HU177391B

HU177391B - Process for producing maytanzinol and derivatives

Info

Publication number: HU177391B
Application number: HU77TA1458A
Authority: HU
Inventors: Eiji Higashide; Mitsuko Asai; Seiichi Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-13
Publication date: 1981-09-28
Also published as: NL7711273A; PL201539A1; AU2907377A; DE2746253C2; FR2385798A1; PT67853A; AU507869B2; PT67853B; IT1094003B; IT7821819A0; CS214881B2; JPS53121998A; IE45888L; DK143570C; PL108863B1; SU938746A3; DK143570B; AT362058B; GB1554395A; ES463206A1

Description

A találmány tárgya új eljárás maytanzinol, maytanacin és' maytanzinol-propionát előállítására. A felsorolt vegyületek daganat-ellenes hatással rendelkeznek.

Ismeretes, hogy a fenti vegyületek közül a maytanacin és maytanzinol-propionát daganat-ellenes hatása erős (Kupchan és mtsai: Journal or the American Chemical Society 97, 5294 /1975/). A maytanzinol maga viszont csak gyenge daganat-ellenes hatást mutat (lásd a fenti hivatkozást), de ] hasznos intermedier a maytanacin és maytanzinol-propionát, valamint más származékok előállítására.

A maytanzinolt és maytanacint Kupchan és mtsai. a Putterlickia verrucosa (a maytenus nemzet- i ségbe tartozó növény) kérgéből nyerték ki, így igen kis kitermelést kaptak. Közelebbről 1 kg szárított kéregből az első vegyület 0,025 mg-nyi, míg az utóbbi vegyület 0,36 mg-nyi mennyiségét sikerült kinyerni. A maytanzinol-propionátot vi- 21 szont a maytanzinol vegyi úton végzett propionezésével állítottuk elő.

A találmány kidolgozása során különféle talajás egyéb mintákat gyűjtöttünk össze és megvizs- 2!

gáltuk a mintákból izolált mikroorganizmusok által termelt antibiotikumokat.’ Vizsgálataink arra a felismerésre vezettek, hogy néhány így izolált mikroorganizmus alkalmas a maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát összegyűjtésére a táp- 3( talajban. Ezek a mikroorganizmusok a Nocardia nemzetséghez tartoznak. A vegyületek úgy is előállíthatok, hogy az ezekből a mikroorganizmusokból származó mutánsokat alkalmas tápsókat tar5 talmazó táptalajokon, alkalmas körülmények között tenyésztjük.

A fenti felismerések alapján folytatott további tanulmányok vezettek a jelen találmány kidolgozásához.

így a jelen találmány tárgya új eljárás a maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát előállítására, oly módon, hogy egy Nocardia C-15003 jelzésű, ATCC 31281 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust asszimilálható szénfor5 rásokat és emészthető nitrogénforrásokat tartalmazó táptalajban, 20—35 °C hőmérsékleten, 7,0 kezdeti pH-értéken tenyésztünk, majd az összegyűlt maytanzinolt, maytanacint vagy maytanzinol-propionátot önmagában ismert módon elkülönítjük.

A technika állása szerint a fenti vegyületek növényekből állíthatók elő, de az alkalmas növények száma igen korlátozott, az előállítás rendkívül költséges és időigényes valamennyi lépés, 5 így a növesztés, szárítás és a növény elpcrítása és extrakciója, az elkülönítés és a tisztítás lépéseit tekintve egyaránt. Ugyanakkor a kitermelés rendkívül alacsony.

Ezzel szemben a találmány szerinti eljárás , könnyen és simán végrehajtható a mikroorganizmus “tenyésztésével és a vegyületek nagy mennyiségének előállítására alkalmas,

A találmány szerinti eljárás az első ezeknek a vegyületeknek mikroorganizmusok metabolitjaként történő előállítására, és mint ilyen a vegyületek előállítására alkalmas igen kiváló módszerként jellemezhető.

A találmány szerinti eljáráshoz a C—15003 számú, ATCC 31281 számon deponált actinomycetes törzset használjuk, amelyet a talajból és¹⁰egyéb mintákból is izoláltunk az antibiotikumok termelésére alkalmas mikroorganizmusok felkutatása során.

A C-15003 törzs mikrobiológiai jellemzőit a Schirling és Gottlíeb (Intemational Journal of¹⁵Systematic Bacteriology 16, 313—340 /1966/) által javasolt módszerhez hasonló eljárással vizsgáltuk. A 28°C-on, 21 nap múltán végzett megfigyelések eredményeit a következőkben ismertetjük.

