HU177391B - Process for producing maytanzinol and derivatives - Google Patents

Abstract

Maytansinol, maytanacin and/or maytansinol propionate are prepared by culturing a microorganism belonging to the genus Nocardia, which is able to produce maytansinol, maytanacin and/or maytansinol propionate, with concentration of maytansinol, maytanacin and/or maytansinol propionate, and isolating it from the culture broth. These compounds are useful antitumour agents, i.e. useful cytostatics.

Description

A találmány tárgya új eljárás maytanzinol, maytanacin és' maytanzinol-propionát előállítására. A felsorolt vegyületek daganat-ellenes hatással rendelkeznek.The present invention relates to a novel process for the preparation of maytanzinol, maytanacin and maytanzinol propionate. The compounds listed have anti-tumor activity.

Ismeretes, hogy a fenti vegyületek közül a maytanacin és maytanzinol-propionát daganat-ellenes hatása erős (Kupchan és mtsai: Journal or the American Chemical Society 97, 5294 /1975/). A maytanzinol maga viszont csak gyenge daganat-ellenes hatást mutat (lásd a fenti hivatkozást), de ] hasznos intermedier a maytanacin és maytanzinol-propionát, valamint más származékok előállítására.Among these compounds, maytanacin and maytanzinol propionate are known to have potent antitumor activity (Kupchan et al., Journal of the American Chemical Society 97, 5294 (1975)). Maytanzinol, on the other hand, has only a weak antitumor activity (see above), but is a useful intermediate for the preparation of maytanacin and maytanzinol propionate and other derivatives.

A maytanzinolt és maytanacint Kupchan és mtsai. a Putterlickia verrucosa (a maytenus nemzet- i ségbe tartozó növény) kérgéből nyerték ki, így igen kis kitermelést kaptak. Közelebbről 1 kg szárított kéregből az első vegyület 0,025 mg-nyi, míg az utóbbi vegyület 0,36 mg-nyi mennyiségét sikerült kinyerni. A maytanzinol-propionátot vi- 21 szont a maytanzinol vegyi úton végzett propionezésével állítottuk elő.Maytanzinol and maytanacin are described by Kupchan et al. was obtained from the bark of Putterlickia verrucosa (a plant of the maytenus genus) and yielded very low yields. More specifically, 1 kg of dried bark was obtained in an amount of 0.025 mg of the former and 0.36 mg of the latter. However, maytanzinol propionate was prepared by chemical propionation of maytanzinol.

A találmány kidolgozása során különféle talajás egyéb mintákat gyűjtöttünk össze és megvizs- 2!In the course of the present invention, other soil samples were collected and analyzed.

gáltuk a mintákból izolált mikroorganizmusok által termelt antibiotikumokat.’ Vizsgálataink arra a felismerésre vezettek, hogy néhány így izolált mikroorganizmus alkalmas a maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát összegyűjtésére a táp- 3( talajban. Ezek a mikroorganizmusok a Nocardia nemzetséghez tartoznak. A vegyületek úgy is előállíthatok, hogy az ezekből a mikroorganizmusokból származó mutánsokat alkalmas tápsókat tar5 talmazó táptalajokon, alkalmas körülmények között tenyésztjük.Our investigations led to the discovery that some of the microorganisms so isolated are capable of collecting maytanzinol, maytanacin, or maytanzinol propionate in nutrient 3 (soil. These microorganisms also belong to the genus Nocardia. mutants derived from these microorganisms can be prepared by culturing the media in suitable medium containing suitable nutrients.

A fenti felismerések alapján folytatott további tanulmányok vezettek a jelen találmány kidolgozásához.Further studies based on the above findings have led to the development of the present invention.

így a jelen találmány tárgya új eljárás a maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát előállítására, oly módon, hogy egy Nocardia C-15003 jelzésű, ATCC 31281 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust asszimilálható szénfor5 rásokat és emészthető nitrogénforrásokat tartalmazó táptalajban, 20—35 °C hőmérsékleten, 7,0 kezdeti pH-értéken tenyésztünk, majd az összegyűlt maytanzinolt, maytanacint vagy maytanzinol-propionátot önmagában ismert módon elkülönítjük.Thus, the present invention relates to a novel process for the preparation of maytanzinol, maytanacin or maytanzinol propionate in a culture medium containing assimilable carbon sources and digestible nitrogen sources of Nocardia C-15003 deposited under ATCC 31281 at a temperature of 20-35 ° C. Is cultured at an initial pH of 7.0, and the collected maytanzinol, maytanacin or maytanzinol propionate is isolated in a manner known per se.

A technika állása szerint a fenti vegyületek növényekből állíthatók elő, de az alkalmas növények száma igen korlátozott, az előállítás rendkívül költséges és időigényes valamennyi lépés, 5 így a növesztés, szárítás és a növény elpcrítása és extrakciója, az elkülönítés és a tisztítás lépéseit tekintve egyaránt. Ugyanakkor a kitermelés rendkívül alacsony.In the prior art, the above compounds can be prepared from plants, but the number of suitable plants is very limited and preparation is extremely costly and time-consuming in all steps such as growth, drying and extraction, isolation and purification of the plant. However, the yield is extremely low.

Ezzel szemben a találmány szerinti eljárás , könnyen és simán végrehajtható a mikroorganizmus “tenyésztésével és a vegyületek nagy mennyiségének előállítására alkalmas,In contrast, the process of the invention is readily and smoothly carried out by culturing the microorganism and is capable of producing a large amount of the compounds,

A találmány szerinti eljárás az első ezeknek a vegyületeknek mikroorganizmusok metabolitjaként történő előállítására, és mint ilyen a vegyületek előállítására alkalmas igen kiváló módszerként jellemezhető.The process of the present invention is the first to produce these compounds as metabolites of microorganisms and as such is characterized as a very excellent method for the preparation of the compounds.

A találmány szerinti eljáráshoz a C—15003 számú, ATCC 31281 számon deponált actinomycetes törzset használjuk, amelyet a talajból és¹⁰ egyéb mintákból is izoláltunk az antibiotikumok termelésére alkalmas mikroorganizmusok felkutatása során.The process of the invention is used for the C-15003, ATCC No. 31281 deposited actinomycete strain which was isolated from soil and in ¹⁰ other samples also suitable for searching for the production of antibiotics of microorganisms.

A C-15003 törzs mikrobiológiai jellemzőit a Schirling és Gottlíeb (Intemational Journal of¹⁵ Systematic Bacteriology 16, 313—340 /1966/) által javasolt módszerhez hasonló eljárással vizsgáltuk. A 28°C-on, 21 nap múltán végzett megfigyelések eredményeit a következőkben ismertetjük.The microbiological characteristics of strain C-15003 were examined using a procedure similar to that proposed by Schirling and Gottlib (Intemational Journal of ¹⁵ Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966)). The results of the observation at 28 ° C after 21 days are described below.

1. Morfológiai jellemzők1. Morphological characteristics

A vegetatív micélium agar és folyékony táptalajon egyaránt jól szaporodik és elágazódik. Sok 25 gombasejt 0,8—1,2μηι átmérőjű és néhány esetben a pálcika alakú baktériumokra emlékeztető vagy elágazó, rövid sejtekre osztódhat. A törzs jó növekedést mutat különböző taxonómiai táptalajokon, ahoi a léginíceíium ráépüi a vegetatív micélium- 30 ra, bár az gyakran coremia-szerű testeket (50-200 x 200-1000 pm) alkot, amelyeken további légi növekedés léphet fel. Sok 'cgmicélium rugalmas, és néhány esetben egyenes vagy laza spirál-szerű konfigurációt lehetett megfigyelni. Az öregí- 35 tett tenyészetek mikroszkópikus vizsgálata azt mutatta, hogy conidia-szerű sejtek csak néhány esetben jelennek meg a láncokban, míg az ilyen tenyészetek tetejéből nyert sejt szuszpenziók, mikroszkópos megfigyelések szerint, sok elnyújtott 40 ellipszoid (0,8—1,2 pm x 4,8-6,8 pm) és ellipszoid (0,8 1,2 x 1,0-2,0 Mm) alakú, az arthrospores-re emlékeztető testei tartalmaztak.The vegetative mycelium multiplies well on both agar and liquid media and branches. Many 25 fungal cells are 0.8-1.2μηι in diameter and in some cases may divide into short cells resembling or branching to rod-shaped bacteria. The strain exhibits good growth in various taxonomic media where aerial lecithium builds on the vegetative mycelium, although it often forms coremia-like bodies (50-200 x 200-1000 pm) on which additional aerial growth may occur. Many of the cgmicellium are elastic, and in some cases a straight or loose spiral-like configuration has been observed. Microscopic examination of aged cultures showed that only a few cases of conidia-like cells appear in chains, while cell suspensions obtained from the top of such cultures show, under microscopic observation, many elongated 40 ellipsoids (0.8-1.2 pm). x 4.8-6.8 µm) and ellipsoid (0.8 1.2 x 1.0-2.0 mm) shaped like arthrospores-like bodies.

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek a testek sima felületűek. 45Electron microscopy showed these bodies to have smooth surfaces. 45

2. A sejtek összetevői2. Components of cells

A törzset módosított ISP 1 számú táptalajon rázással tenyésztettük 28 °C-os hőmérsékleten, 50 66-99 órán át. A tenyésztés befejeztével a sejteket összegyűjtöttük & leöblítettük. B. Becker és mtsai. (Applied Microbiology 12, 421 /1964/ és Μ. P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 /1968/) módszerével megvizs- 55 gáltuk a finti sejtek diamino-pimelinsav és cukor tartalmát. Az első vegyületrül azt találtuk, hogy mezo-formájúak, míg olyan helyeket is detektáltunk, amelyek galaktóznak és arabinóznak feleltek meg. 60The strain was cultured on modified ISP 1 medium by shaking at 28 ° C for 50 to 66-99 hours. At the end of the culture, the cells were harvested & rinsed. B. Becker et al. (Applied Microbiology 12, 421/1964 / and P. Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934/1968 /) examined the diamino-pimelic acid and sugar content of finnish cells. that they were meso-shaped while we also found sites that corresponded to galactose and arabinose.

3. Taxonómiai táptalajokon mutatott jellemzők3. Characteristics of taxonomic media

A törzs viszonylag jó növekedést mutatott különböző táptalajokon, ahol a vegetatív micélium 65 színtelentől halvány sárgáig változott a tenyésztés kezdeti fázisaiban, és színe világos sárgásbarna és világosbarna között volt a későbbi fázisokban. Azt találtuk, hogy a törzs oldható pigmenteket termel, melyek színe sárgától sárgásbarnáig változhat, különböző taxonómiai táptalajokon. A légmicéliuni porszerű és általában mérsékelt növekedést mutat, színe pedig fehér és világos sárgásbarna között van. A törzs jellemzőit különböző taxonómiai táptalajokon a következő 1. táblázatban foglaljuk össze.The strain showed relatively good growth on various media, where the vegetative mycelium changed from 65 colorless to pale yellow in the initial stages of culture and was between light yellow and light brown in subsequent phases. It has been found that the strain produces soluble pigments, which vary in color from yellow to yellow-brown in various taxonomic media. Aerial mycelium has a powdery and generally moderate growth and is white to light tan. The characteristics of the strain on various taxonomic media are summarized in Table 1 below.

1. táblázatTable 1

A C—15003 törzs tenyésztési jellemzői különböző taxonómiai táptalajokon (A) Szacharóz nitrát agar:Culture characteristics of strain C-15003 on various taxonomic media (A) Sucrose nitrate agar:

Növekedés (G): mérsékelt, világos dinnye sárga (3 ia)^x és borostyánszín között (3 lc)^x, coremia-szerű testek.Growth (G): Moderate, light melon between yellow (3 ia) ^x and amber (3 lc) ^x , coremia-like bodies.

Légi micélium (AM): kevés, fehér Oldható pigment (SP): Nincs vagy világos sárgásbarna.Aerial mycelium (AM): low white Soluble pigment (SP): None or light tan.

(B) Glicerol nitrát agar:(B) Glycerol nitrate agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x, coremia-szerű tesiek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x coremia-like bodies.

AM: mérsékelt, fehér.AM: Moderate, white.

SP: nincs.SP: None.

(C) Glükóz aszparagin agar:(C) Glucose Asparagine Agar:

G: mérsékelt, élénk gólyahír színű (3 pa)^x és élénk sárga (2 pa)^x között. AM: Kevés, fehér. SP: Világossárga (2 pa)^x.G: Moderate, bright stork teal color between (3 pa) ^x and bright yellow (2 pa) ^x . AM: Little white. SP: Light yellow (2 pa) ^x .

(D) Glicerol aszparagin agar:(D) Glycerol Asparagine Agar:

G: mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x, coremia-szerű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x coremia-like bodies.

AM: Kevés, fehér.AM: Little white.

SP: Nincs.SP: None.

(E) Keményítő agai:(E) Starch agai:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x és világos búzaszínű (2 ea)^x között, coremia-szerű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x to light wheat (2 ea) ^x , coremia-like bodies are formed.

AM: Kevés, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x AM: Light, light ivory (2 ca) ^x

SP: Nincs.SP: None.

(F) Tápsó agar;(F) Nutrient Agar;

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x és gyarmati sárga (2 ga)^x között, coremia-szerű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x to colonial yellow (2 ga) ^x , coremia-like bodies are formed.

AM: Kevés, fehér.AM: Little white.

SP: Nincs.SP: None.

1. táblázat folytatása (G) Kálcium maláta agar:Continuation of Table 1 (G) Calcium malt agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x és világos búzaszínű (2 ea)^x között, coremia-szerű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x to light wheat (2 ea) ^x , coremia-like bodies are formed.

SP: Nincs.SP: None.

(H) Élesztő extraktum — maláta extraktum agar: G: Mérsékelt, borostyánszínűtől (3 lx)^x élénk sárgáig (3 la)^x, coremia-szerű testek képződnek.(H) Yeast extract - malt extract agar: G: Moderate, amber (3 lx) ^x vivid yellow (3 la) ^x , coremia-like bodies are formed.

AM: Mérsékelt, fehér és világos elefántcsontszínű között (2 ca)^x,AM: Moderate white to light ivory (2 ca) ^x ,

SP: Nincs.SP: None.

(I) Zabliszt agar:(I) Oatmeal Agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x gyarmati sárgáig (2 ga)^x, coremia-szetű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x colonial yellow (2 ga) ^x , coremia-like bodies are formed.

AM: Kevés, fehér és világossárga között.AM: Few, between white and light yellow.

SP: Nincs.SP: None.

(J) Pepton élesztő extraktum vas agar:(J) Pepton Yeast Extract Iron Agar:

G: Mérsékelt, gyarmati sárga (2 ga)^x AM: NincsG: Moderate, colonial yellow (2 ga) ^x AM: None

SP: Gyarmati sárga (2 ga)^x (K) Tirozin agar:SP: Colonial Yellow (2 ga) ^x (K) Tyrosine Agar:

G: Mérsékelt, világos elefántcsontszínű (2 ca)^x világos dinnye sárgáig (3 ea)^x, coremia-szerű testek képződnek.G: Moderate, light ivory (2 ca) ^x light melon to yellow (3 ea) ^x , coremia-like bodies.

AM: Mérsékelt, fehér és világos elefántcsontszínű között (2 ca)^x.AM: Moderate white to light ivory (2 ca) ^x .

SP: Teve színű (3 ie)^x.SP: Camel colored (3 ie) ^x .

^XA színeket a „Color Harmony Manual” 4. kiadása szerint határoztuk meg (Container Corporation of America, 1958). ^X Colors were determined according to the 4th edition of the Color Harmony Manual (Container Corporation of America, 1958).

4. Fiziológiai jellemzők4. Physiological characteristics

A törzs fiziológiai jellemzőit a 2. táblázatban foglaltuk össze. A növesztés során a hőmérséklet 12 és 38 °C között volt. Az a hőmérsékleti tartomány, amelyen belül agaron (ISP NO. 2) jó légi növekedés figyelhető meg 20—35 °C.The physiological characteristics of the strain are summarized in Table 2. During growth, the temperature was between 12 and 38 ° C. The temperature range within which good air growth is observed on agar (ISP NO. 2) is 20-35 ° C.

2. táblázatTable 2

A C-15003 számú törzs fiziológiai jellemzői Növekedésre alkalmas hőmérsékleti tartomány: 12-38 °C.Physiological Characteristics of Strain C-15003 Temperature range for growth: 12-38 ° C.

Légi növekedésre alkalmas hőmérsékleti tartomány: 20—35 °C.Temperature range suitable for air growth: 20-35 ° C.

A zselatin megolvadása: pozitív.Melting gelatine: positive.

A keményítő hidrolízise: pozitív.Hydrolysis of starch: positive.

Nitrátok redukálása: pozitív.Nitrate reduction: positive.

Tej peptonizálása: pozitív.Peptonization of milk: positive.

Tej koagulálása: negatív.Milk coagulation: negative.

2. táblázat folytatásaContinuation of Table 2

Kazein elbontása: pozitív.Casein breakdown: positive.

Melanoid pigmentek termelése:Production of melanoid pigments:

negatív (pepton élesztő extraktum vas agar) pozitív (tirozin agar)negative (peptone yeast extract iron agar) positive (tyrosine agar)

Tirozin elbontása: pozitív. Xantin elbontása: negatív.Tyrosine breakdown: positive. Xanthin resolution: negative.

Lizocimmel szembeni tolerancia: pozitív. Nátriumkloriddal szembeni tolerancia: 2%.Lysozyme tolerance: positive. Tolerance to sodium chloride: 2%.

5. Különböző szénforrások felhasználása5. Use of different coal sources

A különféle szénforrások felhasználását^ úgy. vizsgáltuk, hogy egy Pridham és Gottlieb (Journal of Bacteriology 56, 107 /1948/) táptalajt és egy azonos összetételű alap táptalajt plusz 0,1% élesztő extraktumot használtunk. A kapott spektrumot a 3. táblázatban mutatjuk be.The use of various carbon sources ^ such. we tested using Pridham and Gottlieb (Journal of Bacteriology 56, 107 (1948)) and a basic medium of the same composition plus 0.1% yeast extract. The resulting spectrum is shown in Table 3.

3. táblázatTable 3

Különféle törzs által By various tribes szénforrások carbon sources hasznosítása utilization a C-15003 C-15003 Szénforrás carbon sources Növekedés Growth Szénforrás carbon sources Növekedés Growth D-xilóz D-xylose ♦ ♦ raffizóz raffizóz + ±^x + ± ^x L-arabinóz L-arabinose 4 4 4 4 melibióz melibiose 4 4 4 4 D-glükóz D-glucose 44 44 44 44 izo-inozitol i-inositol — - - - - - D-galaktóz D-galactose + 4 + 4 D-szorbitol D-sorbitol — — - - D-fruktóz D-fructose 4+4 44 4 + 4 44 D-mannitol D-mannitol 44 44 44 44 Lramnóz Lramnóz 4 + 4+ glicerol glycerol ± ± D-mannóz D-mannose 444 4-t 444 4t oldható keményítő soluble starch + + ++ Szacharóz Laktóz Maltóz Trehalóz Sucrose Lactose Maltose Trehalose 44 44 __X ± + 4 44 44 44 __X ± + 4 44 kontroll control

^xAlap táptalaj 0,1% élesztő extraktum adalékkal. ^x Basic medium with 0.1% yeast extract.

Megjegyzés:Comment:

♦**: kiváló növekedés «·: jó növekedés +: növekedés ±: rossz növekedés♦ **: excellent growth «·: good growth +: growth ±: bad growth

-: nincs növekedés-: no growth

6. Egyéb jellemzők6. Other Features

A sejteket a korábban, a 2. pont alatt leírt módszerrel gyűjtöttük össze és a DNA preparációját J. Marmur és mtsai. (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961) módszeréhez hasonló módon végeztük A DNA (dezoxinukleinsav) G-C (guanincitozin) tartalmát körülbelül 7’ móí%-nak találtuk.Cells were harvested by the method described previously under point 2 and DNA preparation was performed by J. Marmur et al. (Journal of Molecular Biology 3: 208, 1961) The DNA (deoxynucleic acid) G-C (guanincytosine) content was found to be about 7 'mol%.

A törzs vegetatív micéhumának Gram-vízsgálata pozitív eredményt adott.The Gram water test of the vegetative mycelium of the strain gave a positive result.

A C-15003 törzs fenti jellemzőit összevetettük az S. A. Waksman „The Actinomycetes Vol. 2” (The Williams and Wilkins Co. 1961) könyvében, valamint R. E. Buchanan és N. E. Gibbons „Bérgey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8.The above characteristics of strain C-15003 were compared in S. A. Waksman's "The Actinomycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co. 1961) and R. E. Buchanan and N. E. Gibbons, "Bérgey's Manual of Determinative Bacteriology", 8.

kiadás 1974” című kiadványával és más irodalmi adatokkal.edition 1974 ”and other literature.

Miután a törzset a Nocardia genus III. csoportjába tartozónak véltük, az a tény, hogy az ismert törzsek között nem találtunk olyat, amelynek a tulajdonságai azonosak lettek volna, arra a következtetésre kellett jutnunk, hogy az általunk vizsgált törzs egy új speciest képvisel.After the strain is Nocardia genus III. group, the fact that we did not find among the known strains that had the same properties, we had to conclude that the strain we were investigating represented a new specie.

A C-l5003 számú törzset 3992 szám alatt letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, i Agency of Industrial Science and Technology mikroorganizmus gyűjteményében (FERM), míg a törzs a The Institute fór Fermentation, Osaka (IFO) gyűjteményében az IFO 13726 számot és a The American Type Culture Collection (ATCC), Ma- i ryland, USA gyűjteményében a 31281 számot kapta.Strain C-15003 was deposited under number 3992 in the Fermentation Research Institute, Ferromation Collection of the Agency for Industrial Science and Technology (FERM), while the strain was deposited under IFO 13726 in The Institute for Fermentation, Osaka (IFO) and The The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA, was assigned the number 31281.

Míg a C—15003 számú törzs a Nocardia genus egy új species-e, mint említettük, a többi mikroorganizmushoz hasonlóan hajlamos különböző változatok és mutánsok kialakítására akár spontán módon, akár mutagének hatására. így például a törzs sok variánsát kaphatjuk röntgensugarakkal végzett besugárzás hatására vagy gamma-sugarak, ultraibolya sugarak hatására, egysejtes izolálással, 21 különböző vegyszereket tartalmazó táptalajokban végzett tenyésztéssel vagy bármely egyéb mutagén kezeléssel. A törzsből spontán módon keletkezett mutánsokat ugyancsak nem tekintjük külön species-nek, ellenkezőleg, bármely ilyen változat vagy mutáns, amely alkalmas a maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát termelésére, felhasználható a találmány céljaira. így például a C-l5003 törzset különféle mutagén kezeléseknek alávetve olyan mutánsokat kapunk, amelyeknél lényegében hiányzik az oldható pigment termelő képesség, amelyekben a micéliumok színtelenek, sárgászöldek, vöröses cserszínűek vagy narancsvörösek, más mutánsok gombasejtjei bacillusszerű elemekre vagy elágazó, rövid sejtekre képesek felhasadni, ismét mások kevés fehér légmicéliumot tartalmaznak vagy lényegében légmicélium nélküliek.While strain C-15003 is a new species of the Nocardia genus, as mentioned, it, like other microorganisms, tends to produce different variants and mutants, either spontaneously or under the influence of mutagens. For example, many variants of the strain can be obtained by exposure to X-rays or by gamma rays, ultraviolet rays, single-cell isolation, culture in 21 media containing various chemicals, or any other mutagenic treatment. Mutants produced spontaneously from the strain are also not considered to be a separate species; on the contrary, any such variant or mutant capable of producing maytanzinol, maytanacin and maytanzinol propionate may be used for the purposes of the invention. For example, strain C-15003 is subjected to various mutagenic treatments to produce mutants that lack essentially soluble pigment production in which mycelia are colorless, yellowish-green, reddish-tan or orange-red, fungal cells of other mutants are capable of bacillus-like cells, others have little or no aerial mycelium.

A maytanzinol, maytanacin vagy maytanzinol-propionát termelésére alkalmas törzstenyésztésre (a törzset a továbbiakban néha „termelőképes” törzsként rövidítjük) szolgáló táptalaj lehet folyékony vagy szilárd táptalaj, ha olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani tud, bár nagyüzemi gyártáshoz előnyös folyékony táptalaj használata.A culture medium for the production of maytanzinol, maytanacin or maytanzinol propionate (sometimes referred to as a "productive" strain) may be liquid or solid media if it contains nutrients that the strain can utilize, although it is advantageous for use in large-scale production.

Az ilyen, C—15003 antibiotikumot ’ termelő törzsek tenyésztésére felhasznált táptalaj bármely cseppfolyós vagy szilárd táptalaj lehet, azzal a feltétellel, hogy olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani képes, bár nagyüzemi termelés esetében a folyékony táptalajok használata kedvezőbb. A táptalajok tartalmazhatnak nitrogénés szén fonásokat, amelyeket a C—15003 számú mikroorganizmus képes asszimilálni és emészteni, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségű tápsókat és egyéb anyagokat. Szénforrásként például a következő anyagokat használhatjuk: glükóz, laktóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, glicerol, mannitol, szorbitol, zsírok és olajok (például szójabab olaj, disznózsír, csirkezsír). Nitro gén forrásként például a következő vegyületeket használhatjuk: hús extraktum, élesztő extraktum, szárított áesztő, szójabab liszt, kukoricacsávázó folyadék, pepton, lenmag liszt, maláta hulladék, 5 karbamid, ammóniumsók (például ammóniumszulfát, ammóniumklorid, ammóniumnitrát, ammóniumacetát). A táptalaj ezen felül tartalmazhat nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és egyéb sókat, így vas-, mangán·, cink-, kobalt-, nikkelsój kát, foszforsav-, bórsav-sókat és szerves savak sóit, így acetátokat és propionátokat. A táptalaj ezenkívül tartalmazhat még különféle aminosavakat (például glutaminsav, alanin, glicin, lizin, metionin, prolin), peptideket (például dipeptidek, tripepti5 dek), vitaminokat (például Bj, B₂ vitaminok, nikotinsav, Bi ₂, C és E vitaminok), nukleinsavakat (például purin, pirimidin és származékaik). A táptalaj pH-értékének beállítása céljából egy szervetlen vagy szerves savat, lúgot, puffereket és hasonló ) anyagokat adhatunk a rendszerhez. Habzásgátlóként olajok, zsírok, felületaktív szerek és más megfelelő anyagok alkalmas mennyiségeit használhatjuk.The medium used for the cultivation of such antibiotic C-15003 producing strains may be any liquid or solid medium, provided that it contains nutrients which the strain is capable of utilizing, although in the case of large-scale production liquid media are preferred. The media may contain nitrogen and carbon spinning, which can be assimilated and digested by microorganism C-15003, inorganic materials, trace amounts of nutrients and other substances. Examples of carbon sources include glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, starch, glycerol, mannitol, sorbitol, fats and oils (e.g., soybean oil, lard, chicken fat). Examples of nitro gene sources include: meat extract, yeast extract, dried yeast, soybean flour, corn stripping liquid, peptone, linseed meal, malt waste, urea, ammonium salts (e.g., ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium nitrate). The medium may additionally contain sodium, potassium, calcium, magnesium and other salts such as iron, manganese, zinc, cobalt, nickel salts, phosphoric acid, boric acid salts and organic acid salts such as acetates and propionate. The medium may also include various amino acids (e.g., glutamic acid, alanine, glycine, lysine, methionine, proline), peptides (e.g. dipeptides, tripepti5 triglycerides), vitamins (e.g., Bi, B ₂ vitamins, nicotinic acid, Bi _2, vitamins C and E) , nucleic acids (such as purine, pyrimidine and their derivatives). An inorganic or organic acid, alkaline, buffers and the like may be added to adjust the pH of the medium. Suitable amounts of oils, fats, surfactants, and other suitable materials may be used as antifoam agents.

A tenyésztést bármely stacioner, rázó, merülő aerob és más módszerrel végezhetjük. Nagyüzemi ; termelésre természetesen a merülő aerob tenyészetek a legalkalmasabbak. Míg a tenyésztés körülményei természetesen függnek a táptalaj összetételétől, a törzstől, az alkalmazott módszertől és más tényezőktől, az inkubálást 20 és 35 °C ) között, megközelítőleg 7,0 kezdeti pH-érték mellett végezzük. Különösen kívánatos, hogy a hőmérséklet 23 és 30 °C között legyen a tenyésztés közbenső szakaszában és a kezdeti pH-érték 6,5 és 7,5 között változzon. Bár az inkubálás ideje szintén a _; fenti tényezők függvénye, tanácsos az inkubálást addig végezni, míg a kívánt antibiotikum titer-értéke maximális nem lesz. Rázó kultúrák vagy aerob merülő tenyészetek esetében ez az idő általában 48—144 óra között van.The cultivation can be performed by any stationary, shaking, immersing aerobic or other method. Large-scale; Of course, submerged aerobic cultures are the most suitable for production. While the culture conditions will of course depend on the composition of the medium, the strain, the method used and other factors, the incubation is carried out at 20 to 35 ° C) at an initial pH of about 7.0. It is particularly desirable for the temperature to be between 23 and 30 ° C during the intermediate stages of culture and for the initial pH to be between 6.5 and 7.5. Although incubation time is also a _; Depending on the above factors, it is advisable to incubate until the desired antibiotic titer is at its maximum. In the case of shaking cultures or aerobic immersion cultures, this time is usually between 48 and 144 hours.

) Az antibiotikum potenciálját Tetrahymena pyriformis W-al viszgáltuk. így a fenti mikroorganizmust egy vizsgálati táptalajon (20 g proteóz-pepton(Difco), 1 g élesztő extraktum(Difco), 2 g glükóz, 1000 ml desztillált víz és 10 ml 1 mólos i foszfát puffer (pH 7) 28 °C-on, 44—48 órán át tenyésztettük és az antibiotikum potenciálját sorozat hígításos módszerrel határoztuk meg, nyomon követve a zavarosodás változását, megvizsgáltuk a hasvízkór daganatsejtjeire kifejtett hatást és a > későbbiekben leírt módon vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végeztünk.) The antibiotic potential was tested with Tetrahymena pyriformis W. Thus, the above microorganism was assayed in a test medium (20 g of protease peptone (Difco), 1 g of yeast extract (Difco), 2 g of glucose, 1000 ml of distilled water and 10 ml of 1 M phosphate buffer, pH 7) at 28 ° C. , Cultured for 44-48 hours, and the potency of the antibiotic was determined by serial dilution, monitoring for changes in turbidity, assaying for effects on peritoneal tumor cells, and thin-layer chromatography as described below.

A maytanacint, maytanzinolt vagy maytanzinol-propionátot a kapott táptalajon termeljük és gyűjtjük össze, extra- és intracellulárisan egyaránt. Az anyagok egyike sem mutat antibiotikus hatást, így a Tetrahymena törzzsel szembeni aktivitással párhuzamosan vékonyrétegkromatográfiás módszerrel kerültek detektálásra. így a fermentlét sejtekre és szűrletre különítettük el szűréssel vagy centrifugálással és a szűrletet azonos mennyiségű etilacetáttal extraháltuk. A sejtekhez ugyanolyan mennyiségű 70%-os aceton-víz elegyet adunk, mint a szőriéihez és egy órás, 20°C-on végzett keverés után a szuszpenziót szűrtük. Az acetont eltávotítottuk a szűrletből és a kapott vizes szűrletet etilacetáttal extraháljuk. Valamennyi extraktumot 1/100 térfogatra koncentráltunk és vékonyrétegkromatográfiás méréssel vizsgáltunk, szilikagél lemezen (Merek, NSZK, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20). Oldószer rendszerként kloroform és metanol 9 :1 arányú elegyét használtuk. A potenciált a foltok intenzitásának alapján határoztuk meg, amit 2537 A-nél ultraibolya fénnyel végzett besugárzással határoztuk meg.Maytanacin, maytanzinol or maytanzinol propionate is produced and harvested on the resulting medium, both extracellularly and intracellularly. None of the substances exhibited antibiotic activity and were detected by thin layer chromatography in parallel with the activity against the Tetrahymena strain. Thus, the fermentation broth was separated on cells and filtrate by filtration or centrifugation and the filtrate was extracted with an equal volume of ethyl acetate. To the cells was added the same amount of 70% acetone / water mixture as for their hairs and after stirring for 1 hour at 20 ° C the suspension was filtered. The acetone was removed from the filtrate and the resulting aqueous filtrate was extracted with ethyl acetate. Each extract was concentrated to 1/100 volume and analyzed by TLC on a silica gel plate (Merek, Germany, Kieselgel 60 F 254, 0.25 mm, 20 x 20). Chloroform: methanol (9: 1) was used as the solvent system. The potential was determined by the intensity of the spots as determined by irradiation at 2537 A with ultraviolet light.

A táptalajon így előállított maytanacin, maytanzinol-propionát vagy maytanzinol lipofil és semleges anyagok, és könnyen kinyerhetők általánosan használt elkülönítési és tisztítási eljárásokkal, amelyeket rendszerint ilyen típusú szervezetek begyűjtésére alkalmazunk. így például használhatjuk azt az eljárást, amely az antibiotikumok és a szennyezések oldhatóságában mutatkozó különbséget hasznosítja, azaz, amely a különféle adszorbensekkel szemben mutatott adszorptív affinitást hasznosítja (ilyen adszorbensek lehetnek például: aktív szén, makropórusos, nem-ionos gyanták, szilikagél, alumíniumoxid). A szennyezések ezen kívül ioncserélő gyantákkal és más módszerekkel is eltávolíthatók, amelyeket egymagukban vagy alkalmas kombinációban, adott esetben ismételten is alkalmazunk.The media thus obtained maytanacin, maytanzinol propionate or maytanzinol are lipophilic and inert materials and can be readily recovered by commonly used isolation and purification procedures which are usually used to harvest these types of organisms. For example, a method that utilizes the difference in solubility of antibiotics and impurities, i.e., one that utilizes adsorptive affinity for various adsorbents (such as activated carbon, macroporous, non-ionic resins, silica gel, alumina), may be used. In addition, impurities can be removed by ion exchange resins and other methods, which may be used alone or in combination, optionally repeated.

Miután az említett vegyületek a szűrletben és a sejtekben egyaránt előfordulnak, az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása ilyen adszorbensek segítségével, ha használatukra egyáltalán sor kerül, történhet akár közvetlenül, akár — szűrlet esetében — oldószeres extrakció, vagy — mikrobiológiai sejtek esetében - oldószeres extrakció után. Az oldószeres extrakciót a következő módszerek bármelyike szerint végrehajthatjuk:Since these compounds are present in the filtrate as well as in the cells, the isolation and purification of antibiotics by such adsorbents, if any, can be carried out either directly or after filtration by solvent extraction or by microbiological cells by solvent extraction. Solvent extraction can be carried out by any of the following methods:

(1) A fermentlé oldószeres extrakciója a sejtek elkülönítése előtt, (2) a sejtek és a szűréssel, centrifugálissal vagy más módszerekkel kapott szűrlet oldószeres extrakciója. A szűrlet és a sejtek független extrakciójára előnyösen a következő eljárást használjuk.(1) Solvent extraction of fermentation broth before separation of cells; (2) Solvent extraction of cells and filtrate obtained by filtration, centrifugation or other methods. Preferably, the following procedure is used for the independent extraction of filtrate and cells.

A szűrlet extrakciójára alkalmas oldószerek vízzel nem elegyedő, szerves oldószerek, így zsírsav-észterek, például etilacetát, amilacetát, alkoholok, például butanol, halogénezett szénhidrogének, például kloroform és ketonok, például metil-izobutil-keton. Az extrakciót semlegeshez közeli pH-értéken hajtjuk végre és előnyösen, az előzőleg pH 7-re beállított folyékony fermentlét etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot vízzel mossuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután egy nem poláros oldószert, így petrolétert vagy hexánt adunk a koncentrátumhoz és a hatóanyagot tartalmazó I számú nyersterméket kinyeijük. Mivel vékonyrétegkromatográfiás mérések szerint a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol mellett számos más foltot is kapunk, az I. számú terméket több lépcsőben a következő tisztítási eljárásokkal dolgozzuk fel. így szokásos tisztítási eljárásként adszorpdós kromatográfiát használhatunk erre a célra, adszorbensként a szokásos adszorbensek valamelyikét, így szilikagélt, alumíniumoxidot, makropórusos nem-ionos adszorbens gyantát alkalmazhatunk. Az I. számú nyerstermék tisztítására legelőnyösebb a szilikagél használata. Az előhívást például úgy hajthatjuk végre, hogy petroléterrel és hexánnal indulunk és az eluálast valamely poláris oldószerrel, úgy mint etilacetáttal, acetonnal, etanollal vagy metanollal végezzük. Egy szokásos eljárás szerint, vivőanyagként szilikagélt használva (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm), az oszlopkromatográfiát úgy végezzük, hogy a hexán : etilacetát arányt fokozatosan növeljük. Az eluátumból mintát veszünk, amelyet vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálunk meg és a hatóanyagokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. Ezután a koncentrátumhoz petrolétert vagy hexánt adunk, miáltal II. számú nyersterméket kapunk. Mivel ez a termék még tartalmaz szennyezéseket, a következőképpen tovább tisztítjuk. A II. számú nyersterméket például szilikagél oszlopon tisztíthatjuk, különféle oldószerrendszereket használva. Az erre a célra használt előhívórendszer egy halogénezett szénhidrogénből, így diklórmetánból vagy kloroformból állhat, egy poláris oldószer, úgy mint alkohol, például metanol vagy etanol, keton, például aceton vagy metiletilketon vagy más hasonló oldószerek hozzáadása mellett. Ezzel a módszerrel elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot és maytanzinolt. Az első és második szilikagél oszlopra felvitt oldószerek sorrendje megfordítható, és szükség esetén a fenti rendszerekkel együtt még más szokásos szerves oldószerek is használhatók.Suitable solvents for extracting the filtrate are water immiscible organic solvents such as fatty acid esters such as ethyl acetate, amyl acetate, alcohols such as butanol, halogenated hydrocarbons such as chloroform and ketones such as methyl isobutyl ketone. The extraction is carried out at a pH close to neutral and preferably the liquid fermentation broth previously adjusted to pH 7 is extracted with ethyl acetate. The extract was washed with water and concentrated under reduced pressure. A non-polar solvent such as petroleum ether or hexane is then added to the concentrate and the crude product I containing the active ingredient is recovered. Since TLC shows several spots besides maytanacin, maytanzinol propionate and maytanzinol, product I is subjected to the following purification steps in several steps. Thus, adsorption chromatography can be used as a standard purification process, and one of the usual adsorbents such as silica gel, alumina, macroporous non-ionic adsorbent resin can be used as the adsorbent. The use of silica gel is most preferred for the purification of crude product I. For example, the elution can be accomplished by starting with petroleum ether and hexane and eluting with a polar solvent such as ethyl acetate, acetone, ethanol or methanol. According to a conventional procedure, using silica gel (Merek, USG, 0.05-0.2 mm) as a carrier, column chromatography is carried out by gradually increasing the hexane: ethyl acetate ratio. The eluate was sampled and examined by thin layer chromatography, and the fractions containing the active compounds were collected and concentrated under reduced pressure. Thereafter, petroleum ether or hexane was added to the concentrate to give II. of crude product. Since this product still contains impurities, it is further purified as follows. II. For example, crude product # 1 can be purified on a silica gel column using a variety of solvent systems. The development system used for this purpose may consist of a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane or chloroform, with the addition of a polar solvent such as an alcohol such as methanol or ethanol, a ketone such as acetone or methylethylketone or the like. This method separates maytanacin, maytanzinol propionate and maytanzinol. The order of solvents applied to the first and second silica gel columns is reversible and other conventional organic solvents may be used in combination with the above systems, if necessary.

Ha makropórusos adszorbens gyantát használunk a tisztítás eszközéül a II. számú nyerstermék tisztítása során, a maytanacin, maytanzinol-propionát és maytanzinol eluálását víz és egy rövidszénláncú alkohol, rövidszénláncú keton vagy észter elegy ével végezzük. A rövidszénláncú alkohol lehet például metanol, etanol, propanol vagy butanol és a rövidszénláncú keton lehet például aceton vagy metiletilketon. Észterként például etilacetátot használhatunk. Egy tipikus eljárás szerint a II. számú nyersterméket feloldjuk egy 60%-os metanol-víz elegyben és egy Diaion HP-10 (Mitsubishi KaséiIf a macroporous adsorbent resin is used as a means of purification, the method described in FIG. In the purification of crude product no., elution of maytanacin, maytanzinol propionate and maytanzinol is carried out in a mixture of water and a lower alcohol, lower ketone or ester. The lower alcohol may be, for example, methanol, ethanol, propanol or butanol and the lower ketone may be, for example, acetone or methylethylketone. As the ester, for example, ethyl acetate may be used. According to a typical procedure, the method described in FIG. crude product was dissolved in a 60% methanol-water mixture and a Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasel

K. K.) oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot egy 70%-os metanol-víz eleggyel mossuk, majd az eluálást 90%-os metanol-víz eleggyel hajtjuk végre. Ezzel az eljárással a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt eluáljuk az oszlopról.K.K.) column. The column was washed with 70% methanol / water and eluted with 90% methanol / water. This procedure elutes maytanacin, maytanzinol propionate or maytanzinol from the column.

Bármelyik fent leírt eljárásban az aktív vegyületeket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson koncentráljuk. A száraz termékhez 5-8 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk, majd elkülönítjük a maytanacint, maytanzinol-propionátot vagy maytanzinolt. Ezeket a vegyületeket ezután egy adszorbens segítségével választjuk el egymástól. Erre a célra bármelyik eddig említett adszorbens használható. így szilikagélt vagy makropórusos, nem-ionos adszorbens gyantát használva és a fenti oldószerekkel dolgozva a kívánt vegyületek frakcionálisan eluálhatók. Ha például szilikagélt használunk, az előhívást hexánnal, etilacetáttal vagy kloroform-metanol eleggyel hajtjuk végre, a maytanzinol-propionát és maytanacin az itt megadott sorrendben jelennek meg. Vékonyrétegkromatográfiás detektálás az egyes frakciókat külön-külön koncentráljuk csök177391 kenteit nyomás alatt és a koncentrátumokhoz etilacetátot adunk. Ezen a módon a megfelelő vegyületek kristályos formában kaphatók. Ha makropórusos, nem-ionos gyantát használunk, különböző összetételű alkohol, keton vagy észter és víz ele- 5 gyeket használunk a gradiens eluálási technika kivitelezéséhez. így például gradiens eluálási technikával, 60%-os metanol-víz és 95%-os metanol-víz, valamint 5% nátrium-klorid hozzáadásával dolgozva a maytanacin és maytanzinol-propionát a megadott sorrendben válnak ki. Mintavétel és vékonyrétegkromatográfiás detektálás után az aktív frakciók mindegyik csoportját csökkentett nyomáson koncentráljuk és etilacetátból kristályosítjuk. Az izolált kristályok kristályosítási oldószerként etilacetátot tartalmaznak. Foszforpentoxid felett 70°C-on 8 órán át végzett szárítás után a következő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek.In any of the methods described above, the fractions containing the active compounds were collected and concentrated under reduced pressure. To the dry product is added 5 to 8 volumes of ethyl acetate and the mixture is allowed to stand and the maytanacin, maytanzinol propionate or maytanzinol are separated. These compounds are then separated by means of an adsorbent. Any of the above-mentioned adsorbents can be used for this purpose. Thus, the desired compounds can be fractionally eluted using silica gel or a macroporous non-ionic adsorbent resin and working with the above solvents. For example, when silica gel is used, development is carried out with hexane, ethyl acetate, or chloroform-methanol, and maytanzinol propionate and maytanacin appear in the order given herein. For TLC detection, each fraction was concentrated individually under reduced pressure (177391) and ethyl acetate was added to the concentrates. In this way, the corresponding compounds are obtained in crystalline form. When using a macroporous non-ionic resin, mixtures of alcohol, ketone or ester and water of different compositions are used to perform the gradient elution technique. For example, using gradient elution techniques, 60% methanol-water, 95% methanol-water, and 5% sodium chloride, maytanacin and maytanzinol propionate are precipitated in the order indicated. After sampling and detection by TLC, each group of active fractions was concentrated under reduced pressure and crystallized from ethyl acetate. The isolated crystals contain ethyl acetate as the crystallization solvent. After drying over phosphorus pentoxide at 70 ° C for 8 hours, they have the following physical and chemical properties.

4.. táblázatTable 4

Maytanacin C3 0H39CIN2 O9 Maytanacin C3 0H39CIN2 O9 Maytanzinol-propionát C₃iH₄₁ClN₂O₉ Maytanzinol propionate C ₃ H ₄₁ ClN ₂ O ₉ Maytanzinol C₂ sH_{3 7}C1N₂O₈ Maytanzinol C ₂ sH _{3 7} C1N ₂ O ₈ olvadáspont (°C) mp (° C) 235—236 235-236 188-190 188-190 172,5-174 172.5 to 174 fajlagos forgató- specific rotation [a]p²°—121° ±10°[α] D ² ° -121 ° ± 10 ° [<°-127° + 10° [Α] -127 ° + 10 ° fa]^²°-313° + 10'fa] ^ ² ° -313 ° + 10 ' képesség ability (C = 0,25, CHCI3) (C = 0.25, CHCl 3) (C = 0,35, CHCI3) (C = 0.35, CHCl 3) (C = 0,22, CHC1₃)(C = 0.22, CHCl ₃ ) Analízis Analysis C C 59,62 59.62 59,63 59.63 59,28 59.28 számított (%) calculated (%) H H 6,93 6.93 6,82 6.82 6,38 6.38 N N 4,28 4.28 4,32 4.32 5,02 5.02 Cl cl 5,74 5.74 5,57 5.57 6,15 6.15 Analízis Analysis c c 59,85 59.85 59,94 59.94 59,52 59.52 talált (%) found (%) H H 6,48 6.48 6,65 6.65 6,60 6.60 N N 4,61 4.61 4,51 4.51 4,96 4.96 Cl cl 5,84 5.84 5,71 5.71 6,27 6.27 ultraibolya abszorpciós ultraviolet absorption 233 (30330) 233 (30330) 233 (30240) 233 (30240) 232 (32750) 232 (32750) spektrum (e) spectrum (e) 240 (sh. 28240) 240 (including 28240) 240 (sh. 28400) 240 (including 28400) 244 (sh. 30850) 244 (including 30850) 252 (27850) 252 (27850) 252 (27650) 252 (27650) 252 (31650) 252 (31650) 280 (5680) 280 (5680) 280 (5740) 280 (5740) 281 (5750) 281 (5750) 288 (5660) 288 (5660) 288 (5710) 288 (5710) 288 (5700) 288 (5700) infravörös abszorpciós infrared absorption 1740, 1730, 1740, 1730, 1740, 1730, 1740, 1730, 1715, 1670, 1715, 1670, spektrum (cm'¹)spectrum (cm ' ¹ ) 1670, 1580 1670, 1580 1670, 1580 1670, 1580 1580 1580 NMR-spektrum (m/e) Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (m / e) 545, 485, 545, 485, 559, 485, 559, 485, 503, 485 503, 485 470, 450 470, 450 470, 450 470, 450 470, 450 470, 450 savas, semleges vagy you are acidic, neutral lipofil és lipophilic and lipofil és lipophilic and lipofil és lipophilic and lúgos alkaline semleges neutral semleges neutral semleges neutral anyag material anyag material anyag material színreakciók color reactions Dragendorff- Dragendorff- Dragendorff- Dragendorff- Dragendorff- Dragendorff- -reakció; -reaction; -reakció: -reaction: -reakció: -reaction: pozitív positive pozitív positive pozitív positive Beilstein- Beilstein- Beilstein- Beilstein- Beilstein- Beilstein- -reakció: -reaction: -reakció: -reaction: -reakció: -reaction: pozitív positive pozitív positive pozitív positive

A fenti kémiai analízis, fajlagos forgatóképesség, ultraibolya-spektrum, infravörös-spektrum és tömeg- 60 spektrum adatok jó egyezésben vannak a maytanacinnal, maytanzinollal és maytanzinol-propionáttai kapcsolatban Kupchan és mtsai. által megadott adatokkal (lásd Journal és American ChemicalThe above chemical analysis, specific rotation, ultraviolet, infrared and mass spectral data are in good agreement with maytanacin, maytanzinol and maytanzinol propionate according to Kupchan et al. (See Journal and American Chemical

Society 97, 5294 /1975/). 65Society 97, 5294 (1975). 65

A következő példák találmányunkat tovább szemléltetik, a korlátozás szándéka nélkül. A példákban a „súlyrész” és „térfogatrész” kifejezések közötti összefüggés azonos a „gramm” és „milliliter” kifejezések közötti összefüggéssel. A %-®s értékek, ahol másként nem említjük, vegyes %-ot jelentenek.The following examples further illustrate the present invention without limiting it. In the examples, the relationship between "parts by weight" and "parts by volume" is the same as the expression "grams" and "milliliters". % Values, unless otherwise stated, refer to mixed%.

1. példaExample 1

Egy élesztő extraktum - maláta extraktum táptalajon növesztett, maytanzinolt, maytanacint és maytanzinol-propionátot termelő, C—15003 számú Nocardia mikroorganizmust (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) egy 40 térfogatrész beoltó táptalajt tartalmazó 200 térfogatrész méretű fermentor beoltására használunk fel. A beoltó táptalaj összetétele: 2% glükóz, 3% oldható keményítő, 1% nyers szójabab liszt, 1% kukoricacsávázó folyadék, 0,5% polipepton, 0,3% nátrium-klorid, 0,5% kalcium-karbonát, (pH 7,0). A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk 48 órán át inokulum előállítása céljából. Az így kapott inokulum 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét egy 200 térfogatrész méretű, 40 térfogatrész táptalajt tartalmazó fermentorba adagoljuk. A táptalaj összetétele a következő: 5% dextrin, 3% kukorica csávázó folyadék, 0,1% polipepton, 0,5% kalcium-karbonát, pH 7,0. .A táptalajon 28 °C-on 90 órán át tenyésztést végzünk egy inokulum előállítása céljából (oltó tenyészet).A yeast extract-malt extract grown on culture medium containing Nocardia C-15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) producing maytanzinol, maytanacin and maytanzinol propionate was inoculated with 200 volumes of inoculum medium. Inoculum medium: 2% glucose, 3% soluble starch, 1% raw soybean flour, 1% corn stripping liquid, 0.5% polypeptone, 0.3% sodium chloride, 0.5% calcium carbonate, pH 7 , 0). The inoculated medium is incubated at 28 ° C for 48 hours to produce an inoculum. 0.5 volumes of the inoculum thus obtained are added to a 200-volume fermenter containing 40 volumes of medium. The medium is composed of 5% dextrin, 3% corn dressing fluid, 0.1% polypeptone, 0.5% calcium carbonate, pH 7.0. The medium is cultured at 28 ° C for 90 hours to produce an inoculum (seed culture).

Sorozat hígítási technikával meghatározva, vizsgálati mikroorganizmusként Tetrahymena pyriformis W-t és összehasonlítóként C—15003 P—3 antibiotikumot használva a fenti tenyészet titer értéke 25 íig/ml-nek adódik.Determined by serial dilution using Tetrahymena pyriformis W as the test microorganism and C-15003 P-3 as the comparator, the titre of the above culture is 25 µg / ml.

2. példa térfogatrész az 1. példában kapott inokulumot egy 2000 térfogatrész méretű, 500 térfogatrész oltó tenyészet táptalajt tartalmazó fermentorba viszünk (a táptalaj az 1. példában megadottal azonos) és 48 órán át 28 °C-on inkubálást végzünk. A kapott tenyészet 500 térfogatrésznyi mennyiségét egy 50 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült tartályba visszük, amely 30 000 térfogatrész oltó tenyészet közeget tartalmaz és a tenyésztést 28 °C-on, levegőztetés mellett (280 fordulat/perc 1/2 DT/) és 1 kg/cm² belső nyomás alatt végezzük. A kapott oltó tenyészetet 200 000 térfogatrész méretű, rozsdamentes acélból készült, 100 000 térfogatrész az 1. példában használthoz hasonló táptalajt tartalmazó fermentorba adjuk 10% inokulációs sebesség mellett. A beoltott táptalajt 28 °C-on inkubáljuk, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc), keverés (200 fordulat/perc), és 1 kg/cm² belső nyomás mellett, 90 órán át. Az 1. példában leírt módszer meghatározva a kapott tenyészet titere 25 pg/ml.Example 2 Volume of inoculum obtained in Example 1 was transferred to a 2000 volume volume of 500 volumes of inoculum culture medium (identical to Example 1) and incubated for 48 hours at 28 ° C. 500 volumes of the resulting culture were transferred to a 50,000 volume stainless steel container containing 30,000 volumes of inoculum culture medium and cultured at 28 ° C under aeration (280 rpm 1/2 DT /) and kg / cm ² internal pressure. The resulting inoculum culture was added to a 200,000 volume stainless steel fermenter containing 100,000 volumes of a culture medium similar to that used in Example 1 at a 10% inoculation rate. The inoculated medium is incubated at 28 ° C with aeration (100,000 volumes / min), agitation (200 rpm), and 1 kg / cm ² internal pressure for 90 hours. As determined by the method described in Example 1, the resulting culture titer was 25 pg / ml.

A kapott 95 000 térfogatrész tenyészethez 2000 súlyrész Hyflo-supercel ®-t (Johnes and Manville Products, USA) adunk és alapos keverés után, az elegyet nyomószűrőn szűgük. 85 000 térfogatrész szűrletet és 32 000 súlyrész nedves sejtet kapunk. A 85 000 térfogatrész szűrletet keveijük és 30 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos rétegeket összegyűjtjük, kétszer 30 000 térfogatrész vízzel mossuk, 500 súlyrész vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk, és csökkentett nyomáson 200 térfogatrész mennyisére koncentráljuk. A ‘ 14 koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (53 súly rész) szűréssel elkülönítjük. Ezt az I. számú nyersterméket elkeverjük 100 térfogátrész etilacetáttal és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. A szűrletet 10 súlyrész szilikagéllel keveijük el (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm) és az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 400 térfogatrész méretű szilikagél oszlop tetejére. Az eluálást 500 térfogatrész hexánnal, 500 térfogatrész 3 : 1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 :1 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész 1 : 3 arányú hexán-etilacetát eleggyel, 500 térfogatrész etilacetáttal és 1000 térfogatrész 50 : 1 arányú etilacetát-metanol eleggyel végezzük, az eluátumokat 100 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtve össze.To the resulting 95,000 volumes of culture, 2,000 parts by weight of Hyflo-supercel ® (Johnes and Manville Products, USA) were added and, after thorough mixing, the mixture was filtered through a pressure filter. 85,000 volumes of filtrate and 32,000 parts by weight of wet cells are obtained. The 85,000 volumes of filtrate were stirred and extracted with 30,000 volumes of ethyl acetate. The procedure is repeated once more. The ethyl acetate layers were collected, washed twice with 30,000 volumes of water, dried with 500 parts by weight of anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to 200 volumes. Petroleum ether was added to concentrate '14 and the resulting precipitate (53 parts by weight) was collected by filtration. This crude product I is mixed with 100 volumes of ethyl acetate and the insolubles are filtered off. The filtrate was mixed with 10 parts by weight of silica gel (Merek, Germany, 0.05-0.2 mm) and the ethyl acetate was removed under reduced pressure. The residue was applied to the top of a 400 volume silica gel column. Elution with 500 volumes of hexane, 500 volumes of 3: 1 hexane-ethyl acetate mixture, 500 volumes of 1: 1 hexane-ethyl acetate mixture, 500 volumes of 1: 3 hexane-ethyl acetate mixture, 500 volumes of ethyl acetate and 1000 volumes of 50: 1 ethyl acetate methanol, collecting the eluates in fractions of 100 volumes.

Minden frakció 1 térfogatrésznyi mennyiségét szárazra pároljuk és 0,1 térfogatrész etilacetátot adunk a koncentrátumhoz. A kapott elegyet egy szilikagél-üveglap (Merek, NSZK, 60F_2S4, 0,25 mm, 20x20) alsó sarkától számítva 2,5 cm-re cseppentjük és egy 19 :1 arányú etilacetát-metanol oldószer rendszerrel futtatva körülbelül 17 cm-re hívjuk elő. Előhívás után a detektálást ultraibolya fénnyel végezzük (hullámhossz: 2537 A).One volume of each fraction was evaporated to dryness and 0.1 volume of ethyl acetate was added to the concentrate. The resulting mixture was dropped to 2.5 cm from the bottom corner of a silica gel glass plate (Merek, Germany, 60F _2S4 , 0.25 mm, 20 x 20) and run to about 17 cm with a 19: 1 ethyl acetate-methanol solvent system. live. After development, detection is performed with ultraviolet light (wavelength: 2537 A).

A 0,58-0,63 Rf-értékű 25-30 frakciókat és a 0,25-0,30 Rf-értékű 38-40 frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson körülbelül 20 térfogatrészre koncentráljuk. A kapott koncentrátumokhoz 150-150 térfogatrész petrolétert adunk, és így 5 súlyrész II. számú nyersterméket és 2 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk.The 25-30 fractions with an Rf of 0.58-0.63 and the 38-40 fractions with an Rf of 0.25-0.30 were collected and concentrated under reduced pressure to about 20 volumes. To the concentrates obtained were added 150-150 volumes of petroleum ether to give 5 parts by weight of II. of crude product and 2 parts by weight of crude maytanzinol.

térfogatrész etilacetátban feloldjuk a fenti II. számú nyerstermék 1,5 súlyrésznyi mennyiségét. majd az oldatot jól elkeverjük 4 súlyrész szilikagéllel (Merek, NSZK, 0,05—0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot fel visszük egy 300 térfogat részes szilikagél oszlop tetejére, és az oszlopot először 500 térfogatrész kloroformmal mossuk, majd 500 térfogatrész 20 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 10 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumokat 25 térfogatrésznyi frakciókba gyűjtjük.Dissolve the reaction mixture in II. 1.5 parts by weight of crude product. then the solution is well mixed with 4 parts by weight of silica gel (Merek, Germany, 0.05-0.2 mm). The ethyl acetate was removed under reduced pressure. The residue was applied to the top of a 300 volume silica gel column and the column was washed first with 500 volumes of chloroform and then eluted with 500 volumes of 20: 1 chloroform: methanol and 10: 1 chloroform: methanol. The eluates were collected in fractions of 25 volumes.

Mindegyik frakció 0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A kapott koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyből vett mintát szilikagél vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk (előhívó rendszer: 9 :1 arányú kloroform-metanol elegy).0.5 volumes of each fraction were concentrated under reduced pressure. To the resulting concentrate was added 0.05 volumes of ethyl acetate and the sample was analyzed by silica gel thin-layer chromatography (developing system: chloroform: methanol = 9: 1).

Az Rf 0,48-0,50 zónában 2537 Λ-nél abszorbeáló 40 és 41 számú frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ily módon 0,05 sulyrész vegyes maytanacin, maytanzinol-propionát kristályt állítva elő.Fractions 40 and 41 absorbing at 2537 Λ in the Rf 0.48-0.50 zone are collected and evaporated to dryness under reduced pressure. To the residue was added 0.5 volumes of ethyl acetate and the mixture was allowed to stand at room temperature to give 0.05 parts by weight of mixed maytanacin, maytanzinol propionate crystals.

A maytanacin és maytanzinol-propionát így kapott elegykristályainak 0,05 súlyrésznyi mennyiségét feloldjuk 5 térfogatrész metanolban, majdThe thus obtained mixed crystals of maytanacin and maytanzinol propionate were dissolved in 0.05 parts by weight of methanol and then

0,1 súlyrész nátriumkloridot és 5 térfogatrész vizet adunk az oldathoz. Egy oszlopot megtöltünk 200 térfogatrész Diaion HP— 10-el (Mitsubishi Kaséi0.1 parts by weight of sodium chloride and 5 volumes of water are added. One column was filled with 200 volumes of Diaion HP-10 (Mitsubishi Kaséi

K. K.) és 600 térfogatrész 50%-os, 5% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz eleggyel mossuk. A fenti oldatból vett mintát átengedjük az oszlopon, ₅ és gradiens technikával eluáljuk, 1500 térfogatrész 60%-os metanol-víz elegyet (amely 5% nátriumkloridot tartalmaz) Ή 1500 térfogatrész 95%-os metanol-víz elegyet használva.KK) and 600 volumes of 50% methanol / water containing 5% sodium chloride. A sample of the above solution was passed through the column, eluted with gradient ₅ and technology, 1500 vol (containing 5% sodium chloride) with 60% methanol-water mixture solution of methanol-water mixture was 95% Ή 1500 vol.

Az eluátumot 15 térfogatrésznyi frankciókban fogjuk fel és valamennyi frakciót megvizsgáljuk vékonyrétegkromatográfiásan. A 13Ő—135 frakciók tartalmazzák a maytanacint és a 138-142 frakciók a maytanzinol-propionátot. 15The eluate was collected in fractions of 15 volumes and all fractions were analyzed by TLC. Fractions 13E-135 contain maytanacin and fractions 138-142 contain maytanzinol propionate. 15

Valamennyi frakciót betöményítjük és 30 ml víz és 50 ml etilacetát hozzáadásával feloldjuk. Az oldatot elválasztó tölcsérben rázzuk és a vizes réteget elválasztjuk és miután kétszer 30 ml vízzel átmos- 20 tűk, az etilacetátos réteget vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk, koncentráljuk és állni hagyjuk. A fenti eljárással valamennyi frakcióból kristályokat kapunk. A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. A maytanacin mennyisége: 0,013 g, 25 míg a maytanzinol-propionát mennyisége: 0,013 g.All fractions were concentrated and dissolved in water (30 mL) and ethyl acetate (50 mL). The solution is shaken in a separatory funnel and the aqueous layer is separated and after washing twice with 30 ml of water, the ethyl acetate layer is dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated and allowed to stand. By the above procedure, crystals were obtained from each fraction. The crystals were collected by filtration and dried. The amount of maytanacin is 0.013 g, while that of maytanzinol propionate is 0.013 g.

térfogatrész etilacetátban feloldunkvolume of ethyl acetate

0,2 súlyrész nyers maytanzinolt, melyet a fenti lépésben kaptunk, és az oldatot jól elkeveijük 30 0,5 súlyrész szilikagéllel (Merek, NSZK, 0,05-0,2 mm). Az etilacetátot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot felvisszük egy 80 térfogatrész szilikagélből álló oszlop tetejére és az oszlopot először 150 térfogatrész kloroformmal 35 mossuk, majd 150 térfogatrész 50 : 1 arányú kloroform-metanol eleggyel és 150 térfogatrész 20:1 arányú kloroform-metanol eleggyel, végül 300 térfogatrész 10:1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 10 térfogatrésznyi frakciók- 40 bán gyűjtjük össze.0.2 parts by weight of crude maytanzinol obtained in the above step and the solution is well mixed with 30 0.5 parts by weight of silica gel (Merek, Germany, 0.05-0.2 mm). The ethyl acetate was removed under reduced pressure. The residue was applied to the top of a column of 80 volumes of silica gel and the column was washed first with 150 volumes of chloroform, then with 150 volumes of 50: 1 chloroform: methanol and 150 volumes of 20: 1 chloroform: methanol and finally 300 volumes of 10: 1. eluted with chloroform-methanol. The eluate was collected in 10 volumes of fractions.

Az egyes frakciók 0,5-0,5 térfogatrésznyi mennyiségét csökkentett nyomáson koncentráljuk. A koncentrátumhoz 0,05 térfogatrész etilacetátot adunk és az elegyet mintaként vékonyrétegkroma- 45 tográfiásan vizsgáljuk, előhívó rendszerként kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyét használva.0.5 to 0.5 volumes of each fraction was concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (0.05 volumes) was added to the concentrate and the mixture was analyzed by thin layer chromatography using chloroform / methanol 9: 1 as developing system.

A 2537 A-nél abszorbeáló 50-52 frakciókat (Rf = 0,33—0,38) összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékhoz 0,5 tér- 50 fogatrész etilacetátot adunk és az elegyet állni hagyjuk. 0,020 súlyrész maytanzinol kristályt kapunk.Fractions 50-52 (Rf = 0.33-0.38) absorbing at 2537 A were collected and evaporated to dryness under reduced pressure. To the residue was added 0.5 volumes of ethyl acetate and the mixture was allowed to stand. 0.020 parts by weight of maytanzinol crystals are obtained.

3. példaExample 3

000 súlyrész a 2. példában kapott sejtet 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel, keverés közben 3 órán át extrahálunk, majd nyomó- 60 szűrőn szűrünk. Az extrahálást 50 000 térfogatrész 70%-os aceton-víz eleggyel még egyszer megismételjük. A szűrleteket összegyűjtjük és az acetont csökkentett nyomáson végzett koncentrálással eltávolítjuk. A kapott vizes rendszert átvezetjük egy 65000 parts by weight of the cell obtained in Example 2 were extracted with 50,000 volumes of 70% acetone / water with stirring for 3 hours and then filtered through a pressure filter. The extraction was repeated once more with 50,000 volumes of 70% acetone / water. The filtrates were collected and the acetone was removed by concentration under reduced pressure. The resulting aqueous system was passed through a 65

5000 térfogatrész Diaion HP—10-et (Mitsubishi Kaséi K. K.) tartalmazó oszlopon. Az oszlopot 20 000 térfogatrész vízzel és 50%-os metanollal mossuk, majd 15 000 térfogatrész 90%-os metanolvíz eleggyel eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson koncentráljuk 3000 térfogatrészre és kirázzuk 3000 térfogatrész vízzel és 3000 térfogatrész etilacetáttal. A fenti eljárást még egyszer megismételjük. Az etilacetátos réteget egyesítjük, vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson 200 térfogatrészre koncentráljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott csapadékot (280 súlyrész) szűréssel elkülönítjük. A fent kapott I. számú nyersterméket szilikagél oszlopon végzett kromatografálással tisztítjuk az 1. példához hasonló módon. 1,0 súlyrész nyers II. számú terméket és 0,5 súlyrész nyers maytanzinolt kapunk.5000 volumes on a column containing Diaion HP-10 (Mitsubishi Kaséi K.K.). The column was washed with 20,000 volumes of water and 50% methanol and then eluted with 15,000 volumes of 90% methanolic water. The eluate was concentrated under reduced pressure to 3,000 volumes and extracted with 3,000 volumes of water and 3,000 volumes of ethyl acetate. The above procedure is repeated once more. The ethyl acetate layer was combined, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to 200 volumes. Light petroleum was added to the concentrate and the resulting precipitate (280 parts by weight) was collected by filtration. The crude product I obtained above is purified by chromatography on a silica gel column in a manner similar to Example 1. 1.0 parts by weight crude II. and 0.5 parts by weight of crude maytanzinol.

4. példaExample 4

1000 térfogatrész a 2. példában kapott tenyészetet egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész űrtartalmú tartályba oltunk, amely 100 000 térfogatrész oltó kultúra táptalajt tartalmaz, és a beoltott táptalajt 28 °C-on, levegőztetés (100 000 térfogatrész/perc) és keverés (200 fordulat/perc) mellett 48 órán át inkubáljuk az oltókultúra előállítása céljából. Ezt az oltókultúrát átvisszük egy rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész méretű tartályba, mely 100 000 térfogatrész az 1. példában leírttal megegyező táptalajt tartalmaz. Az átviteli arány 10%. A tenyésztést 28 °C-on levegőztetés (1 000 000 térfogatrész/min), keverés (120 ford/min) és belső nyomás (1 kg/cm²) mellett 90 órán át végezzük. A kapott tenyészet titerét 20/ig/ml-nek találtuk az 1. példában ismertetett eljárással végezve a kiértékelést. A fenti tenyészet 900 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 900 000 térfogatrész acetont adunk és egy órás keverés után 20 000 súlyrész Hyflo-Supercel-t (Johnes and Mán vilié, USA). Az elegyet tovább keveijük és nyomószú'rőn szüljük. A kapott szűrletet 170 000 térfogatrésznyi mennyiségéhez 500 000 térfogatrész vizet adunk, és az elegyet egy Podbielniak-ban (Podbielniak, Inc. USA) az elegyet 1 000 000 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát hozzáadásával szárítjuk és csökkentett nyomáson koncentráljuk A koncentrátumhoz petrolétert adunk és a kapott precipitátumot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A fenti eljárással 680 súlyrész I. számú nyersterméket kapunk. Ezután, mint a 2. és 3. példákban, ezt a nyersterméket tisztítjuk, amikor 1,1 súlyrész maytanacint,1000 volumes of the culture obtained in Example 2 were inoculated in a stainless steel 200,000 volumes vessel containing 100,000 volumes of inoculum culture medium and the inoculated medium at 28 ° C, aeration (100,000 volumes / min) and mixing ( 200 rpm) for 48 hours to prepare the inoculum culture. This inoculum culture was transferred to a 200,000-volume stainless steel container containing 100,000 volumes of the same medium as described in Example 1. The transmission rate is 10%. Cultivation was performed at 28 ° C with aeration (1,000,000 volumes / min), agitation (120 rpm), and internal pressure (1 kg / cm ² ) for 90 hours. The titer of the resulting culture was found to be 20 µg / ml by the procedure described in Example 1. To 900,000 volumes of the above culture was added 900,000 volumes of acetone and, after stirring for one hour, 20,000 parts by weight of Hyflo-Supercel (Johnes and Mann, USA). The mixture is further stirred and suctioned. To the resulting filtrate was added 500,000 volumes of water to 170,000 volumes and the mixture was extracted with 1,000,000 volumes of ethyl acetate in a Podbielniak (Podbielniak, Inc. USA). The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. To the concentrate was added petroleum ether and the resulting precipitate was collected by filtration and dried. The above procedure gives 680 parts by weight of crude product I. Then, as in Examples 2 and 3, this crude product is purified when 1.1 parts by weight of maytanacin,

2,2 súlyrész maytanzinol-propionátot és 0,1 súlyrész maytanzinolt kapunk.2.2 parts by weight of maytanzinol propionate and 0.1 parts by weight of maytanzinol are obtained.

Claims (1)

Szabadalmi igénypont:Claim: Eljárás maytanzinol, maytanacin és maytanzinol-propionát előállítására, azzal jellemezve, hogy egyProcess for the preparation of maytanzinol, maytanacin and maytanzinol propionate, characterized in that Nocardia C-15003 jelzésű, ATCC 31281 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust asszimilál18 ható szénforrásokat és emészthető nitrogén forrásokat tartalmazó táptalajban, 20—35 °C hőmérsékleten, 7,0kezdeti pH-értéken tenyésztünk, majd az összegyűlt maytanzinolt, maytanac és/vagy maytanzinol-propionátot önmagában isn» módon elkülönítjük.The microorganism Nocardia C-15003 deposited under ATCC 31281 is assimilated in a medium containing 18 active carbon sources and digestible nitrogen sources at a temperature of 20-35 ° C and an initial pH of 7.0, followed by accumulation of maytanzinol, maytanac and / or maytansin in itself isn »not separated.