DE2746252A1 - Antibiotikum c-15003 enthaltendes arzneimittel zur behandlung von tumore aufweisenden warmbluetern - Google Patents
Antibiotikum c-15003 enthaltendes arzneimittel zur behandlung von tumore aufweisenden warmblueternInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
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Description
Dr.-Ing. von Kreisler f 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
5 KÖLN 1 13· okt· 1977/Fu
DEICHMANNHAUS AM HAUPTDAHNHOF
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan
Antibiotikum C-15003 enthaltende Arzneimittel zur Behandlung von Tumore aufweisenden Warmblütern.
HU9840/0608
Telefon· (02 21) 23 45 41 - 4 Telex: 888 2307 dopo d Telegramm: Dompotenl Köln
Jahrelang wurde nach Substanzen geforscht, welche nach Verabreichung an V/armblüter einschliesslich
Menschen, welche von Tumoren befallen sind, diesen eine verlängerte Lebensdauer gewährleisten.
Es wurde nun festgestellt, dass das neue Antibiotikum C-15003 dieses Ziel zu erreichen vermag.
Hauptzweck der vorliegenden Erfindung ist daher die Behandlungsmöglichkeit von einen oder mehrere aktive
Tumore aufweisenden Warmblütern mit dem Antibiotikum C-15003. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung
von pharmazeutischen Präparaten, welche als Wirksubstanz das Antibiotikum C-15003 enthalten. ·
Das Antibiotikum C-15003 stellt eine neue Verbindung dar und entspricht der folgenden Strukturformel:
worin R -CO-CH , -CO-CHp-CHp-CH oder -CO-CH2-CH
NCH,
bedeutet.
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In der vorliegenden Beschreibung bedeutet die Bezeichnung "Antibiotikum C-15003" generell die drei Verbindungen
der oben erwähnten allgemeinen Formel I als Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der
besagten Verbindungen oder letzten Endes eine beliebige dieser Verbindungen. Mit Bezug auf die allgemeine Formel I
wird die Verbindung, in welcher R den Rest
-CO-CH
CH,
darstellt, in der vorliegenden'Beschreibung als "Antibiotikum
C-15003 P-3" oder nur "C-15003 P-3" bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest"-CO-CHp-CHp-CH, darstellt,
wird als "Antibiotikum C-15003 P-3"1 oder nur "C-15003 P-3"1
bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest
-CO-CH2-CH
CH3
CH3
■* darstellt, wird in der vorliegenden Beschreibung als "Antibiotikum
C-15003 P-V oder nur "C-15003 P-V bezeichnet.
Das Antibiotikum C-15003 kann beispielsweise dadurch erhalten werden, dass man einen der Gattung Nocardia
angehörenden Mikroorganismus, welcher Antibiotikum C-15003 zu erzeugen vermag, in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen
und verdaubare Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium
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solange züchtet, bis das Antibiotikum darin stark angereichert ist, worauf man es isoliert.
Als Beispiel eines das Antibiotikum C-15003 erzeugenden
Stammes eines Mikroorganismus kann man einen Actinomycetenstamm
Nr. C-15003 bezeichnen, welcher aus dem Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum
erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling
& Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-3*10 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht.
Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 0C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.
1) Morphologische Eigenschaften
Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt
sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einen
Durchmesser von 0,8 bis 1,2 ^m und können sich in gewissen
Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der
Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luft·
mycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche
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Körper (50-200 χ 200 - 1000 ^m), auf welchen weiteres Luftniycel
wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen
auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen
Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen
Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale
(0,8-1,2 ym χ '1,8-6,8 pm) und ellipsoidale
(0,8-1,2 ^m χ 1,0-2,0/im) Körper, welche Arthrosporen
ähneln, enthielten.
Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben.
25 2) Zellenzusammensetzung
Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium
während 66 bis 90 Stunden bei 28 0C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach
der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 1_2, '121 (1964) ] und der Methode nach M. P. Lechevalier [Journal
of Laboratory and Clinical Medicine 71, 93^ (1968)] wurden
die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht.
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Die Säure laß in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet
werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.
3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien
Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative
Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben
bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien
gelb bis gelblichlohfarben v/aren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im. allgemeinen ein massiges Wachstum bei
weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomi-
!5 sehen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.
Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003
auf taxonomischen Medien
(A) Saccharosenitrat-Agar:
Wachstum (G): üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)
(A) Saccharosenitrat-Agar:
Wachstum (G): üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)
bis bernsteinlohfarben (3 Ic) , Bildung
von coremiaähnlichen Gebilden
Luftmycel (AM): spärlich, weiss
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Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblich-
lohfarben
(B) Glycerinnitrat-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von
5 coreniiaähnlichen Gebilden
AM: massig, weiss SP: kein
(C) Glucose-Asparagin-Agar:
G : massig, hellringelblumenfarbig (3 pa) bis leuch-10
tendgelb (2 pa) .
AM: spärlich, weiss SP: leuchtendgelb (2 pa)
(D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von
15 coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiss SP: kein
(E) Stärkeagar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellwei-20
zenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen
Körpern
AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein
(F) Nähragar:
25 G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis khakigelb
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(2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss
SP: kein
(G) CaIciummaleat-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellwei-
zenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein
(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:
G : massig, bernsteinfarbig (3 Ic) bis leuchtend gell
(3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)
SP: kein
(I) Hafermehl-Agar:
■Y-G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb
(2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, v/eiss bis hellgelb
SP: köin
(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G : massig, khakigelb (2 ga) AM: kein
SP: khakigelb (2 ga) (K) Tyrosin-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellmelo-
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AM:
SP:
SP:
nengelb (3 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern
it massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)
γ
kamelfarben (3 ie)
kamelfarben (3 ie)
Farbcode nach "Color Harmony Manual", Ί. Auflage (Container
Corporation of America, 1958)
Ό Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich
für das V/achstum lag bei 12 bis 38 0C. Der Temperaturbereich,
in welchem ein gutes V/achstum des Luftmycel auf Agar (ISP Mo. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 0C.
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-I5OO3
waren die folgenden:
Temperaturbereich für das V/achstum: 12 bis 38 0C
Temperaturbereich für das Wachstum des Luft-
myeels: 20 bis 35 0C
Verflüssigung von Gelatine: positiv
Hydrolyse von Stärke: positiv
Reduktion von Nitraten: positiv
Peptonisierung von Milch: positiv
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Coagulierung von Milch: negativ
Zersetzung von Casein: positiv
Herstellung von Melanoid-Pigmenten: negativ (Pepton-
Hefeextrakt- ^ Eisen-Agar),
positiv (Tyrosin-Agar)
Zersetzung von Tyrosin: positiv
Zersetzung von Xanthin: negativ
Zersetzung von Hypoxanthin: negativ
Toleranz in bezug auf Lysozym: positiv
Toleranz in bezug auf Natriumchlorid: 2 %
5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen
Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen
wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 5^5, 107 (1948)] beschrieben
ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich
die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Vierte eruieren.
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- 12 -
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm No.C-15003
| Kohlenstoffauelle | V/achstum | Kohlenstoffquellen V/achstum |
| D-Xylose | + *+* | Raffinose + +* |
| L-Arabinose | 4- + | Melibiose ' 4- + |
| D-Glucose | i-Inositol - - | |
| D-Galactose | + + | D-Sorbitol - - |
| D-Fructose | +++ 4-4- | D-Mannitol ++ ++ |
| L-Rhamnose | 4- -I- | Glycerin - + |
| D-Mannose | 4:4:4: 4:4" | lösliche Stärke + + |
| Saccharose | 4r4: + + | Blindversuch - - |
| Lactose | ||
| Maltose | ± + | |
| Trehalose | b ++ | |
| Grundmedium bei | Zusatz von C | ),1 % Hefeextrakt |
| Anmerkung: 4=4:4:: | üppiges V/achstum | |
| 4-.b; | gutes V/achstum | |
| + : | V/achstum | |
| + : | ||
| 4 | schlechtes V/achstum | |
| kein Wachstum |
6) Andere Eigenschaften
Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen
Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular
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Biology, 3, 208, 1961] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-Gehalt
des DNA betrug ungefähr 71 MoI-Z.
Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses
Stammes war positiv.
Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., 1961]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bac^ teriology, 8. Auflage, 1974"; und anderen Literaturstellen
Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., 1961]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bac^ teriology, 8. Auflage, 1974"; und anderen Literaturstellen
10 verglichen.
Es wurde angenommen, dans dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche
die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu
!5 schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen
darstellt.
Der besagte Stamm No. C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science
and Technology (FERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute
for Fermentation, Osaka, (IFO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection
(ATCC), Maryland, U.S.A." unter der Nummer 31281 registriert
worden.
Während der Stamm No. C-15003, wie soeben er-
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0_
wähnt, eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen
und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder unter dem Einfluss eines Mutagens. So sollten beispielsweise
die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem
Licht usw., durch.Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf
verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige .andere mutagene Behandlung erhältlich sind,
sowie die Mutanten., die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten
Art betrachtet werden. Irgendwelche die Antibiotika C-15003 P-3, P-31 und/oder P-H zu bilden
vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwenden.
So liefert beispielsweise der Stamm No, C-15003 durch verschiedene
mutagene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien,
v/elche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht
in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luft
mycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien. Das Medium, welches für die Züchtung
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eines ein Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges
oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird
man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstof
fquellen, welche durch den Stamm No. C-15003 assimiliert und verdaut werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel
usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose,
Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und OeIe, z.B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und
dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise
Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmchl,
behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat
usw., und dergl, verwendet werden. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze
usw., Eisen·*, Magnesium·", Zink", Kobalt-, Nickelsalze usw.,
Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische Salze, z.B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann
das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Meth.ionin,
Prolin cA^Ö-jq ffPPh^nΪ·Β· Dipeptide, Tripeptide
D-
etc., Vitamine, z.B. die Vitamine B1, B3, Nicotinsäure,
B C, E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes
des Mediums kann man auch eine anorganische oder organitone
Säure, ein Alkali, ein Puffermittel oder dergl. verwenden. Geeignete Mengen an Oelen, Fetten, oberflächenaktiven
Mitteln usw. können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.
Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen
oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise
eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von
de Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und.anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie
bei 20 bis 35 0C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr
7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30 0C bei einem anfänglichen pH-Wert von
6,5 bis 7,5 -anwenden, Auch die Inkubationsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation
so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat.
Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen
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in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr ^8 bis 1'»Ί Stunden.
Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei
v;urde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium [2,0 g Tryptose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco),
2 g Glucose, 1000 ml destilliertem V/asser und 10 ml 1-molarer
Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28 0C während M bis Ί8
Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsverinögen
des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter
Beobachtung der Wachsturnstrübung durch Aszites-Tumor-Zellen
und durch Dünnschichtchrcanatographie,abgekürzt TLC, nach den weiter unten beschriebenen Angaben bestimmt.
Die neuen Antibiotica C-15003 P-3, P~3' und/oder P-wurden
sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.
Diese Substanzen sind auch durch TLC festgestellt worden. Die Fermentierungsbrühe wurde somit
durch Filtrieren oder Zentrifugieren in Zellen und Filtrat aufgeteilt und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Aethylacetat
extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge an 70 %-igen wässrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zu
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gegeben, worauf man nach 1-stündigem Rühren bei 20 0C die Suspension
filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wässrige Filtrat mit Aethylacetat extrahiert
Jeder dieser Extrakte wurde im Volumenverhältnis 1:100 eingeengt und über einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik,
Kieselgel 60 P3511, 0,25 mm," 20 χ 20) (Lösungsmittelsystem:
Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9:1) der DUnnschichtchromatographie unterworfen.
Das Wirkungsverrnögen wurde auf Grund der Intensitat der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537 Ä
beobachteten Stellen bestimmt.
Die auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugten C-15003 P-3, P-3' und/oder P-1J sind lipophyle
und neutrale Substanzen, welche sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobiellen Metabolite normalerweise übliche
Trenn- und Reinigungsmethoden isolieren lassen. So kann man beispielsweise so arbeiten, dass man sich die Unterschiede
zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann aber
auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener
Adsorptionsmittel, wie z.B. Aktivkohle, makroporöser, nichtionogener Harze, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw. zur
Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauschharz^! beseitigen.
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Man kann aber schliesslich auch andere Methoden oder aber die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder
aber wiederholt anwenden.
Da, wie oben erwähnt, C-15OO3 P-3, 5 P-31 und P-1I sowohl im Filtrat als auch in
den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches
verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder
nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion
mit einem Lösungsmittel kann nach einer beliebigen folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode,
beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion
der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer V/eise,
durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinander zu extrahieren, wird man mit Vorteil die
20 folgende Methode anwenden.
Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind mit V/asser nicht mischbare, organische
Lösungsmittel, wie z,B. Fettsäureester, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone,
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z.B. Mothylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem
dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und vorzugsweise wird die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit
mittels Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser
gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel,
z.B. Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen
Da bei der Dünnschichtchromatographie zusätzlich zum Antibiotikum C-15003 eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt
wird, wird das Produkt I anschliessend den folgenden Reinigung: verfahren unterzogen. Dabei zeigt sich, dass eine routinemässi
ge Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie,
wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd,
ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz usw., verwendet werden'kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I
ist Kieselgel besonders wertvoll. Die Entwicklung kann beispielsweise, ausgehend von Petroläther und Hexan, erfolgen,
während die Eluierung des Antibiotikums C-15003 durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
wie Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Methanol, erfolgt. Gemäss einem typischen Verfahren verwendet
man Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm)-als Trägermittel und führt die Säulenchrornato-
graphie mit einer Mischung von Hexan und Aethylacetat durch,
wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die das Antibiotikum
C-15003 enthaltenden Fraktionen sammelt und unter vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat
mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen
enthält, wird es in der nachstehend beschriebenen Weise weiter gereinigt. So kann man das Produkt II
beispielsweise mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems
reinigen. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem kann aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z.B.
Dichlorrnethan oder Chloroform, bei Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
wie einem Alkohol, z.B. Aethanol oder Methanol, einem Keton, z.B. Aceton oder Methyläthylketon, oder
dergl. bestehen. Auf diese Weise lässt sich das Antibiotikum C-15003 isolieren. Die Rei- 1
henfolge der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgelsäulen kann auch umgekehrt werden, wobei man
überdies nötigenfalls auch übliche organische Lösungsmittel in Verbindung mit den obigen Systemen verwenden kann.
Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt
25 die Eluierung des Antibiotikum C-15003
mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Al-;
kohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer Alkohol kann man beispielsweise Methanol, Aethanol, Propanol
oder Butanol und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon verwenden. Der Ester kann beispielsweise
Aethylacetat sein. Gcmäss einer typischen Arbeitsweise
löst man das rohe Produkt II in 60 % wässrigem Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion
HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.). Diese Säule wird hernach
mit 70 £-igem wässrigem Methanol gewaschen und mit 90 %-igem wässrigem Methanol eluiert. Auf diese
Weise wird das Antibiotikum C-15003 aus der Säule
eluiert.
Bei jeder der vorgenannten Methoden werden die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen gesammelt
und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wird dann mit dem 5" bis 8-fachen Volumen Aethylacetat versetzt
und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle des Antibiotikums C-15003 ausscheiden. Diese
Kristalle enthalten C-15003 P-3, P-31 und P-I. Diese
Verbindungen werden dann mit Hilfe eines Adsorptionsmittels beispielsweise der oben genannten Art voneinander getrennt.
Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes
Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmjttel,
so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert
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eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Aethylacetat oder
einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch 0-15003-P-1I, P-31 und P-3 in der erwähnten Reihenfolge erhalten
werden. Nach erfolgter Dünnschichtchromatographie werden die 0-15003-P-^, P-3' und P-3 entsprechenden Fraktionen
unter vermindertem Druck eingeengt und Aethylacetat den Konzentraten zugegeben. Auf diese Weise erhält man die
entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz,
so kann man eine stufenmässige Eluierung mit schwankenden Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das
Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenteisen Eluierungsme
thode unter Verwendung von 60 #-igem wässrigem Methanol und 95 #-igem wässrigem Methanol unter Zugabe
von 5 % Natriumchlorid erhält man in der voi'genannten
Reihenfolge C-15003 P-3, P-31 und p-l|. Nachdem
man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck
eingeengt und aus Aethylacetat zum Auskristallisieren gebracht.
Die isolierten Kristalle enthalten Aethylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Troc1
nen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70 0C die
nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.
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α co co
ο cn ο co
| C32H | P - ,.,ClN0O Ό 2 |
3 9=635,l69 |
Antibiotikum C-1^003 | 3' 9=635,l69 |
CHCl3) | P - C33H45ClN2O |
4 | 65 | |
| 190 - 1 | 92 0C | P - | 182 - 185 0C | 09 | 177 - 180 0C | 05 | |||
| Schmelzpunkt (0C) | -136 | ° + 10° (c=0,37 |
5 CHCl3) | -134° + 10° (c=0,ll |
02 | -142° + 10° (c=0,522 CHCl3) |
25 | ||
| Spezifische 22° Drehung [q]d |
C | 60, | 06 | 60, | 34 | 60, | 23 | ||
| Elementaranalyse | H | 7, | 04 | 7, | 99 | 7, | 05 | ||
| Gef.: (?) | N | 4, | 33 | 4, | 51 | 4, | 99 | ||
| Cl | 5, | 37 | 5, | 82 | 5, | 32 | |||
| C | 60, | 51 | 6O3 | 41 | 61·, | 46 | |||
| Elementaranalyse | H | 6, | 82 | 53 | 6, | ||||
| Ber.: {%) | N | 4, | 41 | 4, | 4, | ||||
| Cl | 5, | 58 | 5 | 53 | |||||
| Ultraviolettabsorp- tior.sspektrum nn(£) (in Methanol) |
Antibiotikum C-15003 | P - 3 C32K,3ClN2Og=635,l69 |
P - 3' C32H43ClN2Og=635,l69 |
P - 4 C33H45ClN2Og=649,196 |
|
| Infrarotabsorp- tionsspektrum (cm"1)KBr |
233(30250) 2iO'sh 28^50) 252(27640) 280(5750) 288(5700) |
233(30155) 24o(sh 23250) 252(27600) 280(5750) 288(5700) |
233(29900) 24O(sh 28240) 252(27590) 280(5712) 288(5680) |
||
| magnetische Kernre- sonansspektren (ppm) ICOMHz in CDCl, |
1740, 1730, 1670, 1560, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 |
1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1335, 1340, 1255, 1180, 1150,' 1100, 1080, 1038 |
1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 |
||
| OO C |
Massenspektren(m/e) | l,27(d) (3H) l,28(d) (3H) |
l,06(t) (3H) | l,03(d) (6H) | |
| 9840/0 | Löslichkeit | 573, 485, 470, 450 | 573, 485, 470, 450 | 587, 485, 470, 450 | |
| cn ο W |
Farbreaktionen | Im Petroläther, Hexan und Wasser unlöslich, in Benzol und Aether spärlich löslich, in Chloroform, Aethylace- tat, Aceton, Aethar.ol, Methanol, Pyridin, Te trahydrofuran und Dirne- thylsulfoxyd löslich |
unlöslich in Petroläther, Hexan und V/asser, spär lich löslich in Benzol und Aether, löslich in . Chloroform, Aethylacetat, Aceton, Aethanol, Metha nol, Pyridin, Tetrahydro furan und Dimethylsulf- oxyd |
unlöslich in Petroläther, Hexan und Wasser. Spär lich löslich in Benzol und Aether. Löslich in Chloroform, Aethylace tat, Aceton, Aethanol, Methanol, Pyridin, Te trahydrofuran und Dime- thylsulfoxyd |
|
| Dragendorff: positiv Beilstein: positiv |
Dragendorff: positiv Beilstein: positiv |
Dragendorff: positiv Beilstein: positiv |
|||
Auf Grund der obigen Molekularformel und der nachstehend wiedergegebenen antimikrobiellen und tumorver
hindernden Wirksamkeitswerte wurde das neue Antibiotikum mit den bekannten Gruppen von Antibiotika verglichen. In
der Literatur liess sich keine dem Antibiotikum C-15003
ähnliche Gruppe feststellen. Forschungen in bezug auf Sub stanzen, welche ähnliche Ultraviolettabsorptionswerte wie
das vorliegende Antibiotikum liefern könnten und pflanzlichen oder natürlichen, organischen Ursprungs wären,
führten zu den Maytanacingruppen. Insbesondere auf Grund
der in Frage kommenden Molekularformeln wurde vermutet, dass das Antibiotikum zur Maytanacingruppe von Verbindungen,
welche 2 Stickstoffatome enthalten, gehört. Maytanacin wurde als eine Pflanzenkomponente erhalten. Hierüber
wird in Journal of American Chemical Society 9_7_, 5294
(1975) berichtet. Das Massenspektrum für Maytanacin ist das folgende:
+ * 485-C1
55 5 450
| 545 | + | 485 | ( | b | ) = | 470 |
| Ca)=H2O | UNCO | O (j |
||||
| R-C-OH | ||||||
Die Werte tn/e 485, 470 und 450 für C-15003 P-3, P-31
und P-4 führen zur Ueberzeugung, dass diese Verbindungen eine identische Skelettstruktur mit jener von Maytanacin
haben mit dem Unterschied in der in 3-Stellung vorhandenen
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Acylgruppe. Es ergibt sich daraus eindeutig, dass das Antibiotikum
C-15003 eine neue Verbindung darstellt. Werden C-15003 P-3, P-31 und Ρ-Ί mit einem Alkali behandelt und
durch Gaschromatographie in bezug auf die in Freiheit gesetzten Carbonsäuren analysiert, so wird festgestellt, dass
Isobuttersäure, Buttersäure und Isovaleriansäure aus C-15003 P-3, C-15003 P-3' bzw. C-15003 P-I erhältlich sind.
Die Fig. 1 zeigt die Strukturen auf Grund der obigen Daten
für C-15003 P-3, P-3' und P-I. Fig. 1
CHxO
P-3 -CO-CH
CH-
P-31 -CO-CH2-CH2-CH3
P-H -CO-CH2-CH
CH-
CH-
Das Antibiotikum C-15003 vermag die Ueberlebensdauer von Warmblütern zu verlängern, d.h. von Tieren und
Menschen,die an einem oder mehreren Tumoren,beispielsweise an
Leukämie,Sarcomen,Mastocytomen,Melanomen oder Carcinomen leidei
Das Antibiotikum C-15003 hat auch eine regressive Wirkung auf feste Tumore, welche subkutan, intramuskulär
und in anderen Organen wachsen.
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Als Beispiele von Warmblütern seien Säugetiere
und Menschen genannt.
Bei einem akuten Toxizitätstest unter Verwendung von Mäusen als Testtieren konnte man bei intraperitonealen
Injektionen der Antibiotika C-15003 P-3, P-3' und P-H feststellen,
dass durchwegs ein LD^-Wert von mehr als 313 mcg/kg erzielt werden konnte.
Für die Verabreichung des Antibiotikums C-15003 an Warmblüter,
die an einem oder mehreren Tumoren leiden,bedient man sich im
allgemeinen der Injektionsform.Die Injektion kann intramuskulär,intrathorakal, intraabdominal, intrauterin
intrathekal, intraarteriell, subkutan oder intravenös erfolge
Ein solches Injektionsmittel kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. So kann beispielsweise
das Antibiotikum C-15003 in einem wässrigen, flüssigen Medium, welches ein übliches löslichmachendes Mittel, z.B.
einen Alkohol, wie Aethanol, einen Polyalkohol, wie Propylenglycol, Polyäthylenglycol 200 bis 300, ein nichtionogenes
oberflächenaktives Mittel, eine physiologische Kochsalzlösung
und/oder eine isotonische Lösung enthält, lösen oder suspendieren.
Typische Beispiele eines flüssigen Mediums sind eine 0,85 Z-iße physiologische Kochsalzlösung, welche 1 %
Aethanol oder 2,5 % Methanol enthält, oder eine 0,85 S-ige physiologische Kochsalzlösung, welche 1 % Tween 80 enthält.
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Die Konzentration an Antibiotikum C-15003 in der Flüssigkeit liegt zwischen 0,5 mcg/ml und 500 mcg/ml.
Die Injektionslösungen bzw. -suspensionen können sterilisiert sein und/oder Hilfssubstanzen, wie z.B.
Konservierungsmittel, Stabilisiermittel, Netzmittel und Emulgiermittel enthalten.
Das Antibiotikum C-15003 wird tumorhaltigen Warmblütern in Dosierungsmengen zwischen 0,8 und 50 mcg/kg/
Tag verabreicht v/erden.
Das Antibiotikum C-15003 enthält, wie bereits erwähnt, die Antibiotika C-15003 P-3, P-3' und P-I. Bei
den erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparaten kann man eine einzelne Komponente des besagten Antibiotikums,
nämlich Antibiotikum C-15003 P-3, P-3? oder P-4, verwenden.
Man kann aber auch Mischungen einer oder mehrerer dieser Komponenten anwenden, d.h. eine Mischung des Antibiotikums
C-15003 P-3 und P-4, ein Gemisch der Antibiotika C-15003 P-3' und P-1I, ein Gemisch der Antibiotika C-15003
P-3 und P-31 und ein Gemisch der Antibiotika C-15003 P-3,
P-31 und P-1I. Bevorzugt wird in der Pr*axis eine Mischung
der Antibiotika C-15003 P-3, P-31 und P-U.
Die einzelnen Komponenten oder eine Mischung davon brauchen nicht-unbedingt gereinigt zu sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung und die Verwendung des Antibiotikums C-15003, ohne sie ein-
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alt waren, für jeden Tumor verwendet.
Nocardia No.C-15003 (IFO 13726; FEHH 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Me-
dium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) pjezüchtet worden war,
wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter,
welcher 1IO Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2 % Glucose, 3 % lösliche Stärke, 1 % rohes Sojabohnenmehl,
1 % Maisqucllflussigke.it, 0,5 % Polypepton, 0,3 % NaCl,
0,5 % CaCO,, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte Medium wurde während 48 Stunden bei 28 0C inkubiert, um ein
Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums
wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Fermentiermediums
enthielt, welches aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit,
0,1 % Polypepton und 0,5 % Calciurncarbonat (pH 7,0) bestand,
enthielt, eingebracht und während 90 Stunden bei 28 0C gezüchtet,
um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu erhalten.
Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis V/ als Testorganismus
und C-15003 P-3 als Standardprobe festgestellt
werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von
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zuschränken. Die Teile sind jeweils Gew.-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen
den Teilen und Mol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich auf "Gew./
Vol.", sofern nichts anderes ausgesagt wird.
In der vorliegenden Beschreibung sind die Bezeichnungen Tumor, Neoplasma, Leukämie, Sarcom oder Carcinom
einander mehr oder weniger gleichzusetzen.
Alle nachfolgenden Experimente in bezug auf die cytostatische Wirkung des Antibiotikums C-15003 wurden
nach den Angaben in National Cancer Institute, National Institute of Health, U.S.A. (NCI protocols), (vergl.
Cancer Chemotherapy Reports (Part 3) Bd. 3, No. 2, 1972, S. 1-103) bezüglich des Züchtens und der Bewertung der
Cytostatika getestet.
Vom National Cancer Institute, U.S.A., in 1971 erhaltene Melanome B 16 und Leukämien L 1.210 wurden in
C57BL/6 und DBA/2 Mäusen [Cancer Chemotherapy Reports (Part 1) Bd. 50, No. 5, 1975, S. 919-9281 aufrechterhalten.
im Jahre 1975
Durch das Japan Cancer Chemotherapy Center/erhaltene Leukämien
P388 wurden in DBA/2-Mäusen aufrechterhalten. P8l5-
und
Mastocytom in DBA/2-Mäusen/ Ehrlich-Carcinom und Sarcom l80 in JCR-JCL-Mäusen wurden ebenfalls angewandt. In jedem dieser Beispiele wurde ein geeigneter Stamm von Mäusen männlichen oder weiblichen Ursprungs, welche 5 bis 7 Wochen
Mastocytom in DBA/2-Mäusen/ Ehrlich-Carcinom und Sarcom l80 in JCR-JCL-Mäusen wurden ebenfalls angewandt. In jedem dieser Beispiele wurde ein geeigneter Stamm von Mäusen männlichen oder weiblichen Ursprungs, welche 5 bis 7 Wochen
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25 pt;/ml auf.
10 Vol.-Teile des gemäss Bezugsbeispiel 1 erhaltenen
Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 VoI.-Teile
eines Sanienkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie
oben enthielt, worauf man während Ί8 Stunden bei 28 0C brütete.
500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in einen 50.000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl
eingetragen, welcher 30.000 Vol.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30.000
Vol.-Teile/Minute) bei 28 0C züchtete und bei einem Innendruck
von 1 kg/cm2 bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) rührte, um auf diese V/eise eine Samenkultur zu erhalten.
Diese Kultur wurde zum Animpfen eines aus rostfreiem Stahl bestehenden Tanks mit einem Fassungsvermögen von 200.000
Vol.-Teilen verwendet, welcher 100.000 Vol.-Teile eines Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen
Bezugsbeispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10 % eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung
(100.000' Vol. -Teile/Minute) bei 28 0C inkubiert und bei
einem Innendruck von 1 kg/cm2 während 90 Stunden bei 200 Umdrehu
gen pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung
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des Titers in gleicher V/eise wie in Beispiel 1 konnte man feststellen, dass die so erhaltene Kultur einen Titer
von 25 ^ig/rnl aufwies.
95.000 Vol.-Teile der nach den Angaben in Bezugsbeispiel 2
erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo~superce.]M
(Johnes and Manville Products, U.S.A.) versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter
filtriert, wobei 85.000 Vol.-Teile Filtrat und 32000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85.000 VoI.-Teile)
wurde gerührt und mit 30.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Diese Massnahme wurde ein weiteres MaI
wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30.000 Vol.rTcilen V/asser gewaschen,
durch Zugabe von 5OO Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile
eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Miederschlag durch Filtrieren
gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Aethylacetat verrührt, worauf die unlöslichen
Bestandteile abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05
bis 0,2 mm) gerührt und das Aethylacetat unter verminder-
809840/0608
tem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule
('100 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 VoI,-Teilen
Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 3:1), 500 VoI.-Teilen
einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und
Aethylacetaf (Mischungsverhältnis 1:3), 500 Vol.-Teilen Aethylacetat und 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Aethylacetat
und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt
wurde.
1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teil Aethylacetat
hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Dundesrepublik
Deutschland, 60 F ^, 0,25 mm, 20 χ 20) liegende
Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Aethylacetat und
Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelt. Nach erfolgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (2537a)
das gewünschte Produkt festgestellt.
Die aktiven Fraktionen No. 23-28 mit Rf 0,6-0,65 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr
20 VoI.-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden je-
809840/0608
weils mit 150 Vol.-Teile Petroläther versetzt, wobei man 15 Teil«
eines rohen Produktes II erhielt.
32.000 Teile der gemäss Bezugsbeispiel 3 erhaltenen feuchten
Zellen wurden unter Rühren mit 50.000 Vol.-Teilen 70 $-igem wässrigem Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf
auf einem Druckfilter filtriert. Die Extraktion mittels 50.000 Vol.-Teilen 70 $-igem wässrigem Aceton und die anschliessende
Piltrierung wurden einmal mehr wiederholt.
Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wässrige
System wurde durch eine Säule von 5.000 Vol.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) hindurchgeleitet. Die
Säule wurde mit 20.000 Vol.-Teilen V/asser und 50 #-igem wässrigem Methanol gewaschen und anschliessend mit 15.000
Vol.-Teilen 90 #-igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat
wurde unter vermindertem Druck auf '3.000 Vol.-Teile eingeengt und mit 3.000 Vol.-Teilen Wasser und 3-000 Vol.-Teilen
Aethylacetat geschüttelt. Diese Arbeitsweise wurde einmal
mehr wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther
809840/0608
hinzugegeben und der entstandene Niederschlag
durch Filtrieren gesammelt (28 Teile).
Dieses Produkt wurde mittels einer Kieselgelsäule gereinigt, wobei man 8,0 Teile rohes Produkt II erhielt.
5 Bezugsbeispiel 5
In 10 Vol.-Teilen Aethylacetat wurden 1,5 Teile des nach dem obigen Bezugsbeispiel 3 erhaltenen rohen Produktes II
gelöst und die Lösung gründlich mit Ί Teilen Kieselgel (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt.
Das Aethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 VoI.-Teilen
Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit 500 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit
500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung
von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(10:1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von 25 Vol.-Teilen gesammelt.
Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde
mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem:
809840/0608
. - 37 -
27A6252
Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 9:1) unterworfen.
Die bei 2537 Ä absorbierenden Fraktionen Nr. 39 und 40 in der Zone von Rf 0,50-0,60 wurden
gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde hierauf mit 2 Vol.-Teilen
Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,150 Teile Antibiotikum C-15003 in Form von
Kristallen erhielt.
Die obigen Kristalle des Antibiotikums C-15003 (0,150 Teile) wurden in 15 Vol.-Teilen Methanol gelöst
und dann mit 0,300 Teilen Natriumchlorid und 15 VoI.-Teilen Wasser versetzt. Eine mit 200 Vol.-Teilen Diaion
HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) I gefüllte Säule wurde mit
600 Vol.-Teilen 50 #-igem wässrigem Methanol, enthaltend 5 % Natriumchlorid, beschickt. Die so hergestellte Lösung
wurde durch eine Säule geführt und eine Gradienten-Eluierung unter Verwendung von I5OO Vol.-Teilen 60 t-igem
wässrigem Methanol, enthaltend 5 % Natriumchlorid, und I5OO Vol.-Teilen 95 S-igem wässrigem Methanol durchgeführt.
Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion mittels Kieselgel
durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen 1'I5 bis 153 enthielten C-15003 P-3, die Fraktionen
I67 bis 18O enthielten C-15003 P-3' und P-I und die Frak-
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tionen 185 bis 190 enthielten C-15OO3 P-I.
Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 50 Vol.Teilen Wasser und 100 Vol.Teilen
Aethylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichte geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem
Waschen mit jeweils 50 Vol.Teilen Wasser wurde die Aethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
eingeengt und stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese
Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet.
C-15003 P-3 0,070 Teile
C-15003 P-31, P-1» 0,018 Teile
C-15003 P-1I 0,015 Teile
Die gemischten Kristalle von C-15003 P-31 und P-4
(0,018 Teile) wurden in 0,3 Vol.-Teilen Aethylacetat gelöst und auf einer Linie in einem Abstand von 2,5 cm über
dem unteren Rande einer Kieselgelglasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 F2rJ( 0,25 mm, 20 χ 20)
aufgetragen, worauf man mit einer Mischung von Aethylacetat und Flethanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelte. Nach
dieser Entwicklung auf ungefähr l8 cm wurde die Absorptionsbande bei Rf 0,68 (P-4) und Rf 0,65 (P-3') abgeschabt
und jede Bande unabhängig zweimal mit jeweils wenig Wasser enthaltendem Aethylacetat extrahiert. Der entstandene
Aethylacetatextrakt wurde mit V/asser gewaschen, über was-
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serfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und stehen gelassen.
