DE2833689C2

DE2833689C2 -

Info

Publication number: DE2833689C2
Application number: DE2833689A
Authority: DE
Inventors: Eiji Takarazuka Hyogo Jp Higashide; Seiichi Kyoto Jp Tanida; Masayuki Suita Osaka Jp Muroi; Mitsuko Takatsuki Osaka Jp Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-08-04
Filing date: 1978-08-01
Publication date: 1987-08-20
Also published as: GB2001954A; NL7808129A; FR2399436B1; DE2833689A1; GB2001954B; ES472318A1; US4373028A; JPS5948992B2; IT1109118B; US4298600A; FR2399436A1; IT7868851A0; JPS5427501A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung C-14482 A₁ (nachstehend zuweilen kurz als C-14482 A₁ bezeichnet) und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Von der Anmelderin wurden Proben aus der Natur einschließlich einer großen Zahl verschiedener Bodenproben entnommen, und die von diesen Proben isolierten Mikroorganismen wurden einer Auswahluntersuchung bezüglich der von ihnen gebildeten Antibiotika unterworfen. Die Untersuchungsarbeit führte zu der Feststellung, daß ein bestimmter Mikroorganismus ein neues Antibiotikum zu bilden vermag, daß dieser Mikroorganismus zur Gattung Nocardia gehört und daß durch Kultivieren dieses Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium unter geregelten Fermentationsbedingungen dieses Antibiotikum im Kulturmedium angereichert wird.

Die Erfindung ist demgemäß auf die folgenden Gegenstände gerichtet:

1. Das Antibiotikum C-14482 A₁ mit den folgenden Kennzahlen:
- I) Elementaranalyse (%) C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14.
- II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
- III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
- IV) UV-Absorptionsspektrum: λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
- V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr):
  Hauptpeaks (cm^-1):
  3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825
- VI) Löslichkeit:
  Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther.
  Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Wasser.
  Löslich: Methanol, Chloroform.
- VII) Farbreaktionen:
  Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt.
- VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwachbasisch.
- IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun
- X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅).
2. Die Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁ nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Nocardia sp. IFO 13725 in einem Nährmedium kultiviert, hierdurch das Antibiotikum im Kulturmedium bildet und anreichert und das schwach basische Antibiotikum durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von solchen Metaboliten von Mikroorganismen angewendet werden, isoliert.

In der vorliegenden Beschreibung wird Nocardia sp. IFO 13725 auch als C-14482 A₁-bildender Stamm oder Stamm C-14482 bezeichnet.

Die mikrobiologischen Merkmale des Stamms C-14482 wurden nach Methoden untersucht, die den von Schirling und Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16 (1966) 313-340) beschriebenen Methoden analog sind. Die Kultivierung des Mikroorganismus während einer Zeit von 21 Tagen bei 28°C hatte die folgenden Ergebnisse:

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel ist farblos bis blaßgelb oder orangegelb und entwickelt sich gut mit Verzweigungen sowohl auf Agar als auch in flüssigen Medien.

Das vegetative Mycel hat zum größten Teil einen Durchmesser von 0,5 bis 1,2 µm und teilt sich in den späten Phasen der Kultivierung in Fragmente, die stäbchenförmigen Bakterien oder langgestreckten stäbchenförmigen Bakterien oder verzweigten Hyphen ähneln. Dieser Stamm zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien. Während das Luftmycel sich auf dem vegetativen Mycel gut entwickelt, zeigt das erstere in vielen Fällen ein Aussehen, als wäre es auf einer großen Zahl von coremia-artigen Körpern (50 bis 180 µm×400 bis 1500 µm) gewachsen. Ein großer Teil der Lufthyphen ist gewunden oder gerade, wobei in wenigen Fällen eine lose spiralförmige Gestalt oder Verzweigung festzustellen ist. Die Untersuchung gealterter Kulturen unter dem Mikroskop zeigt, daß die Sporen nur in wenigen Fällen in Ketten auftreten und nur wenig sog. Konidien oder Sporen vorhanden sind. Die Untersuchung von Zellen, die von der Oberfläche einer solchen Kultur entnommen wurden, unter dem Mikroskop zeigt die Anwesenheit vieler langgestreckter elliptischer Zellen (0,5-1,2 µm×4,8-6,8 µm) und elliptischer Zellen (0,8-1,2 µm×1,5-4 µm), die wie fragmentierte Zellen oder Arthrosporen aussahen und deren Oberflächen bei der Untersuchung durch Elektronenmikroskopie glatt waren.

Das Luftmycel ist im allgemeinen spärlich. Zwar wird ziemlich gutes Wachstum auf vielen Medien während einer Bebrütung für 3 bis 7 Tage festgestellt, jedoch verschwindet es zuweilen, wenn die Kultivierung 7 bis 10 Tage durchgeführt wird.

Bei der Kultivierung in flüssigen Medien zeigt der Mikroorganismus Motilität in einer Wachstumsphase, wenn das Mycel Polymorphismus, d. h. die Form von Stäbchen, verzweigten Zellen oder langgestreckten Stäbchen, die entweder unabhängig als solche, in Ketten oder verzweigt vorliegen, zeigt. Die Untersuchung im Elektronenmikroskop ergibt eine große Zahl von langgestreckten Geißeln rings um die Zellen.

