DE3234203C2

DE3234203C2 -

Info

Publication number: DE3234203C2
Application number: DE3234203A
Authority: DE
Inventors: Masayuki Suita Osaka Jp Muroi; Seiichi Nagaokakyo Kyoto Jp Tanida; Toru Hasegawa; Makoto Kawanishi Hyogo Jp Kida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-09-17
Filing date: 1982-09-15
Publication date: 1991-08-22
Also published as: DE3234203A1; GB2106111A; FR2512819B1; GB2106111B; FR2512819A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Macbecin-Derivate mit antibakterieller und anderen Wirkungen sowie Verfahren zur Herstellung derselben.

Die Antibiotika C-14919 E-1 und E-2 wurden als neue Antibiotika isoliert (JP-OSen Nr. 121704/1978 und 121705/1978). Später wurden ihre Strukturen bestimmt, und sie wurden Macbecin I bzw. II genannt [z. B. Tetra hedron Letters 21, Nr. 3, Seite 309 (1980)].

Bei der Anmelderin wurde nach einem Verfahren gesucht, Macbecin I und II mit Hilfe eines Mikroorganismus in andere Verbindungen zu überführen. Dabei wurde gefun den, daß die Behandlung von Macbecin I oder II mit der Kulturbrühe eines bestimmten Mikroorganismus oder eines von dieser abgeleiteten Verarbeitungsstoffes die be treffende Verbindung in einer Verbindung umwandelt, die in einer bestimmten Stellung eine Hydroxy-Gruppe an stelle der Methoxy-Gruppe besitzt. Weitere eingehende Untersuchungen der Anmelderin auf der Grundlage dieses Befundes haben zu der vorliegenden Erfindung geführt.

Auf der Suche nach neuen Antibiotika wurde durch die Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen aus dem Boden und anderen Quellen isoliert, nach von den Mikro organismen erzeugten Antibiotika gesucht und dabei ge funden, daß einige der Mikroorganismen Antibiotika er zeugen, daß diese Mikroorganismen zu der Gattung Acti nosynnema gehören und daß Antibiotika, die Aktivität gegen grampositive Bakterien, Pilze und Protozoen zei gen, in geeigneten Medien durch Kultivieren der Mikro organismen in diesen Medien angereichert werden können. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden die Antibiotika isoliert und gereinigt und auf Grund ihrer charakteri stischen Eigenschaften als neue, den Macbecinen ver wandte Verbindungen erkannt und als Antibiotika C-33196 E-3, E-3-R, E-4, E-4-R, E-5, E-5-R, E-6, E-6-R, E-7 und E-7-R bezeichnet. Die Ergebnisse weiterer Forschung auf der Grundlage der im Vorstehenden erwähnten Befunde sind in die vorliegende Erfindung eingeflossen.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung

(1) Macbecin-Derivate der Formel

in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff ist und jede der beiden übrigen Methyl ist und X eine der Gruppen

ist;

(2) ein Verfahren zur Herstellung von Macbecin-De rivaten der Formel

ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine durch die Formel

in der X die im Vorstehenden angegebene Bedeutung hat, bezeichnete Verbindung mit einer Kulturbrühe, die durch Kultivieren eines Mikroorganismus erhalten wurde, der zur Gattung Streptomyces oder zur Gattung Nocardia gehört und in der Lage ist, die Methoxy- Gruppe in der Stellung 17, 18 oder 21 der genannten Ausgangsverbindungen (II) in eine Hydroxy-Gruppe umzuwandeln, oder einem sich von dieser Kulturbrühe ableitenden Verarbeitungsprodukt in Berührung ge bracht wird;

(3) Antibiotikum C-33196 E-4 oder C-33196 E-4-R mit den folgenden Eigenschaften:

a) Antibiotikum C-33196 E-4:
- I) Schmelzpunkt: 209-210°C;
- II) Aussehen: gelbe Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 53° ± 5° (c = 0,5; CHCl₃);
- IV) Elementaranalyse (%):
  C: 63,14 ± 0,5,
  H: 7,57 ± 0,5,
  N: 5,26 ± 0,5;
- V) Massenspektrum (M⁺): m/z 532;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  276 nm ± 2 nm 272 ± 20),390 nm ± 2 nm (E 33,5 ± 5);
- VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500, 1380, 1305, 1290, 1210, 1010;
- VIII) Löslichkeit:
  Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Wasser;
  Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Toluol, Diethylether;
  Leicht löslich in Aceton, Ethylacetat, Methanol, Dimethylsulfoxid;
- IX) Farbreaktionen:
  Positiver Kaliumpermanganat-Test (Entfär bung);
  Negative Ninhydrin-, Ehrlich- und Barton- Reaktion;
- X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;
b) Antibiotikum C-33196 E-4-R (Eigenschaften der ein Molekül Ethylacetat als Kristallisations- Lösungsmittel enthaltenden Kristalle):
- I) Schmelzpunkt: 224-225°C;
- II) Aussehen: farblose Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 32° ± 5° (c = 0,5; MeOH);
- IV) Elementaranalyse (%):
  C: 60,96 ± 0,5,
  H: 8,25 ± 0,5,
  N: 4,59 ± 0,5;
- V) Massenspektrum (M⁺): m/z 534;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  307 nm ± 2 nm 75 ± 8);
- VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380, 1325, 1045;
- VIII) Löslichkeit:
  Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Di ethylether, Chloroform und Ethylacetat;
  Löslich in Methanol;
  Leicht löslich in Dimethylsulfoxid;
- IX) Farbreaktionen:
  Positive Barton-Reaktion;
  Negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion;
- X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;

(4) Antibiotikum C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196-E-7 oder C-33196-E-7-R mit der chemischen Struktur

in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Methyl ist und die übrigen Wasserstoff sind und X eine der Gruppen

ist, und mit den folgenden Eigenschaften:

a) Antibiotikum C-33196 E-6:
- I) Spezifische Drehung: + 258,8° ± 20° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  273 nm ± 2 nm E 454 ± 45),
  397 nm ± 2 nm E 50,3 ± 5);
- III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380, 1325, 1265, 1210, 1090, 1040;
b) Antibiotikum C-33196 E-6-R:
- I) Spezifische Drehung: + 37,8° ± 4° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  255 nm ± 2 nm 337 ± 30),
  307 nm ± 2 nm 91 ± 9);
- III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320, 1090, 1040, 1010;
c) Antibiotikum C-33196 E-7:
- I) Spezifische Drehung: + 37,4° ± 4° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  274 nm ± 2 nm 502 ± 50),
  396 nm ± 2 nm 59,8 ± 6);
- III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325, 1260, 1205, 1150, 1095, 1035;
d) Antibiotikum C-33196 E-7-R:
- I) Spezifische Drehung: + 18,6° ± 2° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
  250 nm ± 2 nm 305 ± 30),
  315 nm ± 2 nm 68 ± 7);
- III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
  1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310, 1250, 1090, 1040; und

(5) ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder C-33196 E-7-R, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein zu der Gattung Actinosynnema gehörender Mikroorganismus, der zur Erzeugung des Antibiotikums C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder C-33196 E-7-R befähigt ist, in einem Kul turmedium kultiviert wird, so daß dieser Mikroorga nismus veranlaßt wird, die betreffende Verbindung in der Kulturbrühe zu erzeugen und anzureichern, und die betreffende Verbindung aus der Kulturbrühe ge wonnen wird.

Die Verbindung der Formel (I), in der R₁, R₂ und R₃ jeweils Methyl sind und X

ist, wird "Macbecin I" genannt, und die Verbindung der vorbezeichneten Strukturformel (I), in der R₁, R₂ und R₃ jeweils Methyl sind und X

ist, wird "Macbecin II" genannt [vergl. die JP-OSen Nr. 121704/1978 und 121705/1978, die US-PS 41 87 292, Te trahedron Letters 21, 309 (1980) und Tetrahedron 37 (6), 1123 (1981)].

Die Verbindung der Formel (I), in der R₁ Wasserstoff ist, R₂ und R₃ Methyl sind und X

ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-3" genannt; die Verbindung der Formel (I), in der R₁ Wasserstoff ist, R₂ und R₃ Methyl sind und X

ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-3-R" genannt; die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₃ Methyl sind, R₂ Wasserstoff ist und X

ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-5" genannt; die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₃ Methyl sind, R₂ Wasserstoff ist und X

ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-5-R" genannt; die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₂ Methyl sind, R₃ Wasserstoff ist und X

ist, wird "21-O-Desmethylmacbecin I" genannt; die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₂ Methyl sind, R₃ Wasserstoff ist und X

ist, wird "21-O-Desmethylmacbecin II" genannt.

In der vorliegenden Beschreibung werden gelegentlich als Bezeichnungen verwendet

für das Antibiotikum C-33196 E-3 "C-33196 E-3" oder einfach "E-3",
für das Antibiotikum C-33196 E-3-R "C-33196 E-3-R" oder einfach "E-3-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-4 "C-33196 E-4" oder einfach "E-4",
für das Antibiotikum C-33196 E-4-R "C-33196 E-4-R" oder einfach "E-4-R-",
für das Antibiotikum C-33196 E-5 "C-33196 E-5" oder einfach "E-5",
für das Antibiotikum C-33196 E-5-R "C-33196 E-5-R" oder einfach "E-5-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-6 "C-33196 E-6" oder einfach "E-6",
für das Antibiotikum C-33196 E-6-R "C-33196 E-6-R" oder einfach "E-6-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-7 "C-33196 E-7" oder einfach "E-7" und
für das Antibiotikum C-33196 E-7-R "C-33196 E-7-R" oder einfach "E-7-R".

