DE2510868C3 - Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin B - Google Patents
Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin BInfo
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Description
2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces rosa var. notoensis FERM-P No. 2209
in einem üblichen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter
aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 15—400C und einem pH von 6—10 züchtet und
anschließend die gebildeten Antibiotica aus der Kultur abtrennt.
Die Erfindung betrifft das Antibioticum Nanaomycin A der Formel
CH., H
./COOH
H II
H O
Il Il
und ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B.
Nanaomycin A ist eine Verbindung vom Chinontyp und ist auf Mycoplasma, gram-positive Bakterien und
Trichophyton aktiv. Die akute Toxizität (LD50, ip) dieser
Verbindung auf Mäuse beträgt 28,2 mg/kg. Die Verbindung wird durch Fermentation gewonnen, indem ein die
Nanaomycine A und B erzeugender Stamm unter
aeroben Bedingungen in einem Medium gezüchtet wird, um die Nanaomycine A und B in der Kulturbrühe
anzusammeln, von welcher die Nanaomycine A und B gewonnen werden. Dieser Stamm gehört zum Genus
Streptomyces. Nanaomycin A ergibt therapeutische Wirkungen bei einigen Infektionskrankheiten, welche
durch einen Trichophyton- oder Mycoplasmaparasiten und dergleichen verursacht werden.
Das Nanaomycin A wird auch als OS-3966-A oder als Rosanomycin A bezeichnet
Nanaomycin A ist von bekannten Antibiotica des Chinontyps, wie Frenolicin (Journal of the American
Chemical Society, 90 [1968] 1325-1332), Deoxyfrenolicin (US-PS 34 52 051), Kalafungin bzw. Kalamycin
(US-PS 36 32 607, US-PS 33 00 382) und Äthylkalafunginat bzw. Äthylkalamycinat (US-PS 35 24 868) in den
Eigenschaften stark unterschieden.
H) Nanaomycin A hemmt das Wachstum von gram-positiven Bakterien wie beispielsweise Staphylococcus
aureus bei einer Konzentration von 2,0 bis 8,0 μg/ml und
bei einer Konzentration von nicht mehr als 3,1 μg/mI
das Wachstum verschiedener Pilze einiger Spezies,
Ii welche zum Genus Trichophyton gehören. Außerdem
hat Nanaomycin A eine starke Aktivität auf Mycoplasma; beispielsweise wurde das Wachstum von Mycoplasma
gallisepticum durch Nanaomycin A bei einer Konzentration von nicht mehr als 0,1 μg/ml verzögert.
:o Außerdem wurde eine starke antimikrobielle Aktivität
von Nanaomycin A auf ein Spiramycin-resistentes Mycoplasma gallisepticum beobachtet.
Eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung wird durch Nanaomycin A bei verschiedenen Infektions-
2") krankheiten erreicht, welche durch das Vorhandensein
eines Parasiten des Genus Trichophyton im Körper von Tieren verursacht wird. Wenn durch Trichophyton
metagrophytes verursachte Dermatomycosis am Rükken von Guineaschweinen mit einer Lösung von
to 0,01 — 1% Nanaomycin A gelöst in Propylen Glycol-Äthanol
(3:1, v/v) einmal täglich 8 Tage hintereinander behandelt wird, zeigt sich eine ausgezeichnete therapeutische
Wirkung bei der Hautrötung und den Schuppen. Nanaomycin A hat außerdem eine therapeutische
r> Wirkung bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen
und der Tiere; es wurde seine therapeutische Wirkung bei einer chronischen Erkrankung der
Atinungswege bei Küken, verursacht durch Mycoplasma gallisepticum, festgestellt.
tu Die Wirkung von Nanaomycin A wurde gegenüber Dermatomycose, die bei Rindern durch Masseninfektion
von Trichophyton veruucosum verursacht worden war, geprüft. Das Nanaomycin A wurde in Olivenöl
suspendiert und direkt auf die befallenen Stellen aufgetragen, wobei die Schuppen entfernt werden
können oder auch belassen bleiben können. Als therapeutisches Kontrollmittel wurde ein zur Bekämpfung
der Dermatomycose bei R'ndern bekanntes, besonders wirkungsvolles handelsübliches Lösungsprä-
Vi parat (mit 2% Methylenblau als Aktivwirkstoff)
verwendet. Die therapeutische Wirkung wurde 4 Wochen hindurch geprüft. Die nach Bestreichen der
befallenen Stellen mit den Testsubstanzen nach einmaliger Anwendung bzw. nach einer ersten und einer
■>-> zweiten, eine Woche später erfolgten Anwendung erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle 1 bzw. 2 angegeben.
