DE2167325C2

DE2167325C2 - Antibiotikum A-201B und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2167325C2
Application number: DE19712167325
Authority: DE
Inventors: Robert L. New Ross Ind. Hamill; Marvin Martin Indianapolis Ind. Hoehn
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1970-12-24
Filing date: 1971-12-24
Publication date: 1984-05-24
Also published as: DE2164564C2; YU35620B; CA985192A; AU3729471A; AU456679B2; FR2119086B1; US3843784A; DE2164564A1; NL174959C; NL7117796A; IL38479A0; GB1315430A; IE36770B1; DK129465B; MY7600252A; NL174959B; YU324971A; SE375545B; FR2119086A1; JPS5530839B1

Description

Eine Reihe von Krankheiten bei Mensch und Tier ist auf den Einfluß von Mikroorganismen zurückzuführen, zu denen sowohl Bakterien als auch Pilze gehören. Diese Krankheiten lassen sich daher durch Antibiotika bekämpfen, die das Wachstum der jeweils ursächlichen Mikroorganismen unterdrücken und hemmen. Zu die- ⁵ⁿ sem Zweck gibt es bereits die verschiedensten Antibiotika mit unterschiedlicher Wirkungsrichtung und Wirkungsstärke. Die Mikroorganismen haben nun jedoch die Fähigkeit, daß sie Im Laufe der Zeit gegenüber einem bestimmten Antibiotikum eine Resistenz entwickeln können, so daß sie dagegen unempfindlich werden und hiermit nicht mehr bekämpft werden können. Allein aus diesem Grunde besteht ständig Bedarf an der Schaffung neuer Antibiotika. Wegen der Vielfalt der als Krankheitserreger In Frage kommenden Mikroorganismen 1st mit den bekannten Mitteln zudem keine dem jeweiligen Problemorganismus optimal gerecht werdende Wirksamkeit möglich, so daß auch deshalb stets nach weiteren Antibiotika gesucht wird.

Aufgabe der Erfindung Ist daher die Schaffung eines ^b5 neuen Antibiotikums, durch das sich die für eine Reihe von Krankheiten ursächlichen Mikroorganismen besser bekämpfen lassen als mit den bekannten antlblotlsch wirksamen Mitteln, und diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende neue Antibiotikum A-201B und seine Herstellung gelöst.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum A-20IB hat die im Patentanspruch 1 zum Teil angegebenen physikalischen Daten. Sein Infrarotspektrum geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Das Antibiotikum A-201B ist eine stickstoffhaltige Verbindung, die aus einer Kieselgelkolonne zweckmäßigerweise: mit einem Gemisch aus Aceton und Methanol (9:1) eluiert wird. Die elektrometrische Titration von A-20ÜB in 67%igem Dimethylformamid zeigt einen Anfangs-pH-Wert von 7,3 und ergibt keine titrierbaren Gruppen im pH-Bereich von 3,5 bis 13,5. Bei paplerchromatographlschen Untersuchungen unter Verwendung von Wlhatman-Papier Nr. 1 und Bloautographie mittels Sarcina lutea zeigt das Antibiotikum A-201B In den angegebenen Lösungsmittelsystemen folgende Rj- Werte:

Lösungsmittelsystem

RyWert

0,65
0,92

Lösungsinittelsysteme:

1. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 2% para-ToIuoisuifonsäure und 1% Piperidin

2. 80%iges Ethanol mit 1,5% NaCi. Das Papier Ist mit Im Natriumsulfatlösung imprägniert.

Das Antibiotikum A-201B wird durch Züchtung von Streptomyces capreolus NRRL 3817 nach dem Im Patentanspruch 2 beschriebenen Verfahren gewonnen. Bei dieser Züchtung fällt ein Gemisch aus dem Antibiotikum A-201A und dem erfindungsgemäßen Antibiotikum A-201B an, welches sich durch übliche Methoden voneinander und von anderen Nebenkomponenten des Fermentationsgemisches trennen läßt, wobei das kristalline und normalerweise In überwiegender Menge vorhandene Antibiotikum A-201A im allgemeinen zuerst abgetrennt wird. Bezüglich weiterer Einzelheiten über das Antibiotikum A-201A und die Auftrennung des Antibiotikumgemisches wird auf DE-OS 21 64 564 hingewiesen.