1. Morfológiai jellemzők

A vegetatív micélium agar és folyékony táptalajon egyaránt jól szaporodik és elágazódik. Sok 25 gombasejt 0,8—1,2μηι átmérőjű és néhány esetben a pálcika alakú baktériumokra emlékeztető vagy elágazó, rövid sejtekre osztódhat. A törzs jó növekedést mutat különböző taxonómiai táptalajokon, ahoi a léginíceíium ráépüi a vegetatív micélium- 30 ra, bár az gyakran coremia-szerű testeket (50-200 x 200-1000 pm) alkot, amelyeken további légi növekedés léphet fel. Sok 'cgmicélium rugalmas, és néhány esetben egyenes vagy laza spirál-szerű konfigurációt lehetett megfigyelni. Az öregí- 35 tett tenyészetek mikroszkópikus vizsgálata azt mutatta, hogy conidia-szerű sejtek csak néhány esetben jelennek meg a láncokban, míg az ilyen tenyészetek tetejéből nyert sejt szuszpenziók, mikroszkópos megfigyelések szerint, sok elnyújtott 40 ellipszoid (0,8—1,2 pm x 4,8-6,8 pm) és ellipszoid (0,8 1,2 x 1,0-2,0 Mm) alakú, az arthrospores-re emlékeztető testei tartalmaztak.

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek a testek sima felületűek. 45

2. A sejtek összetevői

A törzset módosított ISP 1 számú táptalajon rázással tenyésztettük 28 °C-os hőmérsékleten, 50 66-99 órán át. A tenyésztés befejeztével a sejteket összegyűjtöttük & leöblítettük. B. Becker és mtsai. (Applied Microbiology 12, 421 /1964/ és Μ. P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 /1968/) módszerével megvizs- 55 gáltuk a finti sejtek diamino-pimelinsav és cukor tartalmát. Az első vegyületrül azt találtuk, hogy mezo-formájúak, míg olyan helyeket is detektáltunk, amelyek galaktóznak és arabinóznak feleltek meg. 60

3. Taxonómiai táptalajokon mutatott jellemzők

A törzs viszonylag jó növekedést mutatott különböző táptalajokon, ahol a vegetatív micélium 65 színtelentől halvány sárgáig változott a tenyésztés kezdeti fázisaiban, és színe világos sárgásbarna és világosbarna között volt a későbbi fázisokban. Azt találtuk, hogy a törzs oldható pigmenteket termel, melyek színe sárgától sárgásbarnáig változhat, különböző taxonómiai táptalajokon. A légmicéliuni porszerű és általában mérsékelt növekedést mutat, színe pedig fehér és világos sárgásbarna között van. A törzs jellemzőit különböző taxonómiai táptalajokon a következő 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

A C—15003 törzs tenyésztési jellemzői különböző taxonómiai táptalajokon (A) Szacharóz nitrát agar:

Növekedés (G): mérsékelt, világos dinnye sárga (3 ia)^x és borostyánszín között (3 lc)^x, coremia-szerű testek.

Légi micélium (AM): kevés, fehér Oldható pigment (SP): Nincs vagy világos sárgásbarna.

(B) Glicerol nitrát agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x, coremia-szerű tesiek képződnek.

AM: mérsékelt, fehér.

SP: nincs.

(C) Glükóz aszparagin agar:

G: mérsékelt, élénk gólyahír színű (3 pa)^x és élénk sárga (2 pa)^x között. AM: Kevés, fehér. SP: Világossárga (2 pa)^x.

(D) Glicerol aszparagin agar:

G: mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x, coremia-szerű testek képződnek.

AM: Kevés, fehér.

SP: Nincs.

(E) Keményítő agai:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x és világos búzaszínű (2 ea)^x között, coremia-szerű testek képződnek.

AM: Kevés, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x

SP: Nincs.

(F) Tápsó agar;

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x és gyarmati sárga (2 ga)^x között, coremia-szerű testek képződnek.

AM: Kevés, fehér.

SP: Nincs.

1. táblázat folytatása (G) Kálcium maláta agar:

SP: Nincs.

(H) Élesztő extraktum — maláta extraktum agar: G: Mérsékelt, borostyánszínűtől (3 lx)^x élénk sárgáig (3 la)^x, coremia-szerű testek képződnek.

AM: Mérsékelt, fehér és világos elefántcsontszínű között (2 ca)^x,

SP: Nincs.

(I) Zabliszt agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x gyarmati sárgáig (2 ga)^x, coremia-szetű testek képződnek.

AM: Kevés, fehér és világossárga között.

SP: Nincs.

(J) Pepton élesztő extraktum vas agar:

G: Mérsékelt, gyarmati sárga (2 ga)^xAM: Nincs

SP: Gyarmati sárga (2 ga)^x (K) Tirozin agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x világos dinnye sárgáig (3 ea)^x, coremia-szerű testek képződnek.

AM: Mérsékelt, fehér és világos elefántcsontszínű között (2 ca)^x.

SP: Teve színű (3 ie)^x.

^XA színeket a „Color Harmony Manual” 4. kiadása szerint határoztuk meg (Container Corporation of America, 1958).

4. Fiziológiai jellemzők

A törzs fiziológiai jellemzőit a 2. táblázatban foglaltuk össze. A növesztés során a hőmérséklet 12 és 38 °C között volt. Az a hőmérsékleti tartomány, amelyen belül agaron (ISP NO. 2) jó légi növekedés figyelhető meg 20—35 °C.

2. táblázat

A C-15003 számú törzs fiziológiai jellemzői Növekedésre alkalmas hőmérsékleti tartomány: 12-38 °C.

Légi növekedésre alkalmas hőmérsékleti tartomány: 20—35 °C.