Geprüfte Verbindung Kon/. Probe Ergebnis nach
mg/ml I Woche 2 Wochen .1 Wochen 4 Wochen
Nanaomycin A
Nanaomycin A
Nanaomycin A
0,1
Fortsetzung
Geprüfte Verbindung
Nanaomycin A Kontrollmittel (handelsüblich) Nanaomycin A
Nanaomycin A Nanaomycin A Kontrollmittel (handelsüblich)
Konz. Probe Ergebnis nach
mg/ml 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen
10 0,3
0,1
1 10
Geprüfte Verbindung Konz. Probe Ergebnis nach
mg/ml 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen
Nanaomycin A 0,1 1 ++ Nanaomycin A 1 1 ++ Nanaomycin A 10 1 +++
Kontrollmittel 0,3
(handelsüblich)
II Nanaomycin A 0,1 1 +++ Nanaomycin A 1 1 +++ Nanaomycin A 10 1 +++
Kontrollmittel 0,3 1 +++ (handelsüblich)
In den obigen Tabellen bedeuten:
= direkter Auftrag auf die befallene Stelle
Il = Auftrag nach Entfernung der Schuppen von der befallenen Stelle
Konz. = Konzentration des Wirkstoffes
+++ = vollständige Entfernung der Schuppen und Gesundung
+ + = noch geringe Schuppenbildung
+ = Entfernung eines Teiles der Schuppen
- = keine Schuppenentfernung und keine Gesundung
Das Ergebnis über die Wirkung des Nanaomycins A gegenüber verschiedenen Mikroorganismen ist in der
nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellt.
Test-Organismen | Medium*) | Minimale |
Hemin- | ||
konzentra- | ||
tionen | ||
Bacillus subtilis PCI 219 | N | 7,8 |
Staphylococcus aureus | N | 3,9 |
FDA 209 P(JCl) | ||
Staphylococcus aureus | N | 2,0 |
FDA 209 | ||
Sarcina lutea PCI 1001 | N | 2,0 |
Mycobacterium smegmatis | N | 62,5 |
Escherichia coli NIHJ | N | 31,3 |
(V)
Test-Organismen | Medium*) | Minimale |
llemm- | ||
konzentra- | ||
tionen | ||
(μ-g/ml) | ||
Escherichia coli NIHJ (JC-2) | N | 250 |
Klebsieila pneumoniae | N | 31,3 |
PCI 602 | ||
Salmonella typhimurium | N | 62,5 |
Shigella flexneri | N | 31,3 |
Xanthomonas oryzae N-5824 | N | 62,5 |
Pseudomonas aerughosa | N | 500 |
Candida albicans | P | 31.2 |
Saccharomyces sake | P | 31,2 |
Aspergillus niger ATCC 6275 | P | 62,5 |
Aspergillus fumigatus | P | 12,5 |
IAM 2612 | ||
Piricularia oryzae | P | 7,8 |
Mycrosporum gypseum 704 | P | 0,8 |
Fortsetzung | Medium | *) Mininiiile | 5 | Test-Organismen | Minimale Hemm konzentrat ion | Z | (Äthylkalamycinat). | Konzentration | 0,8 >100 |
Ilenim- | /g/ml | (ug/ml) | |||||||
konzcntra- | Nanomycin Λ Υ | <0,2 <0,2 >10() | |||||||
Test-Organismen | lionen | Antimycoplasma-Aktivität | 10 | ||||||
(Tg/ml) | Trichophyton | 3,1 | Antibioticum | 100 | durch die Agar- | ||||
IO | schoenleini | 10 | 27 C, 4 Tage) | ||||||
Trichophyton | 100 | ||||||||
P | 1,6 | violaseum | Nanaomycin A | 10 inn |
|||||
P | 1,6 | Die minimale Hemm-Konzentration wurde | 1 \J\) | ||||||
P | 1,6 | Anmerkung: | Dilutionsmethode (KartofTelagar, pH 6,4, | Deoxyfrenolicin | |||||
Trichophyton asteroides | P | 0,8 | 15 | geprüft. | |||||
Trichophyton ferrugineum | P | 0,2 | Y = Deoxyfrenolicin. Z = Äthylkalafunginat |
Äthylkalafunginat | Hemmbereich | ||||
Trichophyton interdigitale | P | 3,1 | (mm) | ||||||
Trichophyton mentagrophytes | P P |
0,4 <0,l |
20 | Tabelle 5 | |||||
Trichophyton pedis 804 | P | 0,2 | 20,4 | ||||||
Trichophyton purpureum | P | 0,4 | 28,7 | ||||||
Trichophyton roseum Trichophyton rubrum |
H E |
< 0,013 0,05 |
14,6 | ||||||
Trichophyton schoenleini | H | < 0,013 | 21,8 | ||||||
Trichophyton violaceum | E H |
0,10 < 0,013 |
0 o |
||||||
Mycoplasma gallisepticum KP-13 |
E | < 0,013 | |||||||
Mycoplasma gallisepticum S-6 | H | 1,56 | |||||||
Mycoplasma gallisepticum | H | 3,12 | JO | ||||||
333P (Spiramycin resistant) | E | 0,013 | |||||||
Mycoplasma gallinarum | H | >25 | |||||||
Mycoplasma iners | E H |
>25 25 |
|||||||
Mycoplasma pneumoniae | E | >25 | |||||||
Acholeplasma laidlawii (A) | |||||||||
PG 8 Acholeplasma laidlawii (B) |
|||||||||
BmI | |||||||||
*) Die Abkürzungen bedeuten: N, Nähr-Agar (pH 7,0,2 Tage,
37 C); P, KartofTel-Agar (pH 6,4, 4 Tage, 27 C); H, Hokken
PPLO-Agar (pH 7,8, 8 Tage, 37 C); E, Eiken PPLO-Agar (pH 7,8, 8 Tage, 37 C).
