DE3782169T2

DE3782169T2 - Verfahren zur herstellung von antibiotica 10381b.

Info

Publication number: DE3782169T2
Application number: DE8787904447T
Authority: DE
Inventors: D Argoudelis; L Laborde; B Shilliday; E Truesdell
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1986-07-03
Filing date: 1987-06-25
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-06-26
Also published as: DE3782169D1; ATE81341T1; FI100337B; JPH06233674A; JPH0775587A; HK165995A; EP0316313B1; WO1988000200A2; JP2506568B2; AU7641787A; FI890009A0; AU605495B2; KR880701727A; KR950001704B1; JPH0746996B2; WO1988000200A3; FI890009A; EP0316313A1; JPH01503115A; JPH07110226B2

Description

Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung der Antibiotika 10381b.
Die Antibiotika lassen sich durch Fermentieren eines Nährmediums mit einer neuen Art von Streptomyces, Streptomyces argniensis, erhalten. Antibiotika 10381b bestehen aus einer hauptsächlich gegen G-positive Organismen wirksamen Gruppe von mindestens fünf antibakteriellen Wirkstoffen. Antibiotika 10381b besitzen den für die Sulfomycingruppe von Antibiotika berichteten Eigenschaften ähnliche physikalischen Eigenschaften, eine Identität der beiden Familien wurde bis jetzt jedoch nicht gefunden.

Hintergrund der Erfindung

Die Herstellung und Eigenschaften von Arginomycin (Antibiotikum 10391a&sub1;) sind aus der WO-A-86 05 795, die auch den Organismus Streptomyces argniensis und seine Hinterlegung (Zugangsnummer NRRL B-15941) veröffentlicht, bekannt.
Streptomyces argniensis (Kultur 10381) liefert ein Gemisch solvenzlöslicher, als Antibiotika gegen Grampositive Organismen einschließlich "resistentem" Staphylococcus aureus einsetzbarer Verbindungen. Diese Antibiotika wurden als 10381b-Antibiotika bezeichnet.
Chemisch scheinen Antibiotika 10381b mit den, Untersuchungen zufolge, aus Peptiden unbekannter Struktur bestehenden Sulfomycinen (vgl. Y. Egawa et al., "Sulfomycins, A Series of New Sulfur-Containing Antibiotics, I: Isolation, Purification and Properties". J. Antibiotics, 22:12-17 [1969]) verwandt zu sein.
Als Teil einer Bemühung zur Beleuchtung der Verwandtschaftsbeziehung zwischen den Antibiotika 10381b und den Sulfomycinen wurden die antibiotischen Herstellungsmuster von S. argniensis und zweier sulfomycinliefernder Kulturen unter den für die Herstellung der Antibiotika 10381b entwickelten Fermentationsbedingungen verglichen. Die drei Kulturen liefern bei Analyse mit Hilfe der für die Antibiotika 10391b eingesetzten Verfahren im Grunde identisch erscheinende Wirksamkeiten. Nur S. argniensis weist jedoch eine Wirksamkeit gegen Pilzbefall (Antibiotikum 13381a&sub1;/Arginomycin) auf.
Durch Streptomyces viridochromogenes (ss sulfomycini ATCC 29776; UC 8410) hergestellte Sulfomycine wurden durch für die Isolierung des Antibiotikum-13381b-Komplexes eingesetzte Verfahren isoliert. Das erhaltene Material wurde mit dem Antibiotikum 10381b-Komplex mit Hilfe von Infrarotspektren (IR), Ultraviolettspektren (UV), Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie (t1c), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und antibakteriellen Spektren verglichen. Die Antibiotika 10381b sind den Sulfomycinen scheinbar sehr ähnlich, wenn nicht identisch mit ihnen. Das Antibiotikum 10381b&sub2;, als das Hauptantibiotikum, besitzt beinahe die identische Hauptwirksamkeit wie die sulfomycinproduzierenden Organismen. Die produzierenden Organismen sind jedoch definitiv verschieden. S. argniensis (Kultur 10381) liefert Arginomycin, während die beiden sulfomycinproduzierenden Kulturen kein Arginomycin oder eine sonstige Wirksamkeit gegen Pilzbefall liefern.
US-PS 4 007 190 veröffentlicht und beansprucht ein neues Fermentierverfahren zur Herstellung von Sulfomycin aus den Mikroorganismen Streptomyces cineroviridis.
Nach dem japanischen Patent Nr. 45-6880 (Derwent Abstract, Zugangsnummer 18445R) ist Sulfomycin I ein bekanntes Gram-positives Antibiotikum. Sulfomycin II und III sind aus der Literatur (vgl. japanische Patentveröffentlichung Nr. 17599/1970 [Derwent Abstract, Zugangsnummer 42550R]) als Gram-positive Antibiotika bekannt. Alle drei Sulfomycin-Antibiotika wurden durch Fermentation eines Mikroorganismusstammes Streptomyces viridochromogenes hergestellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere bereit: Ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika 10381b durch Fermentieren eines wäßrigen Nährmediums mit einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und einer assimilierbaren Stickstoffquelle mit einem Stamm von Streptomyces argniensis, NRRL 15941 und Mutanten derselben, unter aeroben Bedingungen; und
ein Verfahren zur Förderung des Wachstums bei fleischproduzierenden Tieren durch Verabreichen einer zur Wachstumsförderung wirksamen Menge der Antibiotika 10381b an die Tiere.
Demzufolge lassen sich die hier beschriebenen Antibiotika alleine oder in Kombination mit anderen antimikrobiellen Wirkstoffen zur Verhinderung des Wachstums oder Verringerung der Zahlen von Mikroorganismen in zahlreichen Umweltbereichen, z. B. zur Desinfektion von Oberflächen oder als ein Farbzusatz zur Verhinderung übermäßigen Mikroorganismenwachstums, einsetzen.

