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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, wasserlösliches Antibiotikum, das im folgenden mit A 9578 bezeichnet wird, seine Komponenten, seine Salze und Derivate sowie pharmazeutische Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzgemische.
Das Antibiotikum A 9578 entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomyceten-Stammes, der aus einer bei Boston, Mass., USA, gesammelten Erdprobe isoliert worden ist und der in unseren Laboratorien, sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik unter der Bezeichnung A 9578 aufbewahrt wird.
Streptomyces A 9578 gehört der Art Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici an, unterscheidet sich aber von andern Vertretern dieser Art durch die Bildung des neuen wasserlöslichen Antibiotikums. Es ist bis jetzt nur ein Stamm von Streptomyces griseoflavus bekannt, der ein Antibiotikum produziert. Dabei handelt es sich um das sogenannte Griseoflavin [Y. Waga, J. Antibiotics Japan, A 6, 66 (1953)], das sich aber vom neuen Antibiotikum A 9578 schon durch seine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln unterscheidet. Das Luftmycel des Streptomyces A 9578 ist aschgrau. Die Sporenträger sind verzweigt und bilden reichlich Spiralen mit meist 2-5 Windungen. Die Sporen selbst haben eine Grösse von 1, 0-1, 3 x 0, 7-0, 9). t und tragen an ihrer Oberfläche zirka 0, 2 li lange, spitz zulaufende und an der Basis nur wenig verbreiterte Stacheln.
Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 180 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces A 9578 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch.
Mikrobiol. 17,361 (1952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar : Kolonien schleierartig, farblos, kein Luftmycel.
2. Synthetische Lösung : Sediment, Flocken rötlich. Gut ausgebildete Pellikel mit schlei- erartigem, weissgrauem Luftmycel. Substrat braungelb bis sattgelb.
3. Glucose-Agar : Kolonien anfangs punktförmig, nach 12 Tagen runzlig, blassgelb.
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: Kolonienanfangs punktförmig, späterschleierartig,gelb.
5. Calciummalat-Agar : Kolonien schleierartig, weissgelb, später sattgelb. Luftmycel spär- lich, mehlig bestäubt, mehlweiss. Substrat hellbraun.
6. Gelatinestich (180C) : Wachstum sehr spärlich, Verflüssigung sehr langsam (0,5 cm nach
30 Tagen).
7. Stärkeplatte : Kolonien schleierartig, milchweiss, kein Luftmycel, Hydrolyse
1 cm nach 5 Tagen.
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verfärbt.
9. Karotten : Wachstum sehr spärlich. Luftmycel spärlich, Substrat nicht verfärbt.
10. Lackmusmilch : RingförmigeKolonien ; Oberflächenhaut farblos. Luftmycel weiss- grau. Hydrolyse langsam, ohne Koagulation ; Lackmus blau.
Tyrosinasereaktion : Negativ.
Streptomyces A 9578 zeigt, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacterlology 56, 107 (1948) untersucht, bei Verwendung der folgenden Kohlenstoffquellen gutes Wachstum : L-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, Saccharose, Raffinose, Inulin, D-Mannit, D-Sorbit, Mesoinosit, Salicin, D-Fructose.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums A 9578 anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces A 9578 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stick- stoff- Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums A 9578 wird ein die Eigenschaften von Streptomyces A 9578 aufweisender Streptomyceten-Stamm, z. B. in wässeriger, Kohlenhydrate, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Antibiotikum A 9578 hierauf isoliert.
Als assimilierbare Kohlenhydrate kommen z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekömern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise derBaumwollpf1anze usw. aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Ma- gnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten,
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach l 1/2-5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums A 9578 können z. B. folgende Verfahren dienen : Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird.
Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässerige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässeriges Methanol.
Um das Antibiotikum dem Kulturfiltrat zu entziehen und zu reinigen, sind verschiedene Methoden geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden können. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Kulturlösung während dieser Operationen auf einem PH zwischen 3 und 5 zu halten.
1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Nont, aktivierte Erden, wie Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder wässerigen Säuren, z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-MethanolEisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Noritadsorbates hat sich das
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Teile) erwiesen.
