DE2004686C3 - Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat und deren pharmakologisch nichtgiftige Säureanlagerungssalze sowie Verfahren zur Herstellung des Antibioticums SF-837 - Google Patents

Description

CH, O

in der R₁ und R₄ jeweils den Rest -COCH₂CH₃ bedeuten, R-ährend R₂ und R₃ entweder je ein Wasserstoffatom oder den Rest -COCH₃ darstellen, und deren pharmakologisch nicht giftige Säureanlagerungssalze. 2. Verfahren zur Herstellung des Makrolid-Antibioticums SF-837, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm von Streptomyces mycarofaciens nov. sp., der unter der ATCC Nr. 21454 hinterlegt worden ist, in üblicher Weise in einem Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet und dann das gebildete Antibioticum SF-837 aus der Kultur abtrennt

Die Erfindung betrifft das Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat der allgemeinen Formel

CHO

OCH₃ < ^OR3 CH

CB, O

in der R₁ und R₄ jeweils den Rest — COCH₂CH₃ bedeuten, während R₂ und R₃ entweder je ein Wasserstoffatom oder den Rest -COCH₃ darstellen, und deren pharmakologisch nicht giftige Säureanlagerungssalze sowie ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticums SF-837.

Es wurde gefunden, daß diese neuen Makrolid-Antibiotica eine starke wachstumshemmende bzw. wachs-

tumsverhindernde Wirkung gegen gram-positive patogene Bakterien und gegen eitererzeugende Bakterien haben, die ansonsten gegen Antibiotica resistent sind. Ihre Wirkung wurde gegenüber einer Reihe von Mikroorganismen geprüft, wobei für einjge das bekannte Kitasamycin zum Vergleich herangezogen wurde. Das Kitasamycin ist bekannt aus »Journal of Antibiotics«, 3d. 6, S. 87 (1953).

In diesen Versuchen wurde die minimale Hemmkonzentration in üblicher Weise mit der Brühen-Verdünnungsmethode unter Verwendung von

1. Herzinfusion j-Medium,

2. Glycerin-Bouillon-Medium und

3. Sabouraud-Medium

als Kulturmedien bestimmt Die Bebrütung erfolgte jeweils 24 Stunden bei 37° C. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

	Minimale	Hemmkonzentration	Kitasa
Test		(mcg/ml)	mycin
Mikroorganismen	SF-837	Diacetyl SF-837
	Substanz	Substanz	0,78
Staphylococcus aureus
209P	0,39	078
Staphylococcus aureus
209 P, resistent gegen
Penicillin	0,78	0,78
Staphylococcus aureus
209 P, resistent gegen
Streptomycin und
A. 249-Substanz	0,39	0,39
Staphylococcus aureus
209 P, resistent gegen
Novobiocin	3,125	6,25
Staphylococcus aureus
209 P, resistent gegen
Act'nomycin	0,39	0,78
Staphylococcus aureus
209 P, resistent gegen
Kanamycin	3,125	6,25	0,78
Staphyloccus aureus
Smith	0,39	0,78
Staphylococcus aureus
Terajima	0,78	0,78
Staphylococcus aureus,
resistent gegen
Streptomycin, Penicil
lin und Tetracyclin ..	1,56	6,25
Staphylococcus aureus
193	1,56	3,125	0,78
Staphylococcus aureus
Smith	0,39		3,12
Staphylococcus albus
PCI 1200A	1,56
Bacillus subtilis ATCC			0,19
6633	039	0,78
Sarcina lutea	0,05	0,10
Escherichia coli	>25	>25
Pseudomonas aerugi-
nosa	>25	>25
Proteus vulgaris	>25	>25
Klebsiella pneumoniae	>25	>25	12,5
Shigella dysenteriae....	>25	>25
Mycobacterium SP 607	6,25
Mycobacterium smeg-
matis 607	>25	>25

'5

	Minimale	Hemmkonzentration	Kitasa-
Test		(mcg/ml)	mycin
Mikroorganismen	SF-837	Diacetyl SF-837
	Substanz	.Substanz	mehr al
Mycobacterium phlei			100
Nr. 56 ..:	12,5	12,5
Candida albicans	>25	>25
Penicillium chrysoge-
num	>25	>25
Aspergillus niger	>25	>25
Saccharomyces cere-
visiae	>25	>25	0,39
Streptococcus pyogenes
D 58	019		0,39
Diplococcus pneumo
niae Typ I	009		0,19
Diplococcus pneumo			1,56
niae Typ II	0,09
Bacillus subtilis PCI 219	0,78		1,56
Bacillus antia&c:«
Nr. 119	0,78

Aus den Werten der Tabelle I geht die vorteilhafte Wirkung des Antibioticums SF-837 und der Diacetylverbindung von SF-837 hervor. Es konnte nicht festgestellt werden, daß die bakterienverhindernde Aktivität von SF-837 durch Serum inaktiviert werden kann.

Die Toxität von SF-837 bei oraler und parenteraler Verabreichung ist gering. Bei oraler Gabe von SF-837 an Mäuse beträgt der LD₅₀-Wert 3200 mg/kg.

Ferner wurde die antibakterielle Wirksamkeit in vivo geprüft.

Hierbei wurden die zu prüfenden Verbindungen an Mäuse, die mit Staphylococcus aureus Smith infiziert worden waren, sowohl oral als auch subcutan verabreicht, und die ED₅₀ wurde nach dem Litchfield-Wilcoxon-Verfahren berechnet. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
45

Geprüfte Substanz	ED50 bei oral	Mä	iisen (mg/kg) subcutan
SF-837	125		51
Kitasamycin (bekannt)	230		86

Andere bekannte Antibiotica vom Makrolidtyp wie Niddamycin, Magnamycin und Spiramycin liefern noch schlechtere Ergebnisse als Kitasamycin.

