DE2746209C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE2746209C2 DE2746209C2 DE2746209A DE2746209A DE2746209C2 DE 2746209 C2 DE2746209 C2 DE 2746209C2 DE 2746209 A DE2746209 A DE 2746209A DE 2746209 A DE2746209 A DE 2746209A DE 2746209 C2 DE2746209 C2 DE 2746209C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- parts
- volume
- ethyl acetate
- silica gel
- eluent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
- C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D491/18—Bridged systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D498/18—Bridged systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotika, nämlich
Antibiotika C-15003, und auf ein Verfahren zur Herstellung
von Derivaten der Antibiotika.
Es wurden verschiedene Bodenproben und andere
Proben gesammelt und die daraus isolierten Mikroorganismen
gesichtet. Dabei wurde festgestellt, daß diese Mikroorganismen
teilweise ein neues Antibiotikum zu erzeugen vermögen,
daß solche Mikroorganismen der Gattung Nocardia angehören
und daß durch die Züchtung solcher Mikroorganismen
in einem geeigneten Medium in der Kulturbrühe das oben bezeichnete
Antibiotikum angereichert werden kann. Es wurde ferner festgestellt,
daß aus diesem Antibiotikum Derivate hergestellt
werden können. Diese Feststellungen haben zur
Erfindung geführt.
Die Erfindung bezieht sich somit auf:
(1) Ein durch Anspruch 1 gekennzeichnetes Verfahren zur
Herstellung der Antibiotika C-15003, welche der folgenden
allgemeinen Formel entsprechen:
worin
bedeutet.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung einer Verbindung der folgenden Formel:
welches darin besteht, daß man den Antibiotika
C-15003-Komplex, bestehend aus folgenden Verbindungen
der allgemeinen Formel:
worin
bedeutet, reduktiv hydrolysiert und das durch Anspruch 2 gekennzeichnet
wird.
In der Beschreibung bedeutet die Bezeichnung
"Antibiotikum C-15003" generell die drei Verbindungen
der oben erwähnten allgemeinen Formel I als
Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der
besagten Verbindungen.
Mit Bezug auf die allgemeine Formel I
wird die Verbindung, in welcher R den Rest
darstellt, in der Beschreibung als "Antibiotikum
C-15003 P-3" oder nur "C-15003 P-3" bezeichnet. Die
Verbindung, in welcher R den Rest -CO-CH₂-CH₂-CH₃ darstellt,
wird als "Antibiotikum C-15003 P-3′" oder nur "C-15003 P-3′"
bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest
darstellt, wird in der Beschreibung als "Antibiotikum
C-15003 P-4" oder nur "C-15003 P-4" bezeichnet und
die Verbindung, in welcher R ein Wasserstoffatom bedeutet (womit
diese Verbindung der allgemeinen Formel II entspricht),
wird nachstehend als "Antibiotikum C-15003 P-0" oder nur
"C-15003 P-0" bezeichnet.
Der das Antibiotikum C-15003 erzeugenden
Stammes eines Mikroorganismus wurde als Actinomycetenstamm
Nr. C-15003 bezeichnet, welcher aus dem
Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum
erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes
Nr. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling &
Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology
16, 313-340 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht.
Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28°C in
einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.
Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt
sich zu Verzweigungen, und dies sowohl auf Agar als
auch im flüssigen Medium. Manche der Hyphen haben einen
Durchmesser von 0,8 bis 1,2 µm und können sich in gewissen
Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien
oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der
Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen
Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel
anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche
Körper (50-200×200-1000 µm), auf welchen weiteres Luftmycel
wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei
hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen
auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung
von älteren Kulturen zeigt, daß nur in wenigen
Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen,
während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen
Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop
verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale
(0,8-1,2 µm×4,8-6,8 µm) und ellipsoidale
(0,8-1,2 µm×1,0-2,0 µm) Körper, welche Arthrosporen
ähneln, enthielten.
Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben,
daß diese Körper glatte Oberflächen haben.
Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP Nr. 1-
Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28°C unter Schütteln
gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach
der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12,
421 (1964)] und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal
of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (1968)] wurden
die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure
und Zuckerzusammensetzung untersucht.
Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet
werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose
deuteten.
Der Stamm zeigte ein verhältnismäßig gutes
Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative
Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blaßgelb
und in den letzteren Phasen hellgelblichlohfarben
bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche
Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien
gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig
und zeigte im allgemeinen ein mäßiges Wachstum bei
weißer bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung.
Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen
Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.
- (A) Saccharosenitrat-Agar:
Wachstum (G): massig, leuchtendmelonengelb (3 ia)*) bis bernsteinlohfarben (3 lc)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden
Luftmycel (AM): spärlich, weiß
Lösliches Pigment (SP): keines oder blaß gelblichlohfarben - (B) Glycerinnitrat-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden
AM: mäßig, weiß
SP: kein - (C) Glucose-Asparagin-Agar:
G: mäßig, hellringelblumenfarbig (3 pa)*) bis leuchtendgelb (2 pa)*)
AM: spärlich, weiß
SP: leuchtendgelb (2 pa)*) - (D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß
SP: kein - (E) Stärkeagar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellweizenfarbig (2 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein - (F) Nähragar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß
SP: kein - (G) Calciummaleat-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellweizenfarbig (2 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein - (H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:
G: mäßig, bernsteinfarbig (3 lc)*) bis leuchtend gelb (3 la)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein - (I) Hafermehl-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiß bis hellgelb
SP: kein - (J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G: mäßig, khakigelb (2 ga)*)
AM: kein
SP: khakigelb (2 ga)*) - (K) Tyrosin-Agar:
G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellmelonengelb (3 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern
AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kamelfarben (3 ie)*)
*) Farbcode nach "Color Harmony Manual", 4. Auflage (Container
Corporation of America, 1958)
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden
sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich
für das Wachstum lag bei 12 bis 38°C. Der Temperaturbereich,
in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP
Nr. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35°C.
