DE1770441C2 - Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

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DE1770441C2
DE1770441C2 DE1770441A DE1770441A DE1770441C2 DE 1770441 C2 DE1770441 C2 DE 1770441C2 DE 1770441 A DE1770441 A DE 1770441A DE 1770441 A DE1770441 A DE 1770441A DE 1770441 C2 DE1770441 C2 DE 1770441C2
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Setsuo Suita Harada
Eiji Takarazuka Higashide
Toyokazu Nara Kishi
Komei Settsu Mizuno
Motoo Toyonaka Shibata
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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika und ein Verfahren zu ihrer Herstellung (vgl. hierzu die beiden Patentansprüche).
Bei den neuen antiblotisch wirksamen Verbindungen handelt es sich um die Gruppe der vier Antibiotika T-2636-A, T-2636-B, T-2636-C, T-2636-D und deren Gemische (nachstehend gemeinsam als »Antibiotikum T-2636« bezeichnet). Die Erfindung betrifft auch ein Herstellungsverfahren, bei dem Streptomyces rochei var. volubills IFO 12507 zur Bildung dieser Antibiotika eingesetzt wird.
Dieser erfindungsgemäße Mikroorganismus hat die nachstehend genannten morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Hierbei basleren die mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf »Rldgway's Color Standard and Nomenclature«.
1) Morphologische Eigenschaften
Die Sporophoren zeigen monopodlsche Verzweigung und Pseudovertlclllus und bilden Schleifen oder Spiralen, wobei die Sporen in Ketten angeordnet sind. Die Sporen sind oval bis elliptisch und haben glatte Oberflächen. Ihre Größe beträgt 0,5 bis 1,0 μηιχθ,9 bis 1,5 \im.
2) Merkmale der Kulturen
Das Substratmycel ist Im allgemeinen farblos. Der Stamm bildet ein braunes bis bräunlich-graues Luftmycel. Er erzeugt keine löslichen Pigmente auf fast allen Arten von Medien oder bildet lediglich ein schwach gelbliches Pigment und gehört zum nlcht-chromogenen Typ.
Für das Wachstum beträgt die Temperatur etwa 20 bis 45° C und der pH-Wert 5 bis 9.
•»5 a) Czapek-Agar:
Wachstum: sich ausbreitend, dünn und farblos
Luftmycel: spärlich, pulverig, weiß bis Light Drab (Rdg. XLVI. 17""-b)
Rückseite: farblos
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
so b) Glucose-Czapek-Agar:
Wachstum: sich dünn ausbreitend, farblos
Luftmycel: spärlich, weiß bis Light Drab (Rdg. XLVI, 17""-b)
Rückseite: farblos
LösllcheSiPlgment: nicht vorhanden
c) Glycerln-Czapek-Agar:
Wachstum: dünn, sich ausbreitend, farblos
Luftmycel: spärlich, pulverig, weiß bis Light Cinnamon Drab (Rdg. XLVI, 13""-b)
Rückseite: farblos
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
6(i d) Glucose-Asparagin-Agar:
Wachstum: mäßig, sich ausbreitend, farblos
Luftmycel: reichlich, pulverig und Light Drab (Rdg. XLVl, 17""-b bis Drab (Rdg. XLVl, 17"") oder Drab Gray (Rdg. XLVl, 17""-d] mit eingestreuten weißen Flecken
Rückseite: farblos bis blaßgelb
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
e) Nähragar.
Wachstum: sich ausbreitend, ziemlich gut und farblos bis blaßgelb
Luftmycel·. spärlich, weiß oder zuweilen Light Drab (Rdg. XLVl, 17""-b)
ft
?■'■		 O I j) 17 70 441 Rückseite: farblos bis schwach-gelb 5
I Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Glucose-Nähragar:
}■> Wachstum: reichlich, farblos bis blaßgdb
■?-i Luftmycel: spärlich, weiß bis Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-d)
rr g) k) Rückseite: schwach braun 10
Lösliches Pigment, nicht vorhanden oder zuweilen schwach braun
i·' Glyceri n-Nähragar:
Wachstum: reichlich, faltig, farblos bis blaß gelblich-braun
Luftmycel: ziemlich gut, weiß
h) 1) Rückseite: schwach-braune oder dunkelbraune Flecken 15
Lösliches Pigment: nicht vorhanden oder Bildung von blaßgelbem Pigment
Nährbrühe:
_- Wachstum: Haut oder Ring, später Sediment
D Luftmycel: nicht vorhanden oder spärlich, weiß
m) Lösliches Pigment: nicht vorhanden 20
Pepton-Agar:
Wachstum: spärlich, dünn, sich ausbreitend und weiß
f Luftmycel: spärlich und weiß
η) Rückseite: farblos
Lösliches Pigment: nicht vorhanden 25
V StSrkcagar:
Wachstum: spärlich, farblos
ο) Luftmycel: nicht vorhanden oder knapp, weiß
Rückseite: farblos
Lösliches Pigment: nicht vorhanden 30
Hefeextrakt-Agar:
Wachstum: reichlich, faltig, farblos bis blaß-braun
P) Luftmycel: ziemlich reichlich, weiß bis Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-d) bis Mouse Gray (Rdg. LI, 15"")
Rückseite: gelblich-braun
Lösliches Pigment: nicht vorhanden 35
Ganzes Ei (37° C):
Wachstum: reichlich, flechtenartig, farblos oder mit schwarzen Flecken, wird später schwarz.
q) Luftmycel: reichlich, weiß bis Pale Olive Gray (Rdg. LI, 23""'-f) oder Mouse Gray (Rdg. LI, 15""') bis
Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-d)
Lösliches Pigment: nicht vorhanden 40.