Genaue Beschreibung

Die erfindungsgemäßen Antibiotika lassen sich aus der Zucht von S. argniensis erhalten. Die Taxonomie des Organismus wird in WO-A-86 05 785 dargestellt.

Fermentation und Wiederherstellung der Antibiotika 10381b

Antibiotika 10381b lassen sich bei Wachstum von S. argniensis in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Tauchbedingungen herstellen. In der Regel läßt man den Mikroorganismus in einem Nährmedium mit einer Kohlenstoffquelle und einer(m) assimilierbaren Stickstoffverbindung oder proteinhaltigen Material wachsen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Sandzucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauerhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatisch verdautes Kasein, Destillisationsfeststoffe, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleischund Knochenschnitzel und dergleichen. Günstigerweise lassen sich Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen einsetzen. Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt werden, da Leitungswasser und ungereinigte Zusätze als Mediumbestandteile verwendet werden.
Eine Herstellung der Antibiotika 10381b läßt sich bei jeder zu einem zufriedenstellenden Wachstum des Mikroorganismus führenden Temperatur, vorzugsweise zwischen ungefähr 20 und 320, induzieren. Gewöhnlich läßt sich eine optimale Herstellung der Verbindung in etwa 2 bis 10 Tagen erreichen. Das Medium bleibt in der Regel während der Fermentation schwach basisch (pH-Wert 7,4 bis 9,0). Der End-ph-Wert ist teilweise von den anwesenden Pufferstoffen, sofern welche vorhanden sind, und zum Teil vom anfänglichen, günstigerweise auf einen pH-Wert von etwa 7,2 vor der Sterilisation eingestellten pH-Wert des Kulturmediums, abhängig.
Bei Durchführung des Wachstums in großen Kesseln oder Tanks sollte vorzugsweise die vegetative Form anstatt der Sporenform des Mikroorganismus zur Animpfung eingesetzt werden, um eine deutliche Verzögerung bei der Herstellung der neuen Verbindung und die damit verbundene ineffiziente Verwendung der Gerätschaft zu vermeiden. Demzufolge ist es wünschenswert, ein vegetatives Impfmaterial in einer Nährbouillonkultur durch Impfen dieser Bouillonkultur mit einem Aliquot einer Boden- oder Schrägkultur herzustellen. Ein derartig hergestelltes und abgetrenntes junges, aktives vegetatives Impfmaterial wird anschließend aseptisch in große Kessel oder Tanks überführt. Das zur Herstellung des vegetativen Impfmaterials verwendete Medium kann sich von dem zur Herstellung der neuen Verbindung eingesetzten Medium unterscheiden oder nicht, sofern man damit ein adäquates Wachstum der Mikroorganismen erreicht.
Antibiotika 10381b werden von der Fermentationsbouillon isoliert und gereinigt. Wie nachfolgend in den Beispielen genauer beschrieben, werden die Antibiotika 10381b aus dem Mycelkuchen der Fermentationsbouillon durch Extraktion mit Methanol isoliert. Bei kleinem Fermentationsmaßstab (Schüttelkolben) wird das methanolische Extrakt zur Trockene aufkonzentriert und der Rückstand durch zweimalige Gegenstromverteilung (CDCD) alleine oder anschließend durch Silikagelchromatographie gereinigt. Das bei großem Fermentationsmaßstab (5000 l-Fermentor) erhaltene Mycelextrakt des Kuchens wird zu einer wäßrigen Lösung aufkonzentriert. Diese wird anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Die Antibiotika 10381b-haltigen Ethylacetatextrakte werden zur Trockene aufkonzentriert. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit Ether verrieben. Man erhält dabei ein amorphes Gemisch der Antibiotika 10381b, die im weiteren durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt werden.
Die Hauptbestandteile des 10381-Komplexes wurden als 10381b&sub2; und 10381b&sub3; bezeichnet. Von diesen beiden Verbindungen wurde das Antibiotikum 13381b&sub2; in einer zur Durchführung einer biologischen und chemischen Charakterisierung ausreichenden Menge und Reinheit isoliert.
Das Antibiotikum 10381b&sub2; ist gegen Gram-positive Organismen und Anaerobier (Clostridium perfrigens, Bacteroides fragilis) wirksam. Ebenso ist es gegenüber dem gegen andere Antibiotika (Staphylococcus aureus UC 3665, Staphylococcus aureus UC 6685) (UC ist ein eingetragenes Warenzeichen der Upjohn Company) resistenten Staphylococcus aureus wirksam. Demzufolge sind die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksam für eine Behandlung bakterieller Infektionen bei Säugetieren, einschließlich Menschen.
Zahlreiche Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Antibiotika 10381b werden zur Verabreichung an Menschen und Tiere in einheitlichen Dosierungsformen, z. B. Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver, Körnchen, sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen, Augentropfen, orale Lösungen oder Suspensionen und Wasser-in-Öl-Emulsionen mit geeigneten Antibiotika-Mengen, angeboten.
Zur oralen Verabreichung lassen sich entweder feste oder flüssige einheitliche Dosierungsformen herstellen. Zur Herstellung fester Zusammensetzungen, wie z. B. Tabletten, werden die Antibiotika mit üblichen Bestandteilen, z. B. Talk, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat, Magnesiumaluminiumsilikat, Calciumsulfat, Stärke, Lactose, Gummi arabicum, Methylcellulose und funktional ähnlichen Materialien, wie pharmazeutischen Verdünnungsmitteln oder Trägern, gemischt. Kapseln lassen sich durch Mischen der Antibiotika mit einem inerten Pharmazeutischen Verdünnungsmittel und Füllen der Mischung in eine Hartgelatinekapsel geeigneter Größe herstellen. Weichgelatinekapseln lassen sich durch maschinelle Einkapselung einer Aufschlämmung der Antibiotika mit einem geeigneten pflanzlichen Öl, einem flüssigen Petrolatum oder einem anderen inerten Öl herstellen.
Flüssige einheitliche Dosierungsformen zur oralen Verabreichung, z. B. Sirups, Elixiere und Suspensionen, können hergestellt werden. Die wasserlöslichen Formen können in einem wäßrigen Träger zusammen mit einem Zucker, aromatischen Geschmacksstoffen und Konservierungsmitteln unter Bildung eines Sirups gelöst werden. Ein Elixier läßt sich durch Verwendung eines hydroalkoholischen (Ethanol) Trägers mit geeigneten Süßungsmitteln, z. B. Zucker und Saccharin, zusammen mit einem aromatischen Geschmacksstoff herstellen.
Suspensionen lassen sich mit einem wäßrigen Träger mit Hilfe eines Suspensionsmittels, z. B. Gummi arabicum, Tragant, Methylcellulose und dergleichen, herstellen.
