DE2715255A1 - Anthracyclinglykoside - Google Patents
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Description
MÜLLBR-BORE · DEUFRL · SCHÖN · HERTEL
DR. WOLFGANG MÜLLER-BOR*
(PATENTANWALTVON t*Z7-1»T3)
DR. PAUL OEUFEL. DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHON. DIPL.-CHEM.
WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.
S/be - S/Z 7-2
Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku Kenkyukai,
14-23, 3-chome, Kamiohsaki, Shinagawa-ku, Otakyo,
14-23, 3-chome, Kamiohsaki, Shinagawa-ku, Otakyo,
Japan
Anthracyclinglykoside
709845/0725
β UOKCHBK β· · SIKBEHTSTH. * · POSTFA.CII 8«0780 · KABKI.: IfUKBOFAT · TKL.
<«8t) 4T400S · TXUCX MMIM
Die Erfindung betrifft neue Anthracyclinglykosid-Antitumorantibiotika,
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese Antibiotika enthalten,
insbesondere befaßt sich die Erfindung mit neuen Antitumorantibiotika,
die als MA 144-M1 und MA 144-M2 bezeichnet werden,
mit Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation von MA 144—erzeugenden Stämmen, die zu Streptomyces gehören,
sowie durch die chemische oder enzymatische Umwandlung von Aclacinomycin A oder Cinerubin A, mit Methoden zu ihrer
Gewinnung und Reinigung sowie mit ihrer Anwendung als Cheraotherapeutica
für die Inhibierung von bösartigen Tumoren sowie für die Behandlung von infektiösen Krankheiten, die durch
grampositive. Bakterien erzeugt werden.
In der Kulturbrühe von Streptomyces wurde eine Anzahl von Anthracyclinglykosiden gefunden. Von diesen wurden bereits
Daunomycin und Adriamycin klinisch zur Bekämpfung von menschlichen Krebserkrankungen eingesetzt. Die Erfindung beruht auf
der Erkenntnis, daß insbesondere Anthracyclinglykoside, die von Streptomyces galilaeus MA 144-M1 erzeugt werden, neue Verbindungen
sind, die nach einer Reinigung und Charakterisierung aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften als
Antibiotika erkannt wurden, die als MA 144-M1 und MA 144-M2
bezeichnet werden. Diese Verbindungen besitzen eine wirksame Antitumoraktivität sowie eine geringe Toxizität gegenüber
Tieren. Ferner werden durch die Erfindung reproduzierbare Verfahren und Methoden zu ihrer Herstellung und Reinigung zur
Verfügung gestellt.
Aclacinomycin A wird in der US-PS 3 988 315 sowie von Oki et al in "J. Antibiotics" 28, 830 (1975) beschrieben.
Cinerubin A und Cinerubin B werden in der GB-PS 846 130,
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in der US-PS 3 864 480, sowie von Keller-Schierlein et al, in "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", Seite 68 (1970),
"Chemical Abstracts", 54, 1466 i (1960) sowie in "J. Antibiotics" 28, 830 (1975) beschrieben.
Andere Anthracyclinantibiotika mit Aklavinon— oder £-Pyrromycinonaglykon-Anteilen
werden in folgenden Literaturstellen beschrieben:
(a) Pyrromycin: Chem. Ber. 92, 1904-1909 (1959)
(b) Rutilantin: Biochem. J. 81, 101-104 (1961)
(c) Galirubin A und B: Naturwiss. 52, 539-540 (1965)
Chemical Abstracts 64, 3896 g (1966) Chemical Abstracts 67, 90573 ζ (1967)
(d) Aklavin: J. Bacteriol. 72, 90 (1956)
(e) Requinomycin: J. Antibiotics 25, 393 (1972).
Weitere Erläuterungen zu Anthracyclinantibiotika finden sich in "Index of Antibiotics from Actinomycetes", Hamao Umezawa,
Chefredakteur, University Park Press, State College, Pennsylvania, U.S.A. (1967), wobei die einzelnen Antibiotika an den
nachfolgend angegebenen Stellen näher erläutert werden:
Antibiotikum Seitenzahl Aklavin 111
Cinerubin A 220
Cinerubin B 221
Pyrromyc in 542.
In "Antibiotics", Band 1, Mechanisms of Action, herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York,
Inc., N.Y., N.Y. (1967) wird auf den Seiten 190 - 210 eine
Zusammenfassung von A. DiMarco veröffentlicht, die mit "Daunomycin and Related Antibiotics" betitelt ist.
709846/0 7-2 6
Ferner ist auf "Information Bulletin" Nr. 10, International
Center of Information of Antibiotics, in Zusammenarbeit mit WHO, Dezember 1972, Belgien, betreffend Anthracycline sowie
ihre Derivate, hinzuweisen.
In dieser Veröffentlichung wird auf Seite 25 auf Amicetin hingewiesen (vergleiche auch J. Am. Chem,Soc. 86, 3592 (1964)).
Streptomyces galilaeus wird beispielsweise in "Arch, für
Mikrobiol. 31, 356 (1958) sowie im "International Journal of Systematic Bacteriology", 22, 298 (1972) beschrieben.
Durch die Erfindung werden die Anthracyclinglykosid-Antitumorantibiotika
Ma 144-M^ und MA 144-M2 zur Verfugung gestellt.
Diese Antibiotika können entweder durch Fermentation von MA 144-erzeugenden Stämmen, die zu Streptomyces gehören, oder
durch chemische oder enzymatische Umwandlung von Aclacinomycin A oder Cinerubin A oder Materialien, welche diese Verbindungen
enthalten, hergestellt werden, wobei all diese Verfahren in den Rahmen der Erfindung fallen. Die enzymatische Umwandlung
kann unter Einsatz verschiedener Typen aktiver Enzyme durchgeführt werden. Die chemische Umwandlung kann in Gegenwart verschiedener
Reduktionsmittel ausgeführt werden. Die auf diese Weise erzeugten MA 144-M1 und MA 144-Mp können nach herkömmlichen
Methoden isoliert und gereinigt werden, wie sie zur Isolierung und Reinigung von wasserunlöslichen Antibiotika
angewendet werden. Derartige Methoden bestehen beispielsweise aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung,
einer Konzentration, einer Gelfiltration, einer Gegenstromverteilung,
einer Chelierung mit Metallionen sowie einer Adsorption mit anschließender Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz,
einer adsorbierend wirkenden Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens.
In den Rahmen der Erfindung fallen ferner MA 144-M^, sowie
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MA 144-M2 als rohe Peststoffe, als ihre Salze sowie als DNA-Komplexe,
ferner die Verfahren zur Herstellung der vorstehend angegebenen Materialien, wobei die Lösung, welche MA 144 enthält,
nach der Zugabe wenigstens einer Substanz gefriergetrocknet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Desoxyribonukleinsäure,
Glycerin, Zuckern, Aminosäuren sowie anorganischen oder organischen Säuren besteht.
Durch die Erfindung werden die Antitumorantibiotika MA 144-M^
und MA 144-Mp zur Verfügung gestellt, welche folgende Eigenschaften aufweisen:
(a) antimikrobiell Aktivitäten gegenüber grampositiven- Bakterien
(b) Wirkung bezüglich einer Inhibierung des Wachstums von festen und ascitischen Formen von bösartigen Tumoren in
Säugetieren und
(c) eine höhere Zytotoxizität, so daß das Wachstum von Säugetiertumorzellen
in Kulturen inhibiert wird.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von MA 144-M^ und
MA 144-M2 sind folgende:
MA 144-M1:
Gelbes Pulver mit einem F. von 149 bis 150° C Empirische Formel: C42H55°i5N
Absorptionsmaxima im XJV sowie im sichtbaren Spektrum bei:
229(775), 258(335), 290(128), 432(155) nm in Methanol, 229(815), 259(345), 290(130), 432(160)nm in
0,01nHCl-Methanol und 237(575), 250s(405), 290(125),
323s(80), 526(135).nm in 0,01 η NaOH-Methanol.
MA 144-M2:
Rote Nadelkristalle mit einem F. von 151 bis 152° C. Empirische Formel: C42H55°i6N
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Absorptionsmaxima im UV und im sichtbaren Spektrum bei: 235(600), 259(310), 269(170), 291(105), 492(165) nm in
Methanol, 235(615), 259(325), 269(185), 291(115), 492 (170)nm in 0,01η HCl-Methanol, und 237(505), 269(145),
292(95), 330(55), 554(175), 597(145) nm in 0,01 η NaOH-Methanol.
MA 144-M1 und MA 144-M2 sind in angesäuertem Wasser, Dimethylsulfoxid,
Methylcellosolve, Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Benzol und Toluol löslich, schwachlöslich
in Wasser,Diäthyläther sowie η-Hexan und ergeben eine negative
Ninhydrinreaktion und sind nicht in der Lage, eine Fehling'sche Lösung zu reduzieren.
Durch die Erfindung werden ferner pharmazeutische Zubereitungen
zur Behandlung von Infektionen aufgrund grampositiver Mikroorganismen zur Verfügung gestellt. Ferner werden durch
die Erfindung pharmazeutische Zubereitungen für eine Inhi— bierung von bösartigen Tumoren von Säugetieren geschaffen.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher
erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 <jtLe Absorptionsspektren im UV und im sichtbaren Lichtvon
MA 144-M1 in Methanol ,
Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von MA 144-M1 in
kaliumbromid,
Fig. 3 das NMR-Spektrum von MA 144-M1 In CDCl3(IOO MHz),
Fig. 4 die Absorptionsspektren im UV-Licht sowie im sichtbaren Licht von MA 144-Mp in Methanol,
Fig. 5 das Infrarot-Absorptionsspektrum von MA 144-M2 in
Kaliumbromid,
Fig. 6 das NMR-Spektrum von MA 144-M2 in CDCl3(IOO MHz),
Fig. 7 das Infrarot-Absorptionsspektrum des methylierten Disaccharids,
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Pig. 8 das NMR-Spektrum des methylierten Disaccharide und
Fig. 9 die pH-Kurve der Enzymreaktion zur Bildung von MA 144-M1.