Weiterhin wurde die Wirkung der Diacetylverbindung von SF-837 in der folgenden Weise untersucht: eine wäßrige Suspension von Staphylococcus-Aureus-Smith-Bakterien wurde Gruppen von je 10 ICR-Mäusen intraperitoneal in einer Dosierung injiziert, die lOOmal größer war als der LD₅₀-Wert.

Dreißig Minuten nach dieser Injektion wurden die infizierten Mäuse oral mit wäßrigen Suspensionen von 0,2,1,0, 2,0,4,0,6,0,8,0 bzw. 12 mg Diacetyl-SF-837 in 0,5 ml Wasser und einer geringen Menge an Gummiarabikum behandelt. Dann wurde jede Gruppe nach der Behandlung 7 Tage gefuttert. Aus den Ergebnissen mehrerer Versuche wurde festgestellt, daß das Di-

acetyl-SF-837 einen ED₅₀-Wert von 170 mg/kg besitzt; die ED₅₀-Werte wurden nach der Litchfield-Wilcoxon-Methode berechnet.

Das Makrolid-Antibioticum SF-837 wird erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man den Stamm von Strcptotnyces mycarofaciens nov. sp., das unter der ATCC Nr. 21454 hinterlegt worden ist, in üblicher Weise in einem Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert bzw. züchtet und dann das gebildete Antibioticum aus der Kultur abtrennt.

Der aus einer Bodenprobe erstmals isolierte und bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Streptomyces mycarofaciens nov. sp., der uneingeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington D. C, unter ATCC

Nr. 21 454 hinterlegt worden ist, hat folgende biologische Eigenschaften:

I. Morphologische Beobachtung
S 1. Belüftetes Mycelium

Belüftetes Mycelium erzeugt auf Glycerin-Czapek's-Agar, Glycerin-Calciummaleat-Agar und synthetischem Stärke-Agar reichlich offene Spiralen.

2. Sporen

Die Sporen sind von kugelförmiger, ovaler oder elliptischer Form, die Oberflächenstruktur ist dornig bzw. stachelig (verhältnismäßig dünnere und längere Stacheln), und die Größe der Spore beträgt 0,5 bis 0,7 Micron zu 0,8 bis 1,0 Micron.

II. Die Eigenschaften auf verschiedenen Kultur- bzw. Nährmedien ergeben sich aus der folgenden Tabelle 2

Tabelle 2

Kulturmedium	Wachstum	Belüftetes Mycelium	Lösliches Pigment
Secrose-Czapek-Agar	geringes Wachstum,	spärlich, kraus (Kraus)	keins
	farblos bis cremefarben	weißlichgrau
Glycerin-Czapek-Agar	dunkelbraun	weiß bis cremefarben,	keins oder sehr schwach
		teilweise mit Bildung	rosa
		von gräulich gefärbten
		und krausen Luftmyzel
Krainsky-Glucose-	hellbraun bis	weiß, mit rose Anstrich	keins oder schwach
Asparagin-Agar	rötlichbraun		bräunlichgelb
Ushinsky-Glucose-	braun mir rötlichem	rose bis 1 avendel farben	hellbraun
Aspargin-Agar	Anstrich
Calcium-maleat-Agar	geringes Wachstum,	keins	keins
	cremefarben
Glycerin-Calcium	hellbraun	rose, allmählich über	keins
maleat-Agar		gehend zu gräulich
		(kraus)
synthetischer Stärke-Agar	dunkelbraun mit	rose mit stark röt	keins
	purpurnem Anstrich	lichem Anstrich, all
		mählich übergehend in
		gräulich (kraus)
Fleischbrühe-Agar	gelblichbraun	sehr spärlich, weiß	keins
Glucose-Fleischbrühe-	dick, gut und braun	weiß bis gelblich	keins
Agar	bis dunkelbraun	cremefarben
Glucose-Pepton-Agar	braun	spärlich, weiß	keins
Tyrosin-Agar	rötlichbraun	weiß	keins
Kartoffelschnipsel	dick, gut und braun	reichlich, gräulichbraun	schwärzlichbraun
	bis schwärzlichbraun
Kartoffelschnipsel	braun	weiß bis cremefarben	braun an der Peripherie
			des Wachstums
Magermilch	ringförmig, Oberflächen	spärlich, weiß	keins
	wachstum, hellbraun
Ei	blaßbraun	keins	keins
Glucose-Czapek-Lösung	Oberflächen- und	spärlich, weiß	keins
	Boden wachstum,
*	blaßbraun
Loeffler's koaguliertes	blaßbraun	keins	keins
Serum
Gelatine (200Q	cremefarben bis	keins	keins
	blaßbrauu

Fortsetzung

Kulturmedium	Wachstum	Belüftetes Mycelium	Lösliches Pigment
Bennett's Cellulose-Medium	braun bis schwärzlichbraun kein Wachstum	rose mit rötlichem Einschlag	hellbraun

Bemerkung: Die Bebrütungstemperatur betrug im allgemeinen, wenn nicht anders angegeben, 28°C.

III. Physiologische Eigenschaften Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ Bildung von Tyrosinase: negativ j Bildung von Nitrit: positiv Gerinnen von Magermilch: positiv Peptonisierung von Magermilch: negativ Hydrolyse von Stärke: positiv Verflüssigung von Gelatine: positiv (schwach) Zersetzung von Loeffler's koaguliertem Serum:

negativ

Chromogene Wirkung: negativ IV. Verwendung von Kohlenstoffquellen

1. Verwendet:

Glucose, Galactose, Fructose, Maltose, Lactose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Inosit, Mannose, Salicin, Natriumacetat, Natriumeitrat, Natriumsuccinat.

2. Zweifelhaft:

Arabinose und Rhamnose.

3. Nicht zu verwenden:

Xylose, Saccharose, Raffinose, Dulcit, Sorbit, Mannit und Cellulose.