Zur parenteralen Verabreichung lassen sich flüssige einheitliche Dosierungsformen unter Verwendung der Antibiotika und eines sterilen Trägers, vorzugsweise Wasser, herstellen. Die Antibiotika können je nach Träger und eingesetzter Konzentration im Träger entweder suspendiert oder gelöst werden. Bei der Herstellung von Lösungen lassen sich die Antibiotika in Wasser für eine Injektion auflösen und vor dem Abfüllen in ein(e) geeignete(s) Glasröhrchen oder Ampulle und Abschmelzen sterilisiert filtrieren. Günstigerweise können Zusätze, wie z. B. ein Lokalanästhetikum, ein Konservierungsmittel und Pufferstoffe, im Träger gelöst werden. Zur Erhöhung der Stabilität kann die Zusammensetzung nach einem Abfüllen in die Ampulle eingefroren und vom Wasser unter Vakuum befreit werden. Das trockene lyophilisierte Pulver wird anschließend in der Ampulle abgeschmolzen. Zu dieser wird zur Wiederauflösung kurz vor Gebrauch eine Begleitampulle mit Wasser zur Injektion bereitgestellt. Parenterale Suspensionen lassen sich im wesentlichen in derselben Weise herstellen, mit dem Unterschied, daß die Antibiotika im Träger anstatt gelöst suspendiert werden und eine Sterilisation durch Filtration nicht möglich ist. Die Antibiotika lassen sich vor einer Suspension im sterilen Träger sterilisieren, indem man sie mit Ethylenoxid zusammenbringt. Günstigerweise ist ein oberflächenaktives Mittel oder Benetzungsmittel in der Zusammensetzung enthalten, um eine gleichmäßige Verteilung der Antibiotika zu erleichtern.
Zusätzlich kann ein Rektalzäpfchen zur Verabreichung der Antibiotika verwendet werden. Diese Dosierungsform ist von besonderem Interesse bei nicht in üblicher Weise mit Hilfe anderer Dosierungsformen, z. B. oral oder durch Einblasung, wie im Falle kleiner Kinder oder geschwächter Personen, behandelbaren Säugern. Die Antibiotika lassen sich in jede bekannte Zäpfchenbasis durch Fachleuten wohl bekannte Verfahren einarbeiten. Beispiele derartiger Grundstoffe sind Kokosnußbutter, Polyethylenglykole (Kohlenstoffwachse), Polyethylensorbitanmonostearat und Mischungen dieser mit anderen verträglichen Materialien zur Modifizierung des Schmelzpunktes oder einer Auflösungsgeschwindigkeit. Diese Rektalzäpfchen können zwischen etwa 1 und 2,5 gm wiegen.
Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "einheitliche Dosierungsform" bezieht sich auf als einheitliche Dosierungen für Menschen und Tiere geeignete physikalisch diskrete Einheiten, wobei jede Einheit eine zur Lieferung der angestrebten pharmazeutischen Wirkung in Verbindung mit dem gewünschten pharmazeutischen Verdünnungsmittel, Träger oder Beförderungsmittel berechnete vorbestimmte Menge wirksamen Materials enthält. Die Prüfvorschriften für die erfindungsgemäßen neuen einheitlichen Dosierungsformen sind festgelegt durch und direkt abhängig von (a) den die einzelnen Eigenschaften des wirksamen Materials und der die angestrebte(n) besondere(n) Wirkung und (b) den die mit der Bildung der Zusammensetzung solch eines wirksamen Materials für den Gebrauch bei Mensch und Tier verbundenen Begrenzungen. Diese werden als erfindungsgemäße Merkmale detailliert in dieser Beschreibung veröffentlicht. Beispiele geeigneter einheitlicher Dosierungsformen gemäß dieser Erfindung sind Tabletten, Kapseln, Pillen, Zäpfchen, Pulverpäckchen, Oblaten, Körnchen, Gelatinekapseln, Teelöffelmengen, Eßlöffelmengen, Tropfenmengen, Ampullen, Fläschchen, Aerosole mit Zählauslaß, einzelne, aus irgendwelchen der vorgenannten zusammengesetzten Mischungen und andere Formen, soweit sie hier beschrieben wurden.
Bei der Behandlung verwendet man eine wirksame Menge der Antibiotika. Die Antibiotika-Dosierung für eine Behandlung hängt von zahlreichen, Fachleuten in diesem Bereich wohl bekannten Faktoren ab. Diese sind z. B. die Verabreichungsart und die Wirksamkeit der Antibiotika. Eine Dosierung für Menschen in Höhe von etwa 1 bis 2 g Antibiotika je Dosis in einer parenteralen Verabreichungsform oder in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist für eine Behandlung bakterieller Infektionen wirksam. Insbesondere liegt eine einzelne Dosis bei etwa 2 g Antibiotika. Die orale und rektale Dosis liegt bei etwa 1 bis 2 g je Dosis. Insbesondere liegt die einzelne Dosis bei etwa 2 g Antibiotika.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika lassen sich auch zur Förderung des Wachstums von fleischproduzierenden Tieren, wie Brathühnern, Schwein und Rind, verwenden. Die Antibiotika lassen sich z. B. mit dem Futter der Brathühnchen (NRC zugelassene Nahrung) in einem Dosierungsgrad von etwa 11 Teilchen pro Million (oder 11 mg/kg) vermischen. Über einen Zeitraum von 2 Wochen aß jedes Hühnchen (einen Tag alt) ad libitum etwa 20 g Futter pro Tag. Daraus wurde berechnet, daß jedes Hühnchen etwa 220ug Antibiotika pro Tag zu sich nahm und daß der mittlere Wachstumsindex der Antibiotika größer als 3 und deutlich größer als 0 war (der mittlere Wachstumsindex bestimmt die Wachstumsverbesserung gegenüber Kontrolltieren [ohne Zusatz von Arzneimittel gefütterte Tiere]). Ein Beispiel der Verwendung der erfindungsgemäßen Antibiotika zur Förderung von Wachstum beim Schwein wird im folgenden dargestellt.
Veränderungen bei den oben genannten Mengen und Vorgehensweisen für die Verwendung der erfindungsgemäßen Antibiotika zur Förderung von Wachstum bei fleischproduzierenden Tieren wären jedem herkömmlichen Fachmann bekannt. Für Brathühnchen liegen die bevorzugten Konzentrationen der Antibiotika 10381b zwischen etwa 0,5 und etwa 11 mg pro kg Futter. Für Schweine liegt die bevorzugte Konzentration der Antibiotika 10381b zwischen etwa 10 und etwa 55 mg pro kg Futter.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Ohne weitere Mühe sollte ein Fachmann unter Verwendung der vorangehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem gesamten Umfang nutzen können. Die folgenden detaillierten Beispiele beschreiben die Herstellung der verschiedenen Verbindungen und/oder die Durchführung zahlreicher Verfahren der Erfindung. Sie sollen nur als Erläuterung dienen und die vorangehende Veröffentlichung in keiner Weise begrenzen. Fachleute werden schnell geeignete Abänderungen für die Vorgehensweisen sowohl hinsichtlich der Reaktanten als auch der Reaktionsbedingungen und -methoden finden.
In den folgenden Beispielen werden Antibiotikumherstellung und -reinigung mit Hilfe eines mikrobiologischen Scheiben(Platten)-Assayverfahrens mit Micrococcus luteus und Streptococcus pyogenes als Analyseorganismen bestimmt. Dünnschichtchromatographie wird auf Celluloseplatten (Brinkman Cell 300), pH-Wert 7,0, 0,1 M Phosphatpuffer oder auf Silikagel (Brinkman's Polygram SIL-N-HR)-Platten unter Verwendung von Chloroform- Methanol (95:5 oder 100:10 v/v) als mobiler Phase durchgeführt. Bioautographie wird auf M. luteus oder S. pyogenes durchgeführt.