Durch die Erfindung werden zwei neue Anthracyclinantibiotilca, MA 144-M1 und MA 144-M2, zur Verfügung gestellt, die sowohl
eine antimikrobielle Aktivität als auch eine Antitumoraktivi—
tat aufweisen. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Aktivität gegenüber grampositiven. Bakterien,
Inhibieren des Wachstumsvon verschiedenen Säugetiertumoren,
wie beispielsweise die Leukämien L1210 und P388 bei Mäusen, und besitzen eine geringe Toxizität. Daher eignen sich die
Verbindungen als antibakterielle Mittel sowie als Antitumor— mittel.
Unter "MA 144" sind Antibiotika zu verstehen, die wenigstens ein Antibiotikum umfassen, das aus MA 144-M^ und MA 144-M?
besteht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder nach einem
Fermentationsverfahren oder durch chemische oder enzymatische
Reduktion bestimmter bekannter Anthracyclinausgangsmaterialien
hergestellt werden.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Herstellungsmethode wird Aclacinomycin A, Cinerubin A oder eine Mischung davon enzymatisch
in MA 144-M1, MA 144-M2 oder einer Mischung aus diesen
Materialien umgewandelt. Die als Ausgangsmaterialien eingesetzten Anthracycline können in gereinigter Form, als Salze
oder in unreiner Form eingesetzt werden, beispielsweise in
Form von Materialien, welche die Anthracyclinsubsträte enthalten,
beispielsweise in Form von Fermentationsbrühen oder Rohextrakten aus derartigen Brühen.
Die enzymatische Umwandlung geht aus dem folgenden Reaktionsschema hervor:
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- 23 -
OH 0 OH 0
R=H (Aclacinomycin A)
R = OH (Cinerubin A)
R = H (MA R = OH (MA
Das Enzymsystem, das zur Reduktion der Ketogruppe des
Cinerulose-A-Zuckeranteils verwendet wird, kann von bestimmten
Mikroorganismen erhalten werden, die zu dem Genus Strepto—
myces gehören, sowie aus verschiedenen Säugetiergeweben, beispielsweise Geweben von Affen, Hunden, Kaninchen, Hamstern,
Ratten oder Mäusen. Im Falle des Enzyms, das aus Mikroorganismen erhalten wird, können Stämme, die zu Streptonyces gehören,
welche in der Lage sind, MA 144-M^ und MA 144-M2 zu erzeugen
und nachfolgend näher beschrieben werden, ebenfalls in Form einer Kulturbrühe, einer Zellensuspension, getrockneter Zellen,
eines Zellenhomogenats, einer überstehenden Lösung, eines teilweise
gereinigten Enzyms sowie eines daraus erhaltenen imnobilisierten Enzyms verwendet werden. Im Falle des Enzyms, das
aus Säugetieren erhalten wird, kommen verschiedene Säugetierenzymquellen
infrage, wie beispielsweise verschiedene Organe,
Gewebeschnitte, Gewebehomogenate, daraus hergestellte getrocknete Präparate sowie teilweise gereinigte Enzymlösungen, die
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durch Aussalzen, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, Gelfiltration, sowie Chromatographie erhalten werden.
Immobilisierte Enzyme, die aus derartigen Säugetierquellen erhalten werden, sind zur Durchführung dieses Verfahrens
ebenfalls geeignet. Eine äußerst bevorzugte Säugetierquelle für das Umwandlungsenzymsystem ist ein Leberhomogenat, beispielsweise
ein Rattenleberhomogenat.
Die Reaktion zur Umwandlung von Aclacinomycin A in MA 144-M1
oder von Cinerubin A in MA 144-Mp wird unter Einsatz des
Enzymsystems durchgeführt, das aus den vorstehend erwähnten Enzymquellen erhalten worden ist.
Die Bedingungen der Enzymreaktion, wie der pH, die Temperatur, die Substratkonzentration, die Reaktionszeitspanne, das Coenzym
etc., hängen von dem Zustand des Enzyms, dem eingesetzten Ausgangsmaterial etc. ab. Im allgemeinen ist es vorzuziehen,
solche Bedingungen auszuwählen, welche die Enzymreak— tion beschleunigen und nicht das Enzymsystem inaktivieren.
Im allgemeinen sind Temperaturen von 20 bis 42 C, pH-Werte von 5,5 bis 10,5, eine Substratkonzentration unter 5% sowie
eine Reaktionszeitspanne von 20 bis 120 Minuten vorzuziehen.
Die Enzymaktivität in verschiedenen Quellen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, sowie die Anforderungen an das Coenzym
bezüglich der Enzymaktivität in Ratten sind folgende:
Vergleich der Enzymaktivität in den Leberhomogenaten aus verschiedenen Säugetieren
Säugetiere
Meerschweinchen Hamster Affen
| gebildetes MA 144-M1 | Gewebe) |
| ( μΜοΙ/q | 08 |
| o, | 24 |
| o, | 38 |
| o, |
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Maus 0,38
Kaninchen 0,26
Ratte 0,37
Zusammensetzung der Enzymreaktionsmischung
Leberhomogenat (Enzym) 0,8 ml NADP-Lösung (2 jig/ml) 0,1 ml
Substrat: Aclacinomycin A (800 ug/ml) 0,1 ml,
wobei NADP für Nicotinamidadenindinukleotidphosphat steht. Die Reaktion wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei
37° C durchgeführt. Die Bestimmung wird unter Einsatz eines Shimazu-Doppelwellen-Chromatoscanners nach einer Extraktion
des Produkts mit dem Lösungsmittel durchgeführt (Chloroform : Methanol =1 : 1).
Anforderungen an das Coenzym für die Enzymreaktion (Rattenleber)
Coenzym gebildetes MA 144-M^
( juMol/q Gewebe)
Keines
NAD
NADH
NADP
NADPH
NADH
NADP
NADPH
Die Enzymreaktion wird nach der in Tabelle 1 angegebenen Methode durchgeführt. NAD steht für Nicotinamidadenindinukleotid,
NADH für die reduzierte Form von NAD, NADP hat die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 1 und NADPH steht für die reduzierte
Form von NADP.
Die Figur 9 zeigt den optimalen pH bei der enzymatisehen
Bildung von MA 144-M1 durch Rattenleberhomogenat, wobei die
vertikale Linie die ug/Reagenzglas an gebildetem MA 144-M1
zeigt. Die zur Einstellung des pH eingesetzte Pufferlösung
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| 0 | 35 |
| 0 | 37 |
| 0 | |
| o, | |
| o, | |
besteht aus m/10 Veronal/Natriumacetat (durchgehende Linie 1) sowie aus m/10 Glycin/Natriumchlorid/Natriumhydroxid (gestrichelte
Linie 2).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ferner durch chemische Reduktion von Aclacinomycin A und/oder Cinerubin A
mit verschiedenen Reduktionsmitteln hergestellt werden, welche in selektiver V/eise den Cinerulose-A-Zuckeranteil in den
Amicetose-Zuckeranteil von MA 144-M.. und MA 144-Mp zu reduzieren
vermögen. Bevorzugte Reduktionsmittel sind die Metallhydride, wie Natriumborhydrid, Lithiumhydride (beispielsweise
LiH, LiAlH-) sowie Aluminiumhydride (beispielsweise AlH.,) ·
Die erfindungsgemäß"durchgeführte chemische Reduktion kann
entweder in einem einzigen Lösungsmittelsystem oder in einem gemischten Lösungsmittelsystem durchgeführt werden, welches
die erfindungsgemäßen Antibiotika auflöst. Die Reaktionsbe— dingungen, wie beispielsweise die Temperatur, die Substratkonzentration,
die Reaktionsperiode etc., hängen von dem Lösungsmittelsystem, dem Ausgangsmaterial und dergleichen ab,
wobei solche Bedingungen vorzugsweise ausgewählt werden, welche die höchste Ausbeute und die höchste Reaktionsgeschwindigkeit
ergeben.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten chemischen und enzymatischen
Methoden können die MA 144-Antibiotika auch fermentativ durch Züchten unter geeigneten Bedingungen der nachfolgend
näher erläuterten MA 144-erzeugenden Stämme hergestellt werden. Zur fermentativen Erzeugung der erfindungsgemäßen Antibiotika
können MA 144-erzeugende Stämme, die zu dem Genus Streptomyces gehören, verwendet werden, beispielsweise Streptomyces galilaeus
MA 144-M1 ATCC 31133 (FERM P-2455), Streptomyces sp. ME 505-HE1 ATCC 31273 (FERM P-3667), S. galilaeus ATCC 14969,
S. cinereoruber ATCC 19740, S. niveoruber ATCC 14971, S. antibioticus ATCC 8663, S. purpurascens ATCC 25489 sowie Mutanten
davon.
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Von den vorstehend erwähnten Stämmen wurde St. galilaeus MA 144-M1 ATCC 31133 (FERM P-2455) aus einer Bodenprobe
isoliert, die in Osaki, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan gesammelt worden ist. Eine Kultur von St. galilaeus MA 144-M1 wurde
bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland sowie im Fermentation Research Institute, Japan, hinterlegt
und unter der ATCC-Nr. 31133 bzw. FERM-Nr. 2455 registriert.
Der Stamm Nr. MA 144-M1 weist folgende Eigenschaften auf:
(1) Morphologische Eigenschaften:
Unter einem Mikroskop werden offene Spiralen beobachtet, die gut aus verzweigten Substratmyceln entwickelt sind.
Es werden keine Wirtel festgestellt. Die reife Sporenkette ist mäßig lang und weist mehr als 10 Sporen auf.
Die Sporen sind elliptisch und besitzen eine Größe von 0,4 bis 0,8 u χ 0,8 bis 1,6 ju. Ihre Oberfläche ist glatt.
(2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien:
Die Erläuterung in Klammern entspricht dem Farbstandard des "Color Harmony Manual", das von der Container Corporation
of America, U.S.A., veröffentlicht worden 1st.
(a) Auf einem Glukose/Asparagin-Agar, bebrüted bei 27° C:
leicht gelblichbraunes Wachstum (3gc, leicht bernsteinfarben); keine Luftmyceln; kein lösliches Pigment.
(b) Auf einem Rohrzucker/Asparagin-Agar, bebrüted bei 27° C:
farbloses bis leicht gelblichbraunes Wachstum (3gc,leicht
bernsteinfarben); keine Luftmyceln; kein lösliches Pigment.
