DE2833689C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der
Bezeichnung C-14482 A₁ (nachstehend zuweilen kurz als
C-14482 A₁ bezeichnet) und ein Verfahren zu seiner
Herstellung.
Von der Anmelderin wurden Proben aus der Natur einschließlich
einer großen Zahl verschiedener Bodenproben
entnommen, und die von diesen Proben isolierten Mikroorganismen
wurden einer Auswahluntersuchung bezüglich
der von ihnen gebildeten Antibiotika unterworfen. Die
Untersuchungsarbeit führte zu der Feststellung, daß ein
bestimmter Mikroorganismus ein neues Antibiotikum zu
bilden vermag, daß dieser Mikroorganismus zur Gattung
Nocardia gehört und daß durch Kultivieren dieses Mikroorganismus
in einem geeigneten Nährmedium unter geregelten
Fermentationsbedingungen dieses Antibiotikum im
Kulturmedium angereichert wird.
Die Erfindung ist demgemäß auf die folgenden Gegenstände
gerichtet:
- 1. Das Antibiotikum C-14482 A₁ mit den folgenden Kennzahlen:
- I) Elementaranalyse (%) C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14.
- II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
- III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
- IV) UV-Absorptionsspektrum: λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
- V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr):
Hauptpeaks (cm-1):
3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825 - VI) Löslichkeit:
Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther.
Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Wasser.
Löslich: Methanol, Chloroform. - VII) Farbreaktionen:
Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt. - VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwachbasisch.
- IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun
- X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅).
- 2. Die Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁ nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Nocardia sp. IFO 13725 in einem Nährmedium kultiviert, hierdurch das Antibiotikum im Kulturmedium bildet und anreichert und das schwach basische Antibiotikum durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von solchen Metaboliten von Mikroorganismen angewendet werden, isoliert.
In der vorliegenden Beschreibung wird Nocardia sp.
IFO 13725 auch als C-14482 A₁-bildender Stamm oder
Stamm C-14482 bezeichnet.
Die mikrobiologischen Merkmale des Stamms C-14482 wurden
nach Methoden untersucht, die den von Schirling und
Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology
16 (1966) 313-340) beschriebenen Methoden analog
sind. Die Kultivierung des Mikroorganismus während
einer Zeit von 21 Tagen bei 28°C hatte die folgenden
Ergebnisse:
Das vegetative Mycel ist farblos bis blaßgelb oder
orangegelb und entwickelt sich gut mit Verzweigungen
sowohl auf Agar als auch in flüssigen Medien.
Das vegetative Mycel hat zum größten Teil einen Durchmesser
von 0,5 bis 1,2 µm und teilt sich in den späten
Phasen der Kultivierung in Fragmente, die stäbchenförmigen
Bakterien oder langgestreckten stäbchenförmigen
Bakterien oder verzweigten Hyphen ähneln. Dieser Stamm
zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen
Medien. Während das Luftmycel sich auf dem vegetativen
Mycel gut entwickelt, zeigt das erstere in vielen Fällen
ein Aussehen, als wäre es auf einer großen Zahl von
coremia-artigen Körpern (50 bis 180 µm×400 bis 1500 µm)
gewachsen. Ein großer Teil der Lufthyphen ist gewunden
oder gerade, wobei in wenigen Fällen eine lose spiralförmige
Gestalt oder Verzweigung festzustellen ist. Die
Untersuchung gealterter Kulturen unter dem Mikroskop
zeigt, daß die Sporen nur in wenigen Fällen in Ketten
auftreten und nur wenig sog. Konidien oder Sporen vorhanden
sind. Die Untersuchung von Zellen, die von der
Oberfläche einer solchen Kultur entnommen wurden, unter
dem Mikroskop zeigt die Anwesenheit vieler langgestreckter
elliptischer Zellen (0,5-1,2 µm×4,8-6,8 µm) und elliptischer
Zellen (0,8-1,2 µm×1,5-4 µm), die wie fragmentierte
Zellen oder Arthrosporen aussahen und deren
Oberflächen bei der Untersuchung durch Elektronenmikroskopie
glatt waren.
Das Luftmycel ist im allgemeinen spärlich. Zwar wird
ziemlich gutes Wachstum auf vielen Medien während einer
Bebrütung für 3 bis 7 Tage festgestellt, jedoch verschwindet
es zuweilen, wenn die Kultivierung 7 bis 10
Tage durchgeführt wird.
Bei der Kultivierung in flüssigen Medien zeigt der Mikroorganismus
Motilität in einer Wachstumsphase, wenn das
Mycel Polymorphismus, d. h. die Form von Stäbchen, verzweigten
Zellen oder langgestreckten Stäbchen, die entweder
unabhängig als solche, in Ketten oder verzweigt
vorliegen, zeigt. Die Untersuchung im Elektronenmikroskop
ergibt eine große Zahl von langgestreckten Geißeln rings
um die Zellen.
Der Stamm wurde in modifiziertem ISP-Medium Nr. 1
66 bis 90 Stunden in der Schüttelkultur bei 28°C kultiviert.
In der stationären Phase guten Wachstums wurden
die Zellen abgetrennt und gespült. Sie wurden nach der
Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology
12 (1964) 421) und nach der Methode von
M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory und Clinical
Medicin 71 (1968) 934 auf Diaminopimelinsäure und
Zuckerzusammensetzung untersucht. Es wurde festgestellt,
daß die erstere in der meso-Form vorlag, während hinsichtlich
der letzteren örtlich begrenzte Stellen, die
Galactose und Arabinose entsprachen, festgestellt wurden.
