CS214881B2 - Method of making the maytanacine or maytanasinol propionate - Google Patents

Description

214881214881

Vynález se týká způsobu výroby maytan-sinolu, maytanacinu a propionátu maytan-sinolu, které mají protinádorovou účinnost. Jé známo, že z uvedených sloučenin vy-kazují maytacin a propionát maytansinoluvysokou protinádorovou účinnost [Kupchanse spolupracovníky: Journal cf the Ameri-can Chemical Society 97, 5294 (975)].BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing maytansinol, maytanacin and maytanosinol propionate having antitumor activity. It is known that maytacin and propionate exhibit maytansinol high antitumor activity from these compounds [Kupchanse co-workers: Journal cf the Ameri- can Chemical Society 97, 5294 (975)].

Naproti tomu samotný maytansinol mápouze slabou protinádorovou účinnost (vizshora uvedený odkaz] ale je cenným mezi-produktem, ze kterého se dá snadno vyrá-bět maytanacin, propionát maytansinolu arůzné další deriváty.In contrast, maytansinol alone, except for weak antitumor activity (see above), is a valuable intermediate product from which maytanacin, maytansinol propionate and other derivatives can be readily produced.

Maytansinol a maytanacin byly izoloványKupchanem a spolupracovníky (viz výše)z kůry rostliny Putterlickia verrucosa (rost-lina patřící do rodu Maytenus) ve velminízkých výtěžcích, asi 0,025 mg prvé látkya 0,36 mg polsléze uvedené látky z 1 kg vy-sušené kůry rostliny. Pokud se týká propio-nátu maytansinolu, byl získán chemicky pro-pionací maytansinolu.Maytansinol and maytanacin were isolated by Kupchan and co-workers (see above) from the bark of the Putterlickia verrucosa plant (plant belonging to the genus Maytenus) in large-scale yields, about 0.025 mg of the first substance and 0.36 mg of the semi-leach of said substance from 1 kg of dried plant bark. Regarding the propionate of maytansinol, it was obtained chemically by propelling maytansinol.

Autoři vynálezu shromažďovali různévzorky půdy a zkoumali antibiotika produ-kovaná mikroorganismy izolovaných ze zmí-něných vzorků a nalezli, že některé taktoizolované mikroorganismy mají schopnosthrOmadit maytansinol, maytanacin nebo pro-pionát maytansinolu v kultivačním prostře-dí a že tyto mikroorganismy patří do roduNocardia a že zmíněné sloučeniny lze rov-něž získávat kultivací různých mutantů od-vozelných od těchto mikroorganismů vevhodném živném prostředí za vhodnýchpodmínek.The inventors collected various soil samples and investigated the antibiotics produced by the microorganisms isolated from the samples and found that some of the isolated microorganisms possess the ability to produce omtitin maytansinol, maytanacin or maytansinol propionate in the culture medium and that these microorganisms belong to the genus Nocardia and that the compounds can also be obtained by culturing various mutants derived from these microorganisms in a suitable culture medium under appropriate conditions.

Na základě těchto nálezů byly provedenydalší studie, které vedly ke kompletaci to-hoto vynálezu.Based on these findings, further studies have been conducted to complete this invention.

Vynález se týká způsobu výroby maytan-sinolu, maytanacinu nebo propionátu may-tansinolu, který se vyznačuje tím, že semikroorganismus kmene Nocardia číslo C--15003 (IFO 13726) kultivuje v živném, pro-středí obsahujícím asimilovatelné zdroje u-hlíku a stravitelné zdroje dusíku při teplotě12 až 38 toC tak dlouho, dokud se maytan-sinol, maytanacin nebo propionát maytansi-nolu nenahromadí ve zmíněném prostředí,a že se poté uvedené sloučeniny izolují zapoužití rozpouštědel, adsorbentů a/neboiontoměničQvých pryskyřic.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the preparation of maytanosinol, maytanacin or maytansinol propionate, characterized in that the Nocardia strain C-15003 (IFO 13726) cultures in a nutrient medium comprising assimilable sources of digestible and digestible nitrogen at 12 to 38 ° C until maytanine, maytanacin or maytansinol propionate accumulate in said medium, and that said compounds are then isolated using solvents, adsorbents and / or ion exchange resins.

Podle dosud známého způsobu se shorauvedené sloučeniny dají získávat z rostlin,avšak tento způsob není výhodný, protožese k uvedenému účelu dají použít pouze ur-čité rostliny a protože je třeba vysokýchnákladů a dlouhé doby k výrobě v každémstadiu postupu, jakými jsou například růstrostlin, jejich kácení, sušení a mletí kůry,eixtrakce a čištění produktu. Výtěžky jsoukromě toho mimořádně nízké.According to the prior art, the compounds mentioned can be obtained from plants, but this method is not advantageous since only certain plants can be used for this purpose and because high loads and long production times are needed in each process, such as plants, their felling. , drying and grinding the bark, eixtrating and purifying the product. In addition, extremely low yields.

Naproti tomu způsob podle vynálezu lzeprovádět snadno a hladce kultivací vhod-ných mikroorganismů, a je-li třeba, lze vy-rábět velká množství uvedených sloučenin.In contrast, the process of the invention can be carried out easily and smoothly by culturing suitable microorganisms and, if desired, large amounts of said compounds can be produced.

Způsob podle vynálezu, je prvním příkla- dem, jak získávat zmíněně'sloučeniny jakometabolity mikroorganismů, a lze konstato-vat, že je vynikající metodou k jejích pří-pravě1.. , ; íThe process of the invention is the first example of how to obtain said compounds as metabolites of microorganisms, and can be said to be an excellent method for its preparation. and

Jako příklad mikroorganismu, kterého lzepoužít při způsobu- podle vynálezu, lze uvéstkmen aktinomycet číslo C-15003, který bylizolován z půdy i’ž jiných vzorků při skre-eningu mikroorganismů produkujících zmí-něná antibiotika. ;An example of a microorganism to be used in the method of the present invention is the actinomycene strain C-15003, which has been isolated from soil and other samples by screening microorganisms producing said antibiotics. ;

Mikrobiologické vlastnosti kmene čísloC-15003 byly stanoveny analogickými postu-py, jak jsou popsány Schirlingem & Gottlie-bem [International Journal of SystematicBacteriology 18, 313—340 [1966]]. Výsledkypozorování prováděných během 21 dnů přiteplotě 28 °C jsou uvedeny níže. 1 j Morfologické znakyThe microbiological properties of strain No. C-15003 were determined by analogous procedures as described by Schirling & Gottlie-bem [International Journal of Systematic Bacteriology 18, 313-340 [1966]]. The results of observations performed over 21 days at 28 ° C are shown below. 1 j Morphological characters

Vegetativní mycelium roste dobře a vyvíjíse ve formě rozvětvených vláken, a to jakna agaru, tak tekutém živném prostředí.Četné hyfy mají průměr 0,8—1,2 μία a v ně-kterých případech se mohou rozpadat načástečky podobající se tyčinkovitým bakte-riím nebo krátkým rozvětveným hyfám.Kmen rdste dobře na různých taxonoímic-kých půdách, přičemž vzdušné mycelium setvoří na povrchu vegetativního mycelia ačasto tvoří útvary podobné koremiu (svaz-ky konidioforů o rozměrech 50-200 X 200--1000 ^m), na kterých je umístěno budoucívzdušné mycelium. Četná vzdušná myceliajsou zprohýbaná, přímá nebo volně spirálo-vitá, jak byl útvar určen při různých pří-ležitostech.The vegetative mycelium grows well and develops in the form of branched fibers, both agar and liquid nutrient. Numerous hyphae have a diameter of 0.8-1.2 microns, and in some cases rod-like bacteria may disintegrate, or short branched hyphae.The strain can be well on different taxonomic soils, where the airy mycelium forms on the surface of the vegetative mycelium and often forms coremate-like formations (bundles of conidiophores of 50-200 X 200--1000 ^ m) future air mycelium. Numerous airy mycelia are wavy, straight, or loosely spiraling, as the department was designed for on various occasions.

Mikroskopické hodnocení zralých kulturukazuje, že jen v řídkých případech se navláknech objevují buňky podobné konidiím,zatím co buněčné suspenze získané z po-vrchů zmíněných kultur obsahují, jak bylozjištěno mikroskopicky, četná protáhlá elip-soldní (0,8—1,2 Tím X 4,8-6,8 μπι) a elip-soldní (0,8—1,2 μία, X 1,0—2,0 μΐη] tělískapodobající se arthrosporám. Při pozorování pomocí elektronovéhomikroskopu bylo zjištěno, že tato tělískamají hladký povrch. 2) Složky buněkMicroscopic evaluation of mature cultures shows that conidial-like cells appear only rarely, whereas cell suspensions from the cultures of these cultures contain, as determined microscopically, numerous elongated elip-solders (0.8-1.2 Team X4) , 8-6.8 μπι) and ellipsoidal (0.8-1.2 μία, X 1.0-2.0 μΐη) arthrospore-like bodies were observed. ) Cell components

Kmen byl kultivován za třepání na modi-fikované ISP živné půdě číslo 1 při 28 °Cpo dobu 66—90 hodin a po uvedené doběbyly buňky odděleny a propláchnuty. Veš-keré získané buňky byly poté hodnocenymetodou posanou B. Beckerem a spolupra-covníky (Applied Microbiology 12, 421(1964]] a metodou popsanou Μ. P. Leche-valierem [Journal of Laboratořy and Clini-cal Medicine 71, 934 (1968)] na obsah ky-seliny diaminojpimelové a na složení cukrů.Bylo nalezeno, že prvá látka je přítomnav meso-formiě, a byly detegovány stopy lá-tek, které odpovídaly galaktolse a arabinose. 214381 3) Charakteristické znaky na různýchtaxonomických živných půdáchThe strain was cultured with shaking on a modified ISP broth number 1 at 28 ° C for 66-90 hours and after that time the cells were separated and rinsed. All cells obtained were then evaluated by the method of B. Becker and co-workers (Applied Microbiology 12, 421 (1964)) and the method described by P. Leche-valier [Journal of Laboratories and Clini-cal Medicine 71, 934 (1968) It was found that the first substance was present in meso-formia, and traces of galactol and arabinose-related substances were detected 214381 3) Characteristics on different taxonomic nutrient media

Kmen vykazuje poměrně dobrý růst narůzných živných půdách, přičemž v počá-tečních fázích kultivace je vegetativní my-celium bezbarvé až bledě žluté a v pozděj-ších fázích světle žlutohnědé až žlutohnědé.V různých taxonomických prostředích pro-dukuje kmen rozpustná barviva, žlutá ažžlutohnědá. Vzdušné mycelium je prachové,obvykle středního růstu, bílé až žluté nebosvětle žlutohnědé. Charakteristické znakykmene na různých talxonomických půdáchjsou uvedeny v tabulce 1.The strain shows relatively good growth of various nutrient media, with vegetative mycelium being colorless to pale yellow in the early stages of cultivation, and pale yellowish-yellow-brown in later stages. The strain exhibits soluble dyes, yellow to yellow-brown in various taxonomic environments. The air mycelium is dusty, usually medium growth, white to yellow or light yellow-brown. The characteristic features of the various talxonomic soils are shown in Table 1.

Tabulka 1Table 1

Kultivační charakteristické znaky kmenečíslo C-15O03 na různých taxonomických pů-dách A) Nitrátový agar se sacharosou: Růst (G): bujný, barva melounověžlutá (3 ia)* až jantarová (3 lc)*,tvorba tělísek podobných koremiuVzdušné mycelium (AM): sporé, bíléCultivation traits strain C-15O03 on different taxonomic origins A) Sucrose nitrate agar: Growth (G): lush, melon-yellow (3 ia) * to amber (3 lc) *, corium-like bodies formationAir mycelium (AM) : Sparse, White

Rozpustná barviva (SP): žádné nebosvětle žlutohnědé B) Nitrátový agar s glycerolem: G: střední , barva světlé slonové kos-ti [2 ca) *, tvorba tělísek podobnýchkoremiu AM: střední, bíléSp: žádné C) Asparaginový agar s glukosou: G: střední, barva aksamitnlku (3 pa)*až jasně žlutá (2 pa) * AM: sporé, bíléSP: žluté (2 paj* D) Asparaginový agar s glycerolem: G) střední, barva světlé slonové kosti (2 ca] *, tvorba útvarů podobnýchkoremiu AM: sporé, bílé SP: žádné E) Škrobový agar G: Střední, barva světlé slonové kcstl (2 ca] * až barva světlé kukuřice (2ea) *, tvorba útvarů podobných ko-remiu AM: hojné, barva světlé slonové kosti(2 ca] * SP: žádné F) Živný agar: G: střední, barva světlé slonové kcsti(2 ca) * až starobylé žlutí (2 ga) *,tvorba útvarů podobných koremiuAM: sporé, bílé SP: žádné G) Kalciummalátový agar: G: střední, barva světlé slonové kcsti(2 ca) * až barva světlé kukuřice (2ea) *, tvorba útvarů podobných ko-remiu AM: střední,, barvy bílé až barvy švět-lé s’onové kosti (2 ca) * SP:žádné H) Agar s kvasničným extraktem a slado-vým extraktem: G: střední, barva jantarová (3 lc) *až jasně žlutá (3 la) *, tvorba útva-rů podobných koremiu AM: střední, barvy bílé až barvy svět-lé slonové kosti (2 ca) * SP: žádné I) Agar s ovesnou moukou: G: střední, barva světlé slonové kosti(2 ca) * až starobylé žluti (2 ga) *,tvorba útvarů podobných koremiuAM: sporý, barvy bílé až světle žlutéSP:žádné J) Peptonový agar s kvasničným extraktema železem: G: střední, barva starobylé žlutí (2ga) * AM: žádné SP: starobylá žluť (2 ga) * K) Tyrosinový agar: G: střední, barva světlé slonové kosti (2 ca) * až melounové žlutí (3 ea) tvorba útvarů podoných koremiu 214881 AM: střední, barvy bílé až barvy svět-lé slonové kosti (2 ca] * SP: hnědorůžové (3 ie] * *] Označení barev podle příručky ColorHarmony Manual, 4. vydání (vydavatelContainer Corporation of America, 1958] 4) Fyziologické vlastnostiSoluble dyes (SP): none or light yellow-brown B) Nitrate agar with glycerol: G: medium, bright elephant color [2 ca] *, formation of cortex-like bodies AM: medium, white Sp: no C) Asparagine glucose agar: G : medium, color aksamitlka (3 pa) * to bright yellow (2 pa) * AM: sparse, whiteSP: yellow (2 paj * D) Asparagine agar with glycerol: G) medium, light ivory color (2 ca) *, formation of AM-sparse, white SP: no E) starch agar G: medium, bright elephant kcstl (2 ca) * to bright corn color (2ea) *, formation of AM-like coats: abundant, bright elephant bone (2 ca] * SP: none F) Nutrient agar: G: medium, ivory color (2 ca) * to ancient yellow (2 ga) *, coremius-like formationAM: sparse, white SP: none G) Calcium malate agar: G: medium, light ivory color (2 ca) * to light maize color (2 (ea) *, formation of AM-like structures: medium, white to glaucoma (2 ca) * SP: no H) yeast extract and malt extract: G: medium, color amber (3 lc) * to bright yellow (3 l) *, formation of coremate-like formations AM: medium, white to light ivory color (2 ca) * SP: none I) oatmeal agar: G: medium, ivory color (2 ca) * to ancient yellow (2 g) *, coremius-like formationAM: sparse, white to pale yellow colorSP: none J) Pepton agar with iron extract: G: medium, color ancient yellow (2ga) * AM: no SP: ancient yellow (2 ga) * K) Tyrosine agar: G: medium, bright ivory color (2 ca) * to yellow melon (3 ea) corium formation 214881 AM: medium, white to ivory colors (2 ca] * SP: brown-pink (3 ie] * *] ColorHarmony Manual, 4th edition (published by Container Corporation of America, 1958) 4) Physiological properties

Fyziologické vlastnosti kmene jsou uve-deny v tabulce 2. Kmen roste v rozmezí tep-lot 12—38 °C. Rozsah teploty, ve kterémdochází k dobrému vzdušnému růstu naajgaru (ISP číslo 2] jest 20—35 %C.Tabulka 2The physiological properties of the strain are shown in Table 2. The strain grows in the temperature range of 12-38 ° C. The temperature range in which the good air growth of naajgar (ISP number 2) is 20-35% C.Table 2

Fyziologické vlastnosti kmene číslo C-15003Physiological properties of strain number C-15003

Rozmezí teplot pro růst: 12—38 °CTemperature range for growth: 12-38 ° C

Rozmezí teplot pro vzdušný růst 12—35 °CZtekucování želatiny: pozitivníTemperature range for air growth 12—35 ° Gelatinization: positive

Hydrolýza škrobu: pozitivníStarch Hydrolysis: Positive

Redukce dusičnanů: pozitivníNitrate reduction: positive

Peptonizace mléka: pozitivníMilk Peptonization: positive

Koagulace mléka: negativníMilk coagulation: negative

Rozklad kaseinu: pozitivníCasein degradation: positive

Tvorba melaninových barviv: negativní (peptonový agars kvasničným extraktema železem)pozitivní(tyrosinový agar)Formation of melanin dyes: negative (peptone agars with yeast extracts iron) positive (tyrosine agar)

Rozklad tyrcsinu: pozitivníTyrsine decomposition: positive

Rozklad xanthinu: negativníXanthine decay: negative

Rozklad hypclxanthinu: negativníHypclxanthin decomposition: negative

Tolerance vůči lysozymu: pozitivníTolerance to lysozyme: positive

Tolerance vůči chloridu sodnému: 2 % 5) Využívání různých zdrojů uhlíkuSodium Chloride Tolerance: 2% 5) Use of Different Carbon Sources

Využívání různých druhů uhlíku kmenemC-15003 bylo· sledováno za použití prostředípopsaného Pridhamem a Gottliebem [Jour-nal of Bacterioilogy 58, 107 (1948)] a zapoužití základního živného prostředí o stej-ném složení, ke kterému bylo přidáno 0,1procenta kvasničného extraktu. Získanéspektrum je uvedeno v následující tabulce 3.The use of different carbon species of strain C-15003 was investigated using the environment described by Pridham and Gottlieb [Joural of Bacterioilogy 58, 107 (1948)] and the use of a basic nutrient of the same composition to which 0.1% yeast extract was added. The spectrum obtained is shown in Table 3 below.

Tabulka 3Table 3

Využívání různých zdrojů uhlíku kmenem číslo C-150Ói3Utilization of various carbon sources by strain number C-150Ói3

Zdroj uhlíku Růst Zdroj uhlíku Růst D-xylóza + ++* rafinóza + + * L-arahinóza + + melibioza + + D-glukóza ++ ++ i-inositol D-galaktéza + + D-sorbitol — — D-frukťóza 4—1—1—1—h D-mannitol 4-4- 4-4- L-rhamnóza + + glycerol - + D-mannóza 4—1—1—1—H rozpustný škrob + 4- sacharóza +4- +4- kontrola laktóza maltóza + + trehalóza . . 4- 4-4- kvasničného extraktu *) Základní živné prostředí s přídavkem 0,1 %Carbon source Growth Carbon source D-xylose growth + ++ * raffinose + + L-arahinose + + melibiose + + D-glucose ++ ++ i-inositol D-galactose + + D-sorbitol - - D-fructose 4— 1—1—1 — h D-mannitol 4-4- 4-4- L-rhamnose + + glycerol - + D-mannose 4—1—1—1 — H soluble starch + 4-sucrose + 4- + 4- control lactose maltose + + trehalose. . 4- 4-4- yeast extract *) Basic medium with 0.1% addition

Poznámka: +++ bujný růst++ dobrý růst + růst+ slabý růst— žádný růst 6) Další charakteristické znakyNote: +++ lush growth ++ good growth + growth + weak growth - no growth 6) Other characteristics

Buňky byly vypěstovány způsobem popsa-ným1 výše ad 2) a DNA byla připravena způ-sobem popsaným J. Mermurem a spolupra-covníky [Journal of Molecular Biology, 3, 208 (1961)]. Obsah G—C (guanin-cytosin)v DNA byl nalezen asi 71 mol %.Cells were grown as described in Example 2 above and DNA was prepared as described by J. Mermur and co-workers [Journal of Molecular Biology, 3, 208 (1961)]. G-C (guanine-cytosine) content in DNA was found to be about 71 mol%.