In weiteren Vergleichsversuchen wurde die fungizide Aktivität und die Antimycoplasma-Aktivität von Nanaomycin
A gegenüber dem bekannten Deoxyfrenolicin und Äthylkalafunginat (Äthylkalamycinat) geprüft. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 bzw. 5 zusammengestellt.
Anmerkung:
Der Hemmbereich wurde durch die Papierscheiben-Methode (Eiken PPLO-Agar, pH 7,8, 37 C, 1 Tag) geprüft.
Im Vergleich zu Deoxyfrenolicin besitzt Nanaomycir A etwa die gleiche fungizide Aktivität und ist hierin den
Äthylkalafunginat überlegen.
Das Nanaomycin A stellt ein hellgelbes Pulver mi folgenden physikalischen und chemischen Charakteristi
ken dar:
Tabelle 4 | Minimale Hemmkonzentration | \ Y | 50 | Z |
Fungizide Aktivität | ug/ml | 6,3 | >100 | |
Test-Organismen | Nanomycin / | 6,3 | >100 | |
50 | >100 | >100 | ||
12,5 | <0,2 | >100 | ||
Candida albicans | 6,3 | >100 | ||
Saccharomyces sake | 25 | <0,2 | ||
Aspergillus fumigatus | 0,8 | >100 | ||
Aspergillus niger | 3,1 | |||
Microsporum | 0,8 | >100 | ||
gypseum | 0,4 | |||
Trichophyton | 0,8 | >100 | ||
asteroides | <0,2 | |||
Trichophyton | 1,6 | >100 | ||
ferrugineum | ||||
Trichophyton | <0,2 | |||
interdigitale | ||||
Trichophyton | ||||
rubrum | ||||
1. Gewichtsanalyse in 0M füiene
gefunden: C - 63,35; H - 4,47
berechnet: C - 63,57; H - 4,66.
gefunden: C - 63,35; H - 4,47
berechnet: C - 63,57; H - 4,66.
2. Molekulargewicht:
m/e, durch Massespektrum bestimmt, ist 302 084 und der theoretische Wert von m/e für QeHuOe isi
302 079.
3. Schmelzpunkt: 178-!80°C.
4. Spez. Rotation: [α] ? - 273° (C = 1,0 in Methanol).
5. Ultraviolett-Absorptions-Spektrum:
λ JIi,OH nm (ε): 250 (0,985 χ 10«), 274 (1,22 χ ΙΟ4)
423(0,404 χ ΙΟ4) (Fig. I).
6. Infrarot-Absorptions-Spektrum:
Relativ starke Absorption bei 3150, 2960, 2910 1725, 1640, 1610, 1450, 1370, 1320, 1270, 1220
1160 cm -1 (durch KBr-Methode) (F i g. 2).
7. löslichkeit:
Leicht löslich in Methanol, Äthanol Äthylacetat
Chloroform, Aceton und Äther, Unlöslich ir η-Hexan, Petroläther und Wasser.
8. Farb-Reaktion:
Positiv in den Reaktionen mit Ferrichlorid unc
Reduktions-Katalysator ( F e i g 1, N., Anal. Chem.,
28, 397 [1956]). Negativ in Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion, Ehrlich-Reaktion, Fehling-Reaktion
und Molish-Reaktion.