Kartoffelstichkultur:
Wachstum: reichlich, flechtenartig, farblos
γ) Luftmycel: reichlich, weiß bis Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-d) oder Mouse Gray (Rdg. LI, 15'"")
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Möhrenstlchkultur: 45
S) Wachstum: reichlich, flechtenartig, farblos
Luftmycel: reichlich, pulverig, weiß bis Light Drab (Rdg. XLVI 17""-b) bis Drab (Rdg. XLVI, 17"")
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Lackmusmilch (37° C):
Wachstum: Ring, farblos bis blaß-braun 50
t) Luftmycel: spärlich, weiß
Lösliches Pigment: nicht vorhanden. Peptonlsierung ohne Koaguiierung, fast keine Änderung des pH-
Wertes
Löffler-Serum (37° C):
Wachstum: sich ausbreitend, faltig, farblos 55
Luftmycel: nicht vorhanden oder spärlich, Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-d)
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Keine Verflüssigung oder geringe Verflüssigung
Gelatine (24° C für einen Monat):
Wachstum: schlechtes, ringförmiges Wachstum, farblos. 60
Luftmycel: schlecht, weiß bis Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-f)
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Keine Verflüssigung oder sehr langsame Verflüssigung
Cellulose:
Wachstum: nicht vorhanden oder spärlich, farblos 65
Luftmycel: nicht vorhanden oder spärlich. Drab Gray (Rdg. XLVI, i7""-d).
Calclummaleat-Agar:
Wachstum: mäßig, farblos oder schlecht und dünn
Luftmycel: mäßig, pulverig, weiß bis Light Drab (Rdg. XLVI, 17""-b) oder schlecht und weiß
Rückseite: farblos bis blaß-gelb
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
Tyrosin-Agar:
Wachstum: mäßig, farblos bis Cream Buff (Rdg. XXX, 19"-d)
Luftmycel: schlecht oder mäßig, weiß
Rückseite: farblos oder schwach-gelb
Lösliches Pigment: nicht vorhanden
u) Nitratreduktion: Im wesentlichen keine Reduktion In flüssigem Czapek-Medium, aber Reduktion In
Peptonlösung
v) Stärkeagar:
Wachstumszone 7 bis 10 mm
Enzymatische Zone: 26 bis 30 mm
Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Prldham und Gottlieb, Ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Erythrlt + Saccharose +bls++
Adonit ± Lactose +++
D-Sorbit ± Raffinose -h-
I-Inoslt + Trehalose +H-
D-Mannlt +++ Sal IcI η ·+++
Dulcit + Esculln ±
D-Xylose +++ Inulin ±
L-Arabinose +++ Dextran +++
L-Sorbose ± Stärke +++
D-Galactose +++ Natriumacetat +++
D-Glucose +++ Natriumsuccinat +++
D-Fructose +++ Natrlumcltrat +++
D-Mannose +++ Glycerin +++
Rhamnose + Kontrolle ±
Mellblose +
Maltose +++
Zeichenerklärung: +++ = starkes Wachstum;
++ = gutes Wachstum;
+ = mäßiges Wachstum;
+ = schwaches Wachstum
Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften des Mikroorganismus sowie
•»o seines Aussehens auf den verschiedenen Medien mit den Angaben in »The Actinomycetes' von S. A. Waksman. Band 2, 152 (1961), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage 1957, Archiv für Mikrobiologie, Band 31, Seite 326 bis 358 (L. Ettlinger et al, 1958) läßt die enge Verwandtschaft des zur Herstellung der erflndungsgemäßen Antibiotika verwendeten Mikroorganismen mit Streptomyces rochei erkennen.
Streptomyces rochei bildet gerade oder spiralförmige Sporophoren, erzeugt blaß-gelbe lösliche Pigmente bei
•»5 schneller Verflüssigung auf Gelatine, rötlich-braune Pigmente bei Kartoffelstichkultur und zeigt braunes Wachstum auf Stärkemedium, während der zur Erzeugung der Antibiotika T-2636 verwendete Mikroorganismus schleifen- oder spiralförmige Sporophoren bildet, kein lösliches Pigment und keine Verflüssigung auf Gelatine zeigt und bei der Kartoffelstichkultur fast farblos und auf Stärkemedium farblos ist. In anderer Hinsicht haben jedoch beide Stämme viele Eigenschaften gemeinsam.
Eine Kultur des zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antibiotika verwendeten Mikroorganismus wurde unter der Zugangsnummer IFO 12507 beim Institut for Fermentation, Osaka, hinterlegt.
Die mycologischen Eigenschaften von Actinomycetes, insbesondere der Gattung Streptomyces, liegen noch nicht allgemein fest. Dies gilt auch für die Eigenschaften von Streptomyces rochei.