V. Wachstumstemperatur: 15 bis 38°C

Die obenerwähnten mikro-biologischen Eigenschaften der die Substanz SF-837 erzeugenden Rasse (im folgenden als SF-837-Rasse bezeichnet) können wie folgt zusammengefaßt werden: Der Sporenträger ist spiralförmig, die Spore ist stachelig. Aus synthetischen Kultur- bzw. Nährmedien kann ein cremefarben bis braun bis rötlichbraungefärbtes Wachstum beobachtet werden, wobei ein rosegefärbtes Luftmycelium und ein krauses graugefärbtes Luft-mycelium ge- bildet «erden. Es kann keine wesentliche Bildung an löslichem Pigment beobachtet werden, während die Bildung von löslichem Pigment mit hellbrauner Farbe bei einer beschränkten Gruppe synthetischer Kulturmedien beobachtet werden kann. Bei organischen _J5 Kulturmedien wird andererseits im allgemeinen ein braungefärbtes Wachstum mit der Bildung von weiö oder cremefarben gefärbten Luft-myceBum beobachtet, jedoch ohne Bildung eines löslichen Pigmentes. Bei Kartoffelschnitzeln wird jedoch reichhch Luftmycetium von gräulichbrauner Farbe gebildet und die Bildung von schwärzlichgefärbtem, löslichem Pigment beobachtet

Aus der von Waksman (Waksman's »The Actinomycetes« Bd. 2,1961) bekannten Beschreibung über Mikroorganismen ist zu erkennen, daß die obengenannten Kultureigenschaften der SF-837-Rasse teilweise in der Nähe der Eigenschaften der Fradiae- Arten, der Ruber-Arten und Flavus-Arten des Genus-Streptomyces liegen. Daher wird dieser Punkt nachstehend noch eingehender betrachtet.

Da die SF-837-Rasse negativ bei der Melanin-Bildung ist und die Bildung von Luft-mycelium von rosa Farbe oder Anstrich zeigt, wird die SF-837-Rasse zuerst mit den Rassen der Fradiae-Arten verglichen, nämlich Streptomyces fradiae, Streptomyces luridus, Streptomyces roseus und Streptomyces fuscus. Die SF-837-Rasse unterscheidet sich von den Rassen der Fradiae-Arten dadurch, daß bei der SF-837-Rasse das Luft-mycelium mit rosa Farbe oder Anstrich zeitweilig in der Anfangsstufe der Bebrütung auftritt und in vielen Fällen während des mittleren und späteren Stadiums der Bebrütung sich in ein graugefärbtes und krauses Luft-mycelium verändert, während die rosa Farbe oder der rosa Anstrich, die bzw. der bei den Rassen der Fradiae-Arten beobachtet wird, sehr stabil ist. Das Luft-mycelium von Streptomyces fradiae ist gradlinig und unterscheidet sich von der Spirale der SF-837-Rasse. Streptomyces fradiae unterscheidet sich auch deutlich von der SF-837-Rasse dadurch, daß Streptomyces fradiae eine reichliche Bildung von Luftmycelium auf Saccharose-Czapek-Agar und ein farbloses Wachstum auf Stärke-Agar zeigt

Die SF-837-Rasse unterscheidet sich von Streptomyces fuscus und Streptomyces luridus dadurch, daß Streptomyces fuscus nicht die Spiralbildung hat, während Streptomyces luridus die Spiralbildung nur bei einer begrenzten Gruppe von Kulturmedien aufweist, während die SF-837-Rasse auf vielen Kulturmedien eine ergiebige Spiralbildung zeigt Streptomyces roseus ist mit der SF-837-Rasse insoweit vergleichbar, als die Spiralbildung beobachtet werden kann, wobei diese beiden sich jedoch deutlich dadurch voneinander unterscheiden, daß Streptomyces roseus ein farbloses Wachstum auf synthetischem Stärke-Agar zeigt, während es jedoch kein Luft-mycelium auf Kartoffelschnitzeln bildet

Da die SF-837-Rasse negativ bei der Melanin-Bildung ist und ein Wachstum von roter Farbe oder rotem Anstrich zeigt, wird die SF-837-Rasse zweitens verglichen mit Streptomyces albosporeus, Streptomyces erythraeus, Streptomyces niveoruber und Streptomyces purpurascens usw., die zu den Ruber-Arten gehören.

Streptomyces niveoruber unterscheidet sich deutlich von der SF-837-Rasse dadurch, daß die Oberflächenstruktur der Spore der zuerst erwähnten Art gleichmäßig ist, während diejenige der zuletzt erwähnten Art stachelig ist Streptomyces albosporeus unterscheidet sich von der SF-837-Rasse weiterhin dadurch, daß Streptomyces albosporeus Luft-mycehum bildet, das hauptsächlich gradlinig ist, wobei ein ausgeprägt rotgefärbtes Wachstum auf Sucrose-Czapek-Agar und auf Glycerin-Calcium-maleat-Agar vorhanden ist, während kein Luft-mycehum auf Stärke-Agar gebildet

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wird. Streptomyces erythraeus stimmt mit der SF-837-Rasse insoweit nicht überein, als Streptomyces erythraeus auf Sucrose-Czapek-Agar und auf Kartoffelschnitzel-Agar ein rotgefärbtes Wachstum zeigt, während ein cremefarben gefärbtes Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und synthetischem Stärke-Agar vorhanden ist, auf denen die SF-837-Rasse ein Wachstum mit rötlichem Anstrich hai. Streptcinyces purpurascens stimmt mit der SF-837-Rasse hinsichtlich der stacheligen bzw. faserigen Struktur der Sporenoberfläche Uberein, wobei sich jedoch Streptomyces purpurascens von der SF-837-Rasse dadurch unterscheidet, daß die zuerst genannte Art deutlich lösliches Pigment von roter Farbe oder rotem Anstrich auf synthetischem Kulturmedium bildet, während die SF-837-Rasse kein solches lösliches Pigment aufweist. Die SF-837-Rasse wird weiterhin mit Streptomyces microflavus und Streptomyces roseoflavus verglichen, die zu den Flavus-Arten gehören und von denen angenommen wird, daß sie in enger Beziehung zu der SF-837-Rasse stehen. Wie die Kultureigenschaften zeigen, liegen Streptomyces uMcroflavus und Streptomyces roseoflavus hinsichtlich gewisser Punkte dicht bei der SF-837-Rasse, wobei jedoch die beiden zuerst genannten Rassen Sporen bilden, deren Oberflächenstruktur gleichmäßig bzw. glatt ist (H. D. T r e s η e r und andere, »Journal of Bacteriology«, Bd. 91, S. 1998

S bis 2005, 1966), was einen deutlichen Unterschied zur stacheligen bzw. faserigen Sporenstruktur der SF-837-Rasse bedeutet.