Gramové barvení vegetativního· myceliatohoto kmene bylo pozitivní.Gram staining of the vegetative mycelium was positive.

Shora uvedené charakteristické znakyčíslo C-15003 byly srovnány s popisy uve-denými v S. A. Waksmanově monografii„The Actinomycetes”, svazek 2 (vydavatelWilliams and Wilkins Co., 1961), s popisy v příručce R. E. Buchanana a N. E. Gibboín-Se ,,Bergey’s Manual of Determinative Bac-teriology”, 8. vydání, 1974, a s popisy v dalšíliteratuře. Ačkoliv se autoři vynálezu domnívali, žetento kmen patří do· skupiny III rodu Nocar-dia, nepodařilo se jim najít mezi známýmikmeny žádný druh mající shora popsanécharakteristické znaky a proto usuzují, žetento kmen představuje nový druh mikro-organismů. Předmětný kmen číslo C-15003 je uloženve Výzkumném ústavu pro· fermentaci [Fer-mentatřon Research Institute, Agency of 214881 10The above characteristic C-15003 was compared with the descriptions given in SA Waksman's monograph "The Actinomycetes", Volume 2 (published by Williams and Wilkins Co., 1961), with descriptions in the RE Buchanan and NE Gibboin-Se, Bergey's Manual. of Determinative Bac-teriology ”, 8th edition, 1974, and with descriptions in the next literature. Although the inventors believed that this strain belonged to Group III of the genus Nocarid, they could not find any known species among the known fungi and therefore conclude that this strain represents a new species of micro-organisms. The subject strain C-15003 is deposited with the Fermentation Research Institute [Fer-mentatron Research Institute, Agency of 214881 10

Industrial Science and Technology (FERM)]pod přijímacím číslem 3992 a v Ústavu profermentaci v Osace [Institute for Fermenta-tion, Osaka (IFO)j pod přijímacím, číslemIFO 13726 a v Americké sbírce typovýchkultur [American Type Culture Collection(ATCC), Maryland, USA] pod přijímacím,číslem' 31281. Ačkoliv je kmen číslo C-15003, jak jižbylo uvedeno, novým druhem rodu Nocar-dia, je schopný, jako všechny mikroorga-nismy, podléhat různým variacím a muta-cím, buď spontánně, nebo působením mu-tagenů. Například lze získat četné variantykmene ozařováním X-paprsky, gama-paprs-ky, ultrafialovým světlem atd., izolací jed-nobuněčných buněk, kultivací kmene naživných půdách obsahujících různé chemic-ké látky, anebo jakýmkoliv jiným mutagen-ním působením, a rovněž mutanty vznikléspontánně z původního kmene nelze v pod-statě pokládat za jiný odlišný druh, alespíše lze kteréhokoliv takového variantanebo mutanta původního kmene, schopné-ho produkovat maytansinol, maytanacin apropionát maytansinolu, používat beze změ-ny pro účely tohoto vynálezu stejně jako*kmene číslo C-15003.Industrial Science and Technology (FERM)] under the accession number 3992 and at the Osaka Institute for Fermentation (Osaka (IFO) j under the receiving numberIFO 13726 and the American Type Culture Collection (ATCC), Maryland) United States] under Receipt No. 31281. Although the strain number C-15003, as already mentioned, is a new species of the genus Nocarid, it is capable, like all microorganisms, of undergoing various variations and mutations, either spontaneously or by mutagenesis. For example, numerous variants of X-rays, gamma-rays, ultraviolet light, etc., single cell isolation, culturing strains of nutrient soils containing various chemical agents, or any other mutagenic activity, as well as spontaneous mutants, can be obtained. from the original strain it is not possible to consider it to be another distinct species, at least any such variant or mutant of the original strain, capable of producing maytansinol, maytanacin and propionate maytansinol, can be used without change for the purposes of this invention as well as strain number C-15003 .

Když se kmen číslo C-15003 podrobí pů-sobení různých rputagenů, získají se napří-klad mutanty, kterým v podstatě chybíschopnost produkovat rozpustná barvivá,nebo mutanty, jejichž základní mycelia jsoubezbarvá, žlutavě zelená, červenohnědá ne-bo oranžově červená, nebo mutanty, jejichžhyfy jsou schopné se rozpadat na tyčinko-vité částečky nebo krátké rozvětvené frag-menty hyf, nebo mutanty s hojným bílýmvzdušným myceliem· anebo téměř vůbec bezvzdušného mycelia.For example, when the strain C-15003 is subjected to different rputagens, mutants are obtained which are substantially incapable of producing soluble dyes or mutants whose basal mycelia are colorless, yellowish green, reddish brown or orange red, or mutants, whose phenomena are capable of disintegrating into rod-like particles or short branched fragments of hyphae, or mutants with abundant white air mycelium, or almost no air mycelium.

Jako prostředí lze pra kultivaci kmeneschopného produkovat maytansinol, may-tanacin nebo propionát maytansinolu (vdalším zkracováno někdy jako „produkčníkmen”) použít tekutého nebo pevného pro-středí, jen pokud obsahuje živiny, které mů-že kmen využít; tekuté prostředí je výhodnépři výrobě velkých násadách. Živná prostře-dí musí obsahovat zdroje uhlíku a dusíku,které je kmen číslo C-15003 scopen asimilo-vat a strávit, anoranické látky, stopové ži-viny a další látky. Jako příklad zmíněnýchzdrojů uhlíku lze uvést glukózu, laktózu,sacharózu, maltózu, dextrín, škrob, glyce-rol, mannitol, sorbitol a podobné látky, tu-ky a oleje (například sójový olej, olej vy-lisovaný ze sádla, kuřecí olej a podobné)atd. Jako zdroje dusíku mohou sloužit napří-klad masový výluh, kvasniičný výluh, sušenékvasnice, sójová moučka, kukuřičný výluh,pepton, kasein, bavlníková moučka, prokva-šená melasa, močovina, amonné soli (napří-klad síran amonný, chlorid amonný, dusič-nan amonný, octan amonný atd.) a podob-né suroviny. Živná půda může dále obsahovat soli so-díku, draslíku, vápníku, hořčíku atd., soili železa, manganu, zinku, kobaltu, niklu atd.,soli kyseliny fosforečné, kyseliny borité atd.,a soli organických kyselin, jako octany apropionany. Živné prostředí může dále ob-sahovat jako přídavek různé aminokyseliny(například kyselinu glutamovou, kyselinuasparagovou, alanin, glycin, methionin, pro-lin atd.), peptidy (například dipeptidy, tri-peptidy atd.), vitaminy (například vitaminBi a Bz, kyselinu nikotinovou, vitaminy B12,C, E a další), nukleové kyseliny (napříkladpurin, pyrimidin a jejich deriváty) a dalšílátky. Za účelem úpravy pH živného pro-středí lze přidat anorganickou nebo orga-nickou kyselinu, alkálii, pufr a podobné lát-ky. Dále lze k prostředí přidat vhodnémnožství odpěňovacích prostředků, napří-klad olejů, tuků, povrchově aktivních láteka podobných prostředků.As an environment, maytansinol, may-tanacin, or maytansinol propionate can be used to cultivate a non-human (sometimes abbreviated as "producer") to use a liquid or solid medium only if it contains nutrients that the strain may utilize; The liquid environment is advantageous in the production of large batches. The nutrient medium must contain carbon and nitrogen sources, which is strain C-15003 scanned by assimilation and digestion, anoranic agents, trace elements and other substances. Examples of said carbon sources include glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, starch, glycerol, mannitol, sorbitol and the like, fats and oils (e.g., soybean oil, lard oil, chicken oil, and the like). )etc. Nitrogen sources can be, for example, meat liquor, yeast liquor, dried yeast, soybean meal, corn steep liquor, peptone, casein, cottonseed meal, fermented molasses, urea, ammonium salts (e.g. ammonium sulfate, ammonium chloride, nitrate). ammonium, ammonium acetate, etc.) and the like. The nutrient medium may further comprise salts of sodium, potassium, calcium, magnesium, etc., of iron, manganese, zinc, cobalt, nickel, etc., a salt of phosphoric acid, boric acid, etc., and salts of organic acids such as acetates and propionates. The culture medium may further contain various amino acids (for example, glutamic acid, acid aspartic acid, alanine, glycine, methionine, pro-protein, etc.), peptides (e.g., dipeptides, tri-peptides, etc.), vitamins (e.g., vitamin B 1 and B 2, e.g. nicotinic acid, vitamins B12, C, E and others), nucleic acids (e.g., purine, pyrimidine, and derivatives thereof), and other substances. In order to adjust the pH of the nutrient medium, inorganic or organic acid, alkali, buffer and the like can be added. In addition, a suitable amount of antifoaming agents, for example, oils, fats, surfactant-like compositions, may be added to the environment.

Kultivaci kmene lze provádět za stacio-nárních podmínek, za třepání, za submerz-ních aerobních podmínek i za jiných kulti-vačních podmínek. Pro velkoprodukční ná-sady je samozřejmě výhodná submerzní ae-robní kultivace. Podmínky kultivace závisísamozřejmě na formě a složení živného pro-středí, na druhu kmene, na způsobu kulti-vace a na dalších faktorech; normálně sedává přednost provádění při 20—35 °C připočátečním pH asi 7,0 nebo podobném. Ob-zvláště výhodná teplota ve středním stadiukultivace je 23—30 °C, při počátečním' pH6,5 až 7,5. Doba kultivace je rovněž pro-měnlivá a je závislá na stejných faktorech,jaké byly uvedeny výše; je vhodné pokračo-vat v kultivaci tak dlouho, dokud titr vzni-kajícího antibiotika nedosáhne maxima. V případě provádění kultivace za třepánínebo v případě aerobní submerzní kultivacev tekutém živném prostředí se potřebná do-ba kultivace pohybuje normálně v rozmezí48—144 hodin.Cultivation of the strain can be carried out under standard conditions, under shaking, under submerged aerobic conditions under other culture conditions. Of course, submerged and cultured cultivation is preferred for large-scale compositions. The culture conditions depend, of course, on the form and composition of the medium, on the strain, on the culture method and on other factors; normally, preference is given to performing at 20-35 ° C an additional pH of about 7.0 or the like. A particularly preferred medium-culturing temperature is 23-30 ° C, at an initial pH of 6.5 to 7.5. The cultivation time is also variable and depends on the same factors as above; it is desirable to continue the culture until the titer of the emerging antibiotic reaches its maximum. If shaking or aerobic submerged culture is carried out in a liquid culture medium, the required cultivation is normally within the range of 48-144 hours.

Množství vzniklého antibiotika se stano-vuje za použití mikroorganismu Tetrahyme-na pyriformis W jako testovacího· oganismú.Uvedený mikroorganismus se pěstuje na tes-tovací živné půdě [20 g prateázopeptonu(Difco), 1 g kvasničného extraktu (značkyDifco), 2 g glukózy, 1000 ml destilované vo-dy a 10 ml IM-fosfátového pufru (pH 7,0) ]při 28 °C po dobu 44—48 hodin a množstvíantibiotika se stanoví sériovou zřeďovanímetodou, při které se sleduje zákal způso-bený buňkami mikroorganismů; současněse antibiotikum stanoví tenkovrstevnouchromatografií (TICj, která je popsána níže.The amount of antibiotic formed is determined using the microorganism Tetrahyme pyriformis W as the test organism. The microorganism is grown on a test broth [20 g pratasopepton (Difco), 1 g yeast extract (Difco), 2 g glucose, 1000 ml of distilled water and 10 ml of IM-phosphate buffer (pH 7.0) at 28 ° C for 44-48 hours and the amount of antibiotic is determined by serial dilution with a level to monitor turbidity caused by microorganism cells; at the same time, the antibiotic is determined by thin layer chromatography (TICj, which is described below).

Maytanacin, propionát maytansinolu ne-bo· maytansinol jsou mikroorganismem pro-dukovány a hromaděny v kultivační živnépůdě jednak extracelulárně, jednak intrace-lulárně. Žádná z těchto látek nevykazuje zřetel-nou antibiotickou účinnost, a proto se dele-gují výhodněji pomocí tenkovrstvé chroma-tografie, která se provádí paraleně se sta-novováním aktivity pomocí kmene Tetrahy- 214881 11 měna. Fermentační kapalina se filtrací neboodstředěním rozdělí na podíl obsahující buň-ky a na filtrát, a filtrát se vytřepe stejnýmobjemem ethylacetátu. K buňkám se přidástejné množství 7Q% vodného acetonu jakok filtrátu, suspenze se míchá jednu hodinupři 20 °C a pak se zfiltruje. Z filtrátu se odstraní aceton za sníženéhotlaku a zbývající vadný podíl se vytřepeethylacetátem. Každý jednotlivý ethylacetá-tový elxtrakt se' zahustí na 1/100 původníhoobjemu a koncentrát se podrobí tenkovrstev-né chromatografii na vrstvě silikagelu na-nesené na skleněné desce (Merck, Němec-ká spolková republika, Kieselgel 60 F254,0,2,5 mm, 20 X 20 cm) za použití rozpouš-tědlové soustavy chloroform-methanol 9 :1.Množství látek se stanoví na základě inten-zity flourescence skvrn po detekci ozáře-ním ultrafialovým světlem při 2,537 A.Maytanacin, maytansinol propionate or maytansinol are produced by the microorganism and accumulated in the culture nutrient both extracellularly and intracellularly. None of these substances exhibit distinct antibiotic activity and are therefore more preferably separated by thin-layer chromatography, which is carried out in parallel with the activity of the Tetrahy-214881 11 currency. The fermentation liquid was separated by filtration or centrifugation into a cell-containing and filtrate fraction, and the filtrate was shaken with the same volume of ethyl acetate. An amount of 7% aqueous acetone was added to the cells as the filtrate, the suspension was stirred for one hour at 20 ° C and then filtered. Acetone was removed from the filtrate under reduced pressure and the remaining faulty portion was extracted with ethyl acetate. Each individual ethyl acetate extract was concentrated to 1/100 of the original volume and the concentrate was subjected to thin layer chromatography on a silica gel plate supported on a glass plate (Merck, Federal Republic of Germany, Kieselgel 60 F 254.0, 2.5 mm) 20 x 20 cm) using a chloroform-methanol solvent system of 9: 1. The amount of the substances was determined by the intensity of the stain fluorescence after detection by ultraviolet light irradiation at 2,537 A.

Maytancin, propionát maytansinolu a may-tansinol, které jsou uvedeným způsobemprodukovány do kultivační živné půdy, jsoulipofilní a neutrální látky, které lze izolo-vat a čistit běžnými separačními a čisticímipostupy, kterých se normálně používá přiizolaci podobných mikrobiálních meitaboli-tů. Tak například lze použít postupů, kterévyužívají rozdílů v rozpustnosti mezi anti-biotikem a nečistotou, nebo způsobů, kterévyužívají frakční adsorpční afinity různýchadsorbentů, jako aktivního uhlí, makropoi-rézních nelnogenních pryskyřic, silikagelu,kysličníku hlinitého a podobných, nebo po-stupů využívajících k odstranění nečistotiontoiměničových pryskyřic nebo podobnýchpostupů; uvedené postupy lze aplikovat jed-notlivě nebo ve vhodných kombinacích ne-bo opakovaně.Maytancin, maytansinol propionate and may-tansinol, which are produced in the culture broth, are lipophilic and neutral substances which can be isolated and purified by conventional separation and purification procedures normally used to isolate similar microbial meitaboli. For example, methods that utilize differences in solubility between anti-biotics and impurities, or methods that utilize fractional adsorption affinities of various adsorbents, such as activated carbon, macroporous non-ionic resins, silica gel, alumina, and the like, or methods used to remove them, may be used. impurity-ion exchange resins or similar processes; said procedures may be administered singly or in suitable combinations or repeatedly.

Vzhledem k tomu, že se, jak již bylo· uve-deno výše, maytanacin, propionát maytansi-nOlu nebo maytansinol vyskytují jak ve fil-trátu živného prostředí, tak v buňkách, dajíse zmíněná antibiotika izolovat a čistit po-mocí uvedených adsorbentů buď přímo, ne-bo po extrakci filtrátu rozpouštědlem, nebopo extrakci mikrobiálních buněk rozpouš-tědlem.Since, as mentioned above, maytanacin, maytansinol propionate or maytansinol can be found both in the culture medium and in the cells, the said antibiotics can be isolated and purified using the said adsorbents either directly or, after extracting the filtrate with a solvent, or extracting the microbial cells with a solvent.

Extrakci antibiotik rozpouštědlem lze pro-vádět jedním z níže uvedených způsobů ne-bo jinými způsoby, například: 1) extrakcírozpouštědlem z kultivační živné půdy bezoddělení buněk,’2) extrakcí rozpouštědlemz buněk a z filtrátu po jejich vzájemnémoddělení filtrací, odstředěním nebo jinýmizpůsoby. K extrakci filtrátu a buněk, kaž-dého uvedeného podílu samostatně, lze svýhodou použít následujícího, postupu:Solvent extraction of antibiotics can be accomplished in one of the following ways, or by other means, for example: 1) extraction of solvent from the culture broth without separation of cells, 2) extraction of solvent from the cells and filtrate by separation by filtration, centrifugation or other means. For the extraction of the filtrate and the cells of each of these portions, the following procedure is preferably used:

Jako vhodných rozpouštědel lze k extrak-ci filtrátu použít organických rozpouštědelnemísitelných s vodou, jako esterů mast-ných kyselin, například ethylacetátu nebo-amylacetátu; alkoholů, například butanolu;halogenovaných uhlovodíků, například chlo-roformu; ketonů, například methylisobutyl-ketonu. Extrakce se provádí při pH blízkémneutrální hodnotě a výhodně se kultivační 12 kapalina, upravená předem na pH 7, extra-huje ethylacetátem. Extrakt se promyje vo-dou a zahustí za. sníženého tlaku. Ke kon-centrátu se pak přidá nepolární rozpouštědlo,jako- petrolether nebo hexan, a získá se su-rový produkt I, obsahující účinnou látku.Vzhledem k tomu, že při hodnocení pomocíTLC obsahuje produkt I řadu skvrn jinýchnež maytanacinu, propionát maytansinolunebo maytansinol, podrobí se dalším čisti-cím operacím, Vhodné jsou rutinní čisticípostupy, zvláště adsorpční chromatografie,ke které lze použít jednoho z následujícíchběžných adsorbentů: silikagelu, kysličníkuhlinitého, makroporézní neionogenní ad-sorpční pryskyřice a podobných. K čištění surového produktu I je nejvý-hodnější silikagel, Eluce se může provádětnapříklad nejdříve petroletherem a hexa-nem a poté jejich směsmi s polárními roz-pouštědly, například s ethylacetátem, ace-tonem, ethanolem nebo methanolem. Přitypickém' postupu se používá sloupcovéchromatografie na silikagelu (Merck, Ně-mecká spolková republika, 0,05—0,2 mm]jako nosiči a eluce látek se provádí nejprvehexanem, pak směsí hexanu se stoupajícímmnožstvím ethylacetátu a nakonec ethylace-tátem. Eluát se jímá po frakcích, které sehodnotí pomocí TLC, a frakce obsahujícístejné účinné složky se spojí a zkoncentrujíza sníženého tlaku. Ke koncentrátu se při-dá petrolether nebo heXan a získá se suro-vý produkt II. Jelikož tento produkt obsa-huje ještě nečistoty, čistí se dále následu-jícím způsobem. Například se surový pro-dukt II čistí pomocí druhé chromatografiena sloupci silikagelu v odlišném rozpouš-tědlovém systému. K tomuto účelu je vhodnýnapříklad rozpouštědlový systém skládajícíse z halogenovaného uhlovodíku, jako di-chlormethanu nebo chloroformu, s přídav-kem polárního rozpouštědla, jako alkoholu,například ethanolu nebo methanolu, ketonu,například acetonu nebo methylethylketonu,nebo podobných rozpouštědel. Tímto způ-sobem se získá čistý maytanacin, propio-nát maytansinolu nebo maytansinol. PořadíPozpouštědlOvých systémů pro první a dru-hou sloupcovou chromatografii na silikage-lu může být i obrácené, a dále se může po-užít, v kombinaci s výše uvedenými systémy,popřípadě dalších běžných organických roz-pouštědel. íPoužije-li se k čištění surového produktuII makroporézní adsorpční pryskyřice, pro-vádí se eluce maytanacinu, propionátumatyansinolu nebo matyansinolu směsí vodys nižším alkoholem, nižším ketonem nebo sesterem. Jako nižšího· alkoholu se může po-užít například methanolu, ethanolu, propa-nolu nebo butanolu, jako nižšího ketonunapříklad acetonu nebo methylethylketonua jako esteru například ethylacetátu. Přitypickém postupu se surový produkt II roz-pustí v 60% vodném methanolu, roztok se 214881 13 naadsorbuje na sloupec pryskyřice DiaionHP-liO výrobek firmy Mitsubishi Kasei K. K.),sloupec se promyje 70% vodným methano-lem a pak se provádí eluce 90% vodnýmmethanolem, kterým se ze sloupce vyeluujemayťanaícin, propionát maytansinolu a may-tansinol. Pří kterémkoliv ze shora popsaných způ-sobů čištění se frakce obsahující žádanésloučeniny spojí a rozpouštědla se oddesti-lují za sníženého tlaku. K suchému odparkuse přidá 5 až 8 objemů ethylacetátu a směsse ponechá stát, přičemž se vyloučí krysta-ly maytanacinu, propionátu maytansinolunebo maytansinolu; v případě, že se získákrystlický produkt obsahující směs maytan-acinu s propionátem maytansinolu, oddělíse tyto· látky jedna od druhé chromatogra-fií na vhodném arsorbentu, například najednom ze shora uvedených adsorbentů.Suitable solvents for the extraction of the filtrate are water-miscible organic solvents such as fatty acid esters, for example ethyl acetate and amylacetate; alcohols, for example butanol; halogenated hydrocarbons, for example chloroform; ketones, for example methyl isobutyl ketone. Extraction is carried out at a pH close to neutral and preferably the culture liquid 12, adjusted to pH 7, is extracted with ethyl acetate. The extract was washed with water and concentrated to dryness. reduced pressure. A non-polar solvent, such as petroleum ether or hexane, is then added to the concentrate to obtain the active ingredient I containing the active substance. Since the product I contains a number of other maytanacin stains, the propionate maytansinol or maytansinol is subjected to TLC. Routine purification procedures, in particular adsorption chromatography, to which one of the following conventional adsorbents: silica gel, oxygen-aluminum, macroporous non-ionic adsorbent resins and the like are suitable, are suitable. Silica gel is the most preferred for the purification of crude product I. Elution can be carried out, for example, with petroleum ether and hexane, followed by mixtures thereof with polar solvents, for example ethyl acetate, acetone, ethanol or methanol. A column chromatography on silica gel (Merck, Federal Republic of Germany, 0.05-0.2 mm) is used as the carrier and the elution of the materials is carried out with hexane, then with a mixture of hexane with increasing amounts of ethyl acetate and finally with ethyl acetate. Fractions collected by TLC and fractions containing the same active ingredients are combined and concentrated under reduced pressure, petroleum ether or hexane added to the concentrate to give crude product II, since this product still contains impurities and is further purified. For example, the crude product II is purified by a second silica gel column chromatography in a different solvent system, for example a solvent system consisting of a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane or chloroform with the addition of a polar solvent , such as an alcohol such as ethanol or methanol, ket such as acetone or methyl ethyl ketone or similar solvents to give pure maytanacin, propionate maytansinol or maytansinol. The order of the solvent systems for the first and second column chromatography on silica gel can also be reversed, and can be used, in combination with the above systems, or other conventional organic solvents. When macroporous adsorption resin is used to purify crude product II, the elution of maytanacin, propionate-butaninol or matyansinol is carried out with a mixture of water with a lower alcohol, a lower ketone or a sister. As the lower alcohol, for example, methanol, ethanol, propanol or butanol may be used as the lower ketone, for example acetone or methyl ethyl ketone as an ester of, for example, ethyl acetate. In a similar manner, the crude product II is dissolved in 60% aqueous methanol, the solution is adsorbed on a column of DiaionHP-10 resin from Mitsubishi Kasei KK), the column is washed with 70% aqueous methanol and then eluted with 90% aqueous methanol. eluting with the column, propionate maytansinol and may-tansinol. In any of the purification procedures described above, fractions containing the desired compounds are combined and the solvents are distilled off under reduced pressure. 5 to 8 volumes of ethyl acetate are added to the dry evaporation and the mixture is allowed to stand to precipitate maytanacin, maytansine or maytansinol propionate; in the case where a crystalline product containing a mixture of maytansin and maytansinol propionate is obtained, these are separated from each other by chromatography on a suitable arsorbent, for example at least one of the abovementioned adsorbents.

Například za použití silikagelu nebo ma-kroporézní neionogenní absorpční prysky-řice a shora uvedených rozpouštědlovýchsystémů lze frakčně eluovat žádané slouče-niny v Čistém stavu. Použije-li se k dělenízmíněné směsi silikagelu a eluce se prová-dí hexanem, ethylacetátem nebo směsí chlo-roformu s methanolem, vytékají ze sloupce 11 nejdříve frakce obsahující propionát may-tansinolu a pak frakce obsahující maytan-acin.For example, using silica gel or macroporous non-ionic absorption resin and the above solvent systems, the desired compounds can be fractionally eluted in the pure state. When a silica gel elution mixture is used and the elution is carried out with hexane, ethyl acetate or a chloroform / methanol mixture, column 11 first contains maytansinol propionate-containing fractions and then maytan-acin-containing fractions.

Po zhodnocení pomocí TLC se příslušnéfrakce spojí, rozpouštědla se oddestilují zasníženého tlaku a k odparku se přidá eťhyl-acetát. Tímto způsobem se získají krystalyčistých sloučenin. Použije-li se k dělení zmí-něné směsi makroporézní neionogenní ab-sorpční pryskyřice, aplikuje se gradientováeluce za použití stoupajícího množství alko-holu, ketonu nebo esteru ve vodě. Napříkladpři gradientově eluci za použití 60% vodné-ho methanolu až 95% vodného· methanolu spřídavkem .5 % chloridu sodného vytékajíze sloupce nejprve frakce obsahující maytan-acin a pak frakce obsahující propionát may-tansinolu. Frakce se zhodnotí pomocí TLC,skupiny frakcí obsahující stejnou účinnoulátku se spojí, rozpouštědla se oddestilujíza sníženého tlaku a odparky se krystalizujíz ethylacetátu. Získané krystalické látky ob-sahují ethylacetát jako krystalové rozpouš-tědlo; po vysušení nad kysličníkem fosfo-rečným při 70 °C (po dobu 8 hodin) vyka-zují následující fyzikální a chemické vlast-nosti (viz tabulku 4). T a b u 1 k a 4After TLC evaluation, the appropriate fractions were combined, the solvents were distilled off under reduced pressure, and ethyl acetate was added to the residue. Crystalline compounds are thus obtained. If a macroporous nonionic absorbent resin is used to separate said mixture, gradient gradient is applied using increasing amounts of alcohol, ketone or ester in water. For example, in a gradient elution using 60% aqueous methanol to 95% aqueous methanol in addition to 5% sodium chloride, the columns containing the maytanecin-containing fraction and then the maytansinol propionate-containing fraction flow out first. The fractions were collected by TLC, the groups of fractions containing the same were combined, the solvents were distilled off under reduced pressure, and the residue was crystallized from ethyl acetate. The obtained crystalline compounds contain ethyl acetate as a crystalline solvent; after drying over phosphorus pentoxide at 70 ° C (for 8 hours), they exhibit the following physical and chemical properties (see Table 4). T a b u 1 k and 4

Fyzikální a chemické vlastnosti maytancinu, propionátu maytansinolu a maytansi-noluPhysical and chemical properties of maytancin, maytansinol propionate and maytansinol

Sloučenina Mayťanacin C30H39CIN2O9 Maytansinolpropionát C31H41CÍN2O9 Maytansinol C28H37CIN2O8 Teplota tání, ° C 235—236° 188—190 0 172,5-174° Specifická [u]n22— [«]o22= [as]D22= rotace —1210 +10 0 —127° +10° —313 0 +100 (c=0,25, CHCI3) (c=O,35, CHCI3) (c=0,22, CHCls) Analýza, C 59,62 59,93 59,28 nalezeno' (%) H 6,93 6,82 6,38 N 4,28 4,32 5,02 Cl 5,64 5,57 6,15 Analýza, C 59,85 59,94 59,52 vypočteno (%) H 6,48 6,65 6,60 N 4,61 4,51 4,96 Cl 5,84 5,71 6,27 Ultrafialové 233 (30330) 233 (30240) 232 (32750) absorpční 240 (sh. 28240) 240 (sh. 28400) 244 (sh. 30850) spektrum 252 (27850) 252 (27650) 252 (31650) nm (s) 280 (5680) 280 (5740) 281 (5750) 288 (5660) 288 (5710) 288 (5700) Infračervené 1740, 1730, 1740, 1730, 1715, 1670, absorpční 1670, 1580 1670, 1580 1580 spektrum (cm“1) Hmotové 545, 485, 470 559, 485, 470, 503, 485 , 470, spektrum 450 450 450 (m/e) 1 214881Compound Mayanacin C30H39CIN2O9 Maytansinol propionate C31H41CIN2O9 Maytansinol C28H37CIN2O8 Melting point, ° C 235-236 ° 188—190 0 172.5-174 ° Specific [u] n22— [«] o22 = [as] D22 = rotation —1210 +10 0 —127 [.Alpha.] D @ 20 = +31 (c = 0.25, CHCl3) (c = 0.35, CHCl3) (c = 0.22, CHCl3) Analysis, C 59.62 59.93 59.28 found. (%) H 6.93 6.82 6.38 N 4.28 4.32 5.02 Cl 5.64 5.57 6.15 Analysis, C 59.85 59.94 59.52 calculated (%) H 6.48 6.65 6.60 N 4.61 4.51 4.96 Cl 5.84 5.71 6.27 Ultraviolet 233 (30330) 233 (30240) 232 (32750) Absorption 240 (sh. 28240) 240 (sh. 28400) 244 (sh. 30850) spectrum 252 (27850) 252 (27650) 252 (31650) nm (s) 280 (5680) 280 (5740) 281 (5750) 288 (5660) 288 (5710) 288 ( 5700) Infrared 1740, 1730, 1740, 1730, 1715, 1670, absorption 1670, 1580 1670, 1580 1580 spectrum (cm -1) Mass 545, 485, 470 559, 485, 470, 503, 485, 470, spectrum 450 450 450 (m / e) 214881

15 1B15 1B

SloučeninaCompound

Maytanacin Maytansinolpropionát C30H39CIN2O9 C31H41CIN2O9Maytanacin Maytansinol propionate C30H39CIN2O9 C31H41CIN2O9

Maytansínol C28H37CIN2O8Maytansinol C28H37CIN2O8

Kyselý lipofilní a neutrální neutrální nebo látka bazickýAcidic lipophilic and neutral neutral or basic

Barevné reakce Dragendorfova reakce: pozitivníColor reaction Dragendorf reaction: positive

Beilsteinova reakce: pozitivní lipofilní a neutrální lipofilní a neutrálnílátka látkaBeilstein reaction: a positive lipophilic and neutral lipophilic and neutral substance

Dragendorfova reakce: Dragendorfova reakce: pozitivní- pozitivníDragendorf reaction: Dragendorf reaction: positive-positive

Beilsteinova reakce: Beilsteinova reakce: .pozitivní ' pozitivníBeilstein reaction: Beilstein reaction: positive

Shora uvedené reakce hodnoty elemen-tárních analýz, specifických rotací, ultra-fialových spekter, infračervených spekter,hmotových spekter atd. jsou v dobré shoděs daty uvedenými v literatuře [Kupchan .sespolupracovníky, The Journal of AmericanChemical Society 97, 5294 (1975)] pro may-tanacin, propionát maytansinolu a maytan-sinol.The above reactions of the values of elemental analyzes, specific rotations, ultra-violet spectra, infrared spectra, mass spectra, etc. are well matched by the literature data [Kupchan. Semi-workers, The Journal of American Chemical Society 97, 5294 (1975)] for may-tanacin, maytansinol propionate and maytan-sinol.

Způsob podle vynálezu je dále ob jasně vnásledujících příkladech provedení, kterévšak rozsah vynálezu nijak neomezují. Po-kud není jinak uvedeno, znamenají „díly”hmotnostní a vztah mezi „díly" a objemový-mi díly” odpovídá vztahu mezi „gramy” a„mililitry“; „%!“ se vztahují, pokud není ji-nak udáno, na poměr „hmotnost/objem”. Příklad 1Furthermore, the process of the invention is clear in the following non-limiting examples. Unless otherwise stated, "parts" means mass and the relationship between "parts" and volume parts "refers to the relationship between" grams "and" milliliters "; weight / volume ratio Example 1

Kmen číslo C-1'5003 (IFO 13726; FERM39,92; ATCC 312(81) druhu Nocardia, produ-kující maytanacin, maytansínol a propionátmaytansinolu, jak byl vypěstován na agaro-vé živné půdě (agar s kvasničným a slado-vým výluhem), se použije k naočkování 40objemových dílů násadního kultivačníhomédia (složení: 2 % glukózy, 3 °/o rozpust-ného škrobu, 1 % surové sójové moučky,1 % kukuřičného výluhu, 0,5 % polypepto-nu, 0,3 % chloridu sodného, 0,5 % uhliči-tanu vápenatého, pH 7,0), nacházejícího seve fermentoru o obsahu 200 objemovýchdílů. Naočkované médium Se inkubuje 48hodin při 28 °C, čímže se získá inokulum. 0,5 objemových dílů takto získaného ino-kula se přenese do fermentoru o obsahu200! objemových dílů, ve kterém je umístěno40 objemových dílů fermentační půdy slo-žené z 5 '% dextřinu, 3 % kukuřičného vý-luhu, 04 % polypeptonu a 0,5 % uhličitanuvápenatého (pH 7,0) a kultivuje se 9Ό ho-din při 28 °C, čímž se získá inokulum (ná-sadní kultura). Sériovou zřeďovací metodou, za použitímikroorganismu Tetrahymena pyriformis Wjako testovacího organismu a propionátumaytansinolu jako standardu, bylo nalezeno·,že shora uvedená kultura má titr 25 ^m/ml.Příklad 2 Dávka 10 objemových dílů inokula (ná- sadní kultura) získaného postupem popsa-ným v příkladu 1 se přenese do fermentoruo obsahu 2 000 objemových dílů, který ob-sahuje 500 objemových dřlů násadního kul-tivačního .média (stejného složení, jak uve-deno výše v příkladu 1) a iníkubuje se 48hodin při 28 °C. 500 objemových dílů získanékultury se přenese do fermentačního tankuz nerezové oceli o obsahu 50 000 objemovýchdílů, který Obsahuje 30 000 objemových dí-lů násadního kultivačního média a mikro-organismus se kultivuje při 28 °C za pro-vzdušňování (30 000 objemových dílů za mi-nutu), za míchání, 280 otáček za minutu(1/2DT) a za vnitřního tlaku 1 kg/cm2;získá se násadní kultura. Získaná násada sepoužije k naočkování fermentačního tankuz nerezové oceli o obsahu 200 000 objemo-vých dílů, ve kterém je 100 000 objemovýchdílů fermentační živné půdy podobnéhosložení jako půda použitá v příkladu 1, vinokulačním poměru 10· %. Naočkovanápůda se inkubuje při 28 °C za provzdušňo-vání (1O0 000 objemových dílů za minutu),za míchání, 200 otáček za minutu (1/2 DT)a za vnitřního tlaku 1 kg/cm2 po dobu 90hodin. Za použití testovací metody popsanév příkladu 1 bylo nalezeno, že shora uve-deným způsobem získaná kultura má titr25 (Ug/ml. K 90 000 objemovým dílům kapaliny získa-né způsobem shora uvedeným se přidá2000 dílů křemeliny Hyflo-supercel ® (vý-robek firmy Johnes and Manville Products,USA) a po důkladném promíchání se směszfiltruje tlakovým filtrem; získá se 85 000objemových dílů filtrátu a 32000 dílů vlh-kých buněk.Strain number C-1'5003 (IFO 13726; FERM39,92; ATCC 312 (81) of the Nocardia species producing maytanacin, maytansinol and propionate maytansinol as grown on agar medium (agar with yeast and malt extract) ), is used to inoculate 40 parts by volume of seed culture (composition: 2% glucose, 3% soluble starch, 1% crude soybean meal, 1% corn liquor, 0.5% polypeptone, 0.3% chloride sodium carbonate, 0.5% calcium carbonate, pH 7.0, located in a 200-volume fermenter, and the inoculated medium is incubated at 28 ° C for 48 hours to give an inoculum of 0.5 parts by volume of the thus obtained inoculum. is transferred to a fermenter containing 200 parts by volume in which 40 parts by volume of fermentation broth composed of 5% dextran, 3% corn extract, 04% polypepton and 0.5% carbonate calcium (pH 7.0) are placed cultivated for 9 hours at 28 ° C The serial dilution method, using Tetrahymena pyriformis W as the test organism and propionate and tansinol as a standard, has been found to have a titre of 25 µm / ml. Example 2 Dose of 10 volumes of inoculum (culture medium as described in Example 1) is transferred to a 2,000 volume volume fermenter containing 500 volumes of seed culture medium (same composition as in Example 1 above) and incubated for 48 hours at 28 ° C. 500 parts by volume of the obtained culture is transferred to a 50,000 volumetric stainless steel fermentation tank containing 30,000 parts by volume of seed culture medium and the microorganism is cultured at 28 ° C under aeration (30,000 parts by volume per ml). with stirring, 280 rpm (1 / 2T) and an internal pressure of 1 kg / cm 2, a hatching culture is obtained. The feedstock is used to inoculate a 200,000 vol.% Stainless steel fermentation tank in which 100,000 volumetric fermentation broths are similar to the soil used in Example 1, in a 10% vaporization ratio. The inoculated soil is incubated at 28 ° C with aeration (10,000 parts by volume per minute), with stirring, 200 rpm (1/2 DT) and at an internal pressure of 1 kg / cm 2 for 90 hours. Using the test method described in Example 1, it was found that the culture obtained above had a titre of 25 (Ug / ml). 2000 parts of Hyflo-supercel ® (company product) were added to 90,000 parts by volume of the above liquid. Johnes and Manville Products, USA) and after thorough mixing, the mixture is filtered through a pressure filter to obtain 85,000 parts by volume of the filtrate and 32,000 parts of wet cells.