2. Eine zweite Methode zur Abtrennung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat besteht darin, dass man das Antibiotikum an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Amberlite IRC-50 geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich ein Gemisch dieser beiden Formen im Volumenverhältnis 1 : 2 besonders bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit verdünnten Säuren, z. B. mit methanolischer Salzsäure.
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3. Weiter kann das basische Antibiotikum auch direkt aus dem Kulturfiltrat ausgefällt werden, z. B. mitteis Umsetzung mit einer organischen Säure vom Typus der Pikrinsäure. Durch Behandlung dieser Fällungen mit Salzen organischer Basen, z. B. mit Triäthylammoniumsulfat, oder mit verdünnten Säuren, wird das Antibiotikum in Form des entsprechenden Salzes erhalten. Man kann dabei sowohl in wässerigem Medium als auch in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, arbeiten.
Diese Überführung der schwerlöslichen Salze in leichtlösliche Salze des Antibiotikums wird entweder mit Mineralsäuren oder an Ionenaustauscherharzen, z. B. anAmberliteIRA-400, durchgeführt.
4. Eine Anreicherung des Antibiotikums wird auch dadurch erreicht, dass man wässerige oder alkoholisch-wässerige Lösungen des Salzes mit einem Überschuss von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan usw. versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.
5. Eine weitere Methode der Anreicherung des Antibiotikums besteht darin, dass man wässerige Lösungen von Phenol In Chloroform extrahiert, wobei sowohl das PH der wässerigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befindet sich das Antibiotikum z.
B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 cm3 Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wässeri- gen Phase von pH 1 bis 6 fast ausschliesslich in der organischen Phase, während es bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 cm Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wässerigen Phase lediglich bei
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Antibiotikums das Verhältnis von Konzentration intion in der wässerigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem PH der wässerigen Phase abnimmt.
Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.
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Anreicherungsmethode fürCelite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50, Amberlite IRC-50 u. dgl. Beispielsweise hat sich die Verteilungschromatographie an Cellulose unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol (4 Vol.-Teile), Eisessig (1 Vol.-Teil) und Wasser (5 Vol.-Teile) besonders bewährt.
7. Weiter kann dasantibiotikum durchgegenstromverteilung nachcraig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsrnittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei bewährt : a) sek. Butanol-1/10 N Ammonacetatpuffer von PH 4, 68
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teilungskoeffizient des Antibiotikums im System b) und damit die Lage des Aktivitätsmaximums In der Verteilung kann einerseits durch Änderung des PH der Pufferlösung und anderseits durch Variierung des Phenolgehaltes der organischen Phase beliebig verändert werden.
Zur Herstellung eines weitgehend reinen Präparates hat sich folgende Kombination der aufgeführten Anreicherungsverfahren bewährt. Aus dem Kulturfiltrat wird das Antibiotikum am gepufferten Ionenaustauscher Amberlite IRC-50 adsorbiert und mittels methanolischer Salzsäure eluiert. Die Eluate werden bei PH 5 im Vakuum konzentriert, wobei ein wässeriges Konzentrat des Antibiotikums erhalten wird, das volumenmässig ungefähr 1/100 derKulturlösung entspricht. Dieses wird gemäss der oben erwähnten Metho- de 5. einige Male zwischenPhenol-Chloroform-Gemischen einerseits und wässerigen Lösungen von variierendem PH anderseits verteilt, wobei nach Gefriertrocknung ein Präparat erhalten wird, das in bezug auf das. Kulturfiltrat eine um den Faktor 500-1000 erhöhte spezifische Wirksamkeit besitzt.
Durch Behandlung eines solchen Präparates gemäss der oben aufgeführten Methoden 6. (Verteilungschromatographie an Cellulose) und Methode 7. kann das basische, weitgehend einheitliche Antibiotikum A 9578 vorzugsweise in Form eines Salzes erhalten werden.
Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen hervorgeht, besteht das Antibiotikum A 9578 aus mindestens zwei Komponenten, nämlich der Hauptkomponente A und der Nebenkomponente B. Diese werden im Verlaufe des beschriebenen Anreicherungsprozesses weitgehend voneinander getrennt, speziell bei der Verteilungschromatographie an Cellulose und bei der Gegenstromverteilung.
Die beidenKomponenten von A 9578 werden papierchromatographisch definiert durch einen direkten Vergleich ihrer Ru-Werte mit den Rr-Wenen einer Reihe von bekannten A ntibiotika (2-11) in den Systemen A-G. Beim System H wird durchlaufend chromatographiert. Die angegebenen Zahlen sind dort die in cm
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<tb>
<tb> gemessenenLaufstrecken <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> nach <SEP> 16-stündiger <SEP> Chromatogrammdauer. <SEP> Der <SEP> Nachweis <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> erfolgt <SEP> autobiographisch <SEP> mit <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> oder <SEP> Bacillus <SEP> subtilis.
<tb>
System <SEP> la <SEP> 1b <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP>
<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,92 <SEP> 0,07 <SEP> 0
<tb> B <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 63 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 66 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0.
<SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> C <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 58 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 03 <SEP> 0, <SEP> 72 <SEP> 0, <SEP> 62 <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP>
<tb> D <SEP> 0,05 <SEP> 0,15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,92 <SEP> 0
<tb> E <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> F <SEP> 0,47 <SEP> 0,47 <SEP> 0,22 <SEP> 0,14 <SEP> 0,12 <SEP> 0,04 <SEP> 0,05 <SEP> 0,49 <SEP> 0,42 <SEP> 0,91 <SEP> 0,43 <SEP> 0,36
<tb> G <SEP> 0,74 <SEP> 0,74 <SEP> 0,07 <SEP> 0,02 <SEP> x <SEP> x <SEP> 0,94 <SEP> 0,61 <SEP> 0,69
<tb> H <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> (14, <SEP> 5) <SEP> (8,
<SEP> 8) <SEP> 27 <SEP> 1
<tb>
A wassergesättigtes Butanol
B Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5) (obere Phase)
C wassergesättigtes Butanol + 2% p-Toluolsulfosäure
D wassergesättigtes Butanol + 2% Piperidin
E Butanol-Pyridin-Wasser (6 : 4 : 3)
F 80%Äthanol 1, 5% Natriumchlorid, Whatman Nr. 4 imprägniert mit 0, 95-m.
Natriumsulfat + 0,05-m. Natriumhydrosulfat
G Butanol-Äthanol-Wasser (1 : 1 : 2)
H Butanol-Butylacetat-Eisessig-Wasser (10 : 3 : 1, 3 : 14, 3) (obere Phase) la A 9578 Base A Ib A 9578 Base B
2 Streptomycin
3 Ristocetin A
4 Ristocetin B
5 Neomycin B
6 Viomycin
7 Chlortetracyclin
8 Oxytetracyclin
9 Actinomycin J 10 Cycloserin 11 Grisein x Antibiotikum über ganze Laufstrecke verteilt () Position unscharf.
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Die Komponente A des Antibiotikums A 9578 ist ein orangegelbes Pulver, das sich leicht in Wasser, gut in Methanol und schwer in den meisten organischen Lösungsmitteln löst.
Die Base A gibt folgende Farbreaktionen : FeCL : braunrot FeC-KFe (CN) : blau Ninhydrin : schwach violett
Der Sakaguchi-, Maltol- und Ehrlich-Morgantest sind negativ.
Eine wässerige Lösung der Komponente A zeigt im UV-Spektrum Absorptionsmaxima bei 215 m (El% = 312) und bei 315 mp (El% = 42). lcm lcm
Die freie Base des Antibiotikums A 9578 ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässerigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts
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mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat- und -sulfat-Niederschlages und Isolierung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.
Eine der auffallendsten Eigenschaften des Antibiotikums A 9578 ist ein ausgeprägtes Stabilitätsminimum zwischen PH 7-11. Lösungen des Antibiotikums verlieren bei 200C und bei einem PH von 8-10 innerhalb 48 Stunden den grössten Teil ihrer Aktivität, während sie bei der gleichen Temperatur und bei PH-Werten von 1-5 vollständig und bei einem PH von 6-7 und über 11 teilweise wirksam bleiben.
Die Salze des Antibiotikums A 9578 und seiner Komponente leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphor- säuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von A 9578-sulfat mit pantothensaurem Calcium.