2) Bestandteile der Zellen

Der Stamm wurde in modifiziertem ISP-Medium Nr. 1 66 bis 90 Stunden in der Schüttelkultur bei 28°C kultiviert. In der stationären Phase guten Wachstums wurden die Zellen abgetrennt und gespült. Sie wurden nach der Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 12 (1964) 421) und nach der Methode von M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory und Clinical Medicin 71 (1968) 934 auf Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Es wurde festgestellt, daß die erstere in der meso-Form vorlag, während hinsichtlich der letzteren örtlich begrenzte Stellen, die Galactose und Arabinose entsprachen, festgestellt wurden. Nach der Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 17 (1965) 236) wurden Zellwände isoliert und auf Diaminopimelinsäure, Zucker und Aminosäuren analysiert. Die Diaminopimelinsäure wurde in ihrer meso-Form festgestellt. Während jedoch eine große Menge Galactose als Zuckerbestandteil nachgewiesen wurde, wurde Arabinose nicht nachgewiesen. Als Aminosäuren wurden Glutaminsäure und Alanin eindeutig nachgewiesen während Lysin und Glycin nur in Spuren gefunden werden konnten.

3) Kulturmerkmale auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigt stets verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Kultur farblos bis blaßgelb und in den späteren Phasen blaßgelblichbraun bis gelbbraun ist. Der Mikroorganismus bildet in den meisten taxonomischen Medien keine löslichen Pigmente, jedoch in einigen wenigen Medien ein schwachbraunes Pigment. Das Luftmycel ist mehlähnlich, im allgemeinen mäßig und weiß bis gelb oder blaßgelblichbraun. Auf vielen Medien verschwindet das Luftmycel bei längerer Kultivierung (etwa 2 Wochen oder länger), wobei die Oberfläche des vegetativen Mycels glänzend zu werden beginnt. Die Kulturmerkmale dieses speziellen Stammes sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Wachstum (W):schlecht, dünn, farblos Luftmycel (LM):spärlich, weiß Lösliches Pigment (LP):nicht vorhanden

B) Glucosenitratagar
W:schlecht, dünn, farblos LM:sehr spärlich, weiß LP:nicht vorhanden
C) Glycerinnitratagar
W:mäßig, farblos bis Lt Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ea oder 2 ga)*) oder Brite Melon Yellow (3 ia)*); Bildung von coremiaartigen Körpern. LM:sehr spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden.
D) Glucose-Asparaginagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:spärlich, Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden
E) Glycerin-Asparaginagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:mäßig, weiß bis Lt Wheat (2 ea)*) LP:nicht vorhanden
F) Nähragar
W:mäßig, farblos bis Lt Ivory (2 ca)*) oder Melon Yellow (3 ga)*) LM:nicht vorhanden LP:nicht vorhanden
G) Calciummalatagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Marigold (3 pa)*); Bildung von coremia- artigen Körpern LM:mäßig, weiß LP:nicht vorhanden
H) Hefeextrakt-Malzextraktagar
W:üppig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern. LM:mäßig, weiß bis Pearl Pink (3 ca)*) oder Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:blaßgelblichbraun
I) Hafermehl-Agar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Lt Ivory (2 ca)*) LM:mäßig, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) oder Pearl Pink (3 ca)*) LP:nicht vorhanden oder blaßgelblichbraun
J) Stärkeagar
W:mäßig, farblos bis Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ga oder 2 ga)*) LM:spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden
K) Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar
W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*) LM:nicht vorhanden oder spärlich, weiß LP:blaßgelblichbraun
L) Tyrosin-Agar
W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern LM:spärlich, Pearl Pink (3 ca)*) oder Brite Maize (3 la)*) LP:hellgelblichbraun (mit einem Hauch von Purpur)
*) Die Farbbezeichnungen entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America 1958).

4) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stamms sind in Tabelle 2 genannt. Temperaturbereich für das Wachstum: 12° bis 38°C. Der Temperaturbereich, in dem Wachstum des Luftmycels auf Agar (ISP Nr. 2) stattfindet, ist 20 bis 35°C.
Wachstumstemperaturbereich12 bis 38°C Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels20 bis 35°C Verflüssigung von Gelatinesehr schwach Hydrolyse von Stärkepositiv Reduktion von Nitratenpositiv Peptonisierung von Milchpositiv Gerinnung von Milchnegativ Zersetzung von Caseinpositiv Bildung von schwarzen Pigmenten:
(Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar)negativ (Tyrosinagar)negativ Zersetzung von Tyrosinpositiv Zersetzung von Xanthinnegativ Zersetzung von Hypoxanthinnegativ Verträglichkeit mit Lysozympositiv Verträglichkeit mit Natriumchlorid2%

5) Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

Die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen wurde nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal of Bacteriology 56 (1948) 107) mit einem Basalmedium der gleichen Zusammensetzung plus 0,1% Hefeextrakt (Difco Co.) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm C-14482

6) Andere Merkmale

Die Zellen wurden auf die unter (2) "Bestandteile der Zellen" beschriebene Weise isoliert. Nach einem Verfahren analog dem Verfahren von J. Murmar und Mitarbeitern (Journal of Molecular Biology 3 (1961) 208) wurde DNA hergestellt. Der G-C-Gehalt (Guanin-Cytosin) des DNA wurde mit etwa 71 Mol.-% ermittelt.