0,010 Teile der Kristalle von C-15003 P-Ί und 0,003 Teile der Kristalle von C-15003 P-31 wurden aus den
Fraktionen mit Rf 0,68 bzw. Rf 0,65 erhalten.
1000 Vol.-Teile der Kultur gemäss Bezugsbeispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen
von 200.000 Vol.-Teilen aufwies und 100.000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt, mit 1000 VoI.-Teilen
des Kulturmediums gemäss Bezugsbeispiel 2 geimpft und das angciiiipfte Medium unter Belüftung (100.000 Vol. -Teile/
Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute während 48 Stunden bei 28 X bebrütet, um eine Samenkultur
zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2.000.000 VoI.-Teilen,
welcher 1.000.000 Vol.-Teile eines Fcrmentierinediums
gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, bei einer Transplantationsrate von 10 % eingetragen. Die
Züchtung erfolgte unter Belüftung (1.000.000 VoI.-Teile/Minuten)
bei 28 0C. vfährend 90 Stunden unter Rühren bei 120
Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck von 1 kg/cm2. Die so entstandene Kultur wies beim Testen
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gernäss der Methode nach Bezugsbeispiel 1 einen Titer von
20 ug/ml auf.
900.000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit
wurden mit 900.000 VoI.-Teilen Aceton versetzt und nach
1-stündigem Rühren mit 20.000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnos
& Manville, U.S.A.) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert.
1.700.000 Vol.-Teile des εο erhaltenen Filtrates wurden mit
500.000 Vol.-Teilen V/asser versetzt und das Gemisch in einor Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Inc., U.S.A.)
mit 1.000.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Die Acthylacetatschicht wurde mit V/asser gewaschen, durch Zugabe
von wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther
versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese V/eise erhielt
man 68 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen
3,'l und 5 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese V/eise erhielt man 9,5 Teile C-15003 P-3, 0,300 Teile C-15003 P-31
und 2,5 Teile C-15003 P-1* ·
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Wirkung von C-15003 (eine Mischung von C-15003 P~3,
C-15003 P-3f und C-15003 P-1O auf die Ueberlebensdauer
bei an Leukämie P388 erkrankten Mäusen
(C57BL/6 χ DBAZS)F1 (BDF1)-Mäuse (in einer Gruppe
von 3 oder 5 Mäusen) mit einem Gewicht von l8 bis 22 g wurden intraperitoneal mit 1 χ 10 Zellen Leukämie P388 am
Tage 0 beimpft.
Das Antibiotikum C-15003 [ein Gemisch von C-15003 P-3 (60 bis 65 Gew.-Z), C-15003 P-2I (30 bis 35 Gew.-?) und
C-15003 P-3'] wurde in einer 1^-Tween 80 enthaltenden 0,85 2-physiologischen
Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension intraperitoneal tumorhaltigen Tieren (0,2 ml/Maus) einmal
täglich v/ährend 9 Tagen geimpft, wobei die Behandlung 2M
Stunden nach der Turnorimpfung begonnen wurde.
Um die cytostatische Wirkung des Antibiotikums C-15003 zu bewerten, wurde der T/C %, d.h. das Verhältnis
χ 100 der durchschnittlichen Ueberlebensdauer der P388-aufweisenden
Mäuse, welche mit dem Antibiotikum C-15003 behandelt worden waren (T), zu jenem der unbehandelten Mäuse
(C) berechnet. Ein Wert von mehr als 125 für T/C % wurde gemäss der NCI-Norm als positiv hinsichtlich der cytostatischen
Wirkung angesehen.
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„ I4 2 -
| Tabelle 5 | durchschnittli | T/C % | |
| che Ueberlebens- dauer in Tagen |
227 | ||
| Dosis | Anzahl | 24 ?5 | 185 |
| incg/kg/Tag | Mäuse | 20;0 | 199 |
| 25 | 3 | 21,5 . | |
| 12,5 | 3 | 10 8 | 82 |
| 6.25 | 3 | 194 | |
| (Blindversuch) | 11 | 22;5 | 194 |
| 50 | 5 | 22,5 | 194 |
| 25 | 5 | 22,5 | 168 |
| 12.5 | 5 | 19,5 | 129 |
| 6.25 | 5 | 15,0 | 108 |
| 3.13 | 5 | 12,5 | 108 |
| 1.6 | 5 | 12,5 | |
| 0.8 | 5 | 11,6 | |
| 0.4 | 5 | ||
| (Blindversuch) | 20 | ||
Wie sich aus den Resultaten in Tabelle V ergibt, vermag das intraperitoneale Verabreichen täglicher Dosierungen
von 1,56 bis 25 mcg/kg des Antibiotikums während 9 Tagf eine verlängerte Ueberlebensdauer bei den behandelten Mäusen
zu bewirken.
Die am meisten signifikante Lebensdauerverlängerung der behandelten Mäuse wurde bei einer Dosierung von
25 mcg/kg (optimale Dosis) (T/C % von 227) festgestellt.
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27A6252 Dj
Wirkungen von C-15003 P-3 und C-15003 P-^ in bezug auf
die Ueberlebensdauer bei an Leukämie P388 leidenden Mäusen
BDF1-MaUSe (5 Mäuse pro Testgruppe) mit einem
Gewicht von 18 bis 22 g wurden intraperitoneal mit 1 χ 10
von
Zellen/Leukämie P388 am Tage 0 inokuliert. Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 ?-igen physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol enthielt, gelöst und die Lösung intraperitoneal einmal täglich während 9 Tagen Mäusen (0,2 ml/Maus) verabreicht, wobei die Verabreichung 2'I Stunden nach erfolgter Tumorinokulation erfolgte.
Zellen/Leukämie P388 am Tage 0 inokuliert. Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 ?-igen physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol enthielt, gelöst und die Lösung intraperitoneal einmal täglich während 9 Tagen Mäusen (0,2 ml/Maus) verabreicht, wobei die Verabreichung 2'I Stunden nach erfolgter Tumorinokulation erfolgte.
Wie in Beispiel 1 beschrieben worden ist, wurde mehr als 125 in T/C % gemäss der NCI-Methode als in bezug
auf cytostatische Wirkung positiv betrachtet. Wie sich aus der Tabelle 6 ergibt, verlängerte die intraperitoneale Verabreichung
von C-15003 P-3 bei täglichen Dosierungsmengen von 1,6 bis 25 mcg/kg oder von C-15003 P-1I bei täglichen
Dosierungen von 0,8 bis 50 mcg/kg die Ueberlebensdauer der behandelten Mäuse in signifikanter Weise. Die maximale Wirkung
wurde bei einer täglichen Dosierungsmenge von 25 mcg/kg bei jedem der vorgenannten Testmittel beobachtet.
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| αν C-15003 P-3 |
c-15003 p-4 | |
| Dosis | 118 | 125 |
| 50 | 223 | .195 |
| 25 | 177 | 177 |
| 12,5 | 168 | . 180 |
| 6,25 | 159 | 145 |
| 3,13 | 144 | 141 |
| 123 | I32 | |
| 0,8 | 105 | IO5 |
| 0,4 | Beispiel 3 | |
Wirkung des Antibiotikums C-15003 (ein Gemisch von C-15003 P-3, C-15003 P-3' und C-15003 P-1I) auf die Ueberlcbensdauer von an Mclanom B l6 erkrankten Mäusen
1 g des Tumors wurde mit 10 ml einer kalten, 0,85 $-igen physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert,
worauf man 0,5 ml dieses den Tumor enthaltenden, homogenisierten Materials intraperitoneal bei BDF,-Mäusen (5 Tiere
pro Testgruppe) gemäss Angaben in NCI-Direktiven impft.
Das Antibiotikum C-15003 [ein Gemisch von
C-15003 P-3(6O - 65 Gew.-?), C-15003 P-1(30 - 35.Gew.-*)
0,85 %- und C-15003 P-3'] wurde in einer 1 % Tween 80 enthaltenden/
igen physiologischen Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension einmal täglich während 9 Tagen intraperitoneal
Mäusen verabreicht, wobei die Behandlung 2k Stunden nach
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der Tumorinokulierung (5 Mäuse in jeder Gruppe und 15 Mäuse beim Blindversuch) begonnen wurde.
T/C % bei der mittleren Ueberlebensdauer wurde
gemäss den Angaben in Beispiel 1 berechnet. T/C % von mehr als 125 wurde als positive cytostatische Wirkung betrachtet
V/ie sich aus der Tabelle 7 ergibt wurde die
Ueberlebensdauer der mit dem Antibiotikum C-15003 behandelten
Mäuse in signifikanter Weise verlängert, dies im Gegensatz
zu den unbehandclten Mäusen.
| Dosis | Anzahl | 5 |
| mcg/kg/lap; | Mäuse | 5 |
| 24 | 5 | 5 |
| 12 | 5 | 5 |
| 6 | 5 | |
| 3 | 5 | |
| 1.5 | 5 | |
| (Blindversuch) 15 | ||
| 24 | ||
| 12 | ||
| 6 | ||
| 3 |
durchschnittliche Ueberlebensdauer
in Tagen
T/C
29,5 31,5 35,5
34,5 29tO
18,5
159 170 192 186 157
(Blindversuch) 15
31,5 28,5 22,5 16,2 14,8
213 193 152 109
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Wirkungen von C-15003 P-3 und C-15003
P-H
auf die Ueberlebensdauer von an Melanom B 16 erkrankten Mäusen
BDF1-MaUSe (5 Tiere pro Testgruppe) wurden intraperitoneal
mit einer Suspension von B 16 Melanom in der gleichen V/eise v/ie in Beispiel 3 beimpft.
Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 ?-igen physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol enthielt,
gelöst und die Lösung einmal täglich während 9 Tagen den Mäusen (0,2 ml/Maus) intraperitoneal verabreicht,
wobei die Verabreichung nach Ablauf von 24 Stunden nach
der Tumorinokulation begonnen wurde.
Wie sich aus der Tabelle 8 ergibt, verursachte die Verabreichung von C-15003 P-3 oder C-15003 P-H bei täglichen
Dosierungsmengen von 1,6 bis 50 meg/kg eine signifikante verlängerte Ueberlebensdauer bei den behandelten Mäusen
.
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_ 1,7 -
1J?*1.* c-15003 P-3
mcG/kß/Tag x
T/C
C-15003 P-4
50
25
25
12,5
6,25
3,13
3,13
0,8
>219
>219
207
189
128 116 IO5
>219 >219 199 182 159 122 103 104
Wirkungen des Antibiotikums C-15003 (ein Gemisch von C-15003 P-3, C-15003 P-3' und C-15003 P- 1 Q und C-15003 P-3
auf die Ueberlebensdauer bei an Leukämie L1210 erkrankten Mäusen
BDF,-Mäuse (5 Tiere pro Testgruppe) wurden intraperitoneal mit 1 χ 10 Zellen von Leukämie L1210 am Tage
geimpft.
Das Antibiotikum C-15003 [ein Gemisch von
C-15003 P-3 (60 - 65 Gew.-?), C-15003 P-I (30-35 Gew.-?) und
C-15003 P-31I und C-15003 P-3 wurden jeweils in einer
0,85 ?-igen physiologischen Kochsalzlösung, Vielehe 2,5 ? Methanol enthielt, gelöst und jede Lösung einmal täglich
während 9 Tagen an mit dem Tumor geimpften Mäusen (0,2 ml/Maus)
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intraperitoneal verabreicht, wobei man die Verabreichung 2'I Stunden nach erfolgter Tumorinokulation begann.
Um die cytostatische Wirkung der Testmittel zu bewerten, wurde der T/C % gemäss Angaben in NCI-Methodik
5 festgehalten. Es handelt es sich hierbei, wie bereits erwähnt, um das Verhältnis χ 100 der mittleren Ueberlebensdauer
von an L1210 erkrankten Mäusen, welche mit den Mitteln behandelt worden waren und dies im Vergleich zu nicht
behandelten Mäusen (eine Gruppe von 25 Mäusen). T/C % von
10 120 wurde als Minimalwert in bezug auf die cytostatische V/irkung der Mittel betrachtet.
Wie aus der Tabelle 9 ersichtlich ist, war das Gemisch aus C-15003 P-3, C-15003 P-3' und C-15003 P-2J und
C-15003 P-3 bezüglich der Verlängerung der Ueberlebensdauer
15 von an L1210 erkrankten Mäusen wirksam.
Mittel
Dosis Anzahl durchschnittlimcg/kg/Τθί-M«use
che Ueberlebens- T/C %
dauer in Tagen
| Das Gemisch von C-15003 P-3, C-ISC03 p-3 and C-15003 T"1» ft |
40 30 20 |
■5
5 5 |
12 0 12,2 11,0 |
128 I30 117 |
| P-4 | 10 | 5 | 10,2 | 109 |
| C-15003 P-3 | 40 | 5 | 11,0 | 117 |
| 30 | 5 | 12;2 | I30 | |
| 20 | 5 | 11,2 | 119 | |
| 10 | 5 | 10,4 | 111 | |
| (Blindversuch) | - 4UL | 25 a.ftδfj /ng |
9,4 na > |
27A6252
Wirkungen von C-15003 P-3 und C-15003 P-*<
auf die Ueberlebensdauer von am Sarkom l80 erkrankten Mäusen
ICR-JCL-Mäuse (geliefert durch die Japan Clea,
g Tokyo, 5 Tiere pro Testgruppe) wurden mit 4 χ 10 Zellen
Sarkom l80 am Tage 0 intraperitoneal geimpft.
Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 ?-igen physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol enthielt,
gelöst und die Lösung den mit dem Tumor geimpften Mäusen (0,2 ml/Maus) intraperitoneal einmal täglich während
7 Tagen verabreicht, v/obei die Verabreichung 2H Stunden
nach der Tumorinokulation begonnen wurde.
Der T/C Ϊ-Wert bei der mittleren Ueberlebensdauer
wurde nach den Angaben in Beispiel 1 berechnet.
Wie aus der Tabelle 10 ersichtlich ist, waren beide Mittel für die Verlängerung der Ueberlebensdauer von
an Sarkom l80 erkrankten Tieren in signifikanter Weise wirksam.