Filtrát (85 000 objemových dílů) >se za mí-chání extrahuje 30 000 objemovými dílyethylaeetátu a uvedená operace se ještějednou opakuje. Ethylacetátové podíly sespojí, prcimyjí dvakrát 30 000 objemovýmidíly vody, vysuší přidáním 500 dílů bezvo-dého síranu sodného a zahustí za sníženéhotlaku na 200 objemových dílů. Ke zkoncen-trovanému roztoku se přidá petrolether avyloučená sraženina se odfiltruje (výtěžek53 dílů). Získaný surový produkt I se mícháse 100 objemovými díly ethylaeetátu a ne-rozpuštěný podíl se odfiltruje. Filtrát se roz- 214881 17 18 ""<íf, ίΤ"·<- Λνί * , Α%£ , máchá s 10 díly silikagelu (Merck, Německáspolková republika, zrnění 0,05—0,2 mim,)a ethylacetát se odstraní za sníženého tlaku.Zbylý silikagel s naadsorbovaným produk-tem se nane!se na horní konec sloupce sili-kagelu (400 objemových dílů) a látky seeluují postupně 500 objemovými díly hexa-nu, 500 objemovými díly směsi hexanu sethylacetátem (3 :1), 500 objemovými dílysměsi hexanu s ethylacetátem (1:1), 500objemovými díly Směsi hexanu s ethylace-tátem (1:3), 500 objemovými díly ethylace-tátu, 1000 objemovými díly směsi ethylace-tátu s methanolem (50: 1) a 1000 objemo-vými díly směsi ethylacetátu s methanolem(25 :1), přičemž se eluát jímá po frakcícho 100 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 1 objemovýdíl roztoku, rozpouštědla se oddestilují ksuchu a k odparku se přidá 0,1 objemovéhodílu ethylacetátu. Roztok se nanese vevzdálenosti 2,5 cm od spodního okraje navrstvu silikagelu nanesené na skleněné des-ce (Merck, Německá spolková republika,60 F254, 0,25 mm, 20 X'20 cm) a vyvolá dovzdálenosti asi 17 cm v rozpouštědlovémsystému ethylácetát-methanol (19:1), Povyvolání se provede detekce pomocí ultra-fialového světla o vlnové délce 2 537 A.The filtrate (85,000 parts by volume) was extracted with 30,000 parts by volume of ethyl acetate with stirring and the operation repeated one more time. The ethyl acetate portions were combined, washed twice with 30,000 volumes of water, dried by adding 500 parts of anhydrous sodium sulfate and concentrated to 200 parts by volume under reduced pressure. Petroleum ether is added to the concentrated solution and the precipitate formed is filtered off (53 parts yield). The crude product I obtained is stirred with 100 parts by volume of ethyl acetate and the insoluble material is filtered off. The filtrate was washed with 10 parts of silica gel (Merck, German Federal Republic, 0.05-0.2 mole grain) and the ethyl acetate was removed. The remaining silica gel with adsorbed product is applied to the upper end of the silica gel column (400 parts by volume) and the substances are sequentially eluted with 500 parts by volume of hexane, 500 parts by volume of hexane / ethyl acetate (3: 1), 500 parts by volume of hexane / ethyl acetate (1: 1), 500 parts by volume of hexane / ethyl acetate (1: 3), 500 parts by volume of ethyl acetate, 1000 parts by volume of ethyl acetate / methanol (50: 1) and 1000 by volume. 25 parts by volume of ethyl acetate / methanol (100: 1 by volume), 1 volume of solution is removed from each fraction, the solvents are distilled off and ethyl acetate (0.1 volumes) is added to the residue. 2.5 cm from sp the top edge of a layer of silica gel deposited on glass plates (Merck, Federal Republic of Germany, 60 F 254, 0.25 mm, 20 X 20 cm) and induces a distance of about 17 cm in the ethyl acetate-methanol solvent system (19: 1); performs ultra violet light detection at 2,537 A.

Frakce číslo 25 — 30, obsahující účinnoulátku o Rf 0,58—0,63, a frakce číslo 38-40,obsahující účinnou látku o RF 0,25—0,30, sespojí a zahustí za sníženého tlaku, každá naobjem asi 20 objemových dílů. K těmtokoncentrátům se přidá po 150 objemovýchdílech petroletheru a získá se 5 dílů suro-vého produktu II a 2 díly surového maytan-sinolu. 0,5 dílů surového produktu II se rozpustív 10 objemových dílech ethylacetátu a roz-tok se dobře promíchá se 4 díly silikagelu(Merck, Německá spolková republika, 0,05——0,2 mm). Ethylacetát se odpaří za snížené-ho tlaku a zbytek se nanese na vrchní částsloupce připraveného z 300 objemových dí-lů silikagelu, sloupec se. promyje nejdříve500 objemovými díly chloroformu a pak Selátky eluují postupně 500 objemovými dílysměsi chloroformu s methanolem, (50:1),50Q objemovými díly směsi chloroformu smethanolem (20: 1) a 500 díly směsi chlo-roformu s methanolem (10:1); eluát se jí-má po frakcích o 25 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 0,5 objemovéhodílu roztoku, rozpouštědla se oddestilují zasníženého tlaku, k odparku se přildá 0,05objemového dílu ethylacetátu a směs se po-drobí tenkovrstevné chromatografii v roz-poiuštědlové soustavě chlorofor-methanol9 : 1.Fractions 25-30, containing Rf 0.58-0.63, and fractions 38-40, RF 0.25-0.30, are combined and concentrated under reduced pressure, each volume of about 20 vol. parts. Petroleum ether (150 parts by volume) was added to these concentrates to give 5 parts of crude product (II) and 2 parts of crude maytansinol. 0.5 parts of crude product II are dissolved in 10 parts of ethyl acetate and mixed well with 4 parts of silica gel (Merck, Federal Republic of Germany, 0.05-0.2 mm). The ethyl acetate was evaporated under reduced pressure and the residue was applied to a top portion of a column made up of 300 volumes of silica gel column. washed first with 500 parts by volume of chloroform, and then the beads eluted sequentially with 500 parts by volume of a mixture of chloroform with methanol, (50: 1), 50 parts by volume of a mixture of chloroform with methanol (20: 1) and 500 parts of a mixture of chloroform with methanol (10: 1); the eluate was collected in fractions of 25 volumes. 0.5 volume of the solution was removed from each fraction, the solvents were distilled off under reduced pressure, the residue was added with 0.05 parts by volume of ethyl acetate and the mixture was thin-layer chromatographed in chloroform-methanol 9: 1.

Frakce číslo 40 a 41, absorbující při2 537 A v zóně o RF 0,48—0,50, se spojí arozpouštědla se oddestilují za sníženého1tlaku. K odparku se přidá 0,5 objemovéhodílu ethylacetátu a směs se ponechá stát;vyloučí se 0,05 dílu směšných krystalů may-tanacinu s propionátem maytansinolu. 0,05 dílu shora uvedených směsných krys-talů maytanacinu s propionátem maytansi-nolu se rozpustí v 5 objemových dílech me-thanolu, k roztoku se přidá 0,1 dílu chlo-ridu sodného a 5 objemových dílů voidy.Chromaťografická trubice se naplní 200 ob-jemovými díly iontoměničové pryskyřiceDiaíon HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Ka-se! K. K.) a sloupec se promyje 600 Objemo-vými díly 50j% vodného methanolu obsahu-jícího· 5 % chloridu sodného. Shora uvede-ným způsobem připravený roztok účinnýchlátek se nanese na sloupec iontoměniče alátky se eluují gradientovou elucí za pou-žití 1 500 objemových dílů 60% vodného me-thanolu obsahujícího 5 % chloridu sodnéhoa 1 500 objemových dílů 95% vodného me-thanolu. Eluát se jímá po frakcích o 15 ob-jemových dílech a každá frakce se zhodnotíterikovrstevnou chromatografii. Frakce číslo130 až 135 obsahují maytanacin a frakcečíslo 138 a'ž 142 obsahují propionát maytan-sinolu.Fractions 40 and 41, absorbing at 2 537 A in the RF zone of 0.48-0.50, were combined and the solvents were distilled off under reduced pressure. Ethyl acetate (0.5 vol) was added to the residue and 0.05 parts of may-tanacin mixed with maytansinol propionate were precipitated. 0.05 parts of the abovementioned maytanacin mixed crystals with maytansinol propionate are dissolved in 5 parts by volume of methanol, 0.1 parts of sodium chloride and 5 parts by volume are added to the solution. The resin was washed with 600 parts by volume of 50% aqueous methanol containing 5% sodium chloride. The above-prepared active ingredient solution was applied to the ion exchange column and eluted with a gradient elution using 1500 parts by volume of 60% aqueous methanol containing 5% sodium chloride and 1500 parts by volume of 95% aqueous methanol. The eluate is collected in fractions of 15 volumes and each fraction is chromatographed by column chromatography. Fractions 130-135 contain maytanacin and fraction 138-142 contains propanate maytaninol.

Každá skupina frakcí obsahující čistoulátku se spoijí, rozpouštědla sé oddestilujía odparek se rozpustí přidáním 30 ml vodya 50 ml ethylacetátu. Směs se protřepe vdělicí nálevce, vodná vrstva se oddělí, ethyl-acetátový potdíl se promyje dvakrát ,po 30 mívody, vysuší nad bezvodým síranem sodným,zahustí na malý objem a zkoncentrovanýroztok se odstaví ke krystalizaci. Uvedenýmzpůsobem se zláká z každé shora uvedenéskupiny frakcí krystalická látka. Krystaly,se odfiltrují a vysuší; získá se 0,013 dílumaytanacinu a 0,025 dílu prúpionátu may-tansinolu.Each group of fractions containing the detergent was spun off, the solvents were distilled off, and the residue was dissolved by adding 30 ml of water and 50 ml of ethyl acetate. The mixture was shaken with a funnel, the aqueous layer was separated, the ethyl acetate was washed twice, after 30 min, dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated to a small volume and the concentrated solution was removed to crystallize. In this manner, a crystalline substance is attracted from each of the above groups of fractions. The crystals are filtered off and dried; 0.013 parts of tartrate and 0.025 parts of maytansinol transferate are obtained.