Die Gram′ Färbung des vegetativen Mycels dieses Stamms ergab eine positive Reaktion.

Die vorstehenden Merkmale des Stamms C-14482 wurden mit den Beschreibungen in "The Actinomycetes", Band 2 von S.A. Waksman (The Williams and Wilkins Co. 1961), R.E. Buchanan und N.E. Gibbons in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage 1974 und anderen Literaturstellen verglichen.

Die vorstehend genannten Beobachtungen, daß 1) der Stamm in den späteren Phasen der Kultivierung in die Form von Stäbchen oder langgestreckten Stäbchen oder deren verzweigte Zellen zerfällt, 2) wenig wohldefinierte Konidien oder Sporen bildet, 3) die Oberflächen seiner Kolonien auf Agar lederartig und in vielen Fällen glänzend wie Bakterienkolonien sind und 4) der G-C-Gehalt des Mycels etwa 71 Mol.-% beträgt, lassen zusammen mit den anderen Merkmalen darauf schließen, daß der Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehört. Da es jedoch der Anmelderin unmöglich war, irgendwelche bekannten Stämme von Mikroorganismen zu finden, die alle vorstehend genannten Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale, Zellmotilität, Zellwandzusammensetzung usw. mit dem Stamm gemäß der Erfindung teilen, identifizierte die Anmelderin diesen Stamm als neue Spezies und bezeichnete ihn als Nocardia sp. C-14482.

Der Stamm C-14482 wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, unter der Zugangsnummer IFO 13725 hinterlegt.

Das für die Kultivierung des C-14482 A₁ bildenden Stamms verwendete Nährmedium kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, daß es die vom Stamm verwertbaren Nährstoffe enthält, jedoch wird ein flüssiges Nährmedium für die Großherstellung bevorzugt. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die der C-14482 A₁ bildende Stamm assimilieren kann, anorganische Stoffe, Spurennährstoffe usw. enthalten. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit und Fette und Öle (z. B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl usw.) und n-Paraffine. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsaatmehl, ausgebrauchte Melasse, Harnstoff, Ammoniumsalze, (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat) usw. Das Medium kann ferner Salze von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium usw., Salze von Eisen, Mangan, Zink, Kobalt, Nickel usw., Salze von Phosphor- und Borsäure und Salze mit organischen Säuren, z. B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner können dem Medium verschiedene Aminosäuren (z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Methionin und Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide und Tripeptide), Vitamine, z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂ und Vitamin C, Nucleinsäuren (z. B. Purin, Pyrimidin und die entsprechenden Derivate) usw. zugesetzt werden. Zur Einstellung des pH-Werts des Mediums können anorganische oder organische Säuren, Alkali, Puffer o. dgl. zugesetzt werden. Öle und Fette, oberflächenaktive Mittel usw. können ebenfalls in geeigneten Mengen zur Schaumverhütung zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann in stationärer Kultur, Schüttelkultur, aerober Submerskultur und nach anderen Züchtungsverfahren durchgeführt werden. Für die Großherstellung wird natürlich die aerobe Submerskultur bevorzugt. Die Kultivierungsbedingungen hängen natürlich vom Zustand und von der Zusammensetzung des Mediums, vom Stamm, der Kultivierungsmethode und anderen Faktoren ab, jedoch wird vorzugsweise bei 15 bis 35°C, insbesondere bei 20 bis 32°C bei einem Anfangs-pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0, vorzugsweise bei etwa 7,0 gearbeitet. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 25° bis 28°C in einer Zwischenstufe der Kultivierung bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Die Dauer der Kultivierung hängt ebenfalls von den vorstehend genannten Faktoren ab, jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung durchzuführen, bis der Titer des gewünschten Antibiotikums maximal wird. Im Falle der Schüttelkultur oder aeroben Submerskultur im flüssigen Medium liegt die erforderliche Zeit normalerweise im Bereich von etwa 3 bis 8 Tagen.

Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmedium kann das Antibiotikum C-14482 A₁ vorteilhaft durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von Metaboliten aus Mikrobienkulturen angewendet werden, isoliert werden. Da das Antibiotikum C-14482 A₁ schwach basisch ist, kann es beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten Kombination von Verfahren, bei denen diese Eigenschaft ausgenutzt wird, isoliert werden. Da dieses Antibiotikum in erster Linie in der Flüssigphase des Kulturmediums vorliegt, wird das Kulturmedium zuerst filtriert, um das Mycel zu entfernen, worauf das Filtrat neutralisiert oder schwach basisch eingestellt wird. Dann können organische Lösungsmittel, die mit Wasser mehr oder weniger unmischbar sind, zur Isolierung des Antibiotikums verwendet werden. Als organische Lösungsmittel eignen sich hierzu beispielsweise halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform und Methylenchlorid), Fettsäureester (z. B. Äthylacetat und Butylacetat), Ketone (z. B. Methylisobutylketon) und Alkohole (z. B. Butylalkohol und Isobutylalkohol). Das in dieser Weise mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahierte Antibiotikum C-14482 A₁ kann dann mit Hilfe einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Mineralsäure, einer organischen Säure oder einer sauren Pufferlösung in eine wäßrige Phase überführt und in dieser Weise gereinigt werden.

Das in den Zellen vorhandene Antibiotikum C-14482 A₁ kann aus den abfiltrierten Zellen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Methanol, mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Mineralsäure oder mit einem Gemisch dieser Lösungsmittel extrahiert werden.

In gewissen Fällen kann das die Zellen enthaltende Kulturmedium als solches schwach sauer eingestellt und mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Methanol, gerührt, das Gemisch filtriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, das Aceton oder Methanol abdestilliert und die restliche wäßrige Lösung in der im Zusammenhang mit dem Filtrat des Kulturmediums beschriebenen Weise behandelt werden.

Nach einem anderen Verfahren kann das Antibiotikum C-14482 A₁ durch Adsorption des Antibiotikums an einem Adsorptionsmittel und Elution mit einem geeigneten Lösungsmittel aus dem Filtrat des Kulturmediums isoliert werden. Als Adsorptionsmittel eignen sich hierzu beispielsweise Aktivkohle, nicht-ionische Austauscherharze, z. B. die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite XAD-2" und "Diaion HP-10".

Als Elutionsmittel werden beispielsweise wäßrige Alkohole, z. B. wäßriges Methanol und wäßriges Butanol, wäßriges Aceton und wäßrige Medien, die vorher durch Zusatz von verdünnter Mineralsäure o. dgl. angesäuert worden sind, bevorzugt, jedoch kann das Antibiotikum C-14482 A₁ auch mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat oder Chloroform, eluiert werden.

Es ist auch möglich, das Antibiotikum C-14482 A₁ unter Ausnutzung seiner basischen Natur durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz und Desorption mit einem Elutionsmittel zu isolieren. Als Kationenaustauscherharze eignen sich beispielsweise die Produkte der Handelsbezeichnung "Amberlite IRC-50", "Amberlite IR-120", "Dowex-50" und "CM-Sephadex P-25".

Zur Elution der aktiven Substanz vom Harz können verdünnte wäßrige Mineralsäurelösungen, Lösungen von Salzen wie Natriumchlorid und Ammoniumformat, verdünnte wäßrige Alkalilösungen oder Gemische solcher Lösungen mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z. B. Methanol oder Aceton, verwendet werden. Durch eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren kann das gewünschte antibiotische Produkt in ziemlich hoher Reinheit erhalten werden. Zur Gewinnung eines hochreinen Produkts können Adsorptionsmittel wie Kieselgel, Aluminiumoxyd und "Sephadex LH-20" verwendet werden. Als Entwicklerlösungsmittel eignen sich beispielsweise die normalerweise für die Abtrennung von organischen Verbindungen verwendeten Lösungsmittel, z. B. halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform und Methylenchlorid), Alkohole (z. B. Methanol und Äthanol), Gemische dieser Lösungsmittel (z. B. ein Gemisch von Chloroform mit Methanol) und Gemische von Estern (z. B. Äthylacetat) beispielsweise mit Alkoholen.

Für die weitere Reinigung eignen sich beispielsweise Methoden, bei denen die Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, und Verfahren, bei denen gewisse Adsorptionsmittel verwendet werden.

Zu den Verfahren, bei denen Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, gehören beispielsweise das Verteilungsverfahren, das auf dem Unterschied der Koeffizienten zwischen zwei Lösungsmitteln, die nicht mischbare Phasen bilden, beruht, das Gegenstromverteilungsverfahren und die Teilungschromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver als Trägermaterial.

Bei der Aufteilung zwischen Chloroform und Wasser bei pH 8,0 wird das Antibiotikum C-14482 A₁ in die Chloroformschicht überführt. Bei dem Adsorptionsverfahren, bei dem beispielsweise Kieselgel als Adsorptionsmittel verwendet wird, wird das Antibiotikum C-14482 A₁ zuerst an einer Kieselgelsäure (Merck, Deutschland) adsorbiert und dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol eluiert. Durch Dünnschichtchromatographie des erhaltenen rohen Produkts mit einem Lösungsmittelsystem beispielsweise aus Äthylacetat und Methanol wird C-14482 A₁ als reine Substanz erhalten.

