CH619267A5

CH619267A5 -

Info

Publication number: CH619267A5
Application number: CH946076A
Authority: CH
Inventors: Rokuro Okamoto; Tsumoru Fukumoto; Akira Takamatsu; Tomio Takeuchi
Original assignee: Sanraku Ocean Co
Priority date: 1975-08-01
Filing date: 1976-07-23
Publication date: 1980-09-15
Also published as: CA1063954A; DE2634499A1; US4092473A; DE2634499C2; SE441598B; DK151262B; SE7608448L; DK151262C; ES450333A1; NL7608411A; DK344976A; GB1539907A; FR2319374B1; BR7605024A; NL176087C; FR2319374A1

Description

L'invention se rapporte à un procédé de préparation de dérivés acylés d'antibiotiques macrolides comprenant de nouveaux dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine, et des sels d'addition acides de ces dérivés, par acyla-tion biochimique d'au moins l'une des positions 3 et 4" des antibiotiques macrolides à 16 membres, procédé selon lequel la réaction biochimique est effectuée en utilisant des microorganismes du genre Streptomyces choisis pour leur aptitude nouvellement trouvée pour ladite acylation, la récupération des dérivés du mélange réactionnel s'effectuant suivant des méthodes conventionnelles de récupération des antibiotiques macrolides.

Deux exemples sont indiqués dans l'art antérieur, concernant le procédé d'acylation microbienne des antibiotiques macrolides à 16 membres, à savoir l'utilisation de la spiramycine et de YL-704. Le procédé utilisant la spiramycine est décrit dans le brevet américain No. 2 943 024 «Préparation of spiramycin III», le brevet américain No. 2 943 025 «Préparation of spiramycin II», le brevet français No. 1 262 571 «Transformation biochimique de la spiramycine I en spiramycine II et III» et le brevet japonais Showa (Kokoku) 36-349 «Process for producing spiramycin II, spiramycin III and the mixture thereof...» Ces brevets concernent pratiquement la même invention, traduite en des langages différents, illustrant l'essentiel des procédés:

1) Un organisme de Streptomyces ambofaciens NRRL-2420, producteur de spiramycine est cultivé dans un milieu de culture ajouté à la spiramycine I (présentant 3 groupes hydro-xyles) et aux agents d'acylation, ce qui permet d'obtenir la spiramycine II (ayant un groupe 3-acétyl) et la spiramycine III (ayant un groupe 3-propionyl).

2) Des cellules cultivées exemptes de spiramycine et d'agents d'acylation sont mises en suspension dans un milieu

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réactionnel, auquel sont ajoutés la spiramycine I et les agents d'acylation. On obtient après incubation les spiramycines II et m.

3) Dans la fabrication, par fermentation, de la spiramycine avec ledit organisme, l'addition des agents d'acylation accroît le rendement de la spiramycine II ou III.

Le procédé selon l'invention se différencie nettement, dans son principe, des techniques connues, ceci pour les raisons suivantes:

1) Ces techniques utilisent un organisme qui est un producteur direct de spiramycine et le processus est étroitement lié à une fermentation antibiotique. Du fait que les quatre souches utilisées avantageusement dans l'invention ne sont pas des produits d'espèces antibiotiques désirées, ceci indique que le procédé de l'invention est un procédé enzymatique dans son principe.

2) Le substrat antibiotique utilisé dans ces processus est limité à la spiramycine I qui est un produit direct de l'organisme précité, tandis que le procédé de l'invention peut utiliser la plupart des antibiotiques macrolides à 16 membres, ce qui est l'indication de la nature non spécifique de la réaction exprimée par rapport à la spécificité du substrat.

3) Les processus des techniques connues permettent seulement d'effectuer la transformation de la position 3 de la spiramycine I, alors que l'invention permet d'obtenir, si on le désire, la transformation simultanée des positions 3 et 4" avec un organisme. Une très vaste variété de produits peut être obtenue par combinaison du substrat, du donneur acyle et des conditions réactionnelles. On obtient en outre une simplicité dans le procédé pour transformer les deux positions fonctionnelles simultanément avec un système de cellules.

En ce qui concerne le YL-704 qui appartient à la famille des leucomycines, on se réfère au brevet japonais (Kokoku) Showa 49-13 992 «Process for producing an antibiotics YL-704 Ai». Ce procédé montre qu'un organisme choisi dans le groupe comprenant le Streptomyces eurocidicus NIHJ-267, le Strepto-

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myces albireticuli IFO-12 737, le Streptomyces kitasatoensis NRRL-2486 et le Streptomyces sp. MCRL-0737 est cultivé dans un milieu renfermant un «DHP composé», 4"-deacyl YL-704 Ai, ou le composé DHP et la L-leucine, et que l'on isole dans la culture obtenue, le YL-704 Ai présentant un groupe isovaléryle en position 4" du composé DHP.

Les processus de l'invention sont également différents des processus mis en œuvre pour la fabrication du YL-704 Ai, comme cela a déjà été expliqué dans le cas du procédé à la spiramycine, eu égard aux organismes employés, à la nature enzymatique du procédé, à la non-spécificité du substrat ou à la variété des produits recherchés, et en ce sens que l'acylation en positions 3 et 4" peut être faite simultanément avec un système de cellules, ce qui est d'une utilité industrielle importante.

H n'a été donné dans l'art antérieur, aucune description de l'acylation biochimique de la tylosine et de l'angolamycine, ni des dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine qui sont revendiqués dans l'invention.

Les positions 3 et 4" des macrolides à 16 membres dans la présente description désignent respectivement la position 3 du noyau à 16 membres et la position 4" de la mycarose de l'antibiotique macrolide.

L'invention a pour but de fournir un nouveau procédé de fabrication de dérivés O-acylés d'antibiotiques macrolides, par acylation biochimique d'au moins l'une des positions 3 et 4" des macrolides à 16 membres.

L'invention a également pour but de fournir un procédé de fabrication d'un nouveau composé comprenant un nouveau dérivé de la tylosine, de l'angolamycine ou de la spiramycine.

Un autre but de l'invention concerne l'utilisation du composé obtenu comme additif à des denrées fourragères.

L'invention fournit un procédé de fabrication de composés antibiotiques macrolides à 16 membres ayant au moins un groupe acyle en positions 3 et 4", caractérisé en ce qu'on effectue l'acylation d'au moins un groupe hydroxyle aux positions 3 et 4" d'un substrat antibiotique macrolide à 16 membres, au moyen d'un micro-organisme du genre Streptomyces ou d'une préparation enzymatique de ce micro-organisme capable d'une telle acylation en présence de donneurs acyle en C2-C5 biochimiques.

L'invention fournit ainsi un procédé de fabrication de nouveaux composés acylés de tylosine et d'angolamycine tels que:

3-acétyltylosine, 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine, 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, 3-propionyltylosine, 3-propionyI-4"-n-butyryltylosine, 3-propionyl-4//-iso-valéryltylosine, 4"-n-butyryltylosine, 4"-isovaléryl-tylosine, 3-acétylangolamycine, 3-acétyl-4"-n-butyryl-angolamycine, 3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine, 3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine, 3-propionylangolamycine, 3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine, 3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine, 4"-n-butyryIangolamycine, 4"-iso-valérylangolamycine et les sels d'addition acides non toxiques de ces composés, lesquels: inhibent la croissance de microorganismes, ainsi qu'un procédé de fabrication de composés acylés de spiramycine, par exemple: 3-acétylspiramycine I (spiramycine II), 3-propionylspiramycine I (spiramycine III), 3-acétyl-4"-n-butyrylspiramycine I, 3-acét-yl-4/'-isovalérylspiramycine I, 3-propionyl-4"-n-buty-rylspiramycine I, 3-propionyl-4//-isovalérylspiramy-cine 1,4"-n-butyrylspiramycine 1,4//-isovalérylspira-mycine I, parmi lesquels les six derniers composés sont nouveaux, et les sels non toxiques de ces composés acceptables pharmaceutiquement.

L'invention permet en outre d'obtenir un additif pour aliments favorisant la croissance des animaux.

Les dessins annexés illustrent l'invention. Sur ces dessins:

Fig. 1 et 2 représentent les spectres d'absorption en ultraviolet, respectivement de la 4"-n-butyryltylosine et de la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine ;

Fig. 3 à 10 représentent les spectres d'absorption en infra-rouge, respectivement de la 3-acétyltylosine, 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine, 3-acétyl-4"-isovaléryl-tylosine, 3-propionyltylosine, 3-propionyl-4/'-n-buty-ryltylosine, 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine, 4"-n-butyryltylosine et de la 4//-isovaléryltylosine;

Fig. 11 à 18 sont les spectres NMR (CDCI3) de chacun des composés représentés, dans l'ordre, aux figures pour le spectre d'absorption infra-rouge;

Fig. 19, 20 et 21 représentent les spectres de masse par ionisation chimique, respectivement pour la 3-acétyltylosine, la 3-propionyltylosine et la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine;

Fig. 22 et 23 représentent les spectres C13-NMR pour la 3-acétyltylosine et la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine;

Fig. 24 et 25 représentent les spectres d'absorption UV de la 3-acétylangolamycine et de la 3-acétyl-4"-isovalérylangola-mycine;

Fig. 26 et 27 représentent les spectres d'absorption IR de la 3-acétylangolamycine et de la 3-acétyl-4//-isovalérylangolamy-cine;

Fig. 28 et 29 représentent les spectres NMR de la 3-acétyl-angolamycine et de la 3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine;

Fig. 30 représente le spectre d'absorption UV de la 4"-isovalérylspiramycine II;

Fig. 31 représente le spectre d'absorption IR de la 4"-isova-lérylspiramycine H;

Fig. 32 représente le spectre NMR de la 4//-isovaIérylspira-mycine H;

Fig. 33 représente la Chromatographie en couches minces des dérivés des macrolides à 16 membres selon l'invention.

L'invention se rapporte plus spécialement à la fabrication de dérivés acylés de macrolides à 16 membres ayant au moins un groupe acyle de 2 à 5 atomes de carbone en positions 3 et 4". Selon ce procédé, on réalise la culture d'un organisme du genre Streptomyces possédant l'activité requise pour l'acylation des positions 3 et 4" des macrolides à 16 membres dans un milieu employé pour la culture des organismes du genre précité; on effectue la réaction d'acylation dans une combinaison de sources enzymatiques, par exemple par développement et non-développement des cellules dudit organisme cultivé ou des préparations enzymatiques de celui-ci, le substrat antibiotique des macrolides à 16 membres à acyler ayant au moins un groupe hydroxyle en position 3 et 4" et le groupe donneur acyle comprenant des composés acylés en C2-C5, par exemple des coenzymes A acylés et leurs précurseurs métaboliques; la récupération des produits acylés du mélange réactionnel se faisant au moyen de méthodes couramment utilisées pour la récupération d'antibiotiques macrolides.

L'invention se rapporte notamment au procédé de fabrication de dérivés acylés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine ayant respectivement les formules générales I, II et III suivantes:

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H,C CH,

v

HO prT

CH, CHoCH0

j i &

XO^-CH^

No Q2

(I)

H2CH3

HO CH.

N

CH -CM-CHO

J | d.

h3 \ x3

N—O— R,

0 k X (n)

n0^ch„

CH2CH3

h3C%

^ CH:

o_R2

H3CN>^0

(m)

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formules dans lesquelles Ri est un hydrogène, un groupe acétyle ou un groupe propionyle, et R2 est un hydrogène, un groupe n-butyry]e ou un groupe isovaléryle, en excluant le cas où Ri et R2 sont tous deux des hydrogènes, ainsi que des sels d'addition acides de ces composés non toxiques et acceptables au point de vue pharmaceutique; et des additifs pour l'alimentation en vue de l'administration à l'homme et à l'animal.

L'acylation des antibiotiques est l'une des méthodes pratiques mises en œuvre pour la fabrication de nouvelles espèces et de nouveaux dérivés antibiotiques. Toutefois, l'acylation peut se produire de façon uniforme et nécessite en conséquence d'autres étapes, par exemple la protection sélective de restes fonctionnels afin d'obtenir le produit désiré, destiné à être acylé en des positions particulières. D'autre part, des processus biochimiques provoquent l'acylation sélective uniquement en des positions-cibles, en raison de la spécificité des réactions enzymatiques, et le rendement est habituellement élevé. On a effectué une étude approfondie d'une telle réaction biochimique, notamment de l'acylation des antibiotiques macrolides, et l'on a trouvé que plusieurs micro-organismes pouvaient acyler spécifiquement à la fois la position 3 et la position 4" des antibiotiques à 16 membres. La découverte de l'existence de tels micro-organismes et des réactions enzymatiques représente un fait nouveau et le premier du genre. Ces réactions ont été en outre étudiées en vue d'établir la transformation biochimique industrielle d'antibiotiques macrolides, étude qui fut appliquée notamment à la production de dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine.

Essai 1

On prépare un milieu ayant la composition suivante:

40 g de farine de soja, 50 g de glucose, 1 g d'extrait de levure, 0,5 g de MgSO<t.7 H2O et 0,5 g de K2HPO4 dans 1000 ml d'eau (pH 7,0). 100 ml de ce milieu, placés dans un flacon de culture de 500 ml, sont stérilisés à 120°Cpendant 20 min. Du Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416 est alors inoculé à ce milieu et cultivé à 37°C sous agitation. Après une journée de culture, temps après lequel la moitié du glucose est consommée, une solution de leucomycine Ai est ajoutée à la concentration finale dans le milieu de 2 g/1 et l'on poursuit la réaction pendant 6 heures supplémentaires. Le mélange réactionnel obtenu est clarifié par centrifugation, ajusté à un pH de 8,5 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium, et extrait avec un égal volume d'acétate d'éthyl. L'extrait est concentré à environ un tiers de son volume original sous pression réduite et une portion est déposée sur une plaque à couche mince de gel de silice (Merck Co.©). La plaque est ensuite développée par un mélange de solvants de n-hexane: acétone :méthanol:benzè-ne:acétate d'éthyl (30:10:8:25:20), complètement séchée, plongée dans l'acide sulfurique à 10% et chauffée. Deux taches sont détectées avec des valeurs Rf d'environ 0,50 et 0,65 lesquelles sont attribuées respectivement à la leucomycine Ai et à la leucomycine A3 (3-acétylleucomycine Ai) par comparaison analytique avec des échantillons authentiques.

Essai 2

Les cellules développées dans le premier essai (juste avant l'addition des antibiotiques) sont rassemblées par centrifugation, rincées une fois avec une solution tampon de phosphate 0,05M de pH 6,5 et remises en suspension dans la même solution tampon avec du glucose ajouté à la concentration de 2 g/ litre. La concentration des cellules dans la solution tampon est d'environ 10 grammes de matière sèche/litre. La laucomycine V suivante et la L-leucine sont ajoutées à des concentrations respectivement de 0,5 g/litre et 1 g/litre, et l'incubation aérobie est conduite dans des conditions similaires à celles de la culture des cellules. La réaction est terminée 3 heures plus tard et est suivie du même processus que dans l'essai 1. Sur une plaque de Chromatographie à couche mince, deux taches apparaissent, présentant chacune une valeur Rf d'environ 0,3 et 0,65, qui sont identifiées comme le substrat, leucomycine V, et le produit, leucomycine A3 (3-acétyl-4//-isovalérylleucomycine v).

Essai 3

Les cellules obtenues et rincées comme dans l'essai 2, sont remises en suspension dans une petite quantité de ladite solution tampon au phosphate et homogénéisées en utilisant une presse dite «française», d'où l'on obtient un fluide surnageant par centrifugation à 3000 X G pendant 10 minutes. A une solution diluée du surnageant, la leucomycine U et l'isovaléryl Coenzyme A (Coenzyme A est désigné ci-après en abrégé par CoA) sont ajoutés tous deux à des concentrations de 0,2 g/ litre, et la réaction est conduite comme dans l'essai 2. La formation de leucomycine A3 (4"-isovalérylIeucomycine U) est confirmée au chromatogramme à couche mince.

Essai 4

Des portions de 20 ml de la solution diluée de surnageant homogène de cellules préparée comme dans l'essai 3, sont placées dans chacun des 27 flacons Erlenmeyer de 500 ml, ces flacons étant numérotés de 1 à 27. Trois types d'antibiotiques sont ajoutés dans les flacons, chacun en une quantité de 20 mg, la tylosine étant ajoutée aux flacons 1-9, l'angolamycine aux flacons 10-18, et la spiramycine I aux flacons 19-27. Des CoA acylés sont également ajoutés à raison de 20 mg pour chaque espèce; on ajoute l'acétyl CoA aux flacons 2,11 et 20, le propionyl CoA aux flacons 3, 12 et 21, le n-butyryl CoA aux flacons 4,13 et 22, l'isovaléryl CoA aux flacons 5,14 et 23, l'acétyl CoA et le n-butyryl CoA aux flacons 6,15 et 24, l'acétyl CoA et l'isovaléryl CoA aux flacons 7,16 et 25, le propionyl CoA et le n-butyryl CoA aux flacons 8,17 et 26, le propionyl CoA et l'isovaléryl CoA aux flacons 9,18 et 27. Aucun acyl CoA n'est ajouté aux flacons 1,10 et 19.

L'incubation se fait pendant 3 heures à 37°C sous agitation modérée, après quoi la solution résultant de la réaction est rendue légèrement alcaline et chaque solution est extraite avec 30 ml d'acétate d'éthyle. Les extraits sont concentrés à environ 2 ml sous pression réduite et les concentrats sont déposés sur des plaques à couches minces, ceci étant suivi d'un développement comme dans l'essai 1. Après développement, les plaques séchées sont éclairées sous une lampe UV, en positionnant la tache du produit principal sur la plaque. Les produits principaux sont dissous dans l'acétone; l'acétone s'évaporant, laisse le produit principal dont les constituants sont dissous chacun dans l'eau légèrement acidifiée. Après avoir été rendues faiblement alcalines, les solutions sont extraites au benzène et les produits extraits sont concentrés à sec de manière à obtenir 7 à 10 mg de produit principal pour chaque flacon; environ 50 mg de poudre de chaque produit sont obtenus en employant plusieurs flacons pour chaque réaction, l'identification se faisant par analyses variées telles que spectre UV, spectre IR, spectre NMR, points de fusion, pouvoirs rotatoires, dégagement d'acide organique par Chromatographie gazeuse et valeurs Rf par Chromatographie en couches minces qui est illustrée à la fig. 33 où les numéros 1 à 27 sont respectivement les taches correspondant aux numéros indiqués entre parenthèses au Tableau 1. Les résultats sont rassemblés au Tableau 1, lequel illustre la relation existant entre les substrats antibiotiques, les CoA acylés et les produits principaux.

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s

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Tableau 1

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flacons no.

substrats acyl CoA

produit principal

1

tylosine néant tylosine

(1)

2

tylosine acétyl CoA

3-acétyltylosine

(4)

3

tylosine propionyl CoA

3-propionyltylosine

(7)

4

tylosine n-butyryl CoA

4"-n-butyryltylosine

(2)

5

tylosine isovaléryl CoA

4"-isovaléryltylosine

(3)

6

tylosine acétyl CoA + n-butyryl CoA

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

(5)

7

tylosine acétyl CoA + isovaléryl CoA

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

(6)

8

tylosine propionyl CoA + n-butyryl CoA

3-propionyI-4"-n-butyryltylosine

(8)

9

tylosine propionyl CoA + isovaléryl CoA

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

(9)

10

angolamycine néant angolamycine

(10)

11

angolamycine acétyl CoA

3-acétylangolamycine

(13)

12

angolamycine propionyl CoA

3-propionylangolamycine

(16)

13

angolamycine n-butyryl CoA

4"-n-butyrylangolamycine

(11)

14

angolamycine isovaléryl CoA

4"-isovalérylangolamycine

(12)

15

angolamycine acétyl CoA + n-butyryl CoA

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

(14)

16

angolamycine acétyl CoA + isovaléryl CoA

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

(15)

17

angolamycine propionyl CoA + n-butyryl CoA

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

(17)

18

angolamycine propionyl CoA + isovaléryl CoA

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

(18)

19

spiramycine I

néant spiramycine

(19)

20

spiramycine I

acétyl CoA

3-acétylspiramycine I (spiramycine II)

(22)

21

spiramycine I

propionyl CoA

3-propionylspiramycine I (spiramycine III)

(25)

22

spiramycine I

n-butyryl CoA

4"-n-butyrylspiramycine I

(20)

23

spiramycine I

isovaléryl CoA

4"-isovalérylspiramycine I

(21)

24

spiramycine I

acétyl CoA + n-butyryl CoA

3-acétyl-4"-n-butyrylspiramycine I

(23)

(4"-n-butyrylspiramycine II)

(24)

25

spiramycine I

acétyl CoA + isovaléryl CoA

3-acétyl-4"-isovalérylspiramycine I

(4"-isovaIérylspiramycine II)

26

spiramycine I

propionyl CoA + n-butyryl CoA

3 -propionyl-4"-n-butyrylspiramycine I

(26)

(4"-n-butyrylspiramycine III)

(27)

27

spiramycine I

propionyl CoA + isovaléryl CoA

3-propionyl-4"-isovalérylspiramycineI

(4"-isovalérylspiramycine III)

La réaction d'acylation des antibiotiques macrolides selon l'invention requiert la présence de trois composants principaux 4« et la mise en contact avec ces composants qui sont: une préparation active enzymatique pour ladite acylation sous la forme de cellules oa de préparation d'enzymes, les antibiotiques macrolides à 16 membres en tant que substrats, par exemple la tylosine, l'angolamycine ou la spiramycine, et un donneur 4s acylé. La mise en œuvre de l'invention est maintenant décrite en détail dans ce qui suit.

Des organismes possédant ladite activité d'acylation sont sélectionnés à partir de dépôts de cultures en stocks et d'isolants non cultivés, en testant ces organismes quant à leur so activité d'acylation. Des organismes possédant une forte activité d'acylation et utilisables de préférence dans l'invention appartenant au genre Streptomyces et les exemples de souches parmi les cultures déposées auprès de l'American Type Culture Collection, 12 301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland, ss U.S.A. sont:

Streptomyces thennotolerans ATCC 11416 (Décembre 1922)

Streptomyces fungicidius subsp. espinomycerus ATTC 21 574 60 (13 juillet 1970)

Streptomyces hygroscopicus ATCC 21582 (27 juillet 1970) Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454 (9 décembre 1969)

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Les variants et les mutants obtenus naturellement ou artificiellement à partir de l'organisme présentant ladite activité sont également utilisés dans l'invention. Par exemple, des mutants présentant l'activité d'acylation accrue peuvent être dérivés par des techniques couramment mises en œuvre pour la mutation et la sélection microbiennes.

Ces organismes dans l'invention sont cultivés en employant le procédé général mis en œuvre pour la culture de souches du genre Streptomyces, tout en prévoyant des conditions appropriées en vue d'obtenir une force d'acylation complète de ladite activité enzymatique. Le milieu de culture renferme de préférence des sources de carbone telles que glucose, maltose, sucrose, amidon ou sirop de malt, des alcools tels que l'éthanol et la gylcérine, des huiles, des graisses et des cires d'origine végétale ou animale, des acides organiques tels que l'acide acétique et l'acide citrique et les sels de ces derniers, d'autres composés du même genre jouant le rôle de sources de carbone étant également utilisables. Ces composés sont utilisés seuls ou en combinaison de deux ou plus, à des concentrations de 0,5-10 g/dl en général et, de préférence, de 2-6 g/dl, en fonction du type de composé. Les sources d'azote utilisées de préférence sont des composés organiques riches en protéines, d'origine animale, végétale ou microbienne tels que la caséine, la peptone, les produits farineux préparés à partir du soja, du blé, du coton, des graines et les préparations de levures ou de bactéries, ainsi que des composés inorganiques variés utilisés couramment comme sources d'azote, tels que les sels d'ammonium. D'autres composés riches en azote et pouvant être assimilés par les organismes sont également utilisables. Ces sources d'azote sont utilisées seules ou en combinaison de deux ou plus dans le milieu, à des concentrations de 0,1-10 g/dl. Avec des produits organiques, la concentration préférée est de 1— 6 g/dl, et avec des composés inorganiques, cette concentration

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est plus faible. Le milieu renferme également des sels inorganiques tels que des phosphates, des sels de magnésium, des sels minéraux et des substances favorisant la croissance telles que les extraits de levures, les extraits de viandes, les vitamines et les produits riches en vitamines. Ces produits sont utilisés à des concentrations de 0,01-0,5 g/dl, en fonction du type d'organisme et de la composition du milieu employé. La culture des organismes est effectuée en milieu aérobie, par aération et agitation. Le pH du milieu est maintenu dans la gamme de 4,5-9,0, de préférence, de 6,0-8,0.

La température de culture est maintenue à 20-45°C, la température préférée étant de 20-35°C avec les souches de Streptomyces en général, et de 30-40°C avec le Streptomyces thermotolerans. L'activité d'acylation des macrolides à 16 membres, par les organismes, selon l'invention, est produite à la première phase de croissance et est maintenue lorsque la croissance a cessé. On relève une activité spécifique particulièrement élevée pour l'acylation du groupe 3-hydroxyle, dans des cellules, de la phase initiale à la dernière phase de croissance, cependant que l'activité d'acylation du groupe 4"-hydroxyle est relevée à partir de la dernière phase de croissance au stade de post-croissance.

Comme on le voit aux essais 1-4, la réaction d'acylation peut être effectuée avec des cellules dans des conditions associées à la croissance ou au repos, soit dans un milieu cultivé, soit après séparation du milieu ou avec des formes variées de préparations enzymatiques, par exemple des cellules séchées, des homogénats de cellules, et une solution surnageante obtenue à partir des homogénats et des préparations enzymatiques. Des préparations enzymatiques immobilisées, telles que celles fixées dans les polymères d'acrylamide sont également utilisables. Il ressort des études relatives à la nature de l'acylation, que deux systèmes enzymatiques sont inclus de façon indépendante dans la réaction d'acylation. Ces systèmes sont la 3-acyl macrolide transferase et la 4"-acyl macrolide transferase, ainsi désignés par les présents inverteurs, du fait du transfert des groupes acylés vers les groupes, respectivement, 3-hydroxyle et 4"-hydroxyle, des macrolides à 16 membres. Ces systèmes enzymatiques catalysent ledit transfert d'une façon non spécifique, suivant le type de groupe acyle; ils présentent cependant des préférences respectives pour chaque groupe acyle, de sorte que la macrolide 3-acyl transferase transfert de préférence, dans l'ordre, le groupe acétyle, le groupe propionyle et le groupe n-butyryle, tandis que la macrolide 4"-acyl transferase préfère le groupe isovaléryle, le groupe n-butyryle et le groupe propionyle, dans l'ordre.

Le donneur acyle utilisé dans la réaction d'acylation de l'invention comprend l'acyl CoA qui sert de donneur direct du groupe acyle à incorporer, et les composés précurseurs d'un tel acyl CoA à partir duquel l'acyl CoA respectif est produit dans la cellule par métabolisme cellulaire. L'acyl CoA utilisé de préférence comprend l'acétyl CoA, le propionyl CoA, le n-butyryl CoA et l'isovaléryl CoA, et leurs composés précurseurs comprennent des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide n-butyrique et l'acide isovalérique et les sels de ces acides, par exemple les sels de potassium, de sodium, d'ammonium etc., ainsi que les esters de ces acides tels que le méthanol, l'éthanol etc. et les amides de ces acides. Sont également inclus les aminoacides tels que l'acide a-amino-butyrique, la norvaline, la L-leucine et les acides cétones tels que l'acide a-cétobutyrique et l'acide a-cétovalérylique.

En général, les acyl CoA sont ajoutés au milieu réactionnel lorsque la réaction est effectuée avec un système enzymatique présentant une faible aptitude à former le CoA acyl respectif à partir du CoA et des précurseurs acylés. Toutefois, des composés précurseurs acylés sont utilisés lorsque le système de régénération de l'acyl CoA concerné est totalement en activité, par exemple dans des conditions de croissance des cellules ou des conditions analogues.

La quantité de donneur acyle ajoutée au mélange réactionnel est habituellement équivalente ou voisine du rapport moléculaire du substrat antibiotique dans le cas de l'acyl CoA, ou dans un rapport moléculaire plus élevé, par exemple dans un rapport de 3-10 moles, dans le cas des composés précurseurs. Des cellules vivantes peuvent fournir de l'acétyl CoA à partir de sources de carbone par leur cycle métabolique, de sorte que si une quantité suffisante de source de carbone est présente dans la réaction utilisant les cellules soit en bouillon de culture, soit sous forme de suspensions de cellules, l'acétylation se fait habituellement par utilisation d'acétyl CoA formé par voie endogène. De la même façon, dans un tel système réactionnel, le propionyl CoA et d'autres CoA sont produits en quantité bien plus faible que l'acétyl CoA, ime petite quantité de tels produits acylés étant relevée dans le mélange ayant réagi. Dans le cas où les acyl CoA sont utilisés dans la réaction, une fois la réaction terminée, le CoA peut être récupéré du milieu réactionnel par des méthodes couramment utilisées pour l'isolement du CoA et peut être réutilisé dans la synthèse de l'acyl CoA.

Les substrats antibiotiques pour ladite acylation sont ajoutés au mélange réactionnel par exemple sous forme d'une solution dans l'eau, dans des fluides aqueux légèrement acidifiés, dans des solvants exerçant un effet légèrement contraire sur la réaction, par exemple le méthanol et l'éthanol ou sous la forme de mélanges de solvants aqueux, de suspensions, de bouillies ou de poudres fines. La concentration des composés antibiotiques utilisés dans le mélange réactionnel est de 0,1-50 g/litre, et de préférence 0,5-30 g/'litre. Les antibiotiques utilisables dans l'invention sont ceux présentant une structure macrolide à 16 membres et deux composés sucrés reliés en position 5 du noyau macrolide, par exemple les leucomycines, maridomyci-nes, spiramycines, l'angolamycine, la tylosine, la carbomycine A et la carbomycine B, dans lesquels au moins un groupe en position 3 et 4" est un hydroxyle naturel ou un hydroxyle obtenu par des méthodes chimiques ou biochimiques.

Les conditions chimiques et physiques de la réaction d'acylation sont pratiquement identiques aux conditions favorables à la culture des cellules pour chaque organisme intervenant dans les réactions enzymatiques appropriées à de telles cellules particulières. La température de réaction est de 25-43°C, de préférence 28-40°C, et le pH est maintenu dans la gamme de 5,0-8,5 de préférence 5,5-8,0 pour l'acylation en position 3 et 6,5-8,5 pour l'acylation en position A". L'utilisation d'une solution tampon appropriée est avantageuse pour maintenir le pH à la valeur voulue dans le cas des réactions de non croissance des cellules. Les solutions tampons couramment utilisées pour les réactions enzymatiques en général telles que la solution tampon au phosphate, la solution tampon au citrate peuvent être employées; cependant l'utilisation de la solution tampon d'acétate ou de sel renfermant un groupe acétyle dans sa composition sera uniquement limitée aux réactions d'acéty-lation. La durée de la réaction est habituellement de 30 minutes à 10 heures.

La description qui suit illustre plus en détail certains modes avantageux d'acylation destinés à produire, à titre d'exemples, les dérivés de la tylosine selon l'invention.

(1) 4"-n-butyryltylosine

Les organismes précités sont cultivés dans un milieu renfermant des concentrations réduites de sources de carbone et d'azote, et lorsque les sources de carbone sont presque complètement épuisées, la tylosine est ajoutée au bouillon en une quantité dépassant la capacité d'activité d'acylation de la position 3 dans les cellules, en même temps que le n-butyryl CoA ou ses précurseurs.

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La réaction est effectuée pratiquement dans les mêmes conditions que dans la culture des cellules. Une partie du substrat ajouté est acétylée pour former la 3-acétyltylosine tandis que l'autre partie demeure non acétylée. Entre temps, la butyrylation parallèle du groupe 4//-hydroxyle se produit, conduisant à la formation de 4//-n-butyryltylosine et une petite quantité de 3-acétyl-4"-n-buryryltylosine à partir de laquelle le premier produit est isolé.

(2) 4//-isovaléryltylosine

Dans une réaction d'acylation conduite d'une manière similaire à (1), l'utilisation d'isovaléryl CoA ou de ses précurseurs en tant que donneur acyle provoque la formation de 4//-isova-léryltylosine dans le fluide réactionnel.