(c) Auf einem Glycerin/Asparagin-Agar (ISP-Medium Nr. 5), bebrüted bei 27° C: gelblich-oranges (4ic, rotbraunes) bis
braunes (51 g, kakaobraunes) Wachstum; weiße bis hellgraue (2fe, deckgraue) Luftmyceln; braunes lösliches Pigment.
(d) Auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP-Medium Nr. 4), bebrüted bei 27° C: helloranges (3ea,
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leicht melonengelbes) bis hellgelblichbraunes (3ie, karaelfarbenes) Wachstum; leicht graue (2fe, deckgraue)
bis graue (e, graue) Luftmyceln; braunes lösliches Pigment.
(e) Auf einem Tyrosin-Agar (ISP-Medium Nr. 7), bebrüted
bei 27° C: bräunlichgraue (31i, bibergraue) bis braune (41g, toastfarbene) Luftmyceln, schwarzes lösliches Pigment.
(f) Auf einem Nähragar, bebrüted bei 27° C: Farbloses bis gräulich-braunes Wachstum; keine Luftmyceln,
braunes lösliches Pigment·
(g) Auf einem Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar (ISP-Medium
Nr. 2), bebrüted bei 27° C: leicht braunes (41e, ahornfarbenes) bis braunes (4ng, leicht braunes) Wachstum;
leicht graue (3fe, silbergraue) bis graue (3ih, beigegraue) Luftmyceln; braunes lösliches Pigment.
(h) Auf einem Hafermehl-Agar (ISP-Medium Nr. 3), bebrüted
bei 27° C: farbloses bis hellgelblichbraunes (2gc, bambusfarbenes) Wachstum; leicht graue (3fe, silbergraue) Luftmyceln;
braunes lösliches Pigment.
(i) Auf einem Glycerin/Nitrat-Agar, bebrüted bei 27° C:
farbloses bis hellgelblichbraunes (3gc, leicht bernsteinfarbenes) oder leicht olivgraues (2db, pergamentfarbenes)
Wachstum; keine Luftmyceln; kein lösliches Pigment, (j) Auf einem Stärkeagar, bebrüted bei 27° C: hellgelblichbraunes
(3gc, leicht bernsteinfarbenes) Wachstum; graue (e, graue) Luftmyceln; leicht braunes lösliches Pigment,
(k) Auf einem CalciummaPt-Agar, bebrüted bei 27° C:
farbloses Wachstum; gräulichweiße (b, hellgraue) bis leicht bräunlichgraue (3dc, naturfarbene) Luftmyceln; kein lösliches
Pigment.
(1) Auf einem Gelatine-Ansatz, bebrüted bei 20° C: hellbraunes bis hellgelblichbraunes Wachstum; weiße Luftmyceln;
braunes lösliches Pigment, (m) Auf einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz, bebrüted
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bei 27° C: hellbraunes bis braunes Wachstum; keine Luftmyceln;
braunes lösliches Pigment.
(n) Auf Magermilch, bebrüted bei 37° C: hellbraunes bis braunes Wachstum; keine Luftmyceln; braunes lösliches
Pigment.
(3) Physiologische Eigenschaften:
(3) Physiologische Eigenschaften:
(a) Die Wachstumstemperatur wurde auf einem Maltose/Hefeextrakt-Agar
(1,0% Maltose, 0,4% Hefeextrakt, 3,5% Agar, pH 6,0) bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50° C,untersucht. Die
optimale Temperatur für das Wachstum liegt bei 27 bis 37°C. Bei 50° C wird kein Wachstum festgestellt.
(b) Gelatineverflüssigung auf einem 15% gelatineenthaltenden Ansatz bei 20° C sowie auf einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz
bei 27° C: Auf dem ersteren Medium wird bei 14tägiger Bebrütung eine schwache Verflüssigung und auf
dem letzteren Medium eine schwache oder mäßige Verflüssigung nach einer 7 Tage dauernden Bebrütung festgestellt.
(c) Stärkehydrolys auf einem Agar aus Stärke und anorganischen
Salzen bei 27° C: Es wird eine schwache Hydrolyse nach 5tägiger Bebrütung festgestellt.
(d) Peptonisierung und Koagulierung von Magermilch bei 37° C: Eine mäßige bis starke Peptonisierung beginnt
5 Tage nach der Bebrütung und ist nach ungefähr 17 Tagen beendet. Keine Koagulation.
(e) Melanin-Bildung auf Tyrosin-Agar (ISP-Medium Nr. 7), Tyrosin/Hefeextrakt-Brühe (ISP-Medium Nr. 1) und Pepton/
Hefeextrakt/Eisen(II)-Agar(ISP-Medium Nr. 6)bei 27° C:
Positiv auf allen Medien.
(f) Verflüssigung von Calciummalat auf Calciummalat-Agar
bei 27° C: Stark positiv.
(g) Nitratreduktion auf Pepton-Agar, das 1,0% Natriumnitrat enthält, (ISP-Medium Nr. 8) bei 27° C: Positiv.
(h) Verbrauch von Kohlehydraten des Pridham-Gottlieb-Grundmediums
(ISP-Medium Nr. 9), bebrüted bei 27° C: Reichliches Wachstum mit L-Arabinose, D-Xylose, Glukose,
D-Pruktose, Rohrzucker, Inosit, L-Rhamnose und Raffinose;
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- 30 kein Wachstum mit D-Mannit.
Die vorstehend beschriebenen Eigenschaften von Nr. MA 144—M^
zusammenfassend ist festzustellen, daß der Stamm zu dem Genus Streptomyces gehört und ein chromogener Typ ist. Er erzeugt
ein braunes lösliches Pigment auf verschiedenen Agar-Medien. Luftmyceln bilden offene Spiralen, jedoch keine Wirtel. Die
Sporenoberfläche ist glatt. Das Wachstum auf verschiedenen Medien ist im allgemeinen hellgelblichbraun bis braun, in
einigen Medien jedoch olivfarben. Die Luftmyceln sind leicht grau. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die proteolytische
Wirkung ist schwach bis mäßig und die Stärkehydrolyse relativ schwach. Melanin wird auf Tyrosin-Agar, Tyrosin/Hefeextrakt-Brühe
sowie Pepton/Hefeextrakt/Eisen(II)-Agar erzeugt.
Von den bekannten Species von Streptomyces ähnelt der Stamm Nr. MA 144-M,. Streptomyces galilaeus.
Hinweis Nr. 1: Archiv für Mikrobiologie, 31, 356, (1958). Hinweis Nr. 2: International Journal of Systematic Bacteriology
22, 298 (1972). Unter besonderer Berücksichtigung der Unterschiede der Morphologie, der Farbe der Luftmyceln sowie der
anderen physikalischen Eigenschaften wurde der Unterschied zwischen dem erfindungsgemäßen Stamm und dem erhaltenen Standardstamm
von S. galilaeus ISP 5481 in parallelen Kulturen untersucht.
Aus den Ergebnissen geht hervor, daß der erfindungsgemäße Stamm bezüglich der Morphologie sowie der Farbe des Wachstums
sowie der Myceln auf verschiedenen Medien und der physiologischen Eigenschaften weitgehend mit S. galilaeus ISP 5481
übereinstimmt. Ferner existiert eine Ähnlichkeit beider Stämme bezüglich der Fermentationsprodukte, d. h. bezüglich Cinerubin,
das von S. galilaeus erzeugt werden kann und eines der Nebenprodukte des erfindungsgemäßen Stammes ist. Daher kann der
Stamm Nr. MA 144-M1 als Streptomyces galilaeus identifiziert
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werden.
Der Stamm Streptomyces sp. ME 505-HE1 FERM P-3667 wurde
ebenfalls von einer Bodenprobe isoliert, die bei Osaki, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan isoliert und in dem Fermentation
Research Institute, Japan sowie in der American Type Culture Collection hinterlegt worden ist und die Nummern FERM P-3667
bzw. ATCC 31273 erhalten hat. Nachfolgend werden die morphologischen und physikalischen Eigenschaften kurz erläutert:
Charakteristische Eigenschaften von Streptomyces sp. ME 505-HEl werden derzeit untersucht. Von dem Stamm Nr. ME 505-HE1
sind derzeit folgende Eigenschaften bekannt: Unter dem Mikroskop weisen die Luftmyceln keine wirtelige Verzweigung und
Spiralenstruktur auf. Das Wachstum auf den verschiedenen Medien ist farblos, hellrötlichbraun bis dunkelbräunlichpurpur. Es
werden keine Luftmyceln gebildet oder nur geringfügig gebildet, die weiß bis rosaweiß sind. In geringem Ausmaße wird
ein mattrotes lösliches Pigment gebildet. Die Melaninbildung ist positiv. Daher gehört der Stamm Nr. 505-HE1 zu dem Genus
Streptomyces.
Im Gegensatz zu den kürzlich isolierten Stämmen können andere bekannte Streptomyces, wie S. galilaeus ATCC 14969, S.
cinereoruber ATCC 19740, S. niveoruber ATCC 14971, S. antibioticus ATCC 8663, S. purpurascens ATCC 25489 sowie Mutanten
davon zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden.
Da die Streptomyces leicht natürlich oder künstlich mutierbar sind, umfassen S. galilaeus Nr. MA 144-M^ sowie andere Mikroorganismen
gemäß vorliegender Erfindung den vorstehend beschriebenen Stamm sowie alle natürlichen und künstlichen Varianten
und Mutanten davon. Insbesondere sollen MA 144-erzeugende Mutanten infrage kommen, die aus den vorstehend erwähnten
Stämmen nach bekannten Methoden erzeugt werden.