Nach der Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied
Microbiology 17 (1965) 236) wurden Zellwände isoliert
und auf Diaminopimelinsäure, Zucker und Aminosäuren
analysiert. Die Diaminopimelinsäure wurde in ihrer
meso-Form festgestellt. Während jedoch eine große Menge
Galactose als Zuckerbestandteil nachgewiesen wurde,
wurde Arabinose nicht nachgewiesen. Als Aminosäuren
wurden Glutaminsäure und Alanin eindeutig nachgewiesen
während Lysin und Glycin nur in Spuren gefunden werden
konnten.
Der Stamm zeigt stets verhältnismäßig gutes Wachstum
auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel
in den Anfangsphasen der Kultur farblos bis blaßgelb und
in den späteren Phasen blaßgelblichbraun bis gelbbraun
ist. Der Mikroorganismus
bildet in den meisten taxonomischen Medien keine
löslichen Pigmente, jedoch in einigen wenigen Medien ein
schwachbraunes Pigment. Das Luftmycel ist mehlähnlich,
im allgemeinen mäßig und weiß bis
gelb oder blaßgelblichbraun. Auf vielen Medien verschwindet
das Luftmycel bei längerer Kultivierung (etwa 2 Wochen
oder länger), wobei die Oberfläche des vegetativen
Mycels glänzend zu werden beginnt. Die Kulturmerkmale
dieses speziellen Stammes sind nachstehend in Tabelle 1
genannt.
Wachstum (W):schlecht, dünn, farblos Luftmycel (LM):spärlich, weiß Lösliches Pigment (LP):nicht vorhanden
Wachstum (W):schlecht, dünn, farblos Luftmycel (LM):spärlich, weiß Lösliches Pigment (LP):nicht vorhanden
- B) Glucosenitratagar
W:schlecht, dünn, farblos LM:sehr spärlich, weiß LP:nicht vorhanden - C) Glycerinnitratagar
W:mäßig, farblos bis Lt Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ea oder 2 ga)*) oder Brite Melon Yellow (3 ia)*); Bildung von coremiaartigen Körpern. LM:sehr spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden. - D) Glucose-Asparaginagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:spärlich, Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden - E) Glycerin-Asparaginagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:mäßig, weiß bis Lt Wheat (2 ea)*) LP:nicht vorhanden - F) Nähragar
W:mäßig, farblos bis Lt Ivory (2 ca)*) oder Melon Yellow (3 ga)*) LM:nicht vorhanden LP:nicht vorhanden - G) Calciummalatagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Marigold (3 pa)*); Bildung von coremia- artigen Körpern LM:mäßig, weiß LP:nicht vorhanden - H) Hefeextrakt-Malzextraktagar
W:üppig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern. LM:mäßig, weiß bis Pearl Pink (3 ca)*) oder Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:blaßgelblichbraun - I) Hafermehl-Agar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Lt Ivory (2 ca)*) LM:mäßig, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) oder Pearl Pink (3 ca)*) LP:nicht vorhanden oder blaßgelblichbraun - J) Stärkeagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ga oder 2 ga)*) LM:spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden - K) Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar
W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*) LM:nicht vorhanden oder spärlich, weiß LP:blaßgelblichbraun - L) Tyrosin-Agar
W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern LM:spärlich, Pearl Pink (3 ca)*) oder Brite Maize (3 la)*) LP:hellgelblichbraun (mit einem Hauch von Purpur) - *) Die Farbbezeichnungen entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America 1958).
Die physiologischen Eigenschaften des Stamms sind in
Tabelle 2 genannt. Temperaturbereich für das Wachstum:
12° bis 38°C. Der Temperaturbereich, in dem Wachstum
des Luftmycels auf Agar (ISP Nr. 2) stattfindet, ist
20 bis 35°C.
Wachstumstemperaturbereich12 bis 38°C Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels20 bis 35°C Verflüssigung von Gelatinesehr schwach Hydrolyse von Stärkepositiv Reduktion von Nitratenpositiv Peptonisierung von Milchpositiv Gerinnung von Milchnegativ Zersetzung von Caseinpositiv Bildung von schwarzen Pigmenten:
(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar)negativ (Tyrosinagar)negativ Zersetzung von Tyrosinpositiv Zersetzung von Xanthinnegativ Zersetzung von Hypoxanthinnegativ Verträglichkeit mit Lysozympositiv Verträglichkeit mit Natriumchlorid2%
Wachstumstemperaturbereich12 bis 38°C Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels20 bis 35°C Verflüssigung von Gelatinesehr schwach Hydrolyse von Stärkepositiv Reduktion von Nitratenpositiv Peptonisierung von Milchpositiv Gerinnung von Milchnegativ Zersetzung von Caseinpositiv Bildung von schwarzen Pigmenten:
(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar)negativ (Tyrosinagar)negativ Zersetzung von Tyrosinpositiv Zersetzung von Xanthinnegativ Zersetzung von Hypoxanthinnegativ Verträglichkeit mit Lysozympositiv Verträglichkeit mit Natriumchlorid2%
Die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen wurde
nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal
of Bacteriology 56 (1948) 107) mit einem Basalmedium
der gleichen Zusammensetzung plus 0,1% Hefeextrakt
(Difco Co.) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
genannt.