Der aus einer Bodenprobe in Nanao-shi auf der Halbinsel Noto, Japan, isolierte Mikroorganismus
Streptomyces rosa var. notoensis, der uneingeschränkt beim Fermentation Research Institute in Chiba-shi,
Japan, unter FERM-P No. 2209 (und bei der American Type Cubture Collection in Rockville, Maryland, USA,
unter ATCC No. 31135) hinterlegt worden ist, besitzt folgende biologische Eigenschaften:
1. Morphologische Charakteristiken:
Bildung von Mycel vollständig an der Luft sowohl auf einem synthetischen als auch auf einem
natürlichen Agar-Agar-Medium, deren Beendigung unter Bildung einer massiven oder unregelmäßigen
Spirale erfolgt. Konidienträger, gebildet auf dem belüfteten Mycel. Die Konidiensporen sind oval
(0,6 —1,0 μ) und in einer Kette von 10 oder mehr. Die Sporen haben glatte Oberflächen.
2. Kultur-Charakteristiken:
Die Kultur-Charakteristiken sind in der nachfolgenden Tabelle 6 wiedergegeben:
Kultur-Charakteristiken von S. rosa var. notoensis FERM-P No. 2209
Medium
Wachstum
Umkehr (reserve) Belüftetes Mycel
Lösliches Pigment
Saccharosenitrat-Agar
Glukosenitrat-Agar
Glycerin-Asparagin-Agar
Anorganische Salze
Stärke-Agar
Stärke-Agar
Tyrosin-Agar
gut, leicht elfenbein bis leicht melonengelb
gut, stäubig gelb bis goldbraun
gut, leicht melonengelb bis orangerostfarben mittelmäßig, leicht
melonengelb
gut, leicht wcizenbis bernstein-topasfarben
NährstofT-Agar mittelmäßig, farblos
bis perlrosafarben
GIukose-Pepton-Agar mittelmäßig, farblos
bis goldbraun
Hefe-Extrakt-Malz- gut, farblos bis Extrakt-Agar goldbraun
Hafermehl-Agar mittelmäßig, farblos
bis leicht melonenfarbig
Pepton-Hefe-Extrakt- mittelmäßig, creme Eisen-Agar bis leicht weizen-
farben
Trypton-Hefe-Extrakt-Oberflächenwachs-Brijhe
turn, mittelmäßig.,
schwach elfenbeinfarben
leicht melonengelb bis apricotfarben
goldbraun bis schokoladenbraun
apricotfarben
perl rosafarben bis goldbraun
leicht melonengelb bis lohfarben
fruchtsaftgelb bis hellgelb
goldbraun bis sepiabraun
goldbraun bis orange-rostfarben
leicht melonengelb bis lohfarben
kolonialgelb
schwach elfenbeinfarben leicht apricotfarben
weiß bis perlrosa
leicht apricotfarben
leicht apricotfarben
weiß bis fleischrosa
leicht melonengelb
bis perlrosa
bis perlrosa
weiß, schwach
weiß
weiß
leicht melonengelb
bis leicht apricotfarben
bis leicht apricotfarben
leicht melonengelb
bis leicht apricotfarben
bis leicht apricotfarben
kärglich, weiß bis
kolonialgelb
kolonialgelb
weiß
perlrosa bis leicht melonengelb
leicht weizen- bis sepiabraun
melonengelb bis apricotfarben
dunkel kofferlohfarben bis sepiabraun
leicht weizen- bis melonengelb
nichts
efeu- bis dunkellorbeerfarben
efeufarben
schwach lohfarben
nichts
nichts
Milch | perlrosafarben | perlrosafarben bis | nichts | leicht apricotfarben |
chartreusefarben | bis perlrosa | |||
Gelatine | Oberflächenwachs | schwach elfenbein | weiß bis meergrün | Iorbeerfarben |
tum, gut | farben | grau | ||
Nitratbrühe | Oberflächenwachs | nichts | weiß | nichts |
tum, mittelmäßig | ||||
Cellulose | nichts | nichts | nichts | |
3. Physiologische Charakteristiken: Wachstumstemperatur: 15—45" C,
Verflüssigung der Gelatinierung: positiv, Hydrolysierung der Stärke: positiv.
Coagulierung von Magermilch: positiv,
Peptonisierung von Magermilch: positiv,
Bildung von Melanoid-Pigment: negativ.
Bildung von Tyrosinase: negativ,
Peptonisierung von Magermilch: positiv,
Bildung von Melanoid-Pigment: negativ.
Bildung von Tyrosinase: negativ,
Reduktion von Nitrat: positiv.
Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ, Zersetzung von Cellulose: negativ.
4. Verwendbarkeit von verschiedenen Kohlenstoffquellen:
Arabinose, Xylose, Glukose, Fruktose, Rhaninose,
Mannit, Glycerin, Maltose und Mannose können brauchbar sein, während Saccharose, Innosit und
Raffinose unbrauchbar sein können.