Der Stamm NRRL 3817 ist ohne Beschränkung der Abgabe an Dritte bei der .ständigen Kulturensammlung des Northern Utilization Research and Development Laboratory, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Peorla, Illinois, hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 3817 frei beziehbar. Der Stamm wurde aus einer aus Venezuela stammenden Bodenprobe Isoliert:. Zur Isolierung des Organismus aus der Bodenprobe wurden Teile der Probe In sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde In Streifen auf Nähragar aufgestrichen. Die beimpften Nähragrarplaüen wurden bei 25 bis 35° C Inkubiert, bis Wachstum beobachtet wurde. Am Ende der Inkubationsdauer wurden Kolonien der A-201B-blldenden Organismen mit Hilfe einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagar übertragen. Die Schrägagarkulturen wurden dann zur Erzeugung geeigneter Mengen Inokulum für die Produktion von A-201B Inkubiert.

Die hauptsächlichen morphologischen Merkmale dieses Stammes von Streptomyces capreolus sind: ovale bis leicht zylindrisch geformte glatte Sporen sind In langen gewellten verschlungenen Ketten angeordnet, die Im allgemeinen 10 bis 50 Sporen pro Kette aufweisen, wobei

einige Ketten mehr als 50 Sporen pro Kette haben. Die Sporen haben Abmessungen von 1,005 bis 2,01 μπι χ 0,67 bis 1,05 μπι. Die Sporenfarbe in Masse reicht von weiß bis gelb oder rot auf verschiedenen Medien IShirling, E. B. und Gottlieb, Inter. Bull. Systematic Bacteriol., 16, 313 bis 340 (1966)J. Diese Kultur kann unter die weiße, gelbe und rote Gruppe nach Tresner und Backus, Applied Microbiology, 11, 335 bis 338 (1963) eingeordnet werden. Zellwantlanalysen nach der Methode von Becker et al., App. Mlcrobiol. 12, 421 bis 423 (1964) zeigen die Anwesenheit des Mesoisomeren von Diaminopimelinsäure. Die Kultur ist melaninnegativ. Die Kultur ist zu gutem Wachstum bei Inkubationstemperaturen von 35° C oder mehr fähig.

Andere ähnliche Arten des Genus Streptoniyces sind Streptomyces alboflavus und Streptornyces canescus. Streptomyces alboflavus bildet jedoch ein Melaninpigment und Streptomyces canescus kugeiförmige Sporen.

Für die taxonomischen Untersuchungen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 wurden die Methoden angewandt, die für das internationale Sireptoffiyces-iProjekt zur Charakterisierung von Streplomyces-Ar^n empfohlen wurden (Shlrling und Gottlieb, IbId). Die Ergebnisse der taxonomischen Untersuchungen sind im folgenden zusammengefaßt. Farbbezeichnungen wurden nach der Methode von Inter Society Color Council, National Bureau of Standards (ISCC. NBS) IKelly, K. L. und Judd, D. B., U. S. Department of Commerce, Circ. 553 (1955)] zugeordnet. Die Buchstaben in runden Klammern beziehen sich auf Farbblöcke und die unterstrichenen Buchstaben und Zahlen auf Farbplättchen nach Tresner und Backus, ibid. Die Zahlen in eckigen Klammern beziehen sich auf Farbblöcke nach Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw Hill, New York (1950). Die ISP-Zahlen beziehen sich auf die Medien des internationalen Streptomyces-Projekts, deren Zusammensetzung in der Veröffentlichung von Shirllng und Gottlieb, IbId, angegeben ist. Die Beobachtungen wurden nach 14 Tage langer Inkubation bei 30° C vorgenommen, wenn nichts anderes angegeben Ist.

