DE2921085C2

DE2921085C2 -

Info

Publication number: DE2921085C2
Application number: DE2921085A
Authority: DE
Inventors: Mamoru Fuchu Tokio/Tokyo Jp Arai; Akio Yokohama Kanagawa Jp Torikata; Ryuzou Ageo Saitama Jp Enokita; Tatsuo Higashikurume Tokio/Tokyo Jp Haneishi; Mutsuo Tokio/Tokyo Jp Nakajima
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1978-05-24
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1987-08-27
Also published as: FR2426697A1; IT1120973B; JPS6024717B2; IT7968118A0; FR2426697B1; US4336249A; AT364082B; DE2921085A1; JPS54160302A; GB2021558A; GB2021558B; NL7904094A; US4332902A; ES480904A1; CH641492A5

Description

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotisch wirksame Substanz, die als Mycoplanecin bezeichnet wird.

Die erfindungsgemäße neue antibiotische Substanz Mycoplanecin ist durch folgende physikalische und chemische Eigenschaften gekennzeichnet:

1. Farbe und Zustandsform: Weißes Pulver;
2. Schmelzpunkt: 161-167°C;
3. Spezifische Drehung: - 66° (c = 0,4, Chloroform);
4. Elementaranalyse:
C: 61,78%; H: 8,48%; N: 11,75% (nach der Trocknung zur Gewichtskonstanz);
5. Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
Nur Endabsorption, gemäß Fig. 1 der Zeichnungen, bei der Messung in einer Konzentration von 20 µg/ml in einer 50prozentigen (V/V) wäßrig-methanolischen Lösung;
6. Infrarot-Absorptionsspektrum:
im KBr-Preßling gemessenes Spektrum gemäß Fig. 2 der Zeichnungen;
7. Kernresonanzspektrum:
Das in Deuterochloroform als Lösungsmittel gegen Tetramethylsilan (TMS) als inneren Standard gemessene Spektrum gemäß Fig. 3 der Zeichnungen;
8. Löslichkeit:
Löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform.
Wenig löslich in Benzol.
Unlöslich in Wasser.
9. Farbreaktionen:
Braunfärbung mit 50prozentiger (V/V) wäßriger Schwefelsäure.
Positiv gegen Jod und Kaliumpermanganat im Silicagel- Dünnschichtchromatogramm.
Negativ gegen Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin.
10. Aufbau aus Aminosäuren:
Durch 20stündige Hydrolyse mit 6-n-Chlorwasserstoffsäure bei 105°C wurden jeweils 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methylhexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylprolin und Äthylprolin und 2 Mol N-Methylvalin aufgefunden.

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt starke antibakterielle Aktivität gegen verschiedene Bakterien des Genus Mycobakterium.

Darüber hinaus zeigt Mycoplanecin Rf-Werte (bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel, F 254, 0,25 mm, Nr. 5715, der Merck und Co. Inc.) von 0,15 nach Entwicklung mit Äthylacetat und von 0,64 nach der Entwicklung mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 95 : 5.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz wird ein neuer Microorganismus, Actinomycetes nov. sp. Stamm Nr. 41 042 verwendet. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Sumoto City, Hyogo Prefecture, Japan, gewonnen wurde. Der Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt und hat die nationale Hinterlegungsnummer FERM-4504 und die internationale Hinterlegungsnummer FERM BP-1139 erhalten.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der antibiotischen Substanz Mycoplanecin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm Actinoplanes nov. sp. Nr. 41 042 = FERM BP-1139 auf einem Kulturmedium züchtet und das Mycoplanecin aus dem Mycel, dem Filtrat oder aus der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe üblicher Methoden, die an seine physikalisch-chemischen Eigenschaften angeglichen sind, isoliert und reinigt.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Arzneimittel, das einen Wirkstoff und gegebenenfalls übliche Träger- und Zusatzstoffe enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff die vorstehend definierte Substanz Mycoplanecin enthält.

Nachstehend werden morphologische Charakteristika und physiologische Eigenschaften von Actinomycetes nov. sp. Stamm Nr. 41 042 beschrieben:

1. Morphologische Eigenschaften

Bei der Züchtung auf dem Medium ISP4 gemäß der Vorschrift des International Streptomyces Project (ISP) bei 28°C während 14 Tagen zeigte Stamm Nr. 41 042 bei der Beobachtung unter dem Mikroskop folgende morphologische Eigenschaften:
Sphärische bis subsphärische Sporangien mit einem gewöhnlichen Durchmesser von 7-15 µm;
Sporen einer Größe von 0,8 µm × 1,3 µm.
Diese Sporen haben Geißeln und besitzen im Phosphatpuffer vom pH 7,0 eine Motilität von etwa 40 Minuten.

Die Ergebnisse beim Wachstum auf verschiedenen Medien bei 28°C während 14 Tagen sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

2. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften von Stamm Nr. 41 042 sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Es wurden folgende Medien verwendet:

Medium A:Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1) Medium B:Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6)

In der nachstehenden Tabelle 3 wird das Kohlenstoffquellenausnutzungsmuster für Stamm Nr. 41 042 auf Pridham-Gottlieb's-Agar-Medium bei 28°C nach 14 Tagen gezeigt.

Tabelle 3

Es wurden folgende Medien verwendet:

Medium C:Pridham-Gottlieb-Agar Medium D:Pridham-Gottlieb-Agar plus 0,5% Hefeextrakt.

3. Mycel-Komponenten

Ein Säurehydrolysat der Mycelien wurde durch Papierchromatographie nach den Verfahren analysiert, die von B. Becker et al in Applied Microbiology, 12, 421-423 (1964) und 13, 236-243 (1965) und von M. P. Lechevalier et al in "The Actinomycetales" von H. Prauser, 311-316 (1970) beschrieben wurden. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt.

Tabelle 4

Zellwand-Typ

Durch diese Ergebnisse wird bestätigt, daß es sich um den Zellwand-Typ II handelt.

Tabelle 5

Saccharidkomponenten der gesamten Zelle

Wie aus den vorstehend beschriebenen Eigenschaften klar ersichtlich ist, gehört Stamm Nr. 41 042 dem Genus Actinoplanes der Familie Actinoplanaceae innerhalb der Spezies Actinomycetes an. Dieser Schluß gründet sich auf die Bildung von sphärischen bis subsphärischen Sporangien, beweglichen Sporen und Zellwänden des Typs II. Der neue Stamm wird daher als Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41 042 bezeichnet.

Die Züchtung der Mycoplanecin bildenden Microorganismen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unter den Bedingungen erfolgen, die üblicherweise zur Züchtung der Spezies Actinoplanes angewendet werden. Bevorzugt werden die Schüttelkultur oder Submerskultur unter Belüftung und Rühren in einem flüssigen Medium. Das zur Züchtung verwendete Nährmedium kann eine Zusammensetzung haben, wie sie üblicherweise zur Züchtung von Actinomycetes angewendet wird. Dieses Medium enthält somit eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z. B. Glucose, Arabinose, Galactose, Mannose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, ein pflanzliches Fett oder Öl, wie Sojabohnenöl, Maisöl oder Leinsamenöl, ein tierisches Fett oder Öl, wie Geflügelöl oder Specköl oder Fischöl, eine assimilierbare Stickstoffquelle, z. B. Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Maisquellwasser, Hafermehl, entrahmte Milch, Pepton, Fleischextrakt, lebende Hefe, Hefeextrakt, Casaminosäure (Aminosäuren aus Casein), Natriumnitrat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumsulfat, sowie anorganische Salze, z. B Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate, Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat oder Calciumchlorid. Es kann außerdem kleine Mengen verschiedener anderer Metallsalze enthalten, z. B. Ferrosulfat, Kupfersulfat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Kobaltsulfat.

Die Züchtung in einem flüssigen Medium erfolgt vorzugsweise aerob unter Lüftung und Rühren. In diesem Fall kann dem Medium ein Antischaummittel zugesetzt werden. Zu geeigneten Antischaummitteln gehören Siliconöle, pflanzliche Öle oder oberflächenaktive Mittel.

Die Züchtung wird in geeigneter Weise bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert und bei einer Temperatur von 18 bis 30°C, vorzugsweise bei etwa 28°C durchgeführt.

