen (56 kg) wird in 50 1 Aceton suspendiert und
nach einem Rühren während einer Zeitspanne von 1 Stunde filtriert. Der Rückstand wird mit 501 Aceton
reextrahiert. Beide Extrakte werden auf 251 unter vermindertem Druck konzentriert und zu 20 1 Äthylacetat
gegeben und gerührt Nach einem Abtrennen der Äthylacetatschicht und einem Einengen auf 1 1 unter
vermindertem Druck wird ein rohes MA144-Gemisch durch Zugabe von 15 1 η-Hexan zu dem Konzentrat
ausgefällt, worauf 36 g eines roten Pulvers nach einem zweimaligen Waschen mit n-Hexan erhalten werden.
Das vorstehend beschriebene Kulturfüirat wird auf einen pH von 6,8 mit Natriumhydroxid eingestellt und
mit 1001 Toluol extrahiert. Der Extrakt wird auf 101
unter vermindertem Druck konzentriert und mit 101 Acetatpuffer mit einem pH von 3,5 reextrahiert. Die
erhaltene wäßrige Schicht wird auf einen pH von 6,8
:■-, eingestellt, erneut mit 4 1 Toluol extrahiert und dann
unter vermindertem Druck auf 30 ml konzentriert. Ein rohes MA144-Gemisch wird durch Zugabe von 300 ml
η-Hexan zu dem Konzentrat ausgefällt. Man erhält 2,5 g eines roten Pulvers.
so B) 10 g des roten MA144-Gemisches, das aus dem
Filterkuchen gemäß Verfahrensstufe A) erhalten worden ist, werden in 100 ml Toluol aufgelöst und einer
Säulenchromatographie in einer Säule mit einer Größe von 5 χ 40 cm unterzogen, die mit 300 g Kieselsäure
j-, gefüllt ist. Nach dem Verwerfen des anfänglichen Eluats,
das unter Einsatz von 1.5% Methanol enthaltendem Toluol gewonnen worden ist, werden MA144-G1-, -G2-
und -L-Fraktionen nacheinanderfolgend mit 2% methanolenthaltendem Toluol eluiert. Dann wird die MA144-Nl-Fraktion
mit 3% methanolenthaltendem Toluol sowie MA144-S1- und -S2-Fraktionen sowie MA144-U1- und -U2-Fraktionen mit 5% methanolenthaltendem
Toluol nacheinanderfolgend eluiert. Nach einem Konzentrieren einer jeden vorstehend erhaltej
nen Fraktion werden rohe orangerote Pulver aus einem Gemisch aus MA144-G1- und -G2 in einer Menge von
210 g, einem Gemisch aus 190 mg MA144-L, 570 mg MA144-N1 und Rhodirubin A, 360 mg eines Gemisches
aus MA144-S1 und -S2 sowie 270 mg eines Gemisches
,ο aus MA144-U1 und -U2 durch die Zugabe von n-Hexan
erhalten.
C) 2,5 g des aus dem Kulturfiltrat wie in Verfahrensstufe A erhaltenen MA144-Rohpulvergemisches werden
in 6 ml Toluol gelöst und einer Säulenchromatographie unter Einsatz einer Säule unterzogen, die mit 100 g
Kieselsäure gefüllt ist. Dann wird die MA144-Y-Fraktion mit 1,7% methanolenthaltendem Toluol bei 5°C
eluiert. Die erhaltene Fraktion wird zur Trockne untei vermindertem Druck eingedampft. 400 mg ΜΑ144Λ
werden in Form eines orangeroten Pulvers erhalten.
D) 210 mg eines gemäß Verfahrensstufe B) erhalte nen Gemisches aus M A144-G1 und -G2 werden in eine
kleinen Menge Äthylacetat aufgelöst und einer Sau lenchromatographie unter Verwendung einer Säuli
unterzogen, die mit 30 g Column-Lite® (Warenzeichen Fuji Chem. Co. für Kieselsäure) gefüllt ist. Dann erfolg
eine Eluierung mit einem Gemisch aus Äthylacetat un< Methanol (1 : 1). Die gelbe Fraktion wird zur Trockni
unter vermindertem Druck konzentriert Der erhaltene Rückstand wird in 50 ml Chloroform aufgelöst und mit
50 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung, die 10~3 Mol EDTA enthält, zur Entiemung der restlichen Metallionen
geschüttelt. Die Giloroformschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 110 mg eines
gelben Pulvers aus MA144-G1.
Die vorstehend beschriebene, mit Column-Lite® gefüllte Säule wird nach der Eluierung der gelben
Fraktionen mit eine 10-3MoI EDTA-enthaltenden
30%igen Methanolgemisch behandelt. Das erhaltene rote Eluat wird zur Trockne eingedampft und in einer
kleinen Menge Chloroform aufgelöst. Restliche Metallionen werden nach der vorstehend beschriebenen
Methode entfernt. Man erhält 22 mg MA144-G2 in
Form eines roten Pulvers (EDTA = Äthyiendiamintetraessigsäure).
