DE2634499C2 - Tylosin-Acylderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und Tierfutterzubereitungen - Google Patents

Tylosin-Acylderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und Tierfutterzubereitungen

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Description

Die Erfindung betrifft die Tylosin-Acylderivate der in dem Patentanspruch angegebenen allgemeinen Formel I sowie deren pharmakologisch nichttoxische Säureadditionssalze. Diese Verbindungen hemmen das Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen, einschließlich wirkstoffbeständiger isolierter Bakterien, die gegenüber Wirkstoffen resistent sind. Außerdem ergeben sie bei einer oralen Verabreichung hohe Blutspiegel.
Die Acylierung von Antibiotika ist eine der zweckmäßigsten Methoden zur Herstellung neuer Antibiotika sowie ihrer Derivate. Normalerweise wird eine chemische Synthese zur Durchführung einer Acylierung angewendet, die Acylierung neigt jedoch dazu, gleichmäßig an vielen Hydroxylgruppen abzulaufen, so daß weitere Reaktionsstufen erforderlich sind, um das gewünschte Produkt zu erhalten, das an bestimmten Positionen acyliert werden soll. Andererseits erleichtern biochemische Verfahren eine selektive Acylierung nur an den gewünschten Stellungen infolge der Spezifität von Enzymreaktionen, wobei die Ausbeute gewöhnlich hoch ist
Die Erfindung beruht unter anderem auf der Erkenntnis, daß eine biochemische Acylierung von Makrolidantibiotika unter Verwendung bestimmter Mikroorganismen möglich ist, wobei in spezifischer Weise die 3- und 4"-Stellung von Tylosin acyliert werden kann. Diese biochemische Acylierung von Tylosin zur Herstellung der erfindungsgemäßen Tylosin-Acylderivate ist neu.
Die chemische Synthese von Tylosin-Acetylester sowie von acyliertem Tylosin wird in der JP-PS Showa 36-22649 (Beispiele 4 und 5) beschrieben, die erhaltenen Produkte sind jedoch von den erfindungsgemäßen Tylosin-Acylderivaten verschieden.
Im Zusammenhang mit der mikrobiologischen Acylierung von 16gliedrigen Makrolidantibiotika, und zwar Spiramycin und YL-704, sind zwei Verfahren bekannt. Das Verfahren unter Einsatz von Spiramycin wird in den US-PS 29 43 024 und 29 43 025, in der FR-PS 12 62 571 sowie in der JP-PS Showa 36-349 beschrieben. Dieses Verfahren läuft wie folgt ab:
1. Ein Spiramycin-erzeugender Organismus von Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 wird in einem Kulturmedium, dem Spiramycin I (mit 3 Hydroxylgruppen) und Acylierungsrrittel zugesetzt worden sind, gezüchtet, wobei Spiramycin 11 (mit der 3-Acetylgruppe) und Spiramycin III (mit der 3-PropionyIgruppe) erzeugt werden.
2. Die gezüchteten Zellen, die frei von Spiramycin sind, sowie die Acylierungsmittel werden in einem Reaktionsmedium suspendiert, dem Spiramycin I und die Acylierungsmittel zugesetzt werden.
Nach einer Bebrütung werden Spiramycin Il und III erzeugt.
3. Bei der Durchführung einer fermentativen Erzeugung von Spiramycinen unter Einsatz des genannten Organismus hat eine Zugabe der Acylierungsmittel eine Erhöhung der erzeugten Menge an Spiramycin II oder III zur Folge.
Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Patentanspruch 2 unterscheidet sich von diesem bekannten Verfahren in folgenden Punkten:
1. Bei der Durchführung des bekannten Verfahrens wird ein Organismus eingesetzt, der direkt Spiramycin erzeugt Das Verfahren ist weitgehend mit einer antibiotischen Fermentation verknüpft
li Demgegenüber erzeugen die erfindungsgemäß
eingesetzten 4 Stämme nicht die gewünschten Antibiotikaspezies, woraus hervorgeht, daß das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip ein enzymatisches Verfahren ist
2. Die bei der Durchführung des bekannten Verfahrens eingesetzten Substratantibiotika sind auf Spiramycin I begrenzt welches ein direktes Produkt des eingesetzten Mikroorganismus ist während das erfindungsgemäße Verfahren auf Tylosin oder dessen Acylderivate d»r angegebenen Formel Γ anwendbar ist woraus die nichtspezifische Art der Reaktion bezüglich der Substratspezifität hervorgeht
3. Das bekannte Verfahren vermag nur die 3-Position von Spiramycin I umzuwandeln, während das erfindungsgemäße Verfahren gleichzeitig die 3- und 4"-Positionen mit einem Organismus umzuwandeln vermag. Dabei kann eine größere Vielzahl von Produkten bei einer entsprechenden Kombination aus Substrat Acyldonator und Reaktionsbedingungen erhalten werden.
Darüber hinaus ist die Einfachheit des Verfahrens zur gleichzeitigen Umwandlung der zwei funktionellen Positionen mit einem Zellsystem hervorzuheben.
Bezüglich YL-704, das zur Familie der Leukomycine gehört, ist auf die JP-PS Showa 49-13992 hinzuweisen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird ein Organismus, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Streptomyces eurocidicus NIHJ-267, Streptomyces albireticuli IFO-12737, Streptomyces kitasatoensis NRRL-2486 und Streptomyces sp. MCRL-0737 besteht, in einem Medium gezüchtet das die »DHP-Verbindung«, 4"-Deacyl YL-7O4Ai, oder die DHP-Verbindung
jo und L-Leucin enthält Nach dem Züchten wird YL-704A), das eine Isovalerylgruppe in der 4"-Posi*ion der DHP-Verbindung enthält, abgetrennt.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von der YL-704Ai-Erzeugung ebenso wie im Falle des beschriebenen Spiramycinverfahrens bezüglich der eingesetzten Mikroorganismen, der enzymatischen Natur des Verfahrens, der nichtgegebenen Substratspezifität sowie der Vielzahl der gesuchten Produkte, wobei ferner die Acylierung an den 3- und 4"-Positionen
bo gleichzeitig mit einem Zellensystem durchgeführt werden kann, so daß das erfindungsgemäße Verfahren für eine Durchführung in industriellem Maßstabe äußerst attraktiv ist.
In den Rahmen der Erfindung fallen ferner pharmazeutische Zubereitungen, die gekennzeichnet sind durch einen Gehalt an Tylosin-Acylderivaten oder deren pharmakologisch nicht-toxischen Säureadditionssalzen der Formel I zusammen mit herkömmlichen inerten
Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder Additiven, ferner Tierfutterzubereitungen, die sich durch einen Gehalt an Tylosin-Acylderivaten und deren pharmakologisch nichttoxischen Säureadditionssalzen gemäß Formel I zusammen mit herkömmlichen inerten Tierfuttermittelbestandteilen und -zusätzen auszeichnen.
Die erfindungsgemäßen Tylosin-Acylderivate hemmen das Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen einschließlich wirkstoffresistenter isolierter Bakterien und bedingen durch orale und enterische Verabreichung hohe Blutspiegel. Sie können dazu verwendet werden, chemotherapeutische Infektionskrankheiten zu bekämpfen, die durch Mikroorganismen in Menschen und Tieren verursacht werden.
Die unter die angegebene Formel I fallenden acht Verbindungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt, und zwar zusammen mit den LD50-Werten, ED50- Werten sowie der Konzentration im Blut. Die LDso-Werte geben die niedrigste Toxizität der Verbindungen bei einer Verabreichung durch intravenöse Injektion an Mäuse an.
Der EDso-Wert ist der therapeutische Wert, d. h. die Dosis der Verbindungen, die bei oraler Verabreichung notwendig ist, um 50% der Versuchsmäuse am Leben zu erhalten, wenn die Mäuse in einer ausreichenden Menge Staphilococcus aureus infiziert werden, die sonst eine Abtötung von 100% der Mäuse zur Folge hätte.
Die maximalen Blutspiegel der erfindungsgemäßen Verbindungen betragen 5 bis 20 mcg/ml bei einer oralen Verabreichung von 100 mg einer jeden Verbindung an Mäuse und 15 bis 20 mcg/ml bei einer Verabreichung der gleichen Menge der Verbindungen mit n-Butyryl oder Isovaleryl in der 4"-Position. Da die LD» der Verbindungen bei intravenöser Verabreichung 400 mg/kg beträgt und die Durchschnittsmaus bei einem Körpergewicht von 20 g ein Blutvolumen von 2 ml besitzt, läßt sich der Blutgehalt entsprechend der LD50 zu 4000 mcg/ml errechnen. Andererseits haben Versuche ergeben, daß, da der Blutgehalt der Mäuse bei einer oralen Verabreichung von 100 mg/kg der Verbindungen r> 5 bis 20 mcg/ml und die Dosis bei einer Verabreichung zur Erzielung einer heilenden ED50 50 mg/kg beträgt, der Blutgehalt der Mäuse, falls eine Dosis entsprechend der ED50 verabreicht wird, zu weniger als 20 mcg/ml ermittelt wird.
Die Tatsache, daß der wirksame Blutgehalt der Verbindungen weniger als 20 mcg/ml zur Erzielung einer Heilungswirkung entsprechend der ED50 beträgt, und daß der Blutgehalt, welcher die Toxizität entsprechend der LD50 wiedergibt, 4000 mcg/ml ausmacht, zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen sehr sichere und wirksame Pharmazeutika sind.
Verbindung LÜ50 ED50 Konzentra
(intravenös) (peroral) tion im Blut
mg/kg mg/kg mcg/ml
3-Acetyltylosin 480 50 5-10
3-Propionyltylosin 500 48 5-10
3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin 520 40 15-20
3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin 515 43 15-20
3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin 510 44 15-20
3-Propionyl-4"-isovalerylty losin 530 41 15-20
4"-n-Butyryltylosin 54(J 48 15-20
4"-isovaleryltvlosin 525 47 15-20
Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
F i g. 1 und 2 die UV-Absorptionsspektren von 4"-n-Butyryltylosin bzw. 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin.
F i g. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 die Infrarotabsorptionsspektren von 3-Acetyltylosin, S-AcetyW'-n-butyryltylosin. 3-Acetyi-4';-isovaieryityiosin, 3-Propionyltylosin, 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin, 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin, 4"-n-Butyryltylosin bzw. 4"-lsovaleryltylosin.
Fig. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 und 18 NMR-Spektren (CDCI3) der Verbindungen, und zwar in der Reihenfolge, wie sie in den anderen Figuren bezüglich der Infrarotabsorptionsspektren angegeben werden.
F i g. 19,20 und 21 die chemischen Ionisationsmassenspektren von 3-Acetyltylosin, 3-Propionyltylosin bzw. S-AcetyW-isovaleryltylosin.
Fig.22 und 23 die C»-NMR-Spektren (25,2MHz) von 3-Acetyltylosin und S-AcetyW'-isovaleryltylosin.
Fig.24 ein Dflnnschichtchromatogramm der erfindungsgemäßen Tylosinderivate.
Nachfolgend wird die Erfindung im einzelnen erläutert:
Die erfindungsgemäß eingesetzten vier Mikroorganismenstämme können aus hinterlegten Kulturvorräten sowie aus im Freien isolierten Materialien gewonnen werden. Die natürlich oder künstlich aus diesen Stämmen erhaltenen Varianten und Mutanten können ebenfalls eingesetzt werden. Beispielsweise können fviuianicn, die eine erhöhte Acyiicrungsaktivität besitzen, nach in herkömmlicher Weise angewendeten Methoden für eine mikrobielle Mutation und Selektion erhalten werden.
Erfindungsgemäß werden diese Organismen durch Anwendung der allgemeinen Methoden gezüchtet, wie sie zum Züchten von Stämmen des Genus Streptomyces angewendet werden, wobei jedoch geeignete Bedingungen ausgewählt werden sollten, um das volle Acylierungsvermögen der enzymatischen Aktivität zu erhalten. Das Kulturmedium enthält vorzugsweise Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Maltose, Rohrzucker, Stärke oder Malzsirup, Alkohole, wie Äthanol und Glyzerin, öle, Fette und Wachse pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, organische Säuren, wie Essigsäure und Zitronensäure, sowie ihre Salze, wobei jedoch auch andere assimilierbare Komponenten verwendet werden
können, die als derartige Kohlenstoffquelle dienen. Diese Verbindungen werden einzeln oder in Kombination aus zwei oder mehreren in einer Konzentration von 0,5 bis 10 g/dl und insbesondere von 2 bis 6 g/dl je nach der Art der verwendeten Verbindungen eingesetzt. Die Stickstoffquellen, welche vorzugsweise eingesetzt werden, sind proteinreiche organische Verbindungen tierischen, pflanzlichen oder mikrowellen Ursprungs, wie Kasein, Pepton, Mehlprodukte, die aus Sojabohnen, Mais oder Baumwollsamen hergestellt werden, sowie Zubereitungen aus Hefe und Bakterien. Ferner kommen verschiedene anorganische Verbindungen in Frage, wie sie in herkömmlicher Weise als Stickstoffquellen verwendet werden, beispielsweise Ammoniumsalze. Andere stickstoffreiche Verbindungen, die durch die Organismen assimiliert werden können, können ebenfalls verwendet werden. Diese Stickstoffquellen werden einzeln oder in Kombination aus zwei oder mehreren in dem Medium in einer Konzentration von 0,1 bis 10 g/dl eingesetzt. Im Falle von organischen Materialien beträgt die bevorzugte Konzentration 1 bis 6 g/dl, während anorganische Verbindungen in geringerer Menge eingesetzt werden. Das Medium enthält ferner anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Mineralsalze sowie das Wachsum fördernde Materialien, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt sowie Vitamine und vitaminreiche Materialien. Diese Materialien werden in Konzentration von 0,01 bis 0,5 g/dl, je nach der Art des Organismus sowie der eingehaltenen Mediumzusammensetzung, verwendet.
Das Züchten der Organismen wird aerob durch Belüftung und Rühren durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wird zwischen 4,5 und 9,0 und vorzugsweise zwischen 6,0 und 8.0 gehalten. Die Züchtungstemperatur wird zwischen 20 und 45° C gehalten, wobei die bevorzugte Temperatur allgemein im Falle von Streptomyces-Stämmen zwischen 20 und 35° C und im Falle von Streptomyces thermotolerans insbesondere zwischen 30 und 40° C gehalten wird. Die Acylierungsaktivität bezüglich der Verbindungen der Formel I der erfindungsgemäß eingesetzten Organismen wird zu einer frühen Wachstumsstufe erzeugt und auch dann beibehalten, wenn das Wachstum aufgehört hat Eine besonders hohe spezifische Aktivität der Acylierung der 3-Hydroxylgruppe stellt man im Falle von Zellen der frühen bis späten Wachstumsphase fest. Eine hohe spezifische Aktivität im Hinblick auf die Acylierung der 4"-Hydroxylgruppe wird in dem Zeitraum zwischen der spaten Wachstumsphase und der Nachwachstumsphase ermittelt
Die Acylierung mit Zellen unter mit dem Wachstum zusammenhängenden Bedingungen oder im Ruhestand kann entweder in dem gezüchteten Medium oder nach der Abtrennung aus dem Medium oder unter Einsatz von verschiedenen Formen enzymatischer Zubereitungen durchgeführt werden, beispielsweise getrockneter Zellen oder unter Einsatz eines Zellhomogenats, der überstehenden Lösung, die aus dem Homogenat erhalten wird, sowie unter Verwendung von Enzymzubereitungen. Eine immobilisierte enzymatische Zubereitung, wie sie beispielsweise in einem Acrylamidpolymeren fixiert wird, ist ebenfalls verwendbar. Als Ergebnis der Untersuchungen der Art der Acylierung wurde festgestellt, daß zwei Enzymsysteme unabhängig bei einer derartigen Acylierung eine Rolle spielen. Es handelt sich um Makrolid-3-acyl-Transferase und Makrolid-^'-acyl-Transferase, wie sie im vorliegenden Falle genannt werden, wobei diese Enzyme Acylgruppe an die 3- bzw. 4"-Hydroxylgruppen von lögliedrigen Makrolidantibiotika übertragen. Diese Enzymsysteme katalysieren diese Übertragung in nichtspezifischer Weise bezüglich der Art der Acylgruppe, sie bevorzugen jedoch jede Acylgruppe derart, daß die Makrolid-3-acyl-Transferase vorzugsweise die Acetylgruppe, Propionylgruppe und n-Butyrylgruppe in der angegebenen Reihenfolge überträgt, während die Makrolid-4"-acyl-Transferase die Isovalerylgruppe, n-Butyrylgruppe
ίο sowie die Propionylgruppe in der angegebenen Reihenfolge überträgt.
Der zur Durchführung der erfindungsgemäßen Acylierungsreaktion eingesetzte Acyldonator besteht aus Acetyl-CoA, Propionyl-CoA, n-Butyryl-CoA, Isovaleryl-CoA und/oder den entsprechenden Vorläufern dieser Acyl-CoA. Die Vorläuferverbindungen setzen sich beispielsweise aus organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure sowie Isovalerylsäure sowie ihren Salzen, beispielsweise Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalzen etc. zusammen, ferner ihren Estern, beispielsweise Methanol- und Äthanolestern sowie ihren Amiden. In Frage kommen ferner Aminosäuren, wie α-Aminobuttersäure, Norvalin, L-Leucin sowie Ketosäuren, wie beispielsweise «-Ketobuttersäure sowie «-Ketovalerylsäure.
Im allgemeinen werden die Acyl-CoAs dem Reaktionsmedium dann zugesetzt, wenn die Reaktion mit einem enzymatischen System durchgeführt wird, das eine schlechte Fähigkeit besitzt, das jeweilige Acyl-CoA aus CoA und den Acylvorläufern zu erzeugen. Gleichzeitig werden Acylvorläuferverbindungen verwendet, wenn das System zur Regenerierung des jeweiligen Acyl-CoA vollständig arbeitet, d.h. wenn beispielsweise Zeilwachstumsbedingungen oder dergleichen vorliegen. Die Menge der dem Reaktionsmedium zugesetzten Acyldonatoren entspricht gewöhnlich dem Molverhältnis des Antibiotikumsubstrats im Falle von Acyl-CoA oder liegt in der Nähe dieses Verhältnisses, wobei auch höhere Molverhältnisse in
ίο Frage kommen, beispielsweise ein 3- bis 1Ofaches Molverhältnis im Falle von Vorläuferverbindungen. Lebende Zellen können Acetyl-CoA aus Kohlenstoffquellen über ihren Stoffwechselzyklus erzeugen. Liegt daher eine ausreichende Menge einer Kohlenstoffquelle bei der Reaktion mit lebenden Zellen vor, dann verläuft die Acetylierung gewöhnlich durch endogen gebildetes Acetyl-CoA. Da Propionyl-CoA sowie andere CoAs in weit kleineren Mengen als Acetyl-CoA gebildet werden, wird in ähnlicher Weise in einem derartigen Reaktionsso system nur eine kleine Menge an derartigen acylierten Produkten in der umgesetzten Mischung festgestellt. Wird Acetyl-CoAs zur Durchführung der Reaktion eingesetzt, dann kann dann, wenn die Reaktion beendet ist, CoA aus dem Reaktionsmedium nach herkömmlichen Methoden für eine CoA-Isolierung abgetrennt und erneut für die Synthese von Acyl-CoA verwendet werden.
Die Substratantibiotika für die Acylierung werden der Reaktionsmischung beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung, einer schwach sauren wäßrigen Flüssigkeit oder gelösten Lösungsmitteln zugesetzt, die nur eine geringe nachteilige Wirkung auf die Reaktion ausüben, beispielsweise gelöst in Methanol oder ÄthanoL Ferner kommen wäßrige Lösungsmittelmischungen in Frage, Suspensionen, Aufschlämmungen und feine Pulver. Die Konzentration der Antibiotikumverbindungen in der Reaktionsmischung beträgt 0,1 bis 50 g/l und vorzugsweise 0,5 bis 30 g/L Die erfindungsgemäß einsetzbaren
Antibiotika sind solche mit einem 16gliedrigen Makrolidring, beispielsweise Leucomycine, Maridomycine, Spiramycine, Angolamycin, Tylosin, Carbomycin A sowie Carbomycin B, wobei wenigstens eine Gruppe in der 3- und 4"-Position aus einer Hydroxylgruppe in natürlicher Weise besteht oder" durch eine chemische oder biochemische Methode in eine Hydroxylgruppe umgewandelt worden ist.
Die chemischen und physikalischen Bedingungen bei der Durchführung der Acylierungsreaktion sind pra.k- ι ο tisch den Bedingungen ähnlich, die beim Zellenzüchten eines jeden in Frage kommenden Organismus eingehalten werden, wobei es sich auch um die begünstigten Bedingungen für die enzymatischen Reaktionen handelt, die für die jeweiligen Zellen gelten. Die Reaktionstemperatur beträgt 25 bis 43° C und vorzugsweise 28 bis 40° C. Der pH wird zwischen 5,0 und 8,5 und vorzugsweise bei 5,5 bis 8,0 zur Acylierung der 3-Position bzw. bei 6,5 bis 8,5 zur Acylierung der 4"-Position gehalten. Die Verwendung einer entsprechenden Pufferlösung ist zweckmäßig zur Aufrechterhaltung des beabsichtigten pH-Wertes im Falle von Reaktionen, bei denen kein Zellenwachstum erfolgt. Die Pufferlösungen, die in herkömmlicher Weise für allgemeine enzymatische Reaktionen eingesetzt werden, beispielsweise Phosphatpufferlösungen, Citratpufftrlösungen etc, werden verwendet, jedoch sollte die Verwendung von Acetatpuffern oder solchen, die Acetylgruppen enthalten, nur auf die Acetylierungsreaktion begrenzt werden. Die Reaktionszeitspanne jo beträgt gewöhnlich 30 Minuten bis 10 Stunden.
Nachfolgend werden weitere Verfahren der Acylierung zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Acyl-Tylosinderivate beschrieben.
l)4"-n-Butyryltylosin j1
Die zuvor erwähnten Organismen werden in einem Medium wachsen gelassen, das beschränkte Konzentrationen an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. Sind die Kohlenstoffquellen fast vollständig verbraucht wird Tylosin der Brühe in einer Menge zugesetzt, welche die Acylierungsaktivität der 3-Position der Zellen übersteigt und zwar zusammen mit n-Butyryl-CoA oder dessen Vorläufern.
Die Reaktion wird unter praktisch den gleichen Bedingungen wie im Falle der Zellenzüchtung durchgeführt. Ein Teil des zugesetzten Substrats wirti unter Bildung von 3-Acetyltylosin acetyliert, während der andere Teil nicht-acetyliert bleibt In der Zwischenzeit verläuft die gleichzeitige Butyrylierung der 4"-Hydroxylgruppe, was die Bildung von 4"-n-Butyryltylosin und einer kleineren Menge 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin. aus welchen das erstere Produkt isoliert wird, bedingt
2) 4"-Isovaleryltylosin
55
Zur Durchführung einer Acylierungsreaktion, die in ähnlicher Weise wie die Reaktion gemäß 1) durchgeführt wird, werden Isovaleryl-CoA oder seine Vorläufer als Acyldonatoren verwendet Dabei wird 4"-Isovaleryltylosin in der Reaktionsflüssigkeit gebildet
3)3-Acetyltylosin
Zur Herstellung von 3-Acetyitylosin wird der Organismus, beispielsweise Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, in einem Medium gezüchtet, das eine ausreichende Menge an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält Nachdem das maximale Wachstum erreicht worden ist und die Kohlenstoffquellen noch in erheblichen Mengen vorliegen, wird Tylosin dem Medium in einer begrenzten Menge zugesetzt, welche nicht die Acetylierungsaktivität der Zellen übersteigt. Während der Reaktion wird kräftig gerührt und belüftet, wobei ein Zellenwachstum stattfindet und die Acetylierung unter Verwendung von Acetyl-CoA durchgeführt wird, das in den Zellen erzeugt wird. Dabei wird 3-Acetyltylosin erhalten.
4) 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin
i) Die zuvor erwähnten Organismen werden in einem Medium gezüchtet, das eine ziemlich eingeschränkte Menge an Kohlenstoffquelle und eine entsprechende Menge einer Stickstoffquelle enthält. Das Züchten wird solange durchgeführt, bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle auf den untersten Wert abgefallen ist. Zu diesem Zeitpunkt wird Tylosin oder 3-Acetyltylosin in einer Menge zugesetzt, die nicht das Acylierungsvermögen der Zellen übersteigt, und zwar zusammen mit n-Butyryl-CoA oder dessen Vorläuferverbindungen als n-Butyrylgruppendonator. Die Reaktion wird solange durchgeführt, bis das Antibiotikumsubstrat vollständig acyliert ist. Das Produkt, und zwar 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin, wird dann isoliert.
ii) Unter Verwendung von 4"-n-Butyryltylosin als Substrat wird die Reaktion in praktisch der gleichen Weise wie unter 3) beschrieben zur Herstellung von 3-Acetyltylosin unter Bewirkung einer Acetylierung an der 3-Hydroxylgruppe zur Gewinnung von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin durchgeführt
5) 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin
Zur Herstellung von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin werden praktisch die gleichen Methoden wie sie unter 4) i) und ii) beschrieben worden sind, angewendet. Es werden Isovaleryl-CoA oder dessen Vorläuferverbindungen als Acyldonator bei der Durchführung der Methode i) und 4"-Isovaleryltylosin als Substrat bei der Durchführung der Methode ii) durchgeführt.
6) 3-Propionyltylosin
Zur Herstellung von 3-Propiony!ty!osin werden die vorstehend erwähnten Organismen in einem Medium gezüchtet das eine beschränkte Menge einer Kohlenstoffquelle und eine ausreichende Menge einer Stickstoffquelle enthält. Nachdem die Kohlenstoffquelle praktisch vollständig verbraucht worden ist wird das Substrat Tylosin der Kulturbrühe in einer Menge zugesetzt die nicht das Propionylierungsvermögen der Zellen übersteigt und zwar zusammen mit Propionylierungsdonatoren, und zwar Propionyl-CoA oder dessen Vorläufern. Die Reaktion wird zur Durchführung einer vollständigen Propionylierung durchgeführt
7) 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin
3-Propionyl-4"-n-butyrytylosin kann in zwei Stufen hergestellt werden. Zunächst wird 3-Propionyltylosin aus Tylosin nach der Methode gemäß 6) hergestellt
Nachdem die erste Reaktion praktisch beendet ist wird der n-Butyryldonator, d.h. n-Butyryl-CoA oder dessen Vorläufer, zusammen mit einer kleinen Kohlenstoffmenge, falls erforderlich, dem Medium zugesetzt worauf eine aerobe Reaktion durchgeführt wird. Dabei erhält man S-PropionyW-n-butyryltylosm.
Diese Verbindung kann auch in einer Stufe durch Zugabe von 3-Propionyltylosin als Substrat zu der gewachsenen Zellenmischung zusammen mit den erwähnten Acyldonatoren hergestellt werden.
8)3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin
In ähnlicher Weise wie unter 7) beschrieben worden ist für die Verwendung eines Isovaleryldonators, und zwar Isovaleryl-CoA oder dessen Vorläuferverbindung, ■-> anstelle des n-Butyryldonators zur Bildung von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin.
Die acylierten Verbindungen, die aus den 16gliedrigen Makrolidantibiotika gemäß vorliegender Erfindung erzeugt werden, können isoliert, gereinigt und unter ι ο Anwendung der Methoden, wie sie im allgemeinen zur Herstellung von 16gliedrigen Makrolidantibiotika angewendet werden, formuliert werden.
Zur Isolierung der Acyl-Tylosinderivate (falls erforderlich) wird die Reaktionsmischung nach schwachem Ansäuern von den Zellen und anderen unlöslichen Einzelteilchen abgetrennt, beispielsweise durch Filtration und Zentrifugieren. Die klare Lösung wird dann auf einen neutralen bis leicht alkalischen pH-Wert eingestellt und mit wasserunmischbaren Lösungsmitteln, beispielsweise Äthylacetat, Toluol oder Benzol, wie sie in herkömmlicher Weise für die Extraktion von Makrolidantibiotika verwendet werden, extrahiert. Zur weiteren Entfernung von Verunreinigungen, die auf die Reaktionsmischung zurückgehen, wird der Extrakt mit angesäuertem Wasser oder einer Pufferlösung vermischt, um die Tylosinderivate in eine wäßrige Schicht zu überführen, die in der vorstehend beschriebenen Weise mit den erwähnten Lösungsmitteln extrahiert wird.
Da eine Reihe von Acyl-Tylosinderivaten in dem Extrakt vorliegt, werden diese Derivate durch verschiedene Differenzierungsmethoden für Makrolidantibiotika abgetrennt In dem Falle, daß ihre Trennkoeffizienten in Bezug auf Wasser und organische Lösungsmittel J5 erheblich differieren, kann man beispielsweise eine 1) Gegenstromextraktionsmethode und eine Trennextraktionsmethode anwenden. Liegen andererseits die Koeffizienten nahe beieinander, dann kann man chromatographische Methoden anwenden, wobei bei- ίο spielsweise Kieselgel, Ionenaustauscherharze etc. angewendet werden, und zwar je nach dem Typ der 2) enthaltenen Derivatspezies.
Die Derivate werden in fester Form durch übliche Konzentrierung derartiger Antibiotikumlösungen, bis "5 3) sie trocken werden oder kristallisieren, erhalten. Zum Kristallisieren der Derivate in einer hochreinen Form wird das roh abgetrennte Material in organischen Lösungsmitteln, wie Azeton und Methanol, aufgelöst, worauf die Lösung allmählich einer Flüssigkeit, wie Wasser oder η-Hexan, in der das Derivat kaum löslich ist, zugesetzt wird. Die Kristallisation kann auch mit Lösungsmitteln, wie Äthyläther oder einer Mischung aus Äthyläther und Isopropyläther, welche diese Derivate gering lösen, durchgeführt werden. 3-Acetyltylosin läßt sich leicht aus Benzol und Toluol auskristallisieren. Die gesammelten Kristalle werden zur Erzeugung weißer kristalliner Pulver getrocknet.
Die acht erfindungsgemäßen Acyl-Tylosinderivate, und zwar 3-Acetyltylosin, 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin, 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin, 3-Propionyltylosin, 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin, 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin, 4"-n-Butyryltylosin sowie 4"-Isovaleryltylosin, sind neue Verbindungen, wie Untersuchungen ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, ihrer chemischen Strukturen etc. ergeben haben. Die physiochemische Analyse sowie die einzelnen Bestimmungen betreffen eine Elementaranalyse, die Ermittlung des Schmelzpunktes, das spezifische Drehvermögen, die Ermittlung des UV-Spektrums, des IR-Spektrums, des NMR-Spektrums, des C13-NMR-Spektrums, des Massenspektrums (chemische Ionisation), die Freisetzung von organischen Säuren unter alkalischen Bedingungen (gaschromatographische Ermittlung), die Löslichkeit in Losungsmitteln, eine Farbentwicklungsreaktion, die Basizität der Verbindungen, das Aussehen und die kristalline Form. Das Molekulargewicht wird als QM + (Quasi Molecular ion) durch eine chemisch ionisierte Massenspektrumanalyse ermittelt. Diese Ergebnisse gehen aus der Tabelle I sowie den F1 g. 1 bis 23 hervor, gemäß welchen
die Ermittlung von organischen Säuren auf gaschromatugraphischem Wege erfolgt: Es werden 0,5 η KOH/Äthanol-Lösungen hergestellt, die bei 70 bis 75°C während einer Zeitspanne von 20 Minuten behandelt und dann einer Analyse unterzogen werden,
die aus den Lösungsmitteln gemäß 13) erhaltenen Kristalle zur Durchführung der Tests 1) bis 12) verwendet werden,
die Molekulargewichte als QM+ aus chemischen ionisierenden Massenspektren unter Verwendung von CH4 als Reaktantengas erhalten werden.
Tabelle I
Physikalisch-chemische Eigenschaften der Acyl-Tylosinderivate
Analyse
Verbindungen
3-Acetyltylosin
3-Acetyl-4;'-nbutyryltylosin 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin
3-Propionyltylosin
1) Aussehen
2) Elementaranalyse
(berechneter Wert) (%)
3) Molekulargewicht
Massenspektroskopie
weiße kristalline Pulver
C 60,25 (60,17) C 60,70 (60,75)
H 8,27 (8,31) H 8,39 (8,33)
O 29,98 (30,06) O 29,51 (29,56)
N 1,50 (1,46) N 1,40 (1,36)
958
1028 C 61,05 (61,08)
H 8,33 (8,41)
O 29,23 (29,17)
N 1,39 (1,34)
1042
C 60,45(60,54)
H 8,46(8,40)
O 29,59(29,62)
N 1,50(1,44)
972
13
14
Fortsetzung
Analyse Schmelzpunkt Verbindungen I 282 nm 2920, 3-AeetyW-n- 282 nm 2890, 2980, 3-Acetyl-4"- 2980, 3-Propionyltylosin I 2945,
• Spezifisches Drehvermögen 3-AcetyItylosin 2790, butyryltylosin 2730, 2860, 2845, 2800,
1716, 177-181°C 1631, 1750, 1741, 1724,
4) C = Methanollösung (1%) 2960, 1588, 3500-3440, 1382, 1597, isovaleryltylosin 1598, 187-192ÜC 1601
5) UV-Absorptionsspektren 214-219°C 2835, 1360, -31,1 2940, 1320, 1376, 180-1840C 1377, 1383
Eiern 1733, 1235, 2800, 1260, 1305, 1277, -31,2 1345
-33,S 1620, 1123, - El(IH 1675, 1089, 1244, -34,3 1147, 1301,
6) Infrarotabsorptionsspektren 1403, 1010, 240 1456, 984, 1057, 1057, i El0H 282 nm 1168,
(KBr-Pellet) (cm"') , McOH 1265, 925, 1360, 902, 968, 982, 236 1120,
235 1138, 1280, 849, 842, 1053,
7) 1043, 1174, 3460, 2980, 988,
3440, 953, 1020, 2880, 2850, 934,
2865, 838, 925, ASS" 282 nm 2730, 1744, 810,
2710, 222 1680, 1633,
1667, Fig. 2 1459, 1417,
1443, 3510-3440, 1374, 1360,
1295, 2940, 2885, 1327, 1319,
1159, 2800, 2720, 1281, 1259,
1078, 1676, 1632, 1145, 1133,
987, 1457, 1418, 1087, 1067,
893, 1320, 1303, 1018, 998,
1242, 1172, 980, 960,
1122, 1088, 901, 843,
1030, 1000, 784
921, 900,
8) NMR (CDCl3)
60MHz
9) Organische Säuren,
bestimmt durch
Gaschromatographie
10) Löslichkeil
Fig.3 Fig. 11 Essigsäure
Fig. 4 Fig. 12
Essigsäure und n-Butlersäure
Fig.5 Fig. 13
Essigsäure und Isovaleriansäure
Fig. 6 Fig. 14
Propionsäure
11) Farbentwicklungsreaktion
12) Alkalinität
13) Für die Kristallisation
eingesetztes Lösungsmittel
löslich in niederen Alkoholen, wie Äthanol, Ketonen, beispielsweise Azeton,
Äthern, beispielsweise Äthyläther, Estern, beispielsweise Äthylacetat, Benzol
und Toluol,
kaum löslich in η-Hexan und Petroläther,
löslich in saurem Wasser,
leicht löslich in neutralem Wasser,
kaum löslich in alkalischem Wasser.