Der Titer des in der Kulturbrühe gebildeten Mycoplanecins kann im Verlauf der Züchtung quantitativ mit Hilfe der Cup-assay- Methode unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Test-Microorganismus bestimmt werden. Die maximale Produktion von Mycoplanecin wird im allgemeinen nach 3-5tägiger Züchtung erreicht.

Mycoplanecin ist sowohl im flüssigen Anteil, als auch in dem Mycel-Anteil der Kulturbrühe vorhanden, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird. Um das Antibiotikum nach Vervollständigung der Züchtung aus der Kulturbrühe zu gewinnen, werden das Mycel und andere Feststoffe zuerst durch Filtration, beispielsweise unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel, oder durch Zentrifugieren, von der flüssigen Phase entfernt. Das Mycoplanecin, welches in dem Mycel-Anteil, dem Filtrat oder in der überstehenden Flüssigkeit vorliegt, kann dann mit Hilfe üblicher Methoden, die an seine physikalisch-chemischen Eigenschaften angeglichen sind, isoliert und gereinigt werden.

So kann beispielsweise das in dem Mycel-Anteil vorliegende Mycoplanecin durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, extrahiert werden. Das Lösungsmittel wird dann von dem Extrakt entfernt und der Rückstand wird mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, Äthylacetat, Methylisobutylketon oder Methylenchlorid, rückextrahiert. Das in dem flüssigen Anteil der Kulturbrühe vorliegende Mycoplanecin kann ebenfalls mit einem solchen wasserunmischbaren Lösungsmittel extrahiert werden, wonach es normalerweise mit dem Extrakt aus dem Mycel-Anteil kombiniert wird und konzentriert wird, so daß ein roher Mycoplanecinextrakt erhalten wird.

Gemäß einer anderen Ausführungsform kann Mycoplanecin durch Zugabe eines wassermischbaren Lösungsmittels, wie eines der vorstehend beispielhaft genannten Lösungsmittel, direkt zu der Kulturbrühe extrahiert werden, ohne daß das Mycel aus dem flüssigen Anteil abgetrennt wird. Der gebildete Extrakt wird filtriert und konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wonach der Rückstand wie in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel extrahiert wird.

Das auf diese Weise erhaltene Mycoplanecin kann mit Hilfe irgendeiner der Methoden, die zur Reinigung von Verbindungen mit ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften gut bekannt sind, weiter gereinigt werden; vorzugsweise werden jedoch Reinigungsmethoden unter Verwendung eines Adsorptionsmittels oder mit Hilfe der Gegenstrom-Verteilungsmethode, bevorzugt. Zu geeigneten Adsorptionsmitteln gehören Aluminiumoxid, Silicagel, Sephadex (eine Reihe von organischen Polysaccharidderivaten) oder Cellulose. Insbesondere wird die Trennmethode durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel als Träger und Methanol, Äthylacetat, Chloroform oder von Gemischen dieser Lösungsmittel als Elutionsmittel, bevorzugt. Die präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel ist ebenfalls gut wirksam zur Herstellung von höher gereinigtem Mycoplanecin.

Das auf diese Weise erhaltene, gereinigte Mycoplanecin zeigt bei Farbreaktionen mit Schwefelsäure, Kaliumpermanganat oder Jod im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm einzelne Flecken und hat außerdem die vorstehend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Die inhibierenden Mindestkonzentrationen (MIC) of Mycoplanecin gegen verschiedene Microorganismen sind in der nachstehenden Tabelle 6 gezeigt. Die Werte wurden in folgender Weise bestimmt:

Für Mycobakterien nach der Inkubation während 5 Wochen bei 37°C mit Hilfe der Verdünnungsmethode unter Verwendung von flüssigem Dubos-Medium mit einem Gehalt an 1% Rinderserum. Allgemein bei Bakterien nach der Inkubation während 24 Stunden bei 37°C mit Hilfe der Agar-Verdünnungsmethode, wobei Herzinfusionsagarmedium verwendet wurde. Bei Fungi und Hefen nach der Inkubation während 48 Stunden bei 26°C mit Hilfe der Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Agarmedium nach Sabouraud.

Tabelle 6

Die Toxizität der antibiotischen Substanz Mycoplanecin wurde durch intraperitoneale Verabreichung an Mäuse in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht geprüft. Dabei ging keine Maus ein.

Die Herstellung von Mycoplanecin wird in den nachstehenden Beispielen verdeutlicht.

Beispiel 1

In einem 500-ml-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines Impfkulturmediums gegeben, welches vor der Sterilisierung einen pH-Wert von 7,0 hatte. Dieses Medium hatte folgende Zusammensetzung (die Prozentangaben sind Gewicht/Volumen):

Glucose1% Glycerin1% Hafermehl0,5% Saccharose1% Sojabohnenmehl2% Casaminosäure0,5% lebende Hefe1% Calciumcarbonat0,1% Wasser q.s.

Dieses Medium wurde mit einer Kultur von Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41 042 beimpft und wurde in pendelnder Schüttelkultur 96 Stunden bei 28°C bebrütet. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde in 5-ml-Anteile unterteilt und jeder Anteil wurde in einen Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der jeweils 100 ml eines Produktionsmediums mit einem pH-Wert von 7,0 vor der Sterilisierung mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthielt (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen):

Glycerin0,5% Saccharose2% Sojabohnenmehl1% lebende Hefe1% Maisquellwasser0,5% CoCl₂ · 6 H₂O0,001% Wasser q. s.

Dann wurde eine Schüttelkultur mit Pendelbewegung während 96 Stunden bei 28°C durchgeführt. Die gebildeten Kulturbrühen wurden kombiniert.

Zu 4 l der kombinierten Kulturbrühen (pH 7,2) wurden 5% (Gewicht/Volumen) eines Filterhilfsmittels (Celite 545) zugefügt und die Brühe wurde filtriert, um die Flüssigkeit von dem das Mycel enthaltende Filterkuchen abzutrennen. Das Filtrat wurde mit 2 l Äthylacetat extrahiert, um das darin enthaltene Mycoplanecin zu gewinnen, während der Mycelkuchen mit 2 l Aceton, das 20% (Volumen/Volumen) Wasser enthielt, extrahiert wurde. Das Aceton wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 2 l Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Extrakte aus dem Filtrat und dem Mycelkuchen wurden kombiniert, wobei 4 l eines kombinierten Extrakts erhalten wurden.

Dieser kombinierte Extrakt wurde zweimal mit jeweils 1 l einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 1,07 g einer öligen Substanz erhalten wurden.

Diese ölige Substanz wurde in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und an einer 20 g Silicagel enthaltenden Säule adsorbiert, die vorher mit Chloroform behandelt worden war. Die Säule wurde dann mit Chloroform gewaschen und Verunreinigungen wurden mit Hilfe eines Gemisches aus Chloroform und Äthylacetat im Volumenverhältnis 1 : 1 und danach nur mit Äthylacetat eluiert. Das gewünschte Mycoplanecin wurde danach mit einem Mischlösungsmittel eluiert, das aus 95 Volum.-% Äthylacetat und 5 Volum.-% Methanol bestand. 1 l einer aktiven Fraktion wurde aus den Eluatfraktionen abgetrennt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 130 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden.

110 mg dieses weißen Pulvers wurden in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und die erhaltene Lösung wurde in eine 200-ml-Säule, die Sephadex LH-20 enthielt, welche mit Chloroform gefüllt war, gegossen. Die Elution wurde dann mit Chloroform durchgeführt. Die dabei gewonnenen aktiven Fraktionen wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 90 mg Mycoplanecin in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden. Dieses gereinigte Produkt zeigte im Silicagel-Dünnschichtchromatogramm einzelne Flecken mit Jod, Schwefelsäure und Kaliumpermanganat.

Beispiel 2

Zehn 500-ml-Sakaguchi-Kolben, die jeweils 100 ml eines Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielten, wurden mit einer Kultur von Actinoplanes nov. sp. Stamm Nr. 41 042 angeimpft und eine Schüttelkultur unter Pendelbewegung wurde 96 Stunden bei 28°C durchgeführt.

Ein 30-l-Krugfermenter, der 15 l eines Produktionsmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, wurde mit 750 ml der wie oben beschrieben gebildeten Kulturbrühe beimpft und das beimpfte Medium wurde dann einer Schüttelkultur unter Rühren mit 250 Upm und Belüftung bei einer Temperatur von 28°C und einer Luftzuführung von 15 l/min während 80 Stunden unterworfen.

Zu der gebildeten Kulturbrühe wurden 15 l Aceton gegeben, das Gemisch wurde gerührt und das Produkt wurde mit Hilfe von 500 g Celite filtriert. 25 l des Filtrats wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei das Aceton abdestilliert wurde. Zu der verbleibenden Flüssigkeit (15 l) wurden 7 l Methylenchlorid zugesetzt und die Extraktion erfolgte unter Schütteln und Rühren. Der Rückstand wurde weiterhin mit zusätzlichen 7 l Methylenchlorid extrahiert und die Extrakte wurden kombiniert, wonach das Lösungsmittel verdampft wurde und 1,8 g einer öligen Substanz verblieben.

Eine Lösung dieser öligen Substanz in einem kleinen Volumen Chloroform wurde an einer 50 g Silicagel enthaltenden und mit Chloroform gefüllten Säule adsorbiert und von dieser Säule wurde Mycoplanecin mit Hilfe eines aus 99 Volum.-% Chloroform und 1 Volum.-% Methanol bestehenden Lösungsmittelsystems eluiert.

Dabei wurden 400 ml aktiver Fraktionen gewonnen und durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 390 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Eine Lösung dieses weißen Pulvers in einem kleinen Volumen Chloroform wurde dann der präparativen Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silicagelplatte (5717 der Merck & Co. Inc.) unterworfen und mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch im Volumverhältnis 95 : 5 entwickelt. Die aktiven Banden wurden mit Äthylacetat extrahiert, wobei 250 mg Mycoplanecin als weißes Pulver in einer Reinheit von etwa 90% (bestimmt durch biologischen Test) erhalten wurden.

Claims

1. Antibiotisch wirksame Substanz Mycoplanecin, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(1) Farbe und Zustand: weißes Pulver;
(2) Schmelzpunkt: 161 bis 167°C;
(3) spezifische Drehung: - 66°C (c = 0,4, Chloroform);
(4) Elementaranalyse:
C 61,78%; H 8,48%; N 11,75% (nach Trocknung zur Gewichtskonstanz);
(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
Nur Endabsorption gemäß Fig. 1, bei Messung von 20 µg/ml in 50% (V/V) wäßrig-methanolischer Lösung;
(6) Infrarot-Absorptionsspektrum: Gemäß Fig. 2, bei Messung in KBr- Preßscheibe;
(7) Kernresonanzspektrum (NMR):
Gemäß Fig. 3, bei Messung in Deuterochloroform als Lösungsmittel und mit Tetramethylsilan (TMS) als innerem Standard;
(8) Löslichkeit:
Löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton und Chloroform;
wenig löslich in Benzol; unlöslich in Wasser;
(9) Farbreaktionen:
Braunfärbung mit 50%iger (V/V) wäßriger Schwefelsäure;
positiv gegenüber Jod und Kaliumpermanganat am Silicagel-Dünnschichtchromatogramm;
negativ gegenüber Ninhydrin und 2,4-Dinitrophenylhydrazin;
(10) Aufbau aus Aminosäuren:
Je 1 Mol Glycin, Prolin, Leucin, 2-Amino-5-methyl- hexansäure, N-Methylthreonin, N-Methylleucin, Methylprolin und Äthylprolin, sowie 2 Mol N-Methylvalin (gemäß der Bestimmung nach Hydrolyse mit 6n-Chlorwasserstoffsäure bei 105°C während 20 Stunden);

wobei die Fig. 1, 2 und 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstellung der antibiotischen Substanz Mycoplanecin des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Actinoplanes nov. sp. FERM BP-1139 auf einem Kulturmedium züchtet und das Mycoplanecin aus dem Mycel, dem Filtrat oder aus der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe üblicher Methoden, die an seine physikalisch- chemischen Eigenschaften angeglichen sind, isoliert und reinigt.

3. Arzneimittel, enthaltend einen Wirkstoff und gegebenenfalls übliche Träger- und Zusatzstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff die antibiotische Substanz nach Anspruch 1 enthält.