Das gemäß Beispiel 3 und 4 hergestellte Antibiotikum C-14482 A₁ hat die folgenden Kennzahlen:

I) Elementaranalyse (%)
C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14.
II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
IV) UV-Absorptionsspektrum (siehe Fig. 1) λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) (siehe Fig. 2):
Hauptpeaks (cm^-1):
3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825
VI) Löslichkeit:
praktisch unlöslich in Hexan und Petroläther.
Schwerlöslich in Äthanol, Butanol, Äthylacetat, und Wasser.
Löslich in Methanol und Chloroform.
VII) Farbreaktionen:
Negativ: Sakaguchi-Reaktion und Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat wird entfärbt.
VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwach basisch
IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun.
X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅)
XI) Stabilität: zwischen pH 3,0 und pH 8,0: 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil; zwischen pH 3,0 und pH 5,0 selbst bei 80°C 1 Stunde stabil; bei pH 6 leicht instabil, wenn das Antibiotikum 1 Stunde bei 80°C erhitzt wird; bei pH 7 bis 8 ziemlich instabil.
XII) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
Chloroform-Methanol (9 : 1):Rf 0,52 Äthylacetat-Methanol (10 : 1):Rf 0,38
XIII) Bildung von Salzen:
Da C-14482 A₁ eine basische Substanz ist, bildet es wasserlösliche Salze mit Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Weinsäure, Glucuronsäure usw. und schwerlösliche Salze mit Säuren wie Picrinsäure und Picrolonsäure.

Als Breitspektrum-Antibiotika, deren Kristalle eine rote bis rötlich-purpurne Farbe aufweisen, sind Mitomycin (T. Hata und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics, Serie A, 9 (1956) 141) und Naphthyridinomycin (D. Kluepfel und Mitarbeiter, The Journal of Antibiotics 28 (1975) 497) zu nennen. Diese beiden Antibiotika unterscheiden sich jedoch vom erfindungsgemäßen Antibiotikum C-14482 A₁ deutlich in den Absorptionen im Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich und in der Elementaranalyse (insbesondere im Stickstoffgehalt).

Da kein bekanntes Antibiotikum die vorstehend genannten chemischen Eigenschaften (insbesondere die Absorptionen im Ultraviolettbereich und sichtbaren Bereich des Spektrums) und die später beschriebenen biologischen Eigenschaften mit diesem Antibiotikum teilt, ist das Antibiotikum C-14482 A₁ als neue Substanz anzusehen.

Biologische Aktivität A) Antimikrobielle Aktivität

Trypticase-Sojaagar-Medium (nachstehend als TSA bezeichnet) mit 3% Glycerin ergänztes TSA und mit 1% Glucose ergänztes TSA wurden verwendet. Die Mindesthemmkonzentrationen von C-14482 A₁ gegen Bakterien, säurefeste Bakterien, Pilze und Hefen wurden nach der Agarverdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Antimikrobielles Spektrum von Antibiotikum C-14482 A₁

Plasmid R 100, R 100-1 oder F wurde auf Escherichia coli CRT 46, einen Mutanten mit einem wärmeempfindlichen Chromosomen-Gen dna A, zur Auslösung der DNA- Replikation (Hirota und Mitarbeiter, Journal of Molecular Biology 35 (1968) 175) und seine in vitro gegen Nalidixinsäure resistenten Mutanten übertragen, und die hitzebeständigen Revertanten (Hfr-Stämme) TE 33, TE 82 und TE 120 wurden nach der Methode von Nishimura und Mitarbeitern (Journal of Molecular Biology 55 (1971) 441) gewonnen. Die wachstumshemmende Wirkung von Antibiotikum C-14482 A₁ wurde gegen diese Stämme von Escherichia coli nach der Kulturmedium-Verdünnungsmethode von Yoshikawa und Mitarbeitern (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 5 (1974) 362) bestimmt. Die spontanen hitzebeständigen Revertanten TE 144 und TE 146 wurden als Kontrollen verwendet. Das Wachstum wurde nach der Extinktion bei 600 nm bewertet. Das Wachstumsverhältnis wurde aus dem Verhältnis der Extinktion für die behandelte Gruppe zur Extinktion der unbehandelten Gruppe berechnet.

Tabelle 5

B) Toxizität

Bei einem Test an Mäusen (CF Nr. 1, männlich, 4 Wochen alt) zur Bestimmung der akuten Toxizität wurde eine Lösung von C-14482 A₁ in physiologischer Kochsalzlösung intravenös verabreicht. Die geschätzte LD₅₀ dieses Antibiotikums betrug etwa 5 mg/kg.

Wie Tabelle 4 zeigt, hat das Antibiotikum C-14482 A₁ eine starke hemmende Wirkung gegen gramnegative, grampositive und säurefeste Bakterien. Das Antibiotikum C-14482 A₁ ist daher wertvoll als keimtötendes Mittel und Desinfektionsmittel.

Ferner zeigen die Ergebnisse in Tabelle 5, daß dieses Antibiotikum wertvoll als Mittel zur Eliminierung von R-Plasmiden wie ein anscheinend starker Inhibitor der Nucleinsäuresynthese ist. Dies läßt darauf schließen, daß das Produkt gemäß der Erfindung als tumorhemmendes Mittel wertvoll ist.