Beispiel 1

A. Fermentation

Ein Bodenstamm Streptomyces argniensis, NRRL-15941 wird auf einer Hickney-Tresner-Agarkultur angelegt und bei 4º C gelagert. Proben werden in Wasser homogenisiert und auf Hickney-Tresner-Agar abermals kultiviert. Nach 7-tägiger Inkubation bei 28º C ist das Wachstum für ein Saatkulturimpfmaterial ausreichend.
Saatkulturen läßt man in einem Saatmedium (SSM. 1) mit je Liter Leitungswasser: 5,8 g Schwarzgurtmelasse, 19 g Difco Pepton, 4 g Difco Hefeextrakt, 4 g Dextrin, G,2 g L-Asparagin, 1 ml CoCl&sub2;·6H&sub2; 3 wachsen. Das Medium wird mit KOH vor einer Sterilisation auf den pH-wert 7,2 eingestellt. Die SSM. 1 wird in flache 500 ml Weithals-Erlenmeyer- Kolben (bedeckt mit 2 Milchfiltern) bei Mengen von 100 ml pro Kolben verteilt und 30 min lang bei 121º C, 15 psi, sterilisiert. Die Kolben werden mit homogenisierten Agarklumpen in einer Menge von 0,5 bis 1 Klumpen pro Kolben geimpft und 3 Tage lang bei 28º C geschüttelt (250 Upm, 2,5'' Takt). Der Ernte-pH-Wert beträgt 8,3.
Die Saatkulturen werden in einem Medium mit einem mengenmäßigen Gehalt von pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl, 2 g Brauerhefe, 20 g Cerelose (zugegeben als 50 % Lösung nach Sterilisierung) fermentiert. Das Medium wird vor einer Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Das Medium wird wie oben beschrieben verteilt, sterilisiert und geschüttelt. Die Impfmenge beträgt 5 ml pro 100 ml Saatkultur. Die Fermentationsbedingungen liegen bei 28º C und einer Dauer von 3 Tagen.
B. Isolierung der Antibiotika 10381b aus einem Schüttelkolben oder aus 10 l-Tankfermentationen.
Das Fermentationsbier wird gegebenenfalls unter Verwendung eines Filterhilfsmittels gefiltert und der Festkörperkuchen wird mit 1/10 des Biervolumens an Wasser gewaschen. Das klare Filtrat und die Waschflüssigkeit werden vereinigt.
Der Kuchen wird viermal mit Mengen von 1,5 l Methanol verrieben. Die methanolischen Extrakte werden analysiert (Tabelle 1). Die wirksamen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene aufkonzentriert. Man erhält Präparat A, das als Startmaterial für die Isolation und Reinigung der Antibiotika 10381b verwendet wird.