Das Antibiotikum A 9578 besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Im sogenannten Agarquerstrich-Test Ist es aktiv gegen folgende Testorganismen : Micrococcus pyogenes, var. aureus, Streptococcus viridans, Streptococcus faeca1is, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Bacillus megatherium und Bacillus subtilis.
In vivo ist das Antibiotikum A 9578 ebenfalls wirksam. Bei fünfma1iger subkutanerVerabreichung von 10 mg/kg an mit Staphylococcus pyogenes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100% und bei einer Dosis von 5 mal 5 mg/kg 5Clo Überlebende beobachtet. 50% Überlebende erhält man, wenn man Mäusen, die mit Escherichia coli infiziert sind, 5 mal 50 mg/kg subkutan appliziert.
Die Toxizität des Antibiotikums ist gering. So wird z. B. die subkutane Applikation von 1000 mg/kg von Mäusen ohne Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum A 9578, seine Komponenten, seine Salze oder Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannteArzneimittelträger. Die pharmazeutischenpräparate können z. B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel l : DieZüchtung desStreptomycesA 9578 wird nach demSubmersverfahrendurchgeführt.
Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Soyamehl und 20 g Mannit enthält.
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 7,5 bis 8, 0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 270, wobei Kulturen in Fermentern mit zirka 2 Vol. steriler Luft pro Vol. Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48-120 Stunden BebrUtung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert ge- genüber den Testorganismen (B. subtilis, B. megatherium, Micrococcus pyogenes, var. aureus) erreicht.
Man unterbricht die Kultur, bringt das PH durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure auf 4, 5 und trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Antibiotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa l% eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird, Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser und mit wässerigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.
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<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> b) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor
<tb> (Maisquellwasser)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
Beispiel 2 : 31 eines gemäss Beispiel l emaltenenKultuniltrates wenden durch Zugabe von ver- dünnter Natronlauge auf PH 7, 5 gebracht und mit 50 g Aktivkohle (Norit A) versetzt. Man lässt während 1 Stunde mechanisch rühren, wobei die gesamte antibiotisch wirksame Substanz von der Kohle adsorbiert wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Ryf10 Supercel, von der vollständig inaktiven Lösung abgetrennt.
Die Kohle wird darauf in 500 cm einer Mi-
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-Teilen WasserBeispiel S: S 1 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf PH 7, 5 gebracht und dann sofort mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0, 5 1 pro Stunde auf eine Säule von Amberlite IRC-50 (H-Form) gebracht, deren Länge bzw. Durchmesser 30 cm bzw. 5 cm beträgt. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Die Säule wird mit 3 1 Wasser gewaschen. Zur Elution verwendet man 11 0, 4 n Salzsäure. Die ersten 500 cm des Eluates sind antibiotisch unwirksam, während die zweiten 500 cms die gesamte Aktivität enthalten. Dieses aktive Eluat wird zur Entfernung der überschüssigen Salzsäure durch eine Säule von Amberlite IR-4B perkoliert.
Durch Gefriertrocknung des Perkolates erhält man das angereicherte Antibiotikum A 9578 in Form eines hochwirksamen amorphen Pulvers.
Beispiel 4 : 61 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden durch Zugabe von ver-
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14 cm lang ist und einen Durchmesser von 4,5 cm hat. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Man wäscht das Adsorberharz hierauf mit 3 1 Wasser und eluiert das Antibiotikum mit 11 einer Mischung von Methanol und l n Essigsäure (1 : 1). Das Eluat, das die gesamte antibiotisch wirksame Substanz enthält, wird im Vakuum bei 350 auf 15 cm eingeengt. Man versetzt diese Lösung mit 75 cm 0, 25 n methanolischer Salzsäure und giesst das Gemisch in 10 1 Aceton, wobei das Hydrochlorid des Antibiotikums ausfällt. Es wird filtriert und mit Aceton gewaschen. Zur weiteren Reinigung löst man es in 150 Cm Methanol und filtriert die etwas trübe Lösung unter Zugabe von Celit.
Nach Eindampfen des Filtrates im Vakuum bei 250 erhält man das Hydrochlorid des Antibiotikums A 9578 in Form eines amorphen Pulvers.
