DE3884973T2

DE3884973T2 - Verfahren zur Herstellung von Avermectine-B und die verwendeten Kulturen.

Info

Publication number: DE3884973T2
Application number: DE88300354T
Authority: DE
Inventors: Edmund William Hafner; Kelvin Scott Holdom; Shih-Jen Edward Lee
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-18
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2008-01-19
Also published as: KR900004419B1; FI90088B; YU47878B; EP0276131A3; AU1074288A; EP0276103B1; PL270239A1; ATE87927T1; HUT47978A; IL85165A0; AU603416B2; MY103514A; PT86584B; EP0276103A3; DD267512A5; FI90091C; IL85118A0; HU201973B; GR3007586T3; AR241798A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Stämme von Streptomyces avermitilis, denen die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität und die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlen, auf Verfahren zum Herstellen dieser S. avermitilis und auf die Verwendung von S. avermitilis zur Herstellung natürlicher und nicht-natürlicher B-Avermectine.
Die US Patente 4.310.519 und 4.429.042 beschreiben die Avermectine, einen Komplex miteinander verwandter Agentien mit starker Wirkung fegen Parasiten, und deren Herstellung durch aerobe Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces avermitilis, nämlich von S. avermitilis ATCC Nr. 31267, 31271 und 31272. Die beiden letztgenannten Stämme stellen Kulturen dar, die in einem Gläschen eingefroren bzw. in einem Röhrchen lyophilisiert wurden und durch ultraviolette Bestrahlung von S. avermitilis ATCC 31267 gewonnen worden waren.
Die EP 214.731, veröffentlicht am 18. März 1987, die der US-Patent-Anmeldung, Serial No. 886,867, eingereicht am 16. Juli 1986, entspricht, offenbart eine Reihe von Verbindungen (die hier als nicht-natürliche Avermectine bezeichnet werden), die mit den natürlichen oder bekannten Avermectinen verwandt sind, aber in 25-Stellung eine neue Substituentengruppe besitzen, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation eines Avermectin produzierenden Organismus in Gegenwart bestimmter, spezifizierter Carbonsäuren oder von Derivaten oder Vorläufern hiervon. Die S. avermitilis-Organismen, die zur Herstellung dieser neuen, C-25-substituierten Avermectine eingesetzt werden, sind S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121. Der letztgenannte Organismus, beschrieben in EP 214.731, wird aus S. avermitilis ATCC 31271 erhalten. Er liefert höhere Ausbeuten an den neuen C-25-substituierten Avermectinen, wenn er in einem halbdefinierten Medium kultiviert wird. Jeder der Stämme ATCC 31267, 31271, 31272 und NCIB 12121 kann außerdem zusätzlich zu den neuen C-25-substituierten Derivaten verschiedene Mengen der bekannten oder natürlichen Avermectine produzieren, in denen der 25-Substituent Isopropyl oder (S)-sec-butyl (1-Methylpropyl) ist.
Das Kohlenstoffskelett der Averinectine (in Formel (I) unten angegeben) leitet sich von Acetaten und Propionaten ab, und der C-25-Substituent natürlicher Avermectine leitet sich von L-Isoleucin (R=(S)-sec-butyl) oder L-Valin (R=Isopropyl) ab (Kisher und Mrozik, 'Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Kap 14).
Unter "bekannten" oder "natürlichen" Avermectinen sollen solche Avermectine verstanden werden, die von S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 und ATCC 31272 produziert werden, wobei der Substituent in 25-Stellung entweder Isopropyl oder (S)-sec-Butyl (1-Methylpropyl) ist. Avermectine in denen der Substituent in 25-Stellung ein anderer als Isopropyl oder sec-Butyl (S-Form) ist, werden in dieser Beschreibung als neue oder nicht-natürliche Avermectine bezeichnet.
Die Stämme von S. avermitilis, die in den oben erwähnten US-Patenten genannt sind, produzieren eine Klasse von Verbindungen, die dort den Gattungsnamen ("Generic") C-076 tragen. Die Klasse umfaßt acht unterschiedliche, aber eng verwandte Verbindungen, die als C-076-Ala, -Alb, -A2a, -A2b, -Bla, -B1b, -B2a und -B2b bezeichnet werden. Die "a"-Verbindungsreihe bezieht sich auf die natürlichen Avermectine, in denen der 25-Substituent (S)-sec-Butyl ist, und die "b"-Reihe auf diejenigen, in denen der 25-Substituent Isopropyl ist. Die Bezeichnungen "A" und "B" beziehen sich auf Avermectine, in denen der 5-Substituent Methoxy bzw. Hydroxy ist. Schließlich bezieht sich die Ziffer "1" auf Avermectine, in denen in der 22-23-Position eine Doppelbindung vorliegt und die Ziffer "2" auf Avermectine, in denen in der 22-Position ein Wasserstoffatom und in der 23-Position Hydroxy gebunden vorliegt.
In dieser Anmeldung werden bezüglich des 25-Substituenten der nicht-natürlichen Avermectine solche Identifikationsmerkmale nicht verwendet. Die Identifikationsmerkmale A1, A2, B1 und B2 wurden beibehalten, um auf strukturelle Merkmale der nicht-natürlichen Avermectine zu verweisen, die denjenigen der natürlichen Avermectine entsprechen, wie oben angemerkt.
Die Erzeugung von Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Öxosäuren fehlt, wurde für Bacillus subtilis von Willecke und Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) und für Pseudomonas putida von Martin et al., J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973) beschrieben, aber nicht für Streptomyces.
Über S. avermitilis Agly-1, einen mutanten Stamm, der faktisch nur die Avermectin-Aglycone A1a und A2a produziert, wurde von Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985) berichtet. Ebenfalls beschrieben wurde die Fermentation von S. avermitilis Agly-1 in Gegenwart von Sinefungin, das eine erhöhte Produktion der Avermectin-Aglycon-B-Bestandteile verursachte. Ähnlich führte die Fermentation von S. avermitilis 08, einem Stamm mit hoher Avermectin-Produktion, in Gegenwart von Sinefungin als inhibitor der O-Methyl-Transferasen zur Produktion von Avermectinen ohne O-Methylgruppen am Aglycon in C-5-Position und an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe.
Das US-Patent 4.378.353 beschreibt mit C-076 verwandte Verbindungen und deren Herstellung durch Kultivation von MA-5218, einer Mutante von S. avermitilis ATCC 31272, die durch ultraviolette Bestrahlung daraus erhalten wurde. Die Mutante wird als ATCC 31780 identifiziert. Den dem C-076 verwandten Verbindungen, die diese Mutante produziert, fehlt der C-076-Furanring. Zusätzlich waren in einigen dieser genannten Verbindungen einer der oder beide Oleandrose-Zuckergruppen abgespalten, während in anderen die Gruppe in 5-Stellung zu einer Keto-Gruppe oxidiert war.
Über drei Klassen von O-Methyltransferase-Mutanten von S. avermitilis, die Avermectine ohne O-Methyl-Gruppen produzieren, ist von Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetesr, Debrecen, Ungarn, 26.-30. August (1985), und von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987) berichtet worden. Die erste Klasse produziert vornehmlich B-Avermectine, da sie nicht in der Lage ist, die C-5-Hydroxylgruppe des macrocyclischen Lactonrings zu methyiieren. Die zweite klasse produziert 3'-O,-3"O-Bis-demethylavermectine (Avermectine, die in der 3-Stellung beider Oleandrose-Monosaccharidreste keinen O-Methyl-Substituenten tragen) , die als Demethylavermectine bezeichnet werden. Die dritte Klasse kann in gar keiner Position methylieren.
Schulman et al., Fed. Proc. 44, 931 (1985), offenbart eine erhöhte Produktion von B-Avermectinen durch Fermentieren von S. avermitilis in Gegenwart von Substanzen wie Sinefungin, S-Adenosylethionin und S-Adenosylhomocystein, die die Methylierung der C-5-Hydroxy-Gruppe der Aglycon-Einheit durch das Enzym Avermectin-B-O-Methyltransferase inhibieren. Schulman et al. offenbart und bezieht sich in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620-624 (1986) auf Streptomyces avermitilis- Mutanten, die keine O-Methyltransferase-Aktivität besitzen und erhöhte Mengen an Avermectin-B-Bestandteilen produzieren.