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. C-15003
waren die folgenden:
Temperaturbereich für das Wachstum: | |||
12 bis 38°C | |||
Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels: | 20 bis 35°C | ||
Verflüssigung von Gelatine: | positiv | ||
Hydrolyse von Stärke: | positiv | ||
Reduktion von Nitraten: | positiv | Peptonisierung von Milch: | positiv |
Coagulierung von Milch: | negativ | ||
Zersetzung von Casein: | positiv | ||
Herstellung von Melanoid-Pigmenten: | negativ (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), positiv (Tyrosin-Agar) | ||
Zersetzung von Tyrosin: | positiv | ||
Zersetzung von Xanthin: | negativ | ||
Zersetzung von Hypoxanthin: | negativ | ||
Toleranz in bezug auf Lysozym: | positiv | ||
Toleranz in bezug auf Natriumchlorid: | 2% |
Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen
wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham
und Gottlieb [Journal of Bacteriology 56, (1948), 107] beschrieben
ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung
plus 0,1% Hefeextrakt untersucht. Dabei ließen sich
die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte
eruieren.
Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2)
wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen
Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular
Biology, 3, 208 (1961)] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-
Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 Mol-%.
Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses
Stammes war positiv.
Die obigen Eigenschaften des Stammes Nr. C-15003
wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes"
Bd. 2 [The Williams ans Wilkins Co., 1961]; R.E. Buchanan
und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
8. Ausgabe, 1974"; und anderen Literaturstellen
verglichen.
Es wurde angenommen, daß dieser Stamm zur Gruppe
III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter
den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche
die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu
schließen, daß dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen
darstellt.
Der besagte Stamm Nr. C-15003 ist beim "Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science
and Technology (FERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute
for Fermentation, Osake, (IFO)" unter der Nummer
IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection
(ATCC), Maryland, USA" unter der Nummer 31281 registriert
worden und kann von dort bezogen werden.
Während der Stamm Nr. C-15003, wie soeben erwähnt,
eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er,
wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen
und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder
unter dem Einfluß eines Mutagens. So sollten beispielsweise
die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch
Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem
Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf
verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch
eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind,
sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten,
im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten
Art betrachtet werden.
So liefert beispielsweise der Stamm Nr. C-15003 durch verschiedene
mutagene Behandlungen Mutanten, welche
keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien,
welche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben
oder organgerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht
in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen
aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weißen Luftmycelien
oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.
Das Medium, welches für die Züchtung des
den Antibiotika C-15003-Komplex erzeugenden Stammes
verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges
oder festes Medium sein, vorausgesetzt, daß es durch
den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird
man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges
Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen,
welche durch den Stamm Nr. C-15003 assimiliert
und verdaut werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel
usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen
kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose,
Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette
und Öle, z. B. Sojabohnenöl, Specköl oder Hühneröl
nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise
Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl,
Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl,
behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z. B.
Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Ammoniumacetat
verwendet werden. Das Medium
kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze
usw., Eisen-, Magnesium-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze,
Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische Salze,
z. B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann
das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z. B.
Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin,
Prolin etc. Peptide, z. B. Dipeptide, Tripeptide,
Vitamine, z. B. die Vitamine B₁, B₂, Nicotinsäure,
B₁₂, C, E, Nucleinsäuren, z. B. Purin, Pyrimidin und
Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes
des Mediums kann man auch eine anorganische oder organische
Säure, ein Alkali bzw. ein Puffermittel verwenden.
Geeignete Mengen an Ölen, Fetten, oberflächenaktiven
Mitteln können ebenfalls als schaumverhindernde
Mittel zugesetzt werden.
Die Züchtung kann unter beliebigen stationären
Bedingungen, unter Schütteln, unter submeren aeroben Bedingungen
oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen.
Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise
eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen
hängen vom Zustande und von
der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode
und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie
bei 20 bis 35°C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr
7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine
solche von 23 bis 30°C bei einem anfänglichen pH-Wert von
6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Inkubationsdauer schwankt
je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation
so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten
antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat.
Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen
in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche
Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 144 Stunden.
Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit
Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei
wurde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium
[20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco),
2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarer
Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28°C während 44 bis 48
Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen
des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter
Beobachtung der Wachstumstrübung durch Aszites-Tumor-
Zellen und durch Dünnschichtchromatographie, abgekürzt
TLC, nach den weiter unten befindlichen Angaben bestimmt.
Die neuen Antibiotica C-15003 P-3, P-3′ und/oder P-4
wurden sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der
erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.
Diese Substanzen sind auch durch TLC festgestellt
worden. Die Fermentierungsbrühe wurde somit
durch Filtrieren oder Zentrifugieren in Zellen und Filtrat
aufgeteilt und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Äthylacetat
extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge
an 70%igem wäßrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zugegeben,
worauf man nach 1-stündigem Rühren bei 20°C die Suspension
filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt
und das erhaltene wäßrige Filtrat mit Äthylacetat extrahiert.
Jeder dieser Extrakte wurde im Volumenverhältnis 1 : 100 eingeengt
und über einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik,
Kieselgel 60 F₂₅₄, 0,25 mm, 20×20) (Lösungsmittelsystem:
Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis
von 9 : 1) der Dünnschichtchromatographie unterworfen.
Das Wirkungsvermögen wurde auf Grund der Intensität
der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537Å
beobachteten Stellen bestimmt.
Die auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugten
C-15003 P-3, P-3′ und/oder P-4 sind lipophile
und neutrale Substanzen, welche sich durch bei der Gewinnung
solcher mikrobiellen Metabolite normalerweise übliche
Trenn- und Reinigungsmethoden isolieren lassen. So kann
man so arbeiten, daß man sich die Unterschiede
zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen
bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann aber
auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener
Adsorptionsmittel, wie z. B. Aktivkohle, makroporöser,
nichtionogener Harze, Kieselgel oder Aluminiumoxyd zur
Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen
mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen.