Das Antibiotikum C-14482 A₁ kann als keimtötendes Mittel, Desinfektionsmittel oder Arzneimittel zur äußeren Anwendung, beispielsweise zur Desinfektion von Geschirr, chirurgischen Instrumenten, Vogelkäfigen, Händen usw. verwendet werden. Bei Verwendung des Antibiotikums als keimtötendes Mittel, Bakterizid oder Desinfektionsmittel gegen Bakterien, beispielsweise die in Tabelle 4 genannten Bakterien, kann es als flüssige Zubereitung, die beispielsweise durch Auflösen von 10 mg Antibiotikum in 1000 bis 2000 ml Wasser hergestellt wird, angewendet werden. Für die Verwendung dieses Antibiotikums als Arzneimittel zur äußeren Anwendung kann es zu einer Salbe beispielsweise durch gleichmäßiges Vermischen von 0,5 mg C-14482 A₁ mit 10 g weißem Petrolatum formuliert werden.

Beispielsweise kann das Antibiotikum in Form einer Salbe, die 0,5 mg C-14482 A₁ pro 10 g weißes Petrolatum enthält, zur Verhinderung oder Behandlung der Eiterung von Wunden durch Staphylococcus aureus oder durch Mischinfektion mit den in Tabelle 4 genannten Mikroorganismen an der Hand örtlich angewendet werden, indem 0,02 bis 0,2 g Salbe viermal täglich auf die Wunde aufgetragen wird.

Ferner kann das Antibiotikum beispielsweise in Form einer Flüssigkeit, die 10 mg C-14482 A₁ in 1000 bis 2000 ml Wasser enthält, zur Desinfektion verwendet werden, indem Geschirr, chirurgische Instrumente, Vogelkäfige oder die Hände etwa 10 Minuten in die Flüssigkeit getaucht werden.

Bei Verabreichung an Mäuse, die mit Leukämie P388 infiziert worden sind, verhindert C-14482 A₁ die Vermehrung der Tumorzellen, wobei es eine starke lebensverlängernde Wirkung zeigt. C-14482 A₁ ist daher außerdem wertvoll als Antitumormittel für die Behandlung von Tumorzellen bei Warmblütern (z. B. Maus, Ratte, Mensch).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. "Teile" verhalten sich zu "Raumteilen" wie Gramm zu Kubikzentimeter. Den Prozentsätzen liegt "Gew./Vol." zu Grunde, falls nicht anders angegeben. Den in den Beispielen genannten Prozentsätzen von wäßrigem Aceton und wäßrigem Methanol liegt "Volumen/Volumen" zu Grunde.

Beispiel 1

Eine Kultur des das Antibiotikum C-14482 A₁ bildenden Stammes Nocardia sp. C-14482 = IFO 13725 im Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Schrägröhrchen wurde zum Beimpfen eines Erlenmeyerkolbens verwendet, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Impfkulturmediums (pH 7,0) enthielt, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 0,5% Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ bestand, worauf 48 Stunden bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten.

Ein Teil von 0,5 Raumteilen dieser Impfkultur wurde in einen Erlenmeyerkolben überführt, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Nährmediums (pH 7,0) aus 5% Dextrin, 3% Sojabohnenmehl, 0,1% Pepton und 0,5% CaCO₃ enthielt, worauf 90 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet wurde. Dieses Kulturmedium wurde nach der Agarverdünnungsmethode gegen Staphylococcus aureus FDA 209 P und Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmikroorganismen unter Verwendung von C-14482 A₁ als Standard getestet. Hierbei wurde ein Titer von 50 µg/ml gefunden. Das Antibiotikum C-14482 wird selbstverständlich noch isoliert.

Beispiel 2

10 Raumteile der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur wurden in einen Sakaguchi-Kolben überführt, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatte und 500 Raumteile eines Impfkulturmediums ähnlich dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Medium enthielt. Das geimpfte Medium wurde 48 Stunden bei 28°C kultiviert. 1000 Raumteile der Kultur wurden in 100 000 Raumteile des vorstehend genannten Kulturmediums in einem Fermentationstank geimpft, der ein Fassungsvermögen von 200 000 Raumteilen hatte. Das Medium wurde 48 Stunden bei 28°C bebrütet, wobei mit einer Rate von 100 000 Raumteilen/Minute belüftet und mit 200 UpM gerührt wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten. Diese Impfkultur wurde in einen 2 000 000 Raumteile fassenden Tank aus nichtrostendem Stahl überführt, der 1 000 000 Raumteile des in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsmediums enthielt. Die verwendete Größe des Inoculums betrug 10%. Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei 28°C bei einer Belüftungsrate von 1 000 000 Raumteilen/Minute, einer Rührergeschwindigkeit von 150 UpM (1/3 DT) und einem Innendruck von 0,981 bar durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium hatte einen Titer von 20 µg/ml, bestimmt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.

Das vorstehend beschriebene Kulturmedium wurde auf pH 5,0 eingestellt und mit der Filterpresse unter Verwendung von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels "Hyflo-Supercel" filtriert. Das Filtrat (880 000 Raumteile) wurde auf pH 8,0 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die 100 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthielt. Die Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf mit 250 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert wurde.

