DE2746253A1 - Verfahren zur herstellung von maytansinol und dessen derivaten - Google Patents
Verfahren zur herstellung von maytansinol und dessen derivatenInfo
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Description
VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler ή- 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln
Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden
Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
5 KÖLN 1 13. Okt. 1977/Fu
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan
Verfahren zur Herstellung von Maytansinol und dessen
Derivaten.
8U9840/0609
Telefon: (0221) 234541-4 ■ Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Maytansinol. Maytanacin
und Maytansinolpropionat, welche als Cytostatica eingesetzt v/erden sollen.
Bekanntlich besitzen unter den vorgenannten Verbindungen Maytanacin und Maytansinolpropionat starke cytostatische Wirkungen [Kupchan et al.: Journal of the American Chemical Society 9]_, 5291J (1975)]· Andererseits besitzt Maytansinol selbst lediglich eine schwache cytostatische Wirkung (vergl. obige Literaturstelle), ist jedoch als Zwischenprodukt für die Herstellung von Maytanacin und Maytansinolpropionat und von anderen Derivaten wertvoll, weil damit eine leichte Herstellungsweise dieser Verbindungen gewährleistet wird.
Bekanntlich besitzen unter den vorgenannten Verbindungen Maytanacin und Maytansinolpropionat starke cytostatische Wirkungen [Kupchan et al.: Journal of the American Chemical Society 9]_, 5291J (1975)]· Andererseits besitzt Maytansinol selbst lediglich eine schwache cytostatische Wirkung (vergl. obige Literaturstelle), ist jedoch als Zwischenprodukt für die Herstellung von Maytanacin und Maytansinolpropionat und von anderen Derivaten wertvoll, weil damit eine leichte Herstellungsweise dieser Verbindungen gewährleistet wird.
Maytansinol und Maytanacin wurden gemäss obiger Literaturstelle aus der Rinde von Putterlickia verrueosa
(eine Pflanze, welche zur Gattung Maytenus gehört) bei äusserst geringer Ausbeute von 0,025 mg an ersterer Verbindung
und 0,36 mg an letzterer Verbindung aus 1 kg getrockneter Pflanzenrinde erhalten. Maytansinolpropionat
wurde durch chemische Propionierung von Maytansinol erhalten.
Es wurden verschiedene Bodenproben und andere Proben gesammelt und die daraus isolierten Mikroorganismen gesichtet.
Dabei wurde festgestellt, dass man gewisse Mikroorganismen isolieren kann und dass dieselben Maytansinol,
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Maytanacin oder Maytansinolpropionat im Züchtungsmedium anzureichern vermögen, Diese Mikroorganismen gehören zur
Gattung Nocardia. Die vorgenannten Verbindungen können auch durch Züchtung von Mutanten, die sich von diesen Mikroorganismen
ableiten, in einem geeigneten Nährmedium unter geeigneten Bedingungen erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Herstellung von Maytansinol, Maytanacin
oder Maytansinolpropionat, wobei dieses Verfahren darin besteht, dass ein Mikroorganismus, welcher zur Gattung
.Nocardia gehört und Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat
zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium unter Anreicherung von Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat
in der Kulturbrühe gezüchtet wird, worauf die erhaltenen Substanzen isoliert werden.
Es ist bekannt, dass die oben erwähnten Verbindungen aus Pflanzen erhalten werden können, doch handelt
es sich hierbei um ganz spezifische Pflanzen, deren Wachstum lange dauert. Auch das Abschneiden, das Abschälen, das
Abhacken, das Trocknen und das Pulverisieren der Pflanzen ist zeitaufwendig. Hinzu kommt das Extrahieren, das Trennen
und das Reinigen. Somit handelt es sich um teure, langwierige Massnahmen bei äusserst geringer Ausbeute,
Demgegenüber lassen sich die erfindungsgemässen Verfahren leicht und ohne Schwierigkeiten durch Züchten
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-1J-
des Mikroorganismus durchführen, wobei man die gewünschten Verbindungen in grossen Mengen erzeugen kann.
Die vorliegende Erfindung stellt das erste Beispiel der Herstellung dieser Verbindungen als Metabolite
von Mikroorganismen dar, wobei es sich um eine ausgezeichnete Methode für die Herstellung dieser Verbindungen handelt.