Ve 3 objemových dílech ethylacetátu serozpustí 0,2 dílu surového maytansinolu,získaného shora uvedeným postupem, a roz-tok se dobře rozmíchá s 0,5 dílu silikagelu(Merck, Německá spolková republika, 0,05——0,2 mm). Ethylacetát se opaří za snížené-ho tlaku, zbylý silikagel s naadsorbovanoulátkou se nanese na horní konec sloupcepřipraveného z 80 objemových dílů silika-gelu, sloupec se nejdříve promyje 150 dílychloroformu a pák se provede eluce látekpostupně ISO objemovými díly směsi chloro-formu s methanolem (50 : 1), 150 objemo-vými díly směsi chloroformu s methanolem(20:1) a 300 objemovými díly směsi chlo-roformu s methanolem (10 : l);eluát se jímáve frakcích po 10 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 0,5 objemovéhodílu roztoku a rozpouštědlo se oddesťilujeza sníženého tlaku. K odparku se přidá 0,05objemového dílu ethylacetátu a vzorky sepodrobí tenkovrstevné chromatografii v roz-pouštědlovém systému chloroform-methanol9 : 1.0.2 parts of crude maytansinol obtained as above were dissolved in 3 parts of ethyl acetate and mixed well with 0.5 parts of silica gel (Merck, Federal Republic of Germany, 0.05-0.2 mm). The ethyl acetate is evaporated under reduced pressure, the remaining silica gel with the adsorbed material is applied to the upper end of the column prepared from 80 parts by volume of silica gel, the column is first washed with 150 parts of chloroform and the pad is eluted with ISO volumes of chloroform / methanol (50%). : 1), 150 parts by volume of a mixture of chloroform with methanol (20: 1) and 300 parts by volume of a chloroform / methanol mixture (10: 1), the eluate being collected in fractions of 10 parts by volume. From each fraction, 0.5 vol. Of solution is removed and the solvent is distilled off under reduced pressure. To the residue was added 0.05 parts by volume of ethyl acetate and the samples were thin-layer chromatographed in chloroform-methanol 9: 1.

Frakce číslo 50 až 52, absorbující při 2 537A v zóně o Rf 0,33—0,38, se spojí a rozpouš-tědla se oddestilují za sníženého tlaku. K od-parku se přidá 0,5 objemového dílu ethyl-acetátu a směs se odstaví ke krystalizaci;Fractions 50-52 absorbing at 2337A in the Rf 0.33-0.38 zone were combined and the solvents were distilled off under reduced pressure. 0.5 volumes of ethyl acetate are added to the mixture and the mixture is left to crystallize;

Claims (3)

1 214881 19 získá se 0,Q2Q dílu krystalického maytan-sinolu, P ř í k 1 ad 3 32 000 dílů odfiltrovaných buněk získa-ných způsobem popsaným v příkladu 2 seextrahuje za míchání 50 000 objemovýmidíly 70% vodného acetonu po dobu 3 ho-din, Směs se zfiltruje na tlakovém filtru aextrakce 50 000 objemovými díly 70% vod-ného acetonu s následující filtrací se opa-kuje ještě jednou. Filtráty se spojí, acetonse. clddestiluje za sníženého tlaku a zbylývodný podíl se adsorbuje na sloupci z 5 000objemových dílů iontorašničové pryskyřiceDiaton HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Ka-sei K. K.l. Sloupec se promyje 20 OOO obje-movými díly vody a 50% vodného methano-lu a látky se eluují 15 000 objemovými díly60%. vodného methanolu. Eluát se zahustí zasníženého tlaku na 3000 objemových dílů,přidá se 3 OOO objemových dílů vody a směsse protřepe s 3 000 objemovými díly ethyl-acetátu. Uvedená operace se opakuje ještějednou, ethylace,tátové extrakty se spojí,promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síra-nem sodným a zahustí za sníženého tlakuna 200 objemových dílů. Ke zkoncentrova-nému roztoku se přidá petrolether a vylou-čená sraženina se odfiltruje. Získá se 280dílů; surového produktu I, který se čistísloupcovou chromatografií na silikagelupodobným způsobem, jak bylo popsáno vpříkladu 1. Získá se 1,0 díl surového pro-duktu II a 0,5 dílu surového maytansinolu.Přikládá ,ΙΟΟΟΟΟ objemových dílů násadní živnépůdy, nacházející se ve fermentačnímtair-ku ž nerezové oceli o obsahu 200 000 obje-mových, dílů, se Inokuluje 1000 objemový- 20 mi díly kultury získané způsobem popsanýmv příkladu 2, a naočkovaná půda se inku-buje při teplotě 28 °C, za provzdušňování(100 OOO objemových dílů za minutu) a zamíchání (200 otáček za minutu] po dobu48 hodin. Získaná násadní kultura se pře-vede do fermentačního tanku z nerezovéoceli o obsahu1, 214881 19, 0.022 parts of crystalline maytanesinol are obtained; EXAMPLE 3 32,000 parts of filtered cells obtained as described in Example 2 are extracted with stirring of 50,000 volumes of 70% aqueous acetone for 3 hours. The mixture is filtered on a pressure filter and extracted with 50,000 parts by volume of 70% aqueous acetone followed by filtration. The filtrates are combined, acetonse. distillation under reduced pressure, and the residual fraction is adsorbed on a column of 5000 parts by volume of ionic resin resin Diaton HP-10 (manufactured by Mitsubishi KaKi KK1 The column is washed with 20,000 parts by volume of water and 50% aqueous methanol and eluted with 15% by volume). The eluate is concentrated under reduced pressure to 3000 parts by volume, 3000 parts by volume of water is added and the mixture is shaken with 3,000 parts by volume of ethyl acetate, the operation being repeated one more time, ethylation, melt extracts are combined. washed with water, dried over anhydrous sodium sulphate and concentrated under reduced pressure to 200 parts by volume, petroleum ether is added to the concentrated solution and the precipitate formed is filtered off to give 280 parts of crude product I which is purified by column chromatography on silica gel as described in Example 1. 1.0 parts of crude product II and 0.5 were obtained In part, ΙΟΟΟΟΟ parts by volume of feed nutrient, contained in a stainless steel fermenter containing 200,000 parts by volume, is inoculated with 1000 parts by volume of a culture obtained as described in Example 2, and the inoculated soil is Incubate at 28 ° C, with aeration (100,000 parts by volume per minute) and agitation (200 rpm) for 48 hours. The batch culture is transferred to a stainless steel fermentation tank 2 OOO OOO objemových dílů,obsahujícího 1 000 000 objemových dílů fer-mentační živné půdy stejného složení, jakbylo popsáno v příkladu 1, v transplantač-ním poměru 10 %. Kultivace se provádí přiteplotě 28 °C, za provzdušňování (1000 OOOobjemových dílů za minutu), za míchání[120 otáček za minutu (1/3 DT) ] a za vnitř-ního tlaku 1 kg/cm2, po dobu 90 hodin,Získaná kultura má titr 20 jug/ml, jak bylozjištěno testovací metodou popsanou v pří-kladu 1. K 900 000 dbjemovým dílům kultivační ka-paliny získané shora uvedeným způsobemsa přidá 600 000 objemových dílů acetonu,směs se jednu hodinu míchá a pak se přidá20 000 dílů křeméliny Hyflo-supercel (vý-robce Johnes &amp; Manvilie, USA). Směs sedále míchá a pak se zfiltruje pomocí tlako-vého filtračního přístróje. K 1 700 OOO obje-movým dílům získaného filtrátu se přidá500 0100 objemových dílů vody a směs se ex-trahuje na PcdbielniakOvě koloně ( výrobcePodbielniak, lne., USA] 1 OOO 00.0 objemový-mi díly ethylacetátu. Ethylacetátový extraktse promyje vodou, vysuší přidáním bezvodé-ho síranu sodného a zahustí za sníženéhotlaku. K zahuštěnému roztoku se přidá pe-trolether a vyloučená sraženina se odfiltrujea vysuší. Uvedeným způsobem se získá 680dílů surového produktu I, který se potéčistí způsoby popsanými v příkladech 2 a2,000,000 parts by volume, containing 1,000,000 parts by volume of fermentation broth of the same composition as described in Example 1, in a 10% transplantation ratio. The cultivation is carried out at a temperature of 28 ° C, with aeration (1000,000 parts by volume per minute), with stirring [120 rpm (1/3 DT)] and at an internal pressure of 1 kg / cm 2, for 90 hours. has a titer of 20 µg / ml as determined by the test method described in Example 1. 600,000 parts by volume of acetone are added to 900,000 parts by volume of the culture liquid obtained by the above method, the mixture is stirred for one hour and then 20,000 parts of silica are added Hyflo-supercel (Johnes &amp; Manvilie, USA). The mixture was stirred and then filtered through a pressurized filtering jet. 5000000 parts by volume of water are added to 1700,000 parts by volume of the filtrate obtained and the mixture is extracted on a column in a column (manufactured by Podbielniak, Inc., USA) with 1 000 00.0 parts by volume of ethyl acetate, and the ethyl acetate extract is washed with water, dried by adding anhydrous To the concentrated solution is added the ether and the precipitate formed is filtered off and dried, yielding 680 parts of crude product I which is then purified as described in Examples 2 and 5. 3.Získá se 1,1 dílu maytanacinu, 2,2 dílu pro-pionátu maytansinolu a 0,1 dílu maytansi-nolu. ' ' pSedmét Způsob výrctby maytansinolu, maytanacinunebo- propionátu maytansinolu, vyznačujícíse tím, že se mikroorganismus kmene No-cardia číslo C-15003 [IFO 13726] kultivuje vživném prostředí obsahujícím asimilova,těl-ně zdroje uhlíku a stravitelné zdroje dusíku VYNÁLEZU při teplotě 12 až 38 °C tak dlouho, dokudse maytansinol, maytanacin nebo propionátmaytansinolu nenahromadí ve zmíněném pro-středí, a že se poté uvedené sloučeniny izo-lují za použití rozpouštědel, adsorbentů a/ne-bo iontoměničových pryskyřic.1.1 parts of maytanacin, 2.2 parts of maytansinol propionate and 0.1 parts of maytansinol are obtained. BACKGROUND OF THE INVENTION A method for producing maytansinol maytansinol maytansinol propionate, characterized in that the microorganism of the No-cardia strain C-15003 [IFO 13726] is cultured in a nutrient-containing nutrient, body-carbon source and digestible nitrogen source of the invention at 12 to 38 ° C until maytansinol, maytanacin or propionate maytansinol accumulate in said medium, and said compounds are then isolated using solvents, adsorbents and / or ion exchange resins.