Gegenstand der Erfindung sind die vier Antibiotika T-2636-A, T-2636-B, T-2636-C, T-2636-D, die dadurch erhalten werden, daß man Streptomyces rochei var. volubills IFO 12507 in einem Medium kultiviert, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoffquellen und andere Nährstoffe enthält und die Kulturbrühe aufarbeitet. Dazu wird die Kulturbrühe mit oder ohne Zusatz eines Filtrierhilfsmittels bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8 filtriert, und das Filtrat bei einem pH-Wert zwischen 2 und 9 mit Ethylacetat, Amylacetat, Benzol, Methylenchlorid, Chloroform, Methylisopropylketon, Meihyllsobutylketon, n-Butanol, Isoamylalkohol
*° oder Diethylether extrahiert. Der so erhaltene Extrakt wird mit einer wäßrigen, sauren Lösung, die einen pH-Wert von 2 bis 5 hat und einer alkalischen, wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 8 bis 10 gewaschen und anschließend eingeengt. Zum Konzentrat wird Petrolether, η-Hexan, Benzol, Diethylether oder ein Gemisch dieser Verbindungen gegeben, und das dabei ausgefällte rohe Pulver in Ethylacetat, Chloroform oder deren Gemischen gelöst. Diese Lösung wird auf eine mit Kieselsäuregel oder Aluminiumoxid gefüllte Säule gegeben, worauf mit Benzol, Diethylether, Ethylacetat, Aceton, Chloroform, Methanol oder einem Gemisch dieser Verbindungen eluiert wird, wobei die Eluate, die die Komponenten A, B, C und D enthalten, in dieser Reihenfolge anfallen. Selbstverständlich kann man die Antibiotika T-2636-A, -B, -C und -D in reiner Form dadurch isolieren, daß man die erfindungsgemäß erhaltenen entsprechenden Eluate einengt und die Konzentrate erneut
der Dünnschicht- oder Sonncnchromutographie an Kieselsäuregel oder Aluminiumoxid unterwirft.
Die folgenden Ausführungen dienen der näheren Erläuterung der Erfindung:
Das Kulturmedium kann flüssig oder fest sein, jedoch 1st die Submerskultur unter Belüftung und Bewegung am vorteilhaftesten. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, Fermentationsdauer und pH-Wert des Mediums werden so gewählt, daß Streptomyces rochel var. volubills IFO 12507 reichlich wächst und die Bildung der erfindungsgemäßen Antibiotika maximal 1st. Eine Kultivierungsdauer von 2 bis 7 Tagen ist im allgemeinen vorteilhaft.
IHis Kulturmedium wird vorzugsweise bei pH 6 bis 8 gehalten. Die optimale Kultivierungstemperatur liegt zwischen etwa 24 und 400C und zur Erzielung besserer Ergebnisse zwischen etwa 28 und etwa 37° C. Durch Veränderung dieser Bedingungen können die Antibiotika T-2636-A, -B, -C und -D In einem Medium in verschiedenen Mengenverhältnissen angereichert werden.
Während beispielsweise T-2636-A und -C bevorzugt gebildet werden, wenn der zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Antibiotika verwendete Mikroorganismus in einem Medium, das 296 Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% Malsquellwasser, 1% Sojabohnenmehl, 0,596 Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,596 Calciumcarbonat enthält (pH 7,0), etwa 42 Stunden kultiviert wird, werden T-2636-B und -D in reichlichen Mengen erhalten, wenn der gleiche Stamm in einem Medium, das 5% lösliche Stärke, 2% Maisquellwasser, 0,596 Po'.ypepton, 0.2% K2HPO4. 0,5% Calciumcarbonat enthält (pH 7,0), etwa 78 bis 90 Stunden kultiviert wird.
Die auf diese Welse gebildeten erfindungsgemäßen Antibiotika sind hauptsächlich im flüssigen Teil der Kulturbrühe, jedoch auch im Mycel vorhanden. Die Antibiotika sind schwach basische oder neutrale fettlösllche Substanzen und können daher insgesamt aus der Kulturbrühe oder ihrem Filtrat oder dem Mycel mit einem .w geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert werden.
Die Abtrennung der Antibiotika aus dem Mycel wird vorteilhaft beispielsweise wie folgt vorgenommen: das nasse Mycel wird mit 70%igem wäßrigem Aceton oder 70%igem wäßrigem Methanol extrahiert. Der Extrakt wird eingeengt. Das Konzentrat wird mit einem Lösungsmittel, wie Benzol, Ethylacetat oder Methylenchlorid, extrahiert. Der Extrakt enthält das Antibiotikum T-2636, dessen Komponenten -A, -B, -C und -D beispielsweise durch Chromatographie In der oben beschriebenen Weise abgetrennt werden können. Der wäßrige Rückstand wird mit n-Butanol extrahiert. Anschließend wird Ether zugesetzt, wobei eine pulverförmlge Substanz erhalten wird, die starke Absorptionsmaxlma Im Ultraviolettlicht bei den Wellenlängen 308, 321, 338 und 355 ηιμ zeigt, gemessen In Methanol.
Die Substanz Ist wirksam gegen Pilze. Es wird angenommen, daß sie ein Pentaen Ist.
Als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Behandlungen werden aus der Kulturbrühe von Streptomyces rochel var. volubills IFO 12507 die vier Antibiotika T-2636-A, T-2636-B, T-2636-C und T-2636-D erhalten.
Physikalisch-chemische Eigenschaften
a) T-2636-A
T-2636-A bildet weiße blättchenförmtge Kristalle vom Schmelzpunkt 200 bis 2O5°C (umkristallisiert aus Diäthyläther). Es hat folgende Elementaranalyse: C 64,73 ± 1,0%, H 7,00 ± 0,5%, N 2,80 ± 0,5%, OCH3 0%, OAc etwa 11,56%. Die Verbindung hat in Methanol eine spezifische Drehung von -221,2 ± 20° C (C = 0,5). «
Das Molekulargewicht, gemessen durch den osmotlschen Druck in Äthylacetat, beträgt etwa 490, während die Messungen mit dem Massenspektrometer eine höchste Massenzahl von 441 ergeben. Hieraus kann somit ein Molekulargewicht von etwa 500 angenommen werden. Das Produkt enthält eine Acetylgruppe.
Das Ultravlolett-Absorptionsspektrum in methanolischer Lösung Ist in Fig. 5 dargestellt. Es zeigt ein Maximum bei 228 ± 2 mu (E, cm = 1050 ± 100). Das Infrarot-Absorptionsspektrum nach der Kallumbromidmethode 1st In Flg. 1 dargestellt. Es zeigt die folgenden Absorptionsbanden: 3550 (mittel), 3400 (mittel), 2960 (schwach), 2900 (schwach), 2850 (schwach), 1755 (stark), 1725 (Schulter), 1720 (sehr stark), 1700 (stark), 1690 (stark), 1650 (schwach). 1500 (mittel), 1450 (schwach), 1440 (schwach), 1360 (mittel), 1320 (mittel), 1260 (sehr stark), 1140 (mittel), 1100 (schwach), 1010 (mittel), 960 (mittel), 950 (mittel), 920 (schwach), 860 (schwach), 810 (schwach), 800 (schwach), 740 (schwach), 680 (schwach), 650 (schwach), 620 (schwach), 580 (schwach) cm"1. so
Diese Absorptionsbanden zeigen die Anwesenheit von Makrolacton- und Acetylgruppen im Carbonylbereich.
Durch Dünnschichtchromatographie an Sillcagei mit verschiedenen Lösungsrniitelsysternen wurden folgende Rf-Werte ermittelt:
Lösungsmittel (Vol.-Verhältnls) RF-Wert
Chloroform/Methanol (93: 7) 0,57 ± 0,05
Methyläthylketon/Diäthyläther (1:3) 0,82 ± 0,05 Äthylacetat/Dläthyläther (1: 3) 0,62 ± 0,05
T-2636-A Ist in Wasser, Hexan, Petroläther und Isopropyläther unlöslich oder schwer löslich, aber in Diäthyläther, Äthylacetat, Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform und Methylenchlorid leicht löslich.
T-2636-A ist positiv In der Mollsh-Reaktion und im Carbomycin-Test, aber negativ im Erythromycln-Test und in der Elsen(III)-Reaktlon.
b) T-2636-B
T-2636-B bildet farblose blättchenförmige Kristalle vom Schmelzpunkt 205 bis 2070C (aus Diäthyläther
umkrtstalllslert). Es hat folgende Elementaranalyse: C 59,27 ± 1%, H 8,60 ± 0,5%, N 0%, OCH3 6,50%, OAc 9,98%. Spezifische Drehung in Äthanol: [a$ -92,4 ± 10° (C = 1,0).
Das Molekulargewicht beträgt etwa 851, gemessen nach der Methode des osmotischen Drucks In Äthylacetat, während durch Massenspektrometrie eine höchste Massenzahl von 850 erhalten wird. Hieraus wird ein Molekulargewicht von etwa 850 angenommen.
Das Ultraviolettspektrum einer Lösung von 1,169 mg T-2636-B In 20 ml Methanol zeigt keine charakterlstlsehe Absorption. Das nach der Kallumbromidmethode aufgenommene Infrarotspektrum 1st in F1 g. 2 dargestellt. Es hat die folgenden Absorptionsbanden: 3500 (stark), 2960 (stark), 2930 (mittel), 1750 (sehr stark), 1730 (sehr stark), 1710 (stark), 1630 (schwach), 1460 (mittel), 1380 (stark), 1340 (mittel), 1250 (stark), 1220 (sehr stark), 1180 (stark), 1150 (stark), 1110 (stark), 1090 (stark), 1050 (stark), 1030 (stark), 1000 (sehr stark), 960 (mittel), 940 (schwach), 910 (schwach), 900 (schwach), 880 (schwach), 800 (schwach) 520 (schwach) errr1.
Das vorstehend genannte Infrarotspektrum und das kernmagnetische Resonanzspektrum zeigen die Anwesenheit von Makrolacton-, Acetyl- und Methoxylgruppen im Molekül.
Durch Dünnschichtchromatographie an SUicagel mit verschiedenen Lösungsmittelsystemen werden die folgenden Rf-Werte ermittelt:
Lösungsmittel (Vol.-Verhältnls) RF-Wert
Chloroform/Methanol (93 : 7) 0,32 ± 0,03
Methyläthylketon/Dläthyläther (1 : 3) 0,60 ± 0,05 Dläthyläther/Äthylacetat (3:1) 0,49 + 0,05
T-2636-B 1st positiv In der Mollsh-Reaktlon und im Erythromycln-Test, aber negativ im Carbomycln-Test. Es hat im wesentlichen die gleichen Löslichkelten in den verschiedenen Lösungsmitteln wie T-2636-A.
c) T-2636-C
T-2636-C bildet farblose Nadeln vom Schmelzpunkt 201 bis 203° C (aus einem Gemisch von Dläthyläther und Äthylacetat umkristallisiert. Es hat folgende Elementaranalyse: C 65,30 ±1,0%, H 7,20 ± 0,5%, N 3,13 ± 0,5%. Das Molekulargewicht, gemessen durch den osmotischen Druck In Äthylacetat, beträgt 439, während die Messungen mit dem Massenspektrometer_einejiöchste Massenzahl von_45? ergeben. Hieraus wird gefolgert, daß das Molekulargewicht etwa 460 beträgt.