Die Zellen wurden auf die unter (2) "Bestandteile der
Zellen" beschriebene Weise isoliert. Nach einem Verfahren
analog dem Verfahren von J. Murmar und Mitarbeitern
(Journal of Molecular Biology 3 (1961) 208)
wurde DNA hergestellt. Der G-C-Gehalt (Guanin-Cytosin)
des DNA wurde mit etwa 71 Mol.-% ermittelt.
Die Gram′ Färbung des vegetativen Mycels dieses Stamms
ergab eine positive Reaktion.
Die vorstehenden Merkmale des Stamms C-14482 wurden mit
den Beschreibungen in "The Actinomycetes", Band 2
von S.A. Waksman (The Williams and Wilkins Co. 1961),
R.E. Buchanan und N.E. Gibbons in "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology", 8. Auflage 1974 und anderen
Literaturstellen verglichen.
Die vorstehend genannten Beobachtungen, daß 1) der
Stamm in den späteren Phasen der Kultivierung in die
Form von Stäbchen oder langgestreckten Stäbchen oder
deren verzweigte Zellen zerfällt, 2) wenig wohldefinierte
Konidien oder Sporen bildet, 3) die Oberflächen
seiner Kolonien auf Agar lederartig und in vielen Fällen
glänzend wie Bakterienkolonien sind und 4) der G-C-Gehalt
des Mycels etwa 71 Mol.-% beträgt, lassen zusammen mit
den anderen Merkmalen darauf schließen, daß der Stamm
zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehört. Da es jedoch
der Anmelderin unmöglich war, irgendwelche bekannten
Stämme von Mikroorganismen zu finden, die alle vorstehend
genannten Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale,
Zellmotilität, Zellwandzusammensetzung usw. mit
dem Stamm gemäß der Erfindung teilen, identifizierte
die Anmelderin diesen Stamm als neue Spezies und bezeichnete
ihn als Nocardia sp. C-14482.
Der Stamm C-14482 wurde beim Institute for Fermentation,
Osaka (IFO), Japan, unter der Zugangsnummer IFO 13725
hinterlegt.
Das für die Kultivierung des C-14482 A₁ bildenden Stamms
verwendete Nährmedium kann ein beliebiges flüssiges
oder festes Medium sein, vorausgesetzt, daß es die vom
Stamm verwertbaren Nährstoffe enthält, jedoch wird ein
flüssiges Nährmedium für die Großherstellung bevorzugt.
Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die
der C-14482 A₁ bildende Stamm assimilieren
kann, anorganische Stoffe, Spurennährstoffe usw.
enthalten. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise
Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin,
Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit und Fette und Öle
(z. B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl usw.) und
n-Paraffine. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise
Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe,
Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsaatmehl,
ausgebrauchte Melasse, Harnstoff, Ammoniumsalze,
(z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat
und Ammoniumacetat) usw. Das Medium kann ferner Salze
von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium usw., Salze von
Eisen, Mangan, Zink, Kobalt, Nickel usw., Salze von Phosphor- und Borsäure und Salze mit
organischen Säuren, z. B. Acetate und Propionate, enthalten.
Ferner können dem Medium verschiedene Aminosäuren
(z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin,
Lysin, Methionin und Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide
und Tripeptide), Vitamine, z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure,
B₁₂ und Vitamin C, Nucleinsäuren (z. B. Purin, Pyrimidin
und die entsprechenden Derivate) usw. zugesetzt werden.
Zur Einstellung des pH-Werts des Mediums können anorganische
oder organische Säuren, Alkali, Puffer o. dgl.
zugesetzt werden. Öle und Fette, oberflächenaktive Mittel
usw. können ebenfalls in geeigneten Mengen zur Schaumverhütung
zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann in stationärer Kultur, Schüttelkultur,
aerober Submerskultur und nach anderen Züchtungsverfahren
durchgeführt werden. Für die Großherstellung
wird natürlich die aerobe Submerskultur bevorzugt.
Die Kultivierungsbedingungen hängen natürlich
vom Zustand und von der Zusammensetzung des Mediums,
vom Stamm, der Kultivierungsmethode und anderen Faktoren
ab, jedoch wird vorzugsweise bei 15 bis 35°C, insbesondere
bei 20 bis 32°C bei einem Anfangs-pH-Wert von
etwa 5,0 bis 9,0, vorzugsweise bei etwa 7,0 gearbeitet.
Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 25° bis
28°C in einer Zwischenstufe der Kultivierung bei einem
Anfangs-pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Die Dauer der Kultivierung
hängt ebenfalls von den vorstehend genannten
Faktoren ab, jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung
durchzuführen, bis der Titer des gewünschten Antibiotikums
maximal wird. Im Falle der Schüttelkultur oder
aeroben Submerskultur im flüssigen Medium liegt die
erforderliche Zeit normalerweise im Bereich von etwa
3 bis 8 Tagen.
Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen
Kulturmedium kann das Antibiotikum C-14482 A₁ vorteilhaft
durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung
von Metaboliten aus Mikrobienkulturen angewendet werden,
isoliert werden. Da das Antibiotikum C-14482 A₁ schwach
basisch ist, kann es beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten
Kombination von Verfahren, bei denen diese
Eigenschaft ausgenutzt wird, isoliert werden. Da dieses
Antibiotikum in erster Linie in der Flüssigphase des
Kulturmediums vorliegt, wird das Kulturmedium zuerst
filtriert, um das Mycel zu entfernen, worauf das Filtrat
neutralisiert oder schwach basisch eingestellt wird.