809840/0608
Mittel
DoFis Anzahl durchschnittli-■p.cg/kg/fög
Mäuse ehe Ueberlebens- T/C
dauer in Tagen
| C-15003 P-3 C-15005 P-4- (Blindversuch) |
25 25 |
5 5 10 |
24,5 33,5 13,0 . |
188 258 |
| C-15003 p-3 (Blindversuch) |
50 25 12. 6. |
5 5 5 5 25 5 10 |
33,5 30,5 15,5 17,8 5,1,8 |
284 258 I3I I50 |
| Beispiel 7 | ||||
| Wirkungen | von C- | 15003 P-3 und | C-15003 P-1I | auf die Ueber |
| lebensdauer von | an Ehrlich-Carcinom erkrankten Mäusen |
ICR-JCL-Mäuse (5 Tiere pro Testgruppe) wurden
mit 1I χ 10 Zellen von Ehrlich-Carcinom am Tage 0 intraperitoneal
geimpft,
Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 ίί-igen
physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol enthielt,
gelöst und die Lösung einmal täglich während 7 Tagen Mäusen (0,2 ml/Maus) intraperitoneal verabreicht, wobei man
mit der Verabreichung 2*4 Stunden nach der Tumorinokulation
begann.
Der T/C £-Wert für die mittlere Ueberlebensdauer
809840/0608
wurde gemäss Angaben wie in Beispiel 1 berechnet.
Wie aus der Tabelle 11 ersichtlich ist, waren beide Mittel bezüglich der Verlängerung der Ueberlebensdauer
bei Ehrlich-Carcinom tragenden Mäusen in signifikanter Weise wirksam.
| Tabelle 1 | Bei | Anzahl | 1 | 8 | T/C % | |
| Mäuse | durchschnittli | |||||
| Dosis | che Ueberlebens- | |||||
| Mittel | mc^/kg/fög | 5 | dauer in Tagen | |||
| VJl | >21,5 | >171 | ||||
| C-15003 P~3 | 50 | VJI | >21,5 | |||
| 25 | 5 | >21,5 | >171 | |||
| 12,5 | 5 | >21,5 | ||||
| 6,25 | 10 | >21,5 | ||||
| c-15003 p-4· | 25 | spiel | 12,6 | |||
| (Blindversuch) | ||||||
Wirkungen von C-15003 P-3 und C-15003 P-1^ auf die Ueberlebensdauer von an P815 Mastocytom erkrankten Mäusen
BDF,-Mäuse (5 Tiere pro Testgruppe) wurden mit
1 χ 10 Zellen von P8l5 Mastocytom am Tage 0 intraperitoneal geimpft.
Jedes Antibiotikum wurde in einer 0,85 iS-igen
physiologischen Kochsalzlösung, welche 2,5 % Methanol ent-
809840/0608
hielt, gelöst und die Lösung einmal täglich während 7 Tagen
intraperitoneal mit Tumor geimpften Mäusen (0,2 ml/Tier) verabreicht, wobei die Verabreichung nach Ablauf von 24 Stunden
nach erfolgter Tumorinokulation begonnen wurde.
Der Wert T/C % bei der mittleren Ueberlebensdauer wurde gemäss Angaben wie in Beispiel 1 berechnet.
Wie aus der Tabelle 12 ersichtlich ist, waren beide Mittel bezüglich der Verlängerung der Ueberlebensdauer
von an P8l5 Mastocytom erkrankten Mäusen bei den in diesem Experiment verwendeten Dosierungsmengen in signifikanter
Weise wirksam.
| Dosis | Tabelle 12 | durchschnittli | T/C % | |
| ;/kg/Tag | che Ueberlebens | |||
| Attz ahl | dauer in Tagen | 61 | ||
| Mittel mCo | 50 | Mäuse | 10,-3 | >170 |
| 25 | >28;5 | >l?0 | ||
| C-15003 P-3 | }2;5 | VJ! | >28?5 | >170 |
| 6,25 | 5 | >28?5 | >170 | |
| 25 | 5 | >28,5 | ||
| VJI | 16,8 | |||
| C-15003 P-4 | VJI | |||
| (Blindversuch) | 10 | |||
809840/0608
Claims (7)
1. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirksubstanz eine wirksame Menge an Antibiotikum C-15OO3
vorzugsweise neben üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen
enthält.
2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Wirksubstanz das Antibiotikum C-15003 P-3 ist.
3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Wirksubstanz das Antibiotikum C-15003 P-31 ist.
4. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Wirksubstanz das Antibiotikum C-15OO3-P-4 ist.
5. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Wirksubstanz eine Mischung des Antibiotikums C-15003 P-3, Antibiotikums C-15003 P-31 und Antibiotikums
C-15003 P-4 ist.
6. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es in einer für die Injektion geeigneten Form vorliegt. /
7. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es außer einem Antibiotikum C-15003 ein flüssiges Medium enthält.
809840/0608
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52037166A JPS6034556B2 (ja) | 1977-03-31 | 1977-03-31 | 抗生物質ｃ−１５００３ |
| US81144977A | 1977-06-29 | 1977-06-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2746252A1 true DE2746252A1 (de) | 1978-10-05 |
Family
ID=26376255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19772746252 Withdrawn DE2746252A1 (de) | 1977-03-31 | 1977-10-14 | Antibiotikum c-15003 enthaltendes arzneimittel zur behandlung von tumore aufweisenden warmbluetern |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU510499B2 (de) |
| DE (1) | DE2746252A1 (de) |
| GB (1) | GB1592264A (de) |
| IT (1) | IT1094020B (de) |
| NL (1) | NL7711272A (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0010735A1 (de) * | 1978-10-27 | 1980-05-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Maytansinoide, ihre Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen |
| EP0014402A1 (de) * | 1979-01-31 | 1980-08-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | 20-0-Acylmaytansinoide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen |
| WO2007067698A2 (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Isolation of ansamitocins |
-
1977
- 1977-09-23 AU AU29074/77A patent/AU510499B2/en not_active Expired
- 1977-10-13 NL NL7711272A patent/NL7711272A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-10-14 DE DE19772746252 patent/DE2746252A1/de not_active Withdrawn
- 1977-10-14 GB GB42823/77A patent/GB1592264A/en not_active Expired
-
1978
- 1978-03-30 IT IT21817/78A patent/IT1094020B/it active
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0010735A1 (de) * | 1978-10-27 | 1980-05-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Maytansinoide, ihre Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen |
| EP0014402A1 (de) * | 1979-01-31 | 1980-08-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | 20-0-Acylmaytansinoide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen |
| WO2007067698A2 (en) * | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Isolation of ansamitocins |
| WO2007067698A3 (en) * | 2005-12-08 | 2007-09-07 | Millennium Pharm Inc | Isolation of ansamitocins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1094020B (it) | 1985-07-26 |
| NL7711272A (nl) | 1978-10-03 |
| GB1592264A (en) | 1981-07-01 |
| AU510499B2 (en) | 1980-06-26 |
| IT7821817A0 (it) | 1978-03-30 |
| AU2907477A (en) | 1979-03-29 |
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|---|---|---|---|
| 8130 | Withdrawal |