Als ein Beispiel eines im vorliegenden Verfahren verwendbaren Mikroorganismus sei der Actinomycetenstamm
No. C-15003 erwähnt, welcher aus dem Boden oder anderen
Proben isoliert wurde.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling
& Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-31IO (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht.
Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 0C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.
1) Morphologische Eigenschaften
Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt
sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einen
Durchmesser von 0,8 bis 1,2 ^im und können sich in gewissen
Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der
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Stamm zeigt ein gutes V/achstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel
anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 χ 200 - 1000 ^m), auf welchen weiteres Luftmycel
wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen
auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen
Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen
Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale
(0,8-1,2 um χ 1,8-6,8 ^m) und ellipsoidale
(0,8-1,2 ^im χ 1,0-2,0 ^im) Körper, welche Arthrosporen
ähneln, enthielten.
Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben.
2) Zellenzusammensetzung
Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium
während 66 bis 90 Stunden bei 28 0C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach
der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421 (1961I)] und der Methode nach M.P, Lechevalier [Journal
of Laboratory and Clinical Medicine 71, 931J (1968)] wurden
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die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure
und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet
werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.
3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien
Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative
Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb
und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche
Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig
und zeigte im allgemeinen ein massiges Wachstum bei weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung.
Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.
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Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003
auf taxonomischen Medien
(A) Saccharosenitrat-Agar:
Wachstum (G): üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)
bis bernsteinlohfarben (3 Ic) , Bildung von coremiaähnlichen Gebilden
Luftrnycel (AM) : spärlich, weiss
Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblichlohfarben
(B) Glycerinnitrat-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von
coremiaähnlichen Gebilden
AM: massig, weiss
SP: kein
AM: massig, weiss
SP: kein
(C) Glucose-Asparagin-Agar:
G : massig, hellringelblumenfarbig (3 pa) bis leuch-
tendgelb (2 pa) .
AM: spärlich, weiss
SP: leuchtendgelb (2 pa)
AM: spärlich, weiss
SP: leuchtendgelb (2 pa)
(D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von
coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiss
AM: spärlich, weiss
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SP: kein
(E) Stärkeagar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellv/eizenfarbig
(2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein
(F) Nähragar:
G.: massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb
(2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiss SP: kein
(G) Calciummaleat-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig
(2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen
Körpern
AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein
(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: G : massig, bernsteinfarbig (3 Ic) bis leuchtend gelb
(3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)
SP: kein
(I) Hafermehl-Agar: G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb
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·· 10 -
■■Κ
(2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss bis hellgelb
SP: kein
SP: kein
(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G : massig, khakigelb (2 ga)
G : massig, khakigelb (2 ga)
AM: kein
SP: khakigelb (2 ga)*
(K) Tyrosin-Agar:
(K) Tyrosin-Agar:
G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellmelonengelb
(3 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Kör
pern
AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)
y
SP: kamelfarben (3 ie)
SP: kamelfarben (3 ie)
Farbcode nach "Color Harmony Manual", ^. Auflage (Container
Corporation of America, 1958)
Ό Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich
für das Wachstum lag bei 12 bis 38 0C. Der Temperaturbereich,
in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 0C.
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Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003
waren die folgenden:
Temperaturbereich für das Wachstum: 12 bis 38 0C
Temperaturbereich für das Wachstum des Luft-
mycels:
Verflüssigung von Gelatine:
Hydrolyse von Stärke:
Reduktion von Nitraten:
Peptonisierung von Milch:
Coagulierung von Milch:
Zersetzung von Casein:
Herstellung von Melanoid-Pigmenten:
Zersetzung von Tyrosin: Zersetzung von Xanthin: Zersetzung von Hypoxanthin:
Toleranz in bezug auf Lysozym: Toleranz in bezug auf Natriumchlorid:
20 bis 35 0C positiv positiv positiv positiv
negativ positiv
negativ (Pepton-Hefeextrakt- Eisen-Agar),
positiv (Tyrosin-Agar) positiv negativ
negativ positiv 2 %
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5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen
Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham
und Gottlieb [Journal of Bacteriology £6, 107 (19^8)] beschrieben
ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich
die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.