Beispiel 2

Isolierung der Antibiotika 10381b aus Präparat A durch Doppelgegenstromverteilung und Silikagelchromatographie
A. Doppelgegenstromverteilung: Zwei Mengen des Präparates A werden vereinigt (26,7 g und 18,6 g) und in beiden Phasen (125 ml je Phase) des Lösungsmittelsystems Cyclohexan- Ethylacetat-95%iges Ethanol-Wasser (1:1:1:1 v/v) gelöst. Die Lösung wird in die Röhrchen 20-25 der oberen Seite des Doppelgegenstromgerätes (die Seite, wo die untere Phase in die Maschine eintritt) eingetragen. Die folgenden Überführungen werden gefahren:
1) 25 Überführungen (Fraktionen werden nicht gesammelt);
2) 45 Überführungen (obere Phase wird gesammelt);
und
3) 100 Überführungen (beide Phasen werden gesammelt).
Die Fraktionen werden durch Bioaktivitätsbestimmung und Bioautographie der entwickelten t1c-Platten auf einem gegen Antibiotika empfindlichen Mikroorganismus (bio-t1c) analysiert. Die folgenden Sammlungen werden durchgeführt. Die Lösung jeder Sammlung wird zu einer wäßrigen Lösung aufkonzentriert und gefriergetrocknet. Man erhält dabei die folgenden Präparate:
Sammlung I: (Fraktionen: unterer Kollektor 5-24) Präp. 84.1 (28, 40 g);
Sammlung II: (Fraktionen: unterer Kollektor 25-79) Präp. 84.2 (1,85 g);
und
Sammlung III: (Fraktionen: unterer Kollektor 80-100; unteres Gerät 50-0; oberes Gerät 1-20) Präp. 84.3 (0,25 g).
Die Dünnschichtchromatographieanalyse (Brinkman's Silikagel; Chloroform-Methanol 95:5 [v/v]; Bioautographie auf M. luteus sens) liefert die folgenden Rf-Werte 0,8 (10381b&sub5;); 0,6 (10381b&sub4;); 0,5 (10381b&sub3;); 0,2 (10381b&sub2;) und 0 (10382b&sub1;).
Die Wirksamkeitswerte (Bu/mg) der Präparate gegen M. luteus sens betragen wie folgt: 2 (Präp. 84.1); 64 (Präp. 94.2) und 256 (Präp. 84.3).

B. Silikagelchromatographie

Die Säule wird mit 600 g Silikagel in Chloroform- Methanol (97:3 v/v) hergestellt. Die wie oben beschrieben erhaltenen Präparate 84.2 und 84.3 werden vereinigt und mit 31 ml absolutem Methanol verrieben. Unlösliches bioinaktives Material wird durch Filtration (600 mg) abgetrennt. Das Filtrat wird mit 60 g Filterhilfsstoff und 970 ml Chloroform vermischt. Das Gemisch wird zu einem trockenen Pulver aufkonzentriert. Dieser Rückstand wird auf den Anfang der Säule gegeben und die Säule wie folgt eluiert. Folgende 20 ml-Fraktionen werden gesammelt:
1) Chloroform-Methanol (97:3 v/v): Fraktionen 1-837;
2) Chloroform-Methanol (94:6 v/v): Fraktionen 838-1285
und
3) Chloroform-Methanol (90:10 v/v): Fraktionen 1286-1600.
Die Fraktionen werden durch Bioaktivität und Bio-t1c analysiert. Die folgenden Sammlungen werden durchgeführt. Jede Sammlung wird zur Trockene aufkonzentriert. Man erhält dabei die folgenden Präparate:
Sammlung I: (Fraktionen 230-299) Präp. 106.1 (30 mg);
Sammlung II: (Fraktionen 300-500) Präp. 106.2 (40 mg);
Sammlung III: (Fraktionen 855-930) Präp. 106.3 (40 mg) und
Sammlung IV: (Fraktionen 931-1303) Präp. 10614 (40 mg).
Die Dünnschichtchromatographieanalyse (Silikagel; Chloroform- Methanol (95:5); Bioautographie auf M. luteus) ergibt die folgenden RfWerte: 3,5 (10381b&sub3;) und 0,2 (10381b&sub2;).
Die Wirksamkeitswerte (Bu/mg) der Präparate gegen S. pyogenes betragen wie folgt: 128 (Präp. 106.1); 100 (Präp. 136.2); ) 1324 (Präp. 136.3) und 380 (Präp. 106.4). Die Wirksamkeitswerte (Bu/mg) der Präparate gegen M. luteus sens betragen wie folgt: 96 (Präp. 106.1); 64 (Präp. 106.2); 384 (Präp. 106.3) und 96 (Präp. 106.4).

Beispiel 3

Reinigung des Präparates A durch Doppelgegenstromverteilung (Lösungsmittel: Cyclohexan-Ethylacetat- Aceton-Wasser [1:2:2:1 v/v]).
Drei Mengen des Präparates A werden vereinigt (20,5 g, 21,1 g und 20,8 g) und in beiden Phasen des oben genannten Systems (155 ml jeder Phase) gelöst. Die Lösung wird in die Röhren 18-25 der oberen Seite des Gegenstromverteilungsgerätes (die Seite, wo die untere Phase in das Gerät eintritt) eingebracht.
Die folgenden Überführungen werden gefahren:
1) 68 Überführungen (die obere Phase wird gesammelt) und
2) 100 Überführungen (beide Phasen werden gesammelt).
Die Verteilung wird durch Bioaktivitätsbestimmung und Bio-t1c analysiert. Die folgenden Sammlungen werden durchgeführt. Jede Sammlung wird zu einer wäßrigen Lösung aufkonzentriert und gefriergetrocknet. Man erhält die folgenden Präparate:
Sammlung I: (Fraktionen: unterer Kollektor 1-33) Präp. 91.1 (34,8 g);
Sammlung II: (Fraktionen: unteres Gerät 30-0; höheres Gerät 1-30) Präp. 91.2 (240 mg);
Sammlung III: (Fraktionen: oberes Gerät 35-50; oberer Kollektor 170-80) Präp. 91.3 (300 mg) und
Sammlung IV: (Fraktionen: oberer Kollektor 79-27) Präp. 91.4.
Die Dünnschichtchromatographieanalyse (Silikagel; Chloroform- Methanol 95:5; Bioautographie auf M. luteus) ergibt die folgenden Rf-Werte: 0,2 (10381b&sub2;). Nach der obigen t1c enthält Präparat 91.3 hauptsächlich 10381b&sub2; und Spuren von 10381b&sub1; und besitzt eine Wirksamkeit von ca. 3000 Bu/mg gegen S. pyogenes.

Beispiel 4

Isolierung der Antibiotika 13381b aus einer 5000 1-Fermentation

A. Das gesamte Bier (Ernte-pH-Wert 6,9) wird unter Verwendung von CELATOM FW 40 als Filterhilfsstoff gefiltert. Der Kuchen wird mit 5000 l Wasser gewaschen und anschließend viermal mit jeweils 600 l Methanol verrieben. Die vier methanolischen Extrakte werden gesammelt und auf ein Volumen von 90 l aufkonzentriert. Das wäßrige Konzentrat (pH-Wert 7,0) wird anschließend dreimal mit gleichen Mengen Ethylacetat extrahiert. Die drei Ethylacetatextrakte werden vereinigt und auf ein Volumen von 15,5 l (Analyse: ca. 1000 Bu/ml, S. pyogenes) unter Erhalt des Präparates B aufkonzentriert.
Präparat B wird mit 60 l Skellysolve B vermischt. Das Gemisch wird 20 h lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Unlösliches Material (Antibiotika 10381b) wird durch Filtration durch einen Filter mit Filterhilfsstoff isoliert. Das Filtrat wird verworfen. Der die Antibiotika 10381b enthaltende Kuchen wird mit Skellysolve B gewaschen und anschließend viermal mit je 4 l Methanol aufgeschlämmt. Die vier Methanolextrakte werden vereinigt und die Lösung zur Trockene unter Erhalt des Präparates C aufkonzentriert.
Präparat C wird mit Ether (ca. 2 l) verrieben. Unlösliches Material wird durch Filtration isoliert, getrocknet (47,3 g) und mit ca. 2000 Bu/mg bewertet.
B. Reinigung des Präparates C durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). (Instrument: Waters Präp. 500A; Trägersäule: Waters C-18 Reserve Phase Silica- Packed Columns; mobile Phase: Acetonitril-Wasser [40:63 v/v] und Fließgeschwindigkeit: 150 ml/min).
Das wie oben beschrieben erhaltene Präparat C (1,0 g) wird mit 100 ml Acetonitril und 150 ml Wasser 2 h lang gerührt. Unlösliches Material wird durch Filtration (258 mg) abgetrennt. Das Filtrat wird auf die Säule injiziert. Die Chromatographie wird durch einen UV-Detektor verfolgt. Zusätzlich werden ausgewählte Fraktionen (je 150 ml) auf Bioaktivität untersucht und durch t1c analysiert (Silikagel; Chloroform-Methanol 100:10 v/v; Bioautographie auf Micrococcus luteus). Die alleinig 10381b&sub2;-haltigen Fraktionen 63-96 werden vereinigt und zu einer wäßrigen Lösung (1600 ml) aufkonzentriert. Diese Lösung wird anschließend dreimal mit je 600 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene aufkonzentriert. Man erhält dabei 129 mg Produkt. Das Produkt wird in 2,5 ml Dimethylsulfoxid und 2,5 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wird anschließend mit 200 ml Ether vermischt. Das ausgefallene Material (61 mg) wird charakterisiert. Die Ergebnisse sind im folgenden dargestellt.
C. Physikalische Eigenschaften: Die physikalischen Eigenschaften von 10381b&sub2; sind in Tabelle 2 dargestellt. Das Spektrum der antimikrobiellen Aktivität von 10381b&sub2; ist in Tabelle 3 dargestellt.