Es ergibt sich somit, daß keine Rasse unter den bekannten Arten des Genus Streptomyces gefunden werden kann, die mit der SF-837-Rasse übereinstimmt.

Andererseits ist die neue antibiotische Substanz, die mittels der SF-837-Rasse erzeugt wird, typisch für basische macrolide Antibiotica. Die Substanz SF-837 zeigt ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge

ij von 232 ΐημ im ultravioletten Spektrum, woraus geschlossen werden kann, daß diese Substanz ein Antibioticum der gleichen Art wie Leucomycin, Josamycin, Spiramycin, Miamycin und Tertiomycin darstellt.
Es bestehen deutliche Unterschiede zwischen den

jo morphologischen Eigenschaften der SF-837-Rasse und den bekannte Antibiotica erzeugenden bekannten Mikroorganismen, wie aus der folgenden Tabelle 3 hervorgeht.

Tabelle Gebildete Antibiotica Microorganismus

Luftmycel

Oberflächenstruktur der Spore

SF-837-Substanz

Leucomycin

Josamycin

Spiramycin

Miamycin

Tertiomycin

Tertiomycin

Carbomycin B

Tylosin

Macrocin

Relomycin

SF-837-Rasse
Streptomyces kitasatoensis

S.reptomyces
narboensis var.
josamyceticus

Streptomyces ambofaciens Streptomyces ambofaciens Streplomyces eurocidicus Streptomyces albireticuli Streptomyces halstedii Streptomyces fradiae Streptomyces fradiae

Streptomycin
hygroscopicus

Spirale

Quirl

geradlinig

Spirale

Spirale

Quirl

Quirl

Spirale

geradlinig

geradlinig

Spirale

stachelig

glatt

glatt

glatt
glatt
glatt
glatt
glatt
glatt
glatt
glatt

Die SF-837-Rasse unterscheidet sich auch deutlich von dem das Niddamycin erzeugenden Mikroorganismus Streptomyces djakartensis (der in der deutschen Patentschrift 1 077 381 beschrieben ist), von dem die Sporenoberflächenstruktur nicht beschrieben ist, wobei der Unterschied darin liegt, daß Streptomyces djakartensis bei der Melaninbildung positiv ist, wobei jedoch weder eine Peptonisierung oder Koagulierung von Magermilch auftritt

Die vorstehenden microbiologischen Vergleiche und Betrachtungen ergeben, daß die SF-837-Rasse nicht nur ein neuer Mikroorganismus ist, der das Macrolid-Antibioticum SF-837 erzeugt, sondern auch, daß die SF-837-Rasse sich von allen bekannten Rassen selbst vom Gesichtspunkt der naturwissenschaftlichen Systemkunde aller Actinomyceten unterscheidet. Aus diesem Grunde wurde diese SF-837-Rasse als Streptomyces mycarofaciens nov. sp. bezeichnet

Die SF-837-Rasse hat Eigenschaften, die zu Veränderungen neigen, wie es üblicherweise bei anderen Streptomyces-Arten beobachtet werden kann. So kann die SF-837-Rasse beispielsweise Varianten und Mutanten bilden, wenn sie mit verschiedenen bekannten

_So Mutantenbildnern behandelt wird, beispielsweise mit ultravioletten Strahlen, Röntgenstrahlen, hochfrequenten magnetischen Wellen, radioaktiven Strahlen, Chemikalien.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß die SF-837-Rasse nach bekanntet Methoden in einem Kultur- bzw. Nährmedium gezüchtet bzw. kultiviert wird, das Nährstoffe enthält die von üblichen Mikroorganismen benatzt werden Als Nährstoffquellen lassen sich sämtliche bekanntet Nährstoffe verwenden, die üblicherweise zur Züchten« bzw. Kultivierung von Streptomyces-Arten bekann sind. Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise be nutzt werden: Glucose, Stärke, Glycerin, Dextrin Sucrose bzw. Saccharose, verzuckerte Stärke, Melasse

6s Als Stickstoffquelle können beispielsweise verwende werden: Sojabohnenmehl, Weizenkeimlinge, Fleisch extrakt, Pepton, Maiswasser, lösliches pflanzlich? Protein, Trockenhefe, Ammoniumsulfat, Natriumni

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trat. Falls notwendig, können dem Kultur- bzw. Nährmedium anorganische Salze wie Caldumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate zugegeben werden. Zusätzlich können solche organischen und anorganischen Stoffe zugesetzt werden, die das Wachstum der SF-837-Rasse fördern und die Bildung der SF-837-Substanz beschleunigen.

Als Verfahren zur Züchtung oder Kultivierung der SF-837-Rasse ist die Flüssigkultur und insbesondere die Flüssigkultur unter submersen aeroben Bedingungen am vorteilhaftesten, und zwar in ähnlicher Weise wie bei den üblichen Verfahren zur Herstellung der bekannten Antibiotica. Die Zucht bzw. Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei einer Fermentationstemperatur von 20 bis 30° C durchgeführt. Für die handelsmäßige oder labormäßige Erzeugung der Substanz SF-837 ist es jedoch häufig vorzuziehen, das Züchtungsverfahren bei Temperaturer in der Nähe von 28° C durchzuführen. Unter diesen Bedingungen erreicht die Konzentration der SF-837-Substanz in der Kulturbrühe ein Maximum am Ende einer Fermentationszeit von 2 bis 5 Tagen, und zwar entweder in Schüttelkulturen oder Tankkulturen.