Die mikrobiologischen Charakteristiken dieses Stammes sind zusammengefaßt die folgenden:
Conidiophore sind spiralförmig und Conidiospore sind glatt. Das Wachstum auf synthetischem Medium ist
gefärbt in gelblichgrau oder orangegrau oder rötlichbraun, und das gebildete belüftete Myccl ist in weiß oder
orangegrau oder rosa gefärbt. Es ist ein lösliches Pigment gebildet, das in gelblichbraun oder stark
rötlichbraun gefärbt ist. Wenn ein organisches Medium verwendet wird, ist der Zuwachs im allgemeinen farblos
oder in orangegrau oder braun gefärbt, und das gebildete Mycel ist in weiß oder orangegrau oder rosa
gefärbt. Oftmals wird das lösliche Pigment nicht gebildet, während ein grünlich graues oder gräulich
schwarzes Pigment in einigen Medien gebildet wird. Dieser Stamm ist nicht chromogen und hat eine relativ
hohe Aktivität in Hinsicht auf die Zersetzung von Protein und Stärke.
Eine Untersuchung an Stämmen, die analoge Charakteristiken zu dem verwendeten Stamm haben
[vergl. S. A. Waksman »The Actinomycetes«, Bd. 2
(1961) und E. B. Sh i rl ing, D. Gottlieb »Coopera tive Description of Type Strains of Strepiomyces« in
»International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 18, No. 2, S. 69-189 (1968); Bd. 18, No. 4, S. 279-392
(1969); Bd. 19, No.4, S. 391 -512 (1969) und Bd. 22, No. 4,
S. 265—394 (1972)], hat einige Spezies ergeben, die als »fradiae« bezeichnet wurden, z. B. Streptomyces fradiae,
Streptomyces luridus, Streptomyces roseus, Streptomyces fuscus, Streptomyces roseoluteus und Streptomyces
rosa. Unter diesen sind Streptomyces roseoluteus und Streptomyces rosa fast analog, jedoch ist einerseits
Streptomyces roseoluteus von dem Nanaomycin-produzierenden Stamm unterscheidbar, weil die Farbe an der
Rückseite von der Streptomyces roseoluteus-Koionie gelblichorange bis gelb wird, z. B. in Medien, die aus
Hefeextrakt-Malzextrakt, Hafermehl-Agar, sowohl anorganischem
Stärke-Agar, als auch Glycerin-Asparagir;-Agar bestehen, unter gleichzeitiger Bildung eines
gelblichen, löslichen Pigmentes. Andererseits ist Streptomyces rosa im allgemeinen gleich dem Nanaomycinproduzierenden
Stamm mit der Abweichung, daß die Produktion an löblichem Pigment in Medien, die z. B. aus
Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar. Glukose-Pepton-Agar
bestehen, eintritt und daß die Reduktion des Nitrats im Falle von Streptomyces rosa nicht zu
beobachten ist. Der Nanaomycin-produzierende Stamm ist für eine Variante von Streptomyces rosa zu halten.
Dieser Stamm wird daher als Streptomyces rosa var. notoensis bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Antibiotica Nanaomycin A und Nanaomycin B ist
dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Streptomyces rosa var. notoensis FERM-P No.
2209 in einem üblichen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Slickstoffquellen enthält, unter aeroben
Bedingungen bei einer Temperatur von 15—400C
und einem dH von 6—10 züchtet und anschließend die gebildeten Antibiotica aus der Kultur abtrennt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird gleichzeitig das Nanaomycin A der oben angegebenen Formel
und das Nanaomycin B der Formel
H H
gebildet. Dieses Nanaomycin B, welches einen Schmelzpunkt von 84 —860C und eine akute Toxizität (LD50. ip)
auf Mäuse von 169 mg/kg besitzt, wird aufgrund seiner im übrigen dem Nanaomycin A sehr ähnlichen
Eigenschaften zu demselben Zweck wie das Nanaomycin A verwendet.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein zum Züchten eines Mikroorganismus übliches Kulturmedium
verwendet werden. Vorzugsweise wird ein flüssiges Medium verwendet, aber auch ein festes Medium ist
verwendbar. Die Fermentierung wird aerob unter Schütteln und/oder getauchten Bedingungen bei einer
Temperatur zwischen 15 und 4O0C und einem dargestellten pH-Wert von 6— 10 etwa 2—8 Tage lang
durchgeführt. Als Nährmedium eignet sich ein übliches synthetisches oder organisches Medium mit üblichen als
Kohlenstoffquelle und Stickstoffquelle zu verwendenden Stoffen und üblichen anorganischen Nährstoffen.