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Was die fermentative Erzeugung von MA 144-M,. und MA 144—M?
betrifft, so ist eine aerobe Sübmerskultur besonders vorteilhaft zur Herstellung großer Mengen der Antibiotika. Medien,
die aus bekannten Arten von Nährquellen für Strahlenpilze bestehen, sind geeignet. Die allgemeinen Methoden, wie sie
zum Züchten von anderen Strahlenpilzen angewendet werden, sind auf das erfindungsgemäße Züchten anwendbar. Das Medium enthält
vorzugsweise im Handel erhältliche Produkte, wie Glycerin, Glukose, Stärke, Dextrin, Maltose, Melassen, Öle, Fette,
Lipide oder dergleichen als Kohlenstoffquellen in entweder reiner oder roher Form, ferner im Handel erhältliche Produkte,
wie Sojabohnenmehl, Malzextrakt, Penton, Hefeextrakt, Schlempe, Fischmehl, Glutenmehl, Maisflüssigkeit, Baumwollsamenmehl,
Kasein, hydrolisierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff oder dergleichen als Stickstoffquellen, anorganische
Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat sowie Spurenmengen
an Schwermetallsalzen, wie Kupfer, Zink, Mangan, Eisen oder
dergleichen. Im Falle einer belüfteten Submerskultur wird ein Antischäumungsmittel, wie flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl,
Fett oder Silicon verwendet. Man kann jede Fermentationstemperatur innerhalb eines Bereiches von 20 bis 35° C einsetzen,
innerhalb dessen ein MA 144-erzeugender Organismus zu wachsen vermag, wobei jedoch der bevorzugte Temperaturbereich zwischen
25 und 30° C variiert. Der pH des Kulturmediums schwankt zwischen 5,0 und 8,0. Die Zeitspanne, die für die Herstellung
notwendig ist, beträgt gewöhnlich 48 bis 72 Stunden.
Zur Isolierung von MA 144-M^ oder MA 144-M2 aus der Reaktionsmischung oder der Kulturbrühe wird die folgende Methode als
Beispiel angeführt:
Nach Beendigung der Enzymreaktion wird MA 144-M^ oder MA 144-M-in
die Reaktionsmischung mit organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser nicht mischbar sind, extrahiert, beispielsweise
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Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Benzol, n-Butanol,
Methylpropylketon, Methylenchlorid, Toluol etc., und zwar
in einem neutralen bis schwachsauren Zustand. Anstelle der Lösungsmittelextraktion der Reaktionsmischung oder zusätzlich
zu dieser bietet eine Chromatographie unter Einsatz von Aktivkohle, Aluminiumoxid, Silicagel, Sephadex LH-20 (Warenzeichen
Pharmacia Fine Chemicals AB) etc. sowie eine Gegenstromverteilung
unter Einsatz eines geeigneten Lösungsmittelsystems eine bequemere Methode zur Wiedergewinnung und Reinigung von
MA 144-M^ oder MA 144-Mp. Lösungsmittelextrakte, welche die
genannte Verbindung enthalten, werden direkt oder nach einer Konzentrierung unter vermindertenDruck mit organischen Lösungsmitteln,
die mit Wasser nicht mischbar sind, rückextrahiert, wobei die Lösungsmittel schicht, die MA 144-M-1 oder MA 144-M-enthält,
mit saurem Wasser vermischt wird, bis der pH unter 3,0 liegt. Dann werden MA 144-M1 oder MA 144-M2, die in eine
saure wässerige Schicht überführt worden sind, mit geeigneten organischen Lösungsmitteln rückextrahiert. Die aktive Substanz
wird als rohes pigmentiertes Pulver durch Konzentrieren unter vermindertem Druck bis zur Trockne aus der organischen Lösung
erhalten. Durch Wiederholung dieser Methoden können die Verbindungen in reiner Form erhalten werden.
Nach einer Zugabe von Wasser zu der chemischen Reaktionsmischung wird immer MA 144-M1 oder MA 144-M2 nach den vorstehend beschriebenen
Methoden extrahiert, gereinigt und als rohes Pulver erhalten. Die Lösung, welche MA 144-M1 oder MA 144-M2 enthält,
kann ferner allein oder wenigstens mit einer Substanz gefriergetrocknet werden, die aus einem Serum, Serumalbumin, Globulin,
Gelatine, Glycerin, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure oder einer organischen oder anorganischen Säure, wie Chlorwasser
stoff säure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure
oder Pantothensäure, besteht. MA 144-M1 oder MA 144-M2
in der Fermentationsbrühe werden nach den gleichen Reinigungs-
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methoden erhalten, wie sie vorstehend in Zusammenhang mit der Enzymreaktionsmischung beschrieben worden sind.
Zur Gewinnung von reinem MA 144-M,. oder MA 144-M? kann eine
weitere Reinigung durch Säulenchromatographie unter Einsatz verschiedener Adsorbentien, wie Kieselsäure, Aluminiumoxid,
Sephadex LH-20 (Warenzeichen, Pharmacia Fine Chemicals AB), Ionenaustauschern wie schwachsauren Harzen, Amberlite XAD
(Warenzeichen, Rohm and Haas, Co., Inc.) sowie Aktivkohle, Gelfiltration, Chelierung mit verschiedenen Metallen oder
durch eine Kombination aus verschiedenen Methoden durchgeführt werden, die aus einer Chelierung mit Metallionen, Lösungsmittelausfällung,
Lösungsmittelextraktion, Gegenstromverteilung, Chromatographie, Konzentration, Adsorption an einem
Adsorbens sowie einer Adsorption mit anschließender Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden
Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens bestehen, wobei diese Methoden in herkömmlicher Weise durchgeführt werden und
nachfolgend in den Beispielen näher erläutert werden.
Nachfolgend werden physikalisch-chemische Eigenschaften von reinem MA 144-M-1 und MA 144-M- angegeben:
MA 144-M1
Schwachbasisches, lipophiles und gelbes Pulver. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte:
Gefunden: Berechnet:
C = 62,37 C = 61,98
H = 7,08 H = 6,81
0 = 28,81 0 = 29,49
N = 2,07 N = 1,72
Molekulargewicht = 814 für c 42H55°i5N·
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Der Schmelzpunkt und die spezifische Drehung (C&3 D seiner
l%igen Lösung in Chloroform)zeigt einen Wert von 149 bis 150°
bzw. +40°. Seine Absorptionsspektren im UV sowie im sichtbaren Bereich in Methanol zeigen Maxima bei folgenden Wellenlängen
(Fig. 1):
max < El% cm >
in MeOH 229(775),258(335),290(128),432(155)
in 0,01 η HCl-MeOH 229(815),259(345),290(130),432(160) in 0,01 η NaOH-MeOH 237(575),250s(405),290(125),323g
(80),526(135)
s : Schulter
In Fig. 1 zeigt die durchgehende Linie die UVr-Absorptionsspektren
sowie die Absorptionsspektren im sichtbaren Licht, während die gestrichelte Linie diejenige in 0,01 η HCl-Methanol ist.
Die x-x-x Linie ist diejenige in 0,01 η NaOH-Methanol.
Die Fig. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Tablette).
Fig. 3 zeigt das NMR-Spektrum (100 MHz, CDCl3).
MA 144-M^ ist löslich in saurem Wasser, Dimethylsulfoxid,
Methylcellosolve, Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Benzol und Toluol und leicht löslich in Wasser
Diäthyläther und η-Hexan. Demgegenüber ist das Hydrochloridsalz
löslich in Wasser, Methanol sowie Chloroform, jedoch nur wenig löslich in Aceton und Äthylacetat. Die Methanollösung
von MA 144-M1 ist gelb in konzentrierter HCl, schlägt jedoch
in rötlichbraun in konzentrierter Schwefelsäure um. Mit alkoholischem Magnesiumacetat zeigt die Lösung eine rote Farbe
und schlägt bei der Alkalinisierung in rötlich-purpur um. MA 144-M1 zeigt eine negative Ninhydrin-Reaktion und reduziert
nicht Fehling'sche Lösung.
MA 144-M2
Schwachbasische, lipophile und rote Nadelkristalle. Die Elemen-
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taranalyse ergibt die folgenden Werte: Gefunden: Berechnet:
C = 60,43 C = 60,79
H = 6,74 H = 6,68
O = 29,70 O = 30,84
N = 1,75 N = 1,69
Molekulargewicht =830 für C42 H55°i6N·
Der Schmelzpunkt beträgt 151 bis 152° C und die spezifische Drehung ([oCJd der l%igen Lösung in Chloroform) zeigt einen
Wert von +127° . Die Absorptionsspektren im UV sowie in den sichtbaren Bereichen zeigen Maxima bei folgenden Wellenlängen
(Fig. 4):
max 1 cm
in MeOH 235(600),259(310),269(170),291(105),
492(165).
in 0,01 η HCl-MeOH 235(615),259(325),269(185),291(115),
492(170).
in 0,01 η NaOH-MeOH 237(505),269(145),292(95), 330(55),
554(175),597(145).
In Fig. 4 zeigt die ausgezogene Linie die Spektren im UV sowie im sichtbaren Licht in Methanol, während die gestrichelte
Linie diejenige in 0,01 η HCl-Methanol und die χ - χ - χ
Linie diejenige in 0,01 η NaOH-Methanol ist.
Die Fig. 5 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr Tablette) und die Fig. 6 das NMR-Spektrum (100 MHz, CDCl3).
MA 144-M2 ist löslich in saurem Wasser, Dimethylsulfoxid,
Methylcellosolve, Chloroform, Äthylacetat, Methanol, Äthanol,
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Aceton, Benzol sowie geringlöslich in V/asser, η-Hexan, Cyclohexan,
Diäthyläther sowie Petroläther. Das Hydrochloridsalz ist löslich in Wasser, Methanol, Äthanol und Chloroform, jedoch
gering.löslich in Aceton und Äthylacetat. MA 144-M2 zeigt eine
negative Ninhydrinreaktion und vermag Fehling'sehe Lösung nicht
zu reduzieren.
Die Methanollösung ist rot in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure
und schlägt in violett in konzentrierter Schwefelsäure
um. Die Lösung erscheint in alkoholischem Magnesiumacetat rötlich-purpur
und zeigt ein purpurnes Blau in einer NaOH-Lösung.
Die chemische Struktur der Verbindungen MA 144-M1 und MA 144-M2
wird wie folgt bestimmt:
Bei der Hydrolyse von MA 144-M1 oder MA 144-M2 mit verdünnter
Chlorwasserstoffsäure fallen die physikalisch-chemischen Eigenschaften,
wie die Absorptionsspektren im UV, im sichtbaren sowie im Infrarotbereich, die Massenresonanz sowie die kernmagnetische
Resonanz, der Schmelzpunkt, die Elementaranalyse sowie die Rf-Werte bei der Durchführung einer Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie
des erhaltenen Aglyconteils vollständig mit den entsprechenden Parametern des Aglycons überein, die aus dem Ausgang
smaterial erhalten werden, d. h. das Aglycon von MA 144-M1
besteht aus Aklavinon und dasjenige von MA 144-M? aus ß'-Pyrromycinon.