Beispiel 5

Verwendung der Antibiotika 10381b zur Förderung von Wachstum beim Schwein

Vorrichtungen: Jeder Versuch wurde in einer mit Heizung und Belüftung ausgerüsteten Vorrichtung zur angemessenen Aufrechterhaltung angenehmer Ernährungsumweltbedingungen durchgeführt. Jeder Stall ist mit einem Futterautomaten und einer Tränke des Saugtyps ausgerüstet. Der Boden jeden Stalls besteht aus festem Beton, ausgenommen 0,74 m² von auf Lücke angeordneten Metalleisten über einen Abflußrohr an einem Ende der Ställe zur Entfernung des Mists.
Tiere: Gleiche Zahlen gesunder weiblicher und kastrierter männlicher Hampshire X Yorkshire gekreuzter, entwöhnter, fünf bis sechs Wochen alter Schweine wurden für jeden Versuch verwendet. Die Experimentiereinheit bestand aus einem Stall von vier Schweinen, zwei weiblichen und zwei männlichen. Bei jedem Versuch wurden die Schweine in Stallblöcke nach Gewichtsgruppe eingeteilt und innerhalb der Blöcke zufallsmäßig einzelnen Ställen zugeordnet (dasselbe Vorgehen erfolgte für beide Geschlechter). Stallblöcke wurden zufallsmäßig Positionen bei der Ernährung zugeordnet und Behandlungen wurden zufallsmäßig auf Schweineställe innerhalb des Blocks verteilt.
Nahrungsmittel und Behandlungen: Eine Nahrung auf Maissojabohnenmehl-Basis mit etwa 18% Rohprotein bildete die Grundnahrung, zu der das Arzneimittel zur Durchführung der Behandlung zugegeben wurde.
Geeignete Mengen 10391b wurden in gemahlenem Sojabohnenfutter in einer Konzentration von 44 g/kg Vormischung vorgemischt. Die Vormischung wurde anschließend mit der Nahrung gemischt. Man erhielt dabei einen Endfuttergrad von 55 mg Arzneimittelaktivität pro kg Nahrungsmittel. Analyse der Daten: Als Variablen von Interesse gelten Zunahme, ausgedrückt als durchschnittliche tägliche Zunahme (ADG), Futterwirksamkeit, ausgedrückt als zu sich genommenes Futter, geteilt durch Zunahme (F/G) und Wachstumsindex (GI), der durch Aufsummieren der Steigerungen an ADG und F/G je für sich gewogenes Tier innerhalb des Blocks berechnet wird.
Die Reaktionen auf das Arzneimittel bezüglich jeder Variable wurden innerhalb jedes Gewichtsblocks relativ zu Kontrolltieren berechnet, z. B.:
Steigerung an ADG = 100 (ADG der behandelten Tiere - ADG der Kontrolltiere)/ADG der Kontrolltiere
Mit Hilfe eines t-Tests wurde die Wahrscheinlichkeit der Zufallsabweichungen bestimmt. Schätzungen der Abweichung wurden aus einer Analyse der Abweichung unter Verwendung eines Modells mit Versuchen und Blöcken innerhalb der Versuche erhalten.
Nach Schweineleistungsfähigkeit-Auswahlverfahren wurden 256 Yorkshire X Hampshire gekreuzte Schweine mit 10381bhaltigem Futter in einer Dosis von 55 mg/kg bzw. einem arzneimittelfreien Futter 21 Tage lang ernährt. Eine Arzneimittelbehandlung wurde in acht Blöcken (4 Schweine von 10) pro Versuch in vier Versuchen über 8 Monate hinweg durchgeführt. Ein Wachstumsindex (GI) wurde aus den Innerblockvergleichen zur Bestimmung von Steigerungen an Zunahme und Futterwirksamkeit der Verbindung berechnet. Zum Bestehen dieses Auswahlverfahrens muß eine Verbindung einen GI-Wert von wenigstens 7,5 besitzen und deutlich verschieden von 0 bei P < 0,10 sein.
13381b war mit einem GI gleich 29,52 bei P=0,004 akzeptabel.
Aus Tabelle 4 wird deutlich, daß der Wachstumsindex für 10381b positiv ist und das minimale Kriterium von 7,5 überschreitet. Aus Tabelle 5 wird deutlich, daß die Wahrscheinlichkeit, daß diese Reaktion auf einem Zufall basiert, kleiner als 0,10 ist. Tabelle 1: Bioanalyse: Filtration, Extraktionskuchen 1. gegen S. lutea-empfindlich Zonen (mm) klares Bier Spur Methanol-1 Methanol-2 Methanol-3 Methanol-4 2. gegen S. pyogenes-empfindlich Zonen (mm) klares Bier Methanol-1 Methanol-2 Methanol-3 Methanol-4

Tabelle 2. Charakterisierung des Antibiotikums 10381b&sub2;