(3) 3-acétyltylosine

Pour la production de la 3-acétyltylosine, l'organisme par exemple le Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416 est cultivé dans un milieu renfermant une quantité importante de sources de carbone et d'azote. Lorsque la croissance maximale est atteinte et que les sources de carbone demeurent en quantités importantes, la tylosine est ajoutée au milieu en une quantité limitée ne dépassant pas la capacité d'activité d'acétylation des cellules. Une vigoureuse agitation et aération étant maintenue dans le milieu réactionnel en même temps que la culture des cellules, l'acétylation s'effectue par utilisation de l'acétyl CoA reproduit dans les cellules, ce qui fournit la 3-acétyltylo-sine.

(4) 3-acétyl-4//-n-butyryltylosine i) Les organismes précités sont cultivés dans un milieu renfermant une quantité bien limitée d'une source de carbone et une quantité équilibrée d'une source d'azote jusqu'à ce que la concentration des sources de carbone décroisse au niveau inférieur, moment auquel la tylosine ou la 3-acétyltylosine est ajoutée en une quantité n'excédant pas la capacité d'acylation des cellules, en même temps que le n-butyryl CoA ou ses composés précurseurs tels qu'un groupe donneur n-butyryl. La réaction est effectuée jusqu'à ce que le substrat antibiotique soit entièrement acylé et le produit acylé, 3-acétyl-4"-n-buty-ryltylosine, est isolé.

ii) En utilisant la 4"-butyryltylosine comme substrat, la réaction est effectuée pratiquement de la même manière qu'en (3) pour la production de la 3-acétyltylosine, ce qui entrane l'acétylation dans le groupe 3-hydroxyle, c'est-à-dire la formation de 3-acétyl-4"-n-butyryltylosine.

(5) 3-acétyl-4//-isovaléryltylosine

Pour la production de la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, on met en œuvre pratiquement les mêmes méthodes que dans (4) i) et ii), dans lesquelles l'isovaléryl CoA ou ses composés précurseurs sont utilisés comme donneur acyle en i) et la 4"-isovaléryltylosine est utilisée comme substrat en ii).

(6) 3-propionyltylosine

Pour la production de la 3-propionyltylosine, les organismes précités sont cultivés dans un milieu renfermant une quantité limitée d'une source de carbone et une quantité importante d'une source d'azote. Lorsque les sources de carbone sont presque complètement utilisées, le substrat de tylosine est ajouté au bouillon de culture en une quantité n'excédant pas la capacité de propionylation des cellules, en même temps que les donneurs de propionylation, c'est-à-dire le propionyl CoA ou ses précurseurs. La réaction est conduite jusqu'à propionylation complète.

(7) 3 -propionyl-4"-n-butyryltylosine

La 3-propionyl-4//-n-butyryltylosine peut être préparée en deux étapes. En premier lieu, la 3-propionyltylosine est préparée à partir de la tylosine par la méthode décrite en (6).

Lorsque la première réaction est presque complète, un donneur n-butyryl, c'est-à-dire un n-butyryl CoA ou son précurseur, et une petite quantité d'une source de carbone, si nécessaire, sont ajoutés au milieu et la réaction aérobie est effectuée. On obtient ainsi la 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine.

Bien entendu, ce composé peut être également obtenu en une étape par addition de 3-propionyltylosine comme substrat, au mélange de cellules cultivées, en même temps que les donneurs acylés.

(8) 3-propionyl-4//-isovaléryltylosine

D'une manière similaire à (7), l'utilisation d'un donneur isovaléryl, c'est-à-dire l'isovaléryl CoA, ou son composé précurseur, à la place d'un donneur n-butyryl, conduit à la formation de la 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine.

Les composés acylés préparés à partir des macrolides à 16 membres, conformément à l'invention, peuvent être isolés, purifiés et formulés en appliquant les méthodes généralement employées dans la fabrication de chaque antibiotique macrolide à 16 membres.

Pour l'isolement des dérivés de la tylosine, le mélange réactionnel, après avoir été légèrement acidifié si nécessaire, est séparé des cellules et d'autres particules insolubles, par des méthodes telles que filtration et centrifugation. La solution clarifiée est ensuite ajustée à un pH neutre à légèrement alcalin, puis extraite avec des solvants non miscibles à l'eau, par exemple l'acétate d'éthyl, le toluène et le benzène, lesquels sont couramment utilisés pour l'extraction des antibiotiques macrolides. Pour l'élimination ultérieure des impuretés provenant du mélange réactionnel, l'extrait est mélangé avec de l'eau acidifiée ou avec une solution tampon, de manière à transférer les dérivés de la tylosine dans une couche aqueuse sur laquelle on répète l'extraction précédente avec lesdits solvants.

Des séries de dérivés de la tylosine présents dans l'extrait sont séparées par des méthodes variées de différenciation pour les antibiotiques macrolides. Dans le cas où les coefficients de partage pour l'eau et les solvants organiques diffèrent nettement, on a recours à des méthodes telles que l'extraction par contre-courant et la séparation par extraction. D'autre part, dans des cas limites des coefficients de partage, des méthodes chromatographiques utilisant le gel de silice, les résines échan-geuses d'ions, etc... sont appliqués en étant choisies en fonction du type de dérivés contenus dans les produits.

Les dérivés de la tylosine sont obtenus sous forme solide par concentration habituelle à sec d'une solution antibiotique ou par cristallisation. En vue de cristalliser les dérivés sous une forme très pure, la préparation brute est dissoute dans des solvants organiques tels que l'acétone et le méthanol, puis la solution obtenue est ajoutée progressivement à un liquide tel que l'eau et le n-hexane dans lequel les dérivés sont difficilement solubles. La cristallisation est également possible en utilisant des solvants tels que l'éther éthylique et un mélange d'éther éthylique et d'isopropionyl éther présentant une faible solubilité vis-à-vis desdits dérivés.

Les dérivés de l'angolamycine, de la spiramycine et d'autres antibiotiques obtenus d'une manière similaire sont également isolés et purifiés en utilisant des méthodes identiques à celles employées pour les dérivés de la tylosine. Pour la cristallisation des dérivés, on peut également utiliser des solvants tels que le toluène, le benzène et l'acétate d'éthyl.

Huit dérivés de la tylosine développés par l'invention, à savoir, la 3-acétyltylosine, la 3-acétyl-4//-n-butyryltylosine, la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine, la s

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3-propionyltylosine, la 3 -propionyl-4"-n-butyryl tylosine, la 3-propionyl-4"-isovaléryltylosine, la 4"-n-butyryltylosine et la 4"-isovaléryltylosine, s'avèrent être de nouveaux composés, comme le montrent les résultats des études de leurs propriétés physico-chimiques, de leurs structures chimiques etc... Les analyses et déterminations physico-chimiques comprennent l'analyse élémentaire, le point de fusion, le pouvoir rotatoire spécifique, le spectre ultra-violet, le spectre infra-rouge, la résonance nucléaire magnétique

(NMR), C13-NMR, le spectre de masse (ionisation chimique), la formation d'acides organiques en condition alcaline (détection par Chromatographie gazeuse), la solubilité dans les solvants, les réactions coloristiques, la basicité des composés, l'aspect et la forme cristalline. Le poids moléculaire est obtenue en tant que QM+ (ion quasi moléculaire) par analyse au spectrographe de masse avec ionisation chimique. Les résultats sont représentés au tableau 2 et aux fig. 1-23.

Tableau 2

Propriétés physico-chimiques des dérivés de la tylosine

Analyses

Composés 3-acétyltylosine

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyl-4"-isovaléiyltylosine

3-propionyltylosine

(1) Aspect

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

(3) Poids moléculaire Spectroscopie de masse

(4) Point de fusion

(5) Pouvoir rotatoire spécifique

Md (1%) C = solution de méthanol

(6) Spectre d'absorption ultraviolet

E1%

lem

Poudre cristalline blanche

C: 60,25 (60,17) C: 60,70 (60,75)

H: 8,27 (8,31) O: 29,98 (30,06) N: 1,50 (1,46)

958

214-219°C -33,9

^e°H 282 nm

H: 8,39 (8,33) O: 29,51 (29,56) N: 1,40 (1,36)

1028

177—181°C -31,1

X EtOH 000

max 282 nm

C: 61,05 (61,08) H: 8,33 (8,41) O: 29,23 (29,17) N: 1,39 (1,34)

1042

180-184°C -34,3

X EtOH o Qo max «öä

nm

235

240

222

Figure 2

Propriétés physico-chimiques des dérivés de la tylosine

C: 60,45 (60,54) H: 8,46 (8,40) O: 29,59 (29,62) N: 1,50 (1,44)

972

187—192°C -31,2

Xi EtOH ngl „ _ max 2o2 nm

236

Analyses

Composés

3-propionyl-4"-n-butyryltylosine

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

4"-n-butyryltylosine

(1) Aspect

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

(3) Poids moléculaire Spectroscopie de masse

(4) Point de fusion

(5) Pouvoir rotatoire spécifique)

Md (1%)

C = solution de méthanol

(6) Spectre d'absorption ultraviolet

H1 cm

Poudre cristalline blanche

C: 61,05 (61,08) C: 61,53 (61,40)

H: 8,37 (8,41) O: 29,25 (29,17) N: 1,33 (1,34)

1042

182-188°C -35,2

X,EtOH 282 nm max

210

H: 8,46(8,49) O: 28,70 (28,78) N: 1,31 (1,33)

1056

180—186°C -33,2

XEtOH 282 nm max

227

C: 61,03 (60,90) H: 8,55 (8,48) O: 28,94 (29,20) N: 1,48 (1,42)

986

147—151°C -53,4

XEtoH 285 nm max

2]L4 „ Figure 1

4"-isovaléryItyIosine

C: 61,33 (61,24) H: 8,65 (8,57) 0:28,56 (28,79) N: 1,46 (1,40)

1000

154—157°C -50,8

Xeioh 284 nm max

217

Analyses

Composés 3-acétyltylosine

3-acétyl-4"-butyryltylosine

3-acétyl-4"-isovaléiyltylosine

3-propionyltylosine

(7) Spectre d'absorption infrarouge

(boulette de KBr) (cm-1)

3440, 2865, 2710, 1667, 1443, 1295, 1159, 1078, 987,

2960,2920, 2835,2790, 1733,1716, 1620,1588, 1403,1360, 1265,1235, 1138,1123, 1043,1010, 953, 925,

893, 838,

3500-3440,2980, 2940,2890,2860 2800,2730,1750, 1675,1631,1597, 1456,1382,1376, 1360,1320,1305, 1280,1260,1244, 1174,1089,1057, 1020, 984, 968, 925, 902, 849,

3510-3440,2980, 2940,2885,2845, 2800,2720,1741, 1676,1632,1598, 1457,1418,1377, 1320,1303,1277, 1242,1172,1147, 1122,1088,1057, 1030,1000, 982, 921, 900, 842,

3460, 2880, 2730, 1680, 1459, 1374, 1327, 1281, 1145, 1087, 1018, 980, 901, 784

2980,2945, 2850,2800, 1744,1724, 1633,1601, 1417,1383, 1360,1345, 1319,1301, 1259,1168, 1133,1120, 1067,1053, 998, 988, 960, 934, 843, 810,

13

619267

Tableau 2 (suivant)