Dann können organische Lösungsmittel, die mit Wasser
mehr oder weniger unmischbar sind, zur Isolierung des
Antibiotikums verwendet werden. Als organische Lösungsmittel
eignen sich hierzu beispielsweise halogenierte
Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform und Methylenchlorid),
Fettsäureester (z. B. Äthylacetat und Butylacetat),
Ketone (z. B. Methylisobutylketon) und Alkohole (z. B.
Butylalkohol und Isobutylalkohol). Das in dieser Weise
mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittel extrahierte Antibiotikum C-14482 A₁ kann
dann mit Hilfe einer verdünnten wäßrigen Lösung einer
Mineralsäure, einer organischen Säure oder einer sauren
Pufferlösung in eine wäßrige Phase überführt und in
dieser Weise gereinigt werden.
Das in den Zellen vorhandene Antibiotikum C-14482 A₁
kann aus den abfiltrierten Zellen mit einem mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton oder
Methanol, mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer
Mineralsäure oder mit einem Gemisch dieser Lösungsmittel
extrahiert werden.
In gewissen Fällen kann das die Zellen enthaltende
Kulturmedium als solches schwach sauer eingestellt und
mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel,
z. B. Aceton oder Methanol, gerührt, das Gemisch filtriert,
das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt,
das Aceton oder Methanol abdestilliert und die restliche
wäßrige Lösung in der im Zusammenhang mit dem Filtrat
des Kulturmediums beschriebenen Weise behandelt werden.
Nach einem anderen Verfahren kann das Antibiotikum
C-14482 A₁ durch Adsorption des Antibiotikums an einem
Adsorptionsmittel und Elution mit einem geeigneten
Lösungsmittel aus dem Filtrat des Kulturmediums isoliert
werden. Als Adsorptionsmittel eignen sich hierzu beispielsweise
Aktivkohle, nicht-ionische Austauscherharze,
z. B. die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite
XAD-2" und "Diaion HP-10".
Als
Elutionsmittel werden beispielsweise wäßrige Alkohole,
z. B. wäßriges Methanol und wäßriges Butanol, wäßriges
Aceton und wäßrige Medien, die vorher durch
Zusatz von verdünnter Mineralsäure o. dgl. angesäuert
worden sind, bevorzugt, jedoch kann das Antibiotikum
C-14482 A₁ auch mit einem organischen Lösungsmittel,
z. B. Äthylacetat oder Chloroform, eluiert werden.
Es ist auch möglich, das Antibiotikum C-14482 A₁ unter
Ausnutzung seiner basischen Natur durch Adsorption an
einem Kationenaustauscherharz und Desorption mit einem
Elutionsmittel zu isolieren. Als Kationenaustauscherharze
eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung
"Amberlite IRC-50", "Amberlite IR-120",
"Dowex-50" und "CM-Sephadex P-25".
Zur Elution der aktiven Substanz vom Harz können verdünnte
wäßrige Mineralsäurelösungen, Lösungen von
Salzen wie Natriumchlorid und Ammoniumformat, verdünnte
wäßrige Alkalilösungen oder Gemische solcher Lösungen
mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel,
z. B. Methanol oder Aceton, verwendet werden. Durch eine
geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen
Reinigungsverfahren kann das gewünschte antibiotische
Produkt in ziemlich hoher Reinheit erhalten werden. Zur
Gewinnung eines hochreinen Produkts können Adsorptionsmittel
wie Kieselgel, Aluminiumoxyd
und "Sephadex LH-20"
verwendet werden. Als Entwicklerlösungsmittel
eignen sich beispielsweise die normalerweise
für die Abtrennung von organischen Verbindungen verwendeten
Lösungsmittel, z. B. halogenierte Kohlenwasserstoffe
(z. B. Chloroform und Methylenchlorid), Alkohole
(z. B. Methanol und Äthanol), Gemische dieser Lösungsmittel
(z. B. ein Gemisch von Chloroform mit Methanol) und
Gemische von Estern (z. B. Äthylacetat) beispielsweise
mit Alkoholen.
Für die weitere Reinigung eignen sich beispielsweise
Methoden, bei denen die Unterschiede im Verteilungskoeffizienten
ausgenutzt werden, und Verfahren, bei
denen gewisse Adsorptionsmittel verwendet werden.
Zu den Verfahren, bei denen Unterschiede im Verteilungskoeffizienten
ausgenutzt werden, gehören beispielsweise
das Verteilungsverfahren, das auf dem Unterschied der
Koeffizienten zwischen zwei Lösungsmitteln, die nicht
mischbare Phasen bilden, beruht, das Gegenstromverteilungsverfahren
und die Teilungschromatographie unter
Verwendung von Cellulosepulver als Trägermaterial.
Bei der Aufteilung zwischen Chloroform und Wasser bei
pH 8,0 wird das Antibiotikum C-14482 A₁ in die Chloroformschicht
überführt. Bei dem Adsorptionsverfahren,
bei dem beispielsweise Kieselgel als Adsorptionsmittel
verwendet wird, wird das Antibiotikum C-14482 A₁ zuerst
an einer Kieselgelsäure (Merck, Deutschland) adsorbiert
und dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform
und Methanol eluiert. Durch Dünnschichtchromatographie
des erhaltenen rohen Produkts mit einem Lösungsmittelsystem
beispielsweise aus Äthylacetat und Methanol wird
C-14482 A₁ als reine Substanz erhalten.
Das gemäß Beispiel 3 und 4 hergestellte Antibiotikum
C-14482 A₁ hat die folgenden Kennzahlen:
- I) Elementaranalyse (%)
C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14. - II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
- III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
- IV) UV-Absorptionsspektrum (siehe Fig. 1) λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
- V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) (siehe Fig. 2):
Hauptpeaks (cm-1):
3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825 - VI) Löslichkeit:
praktisch unlöslich in Hexan und Petroläther.
Schwerlöslich in Äthanol, Butanol, Äthylacetat, und Wasser.
Löslich in Methanol und Chloroform. - VII) Farbreaktionen:
Negativ: Sakaguchi-Reaktion und Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat wird entfärbt. - VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwach basisch
- IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun.
- X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅)
- XI) Stabilität: zwischen pH 3,0 und pH 8,0: 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil; zwischen pH 3,0 und pH 5,0 selbst bei 80°C 1 Stunde stabil; bei pH 6 leicht instabil, wenn das Antibiotikum 1 Stunde bei 80°C erhitzt wird; bei pH 7 bis 8 ziemlich instabil.
- XII) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film
f):
Chloroform-Methanol (9 : 1):Rf 0,52 Äthylacetat-Methanol (10 : 1):Rf 0,38 - XIII) Bildung von Salzen:
Da C-14482 A₁ eine basische Substanz ist, bildet es wasserlösliche Salze mit Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Weinsäure, Glucuronsäure usw. und schwerlösliche Salze mit Säuren wie Picrinsäure und Picrolonsäure.
Als Breitspektrum-Antibiotika, deren Kristalle eine
rote bis rötlich-purpurne Farbe aufweisen, sind Mitomycin
(T. Hata und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics,
Serie A, 9 (1956) 141) und Naphthyridinomycin
(D. Kluepfel und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics
28 (1975) 497) zu nennen. Diese beiden Antibiotika
unterscheiden sich jedoch vom erfindungsgemäßen Antibiotikum
C-14482 A₁ deutlich in den Absorptionen im
Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich und in der
Elementaranalyse (insbesondere im Stickstoffgehalt).
Da kein bekanntes Antibiotikum die vorstehend genannten
chemischen Eigenschaften (insbesondere die Absorptionen
im Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich des Spektrums)
und die später beschriebenen biologischen Eigenschaften
mit diesem Antibiotikum teilt, ist das Antibiotikum
C-14482 A₁ als neue Substanz anzusehen.
Trypticase-Sojaagar-Medium (nachstehend als TSA bezeichnet)
mit 3% Glycerin ergänztes TSA und mit 1% Glucose ergänztes
TSA wurden verwendet. Die Mindesthemmkonzentrationen
von C-14482 A₁ gegen Bakterien, säurefeste
Bakterien, Pilze und Hefen wurden nach der Agarverdünnungsmethode
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4
genannt.
Plasmid R 100, R 100-1 oder F wurde auf Escherichia
coli CRT 46, einen Mutanten mit einem wärmeempfindlichen
Chromosomen-Gen dna A, zur Auslösung der DNA-
Replikation (Hirota und Mitarbeiter, Journal of Molecular
Biology 35 (1968) 175) und seine in vitro gegen
Nalidixinsäure resistenten Mutanten übertragen, und die
hitzebeständigen Revertanten (Hfr-Stämme) TE 33, TE 82
und TE 120 wurden nach der Methode von Nishimura und
Mitarbeitern (Journal of Molecular Biology 55 (1971)
441) gewonnen. Die wachstumshemmende Wirkung von Antibiotikum
C-14482 A₁ wurde gegen diese Stämme von
Escherichia coli nach der Kulturmedium-Verdünnungsmethode
von Yoshikawa und Mitarbeitern (Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 5 (1974) 362) bestimmt. Die
spontanen hitzebeständigen Revertanten TE 144 und
TE 146 wurden als Kontrollen verwendet. Das Wachstum
wurde nach der Extinktion bei 600 nm bewertet. Das
Wachstumsverhältnis wurde aus dem Verhältnis der Extinktion
für die behandelte Gruppe zur Extinktion der unbehandelten
Gruppe berechnet.
Bei einem Test an Mäusen (CF Nr. 1, männlich, 4 Wochen
alt) zur Bestimmung der akuten Toxizität wurde eine
Lösung von C-14482 A₁ in physiologischer Kochsalzlösung
intravenös verabreicht. Die geschätzte LD₅₀ dieses
Antibiotikums betrug etwa 5 mg/kg.
Wie Tabelle 4 zeigt, hat das Antibiotikum C-14482 A₁
eine starke hemmende Wirkung gegen gramnegative, grampositive
und säurefeste Bakterien. Das Antibiotikum
C-14482 A₁ ist daher wertvoll als keimtötendes Mittel
und Desinfektionsmittel.
Ferner zeigen die Ergebnisse in Tabelle 5, daß dieses
Antibiotikum wertvoll als Mittel zur Eliminierung von
R-Plasmiden wie ein anscheinend starker Inhibitor der
Nucleinsäuresynthese ist. Dies läßt darauf schließen,
daß das Produkt gemäß der Erfindung als tumorhemmendes
Mittel wertvoll ist.
Das Antibiotikum C-14482 A₁ kann als keimtötendes Mittel,
Desinfektionsmittel oder Arzneimittel zur äußeren Anwendung,
beispielsweise zur Desinfektion von Geschirr,
chirurgischen Instrumenten, Vogelkäfigen, Händen usw.
verwendet werden. Bei Verwendung des Antibiotikums
als keimtötendes Mittel, Bakterizid oder Desinfektionsmittel
gegen Bakterien, beispielsweise die in Tabelle 4
genannten Bakterien, kann es als flüssige Zubereitung,
die beispielsweise durch Auflösen von 10 mg Antibiotikum
in 1000 bis 2000 ml Wasser hergestellt wird, angewendet
werden. Für die Verwendung dieses Antibiotikums als
Arzneimittel zur äußeren Anwendung kann es zu einer
Salbe beispielsweise durch gleichmäßiges Vermischen
von 0,5 mg C-14482 A₁ mit 10 g weißem Petrolatum formuliert
werden.
Beispielsweise kann das Antibiotikum in Form einer
Salbe, die 0,5 mg C-14482 A₁ pro 10 g weißes Petrolatum
enthält, zur Verhinderung oder Behandlung der Eiterung
von Wunden durch Staphylococcus aureus oder durch Mischinfektion
mit den in Tabelle 4 genannten Mikroorganismen
an der Hand örtlich angewendet werden, indem 0,02
bis 0,2 g Salbe viermal täglich auf die Wunde aufgetragen
wird.
Ferner kann das Antibiotikum beispielsweise in Form
einer Flüssigkeit, die 10 mg C-14482 A₁ in 1000 bis
2000 ml Wasser enthält, zur Desinfektion verwendet werden,
indem Geschirr, chirurgische Instrumente, Vogelkäfige
oder die Hände etwa 10 Minuten in die Flüssigkeit
getaucht werden.
Bei Verabreichung an Mäuse, die mit Leukämie P388 infiziert
worden sind, verhindert C-14482 A₁ die Vermehrung
der Tumorzellen, wobei es eine starke lebensverlängernde
Wirkung zeigt. C-14482 A₁ ist daher außerdem
wertvoll als Antitumormittel für die Behandlung von
Tumorzellen bei Warmblütern (z. B. Maus, Ratte, Mensch).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile
als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. "Teile"
verhalten sich zu "Raumteilen" wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Den Prozentsätzen liegt "Gew./Vol." zu Grunde,
falls nicht anders angegeben. Den in den Beispielen
genannten Prozentsätzen von wäßrigem Aceton und wäßrigem
Methanol liegt "Volumen/Volumen" zu Grunde.
Eine Kultur des das Antibiotikum C-14482 A₁ bildenden
Stammes Nocardia sp. C-14482 = IFO 13725
im Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Schrägröhrchen
wurde zum Beimpfen eines Erlenmeyerkolbens
verwendet, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen
hatte und 40 Raumteile eines Impfkulturmediums (pH 7,0)
enthielt, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1%
Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 0,5% Pepton, 0,3%
NaCl und 0,5% CaCO₃ bestand, worauf 48 Stunden bei
28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet
wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten.
Ein Teil von 0,5 Raumteilen dieser Impfkultur wurde in
einen Erlenmeyerkolben überführt, der ein Fassungsvermögen
von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines
Nährmediums (pH 7,0) aus 5% Dextrin, 3% Sojabohnenmehl,
0,1% Pepton und 0,5% CaCO₃ enthielt, worauf 90 Stunden
auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet
wurde. Dieses Kulturmedium wurde nach der Agarverdünnungsmethode
gegen Staphylococcus aureus FDA 209 P
und Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmikroorganismen
unter Verwendung von C-14482 A₁ als Standard getestet.
Hierbei wurde ein Titer von 50 µg/ml gefunden. Das Antibiotikum
C-14482 wird selbstverständlich noch isoliert.
10 Raumteile der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur
wurden in einen Sakaguchi-Kolben überführt, der
ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatte und
500 Raumteile eines Impfkulturmediums ähnlich dem gemäß
Beispiel 1 hergestellten Medium enthielt. Das geimpfte
Medium wurde 48 Stunden bei 28°C kultiviert.
1000 Raumteile der Kultur wurden in 100 000 Raumteile
des vorstehend genannten Kulturmediums in einem Fermentationstank
geimpft, der ein Fassungsvermögen von
200 000 Raumteilen hatte. Das Medium wurde 48 Stunden
bei 28°C bebrütet, wobei mit einer Rate von 100 000
Raumteilen/Minute belüftet und mit 200 UpM gerührt
wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten. Diese
Impfkultur wurde in einen 2 000 000 Raumteile fassenden
Tank aus nichtrostendem Stahl überführt, der 1 000 000
Raumteile des in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsmediums
enthielt. Die verwendete Größe des Inoculums
betrug 10%. Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei 28°C
bei einer Belüftungsrate von 1 000 000 Raumteilen/Minute,
einer Rührergeschwindigkeit von 150 UpM (1/3 DT)
und einem Innendruck von 0,981 bar durchgeführt. Das
erhaltene Kulturmedium hatte einen Titer von 20 µg/ml,
bestimmt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.
Das vorstehend beschriebene Kulturmedium wurde auf
pH 5,0 eingestellt und mit der Filterpresse unter Verwendung
von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels
"Hyflo-Supercel" filtriert.
Das Filtrat (880 000 Raumteile) wurde auf pH 8,0 eingestellt
und durch eine Säule geleitet, die 100 000
Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2"
enthielt. Die Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser
gewaschen, worauf mit 250 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem
Aceton eluiert wurde.
Das Eluat wurde unter vermindertem Druck destilliert,
um das Aceton zu entfernen. Die restliche wäßrige
Lösung wurde auf pH 6 eingestellt und an einer 60 000
Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IRC-50"
(H-Form) enthaltenden Säule adsorbiert. Die Säule wurde
mit 180 000 Raumteilen Wasser gewaschen und dann mit
180 000 Raumteilen 0,2 n-Salzsäure eluiert. Das Eluat
wurde auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem
Druck eingeengt. Das Konzentrat (30 000 Raumteile) wurde
auf pH 6,0 eingestellt und an einer 15 000 Raumteile
des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthaltenden
Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 45 000 Raumteilen
Wasser gewaschen, worauf mit 60 000 Raumteilen
50%igem wäßrigem Aceton eluiert wurde. Das Eluat wurde
auf pH 5,6 eingestellt und unter vermindertem Druck
auf etwa 1000 Raumteile eingeengt.
Dem Konzentrat wurden 9000 Raumteile Aceton zugesetzt,
wobei 124 Teile rohes Produkt I erhalten wurden.
Die Mutterflüssigkeit wurde weiter destilliert, um das
Aceton zu entfernen. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet,
wobei 36 Teile rohes Produkt II erhalten wurden.
In 450 Raumteilen Wasser wurden 4,5 Teile des rohen
Produkts II gelöst. Die Lösung wurde mit verdünntem
wäßrigem NH₄OH auf pH 8 eingestellt und mehrmals
(vier- bis fünfmal) mit 225 Raumteilen CHCl₃ extrahiert.
Die CHCl₃-Extrakte wurden vereinigt und die
aktive Substanz unter Verwendung von 300 Raumteilen
1/200 n-Salzsäure in eine wäßrige Schicht überführt.
Die weinfarbige wäßrige Schicht wurde auf pH 5,5 bis
6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt,
auf pH 6,0 eingestellt und auf eine Säule von 170 Raumteilen
des Nicht-Ionenaustauscherharzes "Diaion HP-10"
aufgegeben.
Die Säule wurde mit 500 Raumteilen Wasser und
700 Raumteilen 30%igem wäßrigem Methanol in dieser
Reihenfolge gewaschen und dann mit 700 Raumteilen
80%igem wäßrigem Methanol eluiert, wobei eine weinfarbige
antibiotische Substanz erhalten wurde.
Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem
Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei
wurden 0,185 Teile eines dunkelroten Pulvers erhalten.
0,155 Teile dieses Produkts wurden der Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel (HF₂₅₄)
unterworfen (Lösungsmittel CHCl₃-MeOH = 10 : 1). Fraktionen
mit einem Rf-Wert von 0,45 wurden aufgefangen
und mit Methanol extrahiert, wobei 0,024 Teile einer
Fraktion A₁ erhalten wurden.
0,02 Teile dieser Fraktion A₁ wurden durch Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel
(HF₂₅₄) mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat
und Methanol (10 : 1) gereinigt, wobei eine gereinigte
Fraktion A₁ (0,009 Teile) durch Extraktion mit Methanol
aus der A₁ entsprechenden Bande (Rf 0,33) erhalten
wurde. Der E-Wert dieses Antibiotikums C-14482 A₁
in Methanol betrug 41,3 bei 498 nm.
850 000 Raumteile eines Filtrats eines Kulturmediums,
das nach einem Verfahren ähnlich dem in Beispiel 2 beschriebenen
hergestellt worden war, wurden durch eine
Säule von 85 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes
"Amberlite XAD-2" geleitet. Die Säule wurde mit Wasser
(255 000 Raumteile) gewaschen und mit 210 000 Raumteilen
50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde
zur Entfernung des Acetons destilliert. Die restliche
wäßrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und an
einer Säule von 51 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes
"Amberlite IRC-50" (H-Form) adsorbiert. Die
Säule wurde mit 150 000 Raumteilen Wasser gewaschen und
dann mit 150 000 Raumteilen 0,2 n-HCl eluiert. Das Eluat
wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem
Druck auf etwa 50 000 Raumteile eingeengt und an
einer Säule von 12 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes
"Amberlite XAD-2" adsorbiert. Die Säule wurde
mit Wasser gewaschen und mit 18 000 Raumteilen 50%igem
wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf pH 5,5
bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt
und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 118,3 Teile rohes
C-14482 A₁ in Pulverform erhalten.
In 9000 Raumteilen Wasser wurden 90 Teile des erhaltenen
rohen pulverförmigen Produkts gelöst. Die Lösung wurde
mit verdünntem wäßrigem NH₄OH auf pH 8,0 eingestellt
und dreimal mit 3000 Raumteilen n-Butanol extrahiert.
Die Extrakte wurden vereinigt und mit 3000 Raumteilen
1/200 n-HCl zweimal in wäßrige Schichten überführt. Die
wäßrigen Schichten wurden zusammengegossen und auf
pH 6 eingestellt. Das n-Butanol wurde entfernt und die
restliche wäßrige Lösung (pH 6) auf eine Säule von
4500 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-10"
aufgegeben. Die Säule wurde
mit 13 500 Raumteilen Wasser und 9000 Raumteilen 30%igem
wäßrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und
mit 13 500 Raumteilen 80%igem wäßrigem Methanol eluiert,
wobei 3,45 Teile einer A₁-reichen Fraktion (F-1) erhalten
wurden.
3,0 Teile der A₁-reichen Fraktion (F-1) wurden an einer
Säule von 150 Teilen Kieselgel
adsorbiert. Die Elution wurde mit Lösungsmittelgemischen
aus Chloroform und Methanol im Verhältnis von
50 : 1 (1300 Raumteile), 25 : 1 (1000 Raumteile) und 10 : 1
(1000 Raumteile) in dieser Reihenfolge vorgenommen.
Abschließend wurde mit 1000 Raumteilen Methanol eluiert.
Die Elution mit dem Chloroform-Methanol-Gemisch (25 : 1)
ergab 0,368 Teile einer A₁-reichen Fraktion. 0,340 Teile
der A₁-reichen Fraktion wurden durch Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel (HF₂₅₄) mit einem Lösungsmittelgemisch
aus Chloroform und Methanol (9 : 1) gereinigt,
wobei 0,109 Teile C-14482 A₁ als gereinigtes
dunkelrotes kristallines Pulver erhalten wurden.
Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei 60°C
im Vakuum):
C 59,18; H 5,70; N 17,14.
g 498 nm (E 48,3)
C 59,18; H 5,70; N 17,14.
g 498 nm (E 48,3)
900 000 Raumteile eines auf die in Beispiel 2 beschriebene
Weise hergestellten Kulturmediums wurden mit
4 n-H₂SO₄ auf pH 4,0 eingestellt und dann mit 800 000
Raumteilen Aceton versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden
gerührt. Nach Zusatz von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels
"Hyflo-Supercel"
wurde das Gemisch mit der Filterpresse filtriert. Das
Filtrat wurde auf pH 5,5 eingestellt und unter vermindertem
Druck auf 800 000 Raumteile eingeengt. Das Aceton
wurde entfernt und die restliche wäßrige Lösung auf
pH 6,0 eingestellt und durch eine Säule von 90 000 Raumteilen
des Harzes "Diaion HP-10" geleitet. Die Säule
wurde mit 270 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit
250 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert.
Das Aceton wurde entfernt und die restliche wäßrige
Lösung (100 000 Raumteile) auf pH 8,0 eingestellt und
dreimal mit 30 000 Raumteilen Isobutanol extrahiert.
Die Extrakte wurden zusammengegossen und die aktive
Substanz zweimal mit 60 000 Raumteilen 1/200 n-HCl in
eine wäßrige Schicht überführt. Das in der wäßrigen
Schicht enthaltene Isobutanol wurde bei pH 5 bis 6
unter vermindertem Druck abdestilliert. Die restliche
wäßrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf
eine Säule des Harzes "Diaion HP-10" (45 000 Raumteile)
aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit
135 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das
Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem
Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden
82 Teile eines an C-14482 A₁ reichen Pulvers (f-1)
erhalten.
In 1,5×10³ Raumteilen Wasser wurden 15 Teile dieses
Pulvers (f-1) gelöst. Die aktive Substanz wurde viermal
mit 750 Raumteilen CHCl₃ bei pH 8,0 (mit verdünntem
NH₄OH eingestellt) extrahiert und zweimal in 750 Raumteile
1/200 n-HCl überführt. Die wäßrigen Schichten
wurden vereinigt und bei pH 6 unter vermindertem Druck
eingeengt. Das Konzentrat wurde auf eine Säule von
400 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-10" aufgegeben.
Die Säule wurde mit 1200 Raumteilen Wasser und 1200
Raumteilen 30%igem wäßrigem Methanol in dieser Reihenfolge
gewaschen. Die Elution wurde mit 1200 Raumteilen
80%igem wäßrigem Methanol durchgeführt. Das Eluat
wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck
eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 0,393
Teile eines dunklen rötlichbraunen Pulvers, das reich
an A₁ war, erhalten. 0,375 Teile dieses pulverförmigen
Produkts wurden durch Säulenchromatographie an Kieselgel
und Dünnschichtchromatographie auf die in Beispiel 2
und 3 beschriebene Weise gereinigt. Hierbei wurden
0,02 Teile C-14482 A₁ in Form von gereinigten dunkelroten
Kristallen erhalten.
Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei
60°C im Vakuum):
C 58,02; H 5,84; N 16,32
λ 498 nm (E 44,2)
C 58,02; H 5,84; N 16,32
λ 498 nm (E 44,2)
Claims (2)
1. Antibiotikum C-14482 A₁ mit folgenden Merkmalen:
- I) Elementaranalyse (%)
C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14. - II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
- III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
- IV) UV-Absorptionsspektrum: λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
- V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr):
Hauptpeaks (cm-1):
3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825 - VI) Löslichkeit:
Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther.
Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Wasser.
Löslich: Methanol, Chloroform. - VII) Farbreaktionen:
Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt. - VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwachbasisch.
- IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun
- X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅).
2. Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁,
dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardia sp. IFO 13725
in einem Nährmedium kultiviert, hierdurch das Antibiotikum
C-14482 A₁ im Kulturmedium bildet und anreichert
und das schwach basische Antibiotikum durch
Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von solchen
Metaboliten von Mikroorganismenkulturen angewendet werden,
isoliert.
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Legal Events
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: SCHOENWALD, K., DR.-ING. FUES, J., DIPL.-CHEM. DR. |
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D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
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