Die Mutagenese von S. avermitilis erzeugt Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt. Die Mutanten besitzen in Abwesenheit einer zugesetzten Verbindung RCOOH, worin R isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, oder einer Verbindung, die sich während des Fermentationsverfahrens in RCOOH umwandeln läßt, nicht länger die Fähigkeit, nennenswerte Mengen an natürlichen Avermectinen zu produzieren. Überraschend und unerwartet konnte jedoch festgestellt werden, daß die Mutanten Avermectine, natürliche und nicht-natürliche, produzieren, wenn sie in Anwesenheit einer zugesetzten Verbindung R-COOH, worin R Isopropyl oder (S)- sec-Butyl oder eine andere, hier offenbarte Gruppe ist, oder eines Vorläufers für dieses RCOOH fermentiert werden. Noch erstaunlicher ist es, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen nur die Dehydrogenase-Aktivität ur verzweigtkettige 2-Oxosauren fehlt und die L-Isoleucin, L-Leucin oder L-Valin nicht abbauen können, in der Lage sind, eine große Vielzahl von Verbindungen für den biosynthetischen Aufbau von Avermectin zu assimilieren und dabei nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, die von vorliegenden natürlichen Averimectinen frei sind.
Die Mutagenese der so hergestellten, einfach blockierten Mutanten erzeugt Mutanten, denen sowohl die Dehydrogenase- Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren als auch die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität fehlen. Diese doppelt blockierten Mutanten Produzieren überraschend und unerwartet im wesentlichen nur natürliche und nicht-natürliche B-Avermectine, wenn sie in Gegenwart einer zugesetzten Verbindung R-COOH, worin R wie oben definiert ist, kultiviert werden.
Die natürlichen Avermectine werden, wie schon angemerkt, als komplexe Mischung von acht unterschiedlichen, aber nahe verwandten Verbindungen erzeugt; Formel (I), R = Isopropyl und (S)-sec-Butyl. Während sie in im wesentlichen reiner Form isoliert wurden (siehe US Patent 4.429.042), ist das Herstellungsverfahren bestenfalls als mühsam zu bezeichnen. Die B- Avermectine besitzen im allgemeinen eine größere Aktivität als Antihelmintica als die entsprechenden A-Avermectine. Die Herstellung von nicht-natürlichen Avermectinen (der A- und B-Komponenten) nach dem Verfahren, das in der EP 214.731 beschrieben ist, kann wegen des Vorhandenseins der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und der Aminosäuren L-Valin und L-isoleucin in der Zelle der Mikroorganismen S. avermitilis und im Medium, welche für ihre Herstellung eingesetzt werden, auch zu einigen der natürlichen Avermectine - in unterschiedlichen Mengen - führen.
Es ist ein wünschenswertes Ziel, nur die biologisch wirksameren B-Komponenten sowohl der natürlichen als auch der nichtnatürlichen Avermectine erzeugen zu können, um so die Anzahl und die Komplexizität der Produkte möglichst klein zu halten und dadurch die Reinheit eines ausgewählten Avermectins zu steigern und dabei die Trennschritte zu vereinfachen.
Stämme von S. avermitilis, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, werden durch Mutieren Avermectin produzierender Stämme von S. avermitilis erzeugt, und insbesondere durch Mutation von S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 oder NCIB 12121. Die Mutanten sind unfähig, die natürlichen Avermectine zu synthetisieren, es sei denn, man setzt die tettsäure oder einen Vorläufer dafür, die/der die isopropyl- oder sec-Butyl-Gruppe (S-Form) trägt, dem Medium zu, in dem die Mutanten fermentiert werden. Sie sind fähig, naturliche und nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, wenn sie unter wäßrigen, aeroben Bedingungen in einem Nährmedium fermentiert werden, das eine geeignete Starter-Säure oder eine Verbindung enthält, die während des Fermentationsprozesses in diese überführt werden kann.
Diejenigen Mutanten, die durch das Fehlen von Dehydrogenase- Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren charakterisiert sind, werden auf der Grundlage einer ¹&sup4;CO&sub2;-Bestimmung aus den mutierten Kolonien isoliert. in diesem Verfahren zeigt das Fehlen einer ¹&sup4;CO&sub2;-Entwicklung aus einem Substrat aus [¹&sup4;C-1]-2-Oxoisocapronsäure oder [¹&sup4;-C-1]-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [¹&sup4;-C-1]-2-Oxo-3-methylbuttersäure permeabilisierte Zellen das fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren auf.
Es war überraschend und unerwartet, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, ihre Fähigkeit zur Produktion von Avermectinen, insbesondere von nicht-natürlichen Avermectinen, behielten. Die Unfähigkeit der Mutanten, die natürlichen Fettacyl - Coenzym A - Derivate zu produzieren, wenn sie auf einem gängigen Medium gezüchtet werden, hätte zu einer letalen Mutation führen können, wenn die integrität der Membran von diesen Derivaten abhinge oder denn die Akkumulierung von 2-Oxosäuren durch die erstgenannte Mutante Cytotoxizität zur Folge haben könnte. Man hatte darüber hinaus von den Mutanten nicht erwartet, daß sie in der Lage sein würden, Acetyl-CoA und Propionyl-CoA aus dem L-Isoleucin- und L-Valin-Katabolismus zu synthetisieren, da hierfür die Enzym- Aktivitäten notwendig sind, die den Mutanten fehlen. Der Bedarf an diesen Acyl-CoA-Derivaten für die Avermectin-Biosynthese, der oben erwähnt ist, führte zu der Erwartung, daß die Mutanten bezüglich der Produktion von nicht-natürlichen Avermectinen stark beeinträchtigt sein könnten, was überraschenderweise nicht der Fall war.
Das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren in den hier beschriebenen Mutanten führt dazu, daß die Sythese von verzweigtkettigen Acyl-CoA's aus dem Abbau von L-isoleucin, L-Leucin und L-Valin blockiert wird, und damit auch die Synthese der natürlichen Avermectine, es sei denn, daß dem Fermentationsmedium eine Säure R-COOH (worin R (S)-sec-Butyl oder isopropyl ist) oder ein Vorläufer dafür zugesetzt wird.
Weitere Mutation der Mangelmutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, erzeugt Mutanten, denen zusätzlich die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität fehlt. Mutanten ohne Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität können den C-5-Sauerstoff der Agylcon- Gruppe der Avermectine nicht methylieren. Mutanten, denen eine solche Aktivität fehlt, erzeugen im wesentlichen nur B-Avermectine unter Ausschluß der Bildung von A-Avermectinen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch jedweden Organismus, ohne Ansehen seiner Erscheinungsform und seines physiologischen Verhaltens, der mittels Transformation, Transduktion, genetischer Rekombination oder eines anderen genetischen Verfahrens unter Verwendung einer Nukleinsäure oder eines äquivalenten Materials aus den hier beschriebenen Spezies gebildet wurde, wenn er dabei die Charakteristika der hier beschriebenen Mutanten angenommen hat.
Die Ausdrücke "Avermectin" oder "Avermectine" beziehen sich, so wie sie hier gebraucht werden, auf Verbindungen mit der Formel (I) unten, in denen jedoch der 25-Substituent (R) eine beliebige Gruppe sein kann, die von den S. avermitilis-Stämmen dieser Erfindung für diese Stellung assimilierbar ist.
Die hier beschriebenen Mutanten sind für die Produktion von nicht-natürlichen B-Avermectinen durch die hier offenbarten und beispielhaft dargelegten Verfahren außerordentlich wertvoll. Sie sind insbesondere von Wert für die Herstellung bevorzugter Avermectine, d.h. von Verbindungen, in denen der C-25-Substituent C&sub4;-C&sub6;-Cycloalkyl oder -Cycloalkenyl, das fakultativ durch eine C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppe substituiert ist, 1-Methylthioethyl oder eine 5- oder 6-gliedrige, Sauerstoff oder Schwefel tragende heterocyclische Gruppe ist, insbesondere 3-Thienyl oder 3-Furyl.
Die Mutation eines Avermectine produzierenden Angehörigen der Spezies Streptomyces avermitilis wird nach bekannten Verfahren durchgeführt, wobei man eine Vielzahl von Mutationsauslösern verwenden kann, einschließlich Ultraviolett-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Methansulfonsäureethylester, salpetriger Säure und Stickstoff-Senfgas, z.B. N-Methylbis(2-chlorethyl)amin, oder ähnliche Behandlungsverfahren. Die Mutagenese kann an Sporen oder an einer vegetativen Kultur von S. avermitilis, die natürliche Avermectine produzieren kann, durchgeführt werden, z.B. an S. avermitilis ATCC 31272.
Bei dem den Fachleuten gut bekannten Verfahren selektiert man die mutierten Kolonien auf das Fehlen der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren auf der Grundlage eines biochemischen Bestimmungsverfahrens, welches das Durchsuchen einer großen Anzahl zufällig mutierter bakterieller Kolonien auf eine ¹&sup4;CO&sub2;-Produktion aus ausgewählten, verzweigtkettigen [¹&sup4;-C-1]-2-Oxosäuren erlaubt (Tabor et al., J. Bact. 128, 485-486, 1976)