Propriétés physico-chimiques des dérivés de la tylosine

Analyses

Composés 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

4"-n-

butyryltylosine

4".

isovaléryltylosine

Fig. 3

(8) NMR (CDCls) 60 MHz Fig. 11

(9) acides organiques détectés par Chromatographie gazeuse acide acétique

(7) Spectre d'absorption infrarouge

(boulette de KBr) (cm-1)

(8) NMR (CDCls) 60 MHz

(9) acides organiques détectés par Chromatographie gazeuse

3435,2975,2940, 2885,2845,2795, 2730,1731,1670, 1626,1592,1450, 1404,1374,1318, 1270,1172,1086, 1055,1019, 980, 965, 923, 900, 843,

Fig. 7 Fig. 15

acide propionique et acide n-butyrique

Fig. 4 Fig. 12

acide acétique et acide-n-butyrique

3490-3440,2970, 2940,J2885,2845, 2795,2710,1735, 1670,1627,1595, 1450,1412,1372, 1318,1300,1171, 1148,1122,1087, 1058,1025,1005, 981, 921, 900, 843 Fig. 8 Fig. 16

acide propionique et acide isovalérique

Fig. 5 Fig. 13

acide acétique et acide isovalérique

2935, 2790, 1680, 1449, 1313, 1121, 1019, 923,

3490, 2970, 2880, 2840, 2715,1724, 1625,1588, 1406,1375, 1266,1170, 1083,1055, 980, 963, 905, 842

Fig. 9 Fig. 17

acide n-butyrique

Fig. 6 Fig. 14

acide propionique

3497,2965,2935, 2880, 2840, 2790, 2730,1740,1730, 1681,1629,1595, 1457,1412,1374, 1317,1299,1279, 1169,1145,1121, 1083,1055,1028, 1018,1000, 983, 964, 920, 900, Fig. 10 Fig. 18

acide isovalérique

Analyses

Composés 3-acétyltylosine

(10) Solubilité

(11) Tests de coloration

(12) Alcalinité

(13) Solvants utilisés pour la cristallisation

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

3-propionyltylosine soluble dans les alcools inférieurs par ex. l'éthanol; cétones, par ex. acétone; les éthers,

par ex. l'éther éthylique; les esters, par ex. l'acétate d'éthyl; le benzène et le toluène;

difficilement soluble dans le n-hexane et l'éther de pétrole:

soluble dans l'eau acidifiée:

peu soluble dans l'eau neutre:

difficilement soluble dans l'eau alcaline

Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (-), Millon (-), Sakaguchi (-), Beuret (-) Composés alcalins toluène

éther éthylique

Analyses

Composés 3-propionyl-4"-n-butyryltylosine

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

4"-n-

butyryltylosine

4"-isovaléryltylosine

(10) Solubilité

(11) Tests de coloration

(12) Alcalinité

(13) Solvants utilisés pour la cristallisation soluble dans les alcools inférieurs par ex. l'éthanol; cétones, par ex. acétone; les éthers,

par. ex. l'éther éthylique; les esters, par ex. l'acétate d'éthyl; le benzène et le toluène:

difficilement soluble dans le n-hexane et l'éther de pétrole:

soluble dans l'eau acidifiée:

peu soluble dans l'eau neutre:

difficilement soluble dans l'eau alcaline

Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (-), Millon (-), Sakaguchi (-), Beuret (-) Composés alcalins

éther éthylique éther éthylique éther isopropylique Ether isopropylique

éther éthylique éther éthylique

Le spectre ultra-violet présente de légères différences entre les huit composés, comme on le voit par exemple pour la 4"-n-butyryltylosine (Fig. 1) et la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine (Fig. 2). Les pics d'absorption maximale se situent entre 282-285 nm, de même pour la tylosine, ce qui est l'indice d'aucun 60 changement de structure dans la cétone et la structure à double liaison du noyau macrolide.

Par détection de l'acide organique formé par Chromatographie gazeuse et à partir des données analytiques pour le poids moléculaire, les composés s'avèrent présenter une structure de 6s base en commun: la tylosine portant une ou deux espèces de groupes d'acylation, à savoir, des restes acétyle, propionyle, n-butyryle et isovaléryle.

En outre, à partir des analyses des données pour les spectres IR et les spectres NMR, la structure des dérivés de la tylosine, prédemment indiquée dans la formule générale I, se trouve confirmée. Les résultats de la spectrométrie de masse avec ionisation chimique sont donnés pour la 3-acétyltylosine (Fig. 19) et la 3-propionyltylosine (Fig. 20), comme exemples de dérivés 3-acylés, et la 3-acétyl-4//-isovaléryltylosine (Fig. 21), comme exemples de dérivés acylés en 3 et 4". Des transferts sont faits pour chaque fragment dans la comparaison des données avec la tylosine, ce qui révèle la fragmentation en liaisons Cs-O.O-Ci" et

O-Ci'", la déshydratation et la désacylation à la fois dans la tylosine et les dérivés. Ainsi se trouve démontré que

619 267

14

le groupe acétyle et le groupe propionyle sont liés au noyau macrolide, et que le groupe isovaléryle est lié au noyau mycarose. Des résultats obtenus avec d'autres composés ne sont pas indiqués ici, mais permettent d'aboutir aux mêmes conclusions.

Les exemples de spectres CiaNMR sont illustrés avec la 3-acétyltylosine (Fig. 22) pour les dérivés acylés, et avec la 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine (Fig. 23) pour les dérivés acylés en 3 et 4" (25.2MHz). Comme conséquence du transfert de signaux, comparativement à ceux de la tylosine, on en déduit par ailleurs que le groupe acétyle est lié en position 3 du noyau macrolide, et le groupe isovaléryle, en position 4" du mycarose. D'autres composés fournissent également des résultats similaires illustrant la position de la liaison pour le groupe propionyle et le groupe n-butyryle et des structures chimiquement identifiées.

D'autres comparaisons ont été faites entre les dérivés de l'invention et ceux obtenus chimiquement, par synthèse, selon l'état de la technique précédemment décrit. Dans le brevet japonais (Kokoku) Showa 36-22 649 «Method for producing tylosin», en se référant à l'exemple 4, il est décrit la synthèse chimique d'une tylosine acétyl ester par utilisation de chlorure d'acétyle. Il y a lieu de noter que la teneur du groupe acétyle est de 8,22% (en poids) et que le pk est d'environ 5,1 (détermination électrométrique avec la solution dans le diméthyl-formamide - H2O = 2:1 en volume). Dans l'exemple 5 du même brevet, on décrit également la synthèse de la tylosine acétylée par utilisation d'anhydride acétique comme agent acétylant; la teneur en acétyle étant de 8,91 (en poids) et le pk d'environ 5,2. La synthèse chimique de la tylosine acétylée a été en conséquence réalisée suivant les méthodes précitées et 5 la comparaison a été faite avec les composés correspondants conformes à l'invention, quant à leurs valeurs Rf, sur chroma-togramme à couche mince, en employant des plaques du type 5715 (Merck Co.®) avec développement au solvant acétate d'éthyl:éthanol:pyridine (85:15:2 en volume).

10

Conformément à ce qui précède, la 3-acétyltylosine obtenue selon l'invention fournit un Rf de 0,59, tandis que la tylosine acétylée de l'exemple 4 précité dudit brevet fournit 0,71, et le produit de l'exemple 5 du même brevet, 0,70,0,75 et 0,83, ce is qui est l'indice du mélange de trois composés. D'autres déterminations confirment également la différence existant entre la 3-acétyltylosine de l'invention et les produits chimiques précités. Comme dans l'exemple précité dudit brevet, la tylosine propionylée obtenue par synthèse chimique présente un point 20 de fusion de 101-111°C. Cette valeur se différencie nettement de la valeur 187—192° C obtenue pour la 3-propionyltylosine de l'invention.

Les résultats des analyses et des déterminations physico-25 chimiques des dérivés acylés de l'angolamycine et de la spiramycine fabriqués selon l'invention sont indiqués aux tableaux, respectivement 3 et 4.

Tableau 3—1

^Composés Analyses

3-acétylangolamycine

3-propionylangolamycine

3-acétyl-4"-n-butyryl-angolamycine

3-acétyl-4"-isovaléryl-angolamycine

(1) Aspect

Poudre cristalline blanche

Forme cristalline: aiguilles

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

C: 60,23 (60,17) H: 8,25 ( 8,31) O: 30,10 (30,06) N: 1,42 (1,46)

C: 60,48 (60,54) H: 8,47 (8,40) O: 29,64 (29,62) N: 1,41 (1,44)

C: 60,70 (60,75) H: 8,40-(8,33) O: 29,51 (29,56) N: 1,39 (1,36)

C: 61,15 (61,08) H: 8,35 (8,41) O: 29,19 (29,17) N: 1,31 (1,34)

(3) Poids moléculaire Spectroscopie de masse

958

972

1028

1042

(4) Point de fusion

217—222°C

208-215°C

171—176°C

169—175°C

(5) Spectre d'absorption ultraviolet

« MeOH n a r\

K max 240 nm e! cm 152 Fig. 24

, MeOH „

A, max 240 nm

El cm 153

« MeOH ~ . * A, max 240 TITTI

Elim 143

, MeOH„.~

A. max 240 nm El on 122 Fig. 25

(6) Spectre d'absorption infrarouge

(boulette de KBr) (cm-1)

3450, 2970,2930, 2880, 2835, 2785, 2730,1740,1728, 1695,1625,1455, 1413,1368,1347, 1304,1243,1164, 1122,1087,1050, 993, 973, 962, 935, 907, 856, 810, 785, 753, 719 Fig. 26

3450, 2975,2935, 2885,2840,2785, 2730,1740,1727, 1696,1627,1455, 1413,1384,1370, 1345,1302,1167, 1137,1124,1088, 1050, 999, 985, 975, 962, 937, 907, 856, 810, 786, 752, 715,

3500-3450,2975, 2945,2890, 2840, 2785,2730,1735, 1698,1625,1455, 1375,1308,1240, 1173,1127,1090, 1073,1055,1025, 992, 976, 930, 910, 850, 750, 715

3490,2975,2940, 2885, 2840, 2795, 2725,1735,1698, 1625,1456,1412, 1375,1304,1242, 1170,1127,1088, 1072,1052, 995, 978, 925, 913, 853, 753, 715

Fig. 27

(7) Spectres de résonance nucléaire magnétique

Fig. 28

Fig. 29

(8) acides organiques détectés par Chromatographie gazeuse acide acétique acide propionique acide acétique et acide n-butyrique acide acétique et acide isovalérique

(9) Solubilité soluble dans le toluène, le benzène, l'acétate d'éthyl, le méthanol et l'acétone;

peu soluble dans l'éther éthylique;

difficilement soluble dans le n-hexane et l'éther de pétrole;

soluble dans l'eau acidifiée;

seulement peu soluble dans l'eau neutre;

difficilement soluble dans l'eau alcaline

15 619267

Tableau 3—1 (suite)

~ Composés 3-acétylangolamycine 3-propionylangolamycine 3-acétyl-4"-n- 3-acétyl-4"-isovaléryl-

Analyses '——-— butyrylangolamycine angolamycine

(10) Tests de coloration Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (-), Beuret (-), Millon (—) et Sakaguchi (—)

(11) Alcalinité Composés alcalins

(12) Solvants utilisées pour la cristallisation acétate d'éthyl toluène ou benzène acétate d'éthyl ou benzène acétate d'éthyl ou benzène

Note: 1) Détection des acides organiques par Chromatographie gazeuse: les solutions sont préparées dans une solution 0,5 N KOH-éthanol, traitées à 70-75°C pendant 20 min et soumises à l'analyse.

2) Les cristaux obtenus à partir des solvants en (12) sont utilisés pour les tests en (1) - (11)

3) Les poids moléculaires sont obtenus en tant que QM+ par spectrographie de masse avec ionisation chimique en utilisant CH4 comme gaz réactif.

Tableau 3.-2

' ~——Composés Analyses

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

4"-n-butyryl-angolamycine

4"-isovalérylangolamycine

(1) Aspect

Poudre cristalline blanche

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

C: 61,23 (61,08) H: 8,33 (8,41) O: 29,06 (29,17) N: 1,38 (1,34)

C: 61,43 (61,40) H: 8,45 (8,49) 0:28,77 (28,78) N: 1,35 (1,33)

C: 60,48 (60,90) H: 8,50 (8,48) O: 29,26 (29,20) N: 1,40 (1,42)

C: 61,20 (61,24) H: 8,53 (8,57) 0:28,85 (28,79) N: 1,42 (1,40)

(3) Poids moléculaire Spectroscopie de masse

1042

1056

986

1000

' (4) Spectre d'absorption ultraviolet

. MeOH r\ A r\

Àmax 240 nm

240 nm

(5) acides organiques détectés par Chromatographie gazeuse acide propionique et acide n-butyrique acide propionique et acide isovalérique acide n-butyrique acide isovalérique

(6) Solubilité

soluble dans le toluène, le benzène, l'acétate d'éthyl, le méthanol et l'acétone; peu soluble dans l'éther éthylique;

difficilement soluble dans le n-hexane et l'éther de pétrole;

soluble dans l'eau acidifiée;

seulement peu soluble dans l'eau neutre;

difficilement soluble dans l'eau alcaline

(7) Tests de coloration

Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (—), biuret (—), Millon (—) et Sakaguchi (—)

(8) Alcalinité

Composés alcalins

(9) Solvants utilisées pour la cristallisation acétate d'éthyl ou benzène acétate d'éthyl ou benzène

éther éthylique

Tableau 4.—1

■—_ Composés Analyses '

4"-n-butyiyI-spiramycine I

4"-isovaIéryl-spiramycine I

4"-n-butyryl-spiramycine II

4"-isovaléryl-spiramycine II

(1) Aspect

Poudre blanche

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

C: 61,73 (61,82) H: 8,88 (8,83) O: 26,28 (26,28) N: 3,11 (3,07)

C: 62,13 (62,18) H: 8,95 (8,91) O: 25,92 (25,89) N: 3,00 (3,02)

C: 61,58 (61,61) H: 8,70 (8,65) O: 26,75 (26,81) N: 2,97 (2,93)

C: 62,00 (61,96) H: 8,72 (8,74) O: 26,35 (26,41) N: 2,93 (2,89)

(3) Poids moléculaire

(spectroscopie de masse)

913

927

955

969

(4) Spectre d'absorption ultraviolet

1%

El cm

-MeOH

Amax zdi nm

231 nm

Fig. 30

292

619 267

16

Tableau 4.—1

Analyses

Composés 4"-n-butyryl-spiramycine I

4"-isovaléiyl-spiramycine I

4"-n-butyiyl-spiramycinell

4"-isovaléiyl-spiramyrine II

(5) acides organiques détectés acide n-butyrique par Chromatographie gazeuse acide isovalérique acide acétique et acide n-butyrique acide acétique et acide isovalérique

(6) Solubilité

(7) Tests de coloration

(8) Alcalinité

(9) Solvant utilisé pour la cristallisation

(10) Spectre IR

(11) Spectre NMR

soluble dans méthanol, éthanol, acétone, toluène, benzène, acétate d'éthyl et éther; difficilement soluble dans n-hexane, cyclohexane et éther de pétrole

Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (—), biuret (—), Millon (-)

Composés alcalines

Cyclohexane

Fig. 31 Fig. 32

Tableau 4.-2

Analyses

Composés 4"-n-butyrylspiramycine III

4"-isovalérylspiramycine III

(1) Aspect

(2) Analyse élémentaire

(valeur calculée)

(%)

(3) Poids moléculaire (spectroscopie de masse)

(4) Spectre d'absorption ultraviolet El cm

Poudre blanche

C: 61,90 (61,96) H: 8,80 (8,74) O: 26,36 (26,41) N: 2,94 (2,89)

969

» MeOH« - >

/.max Zài nm

C: 62,26 (62,30) H: 8,30 (8,82) O: 26,10 (26,03) N: 2,84 (2,85)

983

MeOH*_1 Àmax zu nm

(5) acides organiques détectés par Chromatographie gazeuse

(6) Solubilité

acide propionique et acide n-butyrique acide propionique et acide isovalérique

(7) Tests de coloration

(8) Alcalinité

(9) Solvant utilisé pour la cristallisation soluble dans méthanol, éthanol, acétone, toluène, benzène et acétate d'éthyl, difficilement soluble dans n-hexane, cyclohexane et éther de pétrole

Molisch (+), acide sulfurique conc. (+), Ninhydrine (—), biuret (-), Millon (-)

Composés alcalins

Cyclohexane

Des exemples de spectres UV, de spectres IR et de spectres NMR sont illustrés aux Fig. 24 à 32 pour la 3-acétylangolamy-cine, la 3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine et la 3-acétyl-4//-isovalérylspiramycine I. En se basant sur des processus d'identification similaires pour les dérivés de la tylosine, les structures chimiques telles que représentées aux formules générales II et III sont confirmées pour les dérivés acylés de l'angolamycine et de la spiramycine selon l'invention.

Les spectres anti-microbiens des nouveaux dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine selon l'invention sont illustrés aux tableaux, respectivement, 5, 6 et 7, en indiquant les concentrations minimales inhibitrices (CMI, mcg/ ml). Ces composés possèdent un spectre antibactérien relative-60 ment large vis-à-vis des bactéries Gram positifs. La toxicité de ces composés a été testée sur des animaux et les valeurs LDso obtenues chez des souris par administration intraveineuse furent supérieures à 400 mg/kg pour tous les composés. Lors d'essais thérapeutiques sur les souris contaminées manuelle-6s ment par le Staphylococcus aureus Smith, les valeurs EDso furent inférieures à 50 mg/kg (p.o.) pour tous les dérivés antibiotiques précités.

L'un des avantages particuliers desdits dérivés de la tylosine

17

619 267

et de l'angolamycine par rapport aux antibiotiques macrolides bactéries résistant aux produits pharmaceutiques. Les résultats connus, est leur nette activité antimicrobienne vis-à-vis des de plusieurs de ces tests sont rassemblés aux tableaux 5, 6 et 7.

Tableau 5 Spectres antimicrobiens Concentrations minimales inhibitrices (mcg/ml)

composé 3-acétyl-

3-acétyl-4"-

3-propionyl-

souche-test .

tylosine n-butyryl-

isovaléryl-

tylosine

tylosine tylosine

(1) Candida albicans IAM 4905

>250

(2) Candida tropicalis IAM 4924

>250

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254

>250

(4) Esherichia coli (National Institute of Health)

250

125

250

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases)

>250

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P

0,25

0,49

0,25

(7) Staphylococcus aureus SMITH

0,12

0,25

0,49

0,12

(8) Bacillus cereus ATCC 9634

0,49

0,98

1,95

0,25

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938

0,25

0,49

< 0,12

(10) Sarcina lutea ATCC 9341

< 0,12

0,25

< 0,12

Composé

souche-test

3-propionyl-4"-n-butyryl-tylosine

(1) Candida albicans IAM 4905

(2) Candida tropicalis IAM 4924

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254

(4) Esherichia coli (National Institute of Health)

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases)

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P

(7) Staphylococcus aureus SMITH

(8) Bacillus cereus ATCC 9634

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938 (10) Sarcina lutea ATCC 9341

>250 >250 >250 250 >250 0,98 0,25 1,95 0,49 < 0,12

3-propionyl-4"-isovaléryl-tylosine

4"-n-butyryl-tylosine

>250 >250 >250 250 >250 0,49 1,95 0,98 0,49 0,25

>250 >250 >250 125 >250 0,25 0,25 0,98 0,49 0,25

4"-isovaléryl-tylosine

>250 >250 >250 125 >250 0,49 0,25 0,98 0,98 < 0,12

>250 >250 >250 250 >250 0,49 0,25 0,49 0,25 0,12

Composé 3-acétyl-

3-acétyl-4"-

3-propionyl souche-test ~

tylosine n-butyryl-

isovaléryl-

tylosine

tylosine tylosine

(11) Micrococcus flavus I

< 0,12

0,25

< 0,12

(12) Corynebacterium bovis 1810

0,25

0,50

0,25

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

7,81

1,95

3,91

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

0,49

0,98

0,25

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610

>250

250

62,5

>250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710

250

15,6

62,5

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771

125

15,6

3,91

62,5

Note: * Souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

souche-test .