Als Kohlenstoffquellen eignen sich z. B. Glukose. Glycerine, Fruktose. Maltose. Mannit, Xylose, Galaktose,
Laktose, Ribose. Stärke und Stärke-hydrolysat. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise
0,5 — 5,0% (wenn als Glukose berechnet), bezogen auf das Medium. Auch organische Säuren, wie Glukonsäure,
Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure und Aminosäuren, wie Glykokoll. Glutaminosäure, Alanin können
verwendet werden. Als Stickstoffqucllc eignen sich z. B.
Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammonsalze. wie Ammonchlorid. Ammonphosphat.
Ammonsulfat, Ammonnitrat; stickstoffhaltige organische Materialien, wie Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt.
Trockenhefc. Hefeextrakt, Maiswasser, Caseinhydrolysat.
Fischmehl, ein daraus extrahiertes Produkt, Sojabohnenmehl, daraus digerierte Produkte, entfettete
Sojabohnen, deren digerierte Produkte, Insektenlarven-Hydrolysat;
und Aminosäuren, wie Glykokoll. Glutaminsäure, Alanin.
Dem Nährmedium können als anorganische Substanzen z. B. verschiedene Phosphate. Magnesiumsulfat
zugegeben werden. Falls gewünscht, können Spuren eines Schwermelallsalzes zugesetzt werden, jedoch ist
das nicht immer wesentlich, sofern das verwendete Medium natürliche Materialien enthält.
Man arbeitet im allgemeinen wie nachstehend beschrieben.
Ein entsprechendes Kulturmedium (100 ml) wird in eine 500-ml Sakaguchi-Flasche eingefüllt und bei einer
Temperatur von 1200C 15 Minuten sterilisiert. Anschließend
wird das sterilisierte Medium mit Sporen und/oder dem Mycel von Streptomyces rosa var. notoensis
FERM-P No. 2209 geimpft und die Fermentierung unter Schütteln (110 U/Min.) bei einer Temperatur von 270C
während einer ausreichenden Zeitspanne von beispiels-
weise 3 Tagen durchgeführt, wobei sich große Mengen von Nanaomycin A und B in der Kulturbrühe bilden.
Man kann auch ein entsprechendes Kulturmedium (20 1) in einen 30-1-Fermenter einfüllen und bei einer
Temperatur von 1200C 15 Minuten lang sterilisieren, ">
Anschließend wird mit dem betreffenden Mikroorganismus beimpft und die Fermentierung bei einer Temperatur
von 27°C 3 Tage unter Schütteln (300 U/Min.) und Belüftung(10 l/Min.)durchgeführt. Bevorzugt wird auch
ein entsprechendes Kulturmedium (2001) in einem κι Tank-Fermenter (Fassungsvermögen 4001) bei einer
Temperatur von 27°C 3 Tage unter Schütteln (200 U/Min.) und Belüftung (100 l/Min.) fermentiert.
Gute Resultate können in allen Fällen erzielt werden, wenn als Kohlenstoff bzw. Stickstoffquelle Glycerin und ι ">
Sojabohnenmeh! verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist ein Medium mit 2,0% Glycerin, 2,0%
Sojabohnenniehl und 0,3% NaCI mit einem pH-Wert von 7,0. Unter Verwendung eines solchen Mediums
wurde nach einer 70stündigen Züchtung bei einer :ii Temperatur von 27°C in einem Tank-Fermenter bei
einer Probe der obenstehenden Flüssigkeit, die einen pH-Wert von 5,2 aufwies, eine Hemrnzone von 30 mm
Durchmesser gegenüber dem Mikroorganismus Mycoplasma gallisepticum KP-13 festgestellt. Sowohl in den :>
fermentierten Flüssigkeiten als auch in den fermentierten Feststoffen sind Nanaomycin A und B zu finden,
jedoch enthält die fermentierte Flüssigkeit gewöhnlich größere Mengen an Nanaomycin A und B als die
fermentierten Feststoffe. in
Testverfahren für Nanaomycin A und B
Das in der Fermentationsflüssigkeit gebildete Nanaomycin A und B wird beispielsweise durch die
Papierscheiben-Methode geprüft, welche von Itoh η
und Mitarbeitern im Journal of Antibiotics, 24, Seite 885-859 (1971) beschrieben wird.
Zur Isolierung von Nanaomycin A und B nach beendeter Fermentierung aus der Kulturbrühe wird die
Brühe in die feste und die flüssige Phase in üblicher Weise z. B. durch Filtrierung, Zentrifugierung getrennt.