Man kann aber schließlich auch andere Methoden oder aber
die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder
aber wiederholt anwenden.
Da, wie oben erwähnt, C-15003 P-3,
P-3′ und P-4 sowohl im Filtrat als auch in
den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit
Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches
verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion
mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder
nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle
von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion
mit einem Lösungsmittel kann nach einer der
folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode,
beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der
Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion
der Zellen und des durch Filtrieren
gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer Weise,
durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig
voneinander zu extrahieren, wird man die
folgende Methode anwenden.
Für die Extraktion des Filtrates geeignete
Lösungsmittel sind dem Prinzip nach mit Wasser nicht mischbare, organische
Lösungsmittel, wie z. B. Fettsäureester, Äthylacetat
oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone,
z. B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem
dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und
die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit wird
mittels Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser
gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf
wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel,
nämlich Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe
Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen.
Da bei der Dünnschichtchromatographie zusätzlich zum Antibiotikum
C-15003 eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt werden,
wird das Produkt I anschließend den folgenden Reinigungsverfahren
unterzogen. Dabei zeigt sich, daß eine routinemäßige
Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie,
wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der
üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd,
ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz verwendet
werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I
dient Kieselgel. Die Entwicklung erfolgt
ausgehend von Petroläther und Hexan,
während die Eluierung des Antibiotikums
C-15003 durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
nämlich Äthylacetat,
erfolgt. Man verwendet
Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05
bis 0,2 mm) als Trägermittel und führt die Säulenchromatographie
mit einer Mischung von Hexan und Äthylacetat durch,
wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird
gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die das Antibiotikum
C-15003 enthaltenden Fraktionen sammelt und unter
vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat
mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt
II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen
enthält, wird es in der nachstehend angegebenen
Weise weiter gereinigt. So wird das Produkt II
mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter
Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems
gereinigt. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem
besteht aus dem halogenierten Kohlenwasserstoff,
Chloroform, unter Zugabe eines polaren Lösungsmittels,
wie dem Alkohol Methanol.
Auf diese Weise läßt sich
das Antibiotikum C-15003 isolieren. Die Reihenfolge
der Lösungssysteme für diese erste und die zweite
Kieselgelsäule kann auch umgekehrt werden.
Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes
II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt
die Eluierung des Antibiotikum C-15003
mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol,
einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer
Alkohol wird Methanol,
und als niederes Keton
Aceton verwendet.
Man löst das rohe Produkt II in 60% wäßrigem
Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion®
HP-10 (vgl. Journal of Chemical Technology and Biotechn. Vol. 32 (1982) S. 109,
118, H. JISSAQ, S. CAZES, Thin-layer Chromatography Vol. 8, Nr. 16 (1985), S. 925-98.
Mitsubishi Chemicals Adsorbents Diaiom Data Sheet, 4 P Series S. 1-10
Oktober 1976). Diese Säule wird anschließend
mit 70%igem wäßrigem Methanol gewaschen und mit
90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Auf diese
Weise wird das Antibiotikum C-15003 aus der Säule
eluiert.
Die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen werden gesammelt
und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete
Produkt wird dann mit dem 5- bis 8-fachen Volumen Äthylacetat versetzt
und das Gemisch stehengelassen, worauf sich
Kristalle des Antibiotikums C-15003 ausscheiden. Diese
Kristalle enthalten C-15003 P-3, P-3′ und P-4. Diese
Verbindungen werden dann mit Hilfe eines Adsorptionsmittels
der oben genannten Art voneinander getrennt.
Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes
Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel,
so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert
eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so
erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Äthylacetat oder
einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch
C-15003 P-4, P-3′ und P-3 in der erwähnten Reihenfolge erhalten
werden. Nach erfolgter Dünnschichtchromatographie
werden die C-15003 P-4, P-3′ und P-3 entsprechenden Fraktionen
unter vermindertem Druck eingeengt und Äthylacetat
den Konzentraten zugegeben. Auf diese Weise erhält man die
entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet
man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz,
so kann man eine stufenmäßige Eluierung mit schwankenden
Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das
Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode
unter Verwendung von 60%igem wäßrigem Methanol
und 95%igem wäßrigem Methanol unter Zugabe
von 5% Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten
Reihenfolge C-15003 P-3, P-3′ und P-4. Nachdem
man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird
jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck
eingeengt und aus Äthylacetat zum Auskristallisieren gebracht.
Die isolierten Kristalle enthalten Äthylacetat
als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trocknen
über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70°C die
nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Auf Grund der obigen Molekularformel und der
nachstehend wiedergegebenen antimikrobiellen und tumorverhindernden
Wirksamkeitswerte wurde das neue Antibiotikum
mit den bekannten Gruppen von Antibiotika verglichen. In
der Literatur ließ sich keine dem Antibiotikum C-15003
ähnliche Gruppe feststellen. Forschungen in bezug auf Substanzen,
welche ähnliche Ultraviolettabsorptionswerte wie
das vorliegende Antibiotikum liefern könnten und pflanzlichen
oder natürlichen, organischen Ursprungs wären,
führten zu den Maytansingruppen. Insbesondere auf Grund
der in Frage kommenden Molekularformeln wurde vermutet,
daß das Antibiotikum zur Maytansingruppe von Verbindungen,
welche 2 Stickstoffatome enthalten, gehört. Maytansin
wurde als eine Pflanzenkomponente erhalten. Hierüber
wird in Journal of American Chemical Society 97, (1975), 5294
berichtet. Das Massenspektrum für Maytansin ist
das folgende:
Die Werte m/e 485, 470 und 450 für C-15003 P-3, P-3′
und P-4 führen zur Überzeugung, daß diese Verbindungen
eine identische Skelettstruktur mit jener von Maytansin
haben mit dem Unterschied in der in 3-Stellung vorhandenen
Acylgruppe. Es ergibt sich daraus eindeutig, daß die verschiedenen Komponenten des Antibiotikums
C-15003 neue Verbindungen darstellen. Werden
C-15003 P-3, P-3′ und P-4 mit einem Alkali behandelt und
durch Gaschromatographie in bezug auf die in Freiheit gesetzten
Carbonsäuren analysiert, so wird festgestellt, daß
Isobuttersäure, Buttersäure und Isovaleriansäure aus
C-15003 P-3, C-15003 P-3′ bzw. C-15003 P-4 erhältlich sind.
Die Fig. 1 zeigt die Strukturen auf Grund der obigen Daten
für C-15003 P-3, P-3′ und P-4.
Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium
wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten
Mikroorganismen mit Hilfe der Papierscheibenmethode
festgestellt. Die Filterpapierscheiben (Toyo Seisakusho-dünner Typ)
mit einem Durchmesser von 8 mm wurden jeweils mit 0,02 ml
einer 300 µg/ml Lösung von C-15003 P-3, P-3′ oder P-4 imprägniert,
worauf man diese Scheiben auf Platten anordnete,
welche mit den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft
waren, um die minimalen Hemmkonzentrationen festzustellen. Die
erzielten Resultate zeigen, daß die Antibiotika in bezug
auf die folgenden Mikroorganismen wirkungslos waren, nämlich
Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia
marcescens, Mycobacterium avium.
Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche als
Versuchsmedium 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogenphosphat,
5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g
Glucose, 15 g Agar und 1000 ml destilliertes Wasser bei
einem pH-Wert von 7,0 enthielten, die Wachstumsverhinderung
gegenüber Talaromyces avellaneus getestet. Bei diesem Testversuch
lagen die minimalen Hemmkonzentrationen bei 3 µg/ml
für C-15003 P-3 und P-3′ und 1,5 µg/ml für C-15003 P-4. Ferner
wurde der wilde Stamm von Tetrahymena pyriformis W als
Testorganismus auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g
Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt, 2 g Glucose,
1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,0, bei 28°C während 44
bis 48 Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf
das Wachstum der antibiotischen Verbindungen in bezug auf
diesen speziellen Mikroorganismus durch die Serienverdünnungsmethode
bestimmt. Die Wachstumsinhibitoren trat bei
1µg/ml für C-15003 P-3 und P-3′ und bei 0,5 µg/ml für
C-15003 P-4 ein.
Die fungizide bzw. fungistatische Wirksamkeit findet sich in der
Tabelle V. Wie aus dieser Tabelle V hervorgeht, besitzt das
Antibiotikum C-15003 eine Hemmwirkung auf das Wachstum
von Mikroorganismen, welche Pflanzenkrankheiten verursachen.
Die mit 0,02 ml einer 1000 µg/ml Lösung von C-15003
imprägnierten Filterpapierscheiben wurden auf mit den in
der Tabelle V erwähnten Mikroorganismen inokulierte Platten
gebracht.
Die therapeutischen Wirkungen von C-15003 P-3,
P-3′ und P-4, nach einer 9-tägigen, intraperitonealen Dosierung
in bezug auf P 388-Leukämie bei Mäusen (1×10⁶
Zellen/Tiere, nämlich Mäusen, wurden bestimmt. Die Resultate
haben gezeigt, daß bezüglich des lebensverlängernden
Verlaufes diese Verbindungen eine cytostatische Wirkung aufwiesen,
welche, verglichen mit einer Dosismenge von
0,00625 mg/kg/Tag, einem Wert von 200% entsprach.
Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als
Testtiere, denen man intraperitoneal C-15003 P-3, P-3′ und
P-4 injizierte, ergab sich mit diesen Antibiotika ein
LD₅₀-Wert von mehr als 0,313 mg/kg.
Wie bereits erwähnt, zeichnet sich das Antibiotikum
C-15003 durch eine starke Hemmwirkung gegenüber Fungi-
und Protozoen aus.
Darüber hinaus
übt das Antibiotikum C-15003 bei mit Tumoren behafteten
Säugetieren, z. B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung
aus.
Das Antibiotikum C-15003 kann unter Beachten seiner Toxizität
auch im Zusammenhang
mit der bakteriellen Ökologie im Boden, in
Belebtschlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit
verwendet werden. Wünscht man daher wertvolle Bakterien
aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die
Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und
Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von Belebtschlammsystemen,
wie sie bei der Behandlung von Abwässern
Verwendung finden, einschätzen, so kann man das neue Antibiotikum
dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bakteriellen
Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen
der Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäß einem besonderen
Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder festen
Medium und überdies 0,1 ml einer 10 bis 100 µg/ml-Lösung
des Antibiotikums in einer 1%igen wäßrigen Methanollösung
pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation
einleitet.
Es ergibt sich daher, daß C-15003 P-3, P-3′ und
P-4 neue Verbindungen darstellen, welche die gleiche Skelettstruktur
haben und überdies als Zwischenprodukte für
die Herstellung von anderen pharmazeutisch wertvollen Verbindungen
verwendet werden können. So kann man beispielsweise
aus dem erfindungsgemäßen Antibiotikum durch Desacylierungsreaktion
P-15003 P-0 (Maytansinol) mit einer Hydroxylgruppe
in der 3-Stellung erhalten. Da sich die Acylgruppe
in β-Stellung zur Carbonylgruppe befindet, kann man
sich der üblichen reduktiven Hydrolysereaktion bedienen.
Man kann daher mit Hilfe eines komplexen Metallhydrids,
z. B. Lithium-Aluminiumhydrid (LiAlH₄), bei niedriger Temperatur
von beispielsweise -20°C die O-Esterbindung
in der 3-Stellung hydrolytisch spalten, ohne aber andere
funktionelle Gruppen, z. B. die Carbonyl-, Epoxy-, Kohlenstoff-
Kohlenstoff-Doppelbindungen usw., zu beeinträchtigen, um
auf diese Weise zu Maytansinol zu gelangen. Die physikalischen
und chemischen Daten, welche man mit einer derweise
erhaltenen Maytansinolprobe erzielt, sind in guter Übereinstimmung
mit den Daten, welche man gemäß Kupchan et al,
The Journal of American Chemical Society 97, (1975), 5294-6295
erzielt.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende
Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils
Gew.-Teile, sofern nicht anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis
zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht
jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich
auf "Gew./Vol.", sofern nicht anderes ausgesagt wird.
Nocardia Nr. C-15003 (IFO 13726;
FERM 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Medium
(Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) gezüchtet worden war,
wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter,
welcher 40 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums
(2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% rohes Sojabohnenmehl,
1% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Polypepton, 0,3% NaCl,
0,5% CaCO₃, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte
Medium wurde während 48 Stunden bei 28°C inkubiert, um ein
Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums
wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter,
welcher 40 Vol.-Teile eines Fermentiermediums
enthielt, welches aus 5% Dextrin, 3% Maisquellflüssigkeit,
0,1% Polypepton und 0,5% Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand,
eingebracht und während 90 Stunden bei 28°C gezüchtet,
um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu
erhalten.
Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter
Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus
und C-15003 P-3 als Standardprobe festgestellt
werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von
25 µg/ml auf.
10 Vol.-Teile des gemäß Beispiel 1 erhaltenen
Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden
Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile
eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie
oben enthielt, worauf man während 48 Stunden bei 28°C brütete.
500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in
einen 50 000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl
eingetragen, welcher 30 000 Vol.-Teile Samenkulturmedium
enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30 000 Vol.-Teile/
Minute) bei 28°C züchtete und bei einem Innendruck
von 1 kg/cm² bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT)
rührte, um auf diese Weise eine Samenkultur zu erhalten.
Diese Kultur wurde zum Animpfen eines aus rostfreiem Stahl
bestehenden Tanks mit einem Fassungsvermögen von 200 000 Vol.-Teilen
verwendet, welcher 100 000 Vol.-Teile eines
Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im
obigen Beispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10%
eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung
(100 000 Vol.-Teile/Minute) bei 28°C inkubiert und bei
einem Innendruck von 1 kg/cm² während 90 Minuten bei 200 Umdrehungen
pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung
des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte
man feststellen, daß die so erhaltene Kultur einen Titer
von 25 µg/ml aufwies.
95 000 Vol.-Teile der nach den Angaben in Beispiel 1
erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-supercel®
(Johnes and Manville Products, USA) versetzt und das
Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter
filtriert, wobei 85 000 Vol.-Teile Filtrat und 32 000 Teile
feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85 000 Vol.-Teile)
wurde gerührt und mit 30 000 Vol.-Teilen Äthylacetat
extrahiert. Diese Maßnahme wurde ein weiteres Mal
wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden gesammelt,
zweimal mit jeweils 30 000 Vol.-Teilen Wasser gewaschen,
durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile
eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt
und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren
gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen
Äthylacetat verrührt, worauf die unlöslichen
Bestandteile abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde mit
10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesreplublik, 0,05
bis 0,2 mm) gerührt und das Äthylacetat unter vermindertem
Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule
(400 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 Vol.-Teilen
Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und
Äthylacetat (Mischungsverhältnis 3 : 1), 500 Vol.-Teilen
einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis
1 : 1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und
Äthylacetat (Mischungsverhältnis 1 : 3), 500 Vol.-Teilen
Äthylacetat und 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Äthylacetat
und Methanol (Mischungsverhältnis 50 : 1) eluiert,
wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt
wurde.
1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne
eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teil Äthylacetat
hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über
dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Bundesrepublik
Deutschland, 60 F₂₅₄, 0,25 mm, 20×20) liegende
Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr
17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat und
Methanol (Mischungsverhältnis 19 : 1) entwickelt. Nach erfolgter
Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (253 Å)
das gewünschte Produkt festgestellt.
Die aktiven Fraktionen Nr. 23-28 mit Rf 0,6-0,65
wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr
20 Vol.-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden jeweils
mit 150 Vol.-Teile Petroläther versetzt, wobei man 15 Teile
eines rohen Produktes II erhielt.
32 000 Teile der gemäß Beispiel 3 erhaltenen feuchten
Zellen wurden unter Rühren mit 50 000 Vol.-Teilen 70%igem
wäßrigen Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf
auf einem Druckfilter filtriert. Die Extraktion mittels
50 000 Vol.-Teilen 70%igem wäßrigem Aceton und die anschließende
Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt.
Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen
unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wäßrige
System wurde durch eine Säule von 5000 Vol.-Teilen
Diaion HP-10® hindurchgeleitet. Die
Säule wurde mit 20 000 Vol.-Teilen Wasser und 50%igem
wäßrigem Methanol gewaschen und anschließend mit 15 000 Vol.-Teilen
90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat
wurde unter vermindertem Druck auf 3000 Vol.-Teile eingeengt
und mit 3000 Vol.-Teilen Wasser und 3000 Vol.-Teilen
Äthylacetat geschüttelt. Diese Arbeitsweise wurde einmal
mehr wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt,
mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein
Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther
hinzugegeben und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren
gesammelt. Dieses Produkt wurde mittels einer Kieselgelsäure
gereinigt, wobei man 8,0 Teile rohes
Produkt II erhielt.
In 10 Vol.-Teilen Äthylacetat wurden 1,5 Teile des
nach dem obigen Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes II
gelöst und die Lösung gründlich mit 4 Teilen Kieselgel
(Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt.
Das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt.
Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 Vol.-Teilen
Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit
500 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit
500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(Mischungsverhältnis 50 : 1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung
von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20 : 1) und
500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol
(10 : 1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von
25 Vol.-Teilen gesammelt.
Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden
unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde
mit 0,05 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch
der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem:
Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis
9 : 1) unterworfen.
Die bei 2537 Å absorbierenden Fraktionen Nr. 39
und 40 der Zone von RF 0,50-0,60 wurden
gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Der Rückstand wurde hierauf mit 2 Vol.-Teilen
Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen,
worauf man 0,150 Teile Antibiotikum C-15003 in Form von
Kristallen erhielt.
Die obigen Kristalle des Antibiotikums C-15003
(0,150 Teile) wurden in 15 Vol.-Teilen Methanol gelöst
und dann mit 0,300 Teilen Natriumchlorid und 15 Vol.-Teilen
Wasser versetzt. Eine mit 200 Vol.-Teilen Diaion
PH-10® gefüllte Säule wurde mit
600 Vol.-Teilen 50%igem wäßrigem Methanol, enthaltend
5% Natriumchlorid, beschickt. Die so hergestellte Lösung
wurde durch eine Säule geführt und eine Gradienten-Eluierung
unter Verwendung von 1500 Vol.-Teilen 60%igem
wäßrigem Methanol, enthaltend 5% Natriumchlorid, und
1500 Vol.-Teilen 95%igem wäßrigem Methanol durchgeführt.
Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils
15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion mittels Kieselgel
durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen
145 bis 153 enthielten C-15003 P-3, die Fraktionen
167 bis 180 enthielten C-15003 P-3′ und P-4 und die Fraktionen
185 bis 190 enthielten C-15003 P-4.
Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und
durch Zugabe von 50 Vol.-Teilen Wasser und 100 Vol.-Teilen
Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter
geschüttelt und die wäßrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem
Waschen mit jeweils 50 Vol.-Teilen Wasser wurde die
Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
eingeengt und stehen gelassen. Auf diese Weise
erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese
Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet:
C-15003 P-3 | |
0,070 Teile | |
C-15003 P-3′, P-4 | 0,018 Teile |
C-15003 P-4 | 0,015 Teile |
Die gemischten Kristalle von C-15003 P-3′ und P-4
(0,018 Teile) wurden in 0,3 Vol.-Teilen Äthylacetat gelöst
und auf einer Linie in einem Abstand von 2,5 cm über
dem unteren Rande einer Kieselgelglasplatte (Merck, Deutsche
Bundesrepublik, Kieselgel 60 F₂₅₄ 0,25 mm, 20×20)
aufgetragen, worauf man mit einer Mischung von Äthylacetat
und Methanol (Mischungsverhältnis 19 : 1) entwickelte. Nach
dieser Entwicklung auf ungefähr 18 cm wurde die Absorptionsbande
bei Rf 0,68 (P-4) und Rf 0,65 (P-3′) abgeschabt
und jede Bande unabhängig zweimal mit jeweils wenig Wasser
enthaltendem Äthylacetat extrahiert. Der entstandene
Äthylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet. unter vermindertem Druck
eingeengt und stehen gelassen.
0,010 Teile der Kristalle von C-15003 P-4 und
0,003 Teile der Kristalle von C-15003 P-3′ wurden aus den
Fraktionen mit Rf 0,68 bzw. Rf 0,65 erhalten.
1000 Vol.-Teile der Kultur gemäß Beispiel 2
wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen
von 200 000 Vol.-Teilen aufwies und 100 000 Vol.-Teile
eines Samenkulturmediums enthielt, geimpft und
das angeimpfte Medium unter Belüftung (100 000 Vol.-Teile/
Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute
während 48 Stunden bei 28°C bebrütet, um eine Samenkultur
zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem
Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Vol.-Teilen,
welcher 1 000 000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums
gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt,
bei einer Transplantationsrate von 10% eingetragen. Die
Züchtung erfolgte unter Belüftung (1 000 000 Vol.-Teile/Minute)
bei 28°C während 90 Stunden unter Rühren bei 120
Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck
von 1 kg/cm². Die so entstandene Kultur wies beim Testen
gemäß der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 µg/ml
auf.
900 000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit
wurden mit 900 000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach
1-stündigem Rühren mit 20 000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnes &
Manville, USA) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter
gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert.
1 700 000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit
500 000 Vol.-Teilen Wasser versetzt und das Gemisch in einer
Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Inc., USA)
mit 1 000 000 Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Die
Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe
von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem
Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther
versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren
gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt
man 68 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses
rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen
3, 4 und 5 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise
erhielt man 9,5 Teile C-15003 P-3, 0,300 Teile C-15003 P-3′
und 2,5 Teile C-15003 P-4.
In 1 Vol.-Teil Tetrahydrofuran wurden 0,015 Teile
des Antibiotikums C-15003 in Form der gemäß Beispiel 5
erhaltenen Kristalle gelöst, worauf man auf -5°C kühlte und
0,012 Teile Lithiumaluminiumhydrid hinzugab. Die Mischung
wurde 2 Stunden stehen gelassen, nach der Zugabe
von 0,5 Vol.-Teilen einer 1%igen wäßrigen Schwefelsäurelösung
wurde das Reaktionsgemisch mit 2 Vol.-Teilen
Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde
mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Hierauf erfolgte eine präparative Dünnschichtchromatographie
mit Kieselgel, worauf die Zone mit Rf 0,25 bis 0,3
abgeschabt wurde. Dann wurde mit wenig Wasser enthaltendem
Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen,
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
unter vermindertem Druck eingeengt, worauf sich Kristalle
ausschieden. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt
und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man
0,010 Teile P-15003 P-0 vom Schmelzpunkt 174°C.
Elementaranalyse für C₂₈H₃₇ClN₂O₈:
Berechnet: C 59,52; H 6,60; N 4,96; Cl 6,27;
Gefunden: C 59,65; H 6,58; N 5,02; Cl 6,51.
IR: 1715, 1670, 1580 (cm-1)
UV (nm): 232(32 750), 244 (sh, 30 850), 252 (31 650), 281 (5750), 288 (5700).
Berechnet: C 59,52; H 6,60; N 4,96; Cl 6,27;
Gefunden: C 59,65; H 6,58; N 5,02; Cl 6,51.
IR: 1715, 1670, 1580 (cm-1)
UV (nm): 232(32 750), 244 (sh, 30 850), 252 (31 650), 281 (5750), 288 (5700).
Bezüglich der Eigenschaften war dieses Produkt
mit Maytansinol identisch.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika (C-15003)
der folgenden allgemeinen Formel:
worin R den Rest
darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus
Nocardia Nr. C-15003, hinterlegt beim Institute
for Fermentation, Osaka mit der Hinterlegungsnummer
IFO 13726=ATCC 31281, in einem üblichen Kulturmedium,
welches assimilierbare Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen
enthält, unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 35°C
und einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 so lange
züchtet, bis die Antibiotika darin angereichert sind,
worauf die Trennung und Isolierung der Einzelbestandteile
unter Kontrolle der Anreicherung durch mikrobiologische
oder physikalische Methoden erfolgt,
- - indem man das Kulturfiltrat einer Lösungsmittelextraktion mittels Ethylacetat unterzieht, den Extrakt einer Gradienten-Chromatographie an Kieselgel mittels Hexan-Ethylacetat (3∼1 : 1∼3) als Eluent, einer Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Chloroform- Methanol (50∼10 : 1) als Eluent und dann einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP10 Säule (einem makro-porösen Styrol-Divinylbenzol- Copolymeren mit hydrophoben unpolaren, nicht- ionischen Eigenschaften und einer spezifischen Oberfläche von 501,3 m²/g und einem Porenvolumen von 0,64 ml/g, welches von Mitsubishi Chemical Industries vertrieben wird) mittels Methanol- Wasser (1,5∼1,9 : 1) als Eluent unterzieht, oder
- - indem man die mikrobiellen Zellen einer Lösungsmittelextraktion mittels Aceton-Wasser (7 : 3) unterzieht, den Extrakt einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP-10 Säule mittels Wasser- Methanol (9 : 1) als Eluent, einer Lösungsmittelextraktion mittels Ethylacetat als Eluent, einer Gradienten- Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Hexan- Ethylacetat (3∼1 : 1∼3) als Eluent, einer Säulenchromatographie an Kieselgel mittels Chloroform- Methanol (50∼10 : 1) als Eluent und dann einer Säulenchromatographie an einer Diaion HP-10 Säule mittels Methanol-Wasser (1,5∼19 : 1) als Eluent unterzieht,
wobei man die Fraktionen der Verbindungen, worin
R -COCH(CH₃)₂ (P-3) bedeutet und die Verbindung,
worin R -COCH₂CH(CH₃)₂ (P-4) bedeutet und eine
Mischung der Verbindungen, worin R -COCH₂CH₂CH₃
(P-3′) und (P-4) ist, nacheinander auffängt, getrennt aufarbeitet
und daraus die Einzelverbindungen auf übliche Weise isoliert, erhält und
man weiterhin die Mischung (P-3′, P-4) einer üblichen
Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterzieht,
wobei eine Trennung mittels UV-Licht kontrolliert
und (P-3′) und (P-4) durch Eluieren und
anschließende Isolierung erhalten werden.
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der
folgenden Formel:
dadurch gekennzeichnet, daß man den Antibiotika C-15003-
Komplex, bestehend aus folgenden Verbindungen der
allgemeinen Formel:
worin R den Rest
bedeutet, erhalten durch Züchtung von Nocardia Nr.
C-15003 gemäß Anspruch 1 als Rohprodukt einer reduktiven
Hydrolyse bei -20°C bis 0°C mittels eines komplexen
Metallhydrids unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man mit Lithiumaluminiumhydrid als Metallhydrid
und Tetrahydrofuran als Lösungsmittel arbeitet, mit
Alkylacetat extrahiert und schließlich eine Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel/Äthylacetat/
Wasser durchführt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP52037166A JPS6034556B2 (ja) | 1977-03-31 | 1977-03-31 | 抗生物質c−15003 |
US05/811,448 US4162940A (en) | 1977-03-31 | 1977-06-29 | Method for producing Antibiotic C-15003 by culturing nocardia |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2746209A1 DE2746209A1 (de) | 1978-10-19 |
DE2746209C2 true DE2746209C2 (de) | 1990-10-31 |
Family
ID=26376254
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19772746209 Granted DE2746209A1 (de) | 1977-03-31 | 1977-10-14 | Neues antibiotikum und verfahren zu dessen herstellung |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
CA (1) | CA1107212A (de) |
CS (1) | CS214749B2 (de) |
DE (1) | DE2746209A1 (de) |
DK (1) | DK458877A (de) |
ES (2) | ES463207A1 (de) |
GB (1) | GB1586688A (de) |
GR (1) | GR66051B (de) |
HU (1) | HU178359B (de) |
IE (1) | IE46064B1 (de) |
IT (1) | IT1094308B (de) |
NL (1) | NL188102C (de) |
PH (2) | PH13381A (de) |
PL (2) | PL122289B1 (de) |
PT (1) | PT67854B (de) |
SE (2) | SE442873B (de) |
YU (2) | YU245377A (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19940131B4 (de) * | 1998-08-24 | 2004-12-02 | Pfefferle, Christoph, Dr. | Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5562090A (en) * | 1978-10-27 | 1980-05-10 | Takeda Chem Ind Ltd | Novel maytansinoid compound and its preparation |
JPS55102583A (en) * | 1979-01-31 | 1980-08-05 | Takeda Chem Ind Ltd | 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound |
JPS5645483A (en) * | 1979-09-19 | 1981-04-25 | Takeda Chem Ind Ltd | C-15003phm and its preparation |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1336399A (en) * | 1971-06-24 | 1973-11-07 | Lepetit Spa | 3-formylrifamycin sv derivatives |
DE2241418A1 (de) * | 1972-08-23 | 1974-03-07 | S Morris Kupchan | Antileukaemische ansamakrolide |
-
1977
- 1977-10-04 PH PH20297A patent/PH13381A/en unknown
- 1977-10-11 GR GR54548A patent/GR66051B/el unknown
- 1977-10-12 YU YU02453/77A patent/YU245377A/xx unknown
- 1977-10-13 NL NLAANVRAGE7711274,A patent/NL188102C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-10-13 SE SE7711542A patent/SE442873B/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-10-13 HU HU77TA1459A patent/HU178359B/hu unknown
- 1977-10-13 CS CS776678A patent/CS214749B2/cs unknown
- 1977-10-14 CA CA288,731A patent/CA1107212A/en not_active Expired
- 1977-10-14 DK DK458877A patent/DK458877A/da not_active Application Discontinuation
- 1977-10-14 ES ES463207A patent/ES463207A1/es not_active Expired
- 1977-10-14 GB GB42822/77A patent/GB1586688A/en not_active Expired
- 1977-10-14 IE IE2101/77A patent/IE46064B1/en unknown
- 1977-10-14 DE DE19772746209 patent/DE2746209A1/de active Granted
- 1977-10-15 PL PL1977201541A patent/PL122289B1/pl unknown
- 1977-10-15 PL PL1977221358A patent/PL124349B1/pl unknown
-
1978
- 1978-03-30 PT PT67854A patent/PT67854B/pt unknown
- 1978-03-30 IT IT21818/78A patent/IT1094308B/it active
- 1978-07-31 ES ES472230A patent/ES472230A1/es not_active Expired
-
1979
- 1979-02-20 PH PH22216A patent/PH15985A/en unknown
-
1982
- 1982-08-17 YU YU01785/82A patent/YU178582A/xx unknown
-
1983
- 1983-05-03 SE SE8302517A patent/SE446004B/sv not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19940131B4 (de) * | 1998-08-24 | 2004-12-02 | Pfefferle, Christoph, Dr. | Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE8302517D0 (sv) | 1983-05-03 |
PH15985A (en) | 1983-05-18 |
PH13381A (en) | 1980-03-25 |
CA1107212A (en) | 1981-08-18 |
PT67854B (en) | 1980-05-05 |
NL188102C (nl) | 1992-04-01 |
SE8302517L (sv) | 1983-05-03 |
SE7711542L (sv) | 1978-10-01 |
SE446004B (sv) | 1986-08-04 |
PL122289B1 (en) | 1982-07-31 |
NL188102B (nl) | 1991-11-01 |
PT67854A (en) | 1978-04-01 |
YU245377A (en) | 1983-01-21 |
DK458877A (da) | 1978-10-01 |
DE2746209A1 (de) | 1978-10-19 |
IE46064B1 (en) | 1983-02-09 |
GB1586688A (en) | 1981-03-25 |
PL201541A1 (pl) | 1978-10-09 |
ES472230A1 (es) | 1979-04-01 |
IT7821818A0 (it) | 1978-03-30 |
IT1094308B (it) | 1985-07-26 |
NL7711274A (nl) | 1978-10-03 |
IE46064L (en) | 1978-09-30 |
YU178582A (en) | 1984-08-31 |
PL124349B1 (en) | 1983-01-31 |
GR66051B (de) | 1981-01-14 |
CS214749B2 (en) | 1982-05-28 |
SE442873B (sv) | 1986-02-03 |
ES463207A1 (es) | 1979-01-01 |
HU178359B (en) | 1982-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CH638194A5 (de) | Esterastin, eine neue physiologisch wirksame substanz und deren herstellung. | |
CH640270A5 (de) | Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-3. | |
DE3521436C2 (de) | ||
EP0196628B1 (de) | Ein neues Ansamycin-Antibiotikum, ein mikrobielles Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel | |
DE2746253C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Maytansinol und dessen Derivaten | |
DE3234203C2 (de) | ||
DE2746209C2 (de) | ||
DE2839668C2 (de) | ||
DE2833689C2 (de) | ||
DE3003359C2 (de) | ||
CH640269A5 (de) | Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-4. | |
CH646712A5 (de) | Istamycine und deren herstellung. | |
DE2450411C3 (de) | ||
CH637137A5 (en) | Antibiotic and process for its preparation | |
DE2725163C2 (de) | ||
DE2817113A1 (de) | Hydroxynovobiocinartige verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung | |
DE69217000T2 (de) | Antibakterielle Verbindung BE-24566B | |
DE2746252A1 (de) | Antibiotikum c-15003 enthaltendes arzneimittel zur behandlung von tumore aufweisenden warmbluetern | |
EP0660825B1 (de) | Entzündungshemmende makrolactame (cyclamenol) | |
EP0182208B1 (de) | Urdamycine, Verfahren und Streptomyceten-Stamm zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
DE2039990C2 (de) | Neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin I bis VI), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung | |
DE2813416C2 (de) | Neue Antibiotika C-14919 E-1 und E-2 und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE69005899T2 (de) | Karzinostatisches oder antitumorales Antibiotikum, Conagenin, seine Herstellung und seine Verwendungen. | |
EP0259778B1 (de) | Antibiotisch wirksames Gentisinsäurederivat | |
EP0026485B1 (de) | Herbicolin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende Mittel |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |