CH646712A5 - Istamycine und deren herstellung. - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf vier neue, wertvolle Antibiotika, bezeichnet als Istamycin A, Istamycin B, Istamycin Ao und Istamycin Bo, sowie auf die fermentative Herstellung dieser neuen Antibiotika unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus.

Eine grosse Anzahl von pathogenen Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze sind Verursacher von Erkrankungen beim Menschen, den Tieren und Pflanzen. Obwohl viele Antibiotika entwickelt wurden, von denen einige hohe anti-mikrobielle Aktiviät gegen einen oder mehrere pathogene Mikroorganismen aufweisen, verbleibt ein Bedürfnis für ein stärker wirksames therapeutisches Mittel zur Bekämpfung der vielen Erkrankungen, die durch pathogene Mikroorganismen beim Menschen, Tier und Pflanzen hervorgerufen werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Antibiotikum zur Verfügung zu stellen, das wertvoll als antibakterielles Mittel für die therapeutische Behandlung von bakteriellen Infektionen von Mensch und Tier ist und das sich auch für die Sterilisation von chirurgischen Geräten und Instrumenten eignet. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotika.

Bei dem Versuch zur Herstellung neuer Antibiotika wurden ausgedehnte Forschungen durchgeführt. Hierbei wurde gefunden, dass, wenn ein neuer Stamm der Gattung Streptomyces mit der Laborbezeichnung SS-939, isoliert aus einer Bodenprobe, die an der Seeseite der Mirua Penisola in der Präfektur Kanagawa, Japan, gefunden wurde, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, vier verschiedene Substanzen mit einer antibakteriellen Aktivität gegen eine grosse Vielzahl von Bakterien hergestellt und in der Kultur angereichert werden können. Diese antibakteriellen Substanzen konnten aus der Kultur erfolgreich isoliert und gereinigt werden. Durch chemische, physikalische und mikrobiologische Untersuchungen dieser isolierten Substanzen wurde bestätigt, dass sie aminoglycosidische Antibiotika darstellen mit einer niedrigen Toxizität.

Gegenstand der Erfindung sind die Istamycine der folgenden Formeln

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Istamycin A der Formel

4

h„nchoc0n

2 2

i ch,

(I)

Istamycin B der Formel

Istamycin Ao der Formel ch,

(II)

ch2nhch3

och,

(III)

5

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oder der Formel

(ÏV)

nh nh.

oh och.

I

ch3

oder Istamycin Bo der Formel

(V)

oh och nh ch3

sowie deren Säureadditionssalze.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die in den Ansprüchen 2 bis 12 definierten Verfahren zur Herstellung solcher Istamycine.

Im folgenden werden durch den Ausdruck «Istamycin» Istamycin A, Istamycin B, Istamycin Ao oder Istamycin Bo oder deren Mischungen bezeichnet, sofern nichts anderes angegeben ist. Durch die Bezeichnung «Istamycinkomplex» wird eine Mischung von zwei, drei oder allen Istamycinen A, B, Ao und Bo gekennzeichnet, sofern nichts anderes angegeben ist. Die vorliegende Erfindung umfasst Istamycin-A-, Istamycin-B-, Istamycin-Ao- und Istamycin-Bo-Substanzen, entweder allein oder in Mischung von mindestens zwei derselben, die vorliegen können als verdünnte Lösung, als rohes Konzentrat, als roher Feststoff, als gereinigter Feststoff, als freie Base oder in Form eines Säureadditionssalzes mit einer anorganischen oder organischen Säure.

Die physiko-chemischen Eigenschaften von Istamycin werden im folgenden im einzelnen angegeben.

Istamycin A ist eine basische Verbindung, wenn es isoliert wird; als Carbonat liegt es in Form eines farblosen Pulvers vor, das keinen definierten Schmelzpunkt hat, sondern sich bei 102-108° zersetzt und eine spezifische optische Drehung aufweist von [a]u = +155° (c 0,4, Wasser), dessen Elementaranalyse koinzident ist mit dem theoretischen Wert der Molekularformel C17H35N5O5.1 /2 H:CCb (C 49,99%, H 8,63%, N 16,65%, 0 24,73%). Diese Molekularformel wurde bestätigt durch hochauflösende Massenspektrometrie (gefunden: m/e 389,2588; berechnet für C17H35N5O5: m/e 389,2635). Das Infrarotabsoriptionsspektrum von Istamycin-A-Halb-Car-bonat, pelletiert in Kaliumbromid, ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen angeben. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Istamycin-A-Hemi-Carbonat in Wasser zeigt nur die End-Absorption.

Im Proton (5 H) Kernresonanzspektrum (externer Standard: TMS, pD 5,4) von Istamycin-A-Hemi-Carbonat in Deu-tero-Wasser sind charakteristische Signale enthalten bei 3,20 (s, N-CHj), 3,57 (s, N-CHj), 3,89 (s, O-CHj), 4,5 (s, CH2) und 5,80 (d, J=3,5 Hz, CH). Istamycin A ist löslich in Wasser und Methanol, jedoch schwer löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln und zeigt eine positive Reaktion mit Ninhydrin und dem Rydon-Smith-Reagenz. In Dünnschichtchromatographie auf Cellulose (Avicel, Funakoshi Yakuhin Co.), entwickelt mit gemischten Lösungsmitteln von n-Butanol-Pyridin-Essig-säure-Wasser (6:4:2:4, bezogen auf das Volumen), ergibt Istamycin A einen einzelnen Fleck bei Rf 0,22 und kann daher unterschieden werden von Istamycin B, das einen einzelnen Fleck bei Rf 0,25 in demselben Dünnschichtchromatogramm ergibt. Bei der Hochspannungspapier-Elektrophorese (3.300 V, 15 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essig-säure-Wasser (25:75:900, bezogen auf das Volumen), ist die Beweglichkeit von Istamycin A und Istamycin B gleich und beträgt 2,15, bezogen auf die Beweglichkeit von Alanin mit 1,0. Daher kann Istamycin A von Istamycin B nicht unterschieden werden durch die Hochspannungspapier-Elektrophorese.

Istamycin B ist sehr ähnlich wie Istamycin A hinsichtlich seiner Eigenschaften, und Istamycin B ist ebenfalls eine basische Verbindung. Istamycin B isoliert als Carbonat liegt in Form eines farblosen Pulvers vor, das keinen definierten Schmelzpunkt hat, sondern sich bei 112-124°C zersetzt und eine spezifische optische Drehung von [«]□ = +165° (c 0,4, Wasser) zeigt und dessen Elementaranalyse koinzident ist mit dem theoretischen Wert der Molekularformel C17H35N5O5. 1 /2 H2CO3 (C 49,99%, H 8,63%, N 16,65%, O 24,73%). Diese Molekularformel wurde bestätigt durch hochauflösende Massenspektrometrie (gefunden: m/e 389,2625; berechnet für CnHssNsOs: m/e 389,2635).