Vergleicht man andererseits die Rf-Werte bei der Durchführung
einer Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie der Zuckeranteile, die durch Hydrolyse aus dem Ausgangsmaterial (Aclacinomycin A
oder Cinerubin A) erhalten werden, mit denjenigen der erfindungsgemäßen
Verbindungen, dann stellt man Rhodosamin und 2-Desoxy—
fucose fest, wobei jedoch der endständige Zucker, d.h. L-Cinerulose,
unterschiedlich ist. Das methylierte Disaccharid, das aus MA 144-M1 und MA 144-M2 durch partielle Methanolyse
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in Methanol erhalten wird, welches bei Zimmertemperatur 0,1 η
Chlorwasserstoffsäure enthält, wird mit Äther extrahiert, mit Kieselsäure- sowie Sephadex LH-20 (V7arenzeichen) Säulenchromatographie
gereinigt und anschließend in Form von weißen Kri— stallplatten in Äther kristallisiert.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses methylierten
Disaccharids sind wie folgt:
Gefunden: Berechnet:
C = 57,09 C = 56,51
H = 8,61 H = 8,75
0 = 34,30 0 = 34,74
für C13H24O6
Molekülargewicht = 276
Schmelzpunkt: 87 bis 91° C (Sublinationspunkt)
Spezifische Drehung: ^0Qn =-151° (c = 1,0, Chloroform).
Die Absorptionsspektren im UV sowie im sichtbaren Bereich des methylierten Disaccharids zeigen eine Endabsorption. Die
Infrarotabsorntion sowie die NMR-Spektren gehen aus den Fig.7
bzw- 8 hervor. Aus den vorstehend analysierten Ergebnissen geht hervor, daß die Struktur des Methyldisaccharids wie
folgt ist:
Hethylcisaccharide, die aus MA 144-M1 und MA 144-M2 erhalten
worden sind, sind bezüglich ihrer physikalisch-chemischen
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Eigenschaften miteinander identisch
Bei der Methanolyse von KA 144-M. und MA 144-M2 konnten
1-Desoxypyrromycin bzw. Pyrromycin auf der Basis der Elementaranalyse,
der Absorptionsspektren im Infrarotbereich, UV-Bereich sowie im sichtbaren Bereich, des NMR-Spektrums, des
Schmelzpunktes sowie der Rf-Vierte bei der Durchführung einer Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden.
Aus den vorstehend erwähnten Ergebnissen wurden die Strukturen der erfindungsgernäften Verbindungen MA 144-I-K und MA
wie folgt bestimmt:
COOCH1
OH 0 OH 0
HO
DA O ι
rcH3 N0H
MA 144-M1
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- 40 -
COOCH3
OH 0 OH O
MA 144-M2
Es ist eine Anzahl von Anthracyclinglykosid-Antibiotika mit
Aklavinon und fi-Pyrromycinonaglycon-Anteilen bekannt. Die
Verbindungen MA 144-M1 und MA 144-M- unterscheiden sich jedoch
deutlich von diesen Antibiotika im Hinblick auf die Molekülformel,
die Abbauprodukte bei der sauren Hydrolyse, die UV-Absorptionsspektren, Absorptionsspektren im sichtbaren Bereich,
Infrarot-Absorptionsspektren sowie NKR-Absorptionsspektren oder
dergleichen, wie vorstehend ausgeführt worden ist. Wie weiter oben dargelegt worden ist, unterscheiden sich MA 144-M^ und
FtA 144-M- von ihren Ausaangsmaterialien Aclacinomycin A und
Cinerubin A bezüglich ihres endständigen Zuckers (vergleiche:
1. The Journal of Antibiotics 28 Nr. 10: 830 - 834 (1975).
2. Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 68-77 (1970)).
Amicetose, welche der endständige Zucker der erfindungsgem-ißen
Verbindungen ist, wurde nur in dem Antibiotikum Amicetin identifiziert
(vergleiche: J. Am. Chern. Soc. 86: 3592-3594 (1964)).
Unter den Rhodomycin-Antibiotika existiert ein Antibiotikum
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mit einem ähnlichen Zuckeranteil, und zwar Rhodosamin-2-desoxyfucose-rhodinose,
diese Verbindung ist jedoch deutlich von MA 144-M1 und MA 144-Mp bezüglich seines Aglycons sowie
seines endständigen Zuckers verschieden (vergleiche: Pharmazie 27: 782-789 (1972)).
Daraus geht hervor, daß MA 144-M1 und MA 144-Mp neue Substanzen
sind.
Um die Eigenschaften von MA 144-M1 und MA 144-Mp weiter aufzuklären,
werden nachfolgend die Rf-Werte angegeben, die bei einer Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie unter Einsatz
verschiedener Lösungmittelsysteme erhalten worden sind:
Lösungsmittelsystem
| Rf-Werte | MA 144-M2 |
| MA 144-M1 | 0,45 |
| 0,45 | 0,11 |
| 0,11 | 0,28 |
| 0,38 | 0,024 |
| 0,024 | |
1. Chloroform : Methanol = 10:1
2. Chloroform : Methanol = 20:1
3. Aceton
4. Äthylacetat
Die biologischen Aktivitäten von MA 144-M1 und MA 144-M2
sind wie folgt:
1. MA 144-M1 und MA 144-M2 weisen eine antimikrobielle Aktivität
gegenüber verschiedenen Arten von Mikroorganismen auf. Die minimale inhibierende Konzentration der erfindungsgemäßen
Verbindungen, die durch die Methode der verdünnten Brühe ermittelt wird, geht aus der Tabelle 3 hervor.
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Minimale Inhibierungskonzentration (MIC, pg/ml)
von MA 144-M1 und MA
Testorganismus
Staph.aureus Staph.aureus
Bac.subtilis Bac.cereus Bac.megaterium
Sarcina lutea Mic.flavus Cory.bovis Ps.fluorescens
Proteus morganii
Mycobact.smegmatis Strept.pyogenes
Can.tropicalis Can.albicans
| MA 144-M. | 2,5 | 1 MA 144-M2 | |
| FDA 209P | 3,1 | 1,25 | 0,78 |
| Smith | 0,2 | >100 | 0,1 |
| ATCC 6633 | 0,4 | 100 | 0,05 |
| ATCC 9634 | 0,78 | 0,05 | |
| NRRL B-938 | 3,1 | 0,78 | |
| ATCC 341 | 0,05 | 0,05 | |
| 0,2 | 0,2 | ||
| 0,4 | 0,1 | ||
| NIH JB-254 >100 (the Institute for Infectious DiseasesMOO |
>100 ^100 |
||
| ATCC 607 | 1,25 | ||
| NY 5 | 0,63 | ||
| IAM 4942 | 100 | ||
| IAM 4905 | 50 |
Wie vorstehend angegeben wurde, zeigen MA 144-M^ und MA
eine antimikrobielle Aktivität gegenüber grampositiven. Bakterien,
so daß sie therapeutisch zur Bekämpfung von Diphterie, Tuberkulose, Lungenentzündung, Tetanus, Infektionskrankheiten, die
durch Staphylococcus sowie Streptococcus verursacht werden, sowie zur Bekämpfung von weiteren Krankheiten geeignet sind.
(2) MA 144-M. und MA 144-Mp zeigen ferner eine ausgeprägte
Antitumoraktivität bei geringer Toxizität und lassen sich daher in wirksamer Weise pharmazeutisch als Antikrebsmittel einsetzen.
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(a) Therapeutische Wirkung gegenüber von mit L1210-befallenen Mäusen
| Dosierung | Verlängerung der Uberlebensae | MA 144-M2 |
| (mg/kg/Tag) | MA 144-M1 | — |
| 10 | 90 | 46 |
| 5 | 200 | 85 |
| 2,5 | 192 | 200 |
| 1,25 | 137 | 192 |
| 0,625 | 123 | 144 |
| 0,313 | 110 | 116 |
| 0,156 | 110 |
CDF..-L1210. Der Wirkstoff wurde intraperitoneal vom Tag
0 bis zum Tag 10 verabreicht.
(b) Therapeutische Wirkung gegenüber von mit P388-befallenen Mäusen
| Dosierung | Verlängerung | der Überlebensze |
| (mg/kg/Tag) | MA 144-M1 | MA 144-M2 |
| 5 | 100 | 57 |
| 2,5 | 184 | 83 |
| 1,25 | 149 | 206 |
| 0,625 | 135 | 148 |
| 0,313 | 110 | 125 |
CDF..-P388. Der Wirkstoff wurde intraperitoneal vom Tag
1 bis zum Tag 9 verabreicht.
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(c) Therapeutische Wirkung gegenüber einem festen Tumor
(Sarcoma 180)
Dosierung Gewicht des Tumors (g) % Inhibierung des Tumor-
Dosierung Gewicht des Tumors (g) % Inhibierung des Tumor-
| (mg/kg/Tag) | MA 144-M1 | MA 144-M2 | MA 144-M1 | MA 144-M2 | _ |
| 5 | 0,38 | toxi sch | 77,4 | ||
| 2,5 | 0,65 | 0,28 | 61,3 | 83,3 | |
| 1,25 | 0,81 | 0,39 | 51,9 | 76,8 | |
| 0,6 | 0,78 | 0,90 | 53,7 | 46,5 | |
| 0,3 | 1,25 | .1,4I- | 25,5 | 16 | |
| Vergleich | 1,68 | — | 0 |
dd-Mäuse wurden mit 2 χ 10 Sarcoma 180-Zellen beimpft,
worauf der Wirkstoff intraperitoneal vom Tag 1 bis zum Tag 10 verabreicht wurde.