Die Methode umfaßt das Züchten der Mutanten-Kolonien in den Schalen einer Mikrotiter-Platte auf einem geeigneten Nährmedium, das Permeabilisieren der Zellen mit Toluol und das anschließende Zusetzen von [¹&sup4;-C-1]-2-Oxosäure (z.B. 2-Oxo- isocapronsäure) zu jeder Schale und das Untersuchen der Atmosphäre über der Kultur auf die Anwesenheit van CO&sub2;. Alternativ kann anstelle von [¹&sup4;-C-1]-2-Oxoisocapronsäure [¹&sup4;-C-1]-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [¹&sup4;-C-1]- 2-Oxo-3-methylbuttersäure verwendet werden. Die Produktion von ¹&sup4;CO&sub2; wird bequemerweise gemessen, indem mit feuchtem gesättigtes Filterpapier oberhalb der einzelnen Schalen angebracht wird, um freigesetztes ¹&sup4;CO&sub2; aufzufangen, und das eventuell gebildete Ba¹&sup4;CO&sub3; mittels Autoradiographie gefunden wird. Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, liefern Autoradiogramme, die denen der (nicht beimpften) Leerkontrollen annähernd gleichen; d.h. von diesen Mutanten wird kein zusätzliches Ba¹&sup4;CO&sub3; produziert.
Die so erhaltenen Mutanten werden mit beliebigen der obengenannten Mutagene weiterer Mutagenese unterworfen. Mutierte Kolonien werden mit Hilfe von Chromatographie (Dünnschicht- oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) auf das Fehlen von Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität untersucht, nachdem man sie in Gegenwart eines zugesetzten Vorläufers (z.B. 2-Methylbuttersäure) fermentiert hatte. Avermectin-A-Verbindungen sind in den Fermentationsbrühen solcher Mutanten im wesentlichen nicht vorhanden.
Zusätzlich zur Herstellung gewünschter Allele eines gegebenen Stammes von Mikroorganismen durch Mutagenese erlaubt die Protoplastenfusion das Einführen erwünschter Allele, die von einem Stamm produziert / in einem Stamm identifiziert wurden, in das Chromosom eines anaeren Stamms. Beispielsweise kann man aus einem Stamm von S. avermitilis, dem die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlen, durch Protoplastenfusion mit einem Stamm von S. avermitilis, der die vorgenannten Aktivitäten aufweist, einen Stamm von S. avermitilis erzeugen, dem nur die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität fehlt. Wie die Fachleute wissen, ermöglicht die Protoplastenfusions-Technologie die Kombination erwünschter Allele aus divergenten Selektionslinien in einem einzigen Stamm.
Die morphologischen Eigenschaften und das Verhalten der erfindungsgemäßen Mutanten in Kultur entsprechen im allgemeinen denjenigen, die im US Patent 4.429.042 beschrieben sind. Das unterscheidende Charakteristikum der erfindungsgemäßen Mutanten ist das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und der Avermectin-B-O-Methyltransferase- Aktivität bei ihnen, und diese Charakteristika werden wie hier beschrieben bestimmt. Das Fehlen dieser Aktivitäten führt zur Unfähigkeit der Mutanten, beim Wachsen auf einem definierten Medium, das im wesentlichen frei von Fettsäuren RCOOH mit R gleich isopropyl oder (S)-sec-Butyl oder von Verbindungen ist, die während der Fermentation in dieses RCOOH umgewandelt werden können, die natürlichen B-Avermectine zu produzieren. Eine taxonomische Untersuchung, ausgeführt von der American Type Culture Collection, bestätigte, daß die Charakteristika des mutanten Stamms I-3, ausgewählt mittels des obenerwähnten ¹&sup4;CO&sub2;-Tests, eine enge Verwandtschaft zu denjenigen des elterlichen Stamms ATCC 31272 aufweisen, der im US Patent 4.429.042 beschrieben ist, jedoch mit bestimmten Ausnahmen. So bildet der mutante Stamm I-3 (ATCC 53567) signifikant weniger Sporenketten,, als dies ATCC 31272 tut. In Experimenten der Anmelderin schien Raffinose das Wachstum von I-3 nicht zu unterstützen. Im Gegensatz zu der Beschreibung, die in der US 4.429.042 für ATCC 31272 gegeben wurde, konnten wir mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle kein Wachstum der Mutante eder von ATCC 31272 bemerken. Der Mutante I-3 fehlt die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren. Die doppelt defizitäre, erfindungsgemäße Mangelmutante S. avermitilis 7881, der die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlen und die durch weitere Mutation der Mutante I-3 (ATCC 53567) erzeugt wurde, besitzt eine ähnliche taxonomische Verwandtschaft mit ATCC 31272 wie der mutante Stamm I-3.
Streptomyces avermitilis I-3 und 7881 wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, einer anerkannten Kulturenbank, die den Verbleib der hinterlegten Kulturen gewährleistet, sowie leichten Zugriff der Öffentlichkeit auf diese, falls ein Patent auf diese Anmeldung erteilt wird. Ihnen wurden die Bezeichnungen Streptomyces avermitilis ATCC 53567 bzw. ATCC 53692 gegeben. Die hinterlegten Kulturen sind einer Person, die vom Präsidenten des Patentamtes und des Warenzeichenamtes der Vereinigten Staaten bestellt wird, zugänglich, solange diese Anmeldung anhängig ist, und zwar gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122, und in Übereinstimmung mit ausländischen Patentgesetzen von Ländern, in denen eine dieser Anmeldung entsprechende Anmeldung oder eine weiterführende Anmeldung eingereicht ist. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit der Mikroorganismen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich zurückgenommen, sobald das Patent erteilt ist.
Jede der Kulturen S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 und NCIB 12121 produziert die natürlichen Avermectine, Verbindungen mit der Formel (I)
worin die gestrichelte Linie in 22-23-Position eine fakultative Doppelbindung darstellt,
R¹ Hydroxy ist und nur dann vorhanden ist, wenn die Doppelbindung fehlt,
R² 4'-(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrosyloxy mit der Formel
ist,
R³ Wasserstoff oder Methyl ist, und
R isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist. Das US Patent 4.285.963 beschreibt ein Avermectin mit der Formel (I), worin die 25-Stellung mit einer Methylgruppe und einer Ethylgruppe substituiert ist, R¹ Hydroxy ist und R³ Methyl ist.
In den nicht-natürlichen Avermectinen, auf die in dieser Schrift Bezug genommen wird, ist R ein Substituent, der nicht die Bedeutung Isopropyl oder (S)-sec-Butyl besitzt und der wie unten angegeben definiert ist.
Die Verbindungen, die für den Einsatz bei der Biosynthese der Verbindungen mit der Formel (I) essentiell sind, sind in der Zelle von S. avermitilis und im Medium vorhanden. Diese Verbindungen entstehen beim Abbau von L-Valin und L-Isoleucin oder aus ihren entsprechenden 2-Oxosäuren via Decarboxylierung der 2-Oxosäuren durch die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren, gleichzeitig mit der Kopplung des Produkts an Coenzym A. Ihr Vorhandensein ist der Grund für die nebeneinander ablaufende Produktion sowohl der Isopropyl- als auch der (S)-sec-Butyl-Verbindungen mit der Formel (I). Hieraus entstehen natürlich Probleme beim Trennen der Isopropyl- von den (S)-sec-Butyl-Derivaten.
Wenn sie in einem Nährmedium fermentiert werden, das die geeignete Starter-Verbindung enthält, produzieren die erfindungsgemäßen Mutanten eine Verbindung mit der Formel (I) oder, wie es häufiger der Fall ist, eine Mischung von zwei oder mehr Verbindungen mit der Formel (I), worin R der eingesetzten Starter-Verbindung entspricht. Es können bis zu zwei Produkte gebildet werden, beguemlichkeitshalber mit Trivialnamen R-Avermectin 31 und 32 genannt, entsprechend den im US Patent 4.429.042 verwendeten Bezeichnungen. Die "R-"Gruppe bezieht sich natürlich auf den C-25-Substituenten. Beispielsweise sind, wenn R Cyclopentyl ist, die zwei möglichen Avermectine: Trivial-Name Cyclopentylavermectin B1 Cyclopentylavermectin B2 Doppelbindung Hydroxy
In den nicht-natürlichen Avermectinen ist der C-25-Substituent "R" in der Formel (I) ein anderer als Isopropyl oder (S)-sec-Butyl.