Dabei ist die Substanz SF-837 das hauptsächliche Stoffwechselprodukt von Streptomyces mycarofaciens nov. sp. ATCC Nr. 21 454.

Die Isolierung der Substanz SF-837 aus der Kultur kann auf verschiedenen Wegen erfolgen.

Das Antibioticum SF-837 ist sowohl in der festen Phase, die Mycelkuchen enthält, als auch in der flüssigen Phase der Kultur vorhanden. Die Kultur kann in bekannter Weise filtriert werden, um den Filterkuchen (d. h. die feste Phase, die Mycelkuchen enthält) und das Filtrat (d. h. die flüssige Phase der Fermentationsbrühe) getrennt zu erhalten. Die in dem Filtrat vorhandenen Aktivstoffe können mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel unter neutralen oder schwach alkalischen Bedingungen extrahiert werden, z. B. mit Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Benzol, Äthyläther, Methylisobutylketon, ButanoL Die in dem Filterkuchen vorhandenen Aktivstoffe können mit angesäuertem Wasser extrahiert werden oder mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, Aceton. Wahlweise kann die Kultur auch direkt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ohne vorhergehende Filtration des Mycelkuchens extrahiert werden, so daß die Aktivstoffe unmittelbar aus der Kultur in das verwendete organische Lösungsmittel übergehen.

Die Aktivstoffe, die in das organische Lösungsmittel übergeführt worden sind, können dann mit angesäuertem Wasser wieder extrahiert werden. Der anfallende saure Extrakt kann anschließend neutral oder durch Zugabe basischer Stoffe wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht werden, woran sich eine Rüttel- bzw. Schüttelbehandlung mit einem entsprechenden organischen Lösungsmittel anschließt, so daß die Aktivstoffe wieder in das organische Lösungsmittel übergehen. Indem diese Verfahren der Rück- bzw. Umkehrextraktion wiederholt werden, können bis zu einem gewissen Umfang Verunreinigungen von den Aktivstoffen abgetrennt werden. Der organische Lösungsmittelextrakt kann unter verringertem Druck bis zur Trockne eingeengt werden, wobei ein Rohpulver gewonnen wird, das die Substanz SF-837 enthält. Die Lösung der aktiven Substanz in dem angesäuerten Wasser kann wahlweise entweder gefriergetrocknet werden, um die Säureanlagerungssalze der aktiven Substanz zu erhalten, oder die wäßrige Lösung kann neutral oder schwach alkalisch gemacht werden, so daß die aktive Substanz in form der freien Base ausfällt.

Da die Substanz SF-837 von basischer Natur ist, kann die Kultur oder deren Filtrat oder eine Lösung der aktiven Substanz auch mit Ionenaustauschern be handelt werden, wie einem Ionenaustauschharz, bei spielsweise Amberlite IRC-SO, oder einer Ionenaustauschcellulose, und wobei die aktive Substanz von dem Ionenaustauscher adsorbiert wird, der dann anschließend mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert wird.

Das anfallende Rohpulver kann weiter durch Extraktion mit einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gereinigt werden, z. B. mit Benzol, das die Substanz SF-837 löst oder durch Waschen mit einem anderen Lösungsmittel, z. B. Petroläther, Ligroin und η-Hexan, das die SF-837-Substanz kaum oder nicht, die Verunreinigungen jedoch gut auflösen kann, und/ oder durch Zugabe von Petroläther, Ligroin oder η-Hexan zu einer Lösung der aktiven Substanz in einem organischen Lösungsmittel wie Benzol.

Auf diese Weise erhält man gereinigtes SF-837, das gegebenenfalls-noch andere aktive Bestandteile (SF-837-A₂-, SF-837-Aj- und SF-837-A4-, deren Gesamtanteil in der Größenordnung von 5 bis 20 Gewichts- prozent des Anteils der Substanz SF-837 schwankt) enthält.

Das gereinigte, gegebenenfalls noch kleinere Anteile an SF-837-A₂-, SF-837-A₃-, SF-837-A4- enthaltende SF-837 kann direkt in ein entsprechendes Säure aniagerungssalz nach üblichen Methoden übergeführt werden. Ferner kann man das gereinigte SF-837 mittels eines üblichen Acetylierungsverfahrens, z. B. durch Lösen in Pyridin, Behandlung der Lösung mit Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur oder bei einer ge- ringfugig höheren Temperatur über einen ausreichend langen Zeitraum in das Diacetylderivat der Substanz SF-837 überführen.

Für die Reinigung und Abtrennung der Substanz SF-837 eignet sich jedes bisher für die Reinigung und Trennung von makroliden Antibiotica angewendete bekannte Verfahren.

Das Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat und deren nicht giftige Säureanlagerungssalze können in verschiedenen Formen für thera- peutische Zwecke verwendet werden. Für die Injektion werden vorzugsweise wegen ihrer hohen Wasserlöslichkeit nicht giftige Säureanlagerungssalze, z. B. Tartrate verwendet Andere geeignete Salze sind beispielsweise solche mit Salzsäure, Schwefelsäure, Brom- wasserstofMure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zimtsäure, Ascorbinsäure, Glykolsäure.

Beispiel 1

Streptomyces mycarofaciens nov.sp. der ATCC Nr. 21 454 (SF-837-Rasse) wurde in 601 eines flüssigen Kultur- bzw. Nährmediums eingeimpft, das 2^% verzuckerte Stärke, 4% lösliches Protein, 0,3% Kaliumchlorid und 0,3% Calciumcarbonat bei einem pH-Wert

von 7,0 enthielt, und dann wurde 35 Standen unter Belüftung bei einer Temperatur von 28° C in einem Standfermenter unter Umrühren kultiviert. Die anfallende Kultur wurde dann direkt nitriert und der

den Mycelkuchen enthaltende Filterkuchen mit verdünnter Salzsäure gewaschen.