Rohes MA144-L-Pulver gemäß Verfahrensstufe B) wird in der gleichen Weise, wie sie vorstehend für
MA144-G1 beschrieben worden ist, behandelt, wobei man 150 mg eines gelben MA144-L-Pulvers erhält.
Nach der vorstehend zur Reinigung von MA144-G1 und
-G2 beschriebenen Reinigungsmethode erhält man 260 mg gereinigtes MA144-Nl-Pulver, 150 mg
MA144-S1.88 mg MA144-S2,128 mg MA144-U1,54 mg
MA144-U2 und 114 mg MA144-Y.
Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in der
nachfolgend beschriebenen Weise unter Einsatz der angegebenen Streptomyces-Stämme erhalten.
Stämme
Erhaltenes MA 144, mg Gl G2 L N 1
S 1
S2
U 1
U2
S. galilaeus ATCC 14969
S. sp. ME 505-HE 1
(FERM P-3667), ATCC 31273
S. cinereoruber ATCC 19740
S. niveoruber ATCC 14971
S. antibioticus ATCC 8663
S. purpurascens ATCC 25489
S. niveoruber ATCC 14971
S. antibioticus ATCC 8663
S. purpurascens ATCC 25489
S. = Streptomyces
42
25
68 | 55 | 126 | 63 | 145 | 115 | 63 | 43 |
- | - | - | 143 | 89 | 97 | 101 | - |
37 | 38 | 76 | 88 | 79 | 27 | 83 | 16 |
56 | - | 43 | 54 | 38 | - | 64 | 12 |
28 | - | - | - | 18 | - | 32 | - |
13 | _ | _ | 9 | 14 |
Ein Gemisch aus Lebern, die aus fünf männlichen, 500 g wiegenden Meerschweinchen isoliert worden
sind, und 10 Volumina 1OmM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer
(pH 7,8), enthaltend 1OmM Magnesiumchlorid und 0,25 Mol Rohrzucker, wird unter Verwendung einer Teflon®-Homogenisierungsvorrichtung
homogenisiert und bei 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten zentrifugiert. 400 ml der
überstehenden Flüssigkeit werden mit 50 ml 4 mg/ml Adacinomycin A und 50 ml 6 mg/ml NADP (Nicotinamidadenindinucleotidphosphat)
vermischt, worauf jeweils 50 ml in 500-ml-Kolben verteilt und bei 40°C
während einer Zeitspanne von 1 Stunde in einem Rotationsschüttler bebrütet werden. Die Reaktion wird
durch die Zugabe von 2 Volumina eines kalten Gemisches aus Chloroform und Methanol (1 : 1)
beendet. Diese Lösung wird gut vermischt und von der Chloroformschicht abgetrennt. Die zurückbleibende
aktive Fraktion in der wäßrigen Schicht wird mit einem gleichen Volumen Chloroform reextrahiert. Beide
Chloroformschichten werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert, auf Kieselsäuredünnschichtplatten aufgebracht und mit einer Mischung aus
Chloroform und Methanol (10:1) entwickelt. Nach der Chromatographie wird das MA144-N1 entsprechende
Band abgekratzt, worauf MA144-N1 mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (10 : 1)
extrahiert und unter vermindertem Druck konzentriert wird. Man erhält 62,3 mg eines gelben Pulvers aus
MA144-N1. F. 146°C [λ] + 57,5° (c= 0,4, CHCI3).
1 g Adacinomycin A wird in 40 ml Äthylacetat gelöst,
mit 40 ml Wasser, das 100 mg Natriumborhydrid enthält, vermischt und kräftig während einer Zeitspanne
von 20 Minuten bei Zimmertemperatur in einem Scheidetrichter geschüttelt. Man läßt die Reaktionsmischung
stehen, worauf die Äthylacetatschkht abge-5 trennt wird. Der Extrakt wird mit der NaCI-gesättigten
Lösung gewaschen, die 10~3 Mol EDTA enthält, zweimal mit Wasser gewaschen und dann nach einer
Dehydratisierung mit wasserfreiem Natriumsulfat konzentriert. Nach einer Kieselsäuresäulenchromatogra-
-,n phie (3 χ 20 cm Säule) unter Verwendung eines Gemisches
aus Toluol und Methanol (100:3), werden die aktiven Fraktionen, die MA144-N1 enthalten, zusammengeschüttet,
konzentriert und zu η-Hexan gegeben. Man erhält 250 mg MA144-N1 in Form eines gelben
Pulvers. F. 147°C [«]■ +57,50^=OACHCl3).