Beispiel 5 : 30 1 eines gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates werden auf PH 4, 5 gebracht und dann in einem Dünnschichteneindampfer auf 2 1 eingeengt. Das Konzentrat bringt man durch Zugabe von verdünnter Natronlauge. auf PH 8 und filtriert es unter Zugabe von Celit. Das klare Filtrat wird auf PH 5 gebracht und unter Rührung mit 1, 51 einer heissen, 5%igen, wässerigen Pikrinsäurelösung versetzt. Der entstandene. Niederschlag wird nach mehrstündigem Stehen bei 00 unter Zugabe von 50 g Celit abfiltriert. Das Filtrat ist antibiotisch nur sehr schwach aktiv. Der Filterrückstand wird hierauf dreimal mit
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bei das Pikrat des Antibiotikums und überschüssige Pikrinsäure ausfallen. Nach Abtrennung erhält man 8, 5 g Trockensubstanz.
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Zur Isolierung des Antibiotikums als Hydrochlorid werden 2,5 g der erwähnten Trochensubstanz in 30 ca Methanol gelöst. Man gibt hierauf zuerst eine Mischung von 1 cms konz. Salzsäure und 10 eins Aceton und dann 500 cm Äther zu, wobei das Hydrochlorid quantitativ ausgefällt wird. Durch wieder- holtes Lösen des Niederschlages in salzsaurem Methanol und Ausfällen mit Äther können die letzten Reste Pikrinsäure daraus entfernt werden. Schliesslich wird das Hydrochlorid In möglichst wenig Methanol gelöst, filtriert und im Vakuum eingedampft. Man erhält 714 mg des Hydrochlorides des Antibiotikums A 9578, das, antibiotisch sehr aktiv ist.
Beispiel 6 : 6001 einesnachBeispiel l erhaltenenKulturfiltrateswerden mit 5, 5 kgHyfloSupercel
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nrückstand wäscht man mit 1001 Wasser. Das klare Filtrat wird mit 7 kg vorbehandeltem Norit während 45 Minuten verrührt. Die Vorbehandlung des Norits erfolgt durch mehrmaliges Ausrühren mit l n Salzsäure und anschliessendem Neutralwaschen mit Wasser. Der mit Antibiotikum beladene Norit wird abfiltriert. Das Filtrat zeigt keine antibiotische Aktivität. Das Noritadsorbat wird zweimal mit 200 1 Wasser durchRühren und Filtrieren gewaschen. Die Waschflüssigkeit enthält keine aktive Substanz.
Die Elution erfolgt durch zweimaliges, 1-stündiges Ausrühren der Aktivkohle mit einem Gemisch von n-ButanolMethanol-Eisessig-Wasser im Volumenverhältnis von 2 : 1 : 1 : 2, wobei die Aktivkohle durch Filtration abgetrennt wird. Die vereinigten Eluate (140 1 + 46 1) werden mit 96 1 n-Butylacetat gut durchmischt. Die sich abscheidende wässerige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit 1, 21 Wasser nachgewaschen. Die vereinigten wässerigen Phasen (65, 5 l) werden sukzessive mit 72 l eines Gemisches von n-Butanol-n-Butylacetat im Volumenverhältnis von 1 : 2, 48 1 Essigester und schliesslich mit 241 Äther durchausrühren gewaschen, Die organischen Phasen werden verworfen.
Die verbleibende wässerige Phase (441), die die gesamte antibiotische aktive Substanz enthält, wird im Quickfitt-Verdampfer bei höchstens 30 C auf ein Volumen von 5, 451 eingeengt. Aus diesem hochaktiven, schwarz-braun gefärbten Konzentrat erhält man das Antibiotikum durch Gefriertrocknung in Form von 509 g eines braunen Pulvers.
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7 :Kulturfiltrates werden 1 Vol.-TeilAmberliteIRC-50 in der H-Form mit 2 Vol.-Teilen Amberlite IRC-50 in der Na-Form mechanisch gemischt. 6, 31 dieses Gemisches werden in eine Glassäule eingefüllt. Das Höhe : Durchmesser.. Verhältnis des Harzbettes beträgt 8 : 1.
Das Kulturfiltrat wird mit 2 n Salzsäure auf PH 4, 0 eingestellt und mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0, 2 l/min/l Harz durch das Harz perkoliert, wobei sich in den oberen 2/3 der Säule eine orange-braune Zone ausbildet. Das Harz wird an-
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Wasservon wenig unlöslichem Material durch Hyflo Supercel filtriert. Dieses Filtrat (2, 31) enthält annähernd die gesamte antibiotisch aktive Substanz der Kulturlösung. Es wird in 4 Portionen mit insgesamt 500 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die wässerige Phase wird verworfen.
Der Phenol-Chloroformextrakt (500 ml) wird mit 11 Chloroform verdünnt und mit 3 mal 500 ml 1/10 n Ammoniumacetatpuffer von PH 4, 60 ausgeschüttelt, wobei der organischen Phase gefärbte, antibiotisch inaktive Verunreinigungen entzogen werden. Die Chloroformphase wird nun mit 300+2 mal 100 ml 1/10 n Salzsäure extrahiert. Der tiefrot gefärbte Säureextrakt, der das Antibiotikum enthält, wird mit Kaliumbicarbonat auf pH 3, 5 gebracht und mit 4 50 ml-Portionen PhenolChloroformgemisch (100 g : 100 rnl) zurilckextrahiert. Man filtriert den Phenol-Chloroformextrakt durch Celite. Das klare, rotgefärbte Filtrat (200 ml) wird unter starkem Schütteln mit 50 ml Wasser, 500 ml, Äther und 300 ml Petroläther versetzt. Nach dem Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit 2 mal 50 ml Wasser nachgewaschen.
Die vereinigten wässerigen Extrakte werden 2 mal mit 500 ml Äther und 1 mal mit 500 ml Benzol ausgeschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 2, 60 g eines antibiotisch hochwirksamen, orange-braun gefärbten Pulvers. Dieses Material zeigt in bezug auf das Ausgangsmaterial eine 500-1000fache spezifische antibiotische Aktivität (Aktivität pro Gewichtseinheit Trockensubstanz). Auf Whatman Nr. 1-Papier zeigt dieses Material im System n-Butanol : n-Bu- tylacetat : Eisessig : Wasser = 10 : 3 : 1, 3 : 14, 3 bei der autobiographischen Entwicklung mit Staphylococcus aureus 2 Substanzflecken. Die langsamer wandernde antibiotische Substanz wird als Base A, die 2, 5 mal schneller wandernde Substanz als Base B bezeichnet.
Die Base A gibt auf dem Papier beim Besprühen mit FeC + K FeCN eine blaue Farbreaktion.
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Beispiel 8 : 338 g eines nach Beispiel 6 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in 1, 5 l Wasser gelöst. Man setzt 150 g kristallines Ammoniumsulfat zu und extrahiert die Lösung mit 1 1 pu 2 mal 500 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 100 ml Chloroform enthalt. Die vereinigten Phenol-Chloroformextrakte werden mit 750 ml 1 n Salzsäure ausgeschüttelt und hierauf durch eine Schicht von Celite filtriert. Das klare rotbraune Filtrat wird unter Rühren mit 600 ml Wasser, 41 Äther und schliesslich mit 4 1 Petroläther versetzt. Die wässerige Phase wird abgetrennt und die organische Phase mit 2 mal 200 ml Wasser nachextrahiert. Die vereinigten wässerigen Phasen (11) werden 2 mal mit 11 Äther gewaschen und hierauf lyophilisiert.
Man erhält 136 g eines braunen Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial eine um den Faktor 2 erhöhte spezifische antibiotische Aktivität aufweist.
Beispiel 9 : 550 mg eines nach Beispiel 11 erhaltenen, stark aktiven Aaübiotikumpräparates (Ba- se A) werden in 55 rnl eines 1/10 n Ammoniumacetatpuffers von PH4, 60 gelöst md mit 4mal 20 ml eines Phenol-Chloroformgemisches, das 100 g Phenol in 400 ml Chloroform enthält, extrahiert. Die organischen Extrakte werden mit 2 mal 15 ml Pufferlösung zurückgewaschen. Der das AEtIbiotikum enthaltende orga- nische Extrakt (80 ml) wird mit 40 ml Chloroform verdünnt, noch einmal mit 60 ml Pufferlösung gewaschen und hierauf durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert. Das tiefrot gefärbte Filsat extrahiert man mit 30+20+10 ml 0, 2 n Salzsäure.
Die das Antibiotikum enthaltende Säurelösung wird mit 50 ml Wasser verdiinnt und mit einem Phenol-Chloroformgemisch, das 100 g Phenol in 100 mi Chloroform enthält, er- schöpfend extrahiert (2x20+10 ml). Die vereinigten Phenol-Chloroformextrstkts werden durch ein doppeltes Faltenfilter filtriert und mit 20 ml Wasser, 200 ml Äther und 100 ml Pescimher geschüttelt. Nach dem Abtrennen der wässerigen Phase wird die organische Phase mit 2 mal 15 ml Wasser maehextrahiert.
Die vereinigten wässerigen Extrakte werden 2 mal mit 50 ml Äther und l mal mit 50 ml Benzol gewa- schen und hierauf lyophilisiert. Man erhält 117 mg eines braunroten Pulvers, dss in bezug auf das Ausgangsmaterial eine annähernd 5fache Anreicherung der antibiotischen Aktivist aufweist.
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Gemisches von 4 Teilen Butanol, 1 Teil Eisessig und 5 Teilen Wasser. Dsr abgetrennten oberen Phase werden 10 Vol. -0/0 reines Butanol zugesetzt. Die Substanz wird mit der 10fachen Menge Cellulosepulver verrieben und als Pulver auf die Säule aufgetragen. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 15-20 ml/Std.
Es werden Fraktionen zu 40 ml aufgefangen. Die einzelnen Fraktionen werden mit 50 ml Petoläther geschüttelt. Die ausgeschiedene wässerige Phase wird mit Benzol gewaschen und lyophilisier ie Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz befindet sich in den Fraktionen 7-8 (121 mg) und 10-13 (142 mg). Gemäss papierchromatographischen Untersuchungen enthalten die Fraktionen 7-8 vorwiegend Base B, die Fraktionen 10-13 vorwiegend Base A.
Beispiel 11 : 3 g eines nach Beispiel 8 erhaltenen AntibiotilumprEparates werden in einer Craig'schen Verteilungsapparatur im System sek. Butanol-0,1 n AmmonacetatpHf'ferpH 4, 68 über 100 Stufen verteilt. Jede Einheit enthält je 100 ml obere und untere Phase. Die Substanz wird in die Einheit Nr. 3 eingefüllt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Versetzen des Gemisches der beiden Phasen mit dem doppelten Volumen Petroläther und Lyophilisation der wässerigen Phase. Die dunkel gefärbten Fraktionen 3-11 enthalten nur wenig antibiotisch aktive Substanz. Die orange-gelb gefärbten Fraktionen 12-20 (631 mg) enthalten den Hauptteil der antibiotisch wirksamen Substanz (vorwiegend Base A). Die gelb gefärbten Fraktionen 21-40 sind schwächer aktiv und enthalten einGemisch vonBass A und E, in dem die letztere aberwiegt.
Beispiel 12 : 200 mg eines nach Beispiel 10 erhaltenemAntibiotikumpraparates (Base A) werden in einer Craig'schen Verteilungsapparatur im System 1/20 n Ammoniumacetztpuffer PH 4,58-105 Phenol in Chloroform über 29 Stufen verteilt. Jede Stufe enthält je 10 ml obere und untere Phase. Die Hauptmenge der antibiotisch aktiven Substanz befindet sich in den Fraktionen 6-15. Diese werden vereinigt (zirka 200 ml), mit 400 ml Äther und 300 ml Petroläther versetzt und geschüttelt. Die abgetrennte, orange-rot gefärbte, wässerige Phase wird mit Chloroform gewaschen und mit 20 3 mal 10 ml eines Gemisches von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert.
Den Phenol-Chloroformextrakt versetzt man unter Schütteln mit 20 ml Wasser, 300 ml Äther und 200 ml Petroläthero Die rotgefärbte wässerige Phase wird abgetrennt, mit viel Äther und Benzol gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 86, 4 mg der
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eines gelben wasserlöslichen Pulvers. UV-Spektrumin Wassers ? L max. s 215 ml{jt (E*- =312),Ninhydrin : schwach positiv. Negativ : Sakaguchi, Maltol, Elson-Morgan.