Verbindungen mit der Formel (I), in denen die Doppelbindung vorliegt und OH fehlt, können alternativ durch eine Dehydratisierungsreaktion aus den entsprechenden Verbindungen mit der Formel (I) hergestellt werden, in denen R OH ist und die Doppelbindung fehlt. Die Reaktion wird durchgeführt, indem zuerst die Hydroxygruppen in 5- und 4"-Stellung selektiv geschützt werden, z.B. in Form des t-Butyldimethylsilyloxyacetyl-Derivats, dann mit einem substituierten Thiocarbonsäurehalogenid, zum Beispiel (4-Methylphenoxy) thiocarbonsäurechlorid, umgesetzt wird und dann in einem Solvens mit hohem Siedepunkt, z.B. Trichlorbenzol, erhitzt wird, um die Dehydratation zu bewirken. Das Produkt wird schließlich von den Schutzgruppen befreit und liefert dabei die ungesättigte Verbindung. Diese Schritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen, im US Patent 4.328.335 beschrieben.
Verbindungen mit der Formel (I), worin R¹ H ist und die Doppelbindung fehlt, können aus den entsprechenden Verbindungen, in denen die Doppelbindung vorliegt und R¹ fehlt, durch selektive katalytische Hydrierung mit Hilfe eines geeigneten Katalysators hergestellt werden. Zum Beispiel kann man die Reduktion unter Verwendung von Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)chlorid ausführen, wie in der Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung 0001689 und in dem ihr entsprechenden US Patent 4.199.569, veröffentlicht am 22. April 1980, beschrieben.
Die Verbindungen mit der Formel (I), worin R² H ist, werden aus den entsprechenden Verbindungen hergestellt, in denen R² 4-'(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrosyloxy ist, indem man die 4'-(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleandrose-Gruppe durch milde Hydrolyse mit einer Säure in einem wäßrigen organischen Solvens entfernt und dabei das Aglycon mit einer Hydroxygruppe in der 13-Stellung erhält; dieses wird dann halogeniert, zum Beispiel durch Umsetzung mit einem Benzolsulfonylhalogenid, wobei das 13-Desoxy-13-Halogen-Derivat entsteht, welches schließlich selektiv reduziert wird, zum Beispiel mit Tributylzinnhydrid. Um unerwünschte Nebenreaktionen zu vermeiden, ist es wünschenswert, andere Hydroxygruppen, die vorliegen können, zu schützen, zum Beispiel unter Verwendung einer tert.-Butyldimethylsilyl-Gruppe. Diese wird dann nach dem Halogenierungs- oder Reduktionsschritt durch Versetzen mit Methanol, das eine Spur Säure enthält, leicht abgespalten. All diese Schritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen für ihre Ausführung, in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0002615 beschrieben.
Die Verbindungen, die von den erfindungsgemäßen Stämmen von S. avermitilis für die Biosynthese von Avermectinen, natürlichen und nicht-natürlichen, verwertet werden können, sind Verbindungen mit der Formel (II-A)
RCOOH (II-A)
einschließlich von Verbindungen, die während des Fermentationsprozesses in (II-A) überführt werden können. Diese Verbindungen werden hier als "Starter-Verbindungen" bezeichnet. In der Formel (II-A) ist R eine alpha-verzweigte Gruppe, deren Kohlenstoffatom, an das die COOH-Gruppe gebunden ist, wiederum mit mindestens zwei weiteren Atomen oder Gruppen verknüpft ist, die nicht Wasserstoff sind. Diese Definition umfaßt natürlich gesättigte und ungesättigte, acyclische und cyclische Gruppen einschließlich solcher, die fakultativ ein Schwefel- oder Sauerstoff Heteroatom als Glied in der acyclischen Kette oder im cyclischen Ring tragen. Spezifischer kann R, das zum C-25-Substituenten wird, eine alpha-verzweigte C&sub3;-C&sub8;-Alkyl, -Alkenyl, -Alkinyl, -Alkoxyalkyl oder -Alkylthioalkylgruppe, eine C&sub5;-C&sub8;- Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine verzweigtkettige C&sub2;-C&sub5;-Alkylgruppe ist, eine C&sub3;-C&sub8;-Cycloalkyl- oder C&sub5;-C&sub8;-Cycloalkenylgruppe, die beide fakultativ mit Methylen oder einer oder mehreren C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatomen (Fluor, Chlor, Iod oder Brom) substituiert sein können, oder ein 3- bis 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender, heterocyclischer Ring sein, der gesättigt oder ganz oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ durch eine oder mehrere C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein kann.
Verbindungen, die im Fermentationsprozeß in RCOOH umwandelbar sind, d.h. Vorläufer, sind Verbindungen mit der Formel (II-B), worin R wie oben definiert ist:
R-(CH&sub2;)n-Z (II-B)
worin n 0, 2, 4 oder 6 ist und Z-CH&sub2;OH, -CHO, -CH&sub2;NH&sub2;, -COOR&sub4; oder -CONHR&sup5; ist, wobei R&sup4; H oder (C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;&submin;&sub4;)Alkyl oder der Rest einer Aminosäure ist, insbesondere von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Methionin, z.B. -CH(COOH)CH&sub2;COOH, -CH(COOH) (CH&sub2;)&sub2;COOH bzw. -CH(COOH) (CH&sub2;)&sub2;SCH&sub3;.
Ebenfalls von dieser Erfindung eingeschlossen sind die isomeren Formen der Verbindungen mit der Formel (II-A) und Verbindungen, die während des Fermentationsverfahrens in diese umgewandelt werden können, und die am C-25 isomeren Avermectine, die infolge ihrer Verwendung im hier beschriebenen Verfahren entstehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem man einen Stamm S. avermitilis, dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O- Transferase-Aktivität fehlen, in einem wäßrigen Nährmedium aerob fermentiert, das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff, anorganische Salze und eine Verbindung mit der Formel RCOOH oder eine Verbindung enthält, die während der Fermentation in diese Verbindung umgewandelt werden kann (d.h. einen Vorläufer). Die Säure oder die Verbindung, die in diese überführt werden kann, wird der zu fermentierenden Kultur entweder zum Zeitpunkt des Animpfens oder in Intervallen während der Fermentation zugesetzt. Die Erzeugung der Avermectin-Produkte kann beobachtet werden, indem Proben aus der Fermentationsbrühe entnommen und mit einem organischen Solvens extrahiert werden und indem man das Erscheinen des Produkts mittels Chromatographie verfolgt, zum Beispiel unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute des Produktes maximal ist, im allgemeinen für einen Zeitraum von 4 bis 15 Tagen.
Eine bevorzugte Menge der jeweils zuzusetzenden Starter-Verbindungen (Carbonsäure oder Verbindung, die in diese umgewandelt werden kann) liegt zwischen 0,05 und 3,0 Gramm pro Liter. Die Starter-Verbindung kann kontinuierlich, intermittierend oder auf einmal der Fermentationsbrühe zugesetzt werden. Die Säure (RCOOH) wird als solche oder als Salz ugesetzt, zum Beispiel als Natrium-, Lithium oder Ammoniumsalz, oder in Form einer Verbindung, die sich in die Säure umwandeln läßt, wie oben definiert. Die Säure wird, wenn sie ein Feststoff ist, vorzugsweise in einem geeigneten Solvens wie Wasser oder (C&sub1;&submin;&sub4;)Alkoholen aufgelöst.
Die für die Fermentation verwendeten Medien können, insbesondere, wenn der C-25-Substituent Tsopropyl oder (S)-sec-Butyl sein soll, gängige Medien sein, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente enthalten.
Wenn der C-25-Substituent eine nicht-natürliche Gruppe sein soll, d.h. er nicht Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, dann ist das Fermentationsmedium ein solches, in welchem unter den gewählten Bestandteilen diejenigen Starter-Verbindungen fehlen oder nur in minimalen Mengen vorhanden sind, in denen die R-Gruppe Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.
Nach mehrtägigem Fermentieren bei einer Temperatur im Bereich von vorzugsweise 24 bis 33ºC wird die Fermentationsbrühe zentrifugiert oder filtriert, und der Mycelkuchen wird mit vorzugsweise Aceton oder Methanol extrahiert. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das gewünschte Produkt wird dann in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Solvens extrahiert, zum Beispiel in Methylenchlorid, Ethylacetat, Chloroform, Butanol oder Methylisobutylketon. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das Rohprodukt wird, wenn notwendig, durch Chromatographie weiter gereinigt, zum Beispiel unter Verwendung von präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (reverse phase HPLC)
Das Produkt erhält man im allgemeinen als Mischung der Verbindungen mit der Formel (I), worin R² 4'-(alpha-L-Oleandrolsyl)-alpha-L-oleandrosyloxy ist, R¹ OH ist und die Doppelbindung fehlt oder R¹ fehlt und die Doppelbindung vorhanden ist, und worin R³ H ist. Verbindungen, in denen R³ CH&sub3; ist, liegen im wesentlichen nicht vor. Die Anteile der einzelnen Verbindung können jedoch in Abhängigkeit von der jeweiligen Mutante, der eingesetzten Starter-Verbindung und den verwendeten Bedingungen schwanken.