Die flüssige Phase, d. h. das Filirat wird z. B. mit
Salzsäure auf einen sauren pH-Wert von vorzugsweise 2 bis 4 eingestellt, welches dann der Extraktion mit
einem organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat oder 4~> Butylacetat unterworfen wird. Danach werden Nanaomycin
A und B durch Reinigung der extrahierten Substanz auf übliche Weise erhalten. Man kann auch
Nanaomycin A und B von der extrahierten Lösung in alkalischem Zustande isolieren, jedoch soll ein übermä- ~>o
ßig hoher pH-Wert vermieden werden, da Nanaomycin B in Nanaomycin A in alkalischem Zustande umgewandelt
wird. Um aus dem Extrakt sehr schnell Nanaomycin A und B zu eluieren, wird beispielsweise eine l%ige
wäßrige Natriumbicarbonatlösung verwendet. Unmit- r>
telbar danach wird das Nanaomycin A und B enthaltende Eluat beispielsweise mit Salzsäure auf einen
sauren pH-Wert eingestellt und dann die wäßrige Lösung mit einem organischen Lösungsmittel, wie
Äthylacetat oder Butylacetat, extrahiert. Der erhaltene mi Extrakt wird zur Trockne konzentriert, wobei Nanaomycin
A und B als Rohpulver erhalten wird, welches dann der Säulen-Chromatographie unter Verwendung
von Silikagel unterworfen wird. Das Rohpulver wird zuerst mit einem Lösungsmittelgemisch von Ben- b'
zol-Äthylacetat (4:1, v/v) entwickelt, wobei die das
Nanaomycin A enthaltenden Fraktionen eluierl werden, und dann wird mit einem Lösungsmittelgemisch von
Benzol-Äthylacetat (3:1, v/v) entwickelt, wobei die das Nanaomycin B enthaltenden Fraktionen eluiert werden.
Die jeweils erhaltenen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne konzentriert. Das Nanaomycin A enthaltende
Trockenmaterial wird in Äthanol gelöst, dem dann eine geringe Menge an Wasser zugesetzt wird,
wobei Kristalinadeln von Nanaomycin A ausfallen. Das Nanaomycin B kann auch in gleicher Weise aus den das
Nanaomycin B enthaltenden Fraktionen erhalten werden, wobei das entsprechende Trockenmaterial
durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigt wird, und bei der in gleicher Weise wie vorstehend
beschrieben unter Verwendung von Benzol-Äthylacetat (3:1, v/v) als Elutionsmittel gearbeitet wird.
Auf einer schrägen Kultur wurde mit Hilfe einer Platinöse etwas von dem Stamm Streptomyces rosa var.
notoensis FERM-P No. 2209 entnommen und damit ein Saatmedium beimpft, welches 2,0% Glycerol, 2,0%
Sojabohnenmehl und 0,3% NaCI enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt sowie 15 Minuten bei 1200C
sterilisiert worden war. Das beimpfte Saatmedium wurde dann 2 Tage bei 27°C und einem pH von 7
gezüchtet. Die anfallende Saatkultur wurde weiter in einer Menge von 1% auf ein Medium (20 I) geimpft,
welches sich in einem 30-1-Fermenter-Gefäß befand und
ebenfalls 2,0% Glycerol, 2,0% Sojabohnenmehl und 0,3% NaCl enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0
eingestellt sowie 15 Minuten bei 1200C sterilisiert worden war. Dann wurde der Mikroorganismus 4 Tage
bei 27°C unter Belüftung (10 l/Min.) und Rühren (300 U/Min.) gezüchtet. Nach Abschluß der Fermentierung
betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 4,8. Eine Probe der obenstehenden Schicht der Brühe ergab bei
der Prüfung gegen Mycoplasma gallisepticum eine Hemmzone von 30 mm Durchmesser. Die Brühe (20 I)
wurde zur Entfernung des Mycel zentrifugiert, das Filtrat mit 6 η HCI auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt
und dann mit 4 1 Butylacetat extrahiert. Der Butylacetatcxtrakt wurde nun mit 800 ml l%igcr wäßriger
Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die wäßrige Lösung wurde dann mit 6 η HCI auf einen pH-Wert von 2.0
eingestellt und mit 160 ml Äthylacetat extrahiert. Dieser Extrakt wurde konzentriert und mit 30 ml Petroläther
versetzt, wobei ein gelbbraunes Pulver (1,09 g) ausfiel. Das erhaltene Pulver wurde anschließend auf folgende
Weise gereinigt.