Das mit der Waschflüssigkeit vereinte Kulturfiltrat ergab eine Gesamtfiüssigkeitsmenge von 501 (Stärke 130 rncg/ml). Diese Flüssigkeit (pH 8) wurde dann mit s 251 Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatphase unter verringertem Druck auf etwa 3 1 eingeengt Das Konzentrat wurde hierauf mit 1,51 Wasser verdünnt, durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und dann heftig durchgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde von der organischen Phase abgetrennt und diese wäßrige Lösung durch Zugabe von 3n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und dann mit 80 ml Äthylacetat extrahiert. Der anfallende Äthylacetatextrakt wurde dann zusammen mit 500 ml wäßriger Salzsäure geschüttelt, die wäßrige Phase abgetrennt und diese mit 400 ml Äthyläther bei einem pH von 8 extrahiert. Der Ätherextrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt, wobei 16,5 g eines hellgelbgefärbten Pulvers erhalten wurden.

12 g dieses Rohpulvers wurden dann in 200 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde durch eine mit 75 g mit Äthylacetat imprägnierten, Kohlenstoff gefüllte Kolonne bzw. Säule geschickt. Das vom Kohlenstoff eingenommene Volumen in der Kolonne entsprach 600 ml.

Die Entwicklung wurde unter Verwendung von Äthylacetat als Lösungsmittel durchgeführt; es wurden 10 Fraktionen von je 500 ml aufgefangen; die aktiven Fraktionen Nr. 3 bis 7 wurden vereinigt.

Die vereinigten Eluate wiesen eine Gesamtmenge voa 2500 ml auf, die dann unter verringertem Druck eingedampft wurde, wobei 5 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 10 ml Benzol gelöst, und die unlöslichen Anteile wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde dann Chromatographien, indem es durch eine Kolonne bzw. Säule, die mit mit Benzol imprägniertem Silikagel gefüllt war, geschickt wurde. Das eingefüllte Silikagel (510 g) nahm in der Kolonne ein Volumen von 700 ml ein.

Die Entwicklung der am Silikagel adsorbierten Substanzen wurde mittels eines Lösungsmittelgemisches aus Benzol — Aceton (4:1) durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 20 ml auigefangen bzw. gesammelt. Die aktiven Fraktionen Nr. 90 bis 380, die bei der Aluminiumoxyd-Dünnschicht-Chromatographie einen Einzelfleck ergaben und die in Anbetracht des Rf-Wertes des Einzelfleckens als Fraktionen anzusehen waren, die die SF-837-Substanz in reinem Zustand enthielten, wurden vereinigt. Bezüglich der Durchführung der Dünnschicht-Chromatographie wird auf die im Anschluß an die Beispiele gebrachten Ausführungen verwiesen. .

Die vereinigten Fraktionen, bei denen es sich um eine Gesamtmenge von 4000 ml handelt, wurden unter verringertem Druck eingeengt, wobei 1,5 g eines weißen Pulvers vom F. 122 bis 124° C erhalten wurden, das die reine freie Base des Makrolid-Anti- ifo bioticums SF-837 darstellt.

Die Substanz SF-837 ist in Methanol, Äthanol, Aceton, Chlorofoirm, Äthylacetat, Butylacetat, angesäuertem Wasser,, Benzol, Äthyläther und Tetrachlorkohlenstoff löslich, jedoch in Petroläther, n-Hexan und neutralem Wasser nur schwer löslich. Sie bildet mit Säuren Salze, die beim Erythromycin-Test mit 50%iger Schwefelsäure positiv und im Gegensatz dazu mit Nnihydrin- und Eisenchloridreagenziei negativ reagieren.

Die Verbindung SF-837 ergibt beim Erythromycin test mit 50%iger Schwefelsäure eine bräunlich un< rötlich purpurne Farbe.

In 50%igeni wäßrigem Äthanol beträgt de pKa-Wert der Substanz SF-837 6,9; die optisch Drehung bei einer Konzentration von 1% in Äthano beträgt a_o = —67°.

Das Uhtaviolettabsorptionsspektnim der Substans SF-837 (in Äthanol) ist in der F i g. 1 dargestellt D« Verbindung besitzt ein charakteristisches Absorp. tionsmaxünnm bei einer Wellenlänge von 232 ηΐμ (EJi = 325). Das Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz SF-837 in Form der freien in Kaliumbromid granulierten Base ist in F i g. 2 dargestellt Die Verbindung besitzt charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Bereich bei folgenden Wellenlängen in cm"¹:3500,297a 2930,1735, 1460, 1408, 1376,1360 1330, 1295, im 1190, 1165, 1120, 1082, 1050, 1015, 9ia 86a 840,805,780, 735 und 680.

Gewichtsanalyse in % für ₄I₆₇₁₅ Berechnet ... C 60,52, H 8,24, N 1,72, O 29,39; gefunden .... C 60,78, H 8,35, N 1,65, O 29,62; MG = 813 bestimmt durch Massenanalyse.

In Fig. 3 ist die Kurve des kernmagnetischen Resonanzspektrums (100 Mc) der Substanz SF-837 in Form der freien Base, die mit einer Konzentration von 10% in Deuterochloroform gelöst ist, dargestellt

Ferner ergibt die Substanz SF-837 bei der Silikagel- oder Aluminium-Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme Einzelflecken mit jeweils verschiedenen Rf-Werten, wodurch die Reinheit und Homogenität dieser Substanz bestätigt wird.

Die Rf-Werte der Substanz SF-837 mit verschiedenen Lösungsmittelsystemen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Lösungsmittelsysteme Silicagel-Dünnschicht-Chromatographie

Benzol-Aceton (2:1)

n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1)..

Methanol

Aluminiumoxyd-Dünnschicht-Chromatographie

Äthylacetat-Benzol (2:1) Äthylacetat

Rf-Wert SF-837-Substanz

0,45

0,67 0,82

0,34 0,78

Beispiel 2

201 eines Kulturmediums, das 3% Glukose, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,2% Natriumchlorid, 0,3% Cakhimcarbonat und 0,3% Sojabohnenöl (eingestellt auf pH 7) enthielt, wurden in einen Stand- bzw. Flaschenfermenter mit einer Kapazität von 301 eingefüllt und dann durch Erhitzen auf 120° C 20 Minuten sterilisiert Danach wurde Streptomyces mycarofaciens nov.sp. der ATCC Nr. 21454 (SF-837-Rasse) dem Kulturmedium eingeimpft und das Ganze unter Belüftung 48 Stunden bei 28° C umgerührt. Die fer-

mentierte Brühe bzw. Nährlösung wurde hierauf bei einem pH-Wert von 6 filtriert, wobei 18 1 des Kulturnitrats (Stärke 200mci;/ml) erhalten wurden. Das Filtrat wurde durch Zugabe von 3 n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und dann mit 8 1 Butylacetat extrahiert Der Butylacetatextrakt wurde wie bei Beispiel 1 beschrieben weiterbehandelt und das erhaltene Rohprodukt dann chromatographisch unter Verwendung einer Silikagel-Kolonne gemäß Beispiel 1 gereinigt Das Rohprodukt wurde nach Verdampfen des Lösungsmittels in Benzol gelöst; die erhaltene Lösung wurde wie beschrieben über eine Silikagelkolonne Chromatographien.

Es wurden 800 mg reiner Substanz SF-837 in Form eines weißen Pulvers vom F. 122 bis 124° C erhalten.

Beispiel 3

4,0 g eines gemäß Beispiel 1, Absatz 1, erhaltenen rohen, gelbgefärbten Pulvers wurden in 1000 ml Wasser suspendiert und die wäßrige Suspension durch Zugabe von 5 n-Silzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Die Lösung wurde dann durch eine Kolonne bzw. Säule, die mit 100 ml des Ionenaustauschers Amberlit CG-50 (Typ H) gefüllt war, *5 hindurchgeschickt. Das Ionenaustauschharz wurde dann mit 800 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann mit einem 0,4 n-Salzsäure-Äthanol-Gemisch (1:2) eluiert. Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen Nr. 9 bis 17 wurden vereinigt.

Die vereinigten Eluate (180 ml) wurden durch Zugabe von 3 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt und dann unter verringertem Druck auf 40 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde hierauf durch Zugabe von 3 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und dann das Ganze zweimal mit jeweils 50 ml Äthyläther extrahiert. Die vereinigten Äthylätherextrakte wurden dann unter verringertem Druck eingeengt, wöbe' 2,1 g eines hellgelben Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung durch eine Kolonne bzw. Säule, die mit mit Athylacetat imprägniertem Aluminiumoxyd gefüllt war, geschickt. Das eingefüllte Aluminiumoxyd nahm in der Kolonne einen Raum ein, der 200 ml entsprach. Anschließend wurde mit 1000 ml Äthylacetat eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen wurden. Die aktiven Fraktionen Nr. 22 bis 31 wurden zu einem Gesamtvolumen von 200 ml vereinigt, das, mit 40 ml destilliertem Wasser versetzt, durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf einen pH-Wert.von 1,8 eingestellt und dann heftig geschüttelt wurde. Die wäßrige Phase wurde von der organischen Phase getrennt und die JS wäßrige Lösung durch Zugabe von 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt, wobei ein Niederschlag ausgefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und in Benzol gelöst und die Lösung wie im Beispiel 1 beschrieben an einer mit Silikagel gefüllten Kolonne chromatographiert und aufgearbeitet. Es wurden 300 mg der reinen Substanz SF-837 als Pulver erhalten.

B e i s ρ i e 1 4 _6j

Streptomyces mycarofaciens nov.sp. der ATCC Nr. 21454 (SF-837-Rasse) wurde in 3001 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, das 2,0% Glukose, 1,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,4% Maiswasser, 0,2% Natriumchlorid, 03% Calciumcarbonat und 0,2% Schweinefett bei einem pH-Wert von 7,0 enthielt, und anschließend wurde das Ganze unter Belüftung 70 Stunden bei 28° C umgerührt

Die fermentierte Brühe bzw. Nährlösung wurde dann direkt filtriert und der den Mycelkuchen enthaltende Filterkuchen mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Kulturfiltrat mit einem Gesamtvolumen von 2801 (Stärke 320 mcg/ml) wurde mit 701 Athylacetat extrahiert, und 711 der erhaltenen Äthylacetatphase wurden hierauf unter verringertem Druck auf etwa 201 eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 101 Wasser verdünnt, durch Zugabe von 5n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und dann heftig geschüttelt. Die wäßrige Phase wurde von der organischen Phase abgetrennt, durch Zugabe von 3n-Nairiumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und dann mit 41 Äthylacetat extrahiert Der Äthylacetatextrakt wurde dann mit 2 1 wäßriger Salzsäure geschüttelt und der wäßrige Anteil dann wiederum mit 1 1 Äthylacetat bei einem pH-Wert von 8 extrahiert

Dieser Athylacetatextrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt, wobei 92 g eines gelben Rohpulvers erhalten wurden.

90 g dieses Rohpulvers wurden in 1 1 Äthylacetat gelöst, und die Lösung wurde durch eine Kolonne bzw. Säule, die mit mit Athylacetat imprägniertem Kohlenstoffpulver gefüllt war, hindurchgeschickt. Das eingefüllte Kohlenstoffpulver nahm in der Kolonne einen Raum ein, der 1,5 1 entsprach. Die Entwicklung wurde unter Verwendung von Äthylacetai als Lösungsmittel durchgeführt; die aktiven Fraktionen des Eluats wurden vereinigt. Es wurden 500-ml-Fraktionen aufgefangen; die aktiven Fraktionen waren die Fraktionen Nr. 2 bis 12.