(3) Akute Toxizität
Die LD-Q -Werte von MA 144-M^ und MA 144-Mp gehen aus der
folgenden Tabelle hervor:
| LD50 (mg/kg) | 144-M2 | |
| Verabreichungsart | MA 144-M1 MA | 12,5 |
| i.p. | 35 | 12-20 |
| i.v. | 30-35 | 10-15 |
| i.p. | 25-30 | 10-15 |
| i.V. | 25-30 | |
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(4) Zytotoxizität
MA 144-M1 und MA 144-Mp inhibieren das Wachstum von Säugetiertumorzellen
in Kulturen, insbesondere bei geringer Konzentration, wobei vollständig eine RNA-Synthese inhibiert
wird. Zur Durchführung dieses Experiments werden L1210-Zellen in ein RPMI 1640-Medium (Nissui1, Roswell Park Memorial Institute
1640) eingeimpft, das 10% Kalbserum enthält, wobei bei 37° C während einer Zeitspanne von 3 Tagen in einem COp-Inkubator
gezüchtet wird. MA 144-M1 und MA 144-M2 sowie 14C-Vorläufer
werden in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die Wirkungen auf die Synthese von Protein, RNA und DNA geben
sich durch die 50%ige Inhibierungskonzentration (jug/ml) zu
erkennen, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß MA 144-M1 und MA 144-M- merklich
das Wachstum von gezüchteten L1210-Zellen sowie die RNA-Synthese bei niedriger Konzentration inhibieren. Diese Ergebnisse
stützen die Ergebnisse bezüglich der therapeutischen Wirksamkeit bei der Bekämpfung von Versuchstiertumoren.
Wirkungen von MA 144-M1 und MA 144-Mp auf das Wachstum sowie
die makromolekulare Synthese in gezüchteten Ll210-Zellen.
| 0 | ID50 | (jug/ml) | 05 | |
| MA | 1 | 144-M1 | 0 | |
| 0 | ,12 | MA 144-M | 5 | |
| *10 | ,7 | o, | ||
| ,7 | 1, | |||
| o, | ||||
| _ |
L1210-Zellen
Wachstum
DNA-Synthese
RNA-Synthese
Proteinsynthese
Wachstum
DNA-Synthese
RNA-Synthese
Proteinsynthese
*% Inhibierung bei einer Konzentration von 10 jjg/ml.
Wie vorstehend erwähnt wurde, zeigen die Verbindungen MA 144-M.
und MA 144-M2 eine ausgeprägte inhibierende Wirkung gegenüber
bösartigen Säugetiertumoren, insbesondere gegenüber ascitischen
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sowie festen Tumoren und Leukämien. Die Verbindungen MA 144-M1
oder MA 144-Mj, ihre Salze oder Komplexe können daher als
therapeutische Mittel gegenüber bösartigen,festen sowie ascitischen
Tumoren eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden nichttoxische Säureadditionssalze
mit einer Vielzahl von organischen und anorganischen salzbildenden Reagenzien sowie nichttoxische Komplexe
mit Nukleinsäuren. Die Säureadditionssalze, die mit derartigen pharmazeutisch verträglichen organischen oder anorganischen
Säuren, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Propionsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Zitronensäure,
Bernsteinsäure, Weinsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure etc., gebildet werden, können daher in der gleichen Weise
wie die MA 144-Verbindungen als solche eingesetzt werden. Diese Salze werden nach Methoden gebildet, isoliert, gereinigt
und formuliert, wie sie im allgemeinen zur Salzbildung von Antibiotika eingesetzt werden. Beispielsweise werden das gewählte
Antibiotikum sowie die beabsichtigte Säure getrennt in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst, das eine geringe Löslichkeit
gegenüber Salzen aufweist, beispielsweise Äthyläther und Aceton oder Mischungen davon, worauf die Lösungen vermischt
werden. Die Lösung wird dann erforderlichenfalls konzentriert und abgekühlt, wobei die Kristalle des Säureadditionssalzes
erhalten werden, die zur Gewinnung eines kristallinen Pulvers gesammelt und getrocknet werden. Die erhaltenen
Salze besitzen eine höhere Löslichkeit in Wasser als die entsprechenden Antibiotika und werden vorzugsweise für therapeutische
Zwecke verwendet. Zum Anwenden der erfindungsgemäßen Antibiotika kann auch ein nichttoxischer Komplex, wie ein DNA-Komplex,
therapeutisch angewendet werden. In diesem Falle kann aus Tieren und Mikroorganismen, wie Kalbsthymus, Helazellen,
menschlichen und tierischen Embryozellen, Hefen etc. extrahierte DNA eingesetzt werden. Die Herstellung von DNA-MA 144-Komplexen
kann nach in der Literatur beschriebenen Methoden zur Herstellung von DNA-Komplexen anderer Anthracyclinantibxotika, wie
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Adriamycin, Daunorubicin etc. durchgeführt werden (vergleiche
beispielsweise Nature, New Biol. 239, 110 (1973) und Europ. J. Cancer 10, 399 (1974)). Für die erfindungsgemäßen Zwecke
sind die Verbindungen in der Form der freien Base äquivalent zu ihren nichttoxischen Säureadditionssalzen und Komplexen.
Durch die Erfindung wird ferner eine Methode zur therapeutischen Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen,
die von Leukämie befallen worden sind, zur Verfügung gestellt, welche darin besteht, an die Menschen oder Tiere eine leukämieinhibierende
Dosis von MA 144-M1, MA 144-M- oder eine Mischung
davon zu verabreichen.
Ferner wird durch die Erfindung eine pharmazeutische Zubereitung zur Verfügung gestellt, die MA 144-M^ oder MA 144-M2 oder eine
Mischung davon in einer Menge enthält, die dazu ausreicht, einen Befall durch Leukämie in vivo zu reduzieren, wobei das
MA 144-M-1, MA 144-M2 oder beide Substanzen mit einem inerten
pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel vereinigt werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß die tatsächlich
bevorzugten Mengen der MA 144-Substanz in Abhängigkeit von der jeweils eingesetzten Verbindung, der jeweils formulierten Zubereitung,
der Verabreichungsmethode sowie der jeweiligen Stelle und dem jeweils behandelten Organismus abhängen. Viele
Faktoren, welche die Wirkung des Wirkstoffes beeinflussen, sind in Betracht zu ziehen, beispielsweise das Alter, das Körpergewicht,
das Geschlecht, das Nahrungsmittel, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Exkretionsmenge, die Wirkstoffkombinationen,
die Reaktionsempfindlichkeit sowie die Schwere der Krankheit. Optimale Verabreichungsmengen für bestimmte
Bedingungen lassen sich leicht unter Anwendung herkömmlicher Dosierungsermittlungstests unter Berücksichtigung der vorstehenden
Richtlinien ermitteln.
Zu einer parenteralen Injektion werden MA 144-M. oder MA 144-M_,
ihre Salze oder Komplexe in für Injektionszwecke geeignetem
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destillierten Wasser oder in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und intraperitoneal, intravenös, subkutan
oder lokal in das Wirtstier injiziert. Die Dosierungsmenge sowie der Injektionsweg werden aufgrund von Tierexperimenten,
dem Zustand der Patienten und der Testtiere, dem Alter, dem Körpergewicht, dem Gepchlecht, der Empfindlichkeit, dem Zeitplan
der Injektionen, der Injektionsperiode sowie in Abhängigkeit
davon gewählt, ob auch andere Wirkstoffe eingesetzt werden. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch
innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. MA 144-M^i oder MA 144-Mp, ihre Salze oder Komplexe können
ebenfalls auf oralem Wege in Form von Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Suspensionen oder dergleichen
verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Eine Mischung aus Lebern, die aus 10 Wister Ratten (300 g,£)
isoliert worden sind, sowie 10 Volumina 10 mM Tris-Puffer
(pH 7,8) die 10 mM Magnesiumchlorid und 0,25 m Rohrzucker enthalten, werden mittels einer Teflon-Homogenisierungseinrichtung
homogenisiert und mit 10000 Upm während einer Zeitspanne
von 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (400 ml) wird mit 50 ml 5 mg/ml Cinerubin A und 50 ml
6 mg/ml NADP vermischt, worauf jeweils 50 ml in jeweils 500 ml-Kolben
verteilt und bei 40° C während einer Zeitspanne von 1 Stunde auf einem Rotationsschüttler bebrütet werden. Die
Reaktion wird durch Zugabe von 2 Volumina einer kalten Mischung aus Chloroform und Methanol (1:1) beendet. Diese Lösung wird
gut vermischt und von der Chloroformschicht abgetrennt. Die zurückbleibende aktive Fraktion in der wässerigen Schicht wird
mit einem gleichen Volumen Chloroform rückextrahiert.
Beide Chloroformschichten werden vereinigt, unter vermindertem
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Druck konzentriert, auf Kieselsäure-Dünnschichtplatten aufgebracht
und mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (10 : 1) entwickelt. Nach der Chromatographie wird das Band,
das dem MA 144-Mp entspricht, abgekratzt, worauf das MA 144-Mp mit Methanol extrahiert, unter vermindertem Druck konzentriert
und aus einer Mischung aus Chloroform und η-Hexan kristallisiert wird. Man erhält 51,3 mg roter Nadelkristalle von
MA 144-M2.
Unter Verwendung von Mauseleberhomogenaten als Enzymquelle
werden 100 mg Aclacinomycin A nach der in Beispiel 1 beschriebenen
Methode behandelt (das eingesetzte Coenzym besteht aus NADP). Man erhält 48,5 mg von MA 144-M. in Form eines gelben
Pulvers.
Unter Einsatz von frischen Kaninchenleberscheiben als Enzymquelle werden 200 mg des gemischten Substrats einschließlich
35,5 mg Cinerubin A und 112,5 mg Aclacinomycin A mit Leberschnitten sowie dem Coenzym NADP in 1000 ml einer Magnesium-Rohr
zucker-Trislösung (pH 7,8) gemäß Beispiel 1 bebrüted.
Die Reaktionsmischung wird mit Chloroform extrahiert, worauf 20 ml l%iges CuSO4 · 5HpO der Chloroformschicht (100 ml) zugesetzt
wird. Nachdem die Lösung kräftig geschüttelt worden ist, wird eine 10 m EDTA-Lösung der Chloroformschicht zugesetzt,
die von der wässerigen Schicht abgetrennt worden ist, worauf kräftig geschüttelt wird. Die Chloroformschicht wird dann unter
Schütteln zweimal mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen. Der Chloroformextrakt wird konzentriert. Man erhält 51 mg eines
gelben MA 144-M^ - Pulvers durch Zugabe von η-Hexan. Die erste
wässerige Schicht, welche den ausgefällten Cu++-chelierten
MA 144-Mj - Komplex enthält, wird zentrifugiert. Der Niederschlag
wird mit Aceton gewaschen in 10 ml 0,1 η HCl aufgelöst und mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Der
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Extrakt wird zweimal mit Wasser, das mit NaCl gesättigt worden
ist, gewaschen, dann erneut mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck konzentriert. Durch Zugabe von η-Hexan zu
dem Konzentrat erhält man 10,5 mg MA 144-M2 in Form eines
roten Pulvers.