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Istamycin B pelletiert in Kaliumbromid, ist in Figur 2 angegeben. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Istamycin-B-Hemi-Car-bonat in Wasser zeigt nur die End-Absorption. Im Proton ('H) Kernresonanz-Absorptionsspektrum (externer Standard: TMS, PD 5,4) zeigt Istamycin-B-Hemi-Carbonat in Deutero-Wasser die folgenden charakteristischen Signale: 8 3,26 (s, N-CH3), 3,59 (s, N-CH3) 3,95 (s, O-CH3), 4,57 (s, CH2) und 5,96 (d, J=3,5 Hz, CH). Ähnlich wie Istamycin A ist Istamycin B löslich in Wasser und Methanol, jedoch schwer löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln und zeigt eine positive Reaktion gegenüber Ninhydrin und im Rydon-Smith-Test. Wie oben angegeben, kann Istamycin B unterschieden werden von Istamycin A durch die Dünnschichtchromatographie auf Cellulose, wobei es einen Rf-Wert von 0,25 zeigt (n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser 6:4:2:4 bez. Volumen). Istamycin Ao ist ebenfalls eine basische Verbindung, und Istamycin Ao, isoliert als Hemi-Carbonat, liegt in Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor, das keinen definierten Schmelzpunkt hat, sondern sich zersetzt bei 111-114°C und eine spezifische optische Drehung aufweist von [a]o = +76° (c, 0,56, Wasser) und dessen Elementaranalyse koinzident ist mit dem theoretischen Wert der Mole-

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cularformel C15H32N4O4.1/2 H2CO3 (C 51,22%, H 9,15%, N 15,42%). Diese Molekularformel wurde bestätigt durch hoch-luflösende Massenspektrometrie (gefunden: m/e 332,2412; Derechnet für CisH3:N404: m/e 332,2420). Das Infrarotabsorptionsspektrum des Istamycin-Ao-Hemi-Carbonats, pelleiert in Kaliumbromid, wird in Figur 3 angegeben. Das Ultra-riolettabsorptionsspektrum von Istamycin-Ao-Hemi-Car-jonat in Wasser zeigt nur die End-Absorption. In dem 3roton ('H) Kernresonänz-Absorptionsspektrum (externer Standard: TMS, pd 5,0) von Istamycin-Ao-Hemi-Carbonat in Deutero-Wasser treten die charakteristischen Signale auf bei > 3,23 (s, N-CH3), 3,28 (s, N-CH3) 3,94 (s, O-CH3) und 5,86 d, J=4 Hz, CH). Istamycin Ao ist löslich in Wasser und Me-hanol, jedoch schwer löslich oder unlöslich in Äthanol und inderen üblichen organischen Lösungsmitteln und ergibt :ine positive Reaktion mit Ninhydrin und bei der Rydon-Jmith-Reaktion. Istamycin Ao ergibt einen einzelnen Fleck >ei Rf 0,36 im Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel, tntwickelt mit der niedrigen Phase der Mischung von Chlo-oform-Methanol-17% wässrigem Ammoniak (2:1:1,

>ezogen auf das Volumen). Bei der Hochspannungspapier-ilektrophorese (3.300 V, 15 Minuten) unter Verwendung von ^meisensäure-Essigsaure-Wasser (1:3:36, bezogen auf das /olumen) beträgt die Beweglichkeit von Istamycin Ao 2,35, m Vergleich zu der Beweglichkeit von Alanin gleich 1,0.

Istamycin Bo ist ebenfalls eine basische Verbindung, und venn es in Form seines Hemi-Carbonats isoliert wird, liegt es n Form eines farblosen kristallinen Pulvers vor, das keinen lefinierten Schmelzpunkt hat und eine spezifische Drehung aß6 = +160° (c 1, Wasser) aufweist und dessen Elementar-.nalyse koinzident ist mit dem theoretischen Wert der Mole-:ularformel C15H32N4O4.1/2 H2CO3.1/2 H:0 (C 49,98%, H ',20%, N 15,04%). Diese Molekularformel wurde bestätigt lurch hochauflösende Massenspektrometrie (gefunden: m/e ' 32,2384; berechnet für C15H32N4O4: m/e 332,2421). Das nfrarotabsorptionsspektrum von Istamycin Bo, pelletiert in Caliumbromid, ist in Figur 4 angegeben. Das Ultraviolettab-orptionsspektrum von Istamycin-Bo-Hemi-Carbonat in Vasser zeigt nur die Endabsorption. In dem Protonen (lH) Cernresonanzabsorptionsspektrum (externer Standard: ~MS, pD 5,2) von Istamycin-Bo-Hemi-Carbonat in Deutero-Vasser treten die charakteristischen Signale auf bei 5 3,21 (s, >I-CH3), 3,28 (s, N-CH3), 3,91 (s, O-CH3) und 5,92 (d, J=3,5 Iz, CH). Istamycin Bo ist löslich in Wasser und Methanol md schwer löslich oder unlöslich in Äthanol und anderen tblichen organischen Lösungsmitteln und ergibt eine posi-ive Reaktion mit Ninhydrin und bei der Rydon-Smith-Reak-ion. Istamycin Bo ergibt einen einzelnen Fleck bei Rf 0,14 in lem oben erwähnten Dünnschichtchromatogramm auf Sili-:agel, entwickelt mit der unteren Phase der Mischung von Chloroform-Methanol-15%igem wässrigem Ammoniak 2:1:1, bezogen auf das Volumen). Bei der oben erwähnten lochspannungspapier-Elektrophorese kann Istamycin Bo licht unterschieden werden von Istamycin Ao, da ihre Beweg-ichkeiten gleich sind und 2,35 betragen.

Die Strukturanalysen ergaben für Istamycin A die durch lie Formel Ifestgelegte Struktur, für Istamycin B die durch lie Formel II dargestellte Struktur und für Istamycin Ao die itruktur, die durch die Formel III oder IV definiert wird.

Durch weitere Untersuchungen der chemischen Struktur on Istamycin Ao wurde bestätigt, dass Istamycin Ao in einer vässrigen Lösung mit einem höheren pH-Wert als neutral die lurch Formel III angegebene Struktur annimmt, während stamycin Ao in einer wässrigen Lösung, die einen niedri-;eren pH-Wert als neutral aufweist (protonierte Form) die Itruktur der obigen Formel IV annimmt. Die Struktur von stamycin Bo wird durch die Formel V angegeben.

Istamycin A, Istamycin B, Istamycin Ao und Istamycin Bo werden im allgemeinen als freie Base oder als Hydrat oder als Carbonat erhalten und können dann umgewandelt werden in pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze durch Umsetzung mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure in üblicher Weise. Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze von Istamycin können solche sein, die erhalten werden durch Umsetzung mit einer Säure wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Sulfonsäure und dgl. oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Ascorbin-säure, Methansulfonsäure oder dgl.

Im folgenden wird Bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen:

Figur 1 zeigt eine Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums einer Probe von Istamycin-A-Hemi-Carbonat, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 2 zeigt die Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums einer Probe von Istamycin-B-Hemi-Carbonat, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 2 zeigt die Kurve des Infrarotabsorptionspektrums einer Probe von Istamycin-Ao-Hemi-Carbonat, pelletiert in Kaliumbromid.

Figur 4 zeigt die Kurve des Infrarotabsorptionspektrums einer Probe von Istamycin-Bo-Hemi-Carbonat, pelletiert in Kaliumbromid.

Istamycin A und Istamycin B gemäss der Erfindung haben eine hohe antibakterielle Aktivität gegen einen grossen Bereich von gram-negativen und gram-positiven Bakterien, wie dies hervorgeht aus den antibakteriellen Spektren dieser Substanzen, die in der folgenden Tabelle 1 angegeben sind. Istamycin A und Istamycin B verhindern in starkem Masse das Wachstum von gram-negativen und gram-positiven Bakterien. Die minimale inhibitorische Konzentration (mcg/ml) von Istamycin A und Istamycin B gegen verschiedene Bakterien wurden, bestimmt gemäss einem Standard einer Serien-Verdünnungsmethode auf Agarplatten, die bei einer Temperatur von 37°C 17 h bebrütet wurden.

Test-Mikroorganismus Minimale

Hemmkonzentrationen (mcg/ml)

Istamycin A Istamycin B

Staphylococcus aureus 209 P

1,56

0,78

Staphylococcus aureus Smith

0,39

<

0,10

Staphylococcus aureus Ap 01

1,56

1,56

Staphylococcus epidermidis 109

1,56

1,56

Micrococcus flavus FDA 16

25

6,25

Sarcina lutea PCI 1001

1,56

3,13

Bacillus anthracis

0,78

<

0,10

Bacillus subtilis PCI 219

0,39

<

0,10

Bacillus subtilis NRRLB-558

1,56

<

0,10

Bacillus cereus ATCC 10702

6,25

3,13

Corynebacterium bovis 1810

3,13

1,56

Mycobacterium smegmatis ATCC 607

1,56

0,78

Escherichia coli NIHJ

3,13

1,56

Escherichia coli K-12

3,13

1,56

Escherichia coli K-12 R5

6,25

6,25

Escherichia coli K-12 R388

3,13

1,56

Escherichia coli K-12 J5R11-2

3,13

1,56

Escherichia coli K-12 M LI 629

3,13

3,13

Escherichia coli K-12 MLI630

6,25

3,13

Escherichia coli K-12 ML1410

12,5

3,13

Escherichia coli K-12 ML1410 R81

6,25

3,13

Escherichia coli K-12 LA290 R55

6,25

3,13

Escherichia coli K-12 LA290 R56

3,13

1,56

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60

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Test-Mikroorganismus Minimale

Hemmkonzentrationen (mcg/ml)

Istamycin A Istamycin B

Escherichia coli K-12 LA290 R64

3,13

1,56

Escherichia coli W677

3,13

1,56

Escherichia coli JR66/W677

6,25

6,25

Escherichia coli K-12 C600 R135

>50

25

Escherichia coli JR225

3,13

1,56

Klebsiella pneumoniae PCI602

6,25

3,13

Klebsiella pneumoniae 22#3038

12,5

12,5

Shigella dysenteriae JS11910

12,5

6,25

Shigella flexneri 4B JS11811

12,5

12,5

Shigella sonnei JS11756

12,5

12,5

Salmonella typhi T-63

1,56

12,5

Salmonella enteritidis 1891

3,13

3,13

Proteus vulgaris OX19

1,56

0,78

Proteus rettgeri GN311

25

12,5

Proteus rettgeri GN466

6,25

6,25

Serratia marcescens

25

12,5

Serratia SOU

>50

>25

Serratia 4

>50

>25

Providencia Pvl6

50

12,5

Providencia 2991

50

25

Pseudomonas aeruginosa A3

>50

12,5

Pseudomonas aeruginosa No. 12

>50

>25

Die antibakterielle Aktivität von Istamycin Ao und Istamycin Bo wurde bestimmt gemäss einem Standard-Serien-Verdünnungsverfahren auf Agarplatten in derselben Weise wie für Istamycin A und Istamycin B. Istamycin Ao und Istamycin Bo zeigen eine sehr schwache Aktivität. Wie gefunden wurde, beträgt die antibakterielle Aktivität von Istamycin Ao ungefähr 1/200 von derjenigen von Istamycin A und die antibakterielle Aktivität von Istamycin Bo etwa 1 /200 von derjenigen des Istamycin B, wenn Bacillus subtilis als Test-Mikroorganismus verwendet wird.

Mäuse tolerierten eine intravenöse Verabreichung von 100 mg/jig von Istamycin A, Istamycin B, Istamycin Ao oder Istamycin Bo.

Aus den oben erwähnten Eigenschaften von Istamycin A und Istamycin B geht hervor, dass sie in einigen Punkten ähnlich sind wie Fortimicin A [R. Okachi et al., Journal of Antibiotics, Band 30, Seite 541 ( 1977)] und Sporaricin [T. Deushi et al., Journal of Antibiotics, Band 32, Seite 173 (1979)]. Nichtsdestoweniger wurde bestätigt, dass Istamycin A und B zweifellos unterschieden werden können von diesen Antibiotika, da die Istamycine keine C-Methylgruppe enthalten, sondern zwei N-Methylgruppen, so dass die Istamycine A, B und auch die Istamycine Ao und Bo neue Antibiotika sein sollten.

Erfindungsgemäss sind die Istamycine A, B, Ao und Bo erhältlich durch Kultivieren eines Istamycin produzierenden Stammes von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bis eine wesentliche Menge Istamycin produziert und im Kulturmedium angereichert ist. Zur Herstellung von Istamycin A wird im genannten Verfahren ein Istamycin A produzierender Stamm von Streptomyces eingesetzt. Entsprechend können die Istamycine B, Ao bzw. Bo unter Verwendung eines Istamycin B, Aobzw. Bo produzierenden Stammes von Streptomyces erhalten werden. Die vorgenannten Verfahren können femer.die Gewinnung in Form der reinen Substanzen, der Rohprodukte oder der Lösungen oder als rohen Feststoff oder als eine Mischung von mindestens zwei der genannten Istamycine A, B, Ao und Bo umfassen.

Als Beispiel für einen Istamycin produzierenden Stamm wird erwähnt ein Stamm von Actinomycetes, der isoliert wurde aus einer Bodenprobe, gewonnen am Seeufer der Küste von Miura Penisola in der Präfektur von Kanagawa, Japan, im August 1978 und der bezeichnet wurde als Stamm Nr. SS-939.

Dieser SS-939-Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.

(a) Mikroskopische Morphologie

Wenn der SS-939-Stamm gut in Agarmedium wächst, produziert das Mycélium einpolige Zweige. Aus dem Substrat Mycélium entwickeln sich gerade oder ein wenig gebogene Luft-Hyphae. Die reifen Luft-Hyphae tragen an der Spitze eine Kette von 10 bis 50 Sporen. Die Gestalt der Sporen ist zylindrisch (1 Mikron breit x 4-5 Mikron lang). Keine Spiralen oder gewundenen Abzweigungen werden beobachtet. Unter dem Elekronenmikroskop ist die Oberfläche der Sporen weich und hat keine haarige oder spinnenförmige Struktur. Es wird weder Flagellum noch Sporagium beobachtet, so dass der SS-939-Stamm ein typischer Strepto-myces-Stamm ist.

(b) Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien

(1) Auf Sucrose-Nitrat-Agarmedium (bebrütet bei 27°C): schwaches, farbloses Wachstum mit Luft-Hyphae, die farblos sind und allmählich in Grau übergehen mit einem bläulichen grünen Farbton (17 ec, wasserblau, entsprechend dem Farbstandard, der angegeben ist in «Color Harmony Manual», veröffentlicht durch Container Corporation of America; dieser Standard wird im folgenden immer angewandt, sofern nicht anders angegeben). In dem Bebrütungsmedium wird kein diffusibles Pigment beobachtet.

(2) Auf Glycerin-Asparagin-Agarmedium (bebrütet bei 27°C): im wesentlichen dasselbe wie in dem Sucrose-Nitrat-Agarmedium, wie vorstehend unter (1) angegeben, jedoch kann das Luft-Hyphae schwierig hergestellt werden.

(3) Auf Stärke Agarmedium (bebrütet bei 27°C): im wesentlichen dasselbe wie auf dem Sucrose-Nitrat-Agarmedium, wie oben unter (1) angegeben, jedoch wird Luft-Hyphae produziert. Die Stärke an der Peripherie des Wachstums wird transparent.

(4) Auf Tyrosin-Agarmedium (bebrütet bei 37°C): Kulturmerkmale im wesentlichen diesselben wie auf den unter (I) und (2) angegebenen Medien, jedoch wird malanoides Pigment produziert.

(5) Auf Nähr-Agarmedium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum, auf dem Luft-Hyphae von weisser Farbe gebildet werden. Das Inkubationsmedium ist durchzogen mit dunklem Braun.

(6) Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum, auf dem Luft-Hyphae gebildet werden. Die Luft-Hyphae ist von weisser Farbe und scheint allmählich grau mit einem bläulich-grünen Farbton

( 19 de, aqua green). Das Medium wird dunkelbraun in der Farbe.

(7) Auf Hafermehl-Agarmedium (bebrütet bei 27°C): farbloses Wachstum, auf dem Luft-Hyphae von weisser bis blaugrauer Farbe (17 ec, aqua blue) gebildet wird.

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Temperatur: Wachsen bei 20-41°C.

(2) Hydrolyse von Stärke: Stärke wird in Stärke-Agarme-dium hydrolysiert.

(3) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch: im wesentlichen negativ.

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(4) Bildung von Melanoid-Pigment: positiv auf Tyrosin-Agarmedium und auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agarme-diurri

(d) Verwendung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum (geschätzt in Pridham-Gottlieb-Medium)

Glukose und Inositol sind verwendbar.

Arabinose, D-Xylose, Sukrose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol sind verwendbar. Die Verwendung von D-Fruc-tose ist zweifelhaft.

Werden die vorgenannten Charakteristika zusammengenommen, so ergibt sich der SS-939 Stamm, der zum Geschlecht Streptomyces gehört und charakterisiert ist durch die Abwesenheit von Spiralen auf dem Luft-Hyphae und durch seine Farbgebung. Auf der Basis der vorgenannten Eigenschaften wurde der SS-939 Stamm verglichen mit bekannten Spezies von Streptomyces gemäss der Beschreibung in dem «International Streptomyces Project» (ISP) und Bergey's Determinative Bacteriology, 1974. Die Charakteristika des SS-939 Stamms gleichen sehr weit dem Streptomyces viridochromogenes. Jedoch ist der SS-939 Stamm verschieden von S. viridochromogenes, insofern als er weder Spiralen vorbringt noch die Verwendung von Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fructose, Raffinose und Mannitol zeigt. Ein anderer wesentlicher Unterschied besteht darin, dass die Oberfläche der Sporen, die von SS-939 produziert werden, nicht spinnenförmig ist. Ferner hat Streptomyces viridifa-ciens keine farbgebenden Eigenschaften und produziert Luft-Hyphae in einer Farbe, die ähnlich ist derjenigen des SS-939 Stamms. Jedoch können sie insofern unterschieden werden als der SS-939 Stamm weder Spiralen an der Luft-Hyphae produziert noch Fructose und Sukrose als Kohlenstoffquellen für sein Wachstum verwendet. Darüberhinaus kann keine bekannte Spezies von Streptomyces festgestellt werden, die die Eigenschaften bei der Verwendung von Kohlenstoffquellen aufweist, die charakteristisch sind für den SS-939 Stamm. Daher stellt der SS-939 Stamm eine neue Spezies dar und wird bezeichnet als Streptomyces tenjimariensis.

Der SS-939 Stamm Streptomyces tenjimariensis wurde hinterlegt in der offiziellen japanischen Hinterlegungsstelle «Fermentation Research Institute», Agency of Industriai Science and Technology, Tsukuba-gun, Ibaragi Prefecture, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P4932 am 21. April 1979, und wurde auch hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C., U.S. A. unter der ATCC Nummer 31603 am 19.2.1980.

Eine Mutation von Actinomycetes tritt häufig entweder unter künstlichen oder spontanen Bedingungen ein. Daher schliesst die vorliegende Erfindung die Verwendung des SS-939 Stamms als solchen als auch dessen Varianten und Mutanten ein sofern diese Istamycin hervorbringen.

Istamycin kann erhalten werden durch aerobe Kultivierung von Sporen oder Mycélium eines Istamycin produzierenden Stamms von Streptomyces, z.B. Streptomyces tenjimariensis SS-939 Stamm (identisch mit FERN-P4932 oder ATCC Nummer 31603). Zur Durchführung dieses erfin-dungsgemässen Verfahrens werden Sporen oder Mycélium eines Istamycin produzierenden Stammes geimpft in einem geeigneten Kulturmedium, das assimilierbare Nährquellen enthält und dann bebrütet unter aeroben Bedingungen, bis eine Kulturbrühe erhalten wird, die Istamycin enthält, d.h. mindestens eines der Istamycine A, B, Ao oder Bo. Im allgemeinen können Nährstoffe der Kulturmedien, die im allgemeinen für die Kultivierung von üblichen Actinomycetes verwendet werden für die Zwecke der Erfindung angewandt werden. Als Stickstoffquellen können beispielsweise verwendet werden handelsübliches Sojabohnenmehl, Erdnuss-pulver, Baumwollsaatmehl, getrocknete Hefe, Pepton,

Fleischextrakt, Kasein, Getreideweiche, Natriumnitrat, Ammoniumsulfat und dergl. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise verwendet werden handelsübliche Kohlenhydrate, wie Glukose, Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Saccharose, Lactose und dergl., ebenso wie Sojabohnenöl und Fette. Sofern erforderlich können im Kulturmedium zusätzlich anorganische Salze verwendet werden, wie Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid und Phosphate ebenso wie verschiedene Aminosäuren. Beim erfindungsgemässen Verfahren können ferner beliebige Nährstoffe, die bekannt sind zur Kultivierung von Actinomycetes verwendet werden, sofern sie assimilierbar sind durch den Istamycin produzierenden Stamm für die Produktion von Istamycin.

Für die grosstechnische Produktion von Istamycin wird die flüssige Kultivierung bevorzugt. Hierbei kann eine beliebige Temperatur bei der der Istamycin produzierende Stamm gedeiht und Istamycin produziert, angewandt werden, eine bevorzugte Temperatur liegt im Bereich von 25 bis 30°C. Die Kultivierung wird im allgemeinen solange durchgeführt bis eine ausreichende Menge Istamycin produziert ist, im allgemeinen beträgt diese 2 bis 7 Tage.

Die Prüfung auf Istamycin A und Istamycin B kann durchgeführt werden unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus gemäss dem Standard Platten verfahren, das im allgemeinen verwendet wird zur Prüfung auf bekannten Antibiotika. Eine Probe eines reinen Istamycins A, das gemäss dem unten beschriebenen Beispiel 3 erhalten wurde, kann als authentisches Produkt verwendet werden und zeigt eine Potenz von 1000 mcg. (Einheiten) pro mg. Eine Probe eines reinen Istamycin B, das erhalten wurde gemäss Beispiel 3 zeigt eine Potenz von 3170 mcg (Einheiten)/mg.

Die Prüfung von Istamycin Ao und Istamycin Bo kann auch durchgeführt werden unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus gemäss dem Standard-Plattenverfahren, das im allgemeinen verwendet wird für die Prüfung bekannter Antibiotika. Eine Probe eines reinen Istamycins Ao, erhalten gemäss der Erfindung hat eine Potenz von 5 mcg (Einheiten)/mg und eine Probe eines reinen Istamycins Bo, erhalten gemäss der Erfindung, hat eine Potenz von 10 mcg (Einheiten)/mg., wenn angenommen wird, dass die reine authentische Probe von Istamycin A eine Potenz von 1000 mcg (Einheiten)/mg hat.

Istamycin A, B, Ao, Bo und ebenso ihre Säureadditionssalzt sind leicht löslich in Wasser und der Istamycinkomplex ist hauptsächlich anwesend in der Lösung der flüssigen Phase der Kulturbrühe des Istamycin produzierenden Stamms. Ista mycin A und B sowie auch Istamycin Ao und Istamycin Bo sind in Lösung in Wasser praktisch nicht extrahierbar durch ein organisches Lösungsmittel, wie Sutanol, Butylacetat, Chloroform oder einem anderen wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, so dass diese organischen Lösungsmittel zur Entfernung von Verunreinigungen aus der Kulturbrühe durch Extraktion angewandt werden können. Für die Gewinnung des Istamycinkomplexes aus der Kulturbrühe oder aus einer wässrigen Lösung von Istamycin können diese behandelt werden mit verschiedenen Adsorptionsmitteln zur Trennung des Istamycins durch Adsorption. Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, kann das Istamycin extrahiert werden mit schwach angesäuertem Wasser, schwach angesäuertem wässrigen Äthanol, schwach angesäuertem wässrigen Propanol, schwach angesäuertem wässrigen Aceton oder dergl.

