DE3013246A1

DE3013246A1 - Glycopeptid-antibiotikum a/16686, seine salze, verfahren zu seiner herstellung, arzneimittel und verwendung

Info

Publication number: DE3013246A1
Application number: DE19803013246
Authority: DE
Inventors: Bruno Cavalleri; Hermes Pagani; Giancarlo Volpe
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA; Lepetit SpA
Current assignee: Biosearch Italia SpA
Priority date: 1979-04-07
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1980-10-16
Also published as: MX5958E; LU82327A1; PT71064A; PH17230A; DK149336B; IT8021162A0; NL192989B; FI65630B; US4303646A; NO155496C; NO800869L; AU535727B2; IL59704A0; ATA187480A; US4328316A; SE8002601L; FR2452931A1; DE3013246C2; BE882632A; CH655515B

Description

u.Z.: P Case: Lp GRUPPO L-EPETIT Mailand, Italien

"Glycopeptid-Antibiotikum A/16686, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung, Arzneimittel und Verwendung"

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum A/16606, seine Salze, ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Züchtung eines neuen Stammes der Gattung Actinoplanes, sowie Arzneimittel mit einem Gehalt an dieser Verbindung und die Verwendung dieser Verbindung als antibakterielles Mittel.

Das Antibiotikum A/16686 ist ein Glycopeptid-Antibiotikum von basischem Charakter, das mit Säuren Salze bildet. Gegenstand der Erfindung sind somit auch die Salze dieses Antibiotikums und insbesondere die physiologisch bzw. pharmakologisch verträglichen Salze davon.

Der Einfachkeit halber wird der Ausdruck "Antibiotikum A/16686" für das Antibiotikum in Form der freien Base sowie für dessen Salze mit Säuren verwendet. 35

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Das Antioiotikum A/16686 bewirkt eine in vitro-Hemmung von bestimmten pathogenen Bakterien, insbesondere von gram-positiven Bakterien. Ausserdem bewirkt eine parenterale Verabfolgung des Antibiotikums A/16686 einen starken Schutz gegenüber experimentell hervorgerufenen Infektionen bei Mäusen.

Wie vorstehend erwähnt, wird das Antibiotikum A/16686 durch Züchtung eines neuen Stammes der Gattung Actinoplanes gebildet. Eine Kultur dieses aus einer in Vaghalbcd (Indien) gewonnenen Bodenprobe isolierten Stammes wurde am 30. Januar 1979 bei der ATCC (American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 33076 hinterlegt.

Nachstehend sind die Eigenschaften von Actinoplanes sp. ATCC 33076 näher erläutert.

Morphologie

Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Medien unter Bildung

eines orangefarbenen Substratmyzels. Er bildet kein Pigment. Luftmyzel wird nie gebildet. Bei mikroskopischer Prüfung des vegetativen Myzels erkennt man verzweigte Hyphen mit einem Durchmesser von etwa 1 /im. Sporangien werden spärlich nur auf Kartoffel-Agar gebildet und sind gewölbt mit einer

sehr unregelmässigen Oberfläche und einem Durchmesser von 5,0 bis 9,0^nm. Eine Sporangienfreisetzung wird nach einem Bruch der Sporangiumwand beobachtet. Die subsphärischen Sporen sind beweglich (1,0 bis 1,5 /im Durchmesser). Bei der

Analyse der Zellwandbestandteile ergibt sich meso-Diamino-30

pimelinsäure und ein Zuckermuster vom Typ D (vgl. Lechevalier

und Mitarb., Chemical composition as a criterium in the classification of Actinomycetes, Adv. Applied Microbiology, Bd. i4 (1971), Academic Press N.Y.).

KuItüreigenschaften

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften von Actinoplanes

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30132A6

ATCC 33076 nach Züchtung auf verschiedenen Standardmedien gemäss Shirling und Gottlieb,(Intern. J. System. Bact., Bd. 16 (1966), S. 313 bis 340) und auf anderen Medien gemäss Waksman, (The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and Wilkins

Co., 1961), zusammengestellt. Die Kultureigenschaften werden nach 6- bis 14-tägiger Inkubation bei 30⁰C bestimmt.

Tabelle I Kultureigenschaften

10

Die bei einigen Kulturmedien angegebenen Ziffern beziehen

sich auf die Angaben von Shirling und Gottlieb in "Methods for characterization of Streptomyces species", Intern. J. System. Bact., Bd. 16, (1966), S. 313 bis 340.

15

Kulturmedien Züchtungseigenschaften

Medium Nr. 2 (Hefeextrakt- ' reichliches Wachstum, gerun-Malz-Agar) zelte Oberfläche, hellbraun

12 H 12

20

Medium Nr. 3 (Hafermehl-Agar) spärliches Wachstum, dünn,

hell orangefarben 9 B 6

Medium Nr. 4 (anorganische massiges Wachstum, krustige Salze-Stärke-Agar) Oberfläche, orangefarben

11 L 12

Medium Nr. 5 (Glycerin- " spärliches Wachstum, glasklar Asparagin-Agar)

Medium Nr. 6 (Pepton-Hefe- spärliches Wachstum, glasklar extrakt-Eisen-Agar) bis hellbraun

Medium Nr. 7 (Tyrosin-Agar) spärliches Wachstum, glatte

Oberfläche, braun 5 D 11

30

Hafermehl-Agar (gemäss Waksman) reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche, orangefarben bis braun t2 C 10

Hickey und Tresner-Agar reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, orangefarben 11 G 8 35

Czapek-Glucose-Agar massiges Wachstum, krusti

ge Oberfläche» orangefarben 11 G 8

0300A2/OS4T

Kulturmedien

Glucose-Asparagin-Agar Nähragar Kartoffel-Agar Bennett-Agar CaIciuramalat-Agar

Magermilch-Agar Czapek-Agar Hühnerei-Agar Pepton-Glucose-Agar Agar

Loeffler-Serum Kartoffeln

Gelatine

Cellulose

Ziichtungseigen schäften

spärliches Wachstum, krustige Oberfläche, hell-orangefarben 11 F 6

massiges Wachstum, glatte Oberfläche, orangefarben 11 G 8

reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche, bernsteinfarben-braun 12 E 10

reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche, orangefarben 11 C 8

massiges Wachstum, glatte Oberfläche, hell-orangefarben 10 C 6

reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche, orangefarben 9 C 2

massiges Wachstum, krustige Oberfläche, orangefarben 10 D 7

massiges Wachstum, glatte Oberfläche, glasklar bis hell-orangefarben

reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche, orangefarben 11 G 11

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, glasklar

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, orangefarben

spärliches Wachstum, krustig, hellbraun

spärliches Wachstum, hellorangefarben

sehr spärliches Wachstum, dünn, glasklar

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KohlenstoffVerwertung

In Tabelle II ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen gemäss dem Verfahren von Pridham und Gottlieb, J. Bact., Bd.

(1948), S. 107, angegeben.
5

Tabelle II Kohlenstoffquellen Verwertung

Inosit

Fructose +

Rhamnose . +

Mannit

Xylose · +

._ Raffinose

Arabinose ·*■

Cellulose

Saccharose +

Glucose +

Mannose +

Lactose

Salicin +

+ = die Kohlenstoffquelle wird verwertet = kein Wachstum

Physiologische Eigenschaften

In Tabelle III sind die physiologischen Eigenschaften des erfindungsgemäss !verwendeten Stammes angegeben.

030042/0041

Tabelle II Untersuchung Ergebnis

Stärkehydrolyse positiv

H₂S-Bildung positiv

Tyrosinase-Reaktion negativ

Caseinhydrolyse positiv

Löslichmachen von Calciummalat negativ

Gelatineverflüssigung positiv

^^.Koagulation positiv Lakmusmilch

"^- Peptonisierung negativ

Cellulosezersetzung negativ

Zur Bildung des Antibiotikums A/16686 wird der Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33076 unter aeroben Bedingungen in einem

wässrigen Nährmedium, das verwertbare Kohlenstoff- und Stickon

stoffquellen und anorganische Salze enthält, gezüchtet.

Zur Züchtung können eine Reihe von in der Fermentationstechnik üblichen Nährmedien verwendet werden, jedoch werden bestimmte Medien besonders bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Fructose, Mannose, Saccharose und der-

25

gleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dergleichen. Als anorganische Salze werden den Züchtungsmedien üblicherweise verwendete lösliche Salze einverleibt, die Ionen liefern, wie Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-,

30

Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat- und Nitrationen. Im allgemeinen wird der das Antibiotikum bildende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet. Die erhaltene Kultur wird sodann zur Beimpfung von Glasfermentern zur Bildung von wesentlichen Mengen des Antibiotikums A/16686 verwendet. Als Anzuchtmedien können die gleichen Medien verwendet werden, die für grössere Fermen-

030042/084?

tationsansätze eingesetzt werden. Möglich ist aber auch die Verwendung von anderen Medien.

Der A/16686 bildende Stamm kann bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 37°C und vorzugsweise von etwa 28 bis etwa 30 C gezüchtet werden.

Während der Züchtung kann die Bildung des Antibiotikums, durch Überprüfung von Proben der Gärbrühe oder von Extrakten der Myzelfeststoffe auf ihre antibiotische Aktivität verfolgt werden. Für diesen Zweck eignen sich Mikroorganismen, deren Empfindlichkeit gegenüber dem Antibiotikum A/16686 bekannt ist. Ein besonders geeigneter Testorganismus ist Sarcina lutea. Der entsprechende biologische Test wird zweckmässigerweise gemäss der Agar-Diffusionsmethode auf Agarplatten durchgeführt. Die maximale antibiotiäche Aktivität tritt im allgemeinen zwischen dem dritten und fünften Tag auf. Das während der Züchtung des Stamms Actinoplanes sp. ATCC 33076 gebildete Antibiotikum findet sich sowohl in der Gärbrühe als auch in der Myzelmasse. Die Gewinnung dieses Antibiotikums kann daher durch getrennte Extraktion von Gärbrühe und Myzel durchgeführt werden.

Die Extraktion der Myzelmasse wird am zweckmässigsten mit Methanol durchgeführt. Es eignen sich aber· auch andere niedere Alkohole und Chloroform. Das Antibiotikum A/16686 wird nach einem üblichen Verfahren als Rohprodukt aus dem Extraktionslösungsmittel gewonnen. In analoger Weise wird die Gärbrühe, vorzugsweise mit n-Butanol, extrahiert. Durch Fällung dieser Extraktionslösung erhält man eine weitere Menge an rohem Antibiotikum A/16686. Die Reinigung des rohen Antibiotikums wird sodann vorgenommen, indem das aus den Extraktionslösungsmitteln gewonnene Produkt mit einem Gemisch aus Chloroform : Äthanol : Wasser =4:7:2 behandelt, das gebildete ölige Produkt abtrennt und in Wasser giesst. Durch diese Behandlung erstarrt das Produkt. Dieses Produkt wird abfiltriert und weiter durch Säulenchro-

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matographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit einem Gemisch aus Acetonitril : 0,01 η HCl =1:1 eluiert wird. Gemäss diesem Verfahren erhält man das Antibiotikum A/16686 in Form des Hydrochlorids, das sodann durch Chromatographie an einer mit vernetztem Dextrangel gepackten Säule entsalzt wird.

Die einzelnen Stufen des vorgenannten Reinigungsverfahrens werden dünnschichtchromatographisch überwacht, wobei ein entsprechendes Lösungsmittelsystem verwendet wird, beispielsweise ein basisches Lösungsmittelsystem, wie n-Propanol : n-Butanol : 1 η Ammoniak =-2:3:4 (obere Phase) oder Methanol : 10-prozentige wässrige Amnjoniumaeetatlösung : 10-prozentiges Ammoniak =10 : 9 : 1. In diesen Lösungsmittelsystemen lassen sich beliebige Salze des Antibiotikums A/16686 in die freie Base überführen. Sämtliche vorgannten Schritte dienen zur Isolierung des reinen Antibiotikums A/16686, das in dem speziellen verwendeten Lösungsmittelsystemen einen bestimmten R„-Wert aufweist.

Es können auch andere Reinigungsverfahren angewendet werden, beispielsweise an sich übliche Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Diese anderen Reinigungsverfahren lassen sich leicht stufenweise zusammenstellen, indem man den Reinigungsfortschritt, wie vorstehend erläutert, dünnschichtchromatographisch überwacht. Durch Verfolgung des bei der Dünnschichtchromatographie gebildeten Flecken des Antibiotikums A/16686 mit einem speziellen R_f-Wert ist es dem Fachmann möglich, die zur Isolierung des reinen Antibiotikums A/16686 geeigneten Verfahrensmassnahmen zu ergreifen.

Gegebenenfalls kann das gemäss dem vorstehend erläuterten Verfahren erhaltene Hydrochlorid des reinen Antibiotikums A/16686 nach an sich üblichen Verfahren in die entsprechende freie Base oder in ein anderes physiologisch bzw. pharmakologisch verträgliches Salz mit einer Säure übergeführt werden.

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Das Antibiotikum A/16686 ist insbesondere gegen gram-positive Mikroorganismen aktiv. In Tabelle IV ist das in vitro-Wirkungsspektrum des Antibiotikums A/16686 zusammengestellt.

Tabelle IV

Organismen' Minimale Hemmkonzentration des Antibiotikums A/i6686_/ue/ml)

S. aureus ATCC 6538 S. aureus ATCC 9144 S. aureus Tour Staphylococcus 1OB Ciba S. epidermidis ATCC 12228 S. saprophyticus NCTC 7292 ' M. flavus ATCC 10240 S. lutea ATCC 9341 S. pyogenes C 203 SKF 13400 S. pneumoniae Feiton UC S. faecalis ATCC 7080 S. foecium ATCC 10541 S. agalactiae ATCC 7077 S. mutans ATCC 27607 C. diphtheriae var.mitis ATCC 11051 C. xerosis NCTC 9755 B. subtilis ATCC 6633 B. cereus var.mycoides ATCC 11778

C. perfringens ISS 30543 P. acnes ATCC 6919

P. acnes ATCC 6922 P. acnes ATCC 25746

030042/0841

C	»,16
0	ι_Γ16
0	.,31
O	>,O8
0	,03 ,
O	,15
O	,016
O	;02
O	,01
O	,05
0	,31
0	,08
O	,02
O	,08
0	,31
O	,02
O	,062
O	,08
O	,16
O	,4
0	/8
O	/⁴

- iß—

1 In Tabelle V sind die Werte für die minimale tlemmkonzentration des Antibiotikums A/16686 gegenüber einer Reihe von klinisch isolierten Stämmen von Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae und Streptococ-

cus faecalis zusammengestellt.

Tabelle V

Org'anismen Minimale Hemmkonzentration des Antibiotikums A/16686 (^g/ml)

S. aureus 54310 L 1096 "

S. aureus 54560/1 L 1097

S. aureus 54 635 L 1098

S. pyogenes L 33 S. pyogenes L 794 S. pyogenes L 800 S. pyogenes L 801 S. pyogenes L 802 S, pyogenes L 803 S. pypgenes L 804 S. pyogenes L 805 S. pneumoniae L 1055 S. pneumoniae L 11O2 S. pneumoniae L 1174 S. faecalis L 768 S. faecalis L 876 S. faecalis L 922

S.· faecalis L 949 S. faecalis L 965 '· S. faecalis L 1139 S. foecium L 763

_ 030Q/.2

O	,62
O	,31
O	,31
O	,04
O	,08
O	,04
O	,16
O	,08
O	,08
O	,62
O	,08
O	,04
O	,04
O	,08
O	,31
ο.	,31
	,31
O₁	,31
ο,	,31
ο,	,62
O₁	,16-

Das Antibiotikum A/16686 besitzt auch eine starke in vivo-Aktivität gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen. Die Wirksamkeit ergibt sich aus Tabelle VI, in der die ED,__n-Werte gegen 3 verschiedene Mikroorganismen bei Mäusen angegeben sind.