Das Eluat wurde unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen. Die restliche wäßrige Lösung wurde auf pH 6 eingestellt und an einer 60 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IRC-50" (H-Form) enthaltenden Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 180 000 Raumteilen Wasser gewaschen und dann mit 180 000 Raumteilen 0,2 n-Salzsäure eluiert. Das Eluat wurde auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat (30 000 Raumteile) wurde auf pH 6,0 eingestellt und an einer 15 000 Raumteile des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" enthaltenden Säule adsorbiert. Die Säule wurde mit 45 000 Raumteilen Wasser gewaschen, worauf mit 60 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert wurde. Das Eluat wurde auf pH 5,6 eingestellt und unter vermindertem Druck auf etwa 1000 Raumteile eingeengt.

Dem Konzentrat wurden 9000 Raumteile Aceton zugesetzt, wobei 124 Teile rohes Produkt I erhalten wurden.

Die Mutterflüssigkeit wurde weiter destilliert, um das Aceton zu entfernen. Der Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei 36 Teile rohes Produkt II erhalten wurden.

In 450 Raumteilen Wasser wurden 4,5 Teile des rohen Produkts II gelöst. Die Lösung wurde mit verdünntem wäßrigem NH₄OH auf pH 8 eingestellt und mehrmals (vier- bis fünfmal) mit 225 Raumteilen CHCl₃ extrahiert. Die CHCl₃-Extrakte wurden vereinigt und die aktive Substanz unter Verwendung von 300 Raumteilen 1/200 n-Salzsäure in eine wäßrige Schicht überführt. Die weinfarbige wäßrige Schicht wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt, auf pH 6,0 eingestellt und auf eine Säule von 170 Raumteilen des Nicht-Ionenaustauscherharzes "Diaion HP-10" aufgegeben. Die Säule wurde mit 500 Raumteilen Wasser und 700 Raumteilen 30%igem wäßrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann mit 700 Raumteilen 80%igem wäßrigem Methanol eluiert, wobei eine weinfarbige antibiotische Substanz erhalten wurde.

Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 0,185 Teile eines dunkelroten Pulvers erhalten. 0,155 Teile dieses Produkts wurden der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (HF₂₅₄) unterworfen (Lösungsmittel CHCl₃-MeOH = 10 : 1). Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0,45 wurden aufgefangen und mit Methanol extrahiert, wobei 0,024 Teile einer Fraktion A₁ erhalten wurden.

0,02 Teile dieser Fraktion A₁ wurden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (HF₂₅₄) mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat und Methanol (10 : 1) gereinigt, wobei eine gereinigte Fraktion A₁ (0,009 Teile) durch Extraktion mit Methanol aus der A₁ entsprechenden Bande (Rf 0,33) erhalten wurde. Der E-Wert dieses Antibiotikums C-14482 A₁ in Methanol betrug 41,3 bei 498 nm.

Beispiel 3

850 000 Raumteile eines Filtrats eines Kulturmediums, das nach einem Verfahren ähnlich dem in Beispiel 2 beschriebenen hergestellt worden war, wurden durch eine Säule von 85 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" geleitet. Die Säule wurde mit Wasser (255 000 Raumteile) gewaschen und mit 210 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde zur Entfernung des Acetons destilliert. Die restliche wäßrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und an einer Säule von 51 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite IRC-50" (H-Form) adsorbiert. Die Säule wurde mit 150 000 Raumteilen Wasser gewaschen und dann mit 150 000 Raumteilen 0,2 n-HCl eluiert. Das Eluat wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 50 000 Raumteile eingeengt und an einer Säule von 12 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Amberlite XAD-2" adsorbiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 18 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf pH 5,5 bis 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 118,3 Teile rohes C-14482 A₁ in Pulverform erhalten.

In 9000 Raumteilen Wasser wurden 90 Teile des erhaltenen rohen pulverförmigen Produkts gelöst. Die Lösung wurde mit verdünntem wäßrigem NH₄OH auf pH 8,0 eingestellt und dreimal mit 3000 Raumteilen n-Butanol extrahiert.

Die Extrakte wurden vereinigt und mit 3000 Raumteilen 1/200 n-HCl zweimal in wäßrige Schichten überführt. Die wäßrigen Schichten wurden zusammengegossen und auf pH 6 eingestellt. Das n-Butanol wurde entfernt und die restliche wäßrige Lösung (pH 6) auf eine Säule von 4500 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-10" aufgegeben. Die Säule wurde mit 13 500 Raumteilen Wasser und 9000 Raumteilen 30%igem wäßrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und mit 13 500 Raumteilen 80%igem wäßrigem Methanol eluiert, wobei 3,45 Teile einer A₁-reichen Fraktion (F-1) erhalten wurden.

3,0 Teile der A₁-reichen Fraktion (F-1) wurden an einer Säule von 150 Teilen Kieselgel adsorbiert. Die Elution wurde mit Lösungsmittelgemischen aus Chloroform und Methanol im Verhältnis von 50 : 1 (1300 Raumteile), 25 : 1 (1000 Raumteile) und 10 : 1 (1000 Raumteile) in dieser Reihenfolge vorgenommen. Abschließend wurde mit 1000 Raumteilen Methanol eluiert.