400 mg des gemäß Beispiel 4 erhaltenen MA144M1 werden in 100 ml einer 0,5%igen Chlorwasserstoffsäure
bo aufgelöst und bei 200C während einer Zeitspanne von
15 Minuten hydrolysiert. Nach einer Neutralisation mit verdünntem Alkali auf einen pH von 7,0 wird MA144-S1
zweimal mit 200 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten werden zusammengegossen und unter
b5 vermindertem Druck konzentriert. Aktive Fraktionen,
die MAl44-Sl enthalten, werden durch eine Kieselsäurechromatographie
(3 χ 25-cm-Säule) unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Toluol (5 : 1001
erhalten, zusammengegossen, konzentriert und zu η-Hexan gegeben. Man erhält 237 mg eines gelben
MA144-S1-Pulvers. F. 145°C [α]!:'+77°C (c=l,0,
CHCl3).
Ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
Lösliche Stärke | 1% |
Sojabohnenpulver | 2% |
Hefeextrakt | 0,3% |
K2HPO4 | 0,1% |
MgSO4 · 7 H2O | 0,1% |
MnCl2 · 4 H2O | 0,0005% |
FeSO4 · 7 H2O | 0,0005% |
pH | 7,7 |
50 ml dieses Mediums werden bei 120°C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500-ml-Kolben
sterilisiert, der mit Streptomyces galilaeus
MA144-M1 (ATCC 31133) beimpft worden ist und bei 280C während einer Zeitspanne von 3 Tagen auf einem
Rotationsschüttler bebrütet.
Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert und auf einen pH von 7,2 unter Verwendung von 1 η Natriumhydroxid
eingestellt. Der überstehenden Lösung wird Ammoniumsulfat bis zu einer 50%igen Sättigung
zugesetzt, worauf man Has Gemisch über Nacht bei 80C
stehenläßt. Nach einem Zentrifugieren wird der erhaltene Niederschlag in 300 ml eines 0,01 m Tris-HCI-Puffers
(pH 7,2) aufgelöst und gegen das 40fache Volumen des vorstehend beschriebenen Puffers über
Nach; bei 8° C in einem Collodiumbeutel dialysiert.
Ungefähr 1000 Einheiten/ml einer rohen Enzymzubereitung werden erhalten.
Die Enzymreaktion zur Gewinnung von MA144-V wird in der folgenden Weise durchgeführt: 1 g
Aclacinomycin A wird in 20 ml Methanol aufgelöst,
ίο worauf 10 ml 0,05 π HCl, gemischt mit 200 ml 1 m Citratpuffer
(pH 5,5), 80 ml der vorstehend hergestellten rohen Enzymlösung und 4000 ml destilliertes Wasser
zugesetzt werden. Jeweils 100 ml der Reaktionsmischung werden in 500-ml- Kolben verteilt und während
einer Zeitspanne von 5 Stunden bei 28°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Die Reaktionsmischung
wird auf einen pH von 6,8 mit 1 n-Natriumhydroxid eingestellt, mit 1 I Toluol extrahiert und unter
vermindertem Druck auf 30 ml konzentriert. Der durch die Zugabe von 300 ml η-Hexan zu dem Konzentrat
erhaltene Niederschlag besteht aus 0,95 g eines zu 90% reinen Pulvers von MA144-Y. Dieses rohe MA144-Y-Pulver
wird in dem 5fachen Volumen Toluol aufgelöst und einer Kieselsäuresäulenchromatographie (Wako
2"> Gel® C-200, 100 g) unterzogen, wobei mit 1,7%
Methanol enthaltendem Toluol bei 5°C Chromatographien wird. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden
zur Trockne konzentriert. Man erhält 0,82 g reines MA144-Y in Form eines gelben Pulvers.
Hicr/u 30 IJhiii Zci
Claims (1)
- Patentansprüche:t. Anthracyclinglycoside der Gruppe MA 144- der allgemeinen FormelR1 O COOCH3CH2CH3-OH(DIi20R2mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R", R2 und R3:R3
H
OHCH,
CH3()=< H
Hf CH3 Gl
G2H H f J-O L H CH3 HO /r-O
CH3
\Nl CH3 H
OHCH3
CH3\ Sl
S2H
OHCH3
CH3Ul
U 2ch" Submersbedingungen in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 37° C sowie bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 züchtet, das gebildete Anthracyclinglycosid-Gemisch, jeweils in an sich bekannter Weise, aus dem Kulturmedium gewinnt und zu den einzelnen Anthracyclinglycosiden gemäß Anspruch 1 fraktioniert und letztere gegebenenfalls in ein nichttoxisches Säureadditionssalz überführt.3. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinglycosid MA 144-N1 durch Reduktion von Aclacinomycin A, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion durch Einwirkung von
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