Aussehen: Amorpher farbiger Feststoff
Löslichkeit: Löslich in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und niedrigen Alkoholen. Weniger löslich in Ethylacetat, Aceton und Acetonitril. Unlöslich in Ether und gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Analytische Daten: C, 48,33; H, 4,58; N, 15,14; S, 5,16; 0 (aus der Differenz, 26,79).
Empirische Formel: Aus den analytischen Werten läßt sich eine Formel C25,5H28,5-29N6,5O10,5S ableiten. Unter der Annahme, daß das Molekül zwei Schwefelatome enthält, wird die Molekülformel für 13381b&sub2; zu C&sub5;&sub1;H&sub5;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub2;&sub1;S&sub2;(Molekulargewicht 1225).
Schmelzpunkt: Bei etwa 195º C beginnt sich das Material unter Gasentwicklung zu zersetzen.
Ultraviolettspektrum: (max, Methanol): 243, 316.
Infrarotspektrum: (cm&supmin;¹, Mineralölaufschwemmung):
2965,5, 2851,6, 1465,7, 1495,6,
1377,0, 1663,5, 1526,5, 1633,6,
3337,7, 1368,3, 1341,3, 721,2,
1197,6, 1082,0, 1307,6, 1021,2,
1039,5, 749,2, 1291,2, 1249,7,
1122,5, 1102,2, 889,0, 1147,5,
997,0.
Antibakterielles Spektrum: Das Antibiotikum 10381b&sub2; ist hauptsächlich gegen G +-Organismen und Anaerobien (Clostridium perfrigens; Bacteroides fragiles) wirksam. Es ist ebenso gegen einen gegen andere Antibiotika Staphylococcus resistenten aureus (Staphylococcus aureus UC 3665; Staphylococcus aureus UC 6685) wirksam.
Antibakterielle In-vitro-Untersuchung: Die In-vitro-Untersuchungsergebnisse des Antibiotikums 10381b&sub2; gegen G +und G- -Organismen sind in Tabelle 7 dargestellt.
Papierchromatographie: Rf (Lösungsmittelsystem): 0,5-0,9 (Streifen) (1-Butanol/Wasser 84/16); 0,5-0,9 (Streifen) (1-Butanol/Wasser 84/16 + 0,25% p-Toluolsulfonsäure); 0,9 (1-Butanol/Essigsäure/ Wasser 2/1/1); 0,9 (1-Butanol/Wasser 84/16 + 2% Piperidin); 0,1-0,5 (Streifen) (1-Butanol/Wasser 4/96); 0,1-0,5 (Streifen) (1-Butanol/Wasser 4/96 + 0,25% p-Toluolsulfonsäure); 0,1-0,5 M Kaliumphosphat pH-Wert 7,0); 0,1-0,3 (Wasser/Methylisobutylketon/Ammoniak 200/20/1); 0,9 (Toluol/Methanol/Wasser 1/1/2); 0,9 (1-Butanol/Wasser 84/16 + 2,0% p-Toluolsulfonsäure); 0,9 (Methanol/15 % NaCl (H&sub2;O) 4/1).

In-vivo-Test des Antibiotikums 10381b&sub2;:

Das Antibiotikum 13381b&sub2; wurde In-vivo gegen Streptococcus pyogenes- und Staphylococcus aureus-induzierte Mastitis bei der Maus getestet. Das Antibiotikum schütze S. pyogenesinfizierte Mäuse bei subkutaner Verabreichung mit einer CD&sub5;&sub0; von 1,25 mg/kg. Es war in dem S. aureus-induzierten Mausmastitis-Test mit einem PD&sub5;&sub0; von 1,8 (gegen Mastitis) und 6,2 gegen S. aureus) mg/Kg wirksam.
Untersuchung des Antibiotikum-10381b&sub2;-Komplexes zur Wachstumsförderung:
Antibiotikum 13381b-Komplex wurde auf eine Wachstumsförderung und/oder Futterverwertungsindikationen beim Brathuhn untersucht. Der mittlere Wachstumsindex (Zunahme/3 + Futterverwertung) der Antibiotika 10381b war größer als 3 und deutlich (P < = 0,20) größer als 0. Demzufolge erfüllten, gemäß der Kriterien der ersten Untersuchung, die Antibiotika 10381b die Anforderungen. (Der mittlere Wachstumsindex bestimmt die Steigerung des Wachstums gegenüber Kontrolltieren [nicht mit arzneimittelhaltigem Futter ernährte Tiere].) Tabelle 3: Antibakterielle In-vitro-Untersuchung des Antibiotikums 10381b&sub2; (Minimale Hemmkonzentration [MIC]) (MIC Medium: MHA) Organismus Kultur # Enterobacter cloacae Klebsiella oxytoca Escherichia coli Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus faecalis Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Citrobacter freundii Proteus vulgaris Tabelle 4 Mittlere Steigerung der Zunahme und Futterverwertungen und mittlere Wachstumsindizes der Versuche Versuch Mittlere Steigerungen der Behandlung Wachstumsindex Gesamt Tabelle 5 Statistische Parameter und t-Test 0-21 Tage Mittlerer Wachstumsindex Prob. Mittel ist = 0,0 Abweichungsbestandteile: Versuche Blöcke (Versuch) Total

Claims

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 10381b mit folgenden Kennwerten:

Analysedaten: C, 48,33; H, 4,58; N, 15,14; S, 5,16;

O (aus der Differenz) 26,79;

IR-Spektrum: (cm&supmin;¹, Mineralölaufschwemmung): 2965,5,

2851,6, 1465,7, 1495,6, 1377,0, 1663,5,

1526,5, 1633,6, 3337,7, 1368,3, 1341,3,

721,2, 1197,6, 1082,0, 1307,6, 1021,2,

1039,5, 749,2, 1291,2, 1249,7, 1122,5,

1102,2, 889,0, 1147,5, 997,0;

durch Fermentieren eines Stamms von Streptomyces arginensis NRRL 15941 oder einer Mutante desselben in einem wäßrigen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und einer assimilierbaren Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen, Filtrieren des Mediums und Isolieren des Antibiotikums aus dem Mycelfilterkuchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur von 15 bis 50ºC und bei einem pH-Wert von 6,0 bis 9,0 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur 20 bis 35ºC und der pH-Wert etwa 7,2 betragen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur 24 bis 32ºC beträgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2 bis 3 Gew.-% Kohlenstoffquellen und 2 bis 3 Gew. -% Stickstoffquellen enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation 2 bis 10 Tage lang durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm aus Streptomyces arginensis NRRL 15941 besteht.

8. Verfahren zur Förderung des Wachstums bei fleischproduzierenden Tieren durch Verabreichen des in Anspruch 1 definierten Antibiotikums 10381b an die Tiere.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in Mischung mit dem Tierfutter verabreicht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Futter pro kg Futter 0,5 bis 55 mg des Antibiotikums enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Tiere Brathähnchen sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Futter 0,5 bis 11 mg des Antibiotikums pro kg Hähnchenfutter enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Tiere Schweine sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Futter 10 bis 55 mg des Antibiotikums pro kg Schweinefutter enthält.