Molisch (+), konzentrierte Schwefelsäure (+), Ninhydrin (-), Millon (-), Sakaguchi (-), Beuret (-)
alkalische Verbindungen Toluol Äthyläther
Äthyläther
Äthyläther
15
Tabelle I (Fortsetzung)		 26 34 499 C 61,53 (61,40)
H 8,46 (8,49)
O 28,70 (28,78)
N 1,31 (1,33)		 16 4"-IsovaIcryl-
tylosin		 Äihyläther (+), Ninhydrin(- , Millon(-), Saka- i;
Analyse Verbindungen
3-Propionyl-4"-
n-butyryltylosin		 3-Propiony!-4"-
isovaleryltylosin		 1056 4"-n-Butyryl-
lylosin
J) Aussehen weiße kristalline Pulver 180-1860C C 61,33 (61,24)
H 8,65 (8,57)
O 28,56 (28 79)
N 1,46(1,40)		 Isopropyläther-
Älhyläther		 !sopropylälher-
Äthylälher
2) Elementaranalyse
(berechneter Wert) (%)		 C 61,05 (61,08)
H 8,37(8,41)
O 29,25 (29,17)
N 1,33 (1,34)		 -33,2 C 61,03 (60,90)
H 8,55 (8,48)
O 28,94 (29,20)
N 1,48(1,42)		 1000 Die UV-Spektren lassen nur geringe Unterschiede isovaleryltylosin (Fig. 2). Die maximalen Absorptions-
zwischen den 8 Verbindungen erkennen (vgl. beispiels- peaks liegen zwischen 282 und 285 nm wie im Falle von
weise 4"-n-Butyryltylosin (Fig. 1) und 3-Acetyl-4"-n- Tylosin, woraus hervorgeht, daß keine Strukturverände-
3) Molekulargewicht
Massenspeklroskopie		 1042 ΛΪΪ1" 282 nm
227		 986 154-157°C
4) Schmelzpunkt 182-188°C 3490-3440, 2970,
2940. 2885, 2845,
2795,2710, 1735,
1670, 1627, 1595,
1450, 1412, 1372,
1318, 1300, 1171,
1148, 1122, 1087,
1058, 1025, 1005,
981, 921, 900,
843,		 147-151°C -50,8
5) Spezifisches Drehvermögen
lan
C = Melhanollösung (1%)		 -35,2 Fig. 8 -53,4 Ä" 284 nm j
217 I
6) UV-Absorptionsspektren
E Um 		/SSl" 282 nm
.210		 Fig. 16 Au?,11 285 nm
214
Fig. 1		 3497, 2965,2935, I
2880, 2840, 2790, |
2730, 1740, 1730, 1
1681, 1629, 1595, I
1457, 1412, 1374 |
1317, 1299,1279, |
1169,1145,1121, |
1083, 1055, 1028, |
1018, 1000, 983, |
964, 920, 900, |
7) Infrarotabsorplionsspektren
(KBr-Pellet)(cm ')		 3435, 2975, 2940,
2885, 2845, 2795,
2730, 1731, 1670,
1626, 1592, 1450,
1404, 1374, 1318,
1270, 1172, 1086,
1055, 1019, 980,
965, 923, 900,
843,		 Propionsäure und
Isovaleriansäure		 3490, 2970, 2935
2880, 2840, 2790,
2715, 1724, 1680,
1625, 1588, 1449,
1406, 1375, 1313,
1266, 1170, 1121,
1083, 1055, 1019,
980, 963, 923,
905, 842,		 Fig. 10 Il
Fig.7 Fig.9 Fig. 18 I
8) NMR (CDCl,)
60 MHz		 Fig. 15 Fig. 17 Isovaleriansäure ι?
9) Organische Säuren,
bestimmt durch
Gaschromatographie		 Propionsäure und
n-Buttersäurc		 n-Buttersäure löslich in niederen Alkoholen, zum Beispiel Äthanol, Ketonen, zum Beispiel J
Azeton. Älhern, wie beispielsweise Äthyläther, Estern, wie beispielsweise ;
Äthylacetat, Benzol und Toluol, )\
kaum löslich in η-Hexan und Petroläther, ?
löslich in saurem Wasser, ;;'>
leicht löslich in neutralem Wasser, d
kaum löslich in alkalischem Wasser. '
10) löslichkeit Molisch (+), konzentrierte Schwefelsäure
guchi (-), Beuret (-)
11) Farbeniwicklungsrcaktion alkalische Verbindungen
12) Alkalinität Äthyläther
13) Für die Kristallisation
eingesetztes Lösungsmittel
rung in der Keton- sowie der Doppelbindungsstruktur des Makrolidrings erfolgt ist. Durch die Ermittlung von freigesetzten organischen Säuren durch Gaschromatographie sowie aus analytischen Werten bezüglich des Molekulargewichts wurde festgestellt, daß die Verbin- ϊ düngen eine Grundstruktur gemeinsam haben, und zwar die Tylosinstruktur, die eine oder zwei Acylierungsgruppen trägt, beispielsweise Acetyl-, Propionyl-, n-Butyrylsowie Isovalerylreste. Die Werte der IR-Spektren sowie der NMR-Spektren bestätigen die vorstehend angege- ι ο benen Strukturen. Die Werte der chemischen Ionisationsmassenspektrometrie sind für 3-Acetyltylosin (Fig. 19) und 3-Propionyltylosin (Fig.20) als Beispiele für 3-acylierte Derivate und 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin (Fig.21) als ein Beispiel für 3- und 4"-acylierte Derivate angegeben. Jedes Fragment wurde mit den Werten für Tylosin verglichen. Dabei wurde eine Fragmentierung in den C5—O— O—Ci"- und O—C-Bindungen festgestellt, ferner eine Dehydratisierung und Deacylierung sowohl im Falle von Tylosin als auch der Derivate. Daraus ist ersichtlich, daß die Acetyl- und die Propionylgruppe mit dem Makrolidring verbunden sind, während die Isovalerylgruppe an dem Mycarosering sitzt Die Werte von anderen Verbindungen, die nicht erwähnt sind, lassen die gleichen Schlüsse zu >>
Die F i g. 22 und 23 sind Beispiele für CI3-NMR-Spektren von 3-Acetyltylosin als 3-acyliertes Derivat sowie von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin als 3- und 4"-acylierte Derivate. Die Ergebnisse der Zuordnung von Signalen zeigen im Vergleich mit der Zuordnung der Signale von j< > Tylosin, daß die Acetylgruppe an der 3-Stellung des Makrolidrings und die Isovalerylgruppe an der 4"-Position von Mycarose gebunden ist. Im Falle von anderen Verbindungen werden ähnliche Ergebnisse ermittelt, welche die Bindeposition der Propionylgruppe sowie si der n-Butyrylgruppe zeigen und identische chemische Strukturen beweisen.
Es wurden weitere Vergleiche zwischen den erfindungsgemäßen Derivaten und Jen in bekannter Weise synthetisierten Derivaten vorgenommen. In der JP-PS Showa 36-22649 wird in Beispiel 4 die chemische Synthese von Tylosinacetylester unter Verwendung von Acetylchlorid beschrieben. Es wird angegeben, daß die Gewichtsmenge der Acetylgruppe 8,22% (bezogen auf das Gewicht) ausmacht und der pk-Wert ungefähr 5,1 <t> beträgt (elektrometrische Bestimmung der Lösung in Dimethylformamid — H2O = 2:1, bezogen auf das Volumen).
In Beispiel 5 dieser JP-PS wird die Synthese von acetyliertem Tylosin unter Einsatz von Essigsäureanhydrid als Acetylierungsmittel beschrieben. Der Acetylgehalt beträgt 8,91 Gew.-% und der pk-Wert ungefähr 5,2. Eine chemische Synthese des acetylierten Tylosin wird dann nach den vorstehend beschriebenen Methoden durchgeführt Ein Vergleich mit den entsprechenden Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung wird bezüglich ihrer Rf-Werte auf einem Dünnschichtchromatogramm durchgeführt, wobei eine Platte mit der Bezeichnung Art 5715 der Merck Co. eingesetzt wird. Das Entwicklungslösungsmittel besteht aus Äthylacetat : Äthanol: Pyridin (85 :15 :2, bezogen auf das Volumen).
Das erfindungsgemäß erhaltene 3-Acetyltylosin ergibt einen Rf-Wert von 0,59, während das acetylierte Tylosin gemäß Beispiel 4 der erwähnten JA-PS einen Wert von 0,71 und das Produkt gemäß Beispiel 5 dieser JA-PS einen Wert von 0,71,0,75 und 0,83 liefert, was auf eine Mischung von drei Verbindungen hindeutet Andere Bestimmungen bestätigten ebenfalls Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen 3-Acetyitylosin und diesen chemischen Produkten.
In dem angegebenen Beispiel dieser JP-PS wird ferner chemisch synthetisiertes propionyliertes Tylosin beschrieben, das einen Schmelzpunkt von 101 bis 111°C besitzt Dieser Wert unterscheidet sich deutlich von dem Wert von 187 bis 192°C für das 3-Propionyltylosin, das erfindupjsgemäß erhalten wird.
Die antimikrobiellen Spektren der neuen erfindungsgemäßen Tylosinderivate gehen aus der Tabelle II hervor, wobei die minimalen wachstumshemmenden Konzentrationen (MIC, mcg/ml) angegeben werden. Diese Verbindungen besitzen ein vergleichsweise breites antibakterielles Spektrum gegenüber grampositiven Bakterien. Die Toxizität dieser Verbindungen wurde anhand von Tieren getestet, und zwar durch intravenöse Verabreichung. Ferner wurden die LD50-Werte in Mäusen ermittelt. Im Falle von allen Verbindungen betragen diese Werte mehr als 400 mg/kg. Bei der Durchführung von therapeutischen Versuchen unter Einsatz von Mäusen, die manuell mit Staphilococcus aureus SMITH infiziert worden waren, lagen die ED50-Werte unterhalb 50 mg/kg (p. o.) im Falle von allen Tylosinderivaten.
Einer der besonderen Vorteile dieser Tylosinderivate gegenüber bekannten Makrolidantibiotika ist ihre ausgeprägte antimikrobielle Aktivität gegenüber Arzneimittel-resistenten Bakterien. Die Ergebnisse einiger dieser Tests sind in der Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II
Antimikrobielle Spektren
Teststamm
Minimale wachstumshemmende Konzentration (mcg/ml)
Verbindung
3-Acetyltylosin 3-Acetyl-4"-
n-butyryl-
tylosin		 3-Acetyl-4"-
isovaleryl-
tylosin		 3-Propionyl
tylosin
>250 >250 >25O >25O
>250 >250 >25O >25O
>250 >250 >25O >25O
250 250 125 250
1) Candida albicans IAM 4905
2) Candida tropicalis IAM 4924
3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254
4) Escherichia coli (National Institute
of Health)
19 20
Fortsetzung
Teststamm
Minimale wachstumshemmende Konzentration (mcg/ml) Verbindung
3-Aceiyltylosin 3-AcetyM"- 3-Acetyl-4"- 3-Propionyl-
tylosin
n-butyryl- isovaleryl-
tylosin tylosin
>250 >250
0,25 0,49
0,25 0,49
0,98 1,95
0,49 0,49
<0,12 0,25
0,25 0.25
0,50 0,50
1,95 3,91
0,4? 0,98
250 62,5
15,6 15,6
15,6 3,91
5) Proteus morganii (The Institute for Infectious Diseases)
6) Staphylococcus aureus FAD209P
7) Staphylococcus aureus SMITH
8) Bacillus cereus ATCC 9634
9) Bacillus megaterium NRRL B-938
10) Sarcina lutea ATCC 9341
11) Micrococcus flavus I
12) Corynebacterium bovis 1810
13) Mycobacterium smegmatis ATCC
14) Bacillus subtilis ATCC 6633
15) Staphylococcus aureus *MS 9610
16) Staphylococcus aureus *MS 8710
17) Streptococcus pyogenes *MH
Bemerkung: * WirkstofT-resistenter Stamm. Tabelle II (Fortsetzung) >250
0,25 0,12 0,49
0,25 <0,12 <0,12 0,25 7,81
0,49 >25O 250
125 (Brüheverdünnungsmethode)
>250
0,25
0,12
0,25
<0,12
<0,12
<0,12
0,25
3,91
0,25
>250
62,5
62,5
Teststamm
Minimale wachstumshemmende Konzentration (mcg/ml) Verbindung 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin
3-Propionyl-4"-isovaleryl- tvlosin
4'-n-Butyrylivlosin
4"-Isovaleryltylosin
Tylosin
1) Candida dbicans IAM 4905
2) Candida tropicalis IAM 4924
3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254
4) Escherichia coli
(National Institute of Health)
5) Proteus morganii (The Institute for Infectious Diseases)
6) Staphylococcus aureus FAD209P
7) Staphylococcus aureus SMITH
8) Bacillus cereus ATCC 9634
9) Bacillus megaterium NRRL B-938
10) Sarcina lutea ATCC 9341
11) Micrococcus flavus I
12) Corynebacterium bovis 1810
13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607
14) Bacillus subtilis ATCC 6633
15) Staphylococcus aureus *MS 9610
16) Staphylococcus aureus *MS 8710
17) Streptococcus pyogenes *MH 771
0,98 0,25 1,95 0,49 <0,12 0,25 0,50 3,91
>250 >250 >250
250 >250
0,49 1,95 0,98 0,49 0,25 0,49 1,00 3,91
0,49 62,5 15,6 3,91
>250 >25O >250
125 >250
0,25 0,25 0,98 0,49 0,25 0,49 0,98 3,91
0,49
>250
62,5
15,6
>250 >25Ö >250
125 >250
0,49 0,25 0,98 0,98 <0,12 0,25 0,50 3,91
0,49 62,5 15,6 7,80
>250 >250 >250
250 >250
0,49 0,25 0,49 0,25 0,12 0,12 0,50 7,81
0,49 >250 >250
(Brüheverdünnungsmethode)
Bemerkung: * WirkstofT-resistenter Stamm.