Das Rohpulver, das Nanaomycin A und B enthielt, wurde in Äthylacetat (15 ml) gelöst, mit Silikagel (4 g)
versetzt und im Vacuum getrocknet. Dann wurde das getrocknete Material in eine mit Silikagel (55 g)
vollgepackte Säule eingegeben und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol-Äthylacetat (4:1, v/v) entwikkelt
Das Eluat wurde in einzelne Fraktionen von jeweils 15 ml aufgeteilt. Jede Fraktion wurde nach der bereits
erwähnten Papierscheibenmethode unter Verwendung von Mycoplasma gallisepticum KP-HalsTest-Mikroorganismus
geprüft. Der erste Teil des Eluats, und zwar die Proben 8 bis 22 der Fraktionen enthielten Nanaomycin
A, wobei die Probe 14 Aktivität gegen den Test-Mikroorganismus aufwies. Für die Fraktionen nach der
Probe 30 wurde als Lösungsmittelgemisch zur Elution ein solches von Benzol-Äthylacetat (3:1. ν/ν) verwendet.
Die Fraktionen 32 bis 60 enthielten das Nanaomycin
B, wobei die Aktivität der Nummer 46 gegenüber dem Test-Mikroorganismus am höchsten war.
Die Fraktionen 8 bis 22 wurden vereinigt und im Vacuum getrocknet Der erhaltene Rückstand wurde in
Äthapol gelöst und dann mit einer geringen Menge Wasser versetzt, wooei gelbe Kristallnadeln (31,7 mg)
erhalten wurden. Die Kristalle wurden aus Äthanol unter Zugabe einer geringen Menge tn Wasser
umkristallisiert. Man erhielt 25,3 mg gereinigtes Nanaomycin A mit einem Reinheitsgrad von über 99% und
einem Schmelzpunkt von 178—1800C.
Das UV-Absorptions-Spektrum der Verbindung ist in F i g. 1 dargestellt
λ ;£."" nm: 250,274 und 423
Das IR-Absorptions-Spektrum (KBr-Methode) der
Verbindung ist in F i g. 2 dargestellt
Charakteristisch starke Absorption bei
1725,1640 und 1610cm-'
1725,1640 und 1610cm-'
Die Fraktionen 32 bis 60 wurden vereinigt und im Vacuum getrocknet, wobei ein blaßgelbes Pulver
(450 mg) erhalten wurde. Das Pulver wurde weiter mittels Säulenchromatographie an Silikagel und unter
Verwendung von Benzol-Äthylacetat (3:1, v/v) als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt 270 mg gereinigtes
Nanaomycin B als Pulver mit einem Reinheitsgrad von 99% und einem Schmelzpunkt von 84—86° C.
UV-Ab.sorptions-Spektrum der Verbindung:
λ iSm nm:231 und 352
λ iSm nm:231 und 352
IR-Absorptions-Spektrum (KBr-Methode) der Verbindung:
Charakteristich starke Absorption bei
1705,1648 und 1605 cm -'.
1705,1648 und 1605 cm -'.
ίο Dem gemäß Beispiel 1 durch Zentrifugieren der
Kulturbrühe erhaltenen Mycel wurden 5 Liter Äthylacetat unter Rühren zugesetzt Der erhaltene Extrakt
wurde mit 2 Liter 1 %iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung (21) versetzt die wäßrige Schicht abgetrennt und
diese mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,C eingestellt Dann wurde sie mit 500 ml Äthylacetai
extrahiert und der Extrakt im Vacuum getrocknet Man erhielt 521 mg eines gelbbraunen pulvrigen Rohproduktes,
das wie im Beispiel 1 der Silikagel-Säulenchromato graphie unterworfen wurde. Man erhielt die folgenden
Ergebnisse:
Ausbeute Schmelzpunkt Reinheitsgrad
Nanaomycin
Nanaomycin B
Nanaomycin B
13 mg
85 mg
85 mg
173-175 C
82- 84 C
82- 84 C
95%
92%
92%
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche:
1. Nanaomycin A der FormelCHj HHO OCOOHH OH HH H
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19752510868 DE2510868C3 (de) | 1975-03-13 | 1975-03-13 | Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin B |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19752510868 DE2510868C3 (de) | 1975-03-13 | 1975-03-13 | Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin B |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2510868A1 DE2510868A1 (de) | 1976-09-23 |
DE2510868B2 DE2510868B2 (de) | 1979-06-21 |
DE2510868C3 true DE2510868C3 (de) | 1980-02-14 |
Family
ID=5941210
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19752510868 Expired DE2510868C3 (de) | 1975-03-13 | 1975-03-13 | Nanaomycin A und Verfahren zur Herstellung der Antibiorica Nanaomycin A und Nanaomycin B |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE2510868C3 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61152668A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-11 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 新抗生物質YS−02931K−β物質およびその製造法 |
-
1975
- 1975-03-13 DE DE19752510868 patent/DE2510868C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2510868B2 (de) | 1979-06-21 |
DE2510868A1 (de) | 1976-09-23 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |