DE3136675A1

DE3136675A1 - Neues peptid und dessen herstellung

Info

Publication number: DE3136675A1
Application number: DE19813136675
Authority: DE
Inventors: Eiji Hyogo Higashide; Satoshi Osaka Horii
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-09-18
Filing date: 1981-09-16
Publication date: 1982-05-06
Also published as: GB2084158A; FR2490223B1; GB2084158B; FR2490223A1; JPS5754151A; US4623733A; JPH0147479B2; US4575489A

Description

NEUES PEPTID UND DESSEN HERSTELLUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid • B-52653, das eine biologisch aktive Verbindung ist, ι und ein Verfahren zu dessen Herstellung,

5 Es ist wohlbekannt,, daß Boden-Mikroorganismen, die aus einer I Bodenprobe isoliert wurden, verschiedenartige biologisch i aktive Verbindungen, darunter Antibiotika, erzeugen.

Auf der Suche nach neuen biologisch wirksamen Verbindungen ; sind bei der Anmelderin eine große'Zahl von Bodenproben j -jo gesammelt, die aus den Proben isolierten Mikroorganismen kultiviert und die Kulturen auf eine Hemmwirkung gegenüber

\ der Zellwandsynthese und der Collagen-Prolin-Hydroxylase in der Kulturbrühe untersucht worden. Dabei wurde in der : Kulturbrühe eines Mikroorganismus ein neues,biologisch

¹ 15 wirksames Peptid aufgefunden. Es wurde gefunden, daß diese I Verbindung nicht nur das Wachstum von gram-positiven und ; gram-negativen Bakterien in Folge ihrer Hemmwirkung auf die Zellwand-Synthese hemmt, sondern auch eine Hemmwirkung gegenüber Collagen-Prolin-Hydroxidase besitzt, daß der 20 betreffende Mikroorganismus zu der Gattung Streptomyces : gehört, daß das betreffende Peptid durch Kultivieren des

Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten Kulturbedingungen in der Kulturbrühe erzeugt und angereichert werden kann, und daß das Peptid als L-Alanyl-L-/(3R) 25 5-hydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl_7glycin geschrieben werden kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf den genannnten

! Befunden. Das neue Peptid wurde als B-52653 bezeichnet.

: Die vorliegende Erfindung richtet sich demgemäß auf (1) ein neues Peptid B-52653, das die Formel

—S

NH₂ HO₂C _Η c²^

H₀C-CH-CONH-CH-C " CH-OH

C-N

• 0* H

^; besitzt und (2) ein Verfahren zur Herstellung dieses Peptids B-52653, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein B-52653-erzeugender Stamm der Gattung Streptomyces kultiviert und

; 5 dadurch veranlaßt wird., B-52653 in der Kulturbrühe zu entwickeln und anzureichern, und daß das B-52653 aus der Kulturbrühe geerntet wird.

Die vorliegende Erfindung wird praktisch durchgeführt, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces verwendet, der zur Entwicklung des neuen Peptids B-52653 befähigt ist. Als Beispiel für solche B-52653^erzeugenden Mikroorganismen sei der Streptomyces sp.-Stamm Nr. B-52653 erwähnt, der ein aus einer Bodenprobe isolierter Stamm ist, die in Akashi City, Hyogo Prefecture, Japan, entnommen wurde.

In der vorliegenden Beschreibung wird das vorerwähnte neue Peptid B-52653 manchmal kurz als B-52653 bezeichnet, und der erwähnte Streptomyces.sp.-Stamm Nr. B-52653 als Stamm Nr. B-52653.

A) Mikrobiologische Charakterisierung des Stammes Nr. B-52653 .

: Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. B-52653 wurden nach dem Verfahren von Schirling und Gottlieb /International Journal of Systematic Bacteriology _1_6, 313—340, 1966_7untersucht. Im folgenden werden die Ergebnisse einer 21-tägigen Kultivierung des Stammes bei 28°C angegeben.

» * te

1) Morphologische Eigenschaften

¹ Im allgemeinen bildet er auf Agarmedium ein vegetatives

Mycel, das gut verzweigt und langgestreckt ist, wobei sein Luftmycel itionopodial verzweigt ist. Viele der Sporenketten 5 bilden Spiralen oder Schleifen, und einige sind gewellt.

j In vielen Fällen ist jede Sporenkette aus mehr als 10 Sporen zusammengesetzt. Die Sporen sind oval oder elliptisch, im

^; Bereich von 0,8 - 1,2/im χ 1,0 - 1,5 /im, mit stachliger i Oberfläche. Weder Geißeln- noch Sporenkapseln wurden i 10 beobachtet.

; 2) Kultur-Eigenschaften
j

Der vorliegende Stamm wächst gut auf verschiedenen Medien

und erzeugt dabei reichlich Sporen, und das Luftmycel ist hellgrau bis bräunlichgrau. Die Farbe der Rückseite reicht ' 15 von blaßgelb bis braun, und auf manchen Medien können he 1.1-i gelbe bis hellbraune lösliche Pigmente gebildet werden.

Kulturmerkmale* Färbung / Color** / Color Code **

	a)	Saccharose-Nitrat-Agar	•	-	aschfarben	s über grau	light brownish	- 5ec)
		G: mäßig	leicht bräunlich		hell lohfarben	gray to Dusty
		AM: mäßig	grau bis staubig-	' Glycerin-Asparagin-Agar		Peach (5cb
			.pfirsxchfarben	G: mäßig
5				AM: reichlich	silbergrau		(5fe)
		SP: keines	' Glucose-Asparagin-Agar	SP:
	b)	G: ' mäßig	Stärke-Agar		Ashes
		AM: reichlich	G: mäßig
		SP: keines	AM: reichlich	hell elfenbein		(3fe)
10		SP: keines			(3gc)
	c)	Tyrosin-Agar		Silver Gray
		G: mäßig		Lt Tan
		AM: mäßig			(3fe)

15	d)	Silver Gray

			(2ca)

	e)	Lt Ivory to
20

bis weidenkätzchengrau

■ SP: rosa-maulwurffarb.

f) Nähr-Agar
G: mäßig
AM: mäßig
SP: keines

g) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar G: reichlich

AM: reichlich bibergrau bis

bleigrau SP: keines oder blaß gelbbraun

Pussywillow

Gray to (5 dc)

Rose Taupe (5ig)

weiß bis perlfarb. White to Pearl (3ba)

Beaver to (4Ii) Lead Gray (5in) pale yellow-brown

Kulturmerkmale* Färbung / Color** / Color Code**

h) Hafermehl-Agar
G: reichlich
, AM: reichlich ' silbergrau Silver Gray (3fe)

! 5 SP: honig-goldfarben Honey Gold (2ic)

i) Calcium-Malat-Agar

G: mäßig

AM: mäßig rohporzellanfarb. Bisque to (3ec)

bis weiß White

10 SP: hell rehbraun Lt Fawn (4ge)

* G = Wachstum; AM = Luftmycel; SP = Lösliches Pigment. ** Die englischsprachigen Farbbezeichnungen und Color Codes entsprechen "The Color Harmony Manual", 4.Auflage, Container Corporation of America> 1958.

'15 3) Physiologische Eigenschaften

a) Temperaturbereich für das Wachstum: 9 - 40⁰C -. b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-

j Pepton-Gelatine): positiv (schwach)

; c) Hydrolyse von Stärke: positiv

^;20 d) Koagulierung von entrahmter Milch: peptonisiert ; e) Erzeugung melanoider Pigmente:

; Tyrosin-Agar: falsch positiv

Pepton-Hefe-Agar: negativ

4) Verwertung von Kohlenstoff-Quellen

\ L-Arabinose +

; D-Glucose

: Sucrose

j 5 L-Rhamnose "*■

D-Mannit
' D-Xylose

D-Fructose
! Inosit

! 10 Raffinose +

Kontrollversuch +

Anmerkung: +++ : Reichliches Wachstum

++ : Gutes Wachstum

+ : Wachstum

15 + : Geringes Wachstum

Im Hinblick auf die vorerwähnten Eigenschaften des Stammes Nr. B-52653 wurde Bezug genommen auf S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2, 1961, erschienen bei The Williams and Wilkins Co.; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Hrsg.), Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974; International Journal of Systematic Bacteriology, VoI 18, Nr. 2, Seiten 69-189, und Nr. 4, Seiten 279-392 (1968), ibid. Vol. 19, Nr. 4, Seiten 391 - 512 (1969), und ibid. Vol. 22, Nr. 4, Seiten 265 - 394 (1972), sowie andere Literatur.

Die taxonomische Stellung dieses Stammes auf der Grundlage seiner vorerwähnten Eigenschaften ist derart, daß er offenbar zu der Untergruppe5pirales oder Retinacuriapelti und der Gray-Reihe gehört, wie von Pridham et al (Applied Microbiology J5, 52 - 79, 1958) vorgeschlagen wurde. Als eine bekannte Species, die dem vorliegenden Stamm am nächsten verwandt zu sein scheint, sei Streptomyces albulus

erwähnt. Dementsprechend wurde ein Vergleich des Stammes Nr. B^-52653 mit Streptomyces albulus IPO 13410 (ISP 5492) durchgeführt. Stamm Nr. B-52653 erzeugt ein hellbraungraues Luftmycel auf Sacharose-Nitrat-Agar und ein hellgelb-graues Luftmycel auf Glukose-Nitrat-Agar. Wenn derselbe Stamm auf Calcium-Malat-Agar gezogen wird, bildet er ein hellbraunes lösliches Pigment. Überdies wächst er bei Verwendung von_;L-Rhamnose und Sucrose. Andererseits bildet Streptomyces albulus ein weißes Luftmycel auf Sacharose-Nitrat-Agar und Glukose-Nitrat-Agar und bildet kein lösliches Pigment auf Calcium-Malat-Agar. Darüber hinaus assimiliert der letztere Stamm L-Rhamnose oder Sucrose nicht und wächst deshalb nicht auf diesen Kohlenstoff-Quellen.

Die vorgenannten Ergebnisse legten nahe, daß Stamm Nr.

B-52653 eine neue Subspecies von Streptomyces albulus war, und dementsprechend wurde für diesen Stamm der Name Streptomyces albulus subsp. ochragerus subsp. nov. vorgeschlagen.

Dieser Stamm Nr. B-52653 wurde bei dem Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Ibaragi, Japan, unter der Registriernummer FERM-P Nr. 5677, bei dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, unter der Eingangsnummer IFO 14072, und bei The American Type Culture Collection (ATCC), USA, unter der Eingangsnummer ATCC 31713 hinterlegt.

Wenngleich der Stamm Nr. B-52653 wie oben erwähnt, ein neuer Stamm der Gattung Streptomyces ist, kann er, entsprechend einer allgemeinen Eigenheit von Mikroorganismen, Veränderungen und Mutationen erleiden, und zwar entweder spontan oder unter dem Einfluß von Mutagenen. Beispielsweise können Mutanten des Stammes mit Hilfe von Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, ultraviolettem Licht oder anderer Strahlung,

it ι

I IK

• «

■ Monosporentrennung, Behandlung mit verschiedenen Chemikalien, Kultivierung auf solche Chemikalien enthaltenden Medien und so weiter erhalten werden. Diese Mutanten können ebenso wie spontane Mutanten für die Zwecke der vorliegenden 5 Erfindung eingesetzt werden, soweit sie nicht im wesentlichen als neue Spezies im Hinblick auf die vorbeschriebenen und

; nachstehend erwähnten mikrobiologischen Eigenschaften zu betrachten sind, und. soweit sie zur Entwicklung von B-52653 befähigt sind. Wenn beispielsweise der Stamm Nr. B-52653 verschiedenen mutagenen Behandlungen unterzogen wird, werden Mutanten erhalten, die gelbe oder blaue Luftmycele erzeugen.

Das für die Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium kann entweder flüssig oder fest sein, sofern es nur diejenigen Nährstoffe enthält, die der benutzte Stamm verwerten kann. Wenn jedoch die Herstellung einer größeren Menge betrachtet wird, ist ein flüssiges Medium vorteilhafter. In das Medium sind solche Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen eingearbeitet, die der Stamm assimilieren und verdauen kann, anorganische Materialien und Spurennährstoffe. Zu den Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, öle und Fette (z.B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl etc.) gehören, und zu den Stickstoff-Quellen können, unter anderem, Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisstärkebrühe, Peptone, Baumwollsamenmehl, ausgelaugte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat etc.) usw. gehören. Weiterhin werden eingearbeitet geeignete Mengen von Salzen, von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium etc.; Salzen von Eisen, Mangan, Zink, Cobalt, Nickel etc., Salze der Phosphorsäure, Borsäure etc., und Salze von organischen Säuren wie Essigsäure, Priop ionsäure etc. Ebenfalls zugesetzt werden können Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Valin, Methionin, Prolin, etc.), Peptide (z.B.

Dipeptide, Tripeptide etc.), Vitamine (z.B. B₁, B₂, Nikotinsäure B₁₂/ C etc.), Nucleinsäure und verwandte Verbindungen (z.B. Purin- oder Pyrimidin-Derivate). Naturgemäß können zum Zwecke der pH-Einstellung des Mediums anorganische oder organische Säuren, Alkalien, Puffer etc. zu dem Medium hinzugefügt werden. Geeignete Mengen von Ölen, oberflächen*- aktiven Mitteln etc. können ebenfalls zu Entschäumungszwecken zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann durch Stationärkultur, Schüttelkultur, Submers-Kultur oder mittels anderer bekannter Kultivierungsverfahren erfolgen. Für eine Fermentation großer Mengen ist naturgemäß die Verfahrensweise einer sogenannten Submerskultur vorteilhaft. Wenngleich die Kulturbedingungen vom Zustand und der Zusammensetzung des Mediums, dem verwendeten speziellen Stamm, dem Verfahren der Kultivierung etc. abhängen, wird die Kultivierung für gewöhnlich bei einer Temperatur von 20°C bis 35°C und mit einem Anfangs-pH im Bereich von pH 5-8 durchgeführt. Bevorzugte Bedingungen sind 23°C - 32Oc und ph 5,5 bis 7,0 (zu Anfang). Wiewohl die Dauer der Kultivierung ebenfalls/äen oben erwähnten Bedingungen abhängt, wird die Kultivierung vorzugsweise so lange fortgesetzt, bis die Menge des hergestellten vorliegenden Peptids den größtmöglichen Wert erreicht. Die für das Erreichen einer solchen maximalen Konzentration erforderliche Zeit liegt normalerweise im Falle von Schüttelkulturen ode,r unter Belüftung gerührten Kulturen in flüssigem Medium bei etwa 2-8 Tagen.

Der für die Herstellung des vorliegenden Peptids geeignete pH ist schwach sauer, wobei der günstigste Bereich bei ph 5,5 bis 7,0 liegt, und die Ausbeute an der Substanz kann dadurch erhöht werden, daß der pH des Mediums mit einer Säure oder einem Alkali beeinflußt wird. So kann die Ausbeute an der Substanz dadurch beträchtlich erhöht werden, daß man anorganische Phosphate in einer Konzentration von 50 - 1000 ppm zu

»·■* se .«

■a-

dem Medium hinzufügt, oder daß man Sacharide wie Glucose, Stärke oder/und Sucrose als Kohlenstoff-Quellen zusammen mit ausgewählten Stickstoff-Quellen und anorganischen Salzen verwendet.

Während sein Anteil mit den Kulturbedingungen variiert, wird B-52653 gewöhnlich extracellular angereichert, wobei etwa 10 % der Gesamtausbeute manchmal innerhalb der Zellen gefunden werden. .

Das auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugte Peptid kann mittels der Agar-Schacht-Methode oder der Papierscheiben-Methode unter Verwendung einer Arzneimittel-resistenten Mutante von Staphylococcus aureus als Test-Organismus und B-52653 als Bezuigsstaridard analysiert werden. Medium A /"Glucose 3 %, Natriumglutamat 0,5 %, K₂IiPO₄ 0,05 %, MgSO₄-7H₂O 0,05 %, KCL 0,05 %, Hefeextrakt (Difco) 0,05 %, Casaminoacid (Difco) 0,02 %, Agar (Difco)_7·

Das vorliegende Peptid wird hauptsächlich im Filtrat der Kulturbrühe erzeugt. Das auf diese Weise hergestellte B-52653 kann nach den Verfahrensweisen isoliert werden, die üblicherweise für die Ernte mikrobieller Metaboliten aus Kulturbrühen angewandt werden, und zwar entweder für sich allein, oder in Kombination, oder durch wiederholte Anwendung. Demgemäß können beispielsweise solche Verfahren zur Anwendung gelangen, wie Filtrieren, Zentrifugieren, Dialyse, Konzentrierung, Trocknen, Gefriertrocknen, Adsorption und Desorption, Mittel, die sich Löslichkeitsunterschiede in verschiedenen Lösungsmitteln zunutze machen (z.B. Ausfällung, Kristallisation, Umkristaliisation, Extraktion, Gegenstromverteilung etc.), Chromatographie etc.

Im einzelnen wird B-52653 _r da es zum größten Teil extracellular gebildet und angereichert wird, vorzugsweise aus der flüssigen Fraktion der Kulturbrühe nach dem Entfernen der

Zellfraktionen gewonnen. Da weiterhin dieses Peptid eine amphotere, wasserlösliche Verbindung mit Carboxyl- und Amino-Funktionen ist, kann es aus der flüssigen Fraktion der Kulturbrühe vorteilhaft dadurch isoliert und gereinigt werden, daß man sich diese Eigenschaft zunutze macht.

Die oben erwähnte Chromatographie kann vorteilhafterweise durchgeführt werden unter Verwendung von Kationen- und Anionen-Austausehern (z.B.Ionenaustauschharzen, Sephadex-Ionenaustauschern, Ionenaustausch-Cellulose etc.), GeI-permeationsträger /_ z.B. Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), Biogel (Bio-Rad Laboratories, U.S.A.),vorzugsweise Sephadex LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, Schweden_7, Aktivkohle, hochporösen Polymeren /_ z.B. vorzugsweise Amberlite XAD-2 (Röhm and Haas Co., U.S.A.), Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei Kogyo, Japan)_7, Aluminiumoxid, Florisil, Silicagel, Cellulose usw.

Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nach den vorgenannten Verfahren isoliert und gereinigt; aufgrund der Untersuchung ihrer physicochemischen Eigenschaften und auch aufgrund unabhängiger Untersuchungen wurde gefunden, daß es sich um L-alanyl-L- /_ (3R) -S-hydroxy^-oxopyrrolidin-3-yl_7glycin handelt, eine neue Verbindung der folgenden Strukturformel:

H2

H ■ " H C-N

⁰ 0* H

B-52653 kann auf die vorbeschriebene Weise hergestellt werden. Seine physicochemischen'Eigenschaften, die an Proben, die gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellt wurden, bestimmt worden sind die folgenden:

(1) Weißes Pulver.

(2) Elementaranalyse:

für C,	3^H1	5^N3	°5*	2H₂O	6	,81;	N,	1	4,	94;
ber. :	C:	38	,43	; H:	6	,34;	N:	1	4,	87.
gef. :	C:	38	,44	; H:

(3) Moleculargewicht (Neutralisationsäquivalent) und pKa¹: Das aus der Dissoziationskurve (Titration in einer wässrigen 0,1 N-HCL enthaltenden Lösung mit 0,1 N-NaOH) bestimmte Neutralisationsäquivalent ist 140 -· 10, und der pH der Lösung an dem aus der Dissoziationskurve bestimmten Punkt der HaIbäquivalenz liegt bei pH 8,3 - 0,5. Diese Dissoziationskurve wird als eine zusammengesetzte Kurve aus den Dissoziationskurven zweier dissoziierbarer Gruppen mit pKa'-Werten, die dicht beieinander liegen (vermutlich bei etwa 7,6 und etwa 8,8, obwohl genaue pKa'-Werte nicht gemessen werden konnten, da ein Wendepunkt nicht vorhanden war), betrachtet. Deshalb wurde das Molekulargewicht des vorliegenden Peptids zu 280-20 angenommen (281,3 für C₉H₁₅N₃O₅^H₂O), Nach Zugabe von 1 N-HCL zu einer wässrigen Lösung dieser Substanz und Titration mit 1 N-NaOH wie oben angegeben, wurde außerdem eine dissoziierbare Gruppe mit einem pKa'-Wert bei etwa 3,15 nachgewiesen.
(4) Optische Drehung

[a]^⁵ + 50° ±5° (c =1.0, H₂O) _t [α]25 + 62° +5° (c = 1.0, 0.1N HCl) [α]25 + 50° +5° (c = 1.0, 0.IN NaOH)

(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der vorliegenden Substanz in wässriger Lösung zeigt zwischen 220 und 360 ran, abgesehen von Endabsorptionen, kein charakteristisches Absorptionsmaximum.

(6) Infrarot-Absorptionsspektrum.

Die Wellenzahlen (cm ) der Hauptabsorptionsbanden im Infrarotspektrum (KBr) sind folgende:

3400, 1690, 1610, 1395, 1265, 1205, 1080. (7) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum.

Das nachstehende kernmagnetische ResonanzSpektrum wurde in Deuteriumoxid unter Benutzung eines Varian EM-390 (90 MHz)-Spektrometers beobachtet.

6: 1.70 (3H, d, J = 7); 1.75 (m), 2.26 (m), 2.78 (m) (total 2H); 3.24 (IH, m), 4.26 (IH, q, J= 7), 4.71 (IH, d, J = 4.5), 5.38 (IH, m).

(8) Farbreaktionen
Ninhydrinreaktion: positiv
Greig-Leaback-Peptidreaktion: positiv Sakaguchi-Reaktion: negativ

Antron-Schwefelsäure-Reaktion: negativ. Orcin-Schwefelsäure-Reaktion: negativ.

(9) Löslichkeit

Leicht löslich in Wasser, jedoch entweder nur spärlich löslich· oder unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Ethanol, Aceton, Chloroform, Ethylacetat, Benzol, Ethylather, Petroläther, Pyridin, Eisessig, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid etc.

(10) Dünnschicht-Chromatographie

(Merck's vorbeschichtete TLC-Platte, Silicagel 6OF-254)

Τ » » ·»
"♦·■»■

! Lösungsmittel-Systeme RF

1-Butanol-Essigsäure-Wasser

(3:1:1) · 0,15

1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (4:1:1:2) ' 0,08

1-Propanol-Wasser
: (7:3) 0,13

2-Propanol-Diisopropyläther-
'. 60 % Ameisensäure

ι . - ■

(4:3:3) 0,16

Chloroform-Methanol-17% wäßr. . " ■ Ammoniak .

(2:2:1) ■ 0,17

'■ Antimikrobielle Wirksamkeit

Bei den Untersuchungen unter Verwendung von Bakterien als Testorganismen wurde eine Schleifenfüllung von 10 CFü/ml (CFU = zellbildende Einheiten) als Impfmaterial verwendet, und die minimalen Hemmkonzentrationen ( MIC) wurden nach 18-20-stündiger Inkubation bei 37°C bestimmt. Im Falle von Pilzen und Hefen wurde eine Schleifenfüllung des betreffenden Mikroorganismus gründlich zerkleinert, eine Schleifenfüllung der entstandenen Suspension wurde zur Impfung benutzt, und die MIC wurde nach 2- oder 3-tägiger Inkubation bei 28°C bestimmt. Die Messung der MIC wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode unter Verwendung der in der Tabelle angegebenen Medien durchgeführt.

Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß B-52653 eine starke Wirkung gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien entfaltet,und daß diese Substanz ebenso gegen verschiedene antibiotika-resistente Mikroorganismen wie gegen die entsprechenden anfälligen Stämme wirksam ist. Es wird ebenfalls gezeigt,daß die vorliegende Substanz eine starke Aktivität gegen gewisse phytopathogene Bakterien entfaltet.

- 4-5—

! Test-Organismus

' Staphylococcus aureus IFO 13276 ' Staphylococcus epidermidis FS 5010 • Bacillus subtilis PCI 219

j 5 Bacillus cereus IFO 3001

I Bacillus megaterium IFO 3970

Escherichia coli NIHJ JC-2 Escherichia coli 0-111 Escherichia coli K-12 W3110 j ¹⁰ Escherichia coli TN 647 : Proteus vulgaris IFO 3988 ¹ Proteus mirabilis IFO 3847 j Proteus morganii IFO 316 8 ι · Klebsiella pneumoniae IFO 3512 ' 15 Klebsiella pneumoniae GN 384 8 : Citrobacter freundii TN 457 i Citrobacter freundii TN 564 j Enterobacter cloacas IFO 12937

Enterobacter aerogenes TN 582 20 Salmonella typhimurium LT-2

Salmonella enteri-tidis IFO 3313 Serratia marcescens IFO 12648 Serratia marcescens TN 24 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 25 Pseudomonas aeruginosa J-31

Alternaria kikuchiana IFO 7515 Pyricularia oryzae KHG-I Cochlioborus miyabeanus IFO 5277 Botrytis cinerea TKF-12 30 Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395 Pellicularia sasakii KHG-2 Penicillium chrysogenum IFO 4626 Aspergillus niger IFO 4066 Saccharomyces cerevisiae IFO 0209 35 Candida albicans IFO 0538

Medium	MlC (ug/rnl)
I	0.39
I	0.39
II	6.25
II	3.13
II	0.1
II	3.13
II	6.25
II	3.13
■ Ii	3.13
II	1.56
II	1.56
II	3.13
II	12.5
II	6.25
II	1.56
II	3.13
II	25
II	6.25
II	0.78
II	0.2
II	0.78
II	0.2
II	>100
II	>100
in	>100
m	10
m	100
m	50
m	1
m	20
IV	>100
IV	>100
IV	12.5
IV	>100

Medium I: 3 % Glukose, 0,5 % Natriumglutamat, 0,05 % K₂HPO₄, 0,05 % MgSO₄- 7H₂O, 0,05 % KCl, 0,05 % Hefeextrakt (Difco) , 0,02 % Casaminoacid, 1",5 % Agar (pH 7,0).

Medium II: 0,5 % Glukose, 0,01 % Hefeextrakt, 0,1 %₄₃ SO₄, 0,01 % MgSO₄-7H₂O, 0,05 % Natriumeitrat, 0,2 % KH₃PO₄, 0,7 % K₃HPO₄, 1,5 % Agar (pH 7,0) /~F.R. Atherton et al. Antimicrobial Agent and Chemotherapy 15, Nr. 5, 677-683 (1979)_7

Medium III: Kartoffel-Sucrose-Agar. Medium IV: Modifiziertes Agar-Medium nach Peffer: 3,0 %

Sucrose, 0,2 % L-Asparagin , 0,3 % NH₄NO₃, 0,1 % KH₃PO₄, 0,1^: MgSO₄-7H₂O, 0,001 % Versenol* Agar 1,5 % (pH 7,0) /?Eisen-Natrium-Ethanolethylen-Diamintriacetat 50 %_/

Das Medium IV wurde vor der Verwendung durch die folgenden Substanzen (pro 100 ml) ergänzt: 100 μg Vitamin B₁-Hydrochloride 100 ug Vitamin B₃, 100 μg Calcium-Pantothenat, 100 μg Nikotinsäureamid, 0,5 ug Biotin, 50 μ-g Folsäure, 200 μg Vitamin Bg-Hydrochlorid, 50 μg p-aminobenzoe-Säure 0,2 μg Vitamin B^₂-

Infektionsbekämpfende Wirkungen bei Mäusen

des
Männliche, 4 Wochen alte Mäuse/ICR/SLC-Stammes wurden intraperitoneal mit 2 χ 10^ CFU-Zellen aus einer über Nacht gebildeten Kultur von Staphyloccus aureus E-97 in Gehirn-Herz-Infusions-Brühe (Difco) infiziert. Unmittelbar anschließend wurde eine wässrige Lösung von B-52653 in einer einzigen Dosis intraperitoneal verabreicht. Wie nachstehend gezeigt wird, hatte die vorgenannte Behandlung eine' prophylaktische Wirkung gegen Infektion.

6,25	12,5	25	50	100
2/5	2/5	3/5	3/5	5/5

- -W—

Dosierung (mg/kg:) 3,13
S/T* 1/5

ED₅₀ =17,7 mg/kg

S*= Anzahl der überlebenden Tiere,
T= Anzahl der dem Test unterzogenen Mäuse.

Collagen-Prolin-Hydro^iLase-Hemmwirkung

Organ-Fibrose einschließlich Lebercirrhose und Lungenfibrose, wird als eine Erkrankung betrachtet, die durch ein pathologisches Überwachstum von Collagen verursacht wird, und es wird angenommen, daß ein Inhibitor des vorgenannten Enzyms für die Unterdrückung solcher Fibrösen wertvoll ist.

Die Kollagen-Prolyl-Hydroxylase-Hemmwirkung von B-52653 wurde nach der Methode von R.E. Rhoads et al. /_ Methods in Enzymology XVII B, 306 (1971)_7 untersucht. Die Untersuchung ergab, daß diese Substanz bei der Konzentration von 270/ig/ml eine 50%ige Hemmung bewirkt. Sodann wurde die Hemmwirkung von B-52653 auf die Collagen-Biosynthese in Ratten nach der Methode B von Ishimaru et al (T. Ishimaru, T. Kanamaru und H.okazaki, the Proceedings of the 1979 Congress of the Japanese Society of Agricultural Chemistry,

S. 373) untersucht. Die Ergebnisse waren derart, daß die Werte für die Hemmung der Collagen-Synthese bei Ratten, denen 50mg/kg, 100 mg/kg bzw. 200 mg/kg verabreicht worden war, 30 %, 43 % bzw. 55 % betrugen.

Dadurch wird die Möglichkeit der Verwendung der vorliegenden Substanz als antifibrotisches Mittel nahegelegt.

Toxizität

Bei den Prüfungen auf akute Toxizität, bei denen B-52653 Mäusen auf intravenösem oder intraperxtonealem Wege verabreicht wurde, trat sogar bei der hohen Dosis von 1000 mg/kg kein Todesfall auf, noch wurde irgendeine besondere Abnormi-

tat während einer 7-tägigen Beobachtungsperiode im Anschluß an die Verabreichung oder 'bei der Autopsie beobachtet. Es wird aus diesem Grunde angenommen, daß B-52653 eine in sehr geringem Umfang toxische Substanz ist.

Wie oben im einzelnen beschrieben wurde, besitzt die vorliegende Substanz B-52653 biologische Aktivitäten wie antimikrobielle Wirkung und Aktivität zur Unterdrückung von Fibröse tierischer Gewebe.

Die vorliegende Substanz kann in Form einer wässrigen Lösung von etwa 10 - etwa 100/ig/ml als Desinfektionsmittel für Vogelkäfige, Laborgerätschäften, oder der menschlichen Hände etc. verwendet werden.

Da die vorliegende Substanz eine Hemmwirkung gegenüber der Collagen-Prolyl-Hydroxylase-Aktivität besitzt, ist sie als

Ϊ5 ein Reagenz für die Untersuchung des Mechanismus der Collagen-Biosynthese von Wert. Eine weitere vielversprechende Anwendungsform der vorliegenden Substanz besteht, darin, daß die Substanz in steriler physiologischer Kochsalzlösung aseptisch aufgelöst und in einer Menge von 2-10 g pro 20 - 100 ml/Tag i-ⁿ Form dieser Lösung menschlichen Patienten durch intravenöse Tropfinfusion zur Hemmung des Fortschreitens der Leberfibrose verabreicht wird.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1
— *

Stamm-Nr. B-52653 (IFO 14072, ATCC 31713) wurde auf Glucose-Asparagin-Agar aufgeimpft und 10 Tage bei 24°C inkubiert. Die gewachsenen Sporen wurden zur Herstellung einer Sporensuspension (lebensfähige Zellen: 3 χ 10 /ml) in steriles Wasser abgestreift, die zur Verwendung als Impfgut im Kühlschrank aufbewahrt wurde. Ein Milliliter des Impfmaterials

■i*

wurde in einen 2-Liter Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der 500 ml eines sterilisierten Vorkulturmediums (35 g Maisquell-Flüssigkeit, 10 g Proflo, 1 g K₂HPO₄, 15 g CaCO₃, 20 g Glucose, 1 1 Leitungswasser; ph 6,5), enthielt, und der Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 40 Stunden bei 28°C inkubiert. Ein Anteil von 500 ml der erhaltenen Kultur wurde in einen 200-Liter Fermentor aus nichtrostendem Stahl überführt, der 100 1 eines sterilisierten Vorkulturmediums ähnlich dem vorgenannten enthielt, und die Kultivierung wurde 24 Stunden bei 28°C unter Belüftung (50 l/min) und Rühren (200 UpM, 1/2 DT) und bei einem Innendruck von 1,03 bar (1 kg/cm^) durchgeführt. Die erhaltene Impfkultur (100 1) wurde anschließend in einen Fermentor aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2000 Litern überführt, der 900 eines sterilisierten Hauptfermentationsmedium enthielt, das aus 500 g DL-Alanin, 1 kg DL-Methionin, 1 kg FeSO₄, 500 g ZnSO₄, 200 g MgSO₄-TH₃O, 100 g MnSO₄, 1,3 kg KH₃PO₄, 25 kg Proflo, 5 kg Sojabohnenmehl, 5 kg NH₄CL, 12,5 kg CaCO₃ und 100 kg Glucose (getrennt sterilisiert) bestand. Die Fermen-' tierung wurde 54 Stunden bei 28°C unter Belüftung (1000 l/min.) und Rühren (200 UpM, 1/3 DT-2 Stufen), und bei einem Innendruck von 1,03 bar (1 kg/cmr) durchgeführt. Als Ergebnis wurden 254 Ajg/ml B-52653 in der Brühe erhalten.

Beispiel 2

Zu 980 1 der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurden 30 kg Topcolite Nr. 34 (Toko Perlite Kogyo, Japan) als Filtrierhilf sstoff zugesetzt, und die Mischung wurde unter Benutzung eines kontinuierlichen Saugfilters filtriert. Zu 1350 1 des erhaltenen Filtrats wurden 1,4 kg Oxalsäure hinzugefügt, und nach 30-minütigem Rühren wurden 5 kg Topcolite zugesetzt, wonach Filtration erfolgte. Das erhaltene Filtrat (1450 1) wurde an einer Säule (350 1) aus Amberlite 200 (H -form) adsorbiert, und nach dem Waschen mit Wasser

erfolgte die Elution mit 0,5 N-wässrigem Ammoniak. Die

■ aktiven Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat' (20 1) wurde an einer Säule

■ (.200 1) aus Aktivkohle . (Shirasagi for Chromatography, Takeda Chemical Industries,Ltd., Japan) adsorbiert, und die Elution

; wurde mit Wasser durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und auf 1,5 1 konzentriert.

■ " .

: Ein Anteil von 750 ml des'Konzentrats wurde an einer Säule j (3 1) aus Aluminiumoxid (Merck, BRD, aktiviertes Aluminium-

j io oxid 90, neutral, Aktivität I) adsorbiert, und nach dem

! Waschen mit Wasser wurde die Elution mit 0,2 N-wässrigem

: Ammoniak durchgeführt» Die aktiven Fraktionen wurden ge-

• sammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.

Der Rückstand (etwa 30 g) wurde in 60 ml Wasser aufgelöst, die Lösung wurde an Aktivkohle (1 1) chromatographiert,

und die Elution erfolgte mit Wasser. Die aktiven Fraktionen ; wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt, j Das Konzentrat wurde weiterhin an einer Säule (700 ml) aus Amberlite IRA 68 (Röhm und Haas Co. USA), adsorbiert, und nach dem Waschen mit Wasser und mit 0,1 M Essigsäure erfolgte

die Elution mit 0,2 M Essigsäure. Die aktiven Fraktionen : wurden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert.

Das Konzentrat wurde an einer Säule (500 ml) aus Aktivkohle adsorbiert und mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 3,9 g eines weißen Pulvers (Reinheit etwa 93 %) erhalten wurden.

Das vorgenannte weiße Pulver (1,0 g) wurde in 4 ml 50%igem wässrigen Methanol aufgelöst, mit 4 ml 70%igem Methanol verdünnt und der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden ;mit 70%igem wässrigen Methanol gequollen) unterzogen.

Die Elution wurde mit 70%igem wässrigen Methanol durchgeführt . Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, und das Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Die erhaltene wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 0,9 g des gewünschten B-52653 erhalten wurden.

Claims

VON KREISLER SCHi&NAtfALV -EISHOL-ß· FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler+ 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln

Dr.-Ing. K.W. Eishold, Bad Soden

Dr. J. F. Fues, Köln

Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln

Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln

Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

Dr. H.-K. Werner, Köln

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

D-5000 KÖLN 1 15.Sept.1981

AvK/Be

Takeda Chemical Industries, Ltd.
27, Doshomachi 2-choitie, Higashi-ku, J-Osaka

Patentansprüche

Peptid B-52653 der Formel

H₂
NH₀ HO₀C „ . C^

H₃C-CH-CONH-CH-C ' CH-OH

C— N

o^{X/ H}
2. Verfahren zur Herstellung des Peptids B-52653, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden und zur Erzeugung des Peptids B-52653 befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthält, bis das Peptid B-52653 in der Kulturbrühe beträchtlich angereichert ist, und daß man dieses erntet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces albulus ist,
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces albulus subsp. ochragerus Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Kein

subsp. nov. (IFO 14072) ist.
5. Biologisch reine Kultur des zu der Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus mit Eigenschaften, die mit denjenigen von IFA 14072 identifizierbar sind, wobei die Kultur befähigt ist, in einem mit Quellen für assimilierbaren
Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthaltenden Kulturmedium eine gewinnbare Menge des Peptids B-52653 zu erzeugen.