Durch Dünnschichtchromatographie an SUicagel mit verschiedenen Lösungsmitteln werden die folgenden Rf-Werte ermittelt:
Losungsmittel (Vol.-Verhaltnls) RF-Wert i
Chloroform/Methanol (93: 7) 0,24 ± 0,05
«J Äthylacetat/Dläthyläther (1:3) 0,25 ± 0,05
Methyläthylketon/Dläthyläther (1 : 3) 0,43 ±0,05 Spezifische Drehung
in Äthanol: [afc5 =-237 ± 20° (C = 1,0).
T-2636-C ist in Äthylacetat, Aceton, Äthanol und Methanol löslich, In Diäthyläther schwer löslich und In n-Hexan unlöslich. Das In Äthanollösung aufgenommene Ultraviolettspektrum ist In Flg. 5 dargestellt. Es zeigt ein Maximum bei 226 (ημ {E\\m = 1013 ± 100). T-2636-C ist positiv in der Mollsh-Reaktion, aber negativ In der Elsen(III)-chlorid-Reaktlon, Im Erythromycin-Test und Carbomycln-Test. Das nach der Kallumbromidmethode aufgenommene Infrarotspektrum 1st In Flg. 3 dargestellt. Es zeigt folgende Absorptionsbanden: 3450 (stark), 3400 (stark), 2940 (schwach), 2880 (stark), 1755 (stark), 1725 (Schulter), 1710 (sehr stark), 1680 (sehr stark), 1520 (mittel), M50 (mittel), 1402 (mittel), 1360 (mittel), 1325 (mittel), 1310 (mitte!), 1260 (stark), 1220 (mittel), 1160 (mittel), 1137 (mittel), 1100 (schwach), 1055 (mittel), 1048 (mittel), 1005 (stark), 962 (stark), 875 (schwach), 850 (schwach), 830 (schwach), 816 (schwach), 800 (schwach), 742 (schwach), 680 (schwach).
d)T-2636-D
T-2636-D bildet farblose Nadeln vom Schmelzpunkt 190 bis 191° C (aus einem Gemisch von Methanol und Äthylacetat umkrlstalllsiert). Es hat folgende Elementaranalyse: C 63,95 ± 1%, H 7,34 ± 0,5%, N 3,11 ± 0,5%, OCHj 0%, OAc 10,38%. Spezifische Drehung in Methanol: M^ -220 ± 20° (C = 0,5).
ω Das Molekulargewicht, gemessen durch den osmotischen Druck In Äthylacetat, beträgt etwa 509, während die Messung mit dem Massenspektrometer eine Massenzahl von 459 ergibt. Es wird somit gefolgert, daß das Molekulargewicht etwa 500 beträgt. Das Ultraviolettspektrum 1st in Flg. 5 dargestellt. Es zeigt ein Maximum In Methanol bei 228,5 ± 2 ταμ (Ej*m = 1070 ± 100).
Das nach der Kaliumbromldmethode aufgenommene Infrarotspektrum von T-2636-D 1st in F1 g. 4 dargestellt.
Es zeigt die folgenden Absorptionsbanden: 3350 (stark), 3320 (sehr stark), 2960 (mittel), 2930 (schwach), 1740 (stark), 1725 (sehr stark), 1705 (sehr stark), 1650 (sehr stark), 1560 (stark), 1450 (schwach), 1370 (mittel), 1320 (mittel), 1240 (sehr stark), 1200 (mittel), 1170 (schwach), 1130 (stark), 1080 (mittel), 1040 (mittel), 1020 (stark), 1010 (mittel), 960 (stark), 920 (schwach), 880 (schwach), 710 (schwach) cm"1. T-2636-D 1st positiv Im Carbomy-
cln-Tcst, In der Molish-Reaktlon, aber negativ im Erythromycln-Tesi, gegenüber Ninhydrin-Reagens und Benzidln-Reagens.
T-2636-D Ist In Dläthyiather, Chloroform und Äthylacetat schwer löslich. In Aceton wenig löslich und in Methanol und Äthanol leicht löslich.
Durch Dünnschichtchromatographie an Slllcagel (Slllcagel HF 254) In verschiedenen Lösungsmittelsystemen 5 werden folgende Rf-Werte ermittelt:
Lösungsmittel (Vol.-Verhältnis)
RF-Wert
Chloroform/Methanol (93 : 7) 0,19 ± 0,05
Methyläthylketon/Dläthyläther (1 : 3) 0,35 ± 0,05 Äthylacetat/Dläthyläther (1 : 3) 0,17 ± 0,05
7) Biologische Wirkungen
Die Antibiotika T-2636 zeigen selbst Im rohen Zustand eine ziemlich starke antimikrobielle Wirkung, insbesondere gegen grampositive Bakterien. Die antimlkrobiellen Wirkungen werden nicht nur in vitro, sondern auch In vivo festgestellt, wenn das Antibiotikum den Versuchstieren oral oder parenteral verabfolgt wird. Die Ergebnisse von Versuchen sind nachstehend als Beispiele angegeben. Die akute Toxizltät von T-2636-A. -B, -C und -D wurden an 4 Wochen alten Mäusen bei intraperitonealer Injektion festgestellt.
LDso (mg/kg)
T-2636-A T-2636-B T-2636-C T-2636-D
>400 (l.p.)
ca. 400 (i.p.)
>400 (Lp.)
>400 (Lp.)
Die mittlere effektive Dosis (ED5o) von T-2636-A und T-2636-C wurde an 4 Wochen alten Mäusen festgestellt, die mit Staphylococcus pyogenes durch subkutane Injektion infiziert wurden.
EDS0 (mg/kg)
T-2636-A 5,04
T-2636-C 1,56
Trlacetylolandomycln (Kontrolle) 30
Antibiotlsches Spektrum
Gewöhnliche Bakterien wurden als Testorganismen 18 Stunden bei 37° C auf Bouillon-Agar kultiviert. Säurefeste Bakterien wurden 40 Stunden bei 37° C auf Glycerin-Boulllon-Agar kultiviert. Im Falle von Kleinpilzen oder Hefe wurde Glucose-Boulllon-Agar als Versuchsmedium verwendet. Die Kultivierung erfolgte 40 Stunden bei 28° C.
Die jeweiligen hemmenden Mindestkonzentrationen der Antibiotika T-2636 sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Testorganismen Hemmende Mindesikonzeniration B C 50 D M*)
Mlkrogramm/Mülillter >100 50 >100 >100
A >100 0,5-0,75 >100 >100
Escherichla coil >100 50 1-2 >100 >100
Proteus vulgaris >100 100 >100 >100
Staphylococcus aureus 10-20
Staphylococcus aureus 20-50 50
(reslstent gegen Oleandomycin 10 20 >100 >100
und Erythromycin) 50 5 >100 >100
Bacillus subUlis >100 20 100 >100 >100
I Bacillus cereus >100 50 50 >100 > 20
Bacillus brevls >100 20 100 >!00 20
Mycobacterlum avlum >100 100 100 100 20
Mycobacterlum phlel >100 >100 >100 >100 1-2,0
Mycobacterlum sp. ATCC-607 >100 >100
Pllllcularla oryzae >100
Penicilllum chrysogenum >100 .
Fortsetzung Testorganlsmen Hemmende Mindestkonzentration Mikrogramm/MlUiUter Aspergühis niger >100 >100 >100 >100 2,0 Saccharomyces ceievlslae >100 >100 >100 >100 2,0 Candida alblcans >100 >100 >100 >100 2,0 M*): Mycelextrakt Synergistischer Effekt hinsichtlich der anUmlkroblellen Wirkungen. : Verdünnungsmethode auf Boulllon-Agar Hemmende Mindestkonzentration in i f. Mtkrogramm/MlllUlter ' Antibiotikum Staphylococus aureus Bacillus subtllls . ;·;
T-2636 : l~
A 10-20 >100 iii
B 50 10 : '<<■■:
C 1 50 ί
D >100 >100 Ή
A+B(l:l) 2-5 5-10 · >'
B+C(l:l) 0,5 5,0 S
B+D_(l:_l) _ 20 10-20 φ
Aus den vorstehenden physjkallsch-chemlschenEigenschaften^ wlrd^gefolgert, daß die Antibiotika T-2636-A, i;t T-2636-B, T-2636-C und T-2636-D neue Antibiotika sind, die sich von allen bekannten Antibiotika unterschel- ν
den. T-2636-A hat eine gewisse Ähnlichkeit mit Bundlln A, unterscheidet sich aber von Bundlln A Im Schmelz- ί; punkt, In der spezifischen Drehung, im Infrarotspektrum und In der Löslichkeit In den verschiedener» Lösungs- ??' mitteln [Shlnlchl Kondo et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 4 848/1962; J. M. J. Sakamoto et *I, Jour- final οΓ Antibiotics 15-A 98, (1962)]. £·. T-2636-B kann als ein Antibiotikum angesehen werden, das eine gewisse Ähnlichkeit mit Lankamycln hat [E. ■« Gaumann et al., janpanische Patentveröffentlichung Nr. 16 700/1962, Helvetica Chlmlca Acta 43, 601 (I960)], 1st aber verschieden von dem bekannten Lankamycln in bezug auf den Schmelzpunkt, das Molekulargewicht, das Ultraviolettspektrum und das Infrarotspektrum, insbesondere in bezug auf den Wert 600 bis 800 cm'1.
T-2636-C ist ein Antibiotikum, das eine gewisse Ähnlichkeit mit Lankacldln hat [E. Gaumann et al., japanische Patentveröffentlichung 16 700/1962, Helvetica Chlmlca Acta 43, 601 (I960)]. Es hat jedoch einen anderen
« Schmelzpunkt, eine andere spezifische Drehung, eine andere Elementaranalyse und Farbreaktion mit 196 FeCh in Äthanol als Lankacldln. Ebenso hat T-2636-C eine stärkere antibakterielle Wirkung gegen gramposltivei Bakterien als Lankacldin. ;
T-2636-D ähnelt dem Antibiotikum Bundlln B (ShlnlchK Kondo et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. I ■.;:. 4 848/1962 und Sakamoto et al. ibld), jedoch unterscheidet es sich von Bundlln B In der Elementaranalyse und! ■
Im Infrarotspektrum. ι )■,'
Staphylokokken sind pyogene oder eitererzeugende Bakterien. Sie pflegen begrenzte Läsionen beispielsweise In' Form von Abszessen und dergleichen zu bilden, die häufig In der Haut auftreten. Staphylokokken sind die) i< Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen häufigen Wundinfektionen. Die neuen Produkte gemäß' ' der Erfindung sind wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Infektionsart bei; ■
so Warmblütern (Hunde, Katzen, Menschen usw.). Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung zuri .': Behandlung einer auf Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektion wird beispielsweise wie folgt herge-; : stellt: In 1 g Wollfett wird jeweils einer der nachstehend genannten Wirkstoffe eingearbeitet: 1) 100 mg T-2636- i A, 2) 20 mg T-2636-C, 3) 25 mg T-2636-A und 25 mg T-2636-B oder 4) 100 mg T-2636-B und 100 mg T-2636-D.' Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g Salbe' erhalten werden. Die Salbe wird unter leichtem Reiben in genügender Menge auf die zu behandelnde Wunde, aufgetragen. Der Auftrag erfolgt wenigstens einmal täglich und wird, falls erforderlich, mehrmals täglich wieder-; holt.
Auf Grund der vorstehend beschriebenen bakteriziden und bakterlostatischen Eigenschaften eignen sich die; neuen Produkte gemäß der Erfindung beispielsweise für die Desinfektion von Geräten und Apparaturen In
so Krankenhäusern, die gewöhnlich pathogenen grampositiven Bakterien des Typs, der gegenüber diesen Verbindungen empfindlich 1st, ausgesetzt sind. Die Desinfektion erfolgt durch Auftrag oder Besprühen mit einer Lösung (z. B. In Methanol oder Äthanol), die pro Milliliter eine der folgenden Komponenten enthält: 1) 200 μg T-2636-A, 2) 20 μg T-2636-C, 3) 50 \ig T-2636-A und 50 Mg T-2636-B oder 4) 200 ng T-2636-B und 200 μg T-2636-D.
Beispiel 1 ~ ~.
Ein 2-1-Erlenmeyer-Kolben, der 0,5 1 eines wäßrigen Kulturmediums (pH 7,0) aus 1% Glucose, 3% löslicher Siärke, 1% Maisqueüwasser, 1% Sojabohnenmehl, 0,5% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,596 Calclumcar-
bonat enthält, wird mit einer Platinöse einer Schrägkultur von Streptomyces rochei var volubilis I. F.O. 12507 beimpft und 40 Stunden bei 37° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet.
1,51 der Kulturbrühe werden In einen 50-1-Tank überführt, der 301 eines Kulturmediums der oben genannten Zusammensetzung und zusätzlich 30 g Sojabohnenöl als Schaumverhütungsmittel enthält. Die Kultivierung wird bei 37° C 20 Stunden bei eln?r Drehzahl des Rührers von 180 UpM durchgeführt, wobei pro Minute eine Luftmenge zugeführt wird, die das gleiche Volumen hat wie das Kulturmedium. 101 der so erhaltenen Kulturbrühe werden als Impfmaterial für die folgende Fementatlon verwendet.
Ein 200-1-Tank, der 1001 eines Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung und Sojabohnenöl als Schaumverhütungsmittel enthält, wird unter submersen aeroben Bedingungen (Belüftung 1001/Mlnute, Geschwindigkeit des Rührers 200 UpM) beimpft. Die Fermentation verlauft wie folgt:
Impftank pH Haupttank pH Antiblotische Wirkung gegen ; Bacillus
Bebrfltungs- Bebrütungs- Staphylococcus subtllis
dauer dauer aureus du/ml ♦)
Std. 7,05 Std. 7,11 du/ml ·) _
0 6,05 0 5,85 <10
20 18 7,20 20 <10
30 6,70 35 15-20
42 6,85 75 15-20
50 75
*) = Verdünnungseinheit nach der Agrar-Verdflnnungsmethode 2s'
100 1 der so erhaltenen Kulturbrühe werden auf pH 5 bis 6 eingestellt und unter Verwendung eines Fliterhllfsstoffs filtriert. 721 des Flltrats werden auf pH 7 eingestellt und dreimal mit je 241 Ethylacetat extrahiert. 571 des vereinigten Extrakts werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und unterhalb von 40° C unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 2,251 eines Konzentrats erhalten werden.
Das Konzentrat wird nacheinander zweimal mit je Vt des Volumens an Salzsäure (pH 3), zweimal mit je '/6 des Volumens an Wasser, zweimal mit je Vt des Volumens an Natriumhydroxyd (pH 8,5) und zweimal mit je % des Volumens an Wasser gewaschen und dann mit Natriumsulfat über Nacht getrocknet. Das so behandelte Konzentrat wird welter eingeengt, worauf 11 eines Gemisches von Dläthyläther und Petroläther (1:20) oder 11 η-Hexan zugesetzt wird, wobei 12 g einer rohen Substanz erhalten werden. "
Beispiel 2
10 g der rohen Substanz werden In 100 ml elMS Gemisches von Chloroform und Äthylacetat (1:1) gelöst. Die Lösung wird an 300 g Silicagel (0,05 bis 0,2 mm) Chromatographien. Die Elutlon mit 11 Dläthyläther oder Benzol ergibt eine antimikrobiell Inaktive gelbe Substanz. Durch anschließenden Durchlauf von a) 11 eines Gemisches von Dläthyläther und Äthylacetat (1:1), 11 Äthylacetat, 11 eines Gemisches von Äthylacetat und Aceton (1:1) oder b) 11 Chloroform und 21 eines Gemisches von Chloroform und Methanol (95:5) In dieser Reihenfolge wird der größte Teil der antlblotisch wirksamen Fraktionen elulert.