A zselatin megolvadása: pozitív.

A keményítő hidrolízise: pozitív.

Nitrátok redukálása: pozitív.

Tej peptonizálása: pozitív.

Tej koagulálása: negatív.

2. táblázat folytatása

Kazein elbontása: pozitív.

Melanoid pigmentek termelése:

negatív (pepton élesztő extraktum vas agar) pozitív (tirozin agar)

Tirozin elbontása: pozitív. Xantin elbontása: negatív.

Lizocimmel szembeni tolerancia: pozitív. Nátriumkloriddal szembeni tolerancia: 2%.

5. Különböző szénforrások felhasználása

A különféle szénforrások felhasználását^ úgy. vizsgáltuk, hogy egy Pridham és Gottlieb (Journal of Bacteriology 56, 107 /1948/) táptalajt és egy azonos összetételű alap táptalajt plusz 0,1% élesztő extraktumot használtunk. A kapott spektrumot a 3. táblázatban mutatjuk be.

3. táblázat

Különféle törzs által	szénforrások	hasznosítása	a C-15003
Szénforrás	Növekedés	Szénforrás	Növekedés
D-xilóz	♦	raffizóz	+ ±^x
L-arabinóz	4 4	melibióz	4 4
D-glükóz	44 44	izo-inozitol	— - -
D-galaktóz	+ 4	D-szorbitol	— —
D-fruktóz	4+4 44	D-mannitol	44 44
Lramnóz	4 +	glicerol	±
D-mannóz	444 4-t	oldható keményítő	+ +
Szacharóz Laktóz Maltóz Trehalóz	44 44 __X ± + 4 44	kontroll

^xAlap táptalaj 0,1% élesztő extraktum adalékkal.

Megjegyzés:

♦**: kiváló növekedés «·: jó növekedés +: növekedés ±: rossz növekedés

-: nincs növekedés

6. Egyéb jellemzők

A sejteket a korábban, a 2. pont alatt leírt módszerrel gyűjtöttük össze és a DNA preparációját J. Marmur és mtsai. (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961) módszeréhez hasonló módon végeztük A DNA (dezoxinukleinsav) G-C (guanincitozin) tartalmát körülbelül 7’ móí%-nak találtuk.

A törzs vegetatív micéhumának Gram-vízsgálata pozitív eredményt adott.

A C-15003 törzs fenti jellemzőit összevetettük az S. A. Waksman „The Actinomycetes Vol. 2” (The Williams and Wilkins Co. 1961) könyvében, valamint R. E. Buchanan és N. E. Gibbons „Bérgey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8.

kiadás 1974” című kiadványával és más irodalmi adatokkal.

Miután a törzset a Nocardia genus III. csoportjába tartozónak véltük, az a tény, hogy az ismert törzsek között nem találtunk olyat, amelynek a tulajdonságai azonosak lettek volna, arra a következtetésre kellett jutnunk, hogy az általunk vizsgált törzs egy új speciest képvisel.

A C-l5003 számú törzset 3992 szám alatt letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, i Agency of Industrial Science and Technology mikroorganizmus gyűjteményében (FERM), míg a törzs a The Institute fór Fermentation, Osaka (IFO) gyűjteményében az IFO 13726 számot és a The American Type Culture Collection (ATCC), Ma- i ryland, USA gyűjteményében a 31281 számot kapta.

Míg a C—15003 számú törzs a Nocardia genus egy új species-e, mint említettük, a többi mikroorganizmushoz hasonlóan hajlamos különböző változatok és mutánsok kialakítására akár spontán módon, akár mutagének hatására. így például a törzs sok variánsát kaphatjuk röntgensugarakkal végzett besugárzás hatására vagy gamma-sugarak, ultraibolya sugarak hatására, egysejtes izolálással, 21 különböző vegyszereket tartalmazó táptalajokban végzett tenyésztéssel vagy bármely egyéb mutagén kezeléssel. A törzsből spontán módon keletkezett mutánsokat ugyancsak nem tekintjük külön species-nek, ellenkezőleg, bármely ilyen változat vagy mutáns, amely alkalmas a maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát termelésére, felhasználható a találmány céljaira. így például a C-l5003 törzset különféle mutagén kezeléseknek alávetve olyan mutánsokat kapunk, amelyeknél lényegében hiányzik az oldható pigment termelő képesség, amelyekben a micéliumok színtelenek, sárgászöldek, vöröses cserszínűek vagy narancsvörösek, más mutánsok gombasejtjei bacillusszerű elemekre vagy elágazó, rövid sejtekre képesek felhasadni, ismét mások kevés fehér légmicéliumot tartalmaznak vagy lényegében légmicélium nélküliek.

A maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát termelésére alkalmas törzstenyésztésre (a törzset a továbbiakban néha „termelőképes” törzsként rövidítjük) szolgáló táptalaj lehet folyékony vagy szilárd táptalaj, ha olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani tud, bár nagyüzemi gyártáshoz előnyös folyékony táptalaj használata.

Az ilyen, C—15003 antibiotikumot ’ termelő törzsek tenyésztésére felhasznált táptalaj bármely cseppfolyós vagy szilárd táptalaj lehet, azzal a feltétellel, hogy olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani képes, bár nagyüzemi termelés esetében a folyékony táptalajok használata kedvezőbb. A táptalajok tartalmazhatnak nitrogénés szén fonásokat, amelyeket a C—15003 számú mikroorganizmus képes asszimilálni és emészteni, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségű tápsókat és egyéb anyagokat. Szénforrásként például a következő anyagokat használhatjuk: glükóz, laktóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, glicerol, mannitol, szorbitol, zsírok és olajok (például szójabab olaj, disznózsír, csirkezsír). Nitro gén forrásként például a következő vegyületeket használhatjuk: hús extraktum, élesztő extraktum, szárított áesztő, szójabab liszt, kukoricacsávázó folyadék, pepton, lenmag liszt, maláta hulladék, 5 karbamid, ammóniumsók (például ammóniumszulfát, ammóniumklorid, ammóniumnitrát, ammóniumacetát). A táptalaj ezen felül tartalmazhat nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és egyéb sókat, így vas-, mangán·, cink-, kobalt-, nikkelsój kát, foszforsav-, bórsav-sókat és szerves savak sóit, így acetátokat és propionátokat. A táptalaj ezenkívül tartalmazhat még különféle aminosavakat (például glutaminsav, alanin, glicin, lizin, metionin, prolin), peptideket (például dipeptidek, tripepti5 dek), vitaminokat (például Bj, B₂ vitaminok, nikotinsav, Bi ₂, C és E vitaminok), nukleinsavakat (például purin, pirimidin és származékaik). A táptalaj pH-értékének beállítása céljából egy szervetlen vagy szerves savat, lúgot, puffereket és hasonló ) anyagokat adhatunk a rendszerhez. Habzásgátlóként olajok, zsírok, felületaktív szerek és más megfelelő anyagok alkalmas mennyiségeit használhatjuk.

A tenyésztést bármely stacioner, rázó, merülő aerob és más módszerrel végezhetjük. Nagyüzemi ; termelésre természetesen a merülő aerob tenyészetek a legalkalmasabbak. Míg a tenyésztés körülményei természetesen függnek a táptalaj összetételétől, a törzstől, az alkalmazott módszertől és más tényezőktől, az inkubálást 20 és 35 °C ) között, megközelítőleg 7,0 kezdeti pH-érték mellett végezzük. Különösen kívánatos, hogy a hőmérséklet 23 és 30 °C között legyen a tenyésztés közbenső szakaszában és a kezdeti pH-érték 6,5 és 7,5 között változzon. Bár az inkubálás ideje szintén a _; fenti tényezők függvénye, tanácsos az inkubálást addig végezni, míg a kívánt antibiotikum titer-értéke maximális nem lesz. Rázó kultúrák vagy aerob merülő tenyészetek esetében ez az idő általában 48—144 óra között van.

) Az antibiotikum potenciálját Tetrahymena pyriformis W-al viszgáltuk. így a fenti mikroorganizmust egy vizsgálati táptalajon (20 g proteóz-pepton(Difco), 1 g élesztő extraktum(Difco), 2 g glükóz, 1000 ml desztillált víz és 10 ml 1 mólos i foszfát puffer (pH 7) 28 °C-on, 44—48 órán át tenyésztettük és az antibiotikum potenciálját sorozat hígításos módszerrel határoztuk meg, nyomon követve a zavarosodás változását, megvizsgáltuk a hasvízkór daganatsejtjeire kifejtett hatást és a > későbbiekben leírt módon vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végeztünk.

A maytanacint, maytanzinolt vagy maytanzinol-propionátot a kapott táptalajon termeljük és gyűjtjük össze, extra- és intracellulárisan egyaránt. Az anyagok egyike sem mutat antibiotikus hatást, így a Tetrahymena törzzsel szembeni aktivitással párhuzamosan vékonyrétegkromatográfiás módszerrel kerültek detektálásra. így a fermentlét sejtekre és szűrletre különítettük el szűréssel vagy centrifugálással és a szűrletet azonos mennyiségű etilacetáttal extraháltuk. A sejtekhez ugyanolyan mennyiségű 70%-os aceton-víz elegyet adunk, mint a szőriéihez és egy órás, 20°C-on végzett keverés után a szuszpenziót szűrtük. Az acetont eltávotítottuk a szűrletből és a kapott vizes szűrletet etilacetáttal extraháljuk. Valamennyi extraktumot 1/100 térfogatra koncentráltunk és vékonyrétegkromatográfiás méréssel vizsgáltunk, szilikagél lemezen (Merek, NSZK, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20). Oldószer rendszerként kloroform és metanol 9 :1 arányú elegyét használtuk. A potenciált a foltok intenzitásának alapján határoztuk meg, amit 2537 A-nél ultraibolya fénnyel végzett besugárzással határoztuk meg.

A táptalajon így előállított maytanacin, maytanzinol-propionát vagy maytanzinol lipofil és semleges anyagok, és könnyen kinyerhetők általánosan használt elkülönítési és tisztítási eljárásokkal, amelyeket rendszerint ilyen típusú szervezetek begyűjtésére alkalmazunk. így például használhatjuk azt az eljárást, amely az antibiotikumok és a szennyezések oldhatóságában mutatkozó különbséget hasznosítja, azaz, amely a különféle adszorbensekkel szemben mutatott adszorptív affinitást hasznosítja (ilyen adszorbensek lehetnek például: aktív szén, makropórusos, nem-ionos gyanták, szilikagél, alumíniumoxid). A szennyezések ezen kívül ioncserélő gyantákkal és más módszerekkel is eltávolíthatók, amelyeket egymagukban vagy alkalmas kombinációban, adott esetben ismételten is alkalmazunk.

Miután az említett vegyületek a szűrletben és a sejtekben egyaránt előfordulnak, az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása ilyen adszorbensek segítségével, ha használatukra egyáltalán sor kerül, történhet akár közvetlenül, akár — szűrlet esetében — oldószeres extrakció, vagy — mikrobiológiai sejtek esetében - oldószeres extrakció után. Az oldószeres extrakciót a következő módszerek bármelyike szerint végrehajthatjuk:

(1) A fermentlé oldószeres extrakciója a sejtek elkülönítése előtt, (2) a sejtek és a szűréssel, centrifugálissal vagy más módszerekkel kapott szűrlet oldószeres extrakciója. A szűrlet és a sejtek független extrakciójára előnyösen a következő eljárást használjuk.

A szűrlet extrakciójára alkalmas oldószerek vízzel nem elegyedő, szerves oldószerek, így zsírsav-észterek, például etilacetát, amilacetát, alkoholok, például butanol, halogénezett szénhidrogének, például kloroform és ketonok, például metil-izobutil-keton. Az extrakciót semlegeshez közeli pH-értéken hajtjuk végre és előnyösen, az előzőleg pH 7-re beállított folyékony fermentlét etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután egy nem poláros oldószert, így petrolétert vagy hexánt adunk a koncentrátumhoz és a hatóanyagot tartalmazó I számú nyersterméket kinyeijük. Mivel vékonyrétegkromatográfiás mérések szerint a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol mellett számos más foltot is kapunk, az I. számú terméket több lépcsőben a következő tisztítási eljárásokkal dolgozzuk fel. így szokásos tisztítási eljárásként adszorpdós kromatográfiát használhatunk erre a célra, adszorbensként a szokásos adszorbensek valamelyikét, így szilikagélt, alumíniumoxidot, makropórusos nem-ionos adszorbens gyantát alkalmazhatunk. Az I. számú nyerstermék tisztítására legelőnyösebb a szilikagél használata. Az előhívást például úgy hajthatjuk végre, hogy petroléterrel és hexánnal indulunk és az eluálast valamely poláris oldószerrel, úgy mint etilacetáttal, acetonnal, etanollal vagy metanollal végezzük. Egy szokásos eljárás szerint, vivőanyagként szilikagélt használva (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm), az oszlopkromatográfiát úgy végezzük, hogy a hexán : etilacetát arányt fokozatosan növeljük. Az eluátumból mintát veszünk, amelyet vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálunk meg és a hatóanyagokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután a koncentrátumhoz petrolétert vagy hexánt adunk, miáltal II. számú nyersterméket kapunk. Mivel ez a termék még tartalmaz szennyezéseket, a következőképpen tovább tisztítjuk. A II. számú nyersterméket például szilikagél oszlopon tisztíthatjuk, különféle oldószerrendszereket használva. Az erre a célra használt előhívórendszer egy halogénezett szénhidrogénből, így diklórmetánból vagy kloroformból állhat, egy poláris oldószer, úgy mint alkohol, például metanol vagy etanol, keton, például aceton vagy metiletilketon vagy más hasonló oldószerek hozzáadása mellett. Ezzel a módszerrel elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot és maytanzinolt. Az első és második szilikagél oszlopra felvitt oldószerek sorrendje megfordítható, és szükség esetén a fenti rendszerekkel együtt még más szokásos szerves oldószerek is használhatók.

Ha makropórusos adszorbens gyantát használunk a tisztítás eszközéül a II. számú nyerstermék tisztítása során, a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol eluálását víz és egy rövidszénláncú alkohol, rövidszénláncú keton vagy észter elegy ével végezzük. A rövidszénláncú alkohol lehet például metanol, etanol, propanol vagy butanol és a rövidszénláncú keton lehet például aceton vagy metiletilketon. Észterként például etilacetátot használhatunk. Egy tipikus eljárás szerint a II. számú nyersterméket feloldjuk egy 60%-os metanol-víz elegyben és egy Diaion HP-10 (Mitsubishi Kaséi

K. K.) oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot egy 70%-os metanol-víz eleggyel mossuk, majd az eluálást 90%-os metanol-víz eleggyel hajtjuk végre. Ezzel az eljárással a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt eluáljuk az oszlopról.

Bármelyik fent leírt eljárásban az aktív vegyületeket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. A száraz termékhez 5-8 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk, majd elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt. Ezeket a vegyületeket ezután egy adszorbens segítségével választjuk el egymástól. Erre a célra bármelyik eddig említett adszorbens használható. így szilikagélt vagy makropórusos, nem-ionos adszorbens gyantát használva és a fenti oldószerekkel dolgozva a kívánt vegyületek frakcionálisan eluálhatók. Ha például szilikagélt használunk, az előhívást hexánnal, etilacetáttal vagy kloroform-metanol eleggyel hajtjuk végre, a maytanzinol-propionát és maytanacin az itt megadott sorrendben jelennek meg. Vékonyrétegkromatográfiás detektálás az egyes frakciókat külön-külön koncentráljuk csök177391 kenteit nyomás alatt és a koncentrátumokhoz etilacetátot adunk. Ezen a módon a megfelelő vegyületek kristályos formában kaphatók. Ha makropórusos, nem-ionos gyantát használunk, különböző összetételű alkohol, keton vagy észter és víz ele- 5 gyeket használunk a gradiens eluálási technika kivitelezéséhez. így például gradiens eluálási technikával, 60%-os metanol-víz és 95%-os metanol-víz, valamint 5% nátrium-klorid hozzáadásával dolgozva a maytanacin és maytanzinol-propionát a megadott sorrendben válnak ki. Mintavétel és vékonyrétegkromatográfiás detektálás után az aktív frakciók mindegyik csoportját csökkentett nyomáson koncentráljuk és etilacetátból kristályosítjuk. Az izolált kristályok kristályosítási oldószerként etilacetátot tartalmaznak. Foszforpentoxid felett 70°C-on 8 órán át végzett szárítás után a következő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

4.. táblázat

	Maytanacin C3 0H39CIN2 O9	Maytanzinol-propionát C₃iH₄₁ClN₂O₉	Maytanzinol C₂ sH_{3 7}C1N₂O₈
olvadáspont (°C)		235—236	188-190	172,5-174
fajlagos forgató-		[a]p²°—121° ±10°	[<°-127° + 10°	fa]^²°-313° + 10'
képesség		(C = 0,25, CHCI3)	(C = 0,35, CHCI3)	(C = 0,22, CHC1₃)
Analízis	C	59,62	59,63	59,28
számított (%)	H	6,93	6,82	6,38
	N	4,28	4,32	5,02
	Cl	5,74	5,57	6,15
Analízis	c	59,85	59,94	59,52
talált (%)	H	6,48	6,65	6,60
	N	4,61	4,51	4,96
	Cl	5,84	5,71	6,27
ultraibolya abszorpciós		233 (30330)	233 (30240)	232 (32750)
spektrum (e)		240 (sh. 28240)	240 (sh. 28400)	244 (sh. 30850)
		252 (27850)	252 (27650)	252 (31650)
		280 (5680)	280 (5740)	281 (5750)
		288 (5660)	288 (5710)	288 (5700)
infravörös abszorpciós		1740, 1730,	1740, 1730,	1715, 1670,
spektrum (cm'¹)		1670, 1580	1670, 1580	1580
NMR-spektrum (m/e)		545, 485,	559, 485,	503, 485
		470, 450	470, 450	470, 450
savas, semleges vagy		lipofil és	lipofil és	lipofil és
lúgos		semleges	semleges	semleges
		anyag	anyag	anyag
színreakciók		Dragendorff-	Dragendorff-	Dragendorff-
		-reakció;	-reakció:	-reakció:
		pozitív	pozitív	pozitív
		Beilstein-	Beilstein-	Beilstein-
		-reakció:	-reakció:	-reakció:
		pozitív	pozitív	pozitív

A fenti kémiai analízis, fajlagos forgatóképesség, ultraibolya-spektrum, infravörös-spektrum és tömeg- 60 spektrum adatok jó egyezésben vannak a maytanacinnal, maytanzinollal és maytanzinol-propionáttai kapcsolatban Kupchan és mtsai. által megadott adatokkal (lásd Journal és American Chemical

Society 97, 5294 /1975/). 65

A következő példák találmányunkat tovább szemléltetik, a korlátozás szándéka nélkül. A példákban a „súlyrész” és „térfogatrész” kifejezések közötti összefüggés azonos a „gramm” és „milliliter” kifejezések közötti összefüggéssel. A %-®s értékek, ahol másként nem említjük, vegyes %-ot jelentenek.

1. példa

Egy élesztő extraktum - maláta extraktum táptalajon növesztett, maytanzinolt, maytanacint és maytanzinol-propionátot termelő, C—15003 számú Nocardia mikroorganizmust (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) egy 40 térfogatrész beoltó táptalajt tartalmazó 200 térfogatrész méretű fermentor beoltására használunk fel. A beoltó táptalaj összetétele: 2% glükóz, 3% oldható keményítő, 1% nyers szójabab liszt, 1% kukoricacsávázó folyadék, 0,5% polipepton, 0,3% nátrium-klorid, 0,5% kalcium-karbonát, (pH 7,0). A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk 48 órán át inokulum előállítása céljából. Az így kapott inokulum 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét egy 200 térfogatrész méretű, 40 térfogatrész táptalajt tartalmazó fermentorba adagoljuk. A táptalaj összetétele a következő: 5% dextrin, 3% kukorica csávázó folyadék, 0,1% polipepton, 0,5% kalcium-karbonát, pH 7,0. .A táptalajon 28 °C-on 90 órán át tenyésztést végzünk egy inokulum előállítása céljából (oltó tenyészet).

Sorozat hígítási technikával meghatározva, vizsgálati mikroorganizmusként Tetrahymena pyriformis W-t és összehasonlítóként C—15003 P—3 antibiotikumot használva a fenti tenyészet titer értéke 25 íig/ml-nek adódik.

2. példa térfogatrész az 1. példában kapott inokulumot egy 2000 térfogatrész méretű, 500 térfogatrész oltó tenyészet táptalajt tartalmazó fermentorba viszünk (a táptalaj az 1. példában megadottal azonos) és 48 órán át 28 °C-on inkubálást végzünk. A kapott tenyészet 500 térfogatrésznyi mennyiségét egy 50 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült tartályba visszük, amely 30 000 térfogatrész oltó tenyészet közeget tartalmaz és a tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (280 fordulat/perc 1/2 DT/) és 1 kg/cm² belső nyomás alatt végezzük. A kapott oltó tenyészetet 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült, 100 000 térfogatrész az 1. példában használthoz hasonló táptalajt tartalmazó fermentorba adjuk 10% inokulációs sebesség mellett. A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc), keverés (200 fordulat/perc), és 1 kg/cm² belső nyomás mellett, 90 órán át. Az 1. példában leírt módszer meghatározva a kapott tenyészet titere 25 pg/ml.

A kapott 95 000 térfogatrész tenyészethez 2000 súlyrész Hyflo-supercel ®-t (Johnes and Manville Products, USA) adunk és alapos keverés után, az elegyet nyomószűrőn szűgük. 85 000 térfogatrész szűrletet és 32 000 súlyrész nedves sejtet kapunk. A 85 000 térfogatrész szűrletet keveijük és 30 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos rétegeket összegyűjtjük, kétszer 30 000 térfogatrész vízzel mossuk, 500 súlyrész vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 térfogatrész mennyisére koncentráljuk. A ‘ 14 koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (53 súly rész) szűréssel elkülönítjük. Ezt az I. számú nyersterméket elkeverjük 100 térfogátrész etilacetáttal és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. A szűrletet 10 súlyrész szilikagéllel keveijük el (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm) és az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 400 térfogatrész méretű szilikagél oszlop tetejére. Az eluálást 500 térfogatrész hexánnal, 500 térfogatrész 3 : 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 :1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 : 3 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész etilacetáttal és 1000 térfogatrész 50 : 1 arányú etilacetát-metanol eleggyel végezzük, az eluátumokat 100 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtve össze.

Minden frakció 1 térfogatrésznyi mennyiségét szárazra pároljuk és 0,1 térfogatrész etilacetátot adunk a koncentrátumhoz. A kapott elegyet egy szilikagél-üveglap (Merek, NSZK, 60F_2S4, 0,25 mm, 20x20) alsó sarkától számítva 2,5 cm-re cseppentjük és egy 19 :1 arányú etilacetát-metanol oldószer rendszerrel futtatva körülbelül 17 cm-re hívjuk elő. Előhívás után a detektálást ultraibolya fénnyel végezzük (hullámhossz: 2537 A).

A 0,58-0,63 Rf-értékű 25-30 frakciókat és a 0,25-0,30 Rf-értékű 38-40 frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson körülbelül 20 térfogatrészre koncentráljuk. A kapott koncentrátumokhoz 150-150 térfogatrész petrolétert adunk, és így 5 súlyrész II. számú nyersterméket és 2 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk.

térfogatrész etilacetátban feloldjuk a fenti II. számú nyerstermék 1,5 súlyrésznyi mennyiségét. majd az oldatot jól elkeverjük 4 súlyrész szilikagéllel (Merek, NSZK, 0,05—0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot fel visszük egy 300 térfogat részes szilikagél oszlop tetejére, és az oszlopot először 500 térfogatrész kloroformmal mossuk, majd 500 térfogatrész 20 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 10 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumokat 25 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük.

Mindegyik frakció 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A kapott koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyből vett mintát szilikagél vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk (előhívó rendszer: 9 :1 arányú kloroform-metanol elegy).

Az Rf 0,48-0,50 zónában 2537 Λ-nél abszorbeáló 40 és 41 számú frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ily módon 0,05 sulyrész vegyes maytanacin, maytanzinol-propionát kristályt állítva elő.

A maytanacin és maytanzinol-propionát így kapott elegykristályainak 0,05 súlyrésznyi mennyiségét feloldjuk 5 térfogatrész metanolban, majd

0,1 súlyrész nátriumkloridot és 5 térfogatrész vizet adunk az oldathoz. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP— 10-el (Mitsubishi Kaséi

K. K.) és 600 térfogatrész 50%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz eleggyel mossuk. A fenti oldatból vett mintát átengedjük az oszlopon, ₅és gradiens technikával eluáljuk, 1500 térfogatrész 60%-os metanol-víz elegyet (amely 5% nátriumkloridot tartalmaz) Ή 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz elegyet használva.

Az eluátumot 15 térfogatrésznyi frankciókban fogjuk fel és valamennyi frakciót megvizsgáljuk vékonyrétegkromatográfiásan. A 13Ő—135 frakciók tartalmazzák a maytanacint és a 138-142 frakciók a maytanzinol-propionátot. 15

Valamennyi frakciót betöményítjük és 30 ml víz és 50 ml etilacetát hozzáadásával feloldjuk. Az oldatot elválasztó tölcsérben rázzuk és a vizes réteget elválasztjuk és miután kétszer 30 ml vízzel átmos- 20 tűk, az etilacetátos réteget vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, koncentráljuk és állni hagyjuk. A fenti eljárással valamennyi frakcióból kristályokat kapunk. A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. A maytanacin mennyisége: 0,013 g, 25 míg a maytanzinol-propionát mennyisége: 0,013 g.

térfogatrész etilacetátban feloldunk

0,2 súlyrész nyers maytanzinolt, melyet a fenti lépésben kaptunk, és az oldatot jól elkeveijük 30 0,5 súlyrész szilikagéllel (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 80 térfogatrész szilikagélből álló oszlop tetejére és az oszlopot először 150 térfogatrész kloroformmal 35 mossuk, majd 150 térfogatrész 50 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 150 térfogatrész 20:1 arányú kloroform-metanol eleggyel, végül 300 térfogatrész 10:1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 10 térfogatrésznyi frakciók- 40 bán gyűjtjük össze.

Az egyes frakciók 0,5-0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet mintaként vékonyrétegkroma- 45 tográfiásan vizsgáljuk, előhívó rendszerként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használva.

A 2537 A-nél abszorbeáló 50-52 frakciókat (Rf = 0,33—0,38) összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 tér- 50 fogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk. 0,020 súlyrész maytanzinol kristályt kapunk.

3. példa

000 súlyrész a 2. példában kapott sejtet 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel, keverés közben 3 órán át extrahálunk, majd nyomó- 60 szűrőn szűrünk. Az extrahálást 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel még egyszer megismételjük. A szűrleteket összegyűjtjük és az acetont csökkentett nyomáson végzett koncentrálással eltávolítjuk. A kapott vizes rendszert átvezetjük egy 65

5000 térfogatrész Diaion HP—10-et (Mitsubishi Kaséi K. K.) tartalmazó oszlopon. Az oszlopot 20 000 térfogatrész vízzel és 50%-os metanollal mossuk, majd 15 000 térfogatrész 90%-os metanolvíz eleggyel eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson koncentráljuk 3000 térfogatrészre és kirázzuk 3000 térfogatrész vízzel és 3000 térfogatrész etilacetáttal. A fenti eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos réteget egyesítjük, vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson 200 térfogatrészre koncentráljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (280 súlyrész) szűréssel elkülönítjük. A fent kapott I. számú nyersterméket szilikagél oszlopon végzett kromatografálással tisztítjuk az 1. példához hasonló módon. 1,0 súlyrész nyers II. számú terméket és 0,5 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk.

4. példa

1000 térfogatrész a 2. példában kapott tenyészetet egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész űrtartalmú tartályba oltunk, amely 100 000 térfogatrész oltó kultúra táptalajt tartalmaz, és a beoltott táptalajt 28 °C-on, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc) és keverés (200 fordulat/perc) mellett 48 órán át inkubáljuk az oltókultúra előállítása céljából. Ezt az oltókultúrát átvisszük egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész méretű tartályba, mely 100 000 térfogatrész az 1. példában leírttal megegyező táptalajt tartalmaz. Az átviteli arány 10%. A tenyésztést 28 °C-on levegőztetés (1 000 000 térfogatrész/min), keverés (120 ford/min) és belső nyomás (1 kg/cm²) mellett 90 órán át végezzük. A kapott tenyészet titerét 20/ig/ml-nek találtuk az 1. példában ismertetett eljárással végezve a kiértékelést. A fenti tenyészet 900 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 900 000 térfogatrész acetont adunk és egy órás keverés után 20 000 súlyrész Hyflo-Supercel-t (Johnes and Mán vilié, USA). Az elegyet tovább keveijük és nyomószú'rőn szüljük. A kapott szűrletet 170 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 500 000 térfogatrész vizet adunk, és az elegyet egy Podbielniak-ban (Podbielniak, Inc. USA) az elegyet 1 000 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott precipitátumot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A fenti eljárással 680 súlyrész I. számú nyersterméket kapunk. Ezután, mint a 2. és 3. példákban, ezt a nyersterméket tisztítjuk, amikor 1,1 súlyrész maytanacint,

2,2 súlyrész maytanzinol-propionátot és 0,1 súlyrész maytanzinolt kapunk.

Claims

Szabadalmi igénypont:

Eljárás maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát előállítására, azzal jellemezve, hogy egy

Nocardia C-15003 jelzésű, ATCC 31281 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust asszimilál18 ható szénforrásokat és emészthető nitrogén forrásokat tartalmazó táptalajban, 20—35 °C hőmérsékleten, 7,0kezdeti pH-értéken tenyésztünk, majd az összegyűlt maytanzinolt, maytanac és/vagy maytanzinol-propionátot önmagában isn» módon elkülönítjük.