Wegen seiner Basizität kann das Istamycin auf wirksame Weise adsorbiert werden durch ein Kationenaustauschharz, aus dem es dann mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert wird. Die Adsorption an einem Kationenaustauschharz ist ein sehr geeigneter Weg zur Gewinnung von Istamycin aus

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einem grossen Volumen der Kulturbrühe. Der für diese Zwecke zu verwendende Kationenaustauscher kann ein Kationenaustauschharz sein, das Carboxylfunktionen aufweist, wie Amberlite IR.C-50 und Amberlite CG-50 (ein Produkt von Rohm & Haas Co., U.S.A.), Lewatit CNP (ein Produkt von Bayer Co., Westdeutschland), CM-Sephadex (ein Produkt von Pharmacia Co, Schweden) in der H-Form, Na-Form oder NH4-Form oder als Mischung dieser Formen. Die Eluierung kann durchgeführt werden durch Behandlung mit angesäuertem Wasser, verdünntem wässrigen Ammoniak oder einer wässrigen Lösung eines anorganischen Salzes. Die Eluierung für diesen Zweck kann durchgeführt werden mit 0,2N bis 1N Salzsäure und 0,2N bis IN wässrigem Ammoniak. Da Istamycin A, B, Ao und Bo praktisch nicht adsorbierbar sind durch ein Anionenaustauschharz, kann dieses Anionenaustauschharz verwendet werden zur Neutralisierung einer sauren wässrigen Lösung von Istamycin oder zur Entfernung von sauren Verunreinigungen aus der Lösung von Istamycin.

Um die einzelnen Istamycine A, B, Ao und Bo getrennt aus dem Istamycinkomplex zu gewinnen, wird dieser eine Kolonnenchromatographie über Kieselsäuregel unterworfen und entwickelt mit der unteren Phase der gemischten Lösungsmittel aus Chloroform-Methanol-17%igem wässrigem Ammoniak (2:1:1, bezogen auf das Volumen) oder ähnlichen gemischten Lösungsmitteln unter Ausnutzung der Charakteristika der Istamycine nach denen Istamycin A einen einzelnen Flecken bei Rf 0,17, Istamycin B einen einzelnen Fleck bei Rf 0,11, Istamycin Ao einen einzelnen Fleck bei Rf 0,36 und Istamycin Bo einen einzelnen Fleck bei Rf 0,14 gibt. Zur Trennung von Istamycin A von Istamycin B kann eine Mischung derselben einer chromatographischen Trennung in einer Cellulosekolonne unterworfen werden, die entwickelt wird mit gemischten Lösungsmitteln aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:4, bezogen auf das Volumen) und ähnliche gemischte Lösungsmittel unter Ausnutzung der Tatsache, dass Istamycin A einen einzelnen Fleck bei Rf 0,22 ergibt, während Istamycin B einen einzelnen Fleck bei Rf 0,25 ergibt. Diese Verfahren zur chromatographischen Trennung können auch angewandt werden zur Gewinnung der Istamycine und ebenso für die Reinigung der isolierten Istamycine. Istamycin A, B, Ao oder Bo können isoliert werden im gereinigten Zustand unter Anwendung der oben beschriebenen Extraktionsverfahren und der chromatographischen Isolierverfahren entweder allein oder in wiederholter Folge einer geeigneten Kombination.

Für die Gewinnung des Istamycinkomplexes und für die Isolierung und Reinigung der einzelnen Istamycine wird das folgende Verfahren bevorzugt: Die Kulturbrühe des Istamycin produzierenden Stammes wird auf ein pH von 2,0 eingestellt durch Zugabe von Salzsäure und dann filtriert,

worauf das Filtrat in eine Kolonne eines Kationenaustausch-harzes wie Amberlite IRC-50 (NH4 Zyklus) zur Adsorption des Istamycins an dem Harz gegeben wird. Das Harz wird gewaschen mit Wasser und dann mit 1N wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei eine konzentrierte Lösung erhalten wird, die anschliessend durch eine Kolonne eines Kationenaustauschharzes wie Amberlite CG-50 zur Durchführung der Adsorption des Istamycins durch das Harz gegeben wird. Dieses Harz wird gewaschen mit Wasser und dann mit 0,2N wässrigem Ammoniak und anschliessend eluiert mit 0,4N wässrigem Ammoniak.

Eine Serie der aktiven Fraktionen, enthaltend eine wesentliche Menge des Istamycin B wird kombiniert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein rohes Pulver von Istamycin B erhalten wird. Dieses rohe Pulver wird wiederholt einer Kôlonnenchromatographie in Silikagel unterworfen und ergibt farbloses Pulver von gereinigtem Istamycin B.

Eine Serie der aktiven Fraktionen, enthaltend eine wesentliche Menge von Istamycin A sowie eine gewisse Menge der Istamycine Ao und Bo werden kombiniert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein rohes Pulver erhalten wird, enthaltend die Istamycine A, Ao und Bo. Dieses rohe Pulver wird dann der Kolonnenchromatographie in Silikagel unterworfen, entwickelt mit der unteren Phase des gemischten Lösungsmittels aus Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigen Ammoniak (2:1:1, bezogen auf das Volumen).

Diejenigen aktiven Fraktionen des Eluats, die nur Istamycin Ao enthalten, werden kombiniert und im Vakuum eingedampft, die eingeengte Lösung durch eine Kolonne eines Kationenaustauschharzes wie Amberlite CG-50 (NH4 Zyklus) unterworfen, und anschliessend eluiert mit 0,5N wässrigem Ammoniak. Die auf diese Weise eluierten aktiven Fraktionen, enthaltend nur Istamycin Ao, werden kombiniert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein farbloses Kristallpulver von reinem Istamycin Ao erhalten wird.

Diejenigen aktiven Fraktionen des Eluats aus der vorstehend genannten Silikagelkolonnenchromatographie, die Istamycin A enthalten, werden kombiniert und im Vakuum eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird nochmals einer Kolonnenchromatographie über Kieselgel unterworfen und diejenigen aktiven Fraktionen, die nur Istamycin A enthalten, kombiniert, zur Trockne eingedampft, wobei ein farbloses Pulver von gereinigtem Istamycin A erhalten wird. Diejenigen Fraktionen des Eluats aus der vorgenannten Silika-gelkolonnenchromatographie, die nur Istamycin Bo enthalten, werden kombiniert und im Vakuum eingedampft, die erhaltene eingeengte Lösung einer Kolonnenchromatographie in einem Kationenaustauschharz wie Amberlite CG-50 (NH4 Zyklus) unterworfen, entwickelt mit 0,5N wässrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen des Eluates, die nur Istamycin Bo enthalten, werden kombiniert und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein farbloses kristallines Pulver von gereinigtem Istamycin Bo erhalten wird.

Aus den Untersuchungen über die Struktur der Istamycine A, B, Ao und Bo geht hervor, dass Istamycin Ao ein Deglycyl-Derivat von Istamycin A und dass Istamycin Bo ein Degly-cylderivat von Istamycin B ist (vergleiche die Formeln (I) und (II) mit den Formeln (III), (IV), (V), die oben angegeben sind). Daher können die erfindungsgemässen Istamycin A und B hergestellt werden durch Kondensation eines Glycin-moleküls mit der Methylaminogruppe in der 4-Stellung von Istamycin Ao oder Istamycin Bo. Diese Umwandlung ist wertvoll, da Istamycin A und Istamycin B eine höhere antibakterielle Aktivität haben und daher wertvollere therapeutische Mittel sind als Istamycin Ao und Istamycin Bo.