Mikroskopische Morphologie, Kulturmerkmale und

Physiologie
von Streptomyces capreolus NRRL 3817

Mikroskopische Morphologie

Die Sporen haben ovale bis schwach zylindrische Form und sind in langen, gewellten, verschlungenen Kstten mit 10 bis 50 Sporen pro Kette oder mehr angeordnet. Die Oberfläche der Sporen 1st glatt, wie Im Elektronenmikroskop beobachtet wird. Die Abmessungen der Sporen reichen von 1,005 bis 2,0 Mikron χ 0,67 bis 1,005 Mikron.

Kultureigenschaften

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar: Gutes Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (W) weiß b. Unterseite hellgrau-gelblich-braun (13B5). Kein lösliches Pigment.

Czapek's-Agar: Gutes Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (R) blaß-orange-gelb 3ca, (10B3). Unterseite blaß-gelb (10B2). Kein lösliches Pigment.

Hefeextakt-Agar: Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite kräftig gelbllch-rosa (2F9). Kein lösliches Pigment.

Bennet-Agar: Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite mäßig rot (3H10). Kein lösliches Pigment.

Nähragar: Mittleres Wachstum ohne Luftmycel oder

Sporen. Unterseite hell-gräullch-braun. Kein lösliches Pigment.

Emerson-Agar Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite dunkel-gräulich-gelb (13K3). Kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagln-Agan Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite stark gelblich-rosa. Kein lösliches Pigment.

Calcium-Malat-Agar: Das Wachstum auf diesem Medium ist so schlecht, daß keine Farbzuordnung durchgeführt wurde.

Tyrosin-Agan Mittleres Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (Y) blaß-gelb 2db (HCI). Unterseite blaß-gelb-grün (10Bl). Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 2: Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite gräulich-rötlichorange (11A8). Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 3: Mittleres Wachstum mit mittlerem Luftmycel und Sporen (R) gräuiich-gelblich-rosa 5cb (4A9). Kein lösliches Pigment.

ISP-Mcdiurn Nr. 4: Spärliches Wac.isturn mit spärlichem Luftmycel und Sporen (W) weiß b. Unterseite blaß-gelb-grün ClOBl). Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 5: Das Wachstum auf diesem Medium ist so schlecht, daß keine Farbzuordnung durchgeführt wurde.

Physiologische Merkmale:

Gelatineverflüssigung	negativ
Nitratreduktion	positiv
Melaninpigmentbildung
(a) Pepton-Hefeextrakt-Elsen-Agar	negativ
(b) Trypton-Hefeextrakt-Brühe	negativ

Temperaturanforderungen:

Zwischen 26 und 30° C wird nur vegetatives Wachstum beobachtet. Bei 37° C zeigt sich gutes vegetatives Wachstum. Bei 43 bis 49° C werden gutes vegetatives Wachstum und gutes Luftmycel beobachtet. Kein Wachstum bei 55° C.

Reaktion der Substratfarbe auf pH-Änderung: Unbeeinflußt.

In Tabelle I sind die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungstests zusammengefaßt, die mit dem A-201-bildenden Stamm von Streptomyces capreolus NRRL 3817 durchgeführt wurden. Die In der Tabelle verwendeten Symbole haben folgende Bedeutung:

+= Verwertung positiv
(+) = Verwertung wahrscheinlich
(-) = Verwertung fraglich

- ·-■ t.eine Verwertung

Tabelle I

KohlenstoffverA'ertuag von S. capreolus, Stamm NRRL 3817

Kohlenstoffquelle

Beurteilung

L-Arabinose

Cellobiose

i-Inosit

D(+)-Xylose

D-Mannit

-I-

Fortsetzung

Kohlenstoffquelle Beurteilung

D(-)-Fructose

D(+)-RafTinose

Saccharose

L(+)-Rhamnose

Dextrose

Kontrolle (kein Kohlenstoff)

IO

Als Kulturmedium zur Züchtung von Streptomyces capreolus NRRL 3817 und Bildung des Antibiotikums A-201B kann eines von vielen verschiedenen Medien verwendet werden. Zur Erzielung wirtschaftlicher Produktion, maximaler Ausbeute und leichter Isolierung bekanntermaßen gegen das Antibiotikum empfindlich sind, verfolgt werden. Ein solcher Testorganismus Ist Bacillus subtllls. Der Biotest kann nach der Papierscheibenmethode oder mit Agarplatten durchgeführt werden.

Um ein wirksameres Wachstum des Organismus und eine vermehrte Antlblotlkumblldung zu erreichen, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet. Das LuItvolumen, das pro Minute durch das Kulturmedium gepumpt wird, beträgt gewöhnlich wenigstens 10,0% des Volumens des Kulturmediums. Im allgemeinen Ist das Wachstum um so wirksamer und die Antibiotikumproduktion um so höher, je größer das Luftvolumen Ist, das durch das Kulturmedium gepreßt wird, bis hinauf zu der Menge, die zu einer wallenden Bewegung führt. Gewöhnlich wird die maximale Bildung von antlblotlscher Aktivität In etwa 72 bis 120 Stunden erreicht.

Das Antibiotikum kann durch Filtration, Extraktion und Adsorption von anderen Substanzen, die vorhanden

WcTucFi jcuöCfi bestimmte medien bcVüiiügi. iiVt allgemeinen bietet ein Mehrkomponentenmedium, in dem verschiedene Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff zur Verfügung stehen, daß beste Wuchsmedium. Kohlenstoff stammt aus Quellen wie Dextrinen, Melasse, Glucose oder Glycerin. Gute Stickstoffquellen sind Aminosäuremischungen oder Peptone. Sojabohnenmehl liefert sowohl Kohlenstoff als auch Stickstoff.

In den Kulturmedien sind anorganische Nährsalze enthalten, welche die üblichen Salze umfassen, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat- und Carbonatlonen und ähnliche Ionen liefern. Der Zusatz von Magnesium- und Elsensalzen, vorzugsweise als Sulfate, hat eine besonders günstige Wirkung auf die Produktion des Antibiotikums. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich 1st, sollen dem Kulturmedium auch wesentliche Spurenelemente zugesetzt wer-

H<»p Qnlrhp QnnrpnelAmgnrp WSrden "SWöhrSÜCh slS

zufällige Verunreinigungen bei der Zugabe der anderen Bestandteile des Kulturmediums eingeführt.

Der zur Produktion von A-201B verwendete Mikroorganlsmus Ist In einem weiten pH-Bereich wachstumsfähig. Beispielsweise kann der pH-Wert der verschiedenen Medien von pH 6,2 bis pH 7,2 reichen. Wie es bei den meisten Streptomyceten der Fall Ist, wird das Medium während der Wachstumsperiode allmählich alkalischer und kann einen pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,0 erreichen. Zur Zeit des Aberntens am Ende der Wachstumsperlode beträgt der pH-Wert jedoch gewöhnlich etwa 6,8 bis 7,2.

Vorzugsweise wird eine submersaerobe Fermentation In großen tiefen Tanks für die Produktion großer Mengen ^x des Antibiotikums angewandt. Kleine Mengen können mit Schüttelkolbenkulturen erzeugt werden. Bei der Produktion wird die Verwendung eines vegetativen Inoku-I ums bevorzugt, da bei Verwendung der Sporenform des Organismus eine zeitliche Verzögerung bei der Inokula- ^d5 tion von großen Tanks auftritt. Das vegetative Inokulum wird dann In den größeren Tank überführt. Das Medium, das zur Züchtung des vegetativen Inokulums verwendet wird, kann das gleiche Medium sein, wie es für große Fermentationen verwendet wird. Es können aber auch andere Medien verwendet werden.

Der A-201B-bl!dende Mikroorganismus kann bei Temperaturen zwischen 30 und 50° C gezüchtet werden. Die höchsten Ausbeuten werden offenbar bei einer Temperatur zwischen 35 und 40° C produziert.

Die Bildung antiblotlscher Aktivität während der Fermentation kann durch Prüfung der Fermentationsbrühe auf antibiotische Aktivität gegen Mikroorganismen, die

20

30

60

65 sein Kuiiiici'i, äügciiciiiii wcfucii. lvic riuSMgiicii, wciinc die antibiotische Aktivität enthält, wird aus dem Wachstumsmedium durch Filtration abgetrennt. Das feste Mycel wird verworfen. Dabei wird gewöhnlich eine übliche Filterhilfe verwendet. Das Antibiotikum wird aus dem Flltrat In ein übliches, damit nicht mischbares Lösungsmittel extrahiert. Der Überführung der Antibiotikummischung In das Lösungsmittel geht eine Einstellung des pH-Werts des Flltrats auf 8,5 mit 5 n-Natrlumhydroxidijsung voraus. Nach dem Extrahieren wird die rohe A-201 -Antibiotikummischung durch Verdampfen des Lösungsmittels Im Vakuum gewonnen. Dabei hlnterblelbt ein trockener Rückstand, der In Methanol gelöst wird. Die Auflösung In Methanol ist unvollständig, und das ungelöste Material wird abfiltriert und verworfen. Die verbleibende Methanoilösung wird Im Vakuum zur Trockne eingeengt, und der so erhaltene getrocknete Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird -»it ^ Vniiirrjgntgiign Pgtrolether °e°eber! wodurch sich ein Niederschlag bildet, der die antibiotische Aktivität enthält. Die ausgefällte rohe Mischung aus Antibiotikum A-201A und A-201B wird abfiltriert und Im Vakuum getrocknet. Die Antibiotikummischung wird in 10 Volumentellen Chloroform gelöst und an einer Kolonne mit Kieselgelfüllung Chromatographien und dadurch In die Antibiotika A-201A und A-201B in praktisch reiner Form getrennt. Alternativ kann die Antibiotikummischung an einer Kolonne mit einer chromatographischen Füllung, wie aktiviertem Aluminiumoxid oder Aktivkohle, zur Gewinnung der getrennten einzelnen Antibiotika in praktisch reiner Form Chromatographien werden. Das Antibiotikum A-201 A wird durch Umkristallls'eren aus einem geeigneten Lösungsmittel weiter gereinigt. Das Antibiotikum A-201B ist eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur.

Das chromatographische Verfahren-zur Trennung der Antibiotikummischung in ihre einzelnen Komponenten wird im folgenden ausführlicher beschrieben.

Die rohe Antibiotikummischung, die aus der Petrolether-Chloroform-VerteÜung als Niederschlag erhalten wird, wird im Vakuum zur Trockne gebracht, in Aceton gelöst und auf eine Kolonne mit Kieselgel aufgegeben. Die Kolonne wird durch Aufschlämmen des Kieselgels In einer 1 :1-Lösung von Chloroform/Aceton und Absinkenlassen des Kleselgels bei ablaufendem Träger gefüllt. Nachdem sich die Füllung gesetzt hat, wird die Kolonne mit drei VoIumenteüen der 1 : l-Cniorofonn-Aceton-Lösung gewaschen. Nach Aufgabe der Chloroformlösung der Antibiotikummischung auf die Kolonne wird die Kolonne erneut mit 1 Volumenteil der 1:1-

Chloroform-Aceton-Lösung gewaschen, und das Antibiotikum A-201A wird mit Aceton eluiert. Das Eluat wird aus der Kolonne In Anteilen abgenommen und auf antlblotlsche Aktivität geprüft. Die Fraktionen, die antlblotlsche Aktivität enthalten, werden vereinigt und Im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird In warmem Aceton aufgenommen, die Lösung wird filtriert, >.id das Flltrat wird 8 Stunden auf -20° C abgekühlt. Dur Niederschlag, der sich In der kalten Acetonlösung bildet, besteht aus Antibiotikum A-201A. Die Kristalle werden abflltrlert und Im Vakuum getrocknet. Die Kleselgelkolonne, aus der die gesamte Aktivität an Antibiotikum A-201A durch Eluleren mit Aceton entfernt Ist, wird mit einer 9: 1-Aceton-Methanol-Lösung eluiert. Das Eluat wird In Anteilen aufgefangen und auf antlblotlsche Aktivität getestet. Die Fraktionen, die antlblotlsche Aktivität zeigen, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand Ist eine Flüssigkeit, die mit Aceton gewaschen und erneut zur Trockne eingedampft wird. Die lösungsmittelfreie Flüssigkeit besteht aus Antibiotikum A-201B, einem farblosen bis hellbraunen Öl.

Das neue Antibiotikum Ist antibakteriell, antlfungal und antlamöblsch wirksam. Es zeichnet sich durch eine hemmende Wirkung gegen das Wachstum von Mikroorganismen aus, zu denen sowohl Bakterien als auch Pilze gehören, welche für Mensch und Tier pathogen sind. Es 1st deshalb zur Unterdrückung des Wachstums solcher Organismen vorteilhaft.

Die minimale Hemmkonzentration dieses Antibiotikums In μg/ml, die nach der Röhrchenverdünnungsmethode ;"ür eine Reihe von repräsentativen Mikroorganismen ermittelt wurde, Ist In der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

miKroorganismus

minimale nciiinikonzentration

Staphylococcus aureus 6,25

Streptococcus faecalis 25,00

Erwinia amylovora 25,00

Botrytis cinerea 0,39

Trichophyton mentagrophytes 3,12

Xanthomonas phaseoli 50,00

Pasteurella multocida >100,00

Escherichia coli >100,00

Salmonella spp. >100,00

Candida tropicalis 50,00

Ceratocystis ulmi 0,39
Fusarium oxysporium F. lycopersici 50,00

Verticillium albo-atrum 12,50

Bei oraler Verabreichung in einer Dosis von 100 mg/kg ist das Antibiotikum A-201A zur Behandlung von jungen Ratten wirksam, die mit Entamoeba histolytica Infiziert sind. Das Antibiotikum ist ferner bei intraperitonealer Verabreichung von 50 mg/kg auch zur Bekämpfung von infektioner! bei Mäusen durch Borreüa n.ovy! wirksam.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1 Schüttelkolbenfermentatlon von Antibiotikum A-20IA

Eine Nühragar-Schrägkultur mit folgender Zusammensetzung wird mil Sporen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 beimpft.

Hefeextrakt-Agar

Bestandteil

Menge

Glucose

Hefeextrakt

Agar

destill. Wasser

5g 10 g 20 g

1 I

Die Schrägkulturen werden mit den Sporen von NRRL 3817 bciffip'i und sechs Tage bei 30° C iPiküb'crt. Die reifen Schrägkulturen werden dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und zur Ablösung der Sporen mit einer sterilen Schlinge abgeschabt. Die erhaltene Sporensuspension wird dann zur Erzielung einer gleichmäßigen Verteilung intensiv durchgemischt, und 1 ml der Suspension wird zum Beimpfen von 100 ml eines vegetativen Wuchsmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet.

Medium für vegetatives Inokulum

Bestandteil

Menge

Dextrose

Sojabohnenmehl

Maisquellwasserfeststoffe

CaCOj

NaCl

Leitungswasser

15 g 15 g 5g 2g 5g 1 1

Das vegetative Wuchsmedium wird vor dem Beimpfen 30 Minuten im Autoklaven bei 120° C sterilisiert.

Das beimpfte vegetative Medium wird 48 Stunden bei 3O⁰C unter ständigem Schütteln auf einer Rotatlonsschüttelvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

Anteile von 100 ml des Produktionsmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben für das vegetative Inokulum angegeben wurde, werden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und 30 Minuten bei 120° C sterilisiert. Nach Abkühlen werden die Kolben mit Anteilen von 5 ml des inkubierten vegetativen Mediums beimpft, das wie vorher beschrieben erhalten wurde.

Die Produktionskultur wird 72 Stunden bei 30° C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, geschüttelt. Der pH-Wert des Mediums vor dem Beimpfen beträgt etwa 7,0. Während der Fermentationsdauer steigt der pH-Wert allmählich an und beträgt beim Abernten etwa 7,5. Die antibiotlsche Aktivität wird aus der Fermentationsbrühe nach allgemein bekannten Methoden extrahiert.

Beispiel 2 A. 946 1 Tankfermentation von A-201-Antibiotika

Eine Nähragar-Schrägkultur mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird mit Sporen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 beimpft.

Bestandteil

Fortsetzung

10

Menge

Glucose

Hefeextrakt

Agar

destill. Wasser

ad

5g 10 g 20 g

1 1

Die beimpfte Schrägkultur wird etwa 5 Tage bei etwa 3O⁰C Inkubiert. Dann wird eine kleine Menge steriles destilliertes Wasser zugesetzt, und die Agaroberfläche wird zur Ablösung der Organismen und Gewinnung einer wäßrigen Suspension vorsichtig mit einer sterilen Platlndrahtschllnge abgeschabt.

V₂ ml der so erhaltenen Suspension wird zum Beimpfen von 50 ml eines sterilen vegetativen Wuchsmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Menge

Dextrose

Bactopeton

Glycerin

Milch-Albumin

Rohrzuckermelasse

getrocknete Maisschlempe

destill. Wasser

ad

15 g 10 g 10 g 10 g

5g 10 g

1 1

Bestandteil

Entschäumer

Dextrose

Sojabohnenschrot

0,02 5,00 1,50

Bestandteil

Der pH-Wert dieses Wuchsmediums wird vor dem Sterilisieren mit 5 n-Natriumhydroxld auf 7,0 bis 7,2 eingestellt. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert des Mediums 6,5 bis 6,6. Das beimpfte vegetative Wuchsmedium wird 72 Stunden bei etwa 3O⁰C unter ständiger uurchmischung auf einer Rotationsschütteivorrichiung, die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

Mit einem Anteil von 20 ml des so erzeugten vegetativen Inokulums werden als zweite Stufe 400 ml eines vegetativen Wuchsmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben beimpft. Dieses zweite Inokulum wird etwa 48 Stunden bei 30° C unter konstanter Durchmischung auf einer Rotationsschüttelvorrlchtung, die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

42 1 eines Saatmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben für das vegetative Wuchsmedium der ersten. Stufe angegeben wurde, mit einem Zusatz von 0,2 g eines Entschäumungsmlttels pro 1 Medium werden nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 120° C in einen Fermentationstank gegeben. Das Saatmedium wird mit etwa 400 ml des vegetativen Inokulums der zweiten Stufe versetzt. Die Fermentation des Saatwuchsmediums wird etwa 24 Stunden bei etwa 30° C unter Rühren mit einem Rührer mit 135 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,0184 m'/Mlnute durchgeführt. Nach etwa 24 Stunden langer Fermentation werden etwa 8,01 der Saattankkultur zum Beimpfen von 9461 eines sterilen Produktionsmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

% (Gew./Vol.)

% (Gew./Vol.:

Rohrzuckermelasse
Calciumcarbonat
destill. Wasser

ad

0,30

0,25

100,00

Die Fermentation wird bei einer Temperatur von etwa 30° C mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 250 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,396 m'/Mlnute etwa 48 Stunden lang durchgeführt. Zu diesem Zeltpunkt wird eine sterile Lösung von 47,2 kg Dextrose In 42 1 Wasser zugesetzt. Die Fermentation wird etwa 48 weitere Stunden fortgesetzt. Dann wird die Fermentation beendet und mit dem Abernten begonnen.

B. Isolierung der Antibiotikummischung

900 1 Fcrmcntutiorisbrühc, die wie unter A beschrieben erhalten wurde, werden unter Zusatz von 27 kg einer üblichen Filterhilfe filtriert, und das Filtrat wird mit 5 n-Natrlumhydroxldlösung auf pH 8,5 eingestellt. Das alkalische Filtrat wird zweimal mit 0,5 Volumenteilen Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird In 2 I Methanol gelöst, und die unlöslichen Teilchen werden abflltriert und verworfen. Das Methanolflltrat wird Im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird In 470 ml Chloroform gelöst und zu 101 Petroilether gegeben. Dabei bildet sich ein Niederschlag. Der Niederschlag wird abnitriert und Im Vakuum getrocknet, wodurch 82,6 g rohe Mischung des Antibiotikums Λ-201 erhalten werden.

C. Auftrennung der A-20!i-Antlblotlkummischung

63 g der rohen Mischung des Antibiotikums A-201, die wie- unter B beschrieben erhalten wurde, werden In 500 ml Chloroform gelöst. Eine chromatographische Kolonne mit den Abmessungen 7 cm χ 60 cm wird mit Kieselgel als Aufschlämmung In einer 1: 1-Mischung von Chloroform und Aceton gefüllt. Der T/3ger wird abgelassen, wodurch sich das Kieselgel absetzt. Die Chloroformlösung der rohen A-201-Antibiotikummischung wird oben auf die Kolonne aufgegeben, und die Antibiotikumlösung wird durch die Kieselgelfüllung strömen gelassen. Nachdem 500 ml Chloroform aus der Kolonne abgelaufen sind, wird die Kieselgelfüllung mit 10 1 einer 1 : 1 -Chloroform-Aceton-Mlschung gewaschen. Der Abfluß und die Waschlösung werden verworfen.

Dann wird Aceton durch die Kolonne geleitet, und das Filtrat wird auf antiblotlsche Aktivität geprüft. Die Fraktionen, die antiblotlsche Aktivität enthalten, werden vereinigt und Im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird mit etwa 500 ml Aceton versetzt. Die Lösung wird erwärmt und dann über Nacht bei -20° C stehen gelassen, um das Antibiotikum A-201 A zu kristallisieren. Die Kristalle werden abflltriert und Im Vakuum getrocknet, wodurch 13,3 g Antibiotikum A-201 A mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 172° C erhalten werden.

Nach dem Eluleren des-Antibiotikums A-201 A wird ein Gemisch aus Aceton und Methanol (9:1) durch die Kolonne geleitet und in Fraktionen abgelassen, die auf antibtotlsche Aktivität geprallt werden. Alle aktiver. EIuaifraktlonen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man etwa 5 g Antibiotikum A-201B als schwachgefärbtes weißes bis hellbraunes Öl bei 25° C erhält.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotikum A-201B, das bei 25° C ein Öl ist, sich in Alkoholen, Aceton, Chloroform und Ethylacetat löst und in Wasser, Kohlenwasserstoffen und Ether unlöslich ist, eine ungefähre Zusammensetzung aus 65,41% Kohlenstoff, 9,03% Wasserstoff, 5,76% Stickstoff und 17,78% Sauerstoff hat, ein nach der osmotischen Dampfdruckmethode ermitteltes Mole- ίο kulargewlcht von 417 aufweist, ein Ultraviolettabsorptionsmaxlmum in 95%igem wäßrigem Ethanol bei etwa 222 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von E',%,,, = 515 hat, ein Absorptionsmaximum bei etwa 242 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von E|'*cm ⁼ 405, ein Absorptionsmaximum bei etwa 327 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von Ej*_cm = 150 und ein Absorptionsmaximum bei etwa 340 nm mit einem Evtinktionskoeffizienten von E}*_cm = 225 hat und in .Chloroform gelöst folgende unterscheidbare Banden im Infrarotabsorptionsspektrum im Bereich von 2,0 bis 16,0 Mikron zeigt: 2,77, 3,05, 3,45, 3,51, 5,90, 6,05, 6,20, 6,60, 6,86, 6,95, 7,10, 7,30, 7,40, 8,30, 8,90, 9,00, 9,64, 10,10, 11,20, 12,30 und 15,23 Mikron.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A-201B nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces capreolus NRRL 3817 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersaeroben Bedingungen züchtet, die filtrierte Fermentationsbrühe auf pH 6,5 einstellt und mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abdampft, den Rückstand In Methanol lest und filtriert, die filtrierte Methanollösung im Vakuum zi, Trockne einengt, den Rückstand in Chloroform löst und zu Petrolether gibt, den dabei entstandenen Niederschlag abfiltriert, im Vakuum trocknet und In Chloroform löst, an einer Kolonne mit Kieselgel Chromatographien und das Antibiotikum A-201B gewinnt.

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