Tabelle VI

ED₅₀ mg/kg (s.c.)

S.aureus Tour S. pyogenes S.pneumoniae

C203 ISM Feiton UC 41

A/16686 24,6 0,09 0,2

Das Antibiotikum A/16686 weist eine relativ geringe Toxizität auf. Beispielsweise beträgt der Lü^-Wert bei intraperitonealer Verabfolgung an Mäuse etwa 500 bis 750 mg/kg.

Wie bereits erwähnt, betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Antibiotikums A/16686 und seiner Salze als antibakterielles Mittel. Unter "Verwendung" sind alle .technischen Anwendungsmöglichkeiten zu verstehen, insbesondere ^ die Verarbeitung zu Arzneimitteln.

Diese Arzneimittel für die orale, lokale oder parenterale Verabreichung werden nach üblicher pharmakologischer Praxis hergestellt. Beispiele für entsprechende Präparate sind in Remington's Pharmaceutical Sciences 15. Aufl., 1975, Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania, beschrieben. Entsprechende Beispiele sind Tabletten, Kapseln, Pulver, Salben, Lösungen und Injektionsflüssigkeiten. Der Wirkstoffanteil der Präparate kann 0,5 bis 99 Prozent und vorzugsweise 5 bis 80 Prozent betragen. Die Tagesdosis wird unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, wie Körpergewicht, infizierender Mikroorganismus, Schwere der Infektion und

Dauer und Art der VeraGi3e&<£h4i2g^t)&4t|gelegt. L

^r ft . 3Q13246 ^π

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Züchtung des Stamms Actinoplanes sp. ATCC 33076

Actinoplanes sp. ATCC 33076 wird in einem Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem Schüttelkolben angezüchtet:

Fleischextrakt 3 g/Liter

Hefeextrakt 5 g/Liter

Trypton 5 g/Liter

lösliche Stärke 2k g/Liter

Glucose 1 g/Liter

CaCCs 4 g/Liter

Leitungswasser 1 Liter

Die Kolben werden etwa 96 Stunden bei 28 bis 30 C geschüttelt. Die erhaltenen Anzuchtkulturen (1 Liter) werden zur Beimpfung von jeweils 10 Liter eines Nährmediums, der nachstehend angegebenen Zusammensetzung, das sich in einem Glasfermenter befindet, verwendet:

Fleischextrakt 40 g

Pepton 40 g

Hefeextrakt 10 g

Natriumchlorid 25 g

Sojabohnenmehl 100 g

Glucose 250 g

CaCO_g 50 g

Leitungswasser 10 Liter

Die Fermentationsansätze werden bei 28 bis 30 C unter aeroben Bedingungen und unter Rühren inkubiert. In bestimmten Abständen wird die antibiotische Aktivität auf mikrobio-

O₅ logischem Wege gemäss der Agar-Diffusionsmethode unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt. Die maximale Aktivität wird nach 72- bis 120-stündiger Züchtung erreicht.

L 0 3 Q 0 4 2 / 0 8 4 1 j

Beispiel 2 Gewinnung des Antibiotikums A/16686

170 Liter gemäss Beispiel 1 hergestellte Gesamtfermentationsbrühe werden auf 10⁰C gekühlt und durch Zusatz von i8-prozentiger Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Die erhaltene saure Brühe wird unter Verwendung eines Filterhilfsmittels (Clarcel Flow-Ma) filtriert. Der Myzelkuchen wird mit Wasser gewaschen. Anschliessend werden die filtrierte Brühe und das Myzel getrennt voneinander weiter verarbeitet.

a) Zur Extraktion der Myzelmasse werden 30. Liter Methanol verwendet. Nach Filtration wird nochmals mit einem Gemisch. aus 30 Liter Methanol und 5 Liter Wasser extrahiert. Das verbrauchte Myzel wird verworfen. Die beiden Methanolextrakte werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 40 C zu 6 Liter eines wässrigen Konzentrats eingeengt. Dieses wässrige Konzentrat wird 3 mal mit jeweils 10 Liter n-Butanol extrahiert. Die Extraktionsflüssigkeiten

20

werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt.

Das erhaltene Konzentrat wird zu Petrolather gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dekantieren abgetrennt

25

und mit einer weiteren Menge an Petroläther versetzt. Der

Niederschlag wird abfiltriert und bei'Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 80 g Antibiotikum A/16686 in Form eines Rohmaterials mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pneumoniae UC ¹H von 0,1 ug/ml. 30

b) Das vereinigte Gemisch aus filtrierter Brühe und Waschflüssigkeit (165 Liter) wird auf 10⁰C gekühlt und durch Zusatz von 2,5 Liter konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird mit 80 Liter

35

n-Butanol extrahiert. Der organische Extrakt wird sodann bei Temperaturen unter 35 C zu 6 Liter Butanolkonzentrat eingeengt. Dieses Konzentrat wird zu Petroläther

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gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dekantieren abgetrennt und mit einer weiteren Menge an Petroläther versetzt. Der Feststoff wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 26,3 g Antibiotikum A/16686 in Form eines Rohprodukts mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pneumoniae UC 41 von 0,8 ,ug/ml.

Beispiel 3 Reinigung des Antibiotikums A/16686

47 g des gemäss Beispiel 2 a) erhaltenen rohen Antibiotikums A/16686 werden mit 1,4 Liter eines Gemisches aus Chloroform: Äthanol : Wasser im Volumenverhältnis 4:7:2 behandelt. Das gebildete ölige Produkt wird von der Lösung dekantiert.

Sodann wird das ölige Produkt mit weiteren 70 ml des vorgenannten Gemisches versetzt und der Trennvorgang wiederholt. Das ölige Produkt erstarrt bei Behandlung mit 440 ml Wasser. Es wird abzentrifugiert und filtriert.

a) Der abgetrennte Feststoff wird in 170 ml Wasser suspendiert, durch Zusatz von 400 ml Methanol in Lösung gebracht und filtriert. Anschliessend werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck durch Zusatz von n-Butanol bei einer Temperatur, die nie über 35⁰C ansteigt, abgestreift. Man erhält etwa 50 ml eines Butanolkonzentrats. Bei Zusatz von 500 ml Diäthyläther bildet sich ein Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 1,012 g eines relativ reinen Produkts des Antibiotikums A/16686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pyogenes von 0,025 >ig/ml. Dieses Produkt wird den nachstehend angegebenen Reinigungsverfahren unterzogen:

1,58 g des vorstehend erhaltenen Antibiotikums A/16686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegen S. pyogenes von 0,025 ^u/ml*werden in einem Gemisch aus Acetonitril und V/asser

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im Volumenverhältnis 1 : 1 gelöst. Die Lösuns wird auf eine mit 430 g Kieselgel· 60 (Merck 0,06 bis 0,2 ml) gepackte Säuie, die in dem gieichen Gemisch hergestellt worden ist, aufgesetzt. Als Laufmittel wird zunächst das vorgenannte Gemisch aus Acetonitril und Wasser verwendet, wobei 70 Fraktionen von jeweils 20 ml abgenommen werden. Anschliessend werden weitere 290 Fraktionen mit jeweils 20 ml unter Verwendung eines Gemisches aus Acetonitril und 0,01 η Salzsäure im Volumenverhältnis 1 : 1 abgenommen.--Die Elution der Säule wird dünnschichtchromatographisch an 60 Fpj-w-Kieselgelplatten und durch Bestimmung der Aktivität der Fraktionen gegenüber Sarcina lutea überwacht. Die Fraktionen 130 bis 265 werden vereinigt und durch Abstreifen der Lösungsmittel mit n-Butanol zu einer n-Butanolkonzentration mit einem Volumen von 20 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird in eine grosse Menge Diäthyläther gegossen. Der gebiidete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über P₂ ⁰C getrocknet. Man erhält 1,015 g des Antibiotikums A/16686.

0,67 g des vorstehenden Produkts werden in 24 ml Wasser und 76 ml Methanol gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 220 g Sephadex LH-20 gepackte Säule der Abmessungen 3,0 χ 62,0 cm aufgesetzt, die mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 7 : 3 geschüttet worden ist. Als Laufmittel wird das vorstehend erwähnte Gemisch verwendet, wobei Fraktionen von 10 ml abgenommen werden. Die Fraktionen 24 bis 32 werden vereinigt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 35⁰C mit n-Butanol auf ein Restvolumen von etwa 10 ml abgestreift. Die erhaltene "Lösung wird zu Diäthyläther gegeben. Es fällt das gewünschte reine Antibiotikum A/16686 aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über PpOj- bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 0,26 greines Antibiotikum A/16686.

030042/CS41

Γ"

b) Das Filtrat wird unter Zugabe von n-Butanol bei Temperaturen unter 35 C unter vermindertem Druck abgestreift. Man erhält ein n-Butanolkonzentrat mit einem Volumen von 50 ml. Der durch Zusatz von Petroläther gebildete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 42,9 g partiell gereinigtes Antibiotikum A/16686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pyogenes von 0,2 ^ug/ml. Dieses Produkt wird in 2,5 Liter Wasser suspendiert und durch Zugabe von 1 η NaOH bis zum pH-Wert 7 in Lösung gebracht. Anschliessend wird die erhaltene wässrige Lösung 3 mal mit jeweils 5 Liter n-Butanol extrahiert. Die erhaltene organische Phase wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 35°C auf ein Volumen von 200 ml eingeengt.

15

Der bei Zugabe von Diäthyläther zum Konzentrat gebildete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Produkt wird in 160 ml der oberen Phase eines Gemisches aus n-Propanol :

n-Butanol : 1 η Ammoniak im Volumenverhältnis 2:3:4 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 1,7 g Kieselgel 60 (Merck 0,06 bis 0,2 mm) gepackte, 100 cm hohe Säule vom Durchmesser 7,5 cm, die in dem vorstehend genannten Lösungsmxttelgemisch geschüttet worden ist, aufgesetzt. Als Laufmittel wird das gleiche Lösungsmittelgemisch verwendet. Fraktionen mit einem Volumen von 300 ml werden aufgefangen. Die Elution der Säule wird dünnschlchtchromatographisch überwacht. Die Fraktionen 21 bis 26 werden vereinigt und bei Temperaturen unter 35°C mit n-Butanol unter vermindertem Druck abgestreift. Man erhält ein n-Butanolkonzentrat von 50 ml. Nach Zusatz von Diäthyläther bildet sich ein Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über P₂ ⁰B getrocknet. Man erhält 1,875 g relativ reines Antibiotikum A/16686, das sodann gemäss den vorstehend unter a) erläuterten Verfahren weiter gereinigt wird.

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Beim Hydrochlorid des Antibiotikums A/16686 handelt es sieh um ein weisses, kristallines, leicht hygroskopisches Material vom F. 224 bis 226 C. Es ist sehr gut löslich in Wasser und Dimethylformamid, löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und Benzol Das unter inerter Atmosphäre bei 140⁰C vorgetrocknete Antibiotikum A/16686-hydrochlorid ergibt bei der Elementaranalyse die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Mittelwert von mehreren Analysen): Kohlenstoff 51,73 Prozent, Wasserstoff 6,34 Prozent, Stickstoff 9,96 Prozent, Chlor (Gesamtgehalt) 5,84 Prozent, Chlorionen 4,74 Prozent und Rück stand 1 Prozent.

Das IR-Spektrum in Nujol ist in Fig. 1 dargestellt. Folgende Abisorptionsmaxima lassen sich beobachten (in cm" ) : 3290-3070, 293Ο und 2860 (Nujol), 1765, I63O, 1510, 1455, 1375 (Nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 und 820.

Das UV-Absorptionsspektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben. Es ergeben sich folgende Absorptionsmaxima:

a) in Methanol:

232 nm (E₁ ¹*. = 178)
' ^cm

265 nm (E ^ =107)

b) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 η HCl: 231 nm (E₁ ¹^_01n =167)

270 nm (E|^% _cm = 96)

c) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 η NaOH: 35

250 nm (E ^1% =23,2)
1 cm

295 nm (Schulter)

L 030042/0841

1 d) in Methanol mit einem Gehalt an einem Puffer vom pH-Wert 7,38

^{231 nm (E}r^/Ocm = ¹⁶⁷>

270 nm (E

= 96)

Die UV-Absorptionsspektren sind mit einem Beckmann DK-2-Spektrophotometer aufgenommen.

Das Antibiotikum A/16686-hydrochlorid weist eine spezifische

Oil

Drehung LpL¹Y) ^{von +} ^9,7 auf (c = 0,43 in Dimethylformamid)

Das Antibiotikum A/16686 zeigt folgende charakteristischen Reaktionen:

Ninhydrin (3-prozentige Äthanollösung) Ninhydrin (3-prozentige Äthanollösung + Natriumacetat) 1 % FeCl₃ - 1 % K₃Fe(CN)₆ (xiässrige Lösung) Molisch Fehling Biuret Anthron Millon H₂SO₁₊ konz. KMnOj, wässrig

negativ positiv

positiv (grün) positiv negativ positiv positiv negativ negativ positiv

Die R„-Werte des Antibiotikums A/16686 bei der Papierchromatographie unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen und von S. aureus ATCC 6538 als Nachweisorganismus sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt.

O30ÜA2/GS41

Tabelle VII

Chromatographisches Verhalten (Whatman Nr. 1-Papier) des Antibiotikums A/16686

EIutionssysteme R„-Werte

1) n-Butanol, gesättigt mit Sörensen-

Puffer vom pH-Wert 6,0 0,00

2) n-Butanol; gesättigt mit Wasser mit

einem Gehalt an 2 Prozent p-Toluolsul-

fonsäure 0,00

3) n-Butanol, gesättigt mit Wasser mit

einem Gehalt an 2 Prozent Ammoniak 0,00

4) Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,0,

gesättigt mit n-Butanol 0,05

5) n-Butanol : Methanol : V/asser =

4:1:2 0,43

6) Essxgsäureäthylester, gesättigt mit

Wasser 0,00

7) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

2:1:1 0,52

8) n-Butanol : Pyridin : Wasser =

4:3:7 0,87

* absteigende Chromatographie

Rm: 40 cm

Mengen: 20 ^g der Verbindung gelöst in wässrigem Methanol (2 mg/ml)
30

Die R_f-Werte des Antibiotikums A/16686 in verschiedenen dünn schichtchromatographischen Systemen sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt.

0300A2/0841 J

Tabelle VIII

Elutionssystertie (Volumenteile) R _f-Werte

■ 1) n-Propanol : n-Butanol : 1 η Ammoniak = 2:3:4 (obere Phase) 0,15

2) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

4:2:5 0,61

3) n-Butanol : Äthanol : 0,1 η Salzsäure 0,61

4) Chloroform : Äthanol : 10-prozentige 10

Essigsäure = 4 : 7 :2 0,00

5) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

4 : 1 :5 0,17

6) Methanol : 10-prozentige wässrige Ammoniumacetatlösung : 10-prozentiges

Ammoniak = 10 : 9 : 1 0,52

7) n-Butanol : Pyridin : Wasser : Essigsäure =6^4:3:1 0,45

8) Methanol : 10-prozentige wässrige

Ammoniumacetatlösung : 10-prozentiges 20

Ammoniak = 10 : 9 : 1 0,11

9) 0,25 m wässriges NaHpPO₁, : Acetonitril =

1:1 0,68

10) Methanol : 10-prozentige wässrige Ammoniumacetatlösung =1:1 0,65

11) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

4:2:5 0,77

Rm: etwa 140 mm

Menge: 2 bis 5 nl einer Lösung (1mg/ml) der Verbindung in 30

Acetonitril/Wasser (1 : 1).

Nachweis: a) Bioautographie auf mit B. subtilis ATCC 6633 beimpften Agarplatten;

b) Verkohlen durch Erhitzen mit Oc-Naphtholschwefel-

säüre;
35

c) Joddampf;

d) Chlor-Toluidin-Reagens;

e) UV-Licht von 254 nm

L 030042/0841

1 bis 7: Kieselgel 60 F^cu-Pl-ä-tten (Merck); Nachweis a, e, b, c, d, e_r

8,9: Kieselgel 60 F_25lj-Platten silanisiert (Merck); Nachweis e,
10,11: Cellulose F-Platten (Merck); Nachweis a.

Durch hochleistungsfähige chromatographische Verfahren lässt sich nachweisen, dass das Antibiotikum A/16686, das gemäss Beispiel 3 isoliert und gereinigt worden ist, zu 70 bis 80 Prozent aus einer Hauptkomponente besteht, während der Rest von 30 bis 20 Prozent mindestens 2 untergeordneten Komponenten zuzuordnen ist.

Das gemäss den vorstehenden Beispielen isolierte Antibiotikum A/16686-hydrochlorid ist ein Hydrochlorid mit einem chlorhaltigen basischen Glycopeptid, das sich von Antibiotika der klassischen Glycopeptidgruppe durch seinen Chlorgehalt und in der Art seiner Aminosäurebestandteile unterscheidet. Nach 6-stündiger Hydrolyse in 6 η Salzsäure bei 11O⁰C lassen sich mit Hilfe eines Aminosäure-Autoanalysators folgende Aminosäuren nachweisen: Ornithin (118^'g/mg = 0,58 ^uMoI/ng 1., Asparaginsäure (29 ,2^g/rag = 0,22 ^uMol/mg), Threonin (68/ig/mg = 0,57/iMol/mg), Glycin (25 >ig/mg = 0,33 ,uMol/mg), Alanin (29_/ug/mg = 0,32 ^Mol/mg), Leucin (4i_/yg/mg = 0,31 juMol/mg) und Phenylalanin (42^g/mg = 0,25 ^Mol/mg).

Unter Verwendung der Säule für neutrale und saure Aminosäuren lassen sich weitere 4 Peaks nachweisen. 2 dieser 4 Aminosäuren wurden durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie nach Umwandlung in die entsprechenden Methylester-Trifluoracetyl-Derivate als Aminosäuren der Formeln I und II identifiziert:

COOH- I COOÜ IX

030042/03-41

^ Beispiel 4

Isolierung der freien Base

Durch Behandlung einer Lösung von 0,05 g des Hydrochlorids des Antibiotikums A/16686 in 3 ml Wasser und 8 ml

Äthanol mit 2 ml 1,2-Epoxybutan erhält man einen Niederschlag, der nach 1-tägigem Stehenlassen bei niedriger Temperatur abzentrifugiert, sodann mit Äthanol gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über -'-PpOc getrocknet wird. Man erhält 0,016 g der entsprechenden freien Base.

Durch Behandlung des Antibiotikums A/16686 in Form der freien Base mit einer anorganischen oder organischen Säure erhält man die entsprechenden Salze mit Säuren. Bevorzugt werden die pharmakologisch verträglichen Salze. Entsprechende pharmakologische Säuren sind nicht-toxische Säuren, die sich zur Bildung von therapeutisch wertvollen Salzen eignen. Beispiele dafür sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Weinsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Glutaminsäure und Methansulfonsäure.

Q300A2/08A1

■ll

Leerseite

Claims

VOSSIUS -VOSSIUS -TAUCH N ER · HEUNEMANN · RAUH

PATENTANWÄLTE 3Q13246

SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 PHONE: (O89) 47+O75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX B-29 453 VOPAT D

u.Z.: P 590 (Vo/Mtt) ^ _April

Case: Lp 570
GRUPPO LEPETIT S.p.A.
Mailand, Italien

"Glycopeptid-Antibiotikum A/16686, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung, Arzneimittel und Verwendung"

Priorität: 7. April 1979, Großbritannien, Nr. 7912298/79

Patentansprüche

1. Glycopeptid-Antibiotikum A/16686 und seine Salze, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften des Hydrochlorids:

A) weisses kristallines Material vom F. 224 bis 226°C; 25

B) sehr gut löslich in Wasser und Dimethylformamid, löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und Benzol;

C) ungefähre Zusammensetzung: 51,73 Prozent Kohlenstoff, 6,34 Prozent Wasserstoff, 9,96 Prozent Stickstoff, 5,84 Prozent Chlor (Gesamtgehalt), 4,74 Prozent Chloridionen und 1 Prozent Rückstand;

P) IR-Spektrum in Nujol mit folgenden Absorptionsmaxima (vgl. Fig. 1): 3290 - 3070, 2930 und 2860 (Nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (Nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 und 820 cm"¹;

^L 030042/0841

ORIGINAL INSPECTED

Γ "I

E) UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima (vgl. Fig. 2):

a) in Methanol:

232 nm (E]^% _cm= 178)

265 nm (EJ^_cm= 107)

b) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 η HCl: 231 nm (E^_01n = 167)

270 nm (EJ^ = 96)

c) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 η NaOH: 250 nm (EJ* = 232)

295 nm (Schulter)

d) in Methanol mit einem Gehalt an einem Puffer vom pH-Wert 7,38:

231 nm (e]^0/° =167)

I Olli

270 nm (E ]* =96)

F) spezifische Drehung Πχ_7^ + 49,7° (c = 0,43 % in Dimethylformamid);

G) charakteristische Eigenschaften:

Ninhydrin (3-prozentige Äthanollösung) negativ Ninhydrin (3-prozentige A'thanollösung + Natriumacetat) positiv

1 Prozent FeCl₀ - 1 Prozent K₀Fe(CN) _a positiv ³ 3 6 _(grün)

..Molish positiv

Fehling positiv

Biuret positiv

Anthron positiv

030042/0841

Millon negativ

HpSO|| konz. negativ

KMnO₁, positiv

H) R_f-Werte bei der Papierchromatographie an Whatman Nr. 1-Papier unter Verwendung von S. aureus ATCC 6538 als Nachweisorganismus:

Elutionssysteme R„-Werte

1) n-Butanol, gesättigt mit Sörensen-

Puffer vom pH-Wert 6,0 0,00

. 2) n-Butanol, gesättigt mit Wasser
mit einem Gehalt an 2 Prozent
p-Toluolsulfonsäure 0,00

3) n-Butanol, gesättigt mit Wasser mit

einem Gehalt an 2 Prozent Ammoniak 0,00

4) Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,0,
gesättigt mit n-Butanol 0,05

5) n-Butanol : Methanol : Wasser =
4:1:2 0,43

6) Essigsäureäthylester, gesättigt mit

Wasser 0,00

7) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

2:1:1 0,52

8) n-Butanol : Pyridin : Wasser =

4:3:7 0,87

I) R_f-Werte in verschiedenen dünnschichtchromatographischen Systemen:

Elutionssysteme (Vol. /Vol. /Vol.) R _f-Wer-te

1) n-Propanol : n-Butanol : 1 η Ammoniak

=2:3:4 (obere Phase) 0,15

2) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

4:2:5 0,61

030042/0841

L J

3) n-Butanol : Äthanol : 0,1 η Salzsäure 0,61

4) Chloroform : Äthanol : 10-prozentige Essigsäure =4:7:2 0,00

5) n-Butanol : Essigsäure : Wasser =

4:1:5 0,17

6) Methanol : 10-prozentige wässrige Ammoniumacetatlösung : 10-prozentiges Ammoniak =10:9:1 0,52

7) n-Butanol : Pyridin : Wasser : Essig-

säure =6:4:3:1 0,45

8) Methanol : 10-prozentige wässrige Ammoniumacetatlösung : 10-prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 1 0,11

9) 0,25 m wässrige NaH^O^-Lösung : Aceto-

nitril =1:1 0,68

10) Methanol : 10-prozentige wässrige Ammoniümacetatlösung =1:1 0,65

11) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4:2:5 0,77

1 bis 7 auf Kieselgel 60 F_25ij;-Platten;

8 und 9 auf silanisierten Kieselgel 60 F^n-Platten; und 10 und 11 auf Cellulose F-Platten;

J) Aminosäureanalyse nach 6-stündiger Hydrolyse in 6 η Salzsäure bei 110 C: mindestens folgende Aminosäuren lassen sich nachweisen: Ornithin, Asparaginsäure, Threonin, Glycin, Alanin, Leucin, Phenylalanin, p-Hydroxyphenylglycin und durch Hydroxylgruppen und/oder Chloratome substituiertes Phenylglycin.

2. Antibiotikum A/16686-hydrochlorid.

3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33076 in einem Nährmedium, das assimilier-

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bare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen so lange züchtet, bis sich eine wesentliche Menge des Antibiotikums A/16686 gebildet hat, und das Antibiotikum nach üblichen Verfahren gewinnt.

4. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33076 in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet worden ist, das Antibiotikum durch getrennte Ex-

' brühe
traktion von Kultur / und Myzel mit einem organischen Lösungsmittel aus der Gruppe niedere Alkanole und Chloroform gewinnt, die aus den Extraktionslösungsmitteln gewonnene antibiotische Substanz mit einem Gemisch aus Chloroform : Äthanol : Wasser =4:7:2 behandelt, das abgeschiedene ölige Produkt in Wasser giesst, das erstarrte Produkt abtrennt und es durch Chromatographie an einer mit Kieselgel gepackten Säule weiter reinigt, wobei mit einem Gemisch aus Acetonitril : 0,01 η HCl = 1 : 1 eluiert wird, wodurch man das Hydrochlorid des Antibiotikums A/16686 erhält, das durch Chromatographie an einer mit vernetztem Dextrangel gepackten Säule entsalzt wird, und dass man gegebenenfalls das Antibiotikum A/16686-hydrochlorid nach an sich üblichen Verfahren in die entsprechende freie Base oder in andere Salze mit Säuren überführt.

5. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung nach Anspruch 1 in Form der freien Base oder in Form eines Salzes mit einer physiologisch verträglichen Säure.

6. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 und seiner Salze als antibakterielles Mittel.

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