Die vereinigten Fraktionen (5,5 1) wurden dann unter verringertem Druck bis zur Trockne eingedampft, wobei 55 g eines weißen Pulvers (Stärke 700 mcg/mg) erhalten wurden. Dieses Pulver wurde einem Gegenstromverteilungsverfahren unter Verwendung von Benzol und eines 0,3molaren Phosphatpuffers (pH 4,40) unterworfen. Bezüglich der Durchfuhrung des Gegenstromverteilungsverfahrens wird auf die im Anschluß an die Beispiele gebrachten Ausführungen verwiesen.

(Es wurden je 2,5 1 der Lösungsmittel Athylacetat und Benzol verwendet, und das Entfernen der unteren beweglichen Schicht wurde lOmal durchgeführt.) Die Substanz SF-837 war danach in den ersten bis dritten Rohren und hauptsächlich in dem zweiten Rohr verteilt vorhanden.

Der Anteil (2,41) in dem ersten Rohr wurde unter verringertem Druck eingeengt, wobei 7,7% eines weißen Pulvers (Stärke 720 mcg/mg) erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 15 ml Benzol gelöst, eventuell vorhandene unlösliche Stoffe wurden abfiltriert und die filtrierte Lösung dann durch eine Kolonne bzw. Säule, die mit mit Benzol imprägniertem Silikagel gefüllt war, hindurchgeschickt. Das eingefüllte Silikagel nahm in der Kolonne einen Raum ein, der 800 ml entsprach. Die absorbierten Substanzen wurden chromatographisch entwickelt, indem ein Lösungsmittelgemisch von Benzol-Aceton (4:1) verwendet wurde. Das Eluat wurde in 100 Fraktionen von jeweils 50 ml gesammelt. 0,1-ml-Anteile jeder dieser erhaltenen Fraktionen wurden untersucht, indem sie

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einer Aluminiumoxyd-Dünnschicht-Chromatographie unterworfen wurden unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat-Benzol (2:1) als Entwicklungslösungsmittel. Bezüglich der Durchführung der Dünnschicht-Chromatographie wird auf die im Anschluß an die Beispiele gebrachten Ausführungen verwiesen.

Die Fraktionen Nr. 70 bis 95, die bei der Aluminiumoxyd-Dünnschicht-Chromatographie einen Einzelflecken ergaben und in denen die Substanz SF-837 allein angesammelt war, wurden dann unter Vakuum eingeengt, wobei 0,8 g der Substanz SF-837 als weißes Pulver vom F. 122 bis 124° C erhalten wurden.

Beispiel 5 ·'

200 mg der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Substanz SF-837 wurden in 10 ml Äthyläther gelöst, und der Lösung wurde tropfenweise eine gesättigte Lösung von Zitronensäure zugegeben. Der gebildete Niederschlag μ wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 230 mg des Citrats der Substanz SF-837 vom F. 162 bis 167° C (unter Zersetzung) erhalten wurden.

B e i s ρ i e 1 6 _}.

300 mg der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Substanz SF-837 wurden in 1,5 ml Pyridin gelöst und der Lösung 1,0 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt. Das Gemisch wurde umgerührt und dann 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktions- 3« gemisch wurde dann unter Rühren in Eiswasser gegossen, wobei ein Niederschlag ausfiel. Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und dann getrocknet, wobei 330 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Durch Umkristallisation dieses Pulvers aus Tetrachlorkohlenstoff wurden 305 mg des Di-acetylderivates des Makrolid-Antibioticums SF-837 in Form weißer Nadeln vom F. 122 bis 125° C erhalten.

Die VerbuJdung besitzt ein charakteristisches UV-Absorptionsmaximum bei 232 πΐμ (EJl = 295), wenn es in Äthanol gelöst ist, und die folgenden charakteristischen Absorptionsbanden im infraroten Bereich des Spektrums, wann es in Kaliumbromid granuliert ist, bei folgenden Wellenlängen in cm ^l: 3450 29270,2930, 1728, Ϊ454,1368,1232,1167,1122, 1082,' 1054,1024,1002,957,907,863,837,783 und 762.

Gewichtsanalyse in % für C₄₅H₇₁O₁₇N: Berechnet ... C 60,20, H 7,90, N 1,56; gefunden .... C 6038, H 7,26, N 1,54.

Dünnschicht-Chromatographie Die Dünnschicht-Chromatographie wurde in üblicher Weise nach der absteigenden Methode an einer dünnen Schicht (0,25 mm dick) aus Alumimumoxyd durchgeführt, die durch Erhitzen auf 110⁰C aktiviert worden war. Der Einzelfleck der aktiven Substanz wurde durch Behandlung mit Schwefelsäure sichtbar gemacht.

Gegenstromverteilungsverfahren

Das Gegenstromverteilungsverfahren wurde mit Hilfe speziell entwickelter zylindrischer Gefäße mit einem Durchmesser von 18 cm und einer Höhe von 30 cm durchgeführt. Eine Lösung des Pulvers in Benzol und eine Menge des Phosphatpuflers wurden in das erste Gefäß eingeführt, worauf die beiden Schichten in dem Gefäß mit Hilfe eines rotierenden Rührers vermischt wurden. Anschließend wurde die die wäßrige Lösung enthaltende Schicht durch ein Loch im Boden des Gefäßes abgezogen und in das nächste Gefäß geleitet, welches dieselbe Form und dieselben Abmessungen aufwies wie das erste Gefäß und ebenfalls das organische Lösungsmittel enthielt, dort wie beschrieben behandelt, weitergeleitet zum nächsten Gefäß usw.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   1. Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat der allgemeinen Formel

   CHO CH₃ CH₃

   OCH₃ Y°^Rs Ca>

   ο ^v ο

   OH