1 g Aclacinomycin A wird in 40 ml Äthylacetat aufgelöst, worauf
mit 40 ml Wasser vermischt wird, das 100 mg Natriumborhydrid enthält. Es wird kräftig während einer Zeitspanne von 20 Minuten
bei Zimmertemperatur in einem Scheidetrichter geschüttelt. Man läßt die Reaktionsmischung stehen, wobei sich die Äthyl—
acetatschicht abtrennt. Der Extrakt wird mit der mit NaCl gesättigten Lösung, die 10 m EDTA enthält, gewaschen, worauf
sich ein zweimaliges Waschen mit Wasser anschließt. Dann erfolgt Konzentrierung nach einer Entwässerung mit wasserfreiem
Natriumsulfat. Nach einer Kieselsäure-Säulenchromatographie (3 χ 20 cm) unter Einsatz einer Mischung aus Toluol und Methanol
(100 : 3) werden aktive Fraktionen·, die MA 144-M^ enthalten,
zusammengeschüttet, konzentriert und η-Hexan zugesetzt» Der erhaltene gelbe Niederschlag von MA 144-M. wiegt 450 mg.
2 g Cinerubin A werden in 80 ml einer Mischung aus Äthylacetat, Chloroform.und Methanol (10 : 1 : 1) aufgelöst, worauf 80 ml
Wasser zugemischt werden, die 200 mg Natriumborhydrid enthalten. Dann erfolgt ein kräftiges Schütteln während einer Zeitspanne
von 20 Minuten bei Zimmertemperatur in einem Scheidetrichter. Eine weitere Reinigung wird gemäß Beispiel 4 durchgeführt.
Man erhält 760 mg MA 144-M2 aus Äthylacetat/n-Hexan in
Form von roten Nadelkristallen.
Ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
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| Kartoffelstärke | KH2PO4 | 2%, Gewicht/Volumen |
| Glukose | K2HPO4 | 2 |
| "Fleisch" (Warenzeichen für | MgSO4 · 7H2O | 2,5 |
| Soj abohnenpulver) | NaCl | |
| MnCl2 . 4H2O | 0,1 | |
| FeSO4 · 7H2O | 0,1 | |
| Silicon | 0,1 | |
| 0,3 | ||
| 0,0005 | ||
| 0,0005 | ||
| 0,005 (pH 7,2) |
50 nil dieses Mediums werden bei 120 C während einer Zeitspanne
von 15 Minuten in einem 500 ml-Kolben sterilisiert, der mit 1 ml einer gefrorenen Kultur von Streptomyces galilaeus
MA 144-M1 (FERM P-2455) beimpft und bei 30° C während
einer Zeitspanne von 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bebrütet wird. 10 1 des zuvor sterilisierten Mediums werden
in einem 20 1 Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl aseptisch
mit 200 ml der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Die Fermentation wird bei 30° C während einer Zeitspanne
von 18 Stunden unter Rühren (300 Upm) und Belüften (5 l/min) durchgeführt. Dann werden 10 1 dieser Kultur in
600 1 des zuvor sterilisierten Mediums in einem Gefäß aus rostfreiem Stahl gegossen, worauf bei 30° C während einer Zeitspanne
von 48 Stunden unter Rühren (180 Upm) und Belüftung (200 l/min) gezüchtet wird.
Die erhaltene Kulturbrühe (570 1) wird auf einen pH von 5,0 mit Schwefelsäure eingestellt und mit Diatomeenerde filtriert.
Der erhaltene Filterkuchen (54 kg) wird in 7 1 Aceton suspendiert und nach einem Rühren während einer Zeitspanne von 3
Stunden filtriert. Der Rückstand wird mit 85 1 Aceton rückextrahiert. Beide Extrakte werden unter vermindertem Druck auf
40 1 konzentriert, zu 25 1 Äthylacetat zugegeben und gerührt.
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Nach dem Abtrennen der Äthylacetatschicht und einem Konzentrieren auf 1 1 unter vermindertem Druck wird eine rohe
Aclacinomycin A - Mischung durch Zugabe von η-Hexan zu dem Konzentrat ausgefällt. 16 g eines orange-gelbgefärbten Pulvers
werden nach einem zweimaligen Waschen mit einer Mischung aus η-Hexan und Äthylacetat (50 : 1) erhalten.
Dieses Rohpulver wird in 200 ml Äthylacetat aufgelöst, auf eine mit 700 g Column-Lite (Warenzeichen der Fuji Chemical
Co. für Kieselsäure) gefüllte Säule aufgegeben und mit einer Mischung aus Äthylacetat und Methanol (1:1) eluiert. Das gelbe
Eluat wird zur Trockne unter vermindertem Druck konzentriert. Das erhaltene rohe Aclacinomycinpulver ( 12 g ) wird in 100 ml
Chloroform aufgelöst, mit 50 ml 10 m EDTA/0,01 m Phosphat-Puffer
(pH 6,8) zur Entfernung von restlichen Metall ionen geschüttelt, worauf die Chloroformschicht zweimal mit Wasser
gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert wird. Man
erhält 11 g eines gelben Pulvers, das Aclacinomycin A enthält.
Dieses Pulver wird in einer kleinen Menge Toluol aufgelöst, auf eine mit Kieselsäure gefüllte Säule ( 4 χ 40 cm)aufgegeben
und eluiert. Aclacinomycin A, B sowie andere Verunreinigungen werden mit 2% (Volumen/Volumen) Methanol, das Toluol enthält,
eluiert, worauf die MA 144-M.j-Fraktion mit 3% Methanol eluiert
wird, das Toluol enthält. Dann wird zur Trockne konzentriert, wobei 10,5 mg MA 144-M., in Form eines gelben Pulvers erhalten
werden.
Die vorstehend beschriebene mit Column-Lite gefüllte Säule
_3 wird nach der Eluierung der gelben Fraktionen mit 10 m EDTA, das 30% (Volumen/Volumen) Methanol enthält, behandelt. Das erhaltene
rote Eluat wird zur Trockne eingedampft. Dabei erhält man 5,0 g eines roten, Cinerubin A enthaltenen Pulvers. Dieses
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rote Pulver wird mit EDTA behandelt und in einer mit Kiesel säure gefüllten Säule nach der im Zusammenhang mit MA 144-M
beschriebenen Methode chromatographiert. Man erhält 6,2 mg MA 144-Mp in Form eines roten Pulvers.
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Leerseite
Claims (52)
1. Anthracyclinglykoside der allgemeinen Formel
R 0 : COOCH, OH 0 OH 0
^3
worin R für ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe
steht, oder ein nichttoxisches Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure.
5 / 0 7 2 5
ORIGINAL INSPECTED
2. Anthracyclinglyjcoside der allgemeinen Formel
COOCH3
OH 0 OH 0
\_y
worin R für ein V/asserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe
steht.
7i A5/Ü7 25
3. Anthracyclinglykosid MA 144-M1 der Formel 2715255
COOCH1
OH 0 CH 0
VV
oder ein nichttoxisches Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure.
4. Anthracyclinglykosid KA 144-M^ der Formel
COOCH,
CH2CH3
OH O CH 0
HO A O
N<
CH1
Ch"
CH
OH
9 845/0725
- fl - I NAOHGEREJOHT
5. Anthracyclinglykosid MA 144-M2 der Formel
OH 0 COOCH,
OH 0 OH 0
oder ein nichttoxisches Säureadditionssalz davon oder ein Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure.
6. Anthracyclinglykosid MA 144-M2 der Formel
OH 0 COOCH3
OH 0 OH 0
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NACHOEREICHT
7. Pharmazeutische Zubereitung in einer für eine oraftd ε<<λϋο
parenterale Verabreichung an Säugetiere, einschließlich Menschen und Tiere, geeigneten Form, gekennzeichnet durch
eine wirksame antibakterielle Menge eines Anthracyclinglykosids der allgemeinen Formel
COOCH3
OH 0 OH 0
worin R für ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe steht, oder eines nichttoxischen Säureadditionssalzes davon
oder eines Komplexes davon mit Desoxyribonukleinsäure in Kombination mit einem für diese Verabreichungsform geeigneten
inerten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel ·
8. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
Anthracyclinglykosid aus MA 144-I-K, einem nichttoxischen
Säureadditionssalz davon und/oder einem Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure besteht.
9. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Anthracyclinglykosid aus MA 144-M-, einem nichtboxischen
Säureadditionssalz davon und/oder einem Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure, besteht.
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ORIGINAL ΙΝ§ΡξΡΤΙΟ
-J - I nachgerboht]
10. Pharmazeutische Zubereitung, die für eine orale sowie
parenterale Verabreichung an Säugetiere, einschließlich Menschen und Tiere, geeignet ist, dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine wirksame tumorinhibierende Menge eines Anthracyclinglykosids der allgemeinen Formel
R 0 COOCH,
OH 0 OH 0
enthält, worin R für ein V/asser stoff atom oder eine Hydroxylgruppe
steht, oder eines nichttoxischen Säureadditionssalzes davon oder eines Komplexes davon mit Desoxyribonukleinsäure,
in Kombination mit einem für diese Verabreichungsform geeigneten inerten pharmazeutisch verträglichen
Träger oder Verdünnungsmittel.
11. Zubereitung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Anthracyclinglykosid aus MA 144-M1, einem nichttoxischen
Säureadditionssalz davon und/odsr einem Komplex davon mit Desoxyribonukleinsäure besteht.
12. Zubereitung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
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das Anthracydinglykosid aus MA 144-Mp, einem nichttoxischen Säureadditionssalz davon und/oder einem Komplex
davon mit Desoxyribonukleinsäure besteht.
13. Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotikums MA dadurch gekennzeichnet, daß ein MA 144 - erzeugender Stamm,
der zu dem Genus Streptomyces gehört, unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle
und ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, solange gezüchtet wird, bis eine erhebliche Menge an MA 144 durch
den Organismus in dem Nährmedium erzeugt worden ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein MA 144-erzeugender Stamm, der aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Streptomyces galilaeusMA 144-M1
ATCC 31133 (FERM P-2455), Streptomyces sp. ME 505-HE1 ATCC 31273 (FERM P-3667), S. galilaeus ATCC 14969, S.
cinereoruber ATCC 19740, S. niveoruber ATCC 14971,
S. antibioticus ATCC 8663, S. purpurascens ATCC 25489 sowie Mutanten davon besteht, in einem Nährmedium bei
einer Temperatur zwischen 20 und 35° C gezüchtet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M1 aus der Kulturbrühe gewonnen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der MA 144-M^ , das in der Kulturbrühe erzeugt worden ist,
nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches wenigstens eine Verfahrensmaßnahme vorsieht, die aus der
Gruppe ausgewählt wird, welche aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfallung, einer Konzentration,
einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie
einer Adsorption und anschließenden Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, an adsorbierend wirkender Kieselerde
oder einem synthetischen Adsorbens besteht.
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17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M.. enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M^ enthält, nach Zugabe wenigstens
einer Substanz zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die
aus einem Serum, Serum Albumin, Serum Globulin, Glycerin, Gelatine, Zucker^,Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure
sowie organischen oder anorganischen Säuren besteht.
19. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-442 aus der KuI tür brühe gewonnen wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M2, das in der Kulturbrühe erzeugt worden ist,
nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, das wenigstens eine Maßnahme vorsieht, die aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentration, einer Gegenstromverteilung,
einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie einer Adsorption und
einer anschließenden Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden Kieselerde oder einem
synthetischen Adsorbens besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche das MA 144-M2 enthält, zur Trockne
konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche das MA 144-M2 enthält, zur Trockne
konzentriert oder gefriergetrocknet wird, nachdem wenigstens eine Substanz zugesetzt worden ist, die aus der
Gruppe besteht, die aus einem Serum, Serum Albumin, Serum
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Globulin, Glycerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure
sowie organischen oder anorganischen Säuren besteht.
23. Verfahren zur Herstellung des Antituraorantibiotikums MA 144-M1, dadurch gekennzeichnet, daß Aclacinomycin A
bei einer Temperatur zwischen 20 und 42° C sowie bei einem pH von 5,5 bis 10,5 in einem Medium bebrüted wird, das ein
Enzymsystem enthält, welches Aclacinomycin A in MA 144-M1
sowie ein Coenzym umzuwandeln vermag, wobei das Enzymsystem aus einem Säugetiergewebe oder aus MA 144-erzeugenden
Streptomyces erhalten wird, und das Coenzym aus Nicotlnamidadenindinukleotidphosphat oder der reduzierten
Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat besteht.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Umwandlung bedingende Enzymsystem aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus Tierorganen, Gewebeschnitten, Gewebehomogenaten, daraus getrockneten Präparaten, teilweise
gereinigten Enzymen davon sowie immobilisierten Enzymen davon besteht.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das die Umwandlung bedingende Enzymsystem aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus einer Kulturbrühe der MA 144-erzeugenden Streptomyces, einer daraus erhaltenen Zellensuspension,
daraus erhaltenen getrockneten Zellen, daraus erhaltenem Zellenhomogenat, davon gewonnener überstehender
Lösung, teilweise gereinigtem Enzym, das daraus erhalten worden ist, sowie daraus erhaltenem immobilisierten Enzym
besteht.
26. Verfahren nach Anspruch 25,dadurch gekennzeichnet, daß
die MA 144-erzeugenden Streptomyces aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Streptomyces galilaeus MA 144-M1
ATCC 31133 (PERM P-2455), Streptomyces sp. ME 505-HE1
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-y-
ATCC 31273 (FERM P-3667), S. galilaeus ATCC 14969, S. cinereoruber ATCC 19740, S. niveoruber ATCC 14971,
S. antibioticus ATCC 8663, S. purpurascens ATCC 25489 sowie Mutanten davon besteht.
27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe, die von einem Aclacinomycin A erzeugenden
Streptomyces erhalten wird, als Quelle für Aclacinomycin A verwendet wird.
28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M1 aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M.. , das in der Reaktionsmischung erzeugt worden
ist, nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, das wenigstens eine Verfahrensmaßnahme vorsieht, die
aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentration,
einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie
einer Adsorption und anschließenden Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden Kieselerde
oder einem synthetischen Adsorbens besteht.
30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M1 enthält, zur Trockne konzentriert oder gefriergetrocknet wird.
31. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M1 enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird, nachdem wenigstens eine Substanz zugesetzt worden ist, die aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus einem Serum, Serum .Albumin, Serum~
,felobulin, Glycerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure
sowie organischen oder anorganischen
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Säuren besteht.
32. Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotikums MA 144-M2, dadurch gekennzeichnet, daß Cinerubin A bei
einer Temperatur zwischen 20 und 42° C sowie bei einem pH-Wert von 5,5 bis 10,5 in einem Medium bebrütet wird,
welches ein Enzymsystem enthält, das Cinerubin A in MA 144-M-sowie
ein Coenzym umzuwandeln vermag, wobei das Enzym— system aus einem Säugetiergewebe oder aus einem MA 144-erzeugenden
Streptomyces erhalten wird und das Coenzym aus Nicotinamidadenindinukleotidphosphat oder der reduzierten
Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat besteht.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das die Umwandlung bedingende Enzymsystem aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus Säugetiergeweben, Gewebeschnitten, Gewebehomogenaten, daraus getrockneten Präparaten, teilweise
gereinigten Enzymen davon sowie immobilisierten Enzymen davon besteht.
34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das die Umwandlung bedingende Enzymsystem aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus einer Kulturbrühe der MA 144-erzeugenden Streptomyces, einer daraus erhaltenen Zellensuspension,
daraus erhaltenen getrockneten Zellen, daraus erhaltenem Zellenhomogenat, daraus gewonnener überstehender
Lösung, teilweise gereinigtem Enzym, das daraus gewonnen worden ist, sowie daraus erhaltenem immobilisierten Enzym
besteht.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß der MA 144-erzeugende Streptomyces aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Streptomyces galiaeus MA 144-M^ ATCC 31133 (FERM P-2455), Streptomyces sp. ME 505-HE1 ATCC
31273 (FERM P-3667), S. galiaeus ATCC 14969, S. cinereoruber ATCC 19740, S. niveoruber ATCC 14971, S. antibioticus
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ATCC 8663, S. purpurascens ATCC 25489 sowie Mutanten davon besteht.
36. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe, die aus einem Cinerubin A-erzeugenden
Streptomyces erhalten worden ist, als Quelle für Cinerubin A eingesetzt wird.
37. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M2 aus der Reaktionsmischung gewonnen wird·
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-M2, das in der Reaktionsmischung erzeugt worden
ist, nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches wenigstens eine Verfahrensmaßnahme vorsieht, die
aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentration,
einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie aus
einer Adsorption und einer anschließenden Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden
Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens besteht.
39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-Mp enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird.
40. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M2 enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird, nachdem wenigstens eine Substanz zugesetzt worden ist, die aus der Gruppe
besteht, die aus einem Serum, Serumalbumin, Serumglobulin,
Glycerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure sowie organischen oder anorganischen Säuren besteht.
41. Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotikums
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MA 144-M^, dadurch gekennzeichnet, daß Aclacinomycin A
chemisch mit einem Reduktionsmittel reduziert wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Natriumborhydrid,
Lithiumhydriden sowie Aluminiumhydriden besteht, wobei die Reduktion in einem aus einem einzigen Lösungsmittel bestehenden System oder einem gemischten Lösungsmittelsystem
ausgeführt wird.
42· Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß
die KuItürbrühe, die aus einem Aclacinomycin A-erzeugenden
Streptomyces gewonnen worden ist, als Quelle für Aclacinomycin A eingesetzt wird.
43· Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß
das MA 144-M1 aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.
44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß
das MA 144-M^, das in der Reaktionsmischung erzeugt worden
ist, nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches wenigstens eine Verfahrensmaßnahme vorsieht, die
aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentration,
einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie
einer Adsorption und einer anschließenden Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden
Kieselerde oder einem synthetischen Adsorbens besteht.
45. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lösung, welche MA 144-M^ enthält, zur Trockne konzentriert
und gefriergetrocknet wird.
46. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lösung, die MA 144-M^ enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird, nachdem wenigstens eine Sub-
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stanz zugesetzt worden ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Serum, Serumalbümin, Serumglobulin,
Glycerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure sowie organischen oder anorganischen Säuren besteht.
47. Verfahren zur Herstellung des Antitumorantibiotikums
MA 144-M2, dadurch gekennzeichnet, daß Cinerubin A chemisch
mit einem Reduktionsmittel reduziert wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Natriumborhydrid, Lithiumhydriden
sowie Aluminiumhydriden besteht, wobei die Reduktion in einem aus einem einzigen Lösungsmittel bestehenden
System oder einem gemischten Lösungsmittelsystem ausgeführt wird.
48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe, die aus einem Cinerubin A-erzeugenden
Streptomyces gewonnen worden ist, als Quelle für Cinerubin
A eingesetzt wird.
49. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-Mp aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.
50. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß das MA 144-Mp, das in der Reaktionsmischung erzeugt worden
ist, nach einem Verfahren extrahiert und gereinigt wird, welches wenigstens eine Verfahrensmaßnahme vorsieht, die
aus einer Lösungsmittelextraktion, einer Lösungsmittelausfällung, einer Konzentration, einer Gegenstromverteilung,
einer Chelierung mit Metallionen, einer Adsorption an einem Adsorbens sowie einer Adsorption und anschließenden
Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz, einer adsorbierend wirkenden Kieselerde oder einem synthetischen
Adsorbens besteht.
51. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß
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die Lösung, welche MA 144-M2 enthält, zur Trockne konzentriert
oder gefriergetrocknet wird.
52. Verfahren nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung, welche MA 144-M2 enthält, zur Trockne konzentriert
und gefriergetrocknet wird, nachdem wenigstens eine Substanz zugesetzt worden ist, die aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus einem Serum, Serumalbumin, Serumglobulin,
Glycerin, Gelatine, Zuckern, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäure sowie organischen und anorganischen Säuren
besteht·
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