Die vereinigten wirksamen Fraktionen werden eingeengt, wobei etwa 5,5 g Antibiotikum T 2636 als gelbes « Pulver erhalten wird. Wenn 200 g Aluminiumoxyd an Stelle von SlHcagel als Träger verwendet werden, werden bei der gleichen Arbeltwelse etwa 3,5 g des gleichen gelben Pulvers erhalten.
5 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen gelben Pulvers werden der Dünnschtchtchromatographle mit 1,3 kg Silicagel als Träger unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Dläthyläther und Äthylacetat (3:1) als Entwickler unterworfen, um die Antibiotika T-2636-A, -B, -C und -D zu trennen. Wenn eine Fraktion nicht so scharf getrennt werden kann, wird sie erneut am gleichen Träger Chromatographien, wobei als Entwickler ein anderes Gemisch verwendet wird, das aus Diäthyläther und Äthylacetat (1 bis 4:1), Chloroform und Methanol (95 bis 98,5:2), Metiiyläthylketon und Dläthyläther (1 :2 bis 3) besteht. Die wirksamen Fraktionen werden jeweils mit Äthylacetat und einer geringen Menge Aceton oder Äthylacetat und Wasser extrahiert, gewaschen, "getrocknet und eingeengt. Nach Umkristallisatlon werden T-2636-A (300 mg), T-2636-B (150 mg), T-2636-C (40 mg) und T-2636-D (180 mg) erhalten.
Beispiel 3
10 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen rohen gelben Pulvers werden unter Verwendung von 500 g Silicagel ω (0,05 bis 0,20 mm) Chromatographien und zur Entfernung der Verunreinigungen mit 11 Benzol gewaschen, anschließend mit 1 I einer Reihe von Lösungsmitteln aus Benzol und Äthylacetat (8 : 2), (7 : 3), (6 :4), (5 : 5), (4 : 6), (3 : 7), (2 : 8) und 1 1 Äthylacetat In dieser Reihenfolge elulert, wobei T-2636-A, -B, -C und -D in den Fraktionen erhalten werden, die mit den oben genannten Lösungsmitteln (8 : 2) und (7 : 5), (5 : 5), (4 : 6) und (3 : 7), (2 : 8) bzw. Äthylacetat elulert wurden.
Das Verfahren wird wiederholt, wobei reine T-2636-A (500 mg), T-2636-B (700 mg), T-2636-C (20 mg) und T-2636-D (800 mg) erhalten werden. Fast das gleiche Ergebnis kann erhalten werden, wenn Dläthyläther als Entwickler an Stelle von Benzol verwendet wird.
Beispiel 4
21 einer Impfkulturbrühe, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten wurde, weiden in einen 200-1-Tank überführt, der 1001 eines Mediums aus 5% löslicher Starke, 2% Maisquellwasser, 0,596 Polypepton, 0,2% Kallummonohydrogenphosphat, 0,5% Calclumcarbonat (pH 7,0) und 100 mg Silicon als Schaumverhütungsmtttel enthalt. Die Fermentation wird bei 37° C 90 Stunden d archgeführt, während pro Minute Luft In einer Menge, die dem Volumen des Kulturmediums entspricht, zugeführt, mit 200 UpM gerührt wird und weitere 300 g Silicon zugesetzt werden. Der Verlauf der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle.
Kultivierungs- pH-Wert Antiblotlsche Wirkung dauer, Std. (Verdünnungseinhelten/ml)
gegen Staphylococcus aureus
Bacillus subtllls
O 7,40 —
18 5,89 15
30 7,45 <*0
42 6,75 <10
54 6,82 <10
66 6,72 10
78 7,70 !5
90 7,90 <10
10 50 75 35
Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise werden 200 mg T-2636-B und 300 mg T-2636-D aus 1001 der In der beschriebenen Welse erhaltenen Kulturbrühe gewonnen.
Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche: "~ "^
1. Antibiotika T-2636-A, -B, -C und -D, erhältlich dadurch, daß man Streptomyces rochel var. volubills IFO 12507 in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff quellen, verwertbare Stickstoffquellen und andere Nährstoffe enthalt, kultiviert, die Kulturbrühe mit oder ohne Zusatz eines Filterhilfsmittels bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8 filtriert, das Filtrat bei einem pH-Wert zwischen 2 und 9 mit Ethylacetat, Amylacetat, Benzol, Methylenchlorid, Chloroform, Methyllsopropylketon, Methyllsobutylketon, n-Butanol, lsoamylal·· kohol oder Diethylether extrahiert, den so erhaltenen Extrakt mit einer wäßrigen, sauren Lösung, die einen pH-Wert von 2 bis S hat, und einer alkalischen, wäßrigen Lösung, die einen pH-Wert von 8 bis 10 hat, wäscht, anschließend einengt, zum Konzentrat Petrolether, η-Hexan, Benzol, Diethylether oder ein Gemisch dieser Verbindungen gibt, das dabei ausgefällt rohe Pulver in Ethylacetat, Chloroform oder deren Gemischen löst und auf eine mit Kieselsäuregel oder Aluminiumoxid gefüllte Säule gibt, worauf mit Benzol, Diethylether, Ethylacetat, Aceton, Chloroform, Methanol oder einem Gemisch dieser Verbindungen elulert wird, wobei man Eluate, die die Komponenten A, B, C und D enthalten, in dieser Reihenfolge erhält.
2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika T-2636-A, -B, -C und -D gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 aufgeführten Maßnahmen in der dort angegebenen Reihenfolge durchführt. _ _
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