Tabelle III
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm N0.C-I5OO3
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm N0.C-I5OO3
D-Xylose + ++
L-Arabinose + +
D-Glucose ++ ++
D-Galactose + +
D-Fructose +++ ++
L-Rhamnose + +
D-Mannose -t++ ++
Saccharose ++ ++
Lactose - -
Maltose + +
Trehalose -t ++
Grundmedium bei Zusatz von 0,1 % Hefeextrakt
Raffinose Melibiose i-Inositol D-Sorbitol
D-Mannitol Glycerin lösliche Stärke Blindversuch
Wachstum
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Anmerkung: +-fc-fc; üppiges Wachstum
+-+: gutes Wachstum
+: Wachstum
+: schlechtes Wachstum
-: kein Wachstum
6) Andere Eigenschaften
Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen
Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular
Biology, ^» 2°8>
!96l] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-Gehalt
des DNA betrug ungefähr 71 Mol-55.
Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.
Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003
wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., 1961] ; R.E. Buchanan
und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 197V; und anderen Literaturstellen
verglichen.
Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter
den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu
schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.
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Der besagte Stamm No. C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science
and Technology (PERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute for Fermentation, Osaka, (IFO)" unter der Nummer
IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection
(ATCC), Maryland, U.S.A." unter der Nummer 31281 registriert worden.
Während der Stamm No. C-15003," wie soeben erwähnt,
eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen
und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder unter dem Einfluss eines Mutagens. So sollten beispielsweise
die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem
Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch
eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten,
im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. Irgendwelche solche Maytansinol,
Maytanacin und Maytansinolpropionat zu bilden vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung als Stamm No. C-15003 verwenden. So liefert beispielsweise der Stamm No. C-15003 durch verschiedene
mutagene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen
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keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien,
v/elche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht
in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luft·
mycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.
Das für die Züchtung des Stammes, welcher Maytansinol,
Maytanacin oder Maytansinolpropionat zu liefern vermag, verwendete Medium (nachstehend der Kürze wegen als
"herstellbarer Stamm" bezeichnet) kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch
den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird
man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stick-
^■5 stoff quellen, welche durch den Stamm No. C-15003 assimiliert
und digeriert werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen
kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette
und OeIe, z.B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und
dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl,
Maisquellflüssigkeit, Pepton, Casein, Baumwollsamenmehl,
behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammonium-
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acetat usw., und dergl. verwendet werden. Das Medium
kann ferner Natrium'-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze
usv/., Eisen-·-, Magnesium-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw.,
Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische SaI-ze, z.B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann
das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin,
Prolin etc., Peptide,z.B. Dipeptide, Tripeptide
etc., Vitamine, z.B. die Vitamine B,, B„, Nicotinsäure, B12' C>
E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyrimidin und
Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine anorganische oder organische
Säure, ein Alkali, ein Puffermittel oder dergl. verwenden. Geeignete Mengen an Oelen, Fetten, oberflächenaktiven
Mitteln usw. können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.
Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen
oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen.
Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen
hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie
bei 20 bis 35 0C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr
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7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30 0C bei einem anfänglichen pH-Wert von
6,5 bis 7,5 -anwenden, Auch die Inkubationsdauer schwankt:.
je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation
so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat.
Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche
Zeitdauer bei ungefähr 48 bis lV-1 Stunden.
Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit
Tetrahyinena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei
wurde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium [20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco),
2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-inolarer
Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28 0C während M bis U8
Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter
Beobachtung der Wachstumstrübunq und durch Dünnschichtchromatographie
, abgekürzt TLC, nach den weiter unten beschriebenen Angaben bestimmt.
Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol
wurde sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.
Keine dieser Substanzen zeigt eine eindeutige antibiotische Wirkung. Die Bestimmung erfolgte daher durch TLC und parallel dazu durch Nachweis der Wirkung gegen
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den Tetrahymenastamm. Die Ferniori'" ierungsbrühe wurde somit
durch Filtrieren oder Zentrifü^Lecen in Zellen und Filtrat
aufgeteilt und das Filtrat mit den gleichen Volumen Aethylacetat
extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge
an 70 %-igem wässrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zugegeben,
worauf man nach 1-ständigem Rühren bei 20 0C die Suspension
filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wässrige Filtrat mit Aethylacetat extrahiert
Jeder dieser Extrakte wurde im Volumehverhältnis 1:103 eingeengt
und über einer Kieseigel-Glasplacte (Merck, Deutsche Bundesrepublik,
Kieselgel 60 F^1-,,. 0,25 min, 20 χ 20) (Lösungsmittelsystem:
Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9:1) der Dünnschicbtohromatographie unterworfen.