Die mit einem * in der Tabelle II gekennzeichneten Stämme sind Wirkstoff-beständige Stämme, die aus Patienten isoliert worden sind, und zwar Staphilococcus aureus MS-9610, der gegenüber Penicillin, Tetracyclin, Erythromycin, Leucomycin, Spiramycin, Iosamycin und Tylosin resistent ist, Staphilococcus aureus MS-871O,der gegenüber Penicillin, Tetracyclin, Erythromycin, Leucomycin und Tylosin resistent ist, sowie Streptococcus pyogenes MH 771, der gegenüber Erythromycin, Oleandomycin, Leucomycin und Tylosin resistent ist. Von den Derivaten »ben diejenigen mit einer 4"-Acylgruppe, d. h. 4"-n-Butyryltylosin, 4"-Isovaleryltylosin, 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin, 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin,
3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin und 3-Propionyl-4"-isovaleryltyiosin, eine besonders starke antimikrobiell Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Arzneimittel-beständigen Stämmen aus.
Die neuen erfindungsgemäßen Tylosinderivate sind basische Verbindungen und bilden nichttoxische Säureadditionssalze mit verschiedenen organischen Säuren, wie Weinsäure, Essigsäure, Propionsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure, sowie anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Diese Salze werden nach den Methoden gebildet, isoliert, gereinigt und formuliert, wie sie gewöhnlich bei der Salzbildung von 16gliedrigen Makrolidantibiotika eingehalten werden. Beispielsweise können das gewünschte Tylosinderivat und die in Frage kommende Säure getrennt in einem geeigneten Lösungsmittel, das eine geringe Löslichkeit für die Salze aufweist, aufgelöst werden, beispielsweise in Äthyläther und Azeton oder einer Mischung davon, worauf vermischt wird. Die Lösung wird dann erforderlichenfalls konzentriert und abgekühlt Dabei erhält man Kristalle des Säureadditionssalzes, die gesammelt und getrocknet werden, wobei ein weißes kristallines Pulver erhalten wird. Die erhaltenen Salze besitzen eine höhere Löslichkeit in Wasser als die entsprechenden acylierten Tylosinderivate und werden vorzugsweise für therapeutische Zwecke verwendet.
Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin-Hydrochlorid mit einem F. von 129 bis 133° C und 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin-Tartrat mit einem F. von 119 bis 122° C.
Infolge ihrer besonderen antimikrobiellen Aktivität eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als infektionsbekämpfende Mittel in der Human- und Veterinärmedizin und können beispielsweise zur enteralen, parenteralen oder oberflächlichen Behandlung von Infektionskrankheiten in ähnlicher Weise wie die bekannten Makrolidantibiotika verwendet werden.
Infolge der besonderen Eignung von Tylosin als Tierwachstumsförderndes Mittel können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch als Nahrungsmittelzusatz zum Aufziehen von Tieren verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die Mischungen mit herkömmlichen Verstreckungsmitteln und Trägern eingesetzt werden, d.h. pharmazeutisch verträglichen organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für eine enterale, parenterale oder Oberflächenaufbringung geeignet sind und nicht in nachteiliger Weise mit den Wirkstoffen reagieren.
Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind beispielsweise Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche öle, Polyäthyienglykole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat; Talk, Kieselsäure, Paraffine, Parfümöle, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride sowie Hydroxymethylzellulose. Die pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsmitteln vermischt werden, beispielsweise Schmiermitteln, Schutzmitteln, Stabilisierungsmitteln, Benetzungsmitteln, Emulgiermitteln, Puffern, Färbemitteln oder Geschmackssubstanzen, die nicht in nachteiliger Weise mit den Wirkstoffen reagieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Form von Nahrungsmittelzusätzen eingesetzt werden, beispielsweise als Nahrungsmittelvormischung bei ίο der Durchführung von herkömmlichen Formulierungsmethoden.
Eine orale, enterale sowie intramuskuläre Verabreichung wird bevorzugt, beispielsweise in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Sirupen und Elixieren, in Form von Injektionslösungen oder in Form von Nahrungsmitteladditivmischungen für eine Verabreichung an Tiere einschließlich Menschen, Vieh, Haushaltstiere, Labortiere und Geflügel. Eine wirksame tägliche Dosis der Verbindungen bei einer oralen Verabreichung an Menschen liegt zwischen 1 und 20 mg pro kg Körpergewicht. Die Dosis kann einzeln oder in geteilten Dosierungen während des Tages verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von 3-Acetyltylosin und 4"-Butyryltylosin aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl (Deziliter) Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O (pH 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert, der dann aus einer Agar-Schrägkultur mit Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft wird. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37° C auf einem Rotationsschüttler. 151
jo des Mediums mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung, das mit einem Antischäumungsmittel in einer Konzentration von 0,05 g/dl versetzt und bei i20°C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß sterilisiert worden sind, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft Das Züchten wird bei 37° C unter kräftigem Rühren und Belüften ungefähr 1 Tag durchgeführt bis die Glukosekonzentration in der Brühe auf 03 g/dl abgesunken ist Zu diesem Zeitpunkt werden 60 g Tylosin und 15 g DL-Norvalin als Donator für die n-Butyrylgruppe in 11 Wasser suspendiert und der Mischung zugesetzt Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von ungefähr 6 Stunden durchgeführt
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und von Myzeln durch Zentrifugieren befreit Nach einer Extraktion mit Benzol wird die zurückbleibende wäßrige Schicht mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und
dann mit 151 Äthylacetat bei 30° C extrahiert Der Äthylacetatextrakt wird mit 151 einer Citratpufferlösung mit einem pH von 3,5 bei 5°C extrahiert Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt und mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH von 8,0 eingestellt und mit 101 Benzol bei 30°C extrahiert Die Benzolschicht wird im Vakuum auf ein Volumen von 150 ml konzentriert Dabei erhält man 5 g eines gelblich-braunen Materials, welches das 4"-n-Butyrylty-
losin enthält. Dieses Material wird auf eine Säule mit einer Länge von 16 cm und einem Durchmesser von 2,1 cm, die mit Silicagelpulver gefüllt ist, gegeben und mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3) extrahiert. Das aus der Säule austretende Eluat wird mit einem Fraktionssammler fraktioniert. Der Inhalt einer jeden Fraktion wird dann chemisch durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Nur die Fraktionen, die 4"-n-Butyryitylosin enthalten, werden gesammelt. Die gesamte Lösung wird dann im Vakuum zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Produkt wird dann in einer erhitzten Mischung aus Äthyläther und Isopropyläther (4:1) aufgelöst. Die Lösung läßt man zum allmählichen Verdampfen des Äthyläthers sowie zu einer Kristallbildung stehen. Man erhält 1,5 g weißer Kristalle von 4"-n-Bi!tyryltylosin von F. 1490C.
Die nach dem Extrahieren mit Benzol verbleibende wäßrige Schicht wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 15 1 Äthylacetat bei 30°C extrahiert. Dieser Extrakt wird mit 15 1 Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5°C vermischt. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 10 I Benzol bei 300C extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird auf ein Volumen von 150 ml unter vermindertem Druck konzentriert und bei 7°C stehengelassen. Man erhält dabei kristallines 3-Acetyltylosin. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden 25 g 3-Acetyltylosin in Form weißer Kristalle von F. 216°C erhalten.
Beispiel 2
Herstellung von 4"-Isovaleryltylosin
aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 - 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Agar-Schrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37° C auf einem Rotationsschüttler. 151 des Mediums, das mit einem Antischäumungsmittel in einer Konzentration von 0,05 g/dl versetzt und bei 120° C 15 Minuten in einem 30 1-Glas-Fermentationsgefäß sterilisiert worden ist. werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 370C unter kräftigem Rühren und Lüften während einer Zeitspanne von ungefähr 1 Tag, bis die Glukosekonzentration in der Brühe auf 03 g/dl abgefallen ist. Zu diesem Zeitpunkt werden 60 g Tylosin und 15 g L-Leucin als Donator für die lsovalerylgruppe zusammen in 11 Wasser suspendiert und der Kulturbrühe zugesetzt Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von ungefähr 6 Stunden zur Beendigung der Umwandlungsreaktion fortgesetzt.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und von den Myzeln durch Zentrifugieren abgetrennt Dabei erhält man 161 überstehende Flüssigkeit. Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und bei 300C in 101 Benzol extrahiert Die Benzolschicht, welche das 4"-Isovaleryltylosin enthält, wird abgetrennt und bei 5° C mit 21 einer Citratpufferlösung von einem pH-Wert von 3,5 extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit 1 1 Äthylacetat bei 30°C extrahiert. Der Lösungsmittelextrakt wird im Vakuum konzentriert und getrocknet. Dabei erhält man 4,7 g eines gelblich-braunen Materials, welches das 4"-lsovaleryltylosin enthält. Dieses Material wird auf eine Säule mit einer Länge von 60 cm und einem Durchmesser von 2,1 cm aufgegeben.
in Die Säule ist mit Silicagelpulver gefüllt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird durch einen Fraktionssammler fraktioniert. Die Inhalte einer jeden Fraktion werden dann chemisch durch Dünn-Schichtchromatographie analysiert. Nur die Fraktionen, welche 4"-Isovaleryltylosin enthalten, werden gesammelt. Die gesammelte Lösung wird dann im Vakuum zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Produkt wird dann in einer erhitzten Mischung aus Äthyläther und Isopropyläther (4 :1) aufgelöst. Die Lösung läßt man
zum allmählichen Verdampfen des Äthyläthers sowie zu einer Kristallbildung stehen. Man erhält 900 mg weißer Kristalle von 4"-Isovaleryltylosin von F. 155° C.
Die nach der Extraktion mit Benzol verbleibende wäßrige Schicht wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 15 1 Äthylacetat bei 30° C extrahiert. Dieser Extrakt wird mit 151 Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird
j(i abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 10 I Benzol bei 300C extrahiert. Der Extrakt wird auf ein Volumen von 150 ml unter vermindertem Druck konzentriert, worauf man ihn bei 70C stehen läßt. Man
ü erhält dabei kristallines 3-Acetyltylosin. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden 17 g 3-Acetyltylosin in Form weißer Kristalle von F. 218° C erhalten.
B e i s ρ i e 1 3
Herstellung von 3-Acetyltylosin aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotole-
5(i rans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C in einem Rotationsschüttler. 15 ml des Mediums aus 4 g/dl Sojabohnenmehi, 5 g/d'i Glukose, 0,02 g/dl K2HPO4, 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O und 0,05 g/dl eines AntischäumungsmiUels, das bei 1200C 15 Minuten in einem 30 1-Fermentationsgefäß sterilisiert worden ist, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft Das Züchten erfolgt bei 37° C unter kräftigem Rühren sowie unter Belüftung.
«,o Nach einem Mikrobenwachstum während einer Zeitspanne von 1 Tag, wobei die Glukosekonzentration auf ungefähr 2 g/dl abgesunken ist (die abnehmende Glukose wirkt als Acetylgruppenvorläufer und wird leicht in Acetyl-CoA durch die Mikrobenwirkung
d5 umgewandelt Daher ist es nicht erforderlich, das Acyl-CoA oder seinen Vorläufer zur Acylierung zuzusetzen), werden 30 g Tylosintartrat in 500 ml einer wäßrigen Lösung der Kulturbrühe zugesetzt, worauf die
Ei-Ei
Reaktion während einer Zeitspanne von weiteren 8 Stunden fortgesetzt wird.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 5 1 Äthylacetat bei 300C extrahiert. Der vereinigte Äthylacetatextrakt wird mit 101 einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 50C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 5 1 Benzol bei 30° C extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Man läßt das Konzentrat bei 7° C während einer Zeitspanne von 2 Tagen stehen. Man erhält kristallines 3-Acetyltylosin. Es werden 16 g 3-Acetyltylosin in Form weißer Kristalle von F. 218° C erhalten.
melt wird und der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, welche 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 2,5 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst.
Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man 530 mg Kristalle von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin von F. 1980C.
Beispiel 4
Herstellung von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin
aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 12O0C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 151 des Mediums mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung, das mit einem Schäumungsmittel in einer Konzentration von 0,05 g/dl versetzt und bei 1200C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß sterilisiert worden ist, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 37° C unter kräftigem Rühren und unter Belüftung während einer Zeitspanne von 1 Tag. Nachdem die Glukose auf eine Konzentration von 0,5 g/dl verbraucht worden ist, werden 3 g Tylosin und 15 g DL-Norvalin in pulverisierter Form zu 151 der Kulturbrühe in einem Fermentationsgefäß gegeben. Nach 8stündiger Reaktion wird die erhaltene Reaktionsmischung mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird ir-ii verdünnter Natriurnhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat bei 300C extrahiert Die erhaltene Äthylacetatschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und dann mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt und mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Allylacetat bei 30° C extrahiert Dieser Extrakt wird bis zur Trockne konzentriert Dabei erhält man 1,5 g eines gelblich-braunen Pulvers. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgebracht, die mit Silicagelpulver gefüllt ist Die Säule besitzt einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3), wobei das aus der Säule austretende Eluat mit einem Fraktionssammler gesam-
Beispiel 5
Herstellung von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin
aus 3-Acetyltylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 sowie 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Agarschrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft.
Das Züchten wird während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Drehschüttler durchgeführt. 15 1 des Mediums mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung, das mit einem Antischäumungsmittel mit einer Konzentration von 0,05 g/dl versetzt und bei 12O0C 15
iü Minuten in einem 30 1-Fermentationsgefäß sterilisiert worden ist, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 37°C unter kräftigem Rühren und unter Belüftung während einer Zeitspanne von ungefähr 1 Tag.
j5 Nachdem die Glukose bis zu einer Konzentration von 0,5 g/dl verbraucht worden ist, werden 1,5 g 3-Acetyltylosin und 15 g DL-Norvalin in pulverisierter Form zu ungefähr 15 1 der Kulturbrühe in einem Fermentationsgefäß zugegeben. Nach einer 8 Stunden dauernden Reaktion wird die Reaktionsmischung mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41
« Äthylacetat zweimal bei 3O0C extrahiert. Der aus 7,51 Äthylacetat bestehende Extrakt wird auf 1 1 im Vakuum konzentriert und dann mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5°C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt mittels einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Athwl2cet2t bei 30° C extrahiert Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 1.2 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist, einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mit einem Fraktionssammler gesammelt Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin analysiert Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 2 ml Äthyläther durch Erwärmen
es aufgelöst Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man 530 mg KristaDe von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin von F. 180°G
Beispiel 6
Herstellung von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin
aus 4"-n-Butyryltylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 HjO (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 120°C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Agarschrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 15 ml des Mediums aus 4 g/dl Sojabohiienmehl, 5 g/dl Glukose, 0,02 g/dl K2HPO4, 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O und 0,05 g/dl eines Antischäumungsmiltels, das bei 1200C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß sterilisiert worden ist, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 37° C unter kräftigem Rühren und unter Belüftung.
Nach einem Mikrobenwachstum während einer Zeitspanne von 1 Tag, wobei die Glukosekonzentration auf 1,7 g/dl abgenommer, hat (die abnehmende Glukose wirkt als Acetylgruppenvorläufer und läßt sich leicht in Acetyl-CoA durch die Mikrobenwirkung umwandeln. Daher ist es nicht erforderlich, das Acyl-CoA oder seinen Vorläufer zur Durchführung der Acetylierung zuzusetzen), werden 500 mg 4"-n-Butyryltylosin der Kulturbrühe zugesetzt, worauf die Reaktion während einer Zeitspanne von weiteren 4 Stunden fortgesetzt wird.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 30° C extrahiert Die aus 7,5 1 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert, dann mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 30°C extrahiert Dieser Extrakt wird bis zur Trockne konzentriert, wobei 750 mg eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mit einem Fraktionssammler fraktioniert wobei der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-Acetyl-4"-n-butyryl-tylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt Nach einer Verdampfung des Lösungsmittels wird der Rückstand in 1 ml Äthyläther unter Erwärmen aufgelöst Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält 250 mg Kristalle von 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin von F. 199-C
Beispiel 7
Herstellung von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin
aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann von einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten wird während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C in einem Rotationsschüttler durchgeführt. 15 1 des Mediums mit der vorstehend erhaltenen Zusam-
Ki mensetzung, ergänzt durch ein Antischäumungsmittel in einer Konzentration von 0,05 g/dl und sterilisiert bei 120°C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 37°C unter kräftigem Rühren und unter Belüftung während einer Zeitspanne von 1 Tag. Nachdem die Glukose auf eine Konzentration von 0,5 g/dl verbraucht worden ist, werden 3 g Tylosin und 15 g L-Leucin in pulverisierter Form zu 15 1 Kulturbrühe in einem Fermentationsgefäß zugesetzt. Nach einer 8 Stunden dauernden Reaktion wird die Reaktionsmischung mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 4 1 Äthylacetat zweimal bei 30° C extrahiert. Die aus 7,5 1 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungs-
jfi schicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 30°C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 1,3 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wird.
j5 Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgebracht, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers gesammelt. Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf Acetyl-4"-isovaleryltylosin analysiert. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 2,5 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst. Durch Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält 400 mg Kristalle von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosinvonF. 180° C.
Beispiele
Herstellung von 3-AcetyI-4"-isovalery!tylosin
aus 3-Acetyitylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K?HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 120° C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann von einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37° C auf einem Rotationsschüttler. 151 des Mediums mit der vorstehend beschriebenen Zusammeno5 setzung, ergänzt durch ein Antischäumungsmittel in einer Konzentration von 0,05 g/dl und sterilisiert bei 120°C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebe-
nen lmpfkultur beimpft Das Züchten erfolgt bei 37° C unter kräftigem Rühren und Belüften während einer Zeitspanne von 1 Tag. Nachdem Glukose bis zu einer Konzentration von 0,5 g/dl verbraucht worden ist, werden 1,5 g 3-Acetyltylosin und 15 g L-Leucin in pulverisierter Form zu 15 1 der Kulturbrüh= in einem Fermentationsgefäß zugesetzt Nach 8 Stunden dauernder Reaktion wird die Reaktionsmischung mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 34 eingestellt und zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 4 1 Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert Die aus 7,5 1 bestehende Äthylacetatschicht wird im Vakuum auf 11 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 3O0C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 1,9 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 : 2). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers gesammelt. Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin analysiert. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 3 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält 500 mg weiße Kristalle von 3-Acctyl-4"-isovaleryltylosin von F. 184°C.
Beispiel 9
Herstellung von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin
aus 4"-isovaleryltylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-KoIben sterilisiert und dann aus einer Agar-Schrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37° C auf einem Rotationsschüttler. 151 des Mediums aus 4 g/dl Sojabohnenmehl, 5 g/dl Glukose, 0,02 g/dl K2HPO4, 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O und 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels, sterilisiert bei 120°C 15 Minuten in einem 301-Fermentationsgefäß, werden aseptisch mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Das Züchten erfolgt bei 37°C unter kräftigem Rühren und unter Belüftung.
Nach einem Mikrobenwachstum während einer Zeitspanne von 1 Tag, wobei die Glukosekonzentration auf 2 g/dl abgenommen hat (die abnehmende Glukose wirkt als Acetylgruppen-Vorläufer und wird leicht in Acetyl-CoA durch die Mikrobenwirkung umgewandelt. Daher ist es nicht erforderlich, das Acetyl-CoA oder seinen Vorläufer bei der Acetylierung zuzusetzen), werden 500 mg 4"-isovaleryltylosin der Kulturbrühe zugesetzt, worauf die Reaktion während einer Zeitspanne von weiteren 4 Stunden fortgesetzt wird.
Die Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 34 eingestellt und zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriuir.hydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert Die aus ungefähr 7,51 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt mit einer
ίο verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 mi Äthylacetat bei 30° C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert Dabei erhält man 2,5 g eines gelblich-braunen Pulvers. Dieses Pulver wird auf eine Säule
ι s aufgegeben, die mit Siiicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule gustretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers
in gesammelt. Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf 3-Acetyl-4"-isovaleiyltylosin analysiert. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 1,5 ml Äthyläther durch
2) Erwärmen au "gelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält 280 mg weißer Kristalle von 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin von F. 1820C.
jo Beispiel 10
Herstellung von 3-Propionyltylosin aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl
j-, Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 12O0C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von I Tag bei 37° C in einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptmediums aus 3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O sowie 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sterilisiert und abgekühlt. 100 ml der Impfkultur werden auf das Medium aufgegeben. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 18 Stunden, bis die zugesetzte Glukose praktisch aufgebraucht ist und der pH-Wert 7,5 beträgt. Dann werden 3 g Tylosin und 30 g Λ-Aminobuttersäure zugesetzt, worauf die Kulturbrühe zur Umsetzung während einer Zeitspanne von 6 Stunden unter den
:5 gleichen Bedingungen, wie sie beim Züchten eingehalten werden, gehalten wird. Die Reaktionsmischung wird aus dem Fermentationsgefäß entnommen.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt
W) und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 4 I Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert. Die aus ungefähr 7,51 Äthylacetai bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1
hr, konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5°C extrahiert. Di« Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit ver dünncer Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert vor
8,5 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 3O0C extrahiert Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert. Dabei erhält man 4,5 g eines gelblich-braunen Pulvers. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagt '.pulver gefüllt ist Sie besitzt einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97:3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mit einem Fraktionssammler gesammelt Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf 3-Propionyltylosin analysiert Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 3,5 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält ungefähr 850 mg weißer Kristalle von 3-Propionyltylosin von F. 189° C.
Beispiel 11
Herstellung von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin
aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptmediums aus 0,3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O sowie 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sterilisiert und abgekühlt. 100 ml der Impfkultur werden auf das Hauptmedium aufgegeben. Das Züchten wird so lange durchgeführt, bis die zugesetzte Glukose vollständig verbraucht ist und der pH-Wert 7,5 erreicht hat. Dann werden 1,5 g Tylosin und 30 g a-Aminobuttersäure als Propionylgruppendonator der Kulturbrühe (151) durchgeführt, um die Propionylierung einer Hydroxygruppe in der 3-Position unter den gleichen Bedingungen durchzuführen, wie sie beim Züchten eingehalten worden sind.
Nachdem die Propionylierung beendet ist, und zwar 4 Stunden nach der Zugabe von Tylosin und a-Aminobuttersäure, werden 30 g DL-Norvalin als Vorläufer eines n-Butyrylgruppendonators zugesetzt, worauf die Reaktion unter den gleichen Bedingungen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, während einer Zeitspanne von 6 Stunden durchgeführt wird. Dabei wird eine Hydroxygruppe in der 4"-Position n-butyryliert.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure mit einem pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 3O0C extrahiert. Die aus 7,5 1 Äthylacetat bestellende Extraktschicht wird auf 1 I im Vakuum konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5°C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 30° C extrahiert Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 2£ g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist, einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers gesammelt, wobei der Inhalt einer jeden Fraktion auf
ίο 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, die diese Verbindung enthalten, werden gesammelt Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 1 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält ungefähr 220 mg weißer Kristalle von Propionyl-4"-n-butyryltylosinvonF. 185° C
Beispiel 12
Herstellung von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin
aus 3-Propionyltylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 sowie 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotole-
3« rans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptmediums aus 3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4,0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O sowie 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 30 1) sterilisiert und abgekühlt. 100 ml einer Impfkultur werden auf das Hauptmedium aufgegeben. Das Züchten erfolgt so lange, bis die zugesetzte Glukose vollständig verbraucht ist und der pH-Wert 7,5 erreicht hat. Dann werden 500 mg 3-Propionyltylosin und 30 g DL-Norvalin als n-Butyrylgruppendonator der Kulturbrühe (151) zugesetzt, um die n-Butyrylierung einer Hydroxygruppe der 4"-Position unter den gleichen Bedingungen während einer Zeitspanne von 4 Stunden durchzuführen, wie sie zum Züchten eingehalten worden sind. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert.
so Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 30° C extrahiert. Die aus 7,51 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 300C extrahiert.
to Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,2 g eines gelblich-braunen Pulvers. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgebracht, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung
b5 erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule ausgetretene Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers gesammelt, wobei der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-Propionyl-4"-n-buty-
ryltylosin analysiert wird Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 1,5 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man 180 mg weißer Kristalle von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosinvonF. 183° C.