Die Elution mit dem Chloroform-Methanol-Gemisch (25 : 1) ergab 0,368 Teile einer A₁-reichen Fraktion. 0,340 Teile der A₁-reichen Fraktion wurden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (HF₂₅₄) mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (9 : 1) gereinigt, wobei 0,109 Teile C-14482 A₁ als gereinigtes dunkelrotes kristallines Pulver erhalten wurden.

Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei 60°C im Vakuum):
C 59,18; H 5,70; N 17,14.
g 498 nm (E 48,3)

Beispiel 4

900 000 Raumteile eines auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellten Kulturmediums wurden mit 4 n-H₂SO₄ auf pH 4,0 eingestellt und dann mit 800 000 Raumteilen Aceton versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Nach Zusatz von 30 000 Teilen des Filterhilfsmittels "Hyflo-Supercel" wurde das Gemisch mit der Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde auf pH 5,5 eingestellt und unter vermindertem Druck auf 800 000 Raumteile eingeengt. Das Aceton wurde entfernt und die restliche wäßrige Lösung auf pH 6,0 eingestellt und durch eine Säule von 90 000 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-10" geleitet. Die Säule wurde mit 270 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 250 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert.

Das Aceton wurde entfernt und die restliche wäßrige Lösung (100 000 Raumteile) auf pH 8,0 eingestellt und dreimal mit 30 000 Raumteilen Isobutanol extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegossen und die aktive Substanz zweimal mit 60 000 Raumteilen 1/200 n-HCl in eine wäßrige Schicht überführt. Das in der wäßrigen Schicht enthaltene Isobutanol wurde bei pH 5 bis 6 unter vermindertem Druck abdestilliert. Die restliche wäßrige Lösung wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf eine Säule des Harzes "Diaion HP-10" (45 000 Raumteile) aufgegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit 135 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 82 Teile eines an C-14482 A₁ reichen Pulvers (f-1) erhalten.

In 1,5×10³ Raumteilen Wasser wurden 15 Teile dieses Pulvers (f-1) gelöst. Die aktive Substanz wurde viermal mit 750 Raumteilen CHCl₃ bei pH 8,0 (mit verdünntem NH₄OH eingestellt) extrahiert und zweimal in 750 Raumteile 1/200 n-HCl überführt. Die wäßrigen Schichten wurden vereinigt und bei pH 6 unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde auf eine Säule von 400 Raumteilen des Harzes "Diaion HP-10" aufgegeben. Die Säule wurde mit 1200 Raumteilen Wasser und 1200 Raumteilen 30%igem wäßrigem Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Elution wurde mit 1200 Raumteilen 80%igem wäßrigem Methanol durchgeführt. Das Eluat wurde auf pH 6 eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Hierbei wurden 0,393 Teile eines dunklen rötlichbraunen Pulvers, das reich an A₁ war, erhalten. 0,375 Teile dieses pulverförmigen Produkts wurden durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Dünnschichtchromatographie auf die in Beispiel 2 und 3 beschriebene Weise gereinigt. Hierbei wurden 0,02 Teile C-14482 A₁ in Form von gereinigten dunkelroten Kristallen erhalten.

Elementaranalyse (nach Trocknung für 30 Stunden bei 60°C im Vakuum):
C 58,02; H 5,84; N 16,32
λ 498 nm (E 44,2)

Claims

1. Antibiotikum C-14482 A₁ mit folgenden Merkmalen:

I) Elementaranalyse (%)
C58,02; 59,18; H 5,84; 5,70; N16,32; 17,14.
II) Schmelzpunkt: nicht weniger als 300°C
III) Spezifische Drehung: ( α ) + 150° ± 30° (c = 0,05 Äthanol)
IV) UV-Absorptionsspektrum: λ (E) 214 nm ± 2 (503 ± 50)λ (E) 281 nm ± 2 (209 ± 10)λ (E) 498 nm ± 2 (46,0 ± 5)
V) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr):
Hauptpeaks (cm^-1):
3430, 3175, 2940, 2890, 2850, 1680, 1650, 1625, 1600, 1455, 1390, 1345, 1250, 1170, 1140, 1110, 1075, 1025, 995, 935, 910, 825
VI) Löslichkeit:
Praktisch unlöslich: Hexan, Petroläther.
Schwerlöslich: Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Wasser.
Löslich: Methanol, Chloroform.
VII) Farbreaktionen:
Negativ: Sakaguchi-Reaktion, Barton-Reaktion. Kaliumpermanganat entfärbt.
VIII) Acidität, Neutralität oder Basizität: schwachbasisch.
IX) Farbe der Kristalle: dunkelrot bis rötlichbraun
X) Molekulargewicht: 460 (gemessen durch Dampfdruckosmometrie in CH₃COOC₂H₅).

2. Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum C-14482 A₁, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardia sp. IFO 13725 in einem Nährmedium kultiviert, hierdurch das Antibiotikum C-14482 A₁ im Kulturmedium bildet und anreichert und das schwach basische Antibiotikum durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von solchen Metaboliten von Mikroorganismenkulturen angewendet werden, isoliert.