Das Wirkungsvermögen wurde; auf Grund der Intensitat der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537 A
beobachteten Stellen bestimmt.
Das auf diese V/eise in der Kulturbrühe erzeugte Maytanacin, Maytansinolpropiona'. ocer Maytansinol ist lipophyl
und neutral. Diese Substanzen lassen sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobiellGi Metabolite normalerweise
übliche Trenn- und Reinigung^nic-ihoden isolieren. So kann
man beispielsweise so arbeiten, dass man sich die Unterschiede
zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann aber
auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener
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- ip ,-
Adsorptionsmittel, wie z.B. Aktivkohle, makroporösen,
nichtionogener Harze, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw. zur Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen
mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen. Man kann aber schliesslich auch andere Methoden oder aber
die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder aber wiederholt anwenden.
Da, wie oben erwähnt, Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol sowohl im Filtrat als auch in
den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches
verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder
nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion
mit einem Lösungsmittel kann nach einer beliebigen folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode,
beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion
der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer Weise,
durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinander zu extrahieren, wird man mit Vorteil die
folgende Methode anwenden. Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare,
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organische Lösungsmittel, wie z.B, Fettsäureester, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone, z.B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem
dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und vorzugsweise wird die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit
mittels Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Drück eingeengt. Hierauf
wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe
Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen-Da bei der Dünnschichtchromatographie eine gewisse Zahl
von Stellen festgestellt wurden, welche Maytanacin, Maytansinolpropionat
oder Maytansinol nicht entsprechen, wird das Produkt I anschliessend den folgenden Reinigungsverfahren
unterzogen. Dabei zeigt sich, dass eine routinemässige Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie,
wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd,
ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz usw., verwendet werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I
ist Kieselgel besonders wertvoll. Die Entwicklung kann beispielsweise, ausgehend von Petroläther und Hexan, erfolgen,
während die Eluierung durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
wie Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Me-
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thanol, erfolgt. Gemäss einem typischen Verfahren verwendet
man Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) als Trägermittel und führt die Säulenchromatographie
mit einer Mischung von Hexan und Aethylacetat durch, wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird
gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die die wirksamen Bestandteile enthaltenden Fraktionen sammelt und unter
vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt
II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen enthält, wird es in der nachstehend beschriebenen
Weise weiter gereinigt. So kann man das Produkt II beispielsweise mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter
Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems reinigen. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem
kann aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z.B. Dichlormethan oder Chloroform, bei Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
wie einem Alkohol, z.B. Aethanol oder Methanol, einem Keton, z.B. Aceton oder Methyläthylketon, oder
dergl. bestehen. Auf diese Weise lässt sich Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol isolieren. Die Reihenfolge
der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgelsäulen kann auch umgekehrt werden, wobei man
überdies nötigenfalls auch übliche organische Lösungsmittel in Verbindung mit den obigen Systemen verwenden kann.
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Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt die
Eluierung von Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol
mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer
Alkohol kann man beispielsv/eise Methanol, Aethanol, Propanol
oder Butanol und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon verwenden. Der Ester kann beispielsweise
Aethylacetat sein. Gemäss einer typischen Ar- IQ beitsweise löst man das rohe Produkt II in 60 % wässrigem
Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.). Diese Säule wird anschließend
mit 70 %-igem wässrigem Methanol gewaschen und mit 90 #-igem wässrigem Methanol eluiert. Auf diese Weise wird
,,- Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol aus der Säule eluiert.
Bei jeder der vorgenannten Methoden werden die die gewünschten Komponenten enthaltenden Fraktionen gesammelt
und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem getrockneten Produkt wird dann das 5- bis 8-fache Volumen Äthylacetat züge
setzt und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle von Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol ausscheiden.
Enthalten die Kristalle Maytanacin und Maytansinolpropionat, so werden sie mit Hilfe eines Adsorptionsmittels
beispielsweise der oben genannten Art voneinander getrennt.
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Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes
Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel, so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert
eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Aethylacetat oder
einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch Maytansinolpropionat und Haytanacin in der erwähnten Reihenfolge
erhalten werden. Nimmt man die Bildung dieser Substanzen durch Dünnschichtchromatographie wahr, so werden die Fraktionen
unter vermindertem Druck eingeengt und Aethylacetat don Konzentraten zugegeben. Auf diese V/eise erhält man die
entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz,
so kann man eine stufenmässige Eluierung mit schwankenden
Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode
unter Verwendung von 60 #-igem wässrigem Methanol und 95 %-igem wässrigem Methanol unter Zugabe
von 5 % Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten Reihenfolge Maytanacin und Maytansinolpropionat. Nachdem
man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck
eingeengt und aus Aethylacetat zum Auskristallisieren gebracht.
Die isolierten Kristalle enthalten Aethylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trocl·
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nen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70 0C die
nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften, (Tabelle IV)
Maytanacin C30H39ClN2O9 |
Maytansinol- propionat · C31H111ClN2O9 |
Maytansinol C28H37ClN2O8 |
|
Schmelz punkt. (0C) |
235-236° | 188-190° | 172,5-174° |
Spezifische Drehung |
[a]g2°-121°4-10O (c=0,25, CHCl3) |
[α]22°-ΐ27°+10Ο (c=0,35, CHCl3) |
[α]£2°-313Ο±10° (c=0,22, CHCl ) |
Analyse Gef. : (JO |
C 59,62 H 6,93 N 4,28 Cl 5,72J |
59,93 6,82 4,32 5,57 |
59,28 6,38 5,02 6,15 |
Analyse Ber. : (50 |
C 59,85 H 6,18 N 1» ,61 Cl 5,84 |
59,94 6,65 4,51 5,71 |
59,52 6,60 4,96 6,27 |
Ultraviolett- absorptoons- spektrum nm(£) |
233(30330) 240(Sch.28240) 252(27850) 280(5680) 288(5660) |
233(30240) 24O(Sch.28400) 252(27650) 280(5740) 288(5710) |
232(32750) 244(Sch.30850) 252(31650) 281(5750) 288(5700) I |
809840/0609
Maytanacin C30H39ClN2O9- |
Maytansinol propionat C31H141ClN2O9 |
Maytansinol C28H37ClN2O8 |
|
Infrarot- ab sorptions- spektrum (cm"1) |
1710,1730,1670, I58O |
17JIO,173O,l67O 158O |
1715,1670,1580 |
Massenspek trum (m/e) |
5i5,185,170,150 | 559,485,470,150 | 503,485,170,450 |
sauer, neu tral oder alkalisch |
lipophile und neutrale Sub stanz |
lipophile und neutrale Sub stanz |
lipophile und neutrale Sub stanz |
Farbreak tionen |
Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion: positiv |
Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion : positiv |
Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion: positiv |
Die oben genannten Daten in bezug auf die Elementaranalysen, spezifische Drehungen, Ultraviolettspektren,
Infrarotspektren, Massenspektren usw. sind in Uebereinstimmung mit den Vierten für Maytanacin, Maytansinolpropionat und
Maytansinol, wie sie aus Kupchan et al. ersichtlich sind. (The Journal of American Chemical Society 97., 5291 (1975).
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils
Gew.-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Ver-
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hältnis zwischen den Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "#" bezieht sich
auf "Gew./VoI", sofern nichts anderes ausgesagt wird.
Maytansinol, Maytanacin und Maytansinolpropionat zu erzeugen vermögender Mikroorganismus Nocardia No.C-15003
(IFO 13726; FERM 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Medium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) gezüchtet worden war,
wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter,
welcher 40 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2 % Glucose, 3 % lösliche Stärke, 1 % rohes Sojabohnenmehl,
1 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 % Polypepton, 0,3 % NaCl, 0,5 % CaCO,, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte
Medium wurde während 48 Stunden bei 28 0C inkubiert, um ein
Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums
wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher ^O Vol.-Teile eines Fermentiermediums
enthielt, welches aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit,
0,1 % Polypepton und 0,5 % Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand, enthielt, eingebracht und während 90 Stunden bei 28 0C gezüchtet,
um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu erhalten.
Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus
809840/0609
und Maytansinolpropionat als Standardprodukt festgestellt
werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von 25 /ig/ml auf,
10 Vol."Teile des gemäss Beispiel 1 erhaltenen
Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile
eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie
oben enthielt, worauf man während *l8 Stunden bei 28 0C brütete.
500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in einen 50.000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl
eingetragen, welcher 30.000 Vol.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30.000
VoI.-Teile/Minute) bei 28 0C züchtete und bei einem Innendruck
von 1 kg/cm bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) rührte, um auf diese Weise eine Samenkultur zu erhalten.
Diese Kultur wurde zum Animpfen eines 200.000 Vol.-Teile enthaltenden Tanks aus rostfreiem Stahl verwendet, welcher
100.000 Vol.-Teile eines Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen Beispiel 1 enthielt, wobei
eine Impfrate von 10 % eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/
Minute) bei 28 0C inkubiert und bei einem
Innendruck von 1 kg/cm während 90 Stunden bei 200 Umdrehun-
ÖU9840/0609
gen pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte
man feststellen, dass die so erhaltene Kultur einen Titer von 25 Ug/ml aufwies.
90.000 Vol.-Teile der nach den obigen Angaben
90.000 Vol.-Teile der nach den obigen Angaben
erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-superceP-^
(Johnes and Manville Products, U.S.A.) versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter
filtriert, wobei 85.000 Vol.-Teile Filtrat und 32000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85.000 VoI.-Teile.)
wurde gerührt und mit 30.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Diese Massnahme wurde ein weiteres Kai
wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30.000 Vol.-Teilen Wasser gewaschen,
durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile
eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren
gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Aethylacetat verrührt, worauf die unlöslichen
Bestandteile abfiltriert l^urden. Das Filtrat wurde mit
10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das Aethylacetat unter vermindertem
Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule (*J00 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 VoI,
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Teilen Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 3:1), 500 Vol.-Teilen
einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und
Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:3), 500 Vol.-Teilen Aethylacetat, 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Aethylacetat
und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1) und 1000 VoL-Teilen einer Mischung von Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis
25:1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt wurde.
, 1 VoI,-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne
eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teile Äthylacetat hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über
dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 60 F „j., 0,25 mm, 20 χ 20) liegende
Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Aethylacetat und
Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelt, Nach erfolgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (2537A*)
das gewünschte Produkt festgestellt.
Die aktiven Fraktionen No. 25-30 mit Rf 0,58-0,63
und die Fraktionen No. 38"4O mit Rf 0,25-0,30 wurden gesammelt
und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr 20 VoI,-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden jeweils
roit 150 Vol.-Teilen Petroläther versetzt, wobei man 5 Teile
809840/0609
eines rohen Produktes II und 2 Teile rohes Maytansinol erhielt.
In 10 Vol.'-Teilen Aethylacetat wurden 0,5 Teile
des nach den obigen Angaben erhaltenen rohen Produktes II gelöst und die Lösung gründlich mit H Teilen Kieselgel
(Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt. Das Aethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt.
Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 VoI.-Teilen Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit
500 Vol.-Teilen Chloroform gev/aschen und hierauf mit 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(Mischungsverhältnis 50:1), 500 VoI,-Teilen einer Mischung
von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(10:1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von 25 Vol.-Teilen gesammelt.
Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde
mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem:
Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis
9:1) unterworfen.
Die Fraktionen Nr. 40 und 41 in der Zone von
RF 0,48-0,50, welche bei 2537 8 absorbierten,wurden
gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne einge-
809840/0609
engt. Der Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen
Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,05 Teile Mischkristalle, bestehend aus Maytanacin
und Maytansinolpropionat, erhielt.
0,05 Teile der soeben erwähnten Mischkristalle von Maytanacin und Maytansinolpropionat wurden in 5 VoI.-Teilen
Methanol gelöst und dann mit 0,1 Teilen Natriumchlorid und 5 Vol.-Teilen V/asser versetzt. Eine mit 200 VoI.-Teilen
Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) beschickte
wässrigem Säule wurde mit 600 Vol.-Teilen 50 ?-igem/Methanol,
enthaltend 5 % Natriumchlorid, gewaschen. Die so hergestellte
Lösung wurde durch eine Säule geführt und eine
Gradienten-Eluierung unter Verwendung von 1.500 Vol.-Teilen 60 5&-igem wässrigem Methanol enthaltend 5 % Natriumii?.s
s Pipern
chlorid, und 1.500 Vol.-Teilen 95 /S-igem/Methanol
durchgeführt. Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion
durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen 130 bis 135 enthielten Maytanacin und die Fraktionen I38
bis 1*12 Maytansinolpropionat.
Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 30 ml Wasser und 50 ml Aethylacetat gelöst.
Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem
Waschen mit jeweils 30 ml Wasser wurde die Aethylacetat-
809840/0609
- 52 -
schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehen gelassen. Auf diese V/eise erhielt man
in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Auf diese
Weise erhielt man 0,013 Teile Maytanacin und 0,025 Teile Maytansinolpropionat.
0,2 Teile des nach den obigen Angaben erhaltenen, rohen Maytansinols wurden in 3 Vol.-Teilen Aethylacetat gelöst
und die Lösung gründlich mit 0,5 Teilen Kiesegel
LO (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gründlich gerührt. Das Aethylacetat wurde unter vermindertem
Druck entfernt. Der Rückstand wurde obenauf eine Säule von 80 Vol.-Teilen Kiesegel eingebracht und die Säule zuerst
mit 150 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit
L5 150 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanoi
(Mischungsverhältnis 50:1), I50 Vol.-Teilen einer Mischung
von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 300 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(Mischungsverhältnis 10:1) eluiert. Das Eluat wurde dann
in Fraktionen von jeweils 10 Vol.-Teilen gesammelt.
0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt, Das Konzentrat wurde hierauf
mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch in Form einer Probe der Dünnschichtchromatographie (Ent-
!5 wicklungssystem: Mischung von Chloroform und Methanol im
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Mischungsverhältnis von 9:1) unterworfen.
Die Fraktionen Nr. 50 bis 52 in der Zone von
Rf 0,33-0,38, welche bei 2.537 8 absorbierten, wurden
gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der-Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen
Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,020 Teile Maytansinol in Form von Kristallen erhielt.
32.000 Teile der gemäss Beispiel 2 erhaltenen.
Zellen wurden unter Rühren mit 50.000 Vol.-Teilen 70 $-igem
wässrigem Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf auf einem Druckfilter filtriert. Die«Extraktion mittels
50.000 Vol.-Teilen 70 #-igem wässrigem Aceton und die anschliessende
Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt.
Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wässrige
System wurde durch eine Säule von 5.000 Vol.-Teilen Diaion HF-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) hindurchgeleitet. Die
Säule wurde mit 20.000 Vol.-Teilen Wasser und 50 i?-igem
. wässrigem Methanol gewaschen und anschliessend mit 15.000 Vol.-Teilen 90 Ji-igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat
wurde unter vermindertem Druck auf 3.000 Vol.-Teile eingeengt und mit 3.000 Vol.-Teilen Wasser und 3.000 Vol.-Teilen
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- 3'i -
Aethylacetat geschüttelt, Diese Arbeitsweise wurde einmal
mehr wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther
hinzugegeben und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gesammelt, wobei man 28OTeile rohes Produkt I erhielt.
Dieses Produkt wurde mittels einer Kieselgelsäule in ähnlicher V/eise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 1 ,o Teile
rohes Produkt II und 0,5 Teile rohes Maytansinol erhielt.
1000 Vol.-Teile der Kultur gemäss Beispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen
von 200.000 VoI.-Teilen aufwies und 100.000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt, geimpft und
das angeimpfte Medium unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/ Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute
während 48 Stunden bei 28 0C bebrütet, um eine Samenkultur
zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2.000.000 VoI.-Teilen,
welcher 1.000.000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt,
bei einer Transplantationsrate von 10 % eingetragen. Die Züchtung erfolgte unter Belüftung (1.000.000 Vol.-Teile/Mi-
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nuten) bei 28 0C während 90 Stunden unter Rühren bei 120
Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck
von 1 kg/cm·. Die so entstandene Kultur wies beim Testen
gemäss der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 μg/ml
auf. 900.000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden mit 900.000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach
1-stündigem Rühren mit 20.000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnes
& Manville, U.S.A.) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert.
1.700.000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit 500.000 Vol.-Teilen Wasser versetzt und das Gemisch in einer
Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Ine.} U.S.A.)
mit 1.000.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Die Aethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe
von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther
versetzt und der entstandene Miederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt
man 680 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen
2 und 3 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 1,1 Teile Maytanacin, 2,2 Teile Maytansinolpropionat
und 0,1 Teile Maytansinol.
S09&IO/06Ö9
Claims (6)
1) Verfahren zur Herstellung von Maytansinol,
Maytanacin oder Maytansinolpropionat, dadurch gekennzeichnet , dass man einen der Gattung Nocardia angehörenden Mi-
Maytanacin oder Maytansinolpropionat, dadurch gekennzeichnet , dass man einen der Gattung Nocardia angehörenden Mi-
kroorganismus, welcher Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat
zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium,
welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare
Stickstoffquellen enthält, so lange züchtet, bis Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat stark angereichert ist, worauf man die gewünschte Verbindung isoliert.
welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare
Stickstoffquellen enthält, so lange züchtet, bis Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat stark angereichert ist, worauf man die gewünschte Verbindung isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt Maytansinol ist.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt Maytanacin ist.
4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das erhaltene Produkt Maytansinolpropionat ist.
5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Nocardia No. C-15003 (ATCC
31281; IFO 13726; PERM 3992) ist.
31281; IFO 13726; PERM 3992) ist.
6) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einer der nach Ansprachen 1 bis 5
hergestellten Verbindungen.
809840/0609
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE2746253A1 true DE2746253A1 (de) | 1978-10-05 |
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SE (1) | SE7711543L (de) |
SU (1) | SU938746A3 (de) |
YU (1) | YU243777A (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0028683A1 (de) * | 1979-09-21 | 1981-05-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotikum C-15003 PHO und seine Herstellung |
USRE39151E1 (en) | 2000-08-18 | 2006-06-27 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
US7432088B2 (en) | 2003-05-08 | 2008-10-07 | Immunogen Inc. | Methods for the production of ansamitocins |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6010720B2 (ja) * | 1977-11-18 | 1985-03-19 | 武田薬品工業株式会社 | 抗生物質c―15003 p―4の製造法 |
JPS6016236B2 (ja) * | 1977-11-18 | 1985-04-24 | 武田薬品工業株式会社 | 抗生物質c―15003 p―3の製造法 |
JPS55162791A (en) * | 1979-06-05 | 1980-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Antibiotic c-15003pnd and its preparation |
US6573074B2 (en) * | 2000-04-12 | 2003-06-03 | Smithkline Beecham Plc | Methods for ansamitocin production |
CN116239607B (zh) * | 2023-01-04 | 2024-04-09 | 山东大学 | 一种美登素衍生物及其生物合成方法与应用 |
-
1977
- 1977-03-31 JP JP52037167A patent/JPS6010718B2/ja not_active Expired
- 1977-09-23 AU AU29073/77A patent/AU507869B2/en not_active Expired
- 1977-10-07 SU SU772533351A patent/SU938746A3/ru active
- 1977-10-07 FR FR7730340A patent/FR2385798A1/fr active Granted
- 1977-10-10 YU YU02437/77A patent/YU243777A/xx unknown
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1978
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NICHTS-ERMITTELT * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0028683A1 (de) * | 1979-09-21 | 1981-05-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotikum C-15003 PHO und seine Herstellung |
USRE39151E1 (en) | 2000-08-18 | 2006-06-27 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
US7432088B2 (en) | 2003-05-08 | 2008-10-07 | Immunogen Inc. | Methods for the production of ansamitocins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL7711273A (nl) | 1978-10-03 |
PL201539A1 (pl) | 1978-09-25 |
AU2907377A (en) | 1979-03-29 |
DE2746253C2 (de) | 1986-08-21 |
FR2385798A1 (fr) | 1978-10-27 |
PT67853A (en) | 1978-04-01 |
AU507869B2 (en) | 1980-02-28 |
PT67853B (en) | 1980-05-05 |
IT1094003B (it) | 1985-07-26 |
IT7821819A0 (it) | 1978-03-30 |
CS214881B2 (en) | 1982-06-25 |
JPS53121998A (en) | 1978-10-24 |
IE45888L (en) | 1978-09-30 |
DK143570C (da) | 1982-02-08 |
PL108863B1 (en) | 1980-05-31 |
SU938746A3 (ru) | 1982-06-23 |
DK143570B (da) | 1981-09-07 |
AT362058B (de) | 1981-04-27 |
GB1554395A (en) | 1979-10-17 |
ES463206A1 (es) | 1978-08-16 |
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JPS6010718B2 (ja) | 1985-03-19 |
CA1092999A (en) | 1981-01-06 |
SE7711543L (sv) | 1978-10-01 |
DK458977A (da) | 1978-10-01 |
HU177391B (en) | 1981-09-28 |
FR2385798B1 (de) | 1980-04-25 |
CH631740A5 (en) | 1982-08-31 |
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IE45888B1 (en) | 1982-12-29 |
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