10
Beispiel 13
Herstellung von 3-Propionyl-4"-n-butyryItyIosin
aus 4"-n-butyryltylosin
Ein wäßriges Medium folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erfenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptmediums aus 3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O und 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 12O0C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sterilisiert und abgekühlt. 100 ml der Impfkultur werden auf das Hauptmedium aufgeimpft Das Züchten wird während einer Zeitspanne von 18 Stunden durchgeführt, bis die zugesetzte Glukose praktisch aufgebraucht ist und der pH-Wert 7,5 r, erreicht hat. Dann werden 500 mg 4"-n-Butyryltylosin und 30 g a-Aminobuttersäure der Kulturbrühe für eine weitere Umsetzung von 6 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie beim Züchten eingehalten worden sind, zugesetzt Die Reaktionsmischung wird aus dem Fermentationsgefäß entnommen.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 4 1 Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert. Die aus 7,51 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt und mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 300C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 2,2 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers fraktioniert. Der Inhalt einer jeden Fraktion wird auf 3-Propionyl-4"-n-Butyryltylosin analysiert. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindungen enthalten, werden gesammelt. Nach einem Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 2 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Man erhält ungefähr 370 mg weißer Kristalle von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin von F. 185° C.
Beispiel 14
Herstellung von 3-Propiony!-4"-isovaleryItylosin
aus Tylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 ■ 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Agarschrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37° C in einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptmediums aus 3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O sowie 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sterilisiert und abgekühlt. 100 ml Impfkultur werden auf das Hauptmedium aufgeimpit Das Züchten wird so lange durchgeführt, bis die zugesetzte Glukose vollständig verbraucht und der pH-Wert 7,5 erreicht hat. Dann werden 1,5 g Tylosin und 30 g Λ-Aminobuttersäure als Propionylgruppendonator de»· Kulturbrühe (151) zugesetzt, um die Propionylierung einer Hydroxygruppe in der 3-Position unter aen gleichen Bedingungen durchzuführen, wie sie zum Züchten eingehalten worden sind.
Nachdem die Propionylierung beendet ist, und zwar 4 Stunden nach der Zugabe des Tylosins und der Λ-Aminobuttersäure, werden 30 g L-Leucin als Vorläufer für einen Isovalerylgruppendonator zugesetzt, worauf die Reaktion weiter unter den gleichen beschriebenen Bedingungen während einer Zeitspanne von 6 Stunden durchgeführt wird, wobei eine Hydroxygruppe in der 4"-Position isovaleryliert wird.
Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 4 1 Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert. Die aus 7,5 I Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird auf 1 1 im Vakuum konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 50C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 3O0C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei 3 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers gesammelt, worauf der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 1 ml Äthyläther unter Erwärmen aufgelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man 80 mg weißer Kristalle von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin von F. 1810C.
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Herstellung von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin
aus 3-Propionyltylosin
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 120° C 20 Minuten in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und danr aus einer Agsrschrägkultur Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft Das Züchten wird während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler durchgeführt 151 eines Hauptmediums aus 3 g/dl Pepton, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O sowie 0,05 g/dJ eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sterilisiert und abgekühlt 100 ml Impfkultur werden auf das »lauptmedium aufgeimpft
Das Züchten wird so lange durchgeführt, bis die Glukosekonzentration in dem Medium auf weniger als 0,5 g/dl abgefallen ist. Dann werden 1 g 3-PropionyltyIosin und 20 g L-Leucin der Kulturbrühe (ungefähr 15 1) zur Durchführung der Reaktion während einer Zeitspanne von 16 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie zum Züchten eingehalten worden sind, zugesetzt. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt so und zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 3O0C extrahiert Die aus 7,5 1 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird im Vakuum auf 1 1 konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5° C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt und mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 30° C -in extrahiert Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert wobei 1,3 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgebracht die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1cm und eine Länge von 60 cm -n besitzt Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97:3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittes eines Fraktionssammlers fraktioniert, wobei der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung aufweisen, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 0,5 ml Äthyläther durch Erwärmen aufgelöst und beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man 20 mg weißer Kristalle von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin von F. 185° C.
Beispiel 16
Herstellung von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin
aus 4"-isovaleryltylosin
faO
Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 2 g/dl Sojabohnenmehl, 2 g/dl Glukose, 0,1 g/dl Hefeextrakt, 0,05 g/dl K2HPO4 und b5 0,05 g/dl MgSO4 · 7 H2O (pH-Wert 7,0). 100 ml dieses Mediums werden bei 1200C 20 Minuten in einem 500ml-Erlenmeyer-Kolben sterilisiert und dann aus einer Agarschrägkultur von Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 mittels einer Platinschleife beimpft Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 1 Tag bei 37°C auf einem Rotationsschüttler. 151 eines Hauptrnediums aus 3 g/dl PeptoTi, 1 g/dl Glukose, 1 g/dl Stärke, 0,2 g/dl K2HPO4, 0,1 g/dl MgSO4 · 7 H2O und 0,05 g/dl eines Antischäumungsmittels (pH-Wert 7,0) werden bei 1200C 15 Minuten in einem Fermentationsgefäß (Gesamtvolumen 301) sierilisiei t und abgekühlt 100 ml einer Impfkultur werden auf das Hauptmedium aufgebracht Das Züchten wird während einer Zeitspanne von 18 Stunden durchgeführt bis die zugesetzte Glukose praktisch verbraucht ist und der pH-Wert 7,5 beträgt Dann werden 500 mg Isovaleryltylosin und 30 g oc-Aminobuttersäure der Kulturbrühe zur Umsetzung während einer Zeitspanne von 6 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie sie zum Züchten eingehalten worden sind, zugesetzt Die Reaktionsmischung wird aus dem Fermentationsgefäß anschließend entnommen. Die erhaltene Reaktionsmischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und mit 41 Äthylacetat zweimal bei 300C extrahiert Die aus 7,5 1 Äthylacetat bestehende Extraktschicht wird auf 1 1 im Vakuum konzentriert und mit 500 ml einer Citratpufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bei 5°C extrahiert. Die Citratpufferlösungsschicht wird abgetrennt, mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit 300 ml Äthylacetat bei 3O0C extrahiert. Dieser Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei man 2 g eines gelblich-braunen Pulvers erhält. Dieses Pulver wird auf eine Säule aufgegeben, die mit Silicagelpulver gefüllt ist und einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Länge von 60 cm besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer Mischung aus Benzol und Methanol (97 :3). Das aus der Säule austretende Eluat wird mittels eines Fraktionssammlers fraktioniert, wobei der Inhalt einer jeden Fraktion auf 3-PropionyI-4"-isovaleryltylosin analysiert wird. Nur die Fraktionen, welche diese Verbindung enthalten, werden gesammelt. Nach einem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 0,5 ml Äthyläther unter Erwärmen aufgelöst. Beim Abkühlen erhält man Kristalle, die gesammelt und getrocknet werden. Dabei erhält man ungefähr 85 mg weißer Kristalle von 3-Propionyl-4"-isovaleryltylosin von F. 183° C.
Beispiel 17
Ein Medium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 40 g Sojabohnenmehl, 50 g Glukose, 1 g Hefeextrakt, 0,5 g MgSO4 · 7 H2O und 0,5 g K2HPO4 in 1000 ml Wasser (pH-Wert 7,0). 100 ml dos Mediums in einem 500 ml Schüttelkolben werden bei 1200C 20 Minuten sterilisiert. Dann werden Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 aufgeimpft, worauf das Züchten während einer Zeitspanne von 2 Tagin bei 37° C unter Schütteln so lange durchgeführt wird, bis die Glukose vollständig verbraucht ist. 100 mcg/ml Tylosin oder Tylosinderivate werden als Substrate einem jeden der Kolben zugesetzt, worauf jeweils 0,1 g/dl der in der Tabelle III angegebenen Materialien als Vorläufer für die Acylgruppe zugegeben werden. Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 12 Stunden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie beim Züchten eingehalten worden sind. Die Reaktionsmischungen werden schwacher, alkalischer eingestellt. Die
Produkte werden mit Benzol zum Analysieren mittels Dünnschichtchromatographie extrahiert.
Ein Teil des Benzols wird auf eine Dünnschichtplatte aus Silicagel (Merck) in Form eines Flecken aufgebracht. Dann erfolgt eine Entwicklung mit einer -, Lösungsmittelmischung aus η-Hexan, Aceton, Methanol, Benzol und Äthylacetat (30 :10 :8 : 25 : 20), worauf die Platte vollständig getrocknet und dann in eine 10%ige Schwefelsäure eingetaucht und erhitzt wird.
Die Frodukte werden durch Vergleich mit neuen ι ο Tylosinderi'-aten identifiziert, die nach dem Verfahren der Beispiele 1 bis 16 hergestellt worden sind, und deren Struktur ermittelt wurde. Es werden jeweils parallele Aufbringungen auf die Platten sowie Entwicklungen durchgeführt. :·,
Die Benzolextrakte der Reaktionsprodukte sowie der zuvor identifizierten Tylosinderivate werden in Form von Flecken auf einzelne Silicagelplatten aufgebracht. Eine Mischung des Extrakts sowie der identifizierten Derivate wird ebenfalls in der Mitte zwischen den zwei :o Flecken Seite an Seite aufgebracht und mit dem vorstehend erwähnten Lösungsmittelsystem entwickelt. Das Hauptreaktionsprodukt zeigt den gleichen Rf-Wert wie die zuvor identifizierte Verbindung. Die Mischung aus den zwei Proben ergibt einen einzigen Flecken mit r, dem gleichen Rf-Wert, wie aus der Tabelle III hervorgeht.
Die Rf-Werte von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin und 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin sind sehr ähnlich (0,61 bzw. 0,62). 3-Acetyl-4"-n-butyryltylosin und 4"-isovaleryltylosin zeigen ebenfalls sehr nahe beieinanderliegende Rf-Werte (0,57 bzw. 0,58). Diese Werte unterscheiden sich deutlich beim fleckenweisen Aufbringen ihrer Mischungen in der beschriebenen Weise.
Nach der gleichen Methode werden die Produkte der Kolben Nr. 3 und 4 (Rf 0,61) mit 3-Acetyl-4"-isovaleryltylosin mit einem ähnlichen Rf-Wert (0,62) vermischt und fleckenweise zur Durchführung der Chromatographie aufgebracht. Dabei werden nahe beieinanderliegende, jedoch unzweifelhaft unterscheidbare zwei Flecken ermittelt, die zeigen, daß die Produkte von dem Tylosinderivat verschieden sind.
!n der gleichen Weise unterscheiden sich die Produkte der Kolben 14, 15 und 16 (Rf-Wert 0,62) von 3-Propionyl-4"-n-butyryltylosin (Rf-Wert 0,61). Die Produkte der Kolben 7, 8, 9 und 10 (Rf-Wert 0,57) unterscheiden sich von 4-lsovaleryltylosin (Rf-Werl 0,58). Die Produkte der Kolben 11, 12 und 13 (Rf-Werl 0,58) sind andere Verbindungen als 3-Acetyl-4"-n-buty· ryltylosin (Rf-Wert 0,57). Die Beziehung zwischen der Acylierungsverfahren und den Produkten geht aus dei Tabelle IH hervor.
Die in Tabelle III zusammengefaßten Verbindunger werden nach der in Beispiel 17 beschriebener Arbeitsweise hergestellt.