Darüberhinaus wurde gefunden, dass Istamycin Ao und Istamycin Bo hergestellt werden können durch Hydrolyse von Istamycin A bzw. Istamycin B unter alkalischen Bedingungen. Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren besteht daher darin Istamycin Ao herzustellen aus Istamycin A oder Istamycin Bo aus Istamycin B durch Hydrolysieren von Istamycin A oder Istamycin B in wässriger Lösung unter alkalischen Bedingungen. Die alkalische Hydrolyse von Istamycin A oder B nach diesem Verfahren kann durchgeführt werden durch Erhitzen einer wässrigen Lösung von Istamycin A oder Istamycin B auf 50-110°C in Gegenwart von Alkali, wie beispielsweise eines Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxids oder Carbonats, beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhy-droxid, Bariumhydroxid oder dergl. Das Alkali, beispielsweise Alkalimetallhydroxid kann in einer Konzentration von 0,1 bis 4M vorliegen. Die Hydrolyse kann in 1 bis 3 Stunden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann sie durchgeführt werden durch einstündiges Erhitzen in Wasser, das 4M

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Natriumhydroxid enthält bei 100°C oder durch dreistündiges Erhitzen in Wasser, das 0,5M Bariumhydroxid enthält bei 100°C. Unter diesen Reaktionsbedingungen werden die glykosidischen Bindungen von Istamycin Ao oder Istamycin Bo nicht aufgebrochen. Die alkalische Hydrolyse kann auch durchgeführt werden in einer Kulturbrühe oder einem Filtrat der Kulturbruhe, enthaltend Istamycin A oder Istamycin B.

Das erfindungsgemässe Istamycin A und Istamycin B hat eine hohe antibakterielle Aktivität und eine niedrige Toxizität gegenüber Tieren. Daher sind sie, ähnlich wie bekannte Antibiotika als antibakterielle Mittel geeignet und können formuliert werden in pharmazeutischen Anwendungsformen und verabreicht werden in derselben Weise wie bekannte antibakterielle antibiotische Mittel. Gemäss der Erfindung wird daher ferner ein pharmazeutisches Präparat vorgeschlagen, das eine sichere und wirksame antibakterielle Menge von mindestens einem Istamycin A, Istamycin B oder deren Säureadditionssalze enthält in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Es ist selbstverständlich, dass die tatsächlich anzuwendenden bevorzugten Menge des Istamycins variieren entsprechend den speziell formulierten Zubereitungen, der Art der Anwendung und der besonderen Art des zu behandelnden Organismus. Bei der Anwendung des Mittels wird der Fachmann ferner in Betracht ziehen das Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Zeit der Ausscheidung, Kombination von Arzneimitteln, Sensibilisierungsreaktion und Schwere der Erkrankung. Aufgrund der vorstehenden Richtlinien können vom Fachmann die optimalen Anwendungsmengen angegeben werden unter Benützung üblicher Testverfahren zur Bestimmung der üblichen Dosierungen.

Wie oben angebeben, ist Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932, ATCC Nummer 31603) ein neuer Mikroorganismus, der neue Antibiotika Istamycine produziert, die die vorstehend genannten mikrobiologischen Eigenschaften haben. Der neue und wertvolle Mikroorganismus Streptomyces tenjimariensis SS-939, isoliert in im wesentlichen reinem Zustand und deponiert als FERM-P 4932 oder ATCC Nummer 31603, weist die Charakteristika auf, dass er Luft-Hyphae von weisser Farbe bildet, die allmählich übergehen in einen grau mit graublauem Farbstich, dass das Luft-Hyphae keine Spiralen bildet, die Sporen eine weiche Oberfläche haben und dass der Stamm chromogenbildend ist, Glukose und Inositol, jedoch nicht Arabinose, D-Xylose, Sukrose, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol als Kohlenstoffquelle verwendet und dass er fähig ist Istamycine A, B, Ao und Bo zu produzieren. Dieser SS-939 Stamm wurde isoliert durch Bebrühten einer Bodenprobe, die gesammelt wurde an der Seeseite der Küste von Miura Penisola in der Präfektur Kanagawa, Japan auf einem M Y-Kulturmedium enthaltend 1% Maltose, 0,4% Hefeextrakt, 1,5% Agar (pH 7,2) unter Zugabe von 10 mcg/ml Kanamycin A. Nach dreitägigem Bebrühten des vorgenannten Agars bei 27°C wurde die Isolierung durchgeführt durch Aufnehmen des Mycéliums und der Sporen einer Kolonie, die produziert wurde auf dem genannten MY-Medium. Das genannte Mycélium und die Sporen wurden auf Platten eines Pridham-Gotlieb Kulturmediums (Testmedium zur Bestimmung der Assimilierbarkeit von verschiedenen Kohlenhydraten) geimpft, wobei jedes 1% Glukose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Raffinose oder Inositol enthielt. Auf diese Weise kann ein Stamm von Actionmycetes als S. tenjimariensis erhalten werden, der auf einem solchen Pridham-Gotlieb Medium gewachsen war, das Inositol enthielt, wobei die Assimilierbarkeit von Inositol gezeigt wurde.

Es wird angenommen, dass unter Anwendung der vorstehenden Beschreibungen und ohne weitere Ermittlungen der Fachmann das Konzept der vorliegenden Erfindung in seinem vollen Umfang benutzen kann. Die folgenden bevorzugten spezifischen Ausführungsformen dienen daher lediglich als Erläuterung der Erfindung.

Bevorzugte Ausführungsformen

Beispiel ]

Eine Agar-Schrägkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932, identifiziert als ATCC Nummer 31603) wurde geimpft auf ein flüssiges Kulturmedium (110 ml, in Erlenmeyer Kolben von 500 ml) enthaltend 1,0% Stärke, 0,2% Glukose, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat (7 H2O), mit anschliessender 48-stündiger Kultivierung unter Rotation und Schütteln bei 27°C, wobei eine Saatkultur erhalten wird. Die erhaltene Saatkultur (220 ml) wurde geimpft in einen 30-Liter Fermentor, enthaltend 15 Liter eines flüssiges Kulturmedium enthaltend 2,0% Stärke, 0,2% Glukose, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat (7 H2O). Die Fermentation wurde 72 h bei 27°C unter Belüftung (151 Luft pro Minute) und Bewegung (300 Upm) durchgeführt.

Die Kulturbrühen aus 6 Fermentatoren wurden kombiniert, das pH durch Zugabe von Salzsäure auf 2,0 eingestellt und dann filtriert, wobei 901 des Filtrats der Brühe erhalten wurden (Potenz 2,5 mcg/ml). Das Filtrat wurde durch eine Kolonne von 121 gegeben, die beschickt ist mit Amberlite IRC-50 (NH4 Form) (ein Produkt von Rohm & Haas Co., USA) zur Adsorption des Istamycins durch das Harz. Das Harz wurde gewaschen mit 241 Wasser und dann eluiert mit IN wässrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden kombiniert (3,1), im Vakuum zur Trockne eingedampft und ergaben 3,51g eines rohen Pulvers (Potenz 61 mcg/mg).

Dieses rohe Pulver wurde gelöst in 100 ml Wasser und die erhaltene Lösung durch eine Kolonne (40 mm Durchmesser) von 300 ml eines Anionenaustauschharzes, Dowex 1-X4 (OH Form) (ein Produkt von Dow Chemical Co., USA) gegeben, mit anschliessender Entwicklung der Kolonne mit Wasser. Die ersten Durchläufe (200 ml) des Abflusses aus der Kolonne wurden verworfen und die darauffolgenden Fraktionen (880 ml) gesammelt und in eine Kolonne (25 mm Durchmesser) von 150 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Diese Kationenaus-tauschharz-Kolonne wurde gewaschen mit Wasser (300 ml) und anschliessend eluiert mit 900 ml 0,2N wässrigem Ammoniak und dann mit 90 ml 0,4N wässrigem Ammoniak. Das Eluat wurde gesammelt in 18 ml-Fraktionen. Die aktiven Fraktionen Nrn. 66-80 wurden kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 210mg eines weissen Pulvers (Potenz 460 mcg/mg), enthaltend Istamycin A und B erhalten wurden. Die Fraktionen Nrn. 28-65 wurden in ähnlicher Weise behandelt und ergaben ein rohes Pulver, das einige andere unidentifizierte Antibiotika als Istamycin A, B, Ao und Bo enthielt.

Beispiel 2

Das Filtrat der Brühe (150 Liter, erhalten aus 10 Fermentatoren), das erhalten wurde durch Fermentation von Streptomyces tenjimariensis in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde durch eine Kolonne von 201 Amberlite IRC-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser (401) wurde die Kolonne eluiert mit 1N wässrigem Ammoniak und die aktiven Fraktionen des Eluats wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 4,1 g eines rohen Pulvers (Potenz, 240 mcg/mg).

Dieses rohe Pulver wurde gelöst in 20 ml Wasser und die

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erhaltene wässrige Lösung in eine Kolonne (30 mm Durchmesser) von 200 ml Dowex 1-X4 (OH Form) gegeben und anschliessend mit Wasser entwickelt. Die ersten Durchläufe (270 ml) des Eluats wurden verworfen und die nächsten Läufe (270 ml) wurden dann durch eine Kolonne (25 mm Durchmesser) von 150 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Die Harzkolonne wurde gewaschen mit 150 ml Wasser und dann eluiert mit 900 ml 0,2N wässrigem Ammoniak und mit 900 ml 0,4N wässrigem Ammoniak. Die Eluate wurden gesammelt in 18 ml-Frak-tionen. Die Fraktionen Nrn. 55-90 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 980 mg eines weissen Pulvers (Potenz 940 mcg/mg) enthaltend Istamycin A und B.

Beispiel 3

Das weisse Pulver (980 mg, Potenz 940 mcg/mg), enthaltend die Istamycine A und B gemäss Beispiel 2 wurde aufgenommen in 15 ml einer Mischung von n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:2 bezogen auf das Volumen), und die erhaltene Lösung wurde in eine Kolonne (25 mm Durchmesser) von 60 g Cellulosepulver(Avicel, ein Produkt von Funakoshi Yakuhin Co.) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Die Cellulose-Kolonne wurde entwickelt zuerst mit 1200 ml eines gemischten Lösungsmittels von n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:2 bezogen auf das Volumen) und anschliessend mit 600 ml eines gemischten Lösungsmittels von n-ButanoI-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:2:4 bezogen auf das Volumen). Das Eluat wurde gesammelt in 10 ml-Fraktionen. Die Fraktionen Nrn. 45-74 enthielten nur Istamycin B, die Fraktionen Nrn. 114-154 enthielten nur Istamycin A und die Fraktionen Nrn. 75-113 enthielten Istamycin A und B in Mischung.

Die vorstehend genannten Fraktionen Nrn. 45-74 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben ein weisses Pulver, das dann in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die wässrige Lösung des auf diese Weise erhaltenen Istamycin B wurde in eine Kolonne von 25 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycin B gegeben. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Harzkolonne eluiert mit 0,4N wässrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 40 ml) des Eluats wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 15,3 mg eines Pulvers von reinem Istamycin B (Potenz, 3170 mcg/mg).

Die vorstehend genannten Fraktionen Nrn. 114-154 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben ein Pulver, das dann in 5 ml Wasser gelöst wurde. Die auf diese Weise erhaltene Lösung von Istamycin A wurde in eine Kolonne von 25 ml Amerlitc CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycin A gegeben. Nach dem Waschen mit 25 ml Wasser wurde die Kolonne mit 0,4N wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 45 ml) des Eluats wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 50 mg eines Pulvers von reinem Istamycin A (Potenz, 1000 mcg/mg).

Beispiel 4

Eine Schrägkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P4932, identifiziert als ATCC Nummer 31603)

wurde geimpft in ein flüssiges Kulturmedium (110 ml in einem Erlenmeyer Kolben von 500 ml) enthaltend 1,0% Stärke, 0,2% Glukose, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magncsiumsulfat (7 HiO). Es wurde 48 h bei 27°C unter Schütteln und Rotation kultiviert, wobei eine Saatkultur erhalten wurde. Diese Saatkultur (220 ml) wurde geimpft in 201 Fermontatorcn, enthaltend 151 eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 2,0% Stärke, 0,2% Glukose, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,2% Natriumpalmitat, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat (7 H>0). Die Fermentation wurde 72 h bei 27°C unter Belüftung 5(151 Luft pro Minute) und Bewegung (30 Upm) durchgeführt.

Die auf diese Weise hergestellte Kulturbrühc wurden aus 10 Fermentatoren entnommen, durch Zugabe von Salzsäure auf ein pH von 2,0 eingestellt und ergab 1501 eines Filtrats 10 (Potenz, 6 mcg/mg). Diese Filterbrühe wurde dann durch eine Kolonne von 121 Amberlite IRC-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycin gegeben. Nach dem Waschen mit 241 Wasser wurde die Harzkolonne eluiert mit 1N wässrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen (insgesamt 5,61) des 15 Eluats wurden kombiniert und unter vermindertem Druck eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wurde in eine Kolonne von 200 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Nach dem Waschen mit 200 ml Wasser wurde die Harzkolonne gewaschen mit 20 1200 ml 0,2N wässrigem Ammoniak und dann eluiert mit 1200 ml 0,4N wässrigem Ammoniak. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen abgeteilt.

Die Fraktionen Nrn. 80-106 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 240 mg 25 eines rohen Pulvers von Istamycin B (Potenz, 380 mcg/mg) erhalten wurde. Dieses rohe Pulver wurde wiederholt einer Kolonnenchromatographie in Silikagel, entwickelt mit der unteren Phase einer Mischung von Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigem Ammoniak (2:1:1) unterworfen, bis ein 30 gereinigtes, weisses Pulver von Istamycin B mit einer Potenz von 1350 mcg/mg erhalten wurde. Ausbeute 35 mg.

Die Fraktionen Nr. 107-124 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 380 mg eines rohen Pulvers (Potenz, 180 mcg/mg), enthal-35 tend die Istamycine A, Ao und Bo. Dieses rohe Pulver wurde einer Kolonncnchromatographic unter Verwendung einer Kolonne von 38 g Silikagel (60, Produkt von E. Merck Co., Germany) unterworfen und mit der unteren Phase eines gemischten Lösungsmittels von Chloroform-Methanol-40 8,5%igem wässrigem Ammoniak (2:1:1, bezogen auf das Volumen) unterworfen. Das Eluat aus der Silikagelkolonne wurde in 5 ml-Fraktionen abgetrennt.

Die Fraktionen Nrn. 54-61 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck eingedampft und dann in eine Kolonne 45 von 3 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption von Istamycin Ao gegeben. Die Amberlite-Kolonne wurde eluiert mit 0,5N wässrigem Ammoniak und die aktiven Fraktionen des Eluats wurden unter vermindertem Druck eingedampft und ergaben ein farbloses kristallines Pulver von reinem Ista-50 myein Ao (Potenz, 5 mcg/mg). Ausbeute 25 mg.

Die Fraktionen Nr. 65-76 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck eingedampft und einer Kolonnenchroma-tographie unter Verwendung einer Kolonne von 10 g Silikagel unterworfen und entwickelt mit der unteren Phase eines 55 gemischten Lösungsmittels von Chloroform-Methanol-8,5%igem wässrigem Ammoniak (2:1:1) zur Reinigung von Istamycin A. Auf diese Weise wurde ein farbloses Pulver von reinem Istamycin A (Potenz, 1000 mcg/mg) in einer Ausbeute von 23 mg erhalten.

f,o Die Fraktionen Nrn. 77-90 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck eingeengt und dann durch eine Kolonne von 3 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption von Istamycin Bo gegeben. Diese Kolonne wurde eluiert mit 0,5N wässrigem Ammoniak und die aktiven Fraktionen des Eluats «5 wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei ein farbloses Kristallpulver von reinem Istamycin Bo (Potenz, 10 mcg/mg) erhalten wurde. Ausbeute

18 mg.

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Beispiel 5

Dieses Beispiel und die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Istamycin A« und B0 aus Istamycin A oder Istamycin B durch alkalische Hydrolyse.