Die Quelle für die R-Gruppe, d.h. ob diese direkt aus R-COOH stammt oder aus einem der obengenannten Vorläufer oder aus einem beliebigen Vorläufer gebildet wird, ist für die Produktion der Avermectine ohne Bedeutung. Das entscheidende Erfordernis des erfindungsgemäßen Verfahrens für ihre Herstellung ist, daß die gewünschte Gruppe R für die erfindungsgemäßen S. avermitilis-Stämme im Fermentationsprozeß verfügbar gemacht wird.
Geeignete Verbindungen umfassen die folgenden:
2,3-Dimethylbuttersäure
2-Methylhexansäure
2-Methylpent-4-ensäure
2-Cyclopropyl-propionsäure
4,4-Difluorcycohexancarbonsäure, Lithiumsalz
4-Methylencyclohexancarbonsäure
3-Methylcyclohexancarbonsäure (cis/trans)
1-Cyclopentencarbonsäure
1-Cyclohexencarbonsäure
Tetrahydropyran-4-carbonsäure
Thiophen-2-carbonsäure
3-Furansäure
2-Chlorthiophen-4-carbonsäure
Cyclobutancarbonsäure
Cyclopentancarbonsäure
Cyclohexancarbonsäure
Cycloheptancarbonsäure
2-Methylcyclopropancarbonsäure
3-Cyclohexen-1-carbonsäure
2-Methylthiopropionsäure
2-Methyl-4-methoxybuttersäure
Thiophen-3-carbonsäure
Hydroxymethylcyclopentan
3-Thiophencarboxaldehyd
3-Cyclohexylpropionsäure
3-Cyclopentylpropionsäure
Hydroxymethylcyclobutan
Tetrahydrothiophen-3-carbonsäure
3-Cyclopentyl-1-propanol
3-Methylcyclobutancarbonsäure, Lithiumsalz
3-Fluorcyclobutancarbonsäure
3-Methylencyclobutancarbonsäure, Lithiumsalz
2-Methyl-4-methylthiobuttersäure
Tetrahydrothiopyran-4-carbonsäure
Cyclobutylmethylamin
Cyclobutancarbonsäureethylester
4-Hydroxymethylcyclopenten
2-(3-Thiophencarbonyl)propionsäureethylester
(S)-2-Methylpentansäure
(R)-2-Methylpentansäure
Aus den hier beschriebenen, bezüglich der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren negativen Mangelmutanten können drei Klassen an O-Methyltransferase-Mutanten gewonnen werden. Mutanten, in denen eine Mutation der aktiven Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren mit einer oder mehreren O-Methyltransferase-Mutationen gekoppelt ist, ergibt Stämme von S. avermitilis, die, wenn sie mit RCOOH-Verbindungen oder Verbindungen gefüttert werden, welche während des Fermentationsprozesses in RCOOH überführt werden können, vorwiegend B Avermectine, Demethylavermectine oder Avermectine liefern, die überhaupt nicht methyliert sind. Diese Mutanten erhält man durch Mutagenese der hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, mit Hilfe von ultraviolettem Licht und/oder chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N-Nitrosourethan, Nitrosoguanidin oder anderen Agentien wie den oben aufgezählten. Alternativ können bezüglich der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren positive Mutanten, denen eine oder beide der O-Methyltransferasen fehlt/fehlen, durch Behandeln mit UV-Licht oder einem Mutagen mutiert werden, wobei man Dehydrogenase-Mangelmutanten für verzweigtkettige 2-Oxosäuren erhält.
Die nicht-natürlichen Avermectine, die von solchen Mutanten gebildet werden, sind dadurch gekennzeichnet, daß in C-5-Stellung der Aglycon-Einheit und/oder in C-3'- und/oder C-3"-Stellungen der Oleandrosegruppen Hydroxygruppen vorliegen.
Die oben beschriebenen Mutanten werden nach dem Verfahren, das von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986) beschrieben wurde, identifiziert. Sie eignen sich in gleicher Weise für die selben Zwecke wie die bekannten Avermectine.
Alternativ werden erhöhte Mengen der B-Avermectine einschließlich derer, denen Methyl-Gruppen an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe fehlen, durch Fermentieren der erfindungsgemäßen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, in Gegenwart einer Substanz wie Sinefungin, S-Adenosylethionin oder S-Adenosylhomocystein hergestellt, welche die O-Methyl-Transferase-Aktivität inhibiert.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hochaktive Mittel gegen Parasiten und besitzen besonderen Wert als Antihelmintica, Ektoparasitizide, Insektizide und Acarizide.
So sind die Verbindungen bei der Behandlung einer Vielzahl von Zuständen wirksam, die durch Endcparasiten verursacht werden, einschließlich insbesondere von Helminthiasis, die am häufigsten von einer Gruppe parasitärer Würmer verursacht wird, welche als Nematoden beschrieben wurden, und die schwere ökonomische Verluste bei Schweinen, Schafen, Pferden und Rindvieh verursachen sowie Haustiere und Geflügel befallen können. Die Verbindungen wirken auch gegen andere Nematoden, die verschiedene Tierspezies befallen können, einschließlich beispielsweise Dirofilaria in Hunden und verschiedene Parasiten, die Menschen infizieren können, worunter auch gastrointestinale Parasiten wie Ancytostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius und Parasiten fallen, die im Blut oder in anderen Geweben oder Organen gefunden werden, z.B. Fadenwürmer und die extraintestinalen Stadien von Strongyloides und Trichinella.
Die Verbindungen sind außerdem bei der Behandlung von Ecto- Parasiten-Infektionen von Wert, wobei insbesondere arthropode Ektoparasiten von Tieren und Vögeln eingeschlossen sind, z.B. Zecken, Milben, Läuse, Flöhe, Schmeißfliegen, saugende Insekten und wandernde Zweiflügler-Larven, die Rindvieh und Pferde befallen können.
Die Verbindungen sind auch Insektizide, die gegen Ungeziefer wirksam sind, z.B. gegen Küchenschaben, Kleidermotten, Teppichkäfer und Hausfliegen, und sie sind auch nützlich bei der Bekämpfung von Insekten-Schädlingen in gelagertem Getreide und landwirtschaftlichen Pflanzungen, z.B. von Blattspinnmilben, Blattläusen, Raupen und bei der Bekämpfung von wandernden Geradflüglern, z.B. von Wanderheuschrecken.
Die Verbindungen mit der Formel (I) werden in einer Darreichungsform verabreicht, die dem spezifischen, ins Auge gefaßten Zweck und der jeweiligen Spezies des tierischen Wirts, der behandelt werden soll, und dem betreffenden Insekt angepaßt ist. Für die Verwendung als Antihelmintica können die Verbindungen oral in Form einer Kapsel, eines Bolus', einer Tablette oder eines flüssigen Arzneitranks verabreicht werden, oder sie können alternativ durch Injektion oder als Implantat gegeben werden. Solche Formulierungen werden der tierärztlichen Standardpraxis gemäß auf übliche Weise hergestellt. So können Kapseln, Boli oder Tabletten hergestellt werden, indem man den aktiven Bestandteil mit einem geeigneten, fein verteilten Verdünnungsmittel oder Träger vermischt, wobei zusätzlich ein den Zerfall förderndes Mittel und/oder ein Bindemittel enthalten sein kann, z.B. Stärke, Lactose, Talcum, Magnesiumstearat etc. Eine Arzneitrank-Formulierung dann man herstellen, indem man den aktiven Bestandteil zusammen mit Dispersions- oder Netzmitteln etc. in einer wäßrigen Lösung dispergiert, und injizierbare Formulierungen können in Form einer sterilen Lösung bereitet werden, die andere Substanzen enthalten kann, beispielsweise ausreichend Salze und Glucose, um die Losung mit Blut isotonisch zu machen. Diese Formulierungen werden bezüglich der Einwaage an aktiver Verbindung in Abhängigkeit vom zu behandelnden Wirtstier, von der Schwere und Art der Infektion und dein Körpergewicht des Wirts schwanken. Im allgemeinen wird für die orale Verabreichung eine Dosis von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Körpergewicht des Tieres ausreichen, die als einzelne Dosis oder in geteilten Dosen über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen dargereicht wird, aber es können naturlich Umstände eintreten, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angezeigt sein werden, und auch diese liegen im Rahmen dieser Erfindung.
Alternativ können die Verbindungen mit dem Tierfutter verabreicht werden, und für diesen Zweck kann man einen konzentrierten Futterzusatz oder eine Vormischung herstellen, die mit dem normalen Tierfutter vermischt werden kann.
Für den Einsatz als Insektizide und für die Behandlung von landwirtschaftlichen Schädlingen werden die Verbindungen in Übereinstimmung mit der landwirschaftlichen Praxis in Form von Sprays, Stäubemitteln, Emulsionen und ähnlichem angewendet.

Erzeugung von S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

Schritt 1.

S. avermitilis ATCC 31272 wurde auf New Patch Agar Medium 12 Tage lang bei 30ºC gezüchtet, bis ein konfluenter Rasen entstanden war. Das Medium enthielt
V-8-Saft* 200 ml
CaCO&sub3; 3 Gramm
Agar 15 Gramm
H&sub2;O ad 1000 ml
Nährbrühe 1,0 Gramm/l
Natriumacetat x 3 H&sub2;O 1,4 Gramm/l
Isovaleriansäure 50 mg/l
Isobuttersäure 50 mg/l
2-Methylbuttersäure 50 mg/l
Isoleucin 250 mg/l
Leucin 250 mg/l
Valin 250 mg/l
Spurenelement-Lösung** 1 ml/l
* Eine Mischung aus 8 Gemüsesäften (Tomate, Karotte, Sellerie, Rote Beete, Petersilie, Lattich oder Kopfsalat, Brunnenkresse und Spinat) plus Salz, Ascorbin- und Zitronensäure und natürliche Aromastoffe. Zu beziehen von Campbell Soup Company, Camden, NJ.
** Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung:
FeCl&sub3; x 6 H&sub2;O 2,7 g
MnSO&sub4; x H&sub2;O 4,2
CuSO&sub4; x 5 H&sub2;O 0,5
CaCl&sub2; 11,0
H&sub3;BO&sub3; 0,62
CoCl&sub2; x 6 H&sub2;O 0,24
ZnCl&sub2; 0,68
Na&sub2;MoO&sub4; 0,24
Die obige Mischung ist in 1 Liter 0,1N HCl zu lösen.
Von dreien solcher Platten wurden Sporen geerntet und in 20 ml 0,05M Tris-Maleinsäurepuffer, pH 9,0, suspendiert.

Schritt 2.

10 ml der Sporen-Suspension wurden in ein Gefäß gegeben, das 10 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) enthielt. Das Gefäß wurde bei 28ºC 60 Minuten lang inkubiert und geschüttelt, und dann wurden die Sporen ausgiebig mit 1%iger NaCl-Lösung gewaschen.

Schritt 3.

Die gewaschenen Sporen wurden in 1%igem NaCl suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 80 %igem Ethylenglycol gemischt. Man konservierte diese Suspension bei -20ºC und verwendete sie als Ausgangsmaterial für Zellen, die auf Mutanten untersucht werden sollten. Das ergab beim Aussäen etwa 10&sup4; Kolonien/ml.
Diese Sporen-Stammlösung wurde auf YPD-Platten aufgebracht und ergab dabei annähernd 100 Kolonien pro Platte (YPD-Medium enthält jeweils 10 g/l Hefeextrakt, Bacto-Pepton* und Dextrose und 15 g/l Bacto-Agar*, vor dem Autoklavieren auf pH 6,9 eingestellt) . Die mit einem Sternchen versehenen Inhaltsstoffe sind von Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238 zu beziehen.

Schritt 4.

Einzelne Kolonien wurden nach zwei- bis dreiwöchigem Wachstum bei 28ºC von den Platten abgenommen und in einzelne Schalen einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Schalen überführt. Außerdem wurde ein kleiner Teil der Kolonie auf ein frisches Agar-Medium aufgebracht, der als Quelle für lebensfähige Zellen dienen sollte, wenn die Mutanten identifiziert waren.

Schritt 5.

In jede Schale gab man annähernd 75 Mikroliter eines flüssigen M9-Salz-Mediums, das 1% Glucose, 0,1% Casaminosäuren und jeweils 0,01% Isovaleriansäure, Isobuttersäure und 2-Methylbuttersäure enthielt. Nach einigen Tagen der Inkubation bei 28ºC wurden die Zellen auf das Vorhandensein von Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren überprüft. (Jeweils ein Liter M9-Salz-Medium enthält 6g Na&sub2;HPO&sub4;, 3g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5g NaCl und 1g NH&sub4;Cl. Das Medium wird autoklaviert und dann werden aseptisch jeweils 1 ml sterilisiertes 1M MgSO&sub4; und 0,1M CaCl&sub2; zugesetzt)

Schritt 6.

Eine Mikrosuspension aus 5% Toluol in M9-Salz-Medium wurde durch eine kurze Behandlung mit Ultraschall der nicht mischbaren Mischung hergestellt. Zu 25 ml dieser Suspension setzte man 1,2 ml einer Lösung zu, die [¹&sup4;-C-1]-2-Oxoisocapronsäure, 2,5 Mikrocurie/ml und 10,0 Mikrocurie/Mikromol enthielt. 50 Mikroliter dieser gesamten Mischung wurden in jede der Schalen der Mikrotiterplatten gegeben, die die zu untersuchenden Kolonien enthielt.

Schritt 7.

Das ¹&sup4;CO&sub2;, das in jeder Schale produziert wurde, wurde aufgefangen und nach dem von Tabor et al., J. Bacteriol. 128 485-486 (1976) unter dem Titel "Convenient Method for Detecting ¹&sup4;CO&sub2; in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants" beschriebenen Verfahren sichtbar gemacht. Mangelmutanten, denen die aktive Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, produzieren nicht mehr Ba¹&sup4;CO&sub2; als das, das man bei den Kontrollen beobachtet.
Ein verfeinertes Verfahren, das den Unterschied zwischen einem Positiven Test aur ¹&sup4;CO&sub2;, ersichtlich aus einem dunklen Flecken auf dem Autoradiogramm als Folge der Ba¹&sup4;CO&sub3;-Bildung, und einem negativen Test, ersichtlich daraus, daß kein Fleck oder nur ein sehr schwacher Fleck erscheint, verbessert, umfaßt das folgende, modifizierte Testverfahren.
Einzelne Kolonien (siehe Schritt 4 oben) wurden nach 7-14 Tagen des Wachstums vom Agar-Medium abgenommen (eher als nach 2 bis 3 Wochen) und direkt mit Hilfe der Schritte 6 und 7 untersucht. Der obengenannte Schritt 5 entfällt.
Ein noch stärker verfeinertes Untersuchungsverfahren, das die ¹&sup4;CO&sub2;-Freisetzung quantitativ erfaßt, umfaßt das Züchten der Mutanten, die mittels der obengenannten Tests gefunden wurden, auf einem geeigneten Medium, das M9-Salz- Medium mit Glucose, 1%ig, und "Syncasa-bcaa" 0,1%ig, enthält (eine synthetische Mischung von L-Aminosäuren mit der angenäherten Zusammensetzung kommerzieller Casaminosäuren, aber ohne daß L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin vorhanden sind, siehe unten).
Nachdem man sie bis zu hoher Zelldichte wachsen ließ, wurden die Zellen in M9-Salz-Medium gewaschen und in kaltem, 1% Toluol enthaltendem M9-Salz-Medium resuspendiert, das mit Ultraschall behandelt worden war, um eine milchig weiße Dispersion des Toluols zu erzielen. Die Zellen/Puffer/Toluol-Suspension wurde 40 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren. Die permeabilisierten Zellen wurden dann in M9-Salz-Medium gewaschen und schließlich in einem Fünftel des ursprünglichen Volumens an M9-Medium-Puffer resuspendiert. 180 Mikroliter dieser Suspension wurden pro Bestimmung verwendet.
Ein Reaktionsvolumen von 300 Mikroliter enthielt die mit Toluol behandelten Zellen, 0,4 mM Thiamin Pyrophosphat (TPP) 0,11 mM Coenzym A (CoA), 0,68 mM Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD), 2,6 mM Dithiothreitoi (DTT), 4,1 mM MgC1 60 mM Tris- HC1, 60 mM Tris-HCl mit pH 7,5 und 6,000 cpm [¹&sup4;-C-1]alpha- Ketoisocaproat, Mikrocurie pro Mikromol. Die Zäh1ausbeute betrug 73 %. Die Reaktion wurde in 5 ml fassenden Scintillationszählergefäßen durchgeführt, die ein 2 x 2 cm großes Whatman #4-Papierquadrat unthielten, das in die Schraubkappe der Gefäße gedrückt war. Das Papier enthielt 30 Mikroliter 1M Hyaminhydroxid (1M Lösung aus Methylbenzethoni hydroxid in Methanol, zu beziehen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) , das während der Reaktion freigesetztes ¹&sup4;CO&sub2; auffängt. Nach 2-stündigem Inkubieren wurden die Papierchen in 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (Flüssigkeitsscintillationszähler), das von New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 bezogen werden kann), eingetaucht, und die Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeitsscintillationszähler gemessen, nachdem man sie in diesem Solvens mindestens 4 Stunden lang äquilibriert hatte. Eine Reaktionsmischung der Leerkontrolle (d.h. keine Zellen) ergibt ca. 50-300 cpm.
Die Mutante I-3 und andere gleich ihr ergaben Impulszahlen, die niedriger als oder gleich groß wie die der Leerkontroll-Reaktionsmischung waren, während der elterliche Stamm eine Zahl von Impulsen ergab, die mehrfach höher als der Wert für die Leerkontrolle war.

Zusammensetzung von "Syncasa-bcaa", 100faches Konzentrat

Gramm/liter
L-Alanin 3
L-Arginin 4
L-Asparaginsäure 6
L-Cystin 1
L-Glutaminsäure 20
Glycin 1
L-Histidin 2
L-Lysin 7
L-Methionin 3
L-Phenylalanin 6
L-Prolin 10
L-Serin 6
L-Threonin 4
L-Tyrosin 4
L-Tryptophan 1
Die Mischung wird auf pH 7 eingestellt und filtrationssterilisiert. Ein Volumenteil des Konzentrats wird zu 99 Volumenteilen Medium zugesetzt, um die Konzentration für Standardbedingungen zu erzielen.

Erzeugung doppelt blockierter Mutanten von S. avermitilis 7881 (ATCC 53692), denen die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlt

Schritt 1.

S. avermitilis ATCC 53567 wurde auf New Patch Agar Medium 12 Tage lang bei 30ºC gezüchtet, bis ein konfluenter Rasen entstanden war.
Von dreien solcher Platten wurden Sporen geerntet und in 20 ml 0,05M Tris-Maleinsäurepuffer, pH 9,0, suspendiert.

Schritt 2.

10 ml der Sporen-Suspension wurden in ein Gefäß gegeben, das 10 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) enthielt. Das Gefäß wurde bei 28ºC 60 Minuten lang inkubiert und geschüttelt, und dann wurden die Sporen ausgiebig mit i%iger NaCl-Lösung gewaschen.

Schritt 3.

Die gewaschenen Sporen wurden in 1%iger NaCl suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 80 %igem Ethylenglycol gemischt. Man konservierte diese Suspension bei -20ºC und verwendete sie als Ausgangsmaterial für Zellen, die auf Mutanten untersucht werden sollten.
Diese Sporen-Stammlösung wurde auf YPD-Platten aufgebracht und ergab dabei annähernd 100 Kolonien pro Platte. Kolonien der mutierten Population (die mit Nitrosoguanidin behandelt war) vom Stamm Streptamyces avermitilis I-3 (ATCC 53567) werden abgenommen und auf ein Agar-Medium verteilt aufgegeben, das wie folgt hergestellt war (Gramm pro Liter) : Verfiüssigte Stärke, 80, K&sub2;HPO&sub4;, 1, MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 1, Ardamin pH, 5, CaCO&sub3;, 5, P-2000, 1 ml, FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,01, MnCl&sub2; x 4 H&sub2;O, 0,001, ZnSO&sub4; x 7 in H&sub2;O, 0,001, Bacto-Agar, 17, destilliertes Wasser ad 980 ml. Der pH wird mit NaOH auf 7,0 eingestellt, bevor bei 121ºC 20 Minuten lang autoklaviert wird. Nach dem Autoklavieren werden 20 ml einer sterilen 5- %igen Stammlösung von (±)-2-Methylbuttersäure, pH 7,0, zugesetzt.
Die Agar-Kulturen werden 8 bis 12 Tage bei 28ºC inkubiert. Zellen (Mycelien) werden von der Agar-Oberfläche abgenommen und in 250 Mikroliter Aceton gegeben. Fünfundzwanzig (25) Mikroliter des Acetonextrakts werden dann auf mit Analtech Silica Gel GF vorbeschichtete Dünnschicht-Platten aufgetragen. 30 bis 40 Minuten lang wird mit Ethyiacetat als Solvens chromatographiert, dann wird das Chromatogramm getrocknet und mit 3 % Vanillin in Ethanol besprüht. Die Platten werden 1 bis 3 Minuten lang in einen 100ºC heißen Ofen gestellt und dann mit 3 % Schwefelsäure in Ethanol besprüht, und dann werden sie nochmals 10 bis 15 Minuten lang in einen 100ºC heißen Ofen gegeben. Mutanten, denen die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlt, werden anhand einer Änderung im Muster des Chromatogramms identifiziert, d.h. die Flecken, die den Avermectin-B-Komponenten entsprechen (Rf ca. 0,54 bzw. 0,42 für Bl bzw. B2) sind nach wie vor vorhanden, aber es fehlen die Flecken, die den Avermectin-A-Komponenten entsprechen (Rf ca. 0,69 und 0,58 für Al bzw. A2).

Allgemeines Verfahren für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Mobile Phase:

150 ml Wasser
70 ml Acetonitril
ad 1 Liter mit Methanol bringen

Säule:

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)
Flußrate: 0,75 ml/Minute
Detektion: UV bei 240 nm
Dämpfung: etwa 6

Probenverdünnungsmittel (D):

35 ml Acetonitril plus 390 ml Methanol

Standards:

1. Man wiege 0,5 mg Avermectin A2a in einen 10 ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf.
2. Man wiege 0,5 mg Testprodukt in einen 10 ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf.
1 und 2 sind Standard-Stammlösungen: zur Herstellung von Arbeits-Standards gebe man :
100 ul (1) und 100 ul (2) in ein Röhrchen und setze 800 ul mobile Phase hinzu.

Proben:

1. Man nehme 1 ml gut geschüttelte Kulturbrühe und zentrifugiere herunter
2. Man entferne soviel Uberstand wie möglich, ohne das Pellet aufzuwirbeln
3. Man setze dem Pellet 100 ul HPLC-Wasser zu und vermische auf einem Vortex-Mischer, um zu dispergieren
4. Man setze 2 ml Verdünnungsmittel (D) zu und mische gut
5. Man filtriere dieses und lasse es über die HPLC-Säule laufen.
Die natürlichen und nicht-natürlichen Avermectine, die hier beschrieben sind, wurden diesem chromatographischen HPLC-Verfahren unterzogen, und die Retentionszeit der Peaks der einzelnen Avermectine wurde durch die Retentionszeit geteilt, die für das vorhandene Oligomycin A beobachtet wurde, welches als interner Standard für eine gegebene HPLC-Bestimmung dient. Oligomycin A wird bei Fermentationen von S. avermitilis mit Hilfe von HPLC fast immer als Nebenprodukt beobachtet, und es ist das einzige Produkt, das sich durch HPLC nachweisen läßt, das von den hier beschriebenen Mutanten produziert wird, wenn diese in einem Medium kultiviert werden, das frei von Säuren RCOOH, wobei R die hier angegebene Definition besitzt, oder von Verbindungen ist, die sich in Säuren mit der Formel RCOOH umwandeln tassen, wobei R die hier angegebene Bedeutung besitzt. Die typische Retentionszeit für Oligomycin A beträgt 12,5-14 Minuten. Das Verhältnis der Retentionszeiten (RT) liefert eine genauere Basis für den Vergleich der Identität und der Ausbeuten an Avermectin-Produkten. Die gewöhliche Erscheinungsfolge der Avermectine nach HPLC ist B2, A2, B1, und A1. Natürliche Avermectine RT/RT (Oligomycin A)
Es ist anzumerken, daß B1a und A1b nicht aufgetrennt sind. Nicht natürliche Avermectine RT/RT (Oligomycin A) Cyclopentyl
Die Retentionszeiten schwanken an den verschiedenen Meßtagen um 1-2 Minuten, wobei Oligomycin im allgemeinen nahe 12,5-14 Minuten erscheint.
In den folgenden Eeispieten wurden die Avermectine nach dem oben beschriebenen HPLC-Verfahren bestimmt, sofern nichts anderes angegeben ist.
Die Zusammensetzung der in den folgenden Beispielen verwendeten Medien ist unten angegeben.

AS-7-Medium

g/l
Verflüssigte Stärke a 20
Ardamin pH b 5
Pharmamedia c 15
CaCO&sub3; 2
a Hergestellt durch Hydrolyse von Stärke durch Alpha- Amylase aus Bacillus licheniformis (zu beziehen von Novo Enzymes, Wilton, CT, und verkauft unter dem Warenzeichen "Termamyl") auf ein Dextroseäquivalent von 40% ± 5%.
b Von Yeasts Products, Inc., Clifton, NJ 07012
c Von Traders Protein., Memphis, TN 38108
Einstellen des pH auf 7,2 mit NaOH.

AP-5-Medium

g/l
Verflüssigte Stärke 80
Ardamin pH 5
K&sub2;HPO&sub4; 1
MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O 1
NaCl 1
CaCO&sub3; 7
FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O 0,01
MnCl&sub2; x 7H&sub2;O 0,001
ZnSO&sub4; x 7 H&sub2;&sub0; 0,001
P-2000 (Mittel gegen Schaumbildung)a 1 ml/l
a Von The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640 Einstellen des pH auf 6,9 mit 25 % NaOH

BEISPIELE 1-4

Avermectine aus Streptomyces avermitilis I-3 (ATCC 53567)

S. avermitilis I-3 ATCC 5367) von einer sporulierten V-8-Platte wurde in 80 ml AS-7-Medium in einen dreifach unterteilten, 500 ml fassenden Kolben gegeben. Der Kolben wurde bei 28-30ºC unter Schütteln bei 200 Upm auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde 1 ml der gesamten Brühe als Inokulum für 300 ml fassende Kolben mit 40 ml AP-5-Medium eingesetzt. Die Fermentationen wurden bei 28-30ºC in Gegenwart von 400 ppm jeweils einer der Starter-Verbindungen, die unten aufgelistet sind und die nach 24 Stunden zugesetzt wurden, in doppelter Ausführung durchgeführt.
Nach 312 Stunden wurden 2 ml-Proben der gesamten Brühe mit 8 ml Methanol:Acetonitril (390:35) vermischt. Nach Filtration wurden Proben mit einem Volumen von 50 ul auf eine Beckman Ultrasphere ODS-Säule (3,9 x 250 mm) injiziert. Die Säule wurde mit Methanol:Acetonitril:Wasser (89:14:7) mit einer Flußrate von 0,8 ml/min eluiert, und die Absorption des Eluates wurde mit einem UV-Detektor bei 240 nm verfolgt. Die Retentionszeiten der neuen Avermectine sind unten angegeben. Retentionszeiten der Avermectine (Minuten) Starter-Verbindung 1) ± 2-Methylbuttersäure 2) Cyclopentancarbonsäure 3) Cyclohexancarbonsäure 4) + 2-Methylbuttersäure * Sowohl +Methylbuttersäure als auch -Methylbuttersäure werden in Avermectine eingebaut. Unter den gewählten chromatographischen Bedingungen wird die Auflösung der + und - Avermectine nur bei B2 und A2 erreicht.

BEISPIEL 5

Cyclohexyl-Avermectine aus Streptomyces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Eine in einem Gläschen eingefrorene Kultur von S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) wurde zum Inokulieren von 100 ml AS-7-Medium in einem dreifach unterteilten, 500 ml fassenden Kolben eingesetzt. Der Kolben wurde bei 28-30ºC auf einem Rotationsschüttler unter Schütteln bei 200 UPm inkubiert. Nach 28-stündigem Inkubieren wurden 5 ml der gesamten Brühe zum Beimpfen von weiteren 100 ml AS-7-Medium in einem 500 ml fassenden, dreifach unterteilten Kolben verwendet. Der Kolben wurde nochmals bei 28-30ºC auf einem Rotationsschüttler unter Schütteln bei 200 Upm inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde 1 ml der gesamten Brühe verwendet, um einen 300 ml fassenden Kolben mit 40 ml AP-5-Medium zu beimpfen. Die Kolben wurden bei 28-30ºC bei 200 Upm inkubiert. Nach 24 Stunden wurden 400 ppm Cyclohexancarbonsäure zugesetzt, und nach 312 Stunden wurden Proben mit einem Volumen von 2 ml genommen und wie in Beispiel 1 beschrieben der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen. Unter diesen Bedingungen wurden die einzigen Avermectin-Bestandteile, die man in der Fermentationsbrühe finden konnte, bei 14,84 (54,9 mg/l) und 31,46 (32,1 g/l) Minuten eluiert, was Cyclohexyl-B2 bzw. -B1 entspricht.

BEISPIEL 6

Sec-Butyl-Avermectine aus Streptomvces avermitilis 7881 (ATCC 53692)

Das Verfahren des Beispiels 5 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von Cyclohexancarbonsäure 400 ppm ±2-Methylbuttersäure verwendet wurde, während alle anderen Bedingungen dieselben wie diejenigen waren, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Man fand in der Fermentationsbrühe nur sec-Butyl-Avermectin B2 (11,60, 12,40 Minuten, 63,5 42,4 mg/l) und sec-Butyl-Avermectin B1 (23,1 Minuten, 105,5 mg/l)

Claims

1. Streptomyces avermitilis. dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O- Methyltransferase-Aktivität fehlen.

2. Streptomyces avermitilis. dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O- Methyltransferase-Aktivität fehlen, gekennzeichnet durch die Unfähigkeit von dessen permeabilisierten Zellen, ¹&sup4;CO&sub2; aus zugefügter [¹&sup4;-C-1]-2-Oxoisocapronsäure zu produzieren.

3. Streptomyces avermitilis ATCC 53692.

4. Verfahren zur Herstellung eines B-Avermectins, welches das aerobe Fermentieren eines Stammes von Streptomyces avermitilis, dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2- Oxosäuren und die Avermectin-5-O-Methyltransferase-Aktivität fehlen, mit einem wäßrigen Nährmedium umfaßt, das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff und anorganische Salze und eine Verbindung enthält, die in der Biosynthese eines Avermectins verwertet werden kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin S. avermitilis der Stamm ATCC 53692 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Verbindung die Formel

R-COOH

hat, worin R eine alpha-verzweigtkettige Gruppe ist, deren Kohlenstoffatom, an das die -COOH-Gruppe gebunden ist, außerdem mit mindestens zwei anderen von Wasserstoff verschiedenen Atomen oder Gruppen verknüpft ist,

oder eine Verbindung ist, die während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandelbar ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin R eine alpha-verzweigte C&sub3;-C&sub8;-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe; eine C&sub5;-C&sub8;-Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine alpha-verzweigte C&sub2;-C&sub5;-Alkylgruppe ist; eine C&sub3;-C&sub8;-Cycloalkyl- oder C&sub5;-C&sub8;-Cycloalkenylgruppe ist, die beide fakultativ durch Methylen oder eine oder mehrere C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein können; oder ein 3- bis 6-gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender, heterocyclischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ durch eine oder mehrere C&sub1;-C&sub4;-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein kann, oder eine während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandelbare Verbindung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die in das Substrat RCOOH umwandelbare Verbindung

R-(CH&sub2;)n-Z

ist, worin R wie oben definiert ist, n 0, 2, 4 oder 6 ist und Z -CH&sub2;OH, -CHO, -COOR&sub4;, -CH&sub2;NH&sub2; oder -CONHR&sup5; ist, worin R&sup4; H oder (C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;&submin;&sub4;)Alkyl, -CH(COOH)CH&sub2;COOH, -CH(COOH)(CH&sub2;)&sub2;COOH oder -CH(COOH)(CH&sub2;)&sub2;SCH&sub3; ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin R

Cyclobutyl

Cyclopentyl

Cyclohexyl

Cycloheptyl

2-Methylcyclopropyl

3-Cyclohexenyl

1-Cyclopentenyl

1-Cyclohexenyl

3-Methylcyclohexyl (cis/trans)

4-Methylencyclohexyl

3-Methylcyclobutyl

3-Methylencyclobutyl

3 -Cyclopentenyl

1-Cyclopropylethyl

3-Fluorcyclobutyl

4,4-Difluorcyclohexyl

Isopropyl

sec-Butyl

2-Pentyl

2,,3-Dimethylpropyl

2-Hexyl

2-Pent-4-enyl

2-Methylthioethyl

S-2-Pentyl

R-2-Pentyl

2-Thienyl

3-Thienyl

4-Tetrahydropyranyl

3-Furyl

2-Chlorthienyl

3-Tetrahydrothienyl

4-Methylthio-2-butyl

4-Tetrahydrothiopyranyl

4-Methoxy-2-butyl oder

4-Methylthio-2-butyl

ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin sich R von einer Carbonsäure der Formel

R-COOH

ableitet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin R Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Thienyl ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin sich R von einer während der Fermentation in R-COOH umwandelbaren Verbindung ableitet, wobei diese Verbindung die Formel

R-(CH&sub2;)n-Z

hat, worin R wie oben definiert ist, n 0, 2, 4 oder 6 ist und z -CH&sub2;OH, -CHO, -COOR&sub4;, -CH&sub2;NH&sub2; oder -CONHR worin R&sub4; (C&sub1;&submin;&sub6;)Alkyl ist, R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;&submin;&sub4;)Alkyl, -CH(COOH)CH&sub2;COOH, -CH(COOH)(CH&sub2;)&sub2;COOH oder -CH(COOH)(CH&sub2;)&sub2;SCH&sub3; ist.

13. Verfahren nach Anspruch 7, worin, wenn R eine alpha-verzweigte C&sub3;-C&sub8;-Alkylgruppe ist, sie nicht Isopropyl oder (S)- sec-Butyl ist.

14. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Stamm von S. avermitilis S. avermitilis ATCC 53692 ist.

15. Stamm von Streptomyces avermitilis, der im wesentlichen keine C-076 Avermectine produziert, wenn er unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium fermentiert wird, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält und das im wesentlichen von einer Säure der Formel

R-COOH

oder einer durch S. avermitilis in diese Säure umwandelbaren Verbindung frei ist, worin R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, der jedoch durch Fermentation in diesem Medium im wesentlichen nur B-Avermectine produzieren kann, worin dieses Medium eine Säure der Formel RCOOH oder eine durch S. avermitilits in diese Säure umwandelbare Verbindung enthält, worin R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, wobei dieser Stamm durch ein Verfahren erhalten ist, das das Mutieren von Streptomyces avermitilis ATCC 53567 umfaßt.