Tabelle III
Beziehung zwischen Substraten, Acylvnrliiufern und Produkten
Ko!-
ben-
Nr.		 Substrate Acylvorlaufer Vergleichs
substanz		 Rf Kl-Wert
des
Reak-
tions-
Haupt-
p rod u k-
tes		 Produkte, die
durch den Rf-
Wert identifiziert
worden sind		 Menge
der
ProdukK
mcg/ml
1 Tylosin a-Kelobutter-
säure		 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 0,28 3-Propionyl-
tylosin		 30
2 Tylosin Natrium-
propionat		 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 0,28 3-Propionyl-
tylosin		 25
3 4"-n-Butyryl-
tylosin		 G-Ketobutter-
säurc		 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 35
4 4"-n-Butyryl-
tylosin		 Natrium-
propionat		 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 27
5 4"-Isovaleryl-
tylosin		 a-Ketobutter-
säure		 3-Propionyl-
4"-isovaIeryl-
tylosin		 0,65 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryI-
tylosin		 37
6 4"-lsovaleryl-
tylosin		 Natrium-
propionat		 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 26
7 3-Acetyl-
tylosin		 e-Keto-n-
Valeriansäure		 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 33
8 3-Acetyl-
tylosin		 n-Buttersäure 3-Acetyl-
4"-n-butyryI-
tylosin		 0,57 0,57 3-AcctyI-
4"-n-butyryI-
tylosin		 21
Fortsetzung
KoI- Substrate
ben-
9 3-Acetyl
tylosin
10 3-Acetyl
tyiosin
11 Tylosin
12
13		 Tylosin
Tylosin
14 3-Acetyl
tylosin
15 3-Acetyl
tylosin
16 3-Acetyl
tvlosin
Acylvorlaufer Vergleichs
substanz		 Rf Rf-Wert
des
Reak-
tions-
Haupt-
produk-
tes		 Produkte, die
durch den Rf-
Wert identifiziert
worden sind		 Menge
der
Produkte
mcg/ml
Äthyl-n-
butylat		 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
lylosin		 18
n-Butyrylamid 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 35
Isovalerian-
säurc		 4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58 0,58 4"-Isovaleryl-
tylosin		 22
Äthyl-
isovalerat
Isovaleryl-
amid		 4"-Isovaleryl-
tylosin
4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58
0,58		 0,58
0,58		 4"-Isovaleryl-
tylosin
4"-Isovaleryl-
tylosin		 17
32
Isovalerian-
säure		 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,62 0,62 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 24
Äthyl-
isovalerat		 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,62 0,62 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 19
Isovaleryl-
amid		 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin 		0,62 0,62 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 27
Beispiel 18
Die Mikroorganismen, Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 bzw. Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454 werden verwendet. Das Züchten und die Reaktion werden wie folgt durchgeführt:
Es wird ein Medium, wie es in Beispiel 17 beschrieben worden ist, verwendet. Streptomyces thermotolerans ATCC 11416 werden bei 37°C und andere Stämme bei 28° C auf einem Rotationsschüttler gezüchtet Nach 30 Stunden werden 300 ml der Brühe (3 Kolben) zum Sammeln von lebenden Zellen filtriert Diese werden in Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert TX m/10) suspendiert Die Zellen werden mittels einer French-Presse aufgebrochen. Jeweils 3 ml der Pufferlösung, die gebrochene Zellen enthalten, werden in Reagenzglas-Fermentationsgefäße des L-Typs gegeben. Einem jedem Fermantationsgefäß werden 40 mcg/ml Tylosin oder Derivate davon als Substrate zugesetzt, worauf verschiedene Arten von Acyl-CoA gemäß Tabelle IV in äquivalenten molaren Konzentrationen zugegeben werden. Die Fermentationsgefäße werden langsam während der 1 stündigen Reaktion geschüttelt Die Reaktion wird durch Zugabe einer Glycin-NaOH-Pufferlösung beendet Die Produkte werden mit Benzol extrahiert und nach der in Beispiel 17 beschriebenen Methode identifiziert Ähnliche Ergebnisse werden mit den vorstehend erwähnten Mikroorganismen erhalten.
so Substrat Acyl CoA. Die eingesetzten Vergleichsverbindungen sowie ihre Rf-Werte sind zusammen mit den Produkten, ihren Rf-Werten sowie den Produktmengen, ermittelt anhand der Farbe der Flecken, in Tabeile ϊV zusammengefaßt
Die Versuche werden mit allen Kombinationen der Mikroorganismen und einzelnen Verbindungen durchgeführt
Tabelle IV
Beziehung zwischen den Substraten, Acyl-CoA, Vergleichssubstanzen, Produkten und Produktmengen
Substrate
Acyl-CoA
Vergleichssubstanz
Rf
Rf-Wert
der
Produkte
Produkte Produktmenge mcg/ml
St. thermo- St. fungieidi- St. hygro- St. Mycaro-
tolerans cus subsp. scopicus faciens
ATCC 11416 esinomyceticus ATCC 21582 ATCC 21454 ATCC 21574
Tylosln Acetyl-CoA 3-Acetyl-
tylosin
Tylosin Propionyl-CoA 3-Propionyl-
tylosin
Tylosln n-Butyryl-CoA 4" .i-Butyryl-
tylosin
Tylosln Isovaleryl-CoA 4"-Isovaleryl·
tylosin
3-AcetyItylosin Acetyl-CoA
3-Acetyltylosin n-Butyryl-CoA 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
lylosin
3-Acelyltylosin Isovaleryl-CoA 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin
3-Propionyl-
tylosin		 n-Butyryl-CoA 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
lylosin
3-Propionyl-
lylosin		 Isovaleryl-CoA 3-Propionyl-
4"-isovalcryl-
tylosin
4"-n-Butyryl-
tylosin		 Acetyl-CoA 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
lylosin
4"-n-Butyryl-
tylosin		 Propionyl-CoA 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin
4"-Isovaleryl-
tylosln		 Acetyl-CoA 3-Acetyl-
4"-icovaleryl-
tylosin
4"-lsovaleryl-
lylosin		 Propionyl-CoA 3-Propionyl-
4"-isovalcryl-
tylosin
0,25 0,25 3-Acetyl-
tylosin		 36
0,28 0,28 hauptsächlich
3-Propionyl-
tylosin		 31
0,54 0,54 hauptsächlich
4"-n-Butyryl-
tylosin		 34
0,58 0,58 4"-Isovaleryl-
tylosin		 37
keine Reaktion 0
0,57 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 38
0,62 0,62 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 36
0,61 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 35
0,65 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 38
0,57 0,57 3-Acclyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 34
0,57 0,57 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 30
0,62 0,62 3-Acelyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 32
0,65 0,65 3-Propionyl-
4"-isovalcryl-
tylosin		 37
18 17
19
11
0 12
14 13 18 20 17 14 13
15 16
13
13
0 12
12
15
18
16
15
12
13 14
12
0 11
13 14 12 15 12
13
Beispiel 19
Die Mikroorganismen Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 bzw. Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454 werden verwendet. Das Züchten und die Reaktion werden wie folgt durchgeführt:
Es wird das in Beispiel 17 beschriebene Medium eingesetzt. Die Stämme werden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler gezüchtet.
Es werden 6 Kolben für die jeweiligen Mikroorganismen vorbereitet, in denen während einer Zeitspanne von 30 Stunden gezüchtet wird. lOOmcg/m! Substrate
■j und 0,1 g/dl Vorläufer werden den Kolben zugesetzt, wobei während einer Zeitspanne von 12 Stunden unter Rühren auf Rotationsschüttlern gebrütet wird. Die Identifizierung und Bestimmung der Produkte erfolgt nach der in Beispiel 17 beschriebenen Methode. Die
ι ο Ergebnisse gehen aus Tabelle V hervor.
Tabelle V
Substrate, Acylvoriäufer, Vcrglcicnssubstanzcn, Produkte und Rf-Werte sowie Produktmengen
Stamm Substrat Acyl-Vorläufer Vergleichs
substanz		 Rf Produkte Rf Produkt
menge
mcg/ml
St. fungicidicus
subsp. espino		 Tylosin a-Amino-
buttersäure		 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 28
myceticus
ATCC 21574		 3-Acetyl-
tylosin		 DL-Norvalin 3-Acetyl-
4"-n-bulyryl-
tylosin		 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 25
4"-lsovaleryl-
tylosin		 a-Keto-n-
buttersäure		 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 20
Tylosin Natrium-
propionat		 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 3-Propionyi-
tylosin		 0,28 14
3-Propionyl-
tylosin		 n-Buttersäure 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 15
3-Acetyl-
tylosin		 Äthyl-
isovalerat		 3-Acetyl-
4"-isovaleryI-
tylosin		 0.i>2 3-Acetyl-
4"->sovaleryl-
tylosin		 0,62 8
St. Hygroscopi
cus ATCC 21582		 4"-Isovaleryl-
tylosin		 a-Amino-
buttersäure		 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 35
3-Propionyl-
tylosin		 DL-Norvalin 3-Propionyl-
4"-n-butyr>'l-
tylosin		 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 31
Tylosin a-Keto-
buttersäure		 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 3-Propionyl-
tylosin		 0,28 23
3-Acetyl-
tylosin		 n-Buttersäure 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 15
TylöMn Äihyi-ii-
butylat		 4"-n-Butyr>l-
tylosin		 0,54 t -n-iiütyryi-
tylosin		 0.54 η
Tylosin Isovaleryl-
amid		 4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58 4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58 10
St mycaro-
faciens
ATCC 21454		 3-Propionyl-
tylosin		 DL-Norvalin 3-Propionyl-
4"-n-Butyryl-
tylosin		 0,61 3-Propionyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,61 30
Tylosin L-Leudn 4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58 4"-Isovaleryl-
tylosin		 0,58 29
3-Acetyl-
tylosin		 a-Keto-n-
valeriansäure		 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 3-Acetyl-
4"-n-butyryl-
tylosin		 0,57 24
3-Propionyl-
tylosin		 Isovalerian-
säure		 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 3-Propionyl-
4"-isovaleryl-
tylosin		 0,65 12
45
Fortsetzung		 26 34 499 Rf 46
Stamm Substrat Acyl-Vorläufer Vergleichs
substanz		 0,62
0,54		 Produkte
3-Acetyl-
tylosin
Tylosin		 Äthyl-
isovalerat
n-Butyrylamid		 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin
4"-n-Butyryl-
tylosin		 3-Acetyl-
4"-isovaleryl-
tylosin
4"-n-Butyryl-
tylosin
Hierzu 24 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Tylosin-Acylderivate der allgemeinen Formel I
H3C CH3
\ / HO CH3 CH2CHO N HO
CH3
CH3
CH2CH
CH
worin Ri ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder Propionylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom, eine m n-Butyryl- oder Isovalerylgruppe bedeutet, wobei jedoch Ri und R2 nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen, und deren pharmakologisch nicht-
H3C
CH3 CH2CHO N
toxische Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Tylosin-Acylderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Tylosin oder dessen Acylderivate der allgemeinen Formel Γ
CH3
/ HO CH3
O —Ri
(O
CH2CH3
-0 CH
H3C
in der Ri' und R2' jeweils ein Wasserstoffatom oder Ri' die Acetyl- oder Propionylgruppe sind, R2' ein Wasserstoffatom darstellt oder R2' die n-Butyryl- oder Isovalerylgruppe und R/ ein Wasserstoffatom bedeutet, in einem Kulturmedium, das übliche assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen mittels Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, oder Streptomyces fungicidicus subsp. espinomyceticus ATCC 21574, oder Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454 oder Streptomyces hygroscopicus
bo ATCC 21582 in Gegenwart von Acetyl-CoA, Propionyl-CoA, n-Butyryl-CoA, Isovaleryl-CoA und/oder den entsprechenden Vorläufern dieser Acyl-CoA als Acyldonator in einer Menge von 1 bis 10 Mol pro 1 Mol des Antibiotikum-Substrats bei einer Temperatur von 25 bis 430C und einem pH-Wert von 5,0 bis 8,5 acyliert.
3. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Tylosin-Acylderivaten
oder deren pharmakologisch nicht-toxischen Säureadditionssalzen gemäß Anspruch 1 zusammen mit herkömmlichen inerten Trägern, Verdünnungsmitteln und/oder Additiven.
4. Tierfutterzubereitungen, gekenrzeichnet durch einen Gehalt an Tylosin-Acylderivaten oder deren pharmakologisch nicht-toxischen Säureadditionssalzen gemäß Anspruch 1 zusammen mit herkömmlichen inerten Tierfuttermittelbestandteilen und -zusätzen.
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