Eine Lösung von 20 mg Istamycin A in 2 ml Wasser wurde gemischt mit 300 mg Bariumhydroxid (Ba(0H)2.8H20). Die Mischung wurde in einem verschlossenen Rohr 3 h auf 100°C erhitzt, wobei die alkalische Hydrolyse von Istamycin A erfolgte. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von verfestigtem Kohlendioxid neutralisiert und dann filtriert. Die Filtratlösung wurde durch eine Kolonne von 3 ml Amberlite CG-50 (NH4 Form) unterworfen und die Kolonne eluiert mit 0,5N wässrigem Ammoniak. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 16 mg eines farblosen kristallinen Pulvers von reinem Istamycin Ao.

Istamycin B (20 mg) wurde in derselben Weise wie oben beschrieben einer alkalischen Hydrolyse unterworfen. Es wurde ein farbloses kristallines Pulver von reinem Istamycin B>. in einer Ausbeute von 15 mg erhalten.

Beispiel 6

Eine Agar Schrägkultur von Streptomyces tenjimariensis SS-939 (FERM-P 4932) wurde in ein flüssiges Kulturmedium (501), enthaltend 1,0% Stärke, 0,2% Glukose, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,1% Magnesiumsulfat (7 H2O) (pH 7,0), das sich in einem Fermentationstank von 1001 aus rostfreiem Stahl befand, geimpft. Die Fermentation wurde bei 28°C 24 h unter Belüftung (501 Luft pro Minute) und Rühren (200 Upm) durchgeführt, wobei eine Saatkultur erhalten wurde. Eine Portion (201) der erhaltenen Saatkultur wurde zur Beimpfung benutzt von einem flüssigen Kulturmedium, enthaltend 4,0% Stärke, 0,4% Glukose, 5,0% Weizenkeime,

0.6% Calciumcarbonat und 0,3% Natriumchlorid (pH 7,0), das sich in einem Fermentationstank aus rostfreiem Stahl mit einer 2-Tonnenkapazität, enthaltend 10001 befand. Anschliessend wurde 108 h bei 28°C unter Belüftung (8001 Luft pro Minute) und Rühren (280 Upm) fermentiert.

Die auf diese Weise erhaltene Fermentationsbrühe (pH 7,3) wurde durch Zugabe von Salzsäure auf ein pH von 2,0 eingestellt und dann filtriert. Das Filtrat wurde durch Zugabe einer wässrigen Natriumhydroxidlösung neutralisiert und ergab 8501 eines Filtrats (pH 6,2, Potenz 105 mcg/ml). Dieses Filtrat wurde dann in eine Kolonne von 551 Amberlite IRC-50 (NH4 Form) zur Adsorption des Istamycins gegeben. Nach dem Waschen mit 3001 Wasser wurde die Kolonne mit

1, IN wässrigem Ammoniak eluiert. Die ersten Durchläufe (381) des Eluats wurden verworfen und die nächsten Läufe (1881) abgetrennt und dann unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2,81 eingeengt.

Die auf diese Weise erhaltene konzentrierte Lösung wurde gemischt mit 475,2 g Bariumhydroxid (Ba(0H)2.8H20) und anschliessend zur Durchführung der alkalischen Hydrolyse von Istamycin A und B 3 h bei 110°C am Rückfluss behandelt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von 1960 ml 2N Schwefelsäure neutralisiert (pH 7,2) und dann filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne von 15 1 Amberlite CG-50 (NH4 Form) zur Adsorption von Istamycin gegeben. Nach dem Waschen mit 451 Wasser wurde die Kolonne aufeinanderfolgend eluiert mit wässrigen Lösungen von Ammoniak bei verschiedenen unten angegebenen Konzentrationen, wobei das Eluat in 3-1 Fraktionen abgetrennt wurde:

Fraktionen Nrn. 1-20 mit 6010,10N wässrigem Ammoniak Fraktionen Nrn. 21-40 mit 6010.15N wässrigem Ammoniak Fraktionen Nrn. 41-60 mit 6010,19N wässrigem Ammoniak Fraktionen Nrn. 61 -80 mit 6010,26N wässrigem Ammoniak Fraktionen Nrn. 81-100 mit 6010,27N wässrigem Ammoniak

Fraktionen Nrn. 101-120 mit 6010,32N wässrigem Ammoniak

Fraktionen Nrn. 121-140 mit 60 10,35N wässrigem Ammoniak

Fraktionen Nrn. 141-160 mit 6010,43N wässrigem Ammoniak

Fraktionen Nrn. 161-180 mit301 l,00n wässrigem •Ammoniak

Die Fraktionen Nrn. 82-104 wurden kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 38,05 g eines rohen Pulvers aus Istamycin Ao erhalten wurde. Die Fraktionen Nrn. 105-134 wurden abgetrennt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben 19,19 g eines rohen Pulvers aus Istamycin Bo.

Beispiel 7

Das rohe Pulver von Istamycin Ao (2,0 g), erhalten gemäss Beispiel 6 wurde gereinigt durch Kolonnenchromatographie unter Verwendung einer Kolonne von 180 g Silikagel und entwickelt mit der unteren Phase eines gemischten Lösungsmittels von Chloroform-MethanoI-8,5%igem wässrigem Ammoniak (2:1:1 bezogen auf das Volumen) und das Eluat ir 25-ml Fraktionen abgetrennt. Die aktiven Fraktionen Nrn. 65-104 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben ein farbloses kristallines Pulver von reinem Istamycin Ao. Ausbeute 586 mg.

Das rohe Pulver von Istamycin Bo (2,0 g), erhalten gemäss Beispiel 6 wurde gereinigt durch Chromatographie in einer Silikagelkolonne in derselben Weise wie oben angegeben mit der Ausnahme, dass das Eluat in 23-ml Fraktionen abgetrennt wurde. Die aktiven Fraktionen Nrn. 73-170 wurden kombiniert, unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und ergaben ein farbloses kristallines Pulver von reinem Istamycin Bo. Ausbeute 1369 mg.

12

s

10

IS

20

25'

30

35

40

45

50

B

2 Blatt Zeichnungei

Claims (13)

1. 646712

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Istamycine mit den folgenden Formeln Istamycin A

   Istamycin B der Formel

   Istamycin Ao der Formel ch2nhch3 0

   3

   646 712

   oder der Formel nh,

   nh,

   oh

   0

   och.

   ch3

   oder Istamycin Bo der Formel oh och.

   nh ch3

   sowie deren Säureadditionssalze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Istamycine A, B, Ao und Bo durch Kultivieren eines Istamycin produzierenden Stammes von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bis eine wesentliche Menge Istamycin produziert und im Kulturmedium angereichert ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Istamycine aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Istamycin produzierender Stamm Streptomyces ten-jimariensis SS-939, gekennzeichnet als FERM-P4932 oder ATCC Nummer 31603, verwendet wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Istamycin A durch Kultivieren eines Istamycin A produzierenden Stammes von Streptomyces.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Istamycin B durch Kultivieren eines Istamycin B produzierenden Stammes von Streptomyces.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Istamycin Ao durch Kultivieren eines Istamycin Ao produzierenden Stammes von Streptomyces.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 2 zur Herstellung von Istamycin Bo durch Kultivieren eines Istamycin Bo produzierenden Stammes von Streptomyces.
9. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 5,6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces tenjimariensis SS-939 kultiviert wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Kulturmedium Istamycin A, Istamycin B, Istamycin Ao und Istamycin Bo isoliert wird.
11. 11. Verfahren zur Herstellung von Istamycin Ao aus Istamycin A durch Hydrolysieren von Istamycin A unter alkalischen Bedingungen.
12. 12. Verfahren zur Herstellung von Istamycin Bo aus Istamycin B durch Hydrolysieren von Istamycin B unter alkalischen Bedingungen.
13. 13. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine antibakte-riell wirksame und ausreichende Menge von Istamycin A, Istamycin B oder deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.