Der für die Herstellung der Verbindung (I) durch Um wandlung der Verbindung (II) zu verwendende Mikroorga nismus kann ein beliebiger Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces oder Nocardia gehört und befähigt ist, die Methoxy-Gruppe in der Stellung 17, 18 oder 21 der Verbindung (II) in eine Hydroxy-Gruppe umzuwandeln, oder eine Mutante desselben sein. Die Mikro organismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung ver wendet werden, sind Streptomyces platensis IFO 12901 (ATCC 23948 = 13865) und Nocardia mediterranei ATCC 13685 (IFO 13415).

Die genannten Stämme IFO 12901 und IFO 13415 sind beim Institute for Fermentation, Osaka, Verzeichnis der Kul turen (List of Cultures) 1978, 6. Auflage, eingetragen. Die Stämme ATCC 23948 ( =13865) und ATCC 13685 sind in der American Type Culture Collection, Katalog der Stämme (Catalogue of Strains) I, 14. Auflage, 1980, und 15. Auflage, 1982, eingetragen.

Die morphologischen Charakteristika von Streptomyces platensis sind in International Journal of Systematic Bacteriology 18, Nr. 4, Seite 360 (1968) beschrieben. Die morphologischen Charakteristika von Nocardia medi terranei ATCC 13685 sind in Mycopathologia 13, Seite 321-330 (1960) beschrieben. Der vorbezeichnete Stamm ATCC 13685 wurde zunächst in die Gattung Streptomyces eingeordnet, in einer späteren Mitteilung jedoch als zu der Gattung Nocardia gehörend bezeichnet [vergl. Archiv für Mikrobiologie 67, Seite 147 (1969)].

Es ist eine allgemeine Eigentümlichkeit der Mikroorga nismen der Gattungen Streptomyces und Nocardia, daß sie in ihren kennzeichnenden Eigenschaften labil sind. In folgedessen können leicht Mutanten von ihnen durch künstliche mutagene Behandlungen erhalten werden, etwa durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, ultravioletter Strahlung oder anderer Strahlung oder durch Verwendung künstlicher Mutagene (z. B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidin, Ethylenimin). Jede solcher Mutanten kann auch bei der praktischen Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sofern sie befähigt ist, die Methoxy-Gruppe in der Stellung 17, 18 oder 21 der Verbindung (II) in eine Hydroxy- Gruppe umzuwandeln.

Das Medium zur Kultivierung der oben genannten Mikro organismen für den Einsatz bei der praktischen Durch führung der vorliegenden Erfindung kann sowohl ein flüssiges als auch ein festes Medium sein, sofern es Nährstoffe enthält, die der Stamm zu verwerten vermag, wenngleich ein flüssiges Medium für die Behandlung im großen Maßstab bevorzugt wird. Das Medium sollte in angemessener Form Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen enthalten, die die Assimilation dieser Elemente und ihre Nutzung im Stoffwechsel durch die bezeichneten Mikroorganismen ermöglichen, anorganische Substanzen, Spurennährstoffe und so weiter. Beispiele für die Koh lenstoff-Quelle sind Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, Fette und Öle (z. B. Sojaöl, Schmalzöl, Hühneröl) und derglei chen. Beispiele für die Stickstoff-Quelle sind Fleisch extrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsamenöl, ausgelaugte Melasse, Harnstoff, Ammonium-Salze (z. B. Ammoniumsul fat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat) und dergleichen. Das Medium kann weiterhin Salze von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium etc., Salze solcher Metalle wie Eisen, Mangan, Zink, Cobalt und Nickel, Salze der Phosphorsäure, Borsäure etc. und Salze orga nischer Säuren wie Acetate und Propionate enthalten. Weiterhin kann das Medium Aminosäuren (z. B. Glutamin säure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin, Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide, Tripeptide), Vitamine (z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂, C, E) Nu cleinsäuren (z. B. Purine, Pyrimidine und Derivate von diesen) und dergleichen enthalten. Zur Einstellung des pH des Mediums können eine anorganische oder organische Säure, ein Alkali, ein Puffer oder dergleichen zuge setzt werden. Geeignete Mengen von Ölen, Fetten, ober flächenaktiven Mitteln etc. können dem Medium zum Zwecke des Entschäumens zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann mit Hilfe jedes der Stationär-, Schüttel- und aeroben Tauchkulturverfahren oder eines anderen Kulturverfahrens durchgeführt werden. Für hohe Produktionsansätze wird naturgemäß die aerobe Tauchkul tur bevorzugt. Wiewohl die Kultivierungsbedingungen naturgemäß in Abhängigkeit vom Zustand und der Zusam mensetzung des Mediums, dem Typ des Stammes, dem Kul turverfahren und anderen Faktoren variieren, wird all gemein bevorzugt, die Inkubation bei etwa 20°C bis 45°C mit einem etwa neutralen pH zu Beginn durchzuführen. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 24°C bis 37°C im intermediären Stadium der Kultivierung, mit einem Anfangs-pH von etwa 6,5 bis 8,5. Die erforderliche Inkubationszeit liegt normalerweise im Bereich von etwa 6 bis 100 h, vorzugsweise von etwa 10 bis 48 h.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende "Kulturbrühe" ist eine solche, die durch die im Vorste henden beschriebene Kultivierung erhalten wurde.

Der gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende "Verarbeitungsstoff" umfaßt die mikrobiellen Zellen und die Desmethylase enthaltenden Zerfallsprodukte von Zel len, die aus der vorgenannten Kulturbrühe durch physi kalische oder chemische Behandlungen erhalten werden, etwa durch Filtrieren, Zentrifugieren, Ultraschallbe handlung, Behandlung mit einer französischen Presse (French press treatment), Vermahlen mit Aluminiumoxid, Behandlung mit einem lytischen Enzym und Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel oder einem oberflächen aktiven Mittel. Er umfaßt auch die mittels üblicher Reinigungsverfahren gewonnene Desmethylase sowie die Zellen oder die Desmethylase, die mittels eines üblichen Verfahrens immobilisiert wurden.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird praktisch so durchgeführt, daß die Ausgangs-Verbindung (II) mit der Kulturbrühe der oben genannten Mikroorga nismen oder einem daraus erhaltenen Verarbeitungsstoff in Berührung gebracht wird. Die Konzentration der Aus gangs-Verbindung (II) in der Reaktionsmischung beträgt vorzugsweise 10 bis 1000 µg/ml. Die Reaktionstempera tur beträgt vorzugsweise etwa 20°C bis 50°C, besonders bevorzugt etwa 24°C bis 40°C, und der pH beträgt vor zugsweise etwa 5 bis 10, besonders bevorzugt etwa 6 bis 9. Es ist ratsam, die Reaktion während eines Zeitraums von etwa 1 bis 100 h, vorzugsweise etwa 16 bis 72 h, durchzuführen. Die Reaktion kann im stationären (unbe wegten) Zustand, unter Schütteln, unter Belüften oder unter Rühren durchgeführt werden, wenngleich die Reaktionsführung unter Schütteln, unter Belüften oder unter Rühren bevorzugt wird.

Wenn irgendeine der Verbindungen (I) allein das Reak tionsprodukt ist, kann die gewünschte Verbindung (I) in kristalliner Form durch einfaches Extrahieren der Kul turbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organi schen Lösungsmittel, beispielsweise mit Ethylacetat, und anschließendes Konzentrieren des Extrakts isoliert werden. Im allgemeinen liefert die Reaktion jedoch eine Mischung von Verbindungen (I). Aus diesem Grunde ist es für Reinigungszwecke vorzuziehen, die Verbindungen 21- O-Desmethylmacbecin II, E-5-R und E-3-R vor dem Ar beitsschritt der Abtrennung unter Verwendung eines Oxi dationsmittels in die entsprechenden Chinone zu über führen. Zu den Oxidationsmitteln gehören solche, die allgemein für die Oxidation von Hydrochinonen zu Benzo chinonen verwendet werden, etwa Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat und Silberoxid.

In einigen Fällen, je nach dem Gehalt an den Verbindun gen 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5 und E-3 sowie an Ver unreinigungen, ist es vorzuziehen, daß die Produkte in Form der Hydrochinone behandelt werden. Die Verbindungen, die in Form der Hydrochinone vorliegen, nämlich die Verbindungen 21-O-Desmethylmacbecin II, E-5-R und E-3-R sind durch Reaktion der Verbindungen 21-O-Des methylmacbecin I, E-5 und E-3 mit einem für die Reduk tion von Benzochinonen einsetzbaren Reduktionsmittel, etwa Natriumdithionit, erhältlich.

Das Ausbeuten-Verhältnis unter den Verbindungen 21-O- Desmethylmacbecin I, E-5 und E-3 variiert in Abhängig keit von dem verwendeten Mikroorganismus, und dement sprechend können auch die angemessenen Verfahren zur Reinigung der Verbindungen verschieden sein. Im allge meinen werden jedoch die normalen Reinigungsverfahren, die für die Abtrennung von Mikroorganismen erzeugter, lipophiler Metaboliten eingesetzt werden, angewandt, beispielsweise die Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Absorp tion durch Aktivkohle oder ein nicht-ionisches makro poröses Harz.

Zu den für diese Extraktion verwendeten Lösungsmitteln zählen Ester wie Ethylacetat und n-Butylacetat, Alkohole wie i-Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid und Ketone wie Methylisobutylketon.

Im einzelnen wird die Kulturbrühe filtriert, das Fil trat wird neutralisiert oder schwach angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat extra hiert, und der Extrakt wird mit einem Oxidationsmittel wie Eisen(III)chlorid oder einem Reduktionsmittel wie Natriumdithionit behandelt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Zusatz eines unpolaren Lösungs mittels wie Hexan liefert ein rohes Produkt. Die ge wünschte Verbindung oder die gewünschten Verbindungen werden aus dem Rohprodukt in geeigneter Weise durch Adsorptionschromatographie mit Hilfe eines solchen Trä gers wie Silicagel oder Aluminiumoxid isoliert. Im ein zelnen können die betreffende Verbindung oder die be treffenden Verbindungen beispielsweise durch Säulen chromatographie oder Dünnschichtchromatographie an Si licagel mittels eines Lösungsmittelgemisches wie eines Ethylacetat-n-Hexan oder eines Chloroform-Methanol- Systems isoliert werden.

Die sechs O-desmethylierten Produkte, die mittels des im Vorstehenden beschriebenen Verfahrens isoliert wer den können, können jeweils in kristalliner Form bei spielsweise aus Ethylacetat, einem Ethylacetat-n-Hexan- Gemisch oder einem Methylenchlorid-n-Hexan-Gemisch ge wonnen werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von 21-O-Des methylmacbecin I, C-33196 E-5 und C-33196 E-3, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurden, sind in der Tabelle 1 und der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von 21-O-Des methylmacbecin II, C-33196 E-5-R und C-33196 E-3-R, wie sie in Beispiel 3 erhalten wurden, sind in der Tabelle 3 und der Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 3

Tabelle 4

Für jede der Verbindungen 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5 und E-3 wird das Molekülion M⁺ im Massenspektrum bei m/z 544 gefunden. Somit sind die Verbindungen Isomere mit der gleichen Molekülformel C₂₉H₄₀N₂O₈, die um eine CH₂-Gruppe kleiner ist als diejenige der Ausgangsver bindung (II) C₃₀H₄₂N₂O₈. In den ¹H-NMR-Spektren werden für die Verbindung (II) Signale für drei OCH₃-Gruppen gefunden, während für jede der Verbindungen 21-O-Des methylmacbecin I, E-5 und E-3 nur zwei OCH₃-Gruppen nachgewiesen werden. Aus diesem Grunde werden die letzteren Produkte als O-desmethylierte Produkte angesehen. Die drei desmethylierten Produkte, d. h. 21-O-Desmethyl macbecin I, E-5 und E-3 unterscheiden sich voneinander in bezug auf die von der desmethylierten OCH₃-Gruppe herrührende chemische Verschiebung. Ihre jeweiligen Strukturen wurden durch einen Feinspin-Entkopplungsver such identifiziert, und es wurde daraus geschlossen, daß 21-O-Desmethylmacbecin I das Produkt der Desmethylierung in der Stellung 21, E-5 das Produkt der Desme thylierung in der Stellung 18 und E-3 das Produkt der Desmethylierung in der Stellung 17 ist.

Die auf diese Weise erhaltene Benzochinon-Verbindungen [nämlich 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5 oder E-3] und Hydrochinon-Verbindungen [nämlich 21-O-Desmethylmacbecin II, E-5-R oder E-3-R] lassen sich jeweils gegen seitig ineinander umwandeln.

Die Überführung der Benzochinon-Form in die Hydrochi non-Form kann mit Hilfe eines üblichen Verfahrens zur Reduktion von Benzochinonen durchgeführt werden. So kann beispielsweise das Reduktionsmittel Natriumdithionit, Natriumhydrogensulfit, Natriumborhydrid oder der gleichen sein, und das Lösungsmittel kann irgendein Lösungsmittel sein, das gegenüber der oben angegebenen Reaktion inert ist, wie beispielsweise Ester (z. B. Ethylacetat), Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol) und Wasser oder Gemische aus diesen. Weiterhin kann ein aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organi schen Lösungsmittel bestehendes binäres System eben falls mit Vorteil verwendet werden. Die Reaktion wird im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0°C bis 40°C, normalerweise bei Raumtemperatur, durchgeführt und innerhalb einer Zeit von etwa 30 s bis 24 h voll ständig, je nach der Reaktionstemperatur.

Für die Überführung der Hydrochinon-Form in die Benzo chinon-Form kann jedes der üblicherweise für die Oxida tion von Hydrochinonen verwendeten Verfahren eingesetzt werden. So umfassen die Oxidationsmittel beispielsweise Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat, Silberoxid und dergleichen, und das Lösungsmittel kann irgendein Lö sungsmittel sein, das die Reaktion nicht stört, bei spielsweise ein Ester (z. B. Ethylacetat), ein Keton (z. B. Aceton), Wasser oder ein Gemisch aus diesen. Ein aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren orga nischen Lösungsmittel bestehendes binäres System kann ebenfalls mit Vorteil verwendet werden.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, und die Reaktion wird im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt. Je nach der Reaktionstemperatur kommt die Reaktion innerhalb einer Zeit von etwa 30 s bis 24 h zum Abschluß.

Die auf diese Weise erhaltenen Macbecin-Derivate, d. h. Verbindungen der Formel (I), besitzen antibakterielle, fungizide und protozoozide Wirksamkeit und erwartungs gemäß Antitumor-Aktivität. Weiterhin können sie als Ausgangsstoffe für die Synthese wertvoller Derivate eingesetzt werden.

E-5, E-5-R, E-3 und E-3-R hemmen jeweils Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis, wobei die MHK 50 bis 100 µg/ml beträgt. Infolgedessen sind sie als antibak terielle Mittel einsetzbar. Hinsichtlich der akuten Toxizität beträgt der LD₅₀-Wert beispielsweise für E-5-R 100 bis 200 mg/kg (Maus, intraperitoneal), was die niedrige Toxizität der Verbindung anzeigt. Es wird angenommen, daß die Verbindungen (I) niedrige Toxizität besitzen.

Die Verbindungen (I) der vorliegenden Erfindung können als Desinfektionsmittel in Form von Ethanol enthaltenden (z. B. 5 Vol.-% Ethanol enthaltenden) wäßrigen Lö sungen, die die Verbindungen (I) in einer Konzentration von 10 bis 100 µg/ml enthalten, eingesetzt werden. Sol che Lösungen können zur Desinfektion von Vogelkäfi gen, Hundehütten, Ställen, Versuchsgeräten und -apparaturen und so weiter angewandt werden.

Die Mikroorganismen, die bei der Durchführung der Er zeugung von E-3, E-3-R, E-4, E-4-R, E-5, E-5-R, E-6, E-6-R, E-7 und/oder E-7-R (diese Verbindungen werden kollektiv "Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R" genannt) zu verwenden sind, können beliebige Mikroorganismen sein, die zu der Gattung Actinosynnema gehören und zur Herstellung eines oder mehrerer der betreffenden Anti biotika befähigt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Acti nosynnema sp. Stamm Nr. C-33196 (im Folgenden auch als "Stamm Nr. C-33196" bezeichnet) verwendet.

Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes C-33196 wurden mit Hilfe von Arbeitsweisen untersucht, die analog zu denen von Shirling und Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16, Seiten 313-340 (1966)] waren. Die folgenden Ergebnisse wurden auf Grund 21tägiger Beobachtung bei 28°C erhalten:

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Myzel, das farblos bis blaßgelb oder orangegelb ist, breitet sich gut aus und entwickelt sich unter Bildung von Verzweigungen, sowohl auf Agar als auch in flüssigem Medium. Die Hyphen zeigen meistens Abmessungen von 0,5 bis 1,2 µm Durchmesser und fragmentieren in späteren Stadien der Inkubation zu bazillären oder verlängerten bazillären Elementen oder verzweigten kurzen Hyphen-Abschnitten. Der Stamm zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen taxono mischen Medien, wobei das Luftmyzel auf dem vegeta tiven Myzel wächst. In vielen Fällen erscheinen die Luftmyzele so, als ob sie auf einer großen Zahl von Coremia (50 bis 180 µm × 400 bis 1500 µm) gewachsen seien. Viele der Luft-Hyphen sind gebogen oder gerade, jedoch einige scheinen in loser Form spiralig zu sein, treten allerdings nur in seltenen Fällen auf. Die mikroskopische Untersuchung gealterter Kulturen zeigt, daß in einigen wenigen Fällen die Sporen of fensichtlich in Ketten auftreten, wobei es wenige von denen gibt, die als Konidien oder Sporen be zeichnet werden. Bei der Untersuchung unter dem Mi kroskop zeigte eine von der Oberfläche einer derar tigen Kultur entnommene Zellsuspension die Anwesen heit vieler verlängert-ellipsoider (0,5 bis 1,2 µm × 4,8 bis 6,8 µm) und ellipsoider (0,8 bis 1,2 µm × 1,5 bis 4 µm) Zellen, die wie fragmentierte Zellen oder Arthrosporen aussahen und deren Oberfläche glatt war, wie die elektronenmikroskopische Unter suchung ergab. Das Luftmyzel ist im allgemeinen spärlich, und obwohl auf vielen Medien im Laufe einer drei- bis siebentägigen Inkubation ein annehm bares Wachstum beobachtet wird, verschwindet es manchmal, wenn die Kultivierung länger als 10 Tage durchgeführt wird.

Wenn gealtertes Luftmyzel in ein flüssiges Medium eingetaucht wird, werden nach 15 bis 30 min motile Zellen freigesetzt. Die elektronenmikroskopische Untersuchung dieser motilen Zellen zeigt lange peri trichöse Geißeln um die Zellen herum. Wenn der Stamm in einem flüssigen Medium kultiviert wird, bildet er in späteren Inkubationsphasen manchmal polymorphe fragmentierte Hyphen, von denen einige motil sind.

2) Zell-Bestandteile

Der Stamm wurde unter Schütteln in modifiziertem ISP-Medium Nr. 1 bei 28°C 66 bis 99 h kultiviert, und in der gut gewachsenen stationären Phase wurden Zellen gesammelt und gespült. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, Seite 421 (1964)] und der Methode von L. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, Seite 934 (1968)] wurden die obigen Zellen auf Di aminopimelinsäure und die Zucker-Zusammensetzung untersucht. Für die erstere wurde gefunden, daß sie in der meso-Form vorliegt, und für die letztere wurde ein der Galactose entsprechender Fleck beobachtet. Eine Probe der Zellwand wurde präpariert nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbio logy 13, Seite 236 (1965)] und auf Diaminopimelin säure, Zucker und Aminosäuren untersucht. Was die Diaminopimelinsäure betrifft, so wurde die meso-Form gefunden. An Zuckern wurde eine große Menge Galactose gefunden, während Arabinose nicht nachgewiesen wurde. Als Aminosäuren wurden Glutaminsäuren und Ala nin deutlich nachgewiesen, wenngleich Lysin und Glycin nur in Spuren gefunden werden konnten. Somit gehört der Stamm zum Typ III bei der Klassifizierung des Zellwand-Typs.

3) Kultureigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigt vergleichsweise ein gleichbleibend gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, und die Farbe des vegetativen Myzels ist farblos bis blaß- gelb in den frühen Inkubationsphasen, jedoch blaß- gelblich-braun bis gelblich-braun in den späteren Stadien. Der Organismus erzeugt in den meisten taxo nomischen Medien keine löslichen Pigmente. Das Luft myzel ist pulvrig, wächst im allgemeinen in mäßigem Ausmaß und zeigt eine weiße bis gelbe oder blaß- gelblich-braune Färbung. Das Luftmyzel verschwindet auf vielen Medien bei verlängerter Kultur (ungefähr zwei Wochen oder mehr), wobei die Oberfläche des vegetativen Myzels glänzend zu werden beginnt. Die Kulturmerkmale dieses besonderen Stammes auf ver schiedenen taxonomischen Medien sind in der folgen den Tabelle 5 zusammengefaßt.

Tabelle 5 Kultureigenschaften des Stammes C-33196 auf taxonomischen Medien

Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen bedeuten

G: Wachstum;
AM: Luftmyzel;
SP: Lösliches Pigment.
*: Die Farb-Codes entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958).

(A) Sucrose-Nitrat-Agar:
G: Mäßig, dünn, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

(B) Glycerin-Nitrat-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

(C) Glucose-Asparagin-Agar:
G: Mäßig, gelb (3ga)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, leicht melonengelb (3ea)*;
SP: Keines.

(D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß bis leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
SP: Keines.

(E) Nährstoff-Agar:
G: reichlich, leuchtend gelb (21a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.

(F) Calcium-Malat-Agar:
G: Dürftig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

(G) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:
G: reichlich, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

(H) Hafermehl-Agar:
G: Mäßig, leicht weizenfarben (2ea)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

(I) Anorganische Salze-Stärke-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
bis leicht melonengelb (3ea)*;
AM: Dürftig, leicht weizenfarben (2ea)*;
SP: Keines.

(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.

(K) Tyrosin-Agar:
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.

4) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes sind in der nachstehenden Tabelle 6 angegeben. Der Tempe ratur-Bereich für das Wachstum ist 12°C bis 35°C. Der Temperatur-Bereich, in dem gutes Luft-Wachstum auf Agar (ISP Nr. 2) stattfindet, ist 16°C bis 32°C.

Tabelle 6

Physiologische Eigenschaften des Stammes C-33196:
Temperatur-Bereich für das Wachstum: 12°C bis 35°C
Temperatur-Bereich für das Luft-Wachstum: 16°C bis 32°C

Verflüssigung von Gelatine:
Positiv
Hydrolyse von Stärke:	Positiv
Reduktion von Nitraten:	Positiv
Peptonisierung von Milch:	Positiv
Koagulierung von Milch:	Negativ
Zersetzung von Casein:	Positiv
Erzeugung melanoider Pigmente:	Negativ
Zersetzung von Tyrosin:	Positiv
Zersetzung von Xanthin:	Negativ
Zersetzung von Hypoxanthin:	Negativ
Toleranz gegen Lysozym:	Positiv
Toleranz gegen Natriumchlorid:	2%.

5) Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen

Die Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen wurde unter Verwendung eines Basalmediums unter sucht, das

0,05% Asparagin,
0,05% Dikaliumphosphat,
0,02% Magnesiumsulfat,
0,001% Eisen(II)sulfat,
0,1% Ammoniumsulfat und
2% Agar

enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen durch den Stamm C-33196

Die Zeichen bedeuten
  ++: Üppiges Wachstum;
  +: Mäßiges Wachstum;
  ±: Schlechtes Wachstum.

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden mittels des im Vorstehenden unter 2) beschriebenen Verfahrens gewonnen, und DNA wurde mit Hilfe eines Verfahrens analog zu demjenigen von J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology 3, Seite 208 (1961)] präpariert. Der G-C (Guanin-Cytosin) -Gehalt der DNA wurde zu etwa 72 Mol-% gefun den.

Die Gram-Färbung des vegetativen Myzels dieses Stam mes war positiv.

Die im Vorstehenden aufgeführten Eigenschaften des Stammes C-33196 wurden verglichen mit den Beschreibun gen in S. A. Waksman, "The Actinomycetes", Band 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961), R. E. Buchanan und N. E. Gibbons (Hrsg.), "Bergey's Manual of Determinative Bac teriology", 8. Aufl., 1974, und anderen Literaturstel len.

Die vorstehenden Beobachtungen

1), daß der Stamm in späteren Phasen des vegetativen Wachstums polymorphe, fragmentierte Hyphen bildet, von denen bei einigen Motilität beobachtet wird,
2), daß peritrichöse motile Zellen sich aus reifen (ma turen) Luft-Hyphen bilden,
3), daß Luft-Hyphen Koremia oder Synnemata auf einigen der Agar-Medien ausbilden, und
4), daß der Stamm zum Zellwand-Typ III gehört,

zeigen, gekoppelt mit anderen Eigenschaften, an, daß der Stamm zu der Gattung Actinosynnema gehört. Aus die sem Grunde wurde er Actinosynnema sp. Nr. C-33196 ge nannt.

Die Gattung Actinosynnema ist eine Gattung aus der Ord nung Actinomycetales, und deren bakterielle Eigenschaf ten werden von Hasegawa et al. in dem International Journal of Systematic Bacteriology 28, Seiten 304-310 (1978) mitgeteilt und sind ebenfalls beschrieben in der gleichen Zeitschrift 30, Seite 245 (1980).

Der Stamm C-33196 wurde am 11. August 1981 bei dem In stitute for Fermentation, Osak, Japan (IFO) unter der Zugangs-Nr. IFO 14 127 hinterlegt und am 26. August 1981 bei dem Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Ministery of International Trade and Industry, Japan (FRI) unter der Zugangs-Nr. FERM P-6138 hinterlegt, wobei die Hinter legung in eine unter den Budapester Vertrag fallende Hinterlegung umgewandelt wurde, und wird bei dem FRI unter der Zugangs-Nr. FERM-BP-166 aufbewahrt.

Im allgemeinen sind Mikroorganismen der Gattung Actino synnema in ihren Eigenschaften labil und können spontan oder unter dem Einfluß von Mutagenen Mutationen erlei den. Deshalb ist darauf hinzuweisen, daß beispielsweise die vielen Mutanten-Stämme, die durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, ultravioletter Strah lung etc., durch Isolierung von Monosporen, durch Kul tur auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch irgendwelche andere, eine Mutagenese indu zierende Mittel erhältlich sind, ebenso wie die Mutan ten, die aus dem Stamm spontan erhalten wurden, nicht als irgendwelche andere, im Vergleich mit den oben dar gelegten bakteriologischen Eigenschaften unterschiedene Species zu betrachten sind, sondern daß jede solcher Mutanten und Varianten, wenn sie zur Erzeugung der ge nannten Antibiotika befähigt ist, in gleicher Weise für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise können verschiedene, eine Muta genese induzierende eines zur Erzeugung der genannten Antibiotika befähigten Stammes Mutanten liefern, die leicht gelbe bis leicht gelblich-braune oder braune lösliche Pigmente erzeugen, Mutanten, die farblos ve getative Myzelien bilden, Mutanten, die rötlich-braune bis orangerote vegetative Myzelien bilden, Mutanten, die gelblich-grüne vegetative Myzelien oder lösliche Pigmente bilden, Mutanten, die in reichlicher Menge weiße Luft-Myzelien bilden, sowie Mutanten, deren My zelien fähig sind, zu fragmentieren.

Das bei der Kultivierung eines Mikroorganismus, der zur Erzeugung der genannten Antibiotika befähigt ist, zu verwendende Medium kann entweder im flüssigen oder im festen Zustand vorliegen, vorausgesetzt, daß es Nähr stoffe enthält, die von dem betreffenden Mikroorganis mus verwertet werden können, wenngleich für Arbeiten im großen Maßstab ein flüssiges Medium bevorzugt wird. In geeigneter Weise in das Medium formuliert werden Koh lenstoff- oder Stickstoff-Quellen, die die Assimilation dieser Elemente und ihre Nutzung im Stoffwechsel durch die bezeichneten Mikroorganismen ermöglichen, anorgani sche Substanzen und Spurennährstoffe. Beispiele für die Kohlenstoff-Quelle sind Glucose, Lactose, Sucrose, Mal tose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, Fette und Öle (z. B. Sojaöl, Schmalzöl, Hühneröl) und n-Paraf fin. Beispiele für die Stickstoff-Quelle sind Fleisch extrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsamenöl, ausgelaugte Melasse, Harnstoff und Ammonium-Salze (z. B. Ammonium sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat). Das Medium kann weiterhin Salze von Natrium, Ka lium, Calcium, Magnesium etc., Salze solcher Metalle wie Eisen, Mangan, Zink, Cobalt und Nickel und anderer Metalle, Salze der Phosphorsäure, Borsäure etc. und Salze organischer Säuren wie Essigsäure und Propionsäure enthalten. Weiterhin kann das Medium Aminosäuren (z. B. Glutaminsäuren, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Methionin, Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide, Tripeptide), Vitamine (z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂, C), Nu cleinsäuren (z. B. Purine, Pyrimidine, Derivate von diesen) und so weiter enthalten. Naturgemäß können zur Einstellung des pH des Mediums eine anorganische oder organische Säure, ein Alkali oder ein Puffer oder der gleichen zugesetzt werden, und/oder ein Fett oder Öl, ein oberflächenaktives Mittel oder dergleichen können in einer geeigneten Menge zum Zwecke des Entschäumens zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann mit Hilfe jedes der Stationär-, Schüttel- und aeroben Tauchkulturverfahren oder eines anderen Kulturverfahrens durchgeführt werden. Für Pro duktionsansätze mit großen Volumina, wird naturgemäß die sogenannte aerobe Tauchkultur bevorzugt. Wiewohl die Kultivierungsbedingungen naturgemäß vom Zustand und der Zusammensetzung des Mediums, dem Typ des Stammes, dem Kulturverfahren und anderen Faktoren variieren, wird normalerweise bevorzugt, die Inkubation bei etwa 20°C bis 32°C mit einem etwa neutralen pH zu Beginn durchzuführen. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 25°C bis 28°C im intermediären Stadium der Kulti vierung, mit einem Anfangs-pH von etwa 6,5 bis 7,5. Wenn auch die Inkubationszeit von den gleichen Faktoren, die oben erwähnt wurden, abhängt, ist es rat sam, die Inkubation fortzusetzen, bis der Titer des gewünschten Antibiotikums seinen maximalen Wert er reicht. Im Falle einer Schüttelkultur oder aeroben Tauchkultur in einem flüssigen Medium liegt die norma lerweise erforderliche Zeit im Bereich von etwa 48 bis 96 h.

Die bezeichneten, in der Kulturbrühe erzeugten Antibio tika können mittels einer Verfahrensweise isoliert wer den, die passend aus den normalerweise bei der Isolie rung und Reinigung von Metaboliten, die von Mikroorga nismen erzeugt wurden, eingesetzten Verfahren ausge wählt wurde, da die betreffenden Antibiotika neutral und fettlöslich sind. Beispielsweise werden die Mittel, die die Unterschiede in den Löslichkeiten der Produkte und der Verunreinigungen ausnutzen, die Adsorptions chromatographie unter Verwendung einer Mannigfaltigkeit von Adsorbentien wie Aktivkohle, nicht-ionische makro poröse Harze, Silicagel und Aluminiumoxid sowie andere Mittel allein oder in Kombination verwendet.

Wiewohl die betreffenden Antibiotika hauptsächlich im Filtrat der Kulturbrühe vorliegen, können sie jedoch auch, soweit erforderlich, aus den Zellen extrahiert werden. Für die Extraktion der Mikroben-Zellen kann ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, etwa ein niederer Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol) oder ein Keton (z. B. Aceton, Methylethylketon) oder eine Mi schung desselben mit Wasser benutzt werden. Die Ex traktion kann auch mit einem mit Wasser nicht mischba ren organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat oder einem ähnlichen Ester durchgeführt werden. Weiterhin kön nen die Antibiotika auch dadurch extrahiert werden, daß ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie Methanol oder Aceton der Vollkulturbrühe zugesetzt wird.

Zur Isolierung der Antibiotika aus dem Filtrat der Kul turbrühe können mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel wie Fettsäureester (z. B. Ethylacetat, Butylacetat), Alkohole (z. B. Butanol), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform) und Ketone (z. B. Methylisobutylketon) eingesetzt werden. Die betreffenden Antibiotika können im rohen Zustand durch Waschen des Extrakts mit Wasser, Konzentrieren desselben und Zugabe von n-Hexan oder dergleichen erhalten werden. In dem Fall, in dem eines der betreffenden Antibiotika als Hauptbestandteil, d. h. in größerer Menge vorliegt, kann es manchmal in kristalliner Form durch den einfachen Arbeitsgang der Extraktion mit einem organischen Lö sungsmittel und anschließendes Konzentrieren erhalten werden.

Die Antibiotika können aus der Kulturbrühe auch durch Adsorption an einem nicht-ionischen makroporösen Harz wie Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries, Japan) und nachfolgende Elution mit einem wäßrigen Alko hol oder Keton oder dergleichen isoliert werden.

Wenn das in der im Vorstehenden beschriebenen Weise aus der Kulturbrühe durch Schritte der Extraktion, Konzen trierung und so weiter erhaltene Rohprodukt ein Gemisch der genannten Antibiotika ist, kann für die Trennung der Bestandteile eine Vielzahl von Techniken der Ad sorptionschromatographie eingesetzt werden. Das Adsor bens kann ein herkömmlicher Träger wie Silicagel, Alu miniumoxid oder ein adsorptionsfähiges Harz sein oder ein Phasenumkehr-Träger wie µBondapak C₁₈ (Waters Associates, Inc., USA).

Wenn das Adsorbens Silicagel ist, wird die Entwicklung im allgemeinen mit einer Kombination aus einem polaren organischen Lösungsmittel und einem unpolaren organi schen Lösungsmittel, beispielsweise einem Lösungsmittel gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan oder aus Metha nol und Chloroform durchgeführt, um die Bestandteile voneinander zu trennen. Beispielsweise können die Kom ponenten dadurch getrennt werden, daß zunächst die Ent wicklung mit einem unpolaren Lösungsmittel durchgeführt wird und anschließend die Elution durchgeführt wird, während der Anteil des polaren Lösungsmittels schritt weise erhöht wird. In dem Fall, in dem das pulvrige Rohprodukt ein Vielkomponenten-Gemisch ist und/oder Verunreinigungen in relativ großen Mengen enthält, kön nen die betreffenden Komponenten dadurch voneinander getrennt werden, daß die Chromatographie unter Varia tion der Kombinationen der organischen Lösungsmittel wiederholt wird.

Die genannten Antibiotika umfassen die Benzochinon-Form und die Hydrochinon-Form, die ineinander überführbar sind. Infolgedessen ist es zum Zwecke der Reinigung vorteilhaft, die Zahl der Komponenten auf die Hälfte zu vermindern, indem die Hydrochinon-Form in die Benzochi non-Form oder die Benzochinon-Form in die Hydrochinon- Form durch Oxidation bzw. durch Reduktion überführt wird.

Die Oxidation kann mit Hilfe eins Verfahrens durchge führt werden, das allgemein für die Oxidation von Hy drochinonen verwendet wird. So ist das Oxidationsmittel beispielsweise Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat, Kaliumeisen(III)cyanid oder Silberoxid, und das Lö sungsmittel kann ein beliebiges Lösungsmittel sein, das gegenüber der Reaktion inert ist, beispielsweise ein Ester wie Ethylacetat, ein Keton wie Aceton, Wasser oder ein Gemisch aus diesen. Weiterhin kann auch ein aus Wasser und einer mit Wasser nicht mischbaren Flüs sigkeit bestehendes binäres System mit Vorteil verwen det werden. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, jedoch wird die Reaktion im allgemeinen bei etwa 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt und gelangt im allgemeinen leicht, je nach der Reak tionstemperatur, in etwa 30 s bis 24 h zum Abschluß.

Die Reduktion wird in einer Weise durchgeführt, wie sie für die Reduktion von Benzochinonen üblich ist. So zäh len zu den Reduktionsmitteln Natriumdithionit, Natrium hydrogensulfat und Natriumborhydrid, und die Lösungs mittel umfassen sämtliche Lösungsmittel die gegenüber der Reaktion inert sind, etwa Ester (z. B. Ethylacetat), Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol), Wasser sowie aus diesen zusammengesetzte gemischte Lösungsmittel. Wei terhin kann auch ein aus Wasser und einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit bestehendes binäres System mit Vorteil verwendet werden. Die Reaktion wird im all gemeinen bei etwa 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei Raum temperatur, durchgeführt und gelangt im allgemeinen leicht, je nach der Reaktionstemperatur, in etwa 30 s bis 24 h zum Abschluß.

Bei der Durchführung der Silicagel-Chromatographie werden die Antibiotika im allgemeinen in der Benzochinon- Form gereinigt. In einigen Fällen ist jedoch die Hydrochinon- Form für die Reinigung besser geeignet. Infolgedessen sollten die Komponenten in der Weise getrennt werden, daß entweder die Methode der Oxidation oder die Methode der Reduktion unter angemessener Berücksichtigung der Verunreinigungen und deren Gehalte in der Mischung gewählt werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Bestandteile können aus einem geeigneten Lösungsmittel wie Ethylacetat, Methanol, Methylenchlorid oder Methanol-Wasser kristallisiert werden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums C-33196 E-4 und des Antibiotikums C-33196 E-4-R, das ein Molekül Ethylacetat als Kristallisations-Lösungsmittel enthält, wie sie in Beispiel 8 und Beispiel 6, die im Folgenden beschrieben werden, erhalten wurden, sind in der Tabelle 8 aufgeführt.

Die Struktur des Antibiotikums C-33196 E-4 und C-33196 E-4-R konnte jeweils bestimmt werden und ist wie nachfolgend angegeben:

Tabelle 8

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Antibiotika C-33196 E-6 und C-33196 E-6-R, wie sie in Beispiel 11 erhalten wurden, und diejenigen der Antibiotika C-33196 E-7 und C-33196 E-7-R, wie sie in Beispiel 10 erhalten wurden, sind in der Tabelle 9 bzw. der Tabelle 10 aufgeführt.

Tabelle 9

Tabelle 10

Das magnetische Kernresonanzspektrum (NMR-Spektrum) ist in Tabelle 11 angegeben.

Tabelle 11

¹H-NMR-Spektrum (Deuterioaceton; 90 MHz)

Auf der Grundlage der im Vorstehenden angegebenen physikalisch- chemischen Eigenschaften und der Daten der NMR-Spektren wird angenommen, daß die Antibiotika gemäß der vorliegenden Erfindung, nämlich C-33196 E-6, E-6-R, E-7 und E-7-R, die folgende allgemeine Formel aufweisen

in der R₁, R₂, R₃ und X die im Vorstehenden angegebenen Bedeutungen haben. Es wird ebenfalls angenommen, daß in E-6 und E-7 X

ist und in E-6-R und R-7-R X

ist.

In Anbetracht der vorstehenden Ausführungen sind die Antibiotika gemäß der vorliegenden Erfindung, d. h. C-33196 E-6, E-6-R, E-7 und E-7-R, aller Voraussicht nach neue Verbindungen, wie aus ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, NMR-Spektren und Strukturformeln gefolgert wird.

In bezug auf die Mischung, die mindestens zwei Individuen der Gruppe der Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R enthält, ist das Verhältnis der einzelnen Bestandteile zueinander nicht kritisch, jedoch ist beispielsweise die Menge eines Bestandteils in jeder Mischung nicht kleiner als etwa 5%.

Die Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R besitzen antibakterielle, fungizide und protozoozide Wirksamkeit. Da sie zytozide Wirkungen gegen Tumor-Zellen zeigen, wird erwartet, daß sie Antitumor-Aktivität besitzen. Weiterhin können sie als Ausgangsstoffe bei der Synthese wertvoller Derivate eingesetzt werden.

Die Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R, deren MHK-Werte gegen Staphylococcuns aureus und Bacillus subtilis 50 bis 100 µg/ml betragen, sind in ihrer antibakteriellen Wirkung gegen diese Species etwa mit Macbecin I und II vergleichbar. Im Test mittels der Methode der Verdünnung der Brühe hemmen E-6 und E-7 das Wachstum von Tetrahymena pyriformis W bei 10 µg/ml bzw. 40 µg/ml. Aus diesem Grunde können die Bakterien und gegen Protozoen verwendet werden.

Hinsichtlich der akuten Toxizität ist festzustellen, daß die LD₅₀ von E-5-R, beispielsweise, bei 100 bis 200 mg/kg (Maus, intraperitoneal) liegt, was seine geringere Toxizität im Vergleich zu Macbecin I und II anzeigt. Das Antibiotikum C-33196 E-7-R weist geringe Toxizität auf, wie die Werte der akuten Toxizität beweisen, d. h. die bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse ist die LD₅₀ nicht niedriger als 400 mg/kg. Daher wird angenommen, daß die Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R eine geringe akute Toxizität besitzen.

Die C-33196 E-3 bis E-7-R können als Desinfektionsmittel zur Desinfizierung von Vogelkäfigen, Versuchgeräten und -apparaturen, Scheunen, Nutzvieh-Stallungen und so weiter eingesetzt werden, beispielsweise in Form von Lösungen von 10 bis 100 µg/ml in Ethanol enthaltendem Wasser.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben. Falls nicht anders angegeben, bezeichnet die Angabe "Prozent (%)" Gewichts-Volumen- Prozent.

Beispiel 1

Ein Medium (pH 7,2), das 1% Dextrin, 1% Glucose, 1% Glycerin, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Fleischextrakt, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% gefälltes Calciumcarbonat enthielt, wurde mit Streptomyces platensis IFO 12 901 beimpft, und die Kultur wurde 17 h bei 28°C geschüttelt. Macbecin I (1,9 g) wurde zu 20 l der erhaltenen Kulturbrühe hinzugefügt, und die Reaktion wurde unter Schütteln 24 h bei 28°C durchgeführt. Die Kulturbrühe wies nach der Reaktion einen verminderten Gehalt an Macbecin I und enthielt O-desmethylierte Produkte, wie durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen wurde.

Beispiel 2

Das durch Filtration von 20 l der in Beispiel 1 erhaltenen Reaktions-Kulturbrühe mit Hyflo Super Cel (Johns Manville, USA), das dieser zugesetzt wurde, erhaltene Filtrat wurde auf pH 6,0 eingestellt und zweimal mit je 10 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und auf 1 l eingeengt. Dazu wurden 500 ml einer 2proz-wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung gegeben, und die Mischung wurde 1 h gerührt. Danach wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit Wasser gewaschen und eingeengt. Der Zusatz von n-Hexan lieferte 1,45 g eines pulverförmigen Rohprodukts.

Das rohe Pulver wurde der Säulenchromatographie an 65 g Silicagel (E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland) unterworfen und zuerst mit n-Hexan (200 ml) und dann mit Hexan-Ethylacetat-Gemischen [1 : 1 (300 ml), 1 : 2 (300 ml), 1 : 4 (300 ml) und 1 : 9 (300 ml) der Reihe nach] eluiert, wobei das verbliebene Ausgangsmaterial (Macbecin I), E-3, 21-O-Desmethylmacbecin I und E-5 in dieser Reihenfolge eluiert wurden. Jede Fraktion wurde dünnschichtchromatographisch geprüft, und die jeweils eine einzige Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden eingeengt. Dabei wurden 43 mg 21-O-Desmethylmacbecin I, 248 mg E-5 und 111 mg E-3 erhalten.

Beispiel 3

Macbecin II (1 g) wurde zur 10 l der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe hinzugefügt, und die Reaktion wurde unter Schütteln 24 h bei 28°C durchgeführt. Mittels TLC wurde bestätigt, daß Macbecin II in der Reaktions- Kulturbrühe in O-desmethylierte Verbindungen umgewandelt worden war.

Nach Zusatz von Hyflo Super Cel wurden 10 l der Reaktions- Kulturbrühe filtriert, und das Filtrat wurde auf pH 6,0 eingestellt und zweimal mit je 3,5 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und auf 1 l eingeengt. Nach Zusatz von 500 ml einer 2proz.- wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung wurde die Mischung 1 h gerührt. Danach wurde die Ethylacetat-Schicht mit Wasser gewaschen und konzentriert. Auf Zusatz von n- Hexan wurden 610 mg eines pulverförmigen Rohprodukts erhalten.

Dieses Pulver wurde der Säulenchromatographie an 30 g Silicagel (E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland) unterworfen und mit n-Hexan, n-Hexan-Ethylacetat (1 : 1), n-Hexan-Ethylacetat (1 : 2), n-Hexan-Ethylacetat (1 : 4) und n-Hexan-Ethylacetat (1 : 9) der Reihe nach eluiert. Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 2)-Elutions- Fraktionen wurden zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst, mit 2-proz. wäßrigem Natriumdithionit reduziert, mit Wasser gewaschen und konzentriert, wodurch 62 mg E-3-R erhalten wurden.

Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 4)-Elutions-Fraktionen wurden zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde weiter mittels präparativer TLC auf Silicagel (E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland) (n-Hexan-Ethylacetat = 1 : 4) weiter gereinigt, danach in Ethylacetat gelöst und mit 2proz. wäßrigem Natriumdithionit reduziert. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert, wodurch 23 mg 21-O-Desmethylmacbecin II erhalten wurden.

Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 9)-Elutions-Fraktionen von der Silicagel-Säule wurden zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde, nach ähnlicher Reinigung mittels präparativer TLC auf Silicagel) (n-Hexan-Ethylacetat = 1 : 4), in Ethylacetat gelöst und mit 2proz. wäßrigem Na₂S₂O₄ reduziert. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit Wasser gewaschen und konzentriert, wodurch 23 mg E-5-R erhalten wurden.

Beispiel 4

Nocardia mediterranei IFO 13 415 wurde unter Schütteln in einem 1% Glucose, 1% Tryptone (Difco, USA) und 0,6% Hefeextrakt enthaltenden Medium 2 d bei 30°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde für die Beimpfung eines Fermentationsmediums der selben Zusammensetzung wie vorstehend verwendet, wobei die Impfmenge 5% betrug. Nach 24stündiger Inkubation bei 30°C wurde die erhaltene Fermentationsbrühe zentrifugiert, und die dabei erhaltenen Zellen wurden mit sterilem Wasser gewaschen und in sterilem Wasser in einer Menge von einem Fünftel der Fermentationsbrühe suspendiert, so daß eine Suspension gewaschener Zellen erhalten wurde. Zu 4,5 ml dieser Zellsuspension wurden 0,2 ml eines 1M Phosphat-Puffers (pH 7,0) und 0,2 ml einer Lösung von 20 mg/ml Macbecin I in Methanol hinzugefügt. Die Reaktion wurde in einem Reagensglas bei 30°C 20 h unter Schütteln durchgeführt. Die flüssige Reaktionsmischung wurde mit der gleichen Menge Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, 2 Volumina einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung wurden zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Danach wurden 5 µl der Ethylacetat-Schicht auf eine Silicagel-Platte (E. Merck A. G., 60 F₂₅₄) getüpfelt und mit Wasser gesättigtem Ethylacetat entwickelt. Die Analyse mit Hilfe eines Shimadzu Zwei-Wellenlängen-TLC-Abtastgeräts CS-910 (Shimadzu Seisakusho Ltd., Japan) ergab eine 80proz. Umwandlung des eingesetzten Macbecin I in O-desmethylierte Verbindungen.

Beispiel 5

Macbecin I (500 mg) wurde zu 1,3 l der durch die Verfahrensweise von Beispiel 4 erhaltenen Kulturbrühe hinzugefügt, und die Reaktion wurde unter Schütteln 20 h bei 30°C durchgeführt. Die flüssige Reaktions-Mischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde auf pH 6,5 eingestellt und zweimal mit je 650 ml Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, 1,1 l einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung wurden zugesetzt, und die Mischung wurde 1 h gerührt. Danach wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit Wasser gewaschen und konzentriert. Auf Zusatz von n-Hexan wurden 400 mg eines pulverförmigen Rohprodukts erhalten.

Das rohe Pulver (400 mg) wurde der Säulenchromatographie an 65 g Silicagel (Merck) unterworfen und der Reihe nach mit n-Hexan und n-Hexan-Ethylacetat-Gemischen der Zusammensetzungen 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 und 1 : 4 entwickelt. Die das Haupt-Reaktionsprodukt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockne eingeengt und weiter der Silicagel-Säulenchromatographie (40 g) unterworfen, wonach mit n-Hexan und Chlorform-Methanol- Mischungen (100 : 1 → 100 : 2 → 100 : 3, in dieser Reihenfolge) entwickelt wurde. Die durch nur einen einzigen Fleck gekennzeichneten Fraktionen wurden vereinigt und bis fast zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Nach dem Abkühlen wurden 84 mg E-3 in Form gelber Kristalle erhalten. Eine zweite Fraktion (51 mg) E-3 wurde aus der Mutterlauge gewonnen.

Beispiel 6

Ein Impfkultur-Medium (pH 7,0) in einem 200 ml-Erlenmeyer- Kolben, das 2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% Roh-Sojabohnen-Mehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ enthielt, wurde beimpft mit Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14 127; FERM BP-166), das auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar kultiviert worden war, und die Inkubation wurde in einem Drehschüttelgerät 48 h bei 28°C durchgeführt. Ein Anteil von 10 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurde in einen 2-l-Sakaguchi-Kolben überführt, der 500 ml des selben Impfkultur-Mediums enthielt. Die Inkubation wurde auf einem Reziprokschüttler 48 h bei 28°C durchgeführt. 1 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurde zur Beimpfung von 100 l des selben Impfkultur-Mediums in einem 200-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl verwendet. Die Inkubation wurde 48 h bei 28°C durchgeführt mit einer Belüftungs-Rate von 100 l/min und unter Rühren mit 200 Umdrehungen/min, wodurch eine Impfkulturbrühe erhalten wurde. Ein Anteil von 60 l der Impfkulturbrühe wurde in einen 2000-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl überführt, der 1200 l eines Fermentationsmediums enthielt, das 5% Glycerin, 2% Maisquellflüssigkeit, 2% Trockenhefe, 0,5% MgCl₂, 2% KH₂PO₄ und 0,1% CaCO₃ enthielt, und die Inkubation wurde 114 h bei 28°C unter einem inneren Druck von 0,981 bar (1 kg/cm²) mit einer Belüftungsrate von 1200 l/min und unter Rühren mit 150 Umdrehungen durchgeführt. Die Fermentationsbrühe (1100 l) wurde mit 61,8 kg Hyflo Super Cel durchgeführt. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt (1200 l), auf pH 6,5 eingestellt und mit 600 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 40 l eingeengt. Dann wurden 20 l einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 1 h gerührt. Nach dem Oxidationsvorgang wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit je 20 l Wasser gewaschen und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der ölige Rückstand (etwa 200 ml) wurde zweimal mit je 1 l n-Hexan gewaschen. Zu dem Rückstand (etwa 100 ml) wurden 500 ml Ethylacetat gegeben, und die Mischung wurde an einem kühlen Ort stehen gelassen, woraufhin sich Kristalle abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert, die Mutterlauge wurde eingeengt, und der Rückstand wurde der Säulen-Chromatographie an 450 g Silicagel (E. Merck A. G.) unterworfen. Die Säule wurde mit n-Hexan (500 ml) gewaschen und dann der Reihe nach mit n-Hexan-Ethylacetat-Gemischen (4 : 1 → 2 : 1 → 1 : 1 → 1 : 2 → 1 : 4 → 1 : 8) entwickelt. E-3 wurde in den n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 2)-Elutionsfraktionen, C-33196 E-4 in den n-Hexan-Ethylacetat- (1 : 4)-Fraktionen und E-5 in den n-Hexan-Ethylacetat- (1 : 8)-Fraktionen gefunden.

Jedes der auf diese Weise erhaltenen Produkte bestand noch nicht nur aus einem einzigen Bestandteil und wurde dementsprechend nochmals durch Silicagel-Chromatographie gereinigt.

Die Mischung, deren Hauptbestandteil E-3 war, wurde an einer Silicagel-Säule von 100 g adsorbiert und, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform- Methanol (100 : 1 - 25 : 1) entwickelt. Das Einengen der vereinigten Fraktionen, die jeweils nur einen Fleck bei der TLC zeigten, lieferte 66 mg E-3. Die Mutterlauge wurde der Reduktion mit 2proz. wäßrigem Natriumdithionit unterworfen. Das Reduktionsprodukt wurde der Säulenchromatographie an Silicagel (100 g) unterworfen. Die Entwicklung, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (50 : 1 - 50 : 4) und das Einengen der Fraktionen, die jeweils nur einen Fleck bei der TLC zeigten, lieferte 170 mg E-3-R in kristalliner Form.

Die Mischung, deren Hauptbestandteil das Antibiotikum C-33196 E-4 war, wurde an einer Silicagel-Säule (150 g) adsorbiert und, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (50 : 1 → 10 : 1) entwickelt. Die das angestrebte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt; der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst und mit 2proz. wäßrigem Natriumdithionit behandelt. Das Reduktionsprodukt wurde nochmals der Säulenchromatographie an Silicagel (130 g) unterworfen. Die Entwicklung, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (25 : 1 → 5 : 1) und das anschließende Einengen der vereinigten, nur einen Fleck zeigenden Fraktionen lieferte Kristalle (430 g) des Antibiotikums C-33196 E-4-R.

Die Fraktion, in der E-5 der Hauptbestandteil war, wurde an einer Silicagel-Säule (200 g) adsorbiert und, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform- Methanol (25 : 1 → 10 : 1) entwickelt. Die E-5 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt; der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 2proz. Natriumdithionit behandelt. Das Reduktionsprodukt wurde nochmals der Säulenchromatographie an Silicagel (130 g) unterworfen und, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (50 : 1 → 10 : 1) entwickelt. Das Einengen der vereinigten, nur einen Fleck zeigenden Fraktionen lieferte Kristalle (1,325 g) E-5-R.

Beispiel 7

Methanol (1 l) wurde zu einem Anteil von 1 l der in gleicher Weise wie in Beispiel 6 erhaltenen Fermentationsbrühe hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert. Das Methanol wurde aus dem Filtrat durch Destillation entfernt. Der Rückstand wurde auf einen pH 6 bis 7 eingestellt und zweimal mit je 500 ml Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und eingeengt. Die TLC des Konzentrats bestätigte die Anwesenheit des Antibiotikums C-33196 E-4, das Antibiotikums C-33196 E-4-R, sowie von E-5, E-5-R, E-3 und E-3-R.

Beispiel 8

In 100 ml Ethylacetat wurden 100 mg des Antibiotikums C-33196 E-4-R, das wie in Beispiel 6 erhalten wurde, gelöst. Dazu wurden 50 ml einer 2proz. wäßrigen Eisen (III)chlorid-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 1 h gerührt. Danach wurde das Ethylacetat abgetrennt, mit Wasser gewaschen und eigeengt, wonach 88 mg des Antibiotikums C-33196 E-4 erhalten wurden.

Beispiel 9

Die Verbindungen E-5-R und E-3-R, die wie in Beispiel 6 erhalten wurden, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 8 behandelt, wonach die Verbindungen E-5 bzw. E-3, beide in kristalliner Form, erhalten wurden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der in den Beispiel 6 und Beispiel 9 erhaltenen Verbindungen E-5 und E-3 sowie derjenigen von E-5-R und E-3-R sind mit denjenigen der in Beispiel 2 erhaltenen Verbindungen identisch.

Beispiel 10

Ein Impfkultur-Medium (pH 7,0) in einem 200-ml-Erlenmeyer- Kolben, das 2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1% Roh-Sojabohnen-Mehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ enthielt, wurde beimpft mit Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14 127; FERM BP-166), das auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar kultiviert worden war, und die Inkubation wurde in einem Drehschüttelgerät 48 h bei 28°C durchgeführt. Ein Anteil von 10 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurde in einen 2-l-Sakaguchi-Kolben überführt, der 500 ml des selben Impfkultur-Mediums enthielt. Die Inkubation wurde auf einem Reziprokschüttler 48 h bei 28°C durchgeführt. 1 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurde zur Beimpfung von 100 l desselben Impfkultur-Mediums in einem 200-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl verwendet. Die Inkubation wurde 48 h bei 28°C durchgeführt mit einer Belüftungs-Rate von 100 l/min und unter Rühren mit 200 Umdrehungen/min, wodurch eine Impfkulturbrühe erhalten wurde. Ein Anteil von 60 l der Impfkulturbrühe wurde in einen 2000-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl überführt, der 1200 l eines Fermentationsmediums enthielt, das 5% Glycerin, 2% Maisquellflüssigkeit, 2% Trockenhefe, 0,5% MgCl₂, 2% KH₂PO₄ und 0,1% CaCO₃ enthielt, und die Inkubation wurde 114 h bei 28°C unter einem inneren Druck von 0,981 bar (1 kg/cm²) mit einer Belüftungsrate von 1200 l/min und unter Rühren mit 150 Umdrehungen durchgeführt. Die Fermentationsbrühe (1100 l) wurde mit 61,8 kg Hyflo Super Cel filtriert. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt (1200 l), auf pH 6,5 eingestellt und mit 650 l Ethylacetat extrahiert.

Die Dünnschichtchromatographie [Elutionsmittel: Chloroform- Methanol (9 : 1)] zeigte die Anwesenheit von E-7 (R_f: 0,65) und E-7-R (R_f: 0,18) an.

Zur leichteren Isolierung und Reinigung der angestrebten Produkte wurde E-7-R in dem Extrakt zunächst zu E-7 oxydiert, das dann gereinigt und weiter wieder zu E-7-R reduziert wurde. Zu diesem Zweck wurde der Extrakt mit 300 l Wasser gewaschen und dann unter vermindertem Druck konzentriert (auf ein Volumen von 28 l). Dazu wurden 14 l einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid- Lösung gegeben, und die Mischung wurde gerührt. Eine Stunde später wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit je 14 l Wasser gewaschen und eingeengt. Das ölige Konzentrat wurde viermal mit je 500 ml n-Hexan gewaschen, und der verbleibende viskose Rückstand wurde in 500 ml Ethylacetat gelöst. Die Mischung wurde mit 250 mg Silicagel (Kieselgel 60, E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland) gemischt. Die erhaltene Mischung wurde zur Trockne eingeengt und auf eine Säule aus Silicagel (500 g) gegeben. Die gesamte Säule wurde mit n-Hexan gewaschen und dann der Reihe nach mit n-Hexan-Ethylacetat- Gemischen (4 : 1 → 2 : 1 → 1 : 1 →1 : 1 → 2 : 1 → 1 : 4 → 1 : 8) eluiert. Die n-Hexan-Ethylacetat-(2 : 1 → 1 : 1)-Elutionsfraktionen enthielten C-33196 E-7. Diese Fraktionen wurden vereinigt und auf etwa 50 ml eingeengt und weiter mit 200 ml Ethylacetat verdünnt. Danach wurden 120 ml einer 2proz. wäßrigen Natriumdithionit- Lösung hinzugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Nach dem Entfernen der wäßrigen Schicht wurde die Reduktions- Behandlung noch einmal in der gleichen Weise wiederholt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt. Dann wurden 10 g Silicagel hinzugefügt, und die Mischung wurde zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde auf eine Säule aus Silicagel (50 g) gegeben. Nach der Entwicklung mit n-Hexan wurde die gesamte Säule der Reihe nach mit Chloroform und Chloroform- Methanol-Gemischen (100 : 1 → 50 : 1 → 4 : 1) eluiert. Die Chloroform-Methanol-(4 : 1)-Elutionsfraktionen, die C-33196 E-7-R enthielten, wurden unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst. Nach dem Abkühlen lieferte die Lösung 423 mg C-33196 E-7-R in Form farbloser Kristalle.

Auflösen von 200 mg C-33196 E-7-R in 100 ml Ethylacetat, Oxidation mit 100 ml einer 2proz. wäßrigen Eisen (III)chlorid-Lösung, Waschen mit Wasser und Zusatz von n-Hexan ergaben 180 mg C-33196 E-7 in Form eines gelben Pulvers.

Beispiel 11

Aliquote Anteile von jeweils 2 ml der durch Kultivierung in dem Erlenmeyer-Kolben in Beispiel 10 erhaltenen Impfkultur wurden in einen 200-ml-Erlenmeyer-Kolben überführt, der 40 ml eines Hauptkulturmediums enthielt, das 5% Glycerin, 2% Trockenhefe, 2% Meisquellflüssigkeit und 3% Monoammoniumphosphat enthielt (pH 7,0). Die Inkubation wurde auf einem Drehschüttler 90 h bei 28°C durchgeführt. Fünf Liter der Kulturbrühe wurden mit Hyflo Super Cel filtriert, und das Filtrat wurde auf pH 7 eingestellt und zweimal mit je 2,5 l Ethylacetat extrahiert.

Die Dünnschichtchromatographie [Elutionsmittel: Chloroform- Methanol (9 : 1)] zeigte die Anwesenheit von E-6 (R_f: 0,41) und E-6-R (R_f: 0,22) an.

Zur Erleichterung der Isolierung der angestrebten Produkte wurde das in dem Extrakt erhaltene E-6-R zu E-6 oxydiert, das dann zusammen mit dem ursprünglich von dem Mikroorganismus erzeugten E-6 isoliert und gereinigt wurde. Zu diesem Zweck wurde nach dem Waschen mit Wasser die Ethylacetat-Schicht auf ein Volumen von 1 l konzentriert. Dazu wurden 500 ml einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung gegeben, und die Mischung wurde 1 h gerührt, und dann wurde die Ethylacetat-Schicht mit Wasser gewaschen und eingeengt. Zu dem Konzentrat (etwa 30 ml) wurden 10 g Silicagel gegeben. Die Mischung wurde wieder zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde auf eine Säule aus Silicagel (50 g) gegeben.

Die gesamte Silicagel-Säule wurde der Reihe nach mit n-Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol-Gemischen (100 : 1 → 30 : 1) entwickelt. Die E-6 enthaltenden Fraktionen (aufgrund der dünnschichtchromatographischen Ergebnisse) wurden vereinigt und konzentriert, woraufhin 160 mg C-33196 E-6 in Form gelber Kristalle erhalten wurden.

Zu der Mutterlauge wurden 5 g Silicagel hinzugefügt, die Mischung wurde zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde auf eine Säule aus Silicagel (25 g) gegeben. Die gesamte Säule wurde in gleicher Weise wie im Vorstehenden entwickelt. Die E-6 enthaltenden Fraktionen wurden konzentriert, in 100 ml Ethylacetat gelöst und zweimal nacheinander mit jeweils 50 ml einer 2proz. Natriumdithionit-Lösung reduziert. Die Ethylacetat- Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert, woraufhin 45 mg C-33196 E-6-R in Form farbloser Kristalle erhalten wurden.

Claims

1. Desmethylmacbecin-Derivate der Formel in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff ist und die übrigen Methyl sind und X eine der Gruppen ist.

2. Macbecin-Antibiotikum-Derivat C-33196 E-4 erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, mit der folgenden Formel: und mit den folgenden Eigenschaften:

I) Schmelzpunkt: 209-210°C;
II) Aussehen: gelbe Kristalle;
III) Spezifische Drehung: + 53° ± 5° (c = 0,5; CHCl₃);
IV) Elementaranalyse (%):
C: 63,14 ± 0,5,
H: 7,57 ± 0,5,
N: 5,26 ± 0,5;
V) Massenspektrum (M⁺): m/z 532;
VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
276 nm ± 2 nm 272 ± 20);390 nm ± 2 nm 33,5 ± 5);
VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500, 1380, 1305, 1290, 1210, 1050;
VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Wasser;
Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Toluol, Diethylether;
Leicht löslich in Aceton, Ethylacetat, Methanol, Dimethylsulfoxid;
IX) Farbreaktionen:
Positiver Kaliumpermanganat-Test (Entfärbung);
Negative Ninhydrin-, Ehrlich- und Barton- Reaktion;
X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;

3. Macbecin-Antibiotikum C-33196 E-4-R erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, mit der folgenden Formel und mit den folgenden Eigenschaften (der ein Molekül Ethylacetat als Kristallisations-Lösungsmittel enthaltenden Kristalle):

I) Schmelzpunkt: 224-225°C;
II) Aussehen: farblose Kristalle;
III) Spezifische Drehung: + 32° ± 5° (c = 0,5; MeOH);
IV) Elementaranalyse (%):
C: 60,96 ± 0,5,
H: 8,25 ± 0,5,
N: 4,59 ± 0,5;
V) Massenspektrum (M⁺): m/z 534;
VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
307 nm ± 2 nm 75 ± 8);
VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380, 1325, 1045;
VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Diethylether, Chloroform und Ethylacetat;
Löslich in Methanol;
Leicht löslich in Dimethylsulfoxid;
IX) Farbreaktionen:
Positive Barton-Reaktion;
Negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion;
X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;

4. Antibiotikum C-33196 E-6 erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der chemischen Struktur in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Methyl ist und die übrigen Wasserstoff sind und X eine der Gruppen ist, und mit den folgenden Eigenschaften:

I) Spezifische Drehung: + 258,8° ± 20° (c = 0,5; CHCl₃);
II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
273 nm ± 2 nm (E 454 ± 45),
397 nm ± 2 nm (E 50,3 ± 5);
III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380, 1325, 1265, 1210, 1090, 1040;

5. Antibiotikum C-33196 E-6-R erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:

I) Spezifische Drehung: + 37,8° ± 4° (c = 0,5; MeOH);
II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
255 nm ± 2 nm 337 ± 30),
307 nm ± 2 nm 91 ± 9);
III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320, 1090, 1040, 1010;

6. Antibiotikum C-33196 E-7 erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:

I) Spezifische Drehung: + 37,4° ± 4° (c = 0,5; CHCl₃);
II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
274 nm ± 2 nm 502 ± 50),
396 nm ± 2 nm 59,8 ± 6);
III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325, 1260, 1205, 1150, 1095, 1035;

7. Antibiotikum C-33196 E-7-R erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:

I) Spezifische Drehung: + 18,6° ± 2° (c = 0,5; MeOH);
II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
250 nm ± 2 nm 305 ± 30),
315 nm ± 2 nm 68 ± 7);
III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden (cm^-1):
1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310, 1250, 1090, 1040; und

8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Desmethylmacbecin- Derivate der Formel in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff ist und die übrigen Methyl sind und X eine der Gruppen ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch die Formel in der X eine der Gruppen ist, bezeichnete Verbindung mit einer Kulturbrühe, einschließlich eines Verarbeitungsstoffes der Kulturbrühe, des Mikroorganismus Streptomyces platensis IFO 12 901 oder Nocardia mediterranei IFO 13 414, der in der Lage ist, eine der Methoxy-Gruppen in den Stellungen 17, 18 und 21 der genannten Ausgangsverbindungen in eine Hydroxy- Gruppe umzuwandeln, in Berührung gebracht wird.

9. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder C-33196 E-7-R, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14127), der zur Erzeugung der Antibiotika C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder C-33196 E-7-R befähigt ist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, so daß dieser Mikroorganismus veranlaßt wird, die betreffende Verbindung in der Kulturbrühe zu erzeugen und anzureichern, und die betreffende Verbindung aus der Kulturbrühe gewonnen wird.