Composé 3-propionyl-4"-n-butyryl- tylosine

3-propionyl-4"-isovaléryl-tylosine

4"-n-butyiyl-tylosine

4"-isovaléryl- tylo-tylosine sine

(11) Micrococcus flavus I

0,25

0,49

0,25

0,12

(12) Corynebacterium bovis 1810

0,50

1,00

0,98

0,50

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

3,91

7,81

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

0,49

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610

250

62,5

>250

62,5

>250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710

31,3

15,6

62,5

15,6

>250

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771

15,6

3,91

15,6

7,80

250

Note: * Souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

619 267

18

Tableau 6 Spectres antimicrobiens Concentrations minimales inhibitrices (mcg/ml)

' Composé 3-acétyl- 3-acétyl-4"- 3-acétyl-4"- 3-propionyl-

souche-test " ■ angolamycine n-butyryl- isovaléryl- angolamycine angolamycine angolamycine

(1) Candida albicans IAM 4905

>250

(2) Candida tropicalis IAM 4924

>250

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254

>250

(4) Esherichia coli (National Institute of Health)

>250

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases)

>250

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P

1,95

0,98

0,63

0,98

(7) Staphylococcus aureus SMITH

1,95

0,98

0,63

0,98

(8) Bacillus cereus ATCC 9634

1,95

0,98

1,25

0,98

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938

0,98

0,49

0,63

0,49

(10) Sarcina lutea ATCC 9341

0,98

0,49

0,63

0,49

composé

3-propionyl-4"-

3-propionyl-

4"-n-butyryl-

4"-isovaléryl-

angola souche-test —

n-butyryl-

4"-isovaIéryl-

angolamycine angolamycine mycine

angolamycine angolamycine

(1) Candida albicans IAM 4905

>250

(2) Candida tropicalis IAM 4924

>250

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254

>250

(4) Esherichia coli (National Institute of Health)

>250

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases)

>250

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P

0,63

0,98

(7) Staphylococcus aureus SMITH

0,98

1,95

0,49

0,98

0,49

(8) Bacillus cereus ATCC 9634

0,98

1,95

0,98

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938

0,49

(10) Sarcina lutea ATCC 9341

0,25

composé 3-acétyI-

3-acétyI-4"-

3-acétyi-4"-

3-propionyl-

souche-test

angolamycine n-butyryl-

isovaléryl-

angolamycine

angolamycine angolamycine

(11) Micrococcus flavus I

0,98

0,63

0,49

(12) Corynebacterium bovis 1810

3,91

1,95

0,31

0,98

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

1,95

0,98

3,91

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

1,95

0,98

0,63

0,49

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610

>250

250

62,5

>250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710

>250

31,5

>250

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771

>250

15,6

7,8

250

Note: * souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

composé 3-propionyl-4"-

3-propionyl-

4"-n-butyryl-

4"-isovaléryl-

angola sondie-test n-butyryl-

4"-isovaléiyl-

angolamycine angolamycine mycine

— -- angolamycine angolamycine

(11) Micrococcus flavus I

0,25

0,49

0,25

(12) Corynebacterium bovis 1810

0,49

0,98

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

1,95

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

0,49

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610

250

62,5

250

62,5

250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710

31,5

15,6

31,5

15,6

250

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771

15,6

7,8

15,6

7,8

125

Note: * souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

19 619 267

Tableau 7 Spectres antimicrobiens Concentrations minimales inhibitrices (mcg/ml)

• composé spiramycine II 4"-n-butyryl- 4"-isovaléryl- spira-

souche-test ' spiramycine II spiramycine II mycinelll

(1) Candida albicans IAM 4905 >250 >250 >250 >250

(2) Candida tropicalis IAM 4924 >250 >250 >250 >250

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254 >250 >250 >250 >250

(4) Esherichia coli (National Institute of Health) 250 250 250 250

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases) >250 >250 >250 >250

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P 0,98 0,98 0,98 0,98

(7) Staphylococcus aureus SMITH 0,49 0,98 0,49 0,49

(8) Bacillus cereus ATCC 9634 3,91 3,91 3,91 3,91

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938 1,95 1,95 1,95 1,95

(10) Sarcina lutea ATCC 9341 0^49 M9 M9 0,25

composé

4"-n-butyryI-

4"-isovaléryl-

4"-n-butyiyl-

4"-isovaléryl-

spira souche-test

spiramycine III

spiramycine I

mycine

(1) Candida albicans IAM 4905

>250

(2) Candida tropicalis IAM 4924

>250

(3) Pseudomonas fluorescens NIHJB 254

>250

(4) Esherichia coli (National Institute of Health)

250

125

(5) Proteus morganii (The institute for Infectious Diseases)

>250

(6) Staphylococcus aureus FAD 209 P

0,98

(7) Staphylococcus aureus SMITH

0,98

0,49

0,25

(8) Bacillus cereus ATCC 9634

3,91

3,91'

3,91

(9) Bacillus megaterium NRRL B-938

1,95

(10) Sarcina lutea ATCC 9341

0,49

0,25

souche-test "

composé spiramycine II

4"-n-butyryl-spiramycine II

4"-isovaléryl-spiramycine II

spiramycine III

(11) Micrococcus flavus I

0,49

0,25

(12) Corynebacterium bovis 1810

0,49

0,98

0,49

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

0,98

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

1,95

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610

>250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710

>250

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771

>250

125

31,3

>250

Note: * souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

" composé 4"-n-butyryl- 4"-isovaléryl- 4"-n-butyryl- 4"-isovaléryl- spira-

souche-test spiramycine III spiramycine spiramycine I spiramycinel mycinel

(11) Micrococcus flavus I

0,49

0,25

(12) Coryne bacterium bovis 1810

0,98

(13) Mycobacterium smegmatis ATCC 607

0,98

(14) Bacillus subtilis ATCC 6633

1,95

(15) Staphylococcus aureus* MS 9610 >250 >250 >250 >250 >250

(16) Staphylococcus aureus* MS 8710 >250 >250 >250 >250 >250

(17) Streptococcus pyogenes* MH 771 125 31,3 125 31,3 >250

Note: * souche résistant aux produits pharmaceutiques (méthode par dilution)

Les souches désignées par (*) aux tableaux 5,6 et 7 sont les souches résistant aux produits pharmceuti-ques, isolées de malades, à savoir: le Staphylococcus aureus MS 9610, qui est résistant à l'angolamycine, la pénicilline, la tétracycline, Erythromycine, la leuco-

micine, la spiramycine, la josamycine et la tylosine;

6s le Staphylococcus aureus MS 8710, qui est résistant à l'angolamycine, la pénicilline, la tétracycline, l'éryth-romicine, la leucomycine et la tylosine; et le Streptococcus pyogenes MH 771, qui est résistant à l'angolamy-

619267

20

cine, I'érythromycine, l'oléandomycine, la leucomycine et la tylosine. Panni ces dérivés, ceux qui présentent un groupe 4"-acyle, à savoir, la 4"-n-butyryltylosine, la 4"-isovaléryltylosine, la 3-acétyl-4//-n-butyryl-tylosine, la 3-acétyl-4/'-isovaléryltylosine, la 3-pro-pionyl-4//-n-butyryltylosine, la 3-propionyl-4"-iso-valéryltylosine, la 4"-n-butyryl-angolamycine, la 4"-isovalérylangolamycine, la 3-acétyl-4/,'-n-butyrylango-lamycine, la 3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine, la 3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine et la 3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine exercent une activité antimicrobienne particulièrement forte vis-à-vis d'une vaste gamme de souches résistant aux produits pharmaceutiques.

Au nombre d'autres avantages des dérivés de la tylosine et de l'angolamycine figurent leurs taux sanguins élevés chez les animaux. Si chacun de ces composés est administré par voie orale sur des souris à une dose de 100 mg/kg, la concentration dans le sang mesurée est de 5-20 mcg/ml, qui est une valeur sensiblement élevée comparativement à celle obtenue avec la tylosine et l'angolamycine (<1 mcg/ml). En particulier, les dérivés présentant des restes n-butyryle ou isovaléryle s'avèrent remarquables pour leur excellente absorption par administration orale. Leur concentration dans le sang une heure après administration atteint 15-20 mcg/ml. Ces avantages mettent en évidence l'utilité thérapeutique supérieure des composés selon l'invention.

Les dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine selon l'invention sont des composés basiques et forment des sels d'addition acides non toxiques avec des acides organiques variés tels que l'acide tartrique, l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide citrique et l'acide succinique, et avec des acides inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique. Ces sels sont formés, isolés, purifiés et formulés suivant les méthodes habituellement utilisées dans la formation des sels pour les antibiotiques macrolides à 16 membres. Par exemple, le dérivé antibiotique choisi et l'acide voulu sont dissous séparément dans un solvant approprié ayant une faible solubilité pour les sels, par exemple l'éther éthylique et l'acétone, ou le mélange de ces deux solvants, puis sont mélangés. La solution est concentrée si nécessaire puis refroidie, ce qui fournit les cristaux du sel d'addition acide, lesquels sont rassemblés et séchés pour donner une poudre cristalline blanche. Les sels formés présentent une solubilité dans l'eau plus élevée que les dérivés antibiotiques acylés correspondants et sont utilisés de préférence pour des applications thérapeutiques.

Comme exemples de tels sels d'addition acides, on mentionne le chlorhydrate de 3-acétyl-4-"-isovaléryl-tylosine ayant un point de fusion de 129-133°C, et le tartrate de 3-acétyl-4"-isovaléryltylosine de point de fusion.de 119-122°C.

Compte tenu de l'utilité particulière de la tylosine en tant qu'agent favorisant la croissance des animaux, les composés de la tylosine selon l'invention peuvent être utilisés comme additifs à des denrées fourragères pour l'élevage du bétail.

Les composés de l'invention peuvent être utilisés en mélange avec des excipients et des véhiculeurs courants c'est-à-dire des substances organiques ou inorganiques acceptables comme additifs à des denrées fourragères.

Des véhiculeurs appropriés pour les additifs comprennent, sans toutefois se limiter à ces produits: l'eau, les solutions salines, les alcools, les huiles végétales, les polyéthylène-gly-cols, la gélatine, le lactose, l'amylose, le stéarate de magnésium, le talc, l'acide silicique, les paraffines, les huiles parfumées, les acides gras, les monoglycérides, les diglycérides et l'hydroxyméthylcellulose. Les additifs peuvent être stérilisées et, si on le désire, mélangées avec des agents auxiliaires, par exemple, des lubrifiants, des antiputrides, des stabilisants, des mouillants, des émulsifiants, des tampons, des colorants et des condiments n'exerçant aucune réaction nuisible avec les composés actifs.

De préférence, l'administration se fait par voie orale, enté-rale et intramusculaire, par exemple sous la forme de comprimés, dragées, capsules, sirops et élixirs, sous la forme de solutions pour injection, ou sous la forme de mélanges d'additifs à des denrées alimentaires pour l'homme et les animaux, bétail, animaux domestiques, de laboratoire et volaille. Une dose quotidienne efficace des composés administrés oralement à l'homme est, de préférence, de 1 à 20 mg par kg de poids vif. La dose peut être administrée en une seule fois ou de façon répartie, en plusieurs fois.

Les exemples spécifiques suivants, sans aucun caractère limitatif, permettent d'illustrer l'invention.

Exemple 1

Fabrication de la 4"-butyryltylosine à partie de la tylosine

On prépare un milieu aqueux ayant la composition suivante:

2 g/dl de farine de soja, 2 g/dl de glucose, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 0,05 g/dl de K2HPO4 et 0,05 g/dl de MgS04.7H20 (pH 7,0). 100 ml de ce milieu dans un Erlenmeyer de 500 ml sont stérilisés à 120°C pendant 20 min. et inoculés à partir d'une culture oblique d'agar-agar de Streptomyces thermotole-rans ATCC 11 416, au moyen d'une boucle de platine. La culture est effectuée pendant une journée à 37°C sur un secou-eur rotatif. 15 litres du milieu additionnés d'un agent antimoussant à une concentration de 0,05 g/dl et stérilisés à 120°C pendant 15 min. dans une cuve de fermentation de 30 litres sont inoculés aseptiquement avec 100 ml des cultures ensemencées précités. La culture est effectuée à 37°C sous agitation vigoureuse et aération pendant environ une journée jusqu'à ce que la concentration de glucose dans le bouillon tombe en-dessous de 0,3 g/dl, moment auquel 60 g de tylosine et 15 g de DL-norvaline en tant que donneur du groupe n-butyryle sont mis en suspension dans un litre d'eau et versés dans le bouillon de culture. La réaction est poursuivie pendant environ 6 heures supplémentaires afin d'achever la transformation.

Le mélange réactionnel ainsi obtenu est ajusté à un pH de 3,5 par l'acide sulfurique dilué et séparé du mycelia par centrifugation en vue de fournir environ 16 litres y compris le rinçage du liquide surnageant. Le surnageant est ajusté à un pH de 6,0 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et extrait à 30°C avec 10 litres de benzène. La couche de benzène renfermant la 4"-n-butyryltylosine est séparée et extraite à 5°C avec 2 litres d'une solution-tampon de citrate d'un pH de 3,5. La couche aqueuse récupérée, après avoir été ajustée à un pH de 7,0 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium, est ajoutée à un litre d'acétate d'éthyle en vue de l'extraction, et le produit extrait au solvant est concentré et séché sous vide pour fournir environ 5 g d'un produit brun jaunâtre contenant la 4"-n-butyryltylosine. Ce produit est chargé sur une colonne de 60 cm de longueur et 2,1 cm de diamètre remplie de «Wako-gen C-200» (Wako Reagent Chemical Co.®) et élué avec un mélange de benzène:méthanol (97:3). Les éluats renfermant uniquement la 4//-n-butyryltylosine sont rassemblés et concentrés à sec sous vide. Ce produit est ensuite dissous dans un mélange d'éther éthylique et d'éther isopropylique (4:1) par chauffage et l'on laisse reposer la solution pour permettre à l'éther éthylique de s'évaporer progressivement en vue de réaliser la formation de cristaux. On obtient environ 1,5 g de cristaux blancs de 4//-n-butyryltylosine.

D'autre part, après extraction au benzène, la couche aqueuse est ajustée à un pH de 8,0 extraite avec 15 litres d'acétate d'éthyle à 30°C. Le produit extrait est mélangé avec s

10

15

20

25

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35

40

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50

55

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15 litres d'une solution-tampon de citrate d'un pH de 3,5 à 5°C, cependant que la couche aqueuse récupérée est ajustée à un pH de 8,0 par une solution diluée d'hydroxyde de sodium et extraite avec 10 litres de benzène à 30°C. Le produit extrait est concentré à un volume de 150 ml sous pression réduite puis laissé reposé à 7°C pour fournir des cristaux de 3-acétyltylosine. Après filtration et séchage, on obtient 25 g de cristaux blancs.

(point de fusion: 4"-n-butyryltylosine 149 ° C 3-acétyltylosine 216°C)

Exemple 2

Fabrication de la 4"-n-butyrylangolamycine à partir de l'angolamycine La réaction similaire de culture et l'extraction sont effectuées comme dans l'exemple 1, en remplaçant la tylosine par l'angolamycine comme substrat. On obtient environ 1,2 g de cristaux blancs de 4//-n-butyrylangolamycine et environ 21 g de cristaux blancs de 3-acétylangolamycine.

Exemple 3

Fabrication de la 4//-n-butyrylspiramycine I à partir de la spiramycine I La culture et la réaction sont effectuées comme dans l'exemple 1, en remplaçant la tylosine par la spiramycine I comme substrat. On obtient 0,9 g de cristaux blancs de 4"-n-butyryl-spiramycine I et 18 g d'une poudre blanche de 3-acétylspira-mycine I (spiramycine II).

Exemple 4 Fabrication de la 4"-isovaléryltylosine à partir de la tylosine La culture et la réaction sont effectuées comme dans l'exemple 1, en remplaçant la DL-norvaline par la L-leucine en tant que donneur isovaléryl. A partir de 60 g de tylosine et de 15 g de L-leucine, on obtient environ 900 mg de cristaux blancs de 4"-isovaléryltylosine et 17 g de cristaux blancs de 3-acétyltylo-sine.

(point de fusion: 4"-isovaléryltylosine 155 ° C 3-acétyltylosine 218° C)

Exemple 5

fabrication de la 4"-isovalérylangolamycine à partir de l'angolamycine La culture et la réaction sont effectuées comme dans l'exemple 4, en remplaçant la tylosine par l'angolamycine comme substrat. On obtient 1,1 g de cristaux blancs de 4"-isovaléryl angolamycine et environ 19 g de cristaux blancs de 3-acétylangolamycine.

Exemple 6

Fabrication de la 4//-isovalérylspiramycine I à partir de la spiramycine I La culture et la réaction sont effectuées comme dans l'exemple 4, en remplaçant la tylosine par la spiramycine I comme substrat. On obtient 0,8 g de cristaux blancs de 4//-isovaléryl-spiramycine I et environ 17 g d'une poudre blanche de 3-acétylspiramycine I.

Exemple 7

Acétylation d'un groupe hydroxy en position 3 et acylation d'un groupe hydroxy en position 4" Du Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416 en culture oblique d'agar-agar est inoculé au milieu ensemencé ayant la même composition que dans l'exemple 1 et cultivé à 370 C sur un secoueur rotatif. 15 litres d'un milieu renfermant 5 g/dl de glucose, 1 g/dl de farine de soja, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de K2HPO4, 0,1 g/dl de MgS04.7H20, 0,02 g/dl de MnS04.4-6H2O et 0,1 g/dl de CaC03 (pH 7,0), sont placés dans une cuve de fermentation (30 litres) et stérilisés. 150 ml de ladite culture ensemencée sont ajoutés et cultivés à 37°C dans des conditions d'aération et d'agitation. Après 24 heures, lorsque la concentration de glucose dans le milieu atteint 2 g/ di, 1 litre du bouillon est versé aseptiquement dans chacune des 9 cuves de fermentation de 2 litres. 2 g de tylosine sont ajoutés dans chacune des 3 cuves de fermentation, 2 g d'ango-lamycine sont ajoutés dans chacune des 3 cuves suivantes et 2 g de spiramycine I, dans chacune des 3 dernières cuves. La réaction est effectuée à 37°C dans des conditions d'aération et d'agitation. Après 3 heures la transformation des antibiotiques est examinée par Chromatographie à couche mince. Lorsqu'en-viron la moitié des antibiotiques ajoutés aux 9 cuves de fermentation est transformée, on obtient les composés correspondants présentant un groupe acétyle en position 3 du noyau macrolide. A ce moment, 1 g de chaque précurseur du groupe désiré acyle, c'est-à-dire de DL-norvaline et de L-leucine, est ajouté dans chacune des 3 cuves de fermentation dans un groupe et le pH est ajusté à la valeur 8,0. Aucun précurseur n'est ajouté aux 3 autres cuves de fermentation. La réaction est effectuée dans les mêmes conditions que précédemment décrit. Une fois la réaction terminée, chaque partie du mélange réactionnel est extraite à l'acétate d'éthyle et la proportion de substrat ajouté et de composés produits est examinée par Chromatographie sur couche mince. Les mélanges réactionnels obtenus sont enlevés, filtrés en milieu faiblement acide et les filtrats sont extraits avec 0,5 litre d'acétate d'éthyle en milieu faiblement alcalin à 30°C. La couche d'acétate d'éthyle est mélangée avec 1,5 litre d'eau légèrement acidifiée. La couche aqueuse récupérée est extraite avec 0,4 litre d'acétate d'éthyle à un pH de 7,5 et la couche d'acétate d'éthyle est concentrée et séchée de manière à obtenir 1,5-1,7 g d'une poudre brute blanc-jaunâtre. A partir de cette poudre, les produits principaux sont séparés et raffinés suivant les méthodes de purification de la n-butyryltylosine utilisées dans l'exemple 1, par Chromatographie sur colonne de gel de silice cependant que les poudres des dérivés de la tylosine sont dissoutes dans l'éther éthylique, celles des dérivés de l'angolamycine dans l'acétate d'éthyle, celles des dérivés de la spiramycine, dans le cyclohexane, en vue de la cristallisation, ce qui permet d'obtenir 0,5-0,8 g de cristaux blancs.

La corrélation entre les substrats, les précurseurs des CoA acylés et les produits est illustrée au Tableau 8.

Tableau 8

Corrélation entre les substrats, les précurseurs des CoA acylés et les produits substrats précurseurs des produits principaux

CoA acylés

tylosine

_

3-acétyltylosine tylosine

DL-norvaline

3-acétyl-4"-n-butyryl-

tylosine tylosine

L-leucine

3 -acétyl-4"-isovaléryl-

tylosine angolamycine

-

3-acétylangolamycine angolamycine

DL-norvaline

3 -acétyl-4"-n-butyryl-

angolamycine angolamycine

L-leucine

3 -acétyl-4"-isovaléryl-

angolamycine spiramycine I

-

spiramycine II

spiramycine I

DL-norvaline

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine I

L-leucine

4"-isovalérylspiramycine II

5

1«

15

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65

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Exemple 8 Acylation aux positions 3- et 4"

Une culture ensemencée ayant la même composition que dans l'exemple 1 est préparée en utilisant les mêmes microorganismes. 10 litres d'un milieu renfermant 2 g/dl d'amidon, 1 g/dl de peptone, 1 g/dl d'extrait de levure, 0,2 g/dl de K2HPO4, 0,02 g/dl de MgS04.7H20, 0,02 g/dl de MnSCU.4-6H2O et 0,1 g/dl de CaCCb (pH 7,0), sont placés dans une cuve de fermentation (d'un volume total de 20 litres) et stérilisés. 300 ml de la culture ensemencée sont inoculés et la culture est effectuée à 37°C dans des conditions d'aération et d'agitation. Après 30 heures, la croissance des micro-organismes atteint la phase stationnaire et, lorsque le glucose ajouté est presque complètement consommé (après 36 heures), 500 ml du bouillon sont versés aseptiquement dans chacune des 9 cuves de fermentation d'un litre de volume. La réaction est effectuée en ajoutant 500 mg de tylosine à chacune des 3 cuves de fermentation, 500 mg d'angolamycine à chacune des 3 cuves suivantes et 500 mg de spiramycine I à chacune des 3 dernières cuves, cependant qu'on ajoute 100 mg d'acide clamino butyrique dans chacune des 9 cuves de fermentation et la réaction est effectuée dans les mêmes conditions que pour la culture. Durant la réaction, le taux de transformation est examiné par intermittence par Chromatographie sur couche mince. Après 6 heures les substrats antibiotiques ajoutés sont presque complètement acylés en composés correspondants s ayant un groupe propionyle en position 3. A ce moment, on ajoute le glucose dans toutes les cuves à la concentration de 1 g/dl et l'on ajuste à 8,0 le pH du mélange réactionnel.

La réaction est poursuivie en ajoutant 2000 mg de DL-norvaline et de L-leucine dans chacune des 3 cuves de fermentation renfermant la tylosine. La troisième cuve est conservée comme témoin. La même méthode est appliquée au groupe de cuves de fermentation renfermant l'angolamycine et la spiramycine I. La réaction est poursuivie de ia manière précédem-ment décrite. Cette réaction est terminée après 48 heures de culture (c'est-à-dire 12 heures après l'addition d'antibiotiques).

Les produits principaux sont isolés des mélanges réaction-nels suivant des méthodes similaires à celles décrites dans 20 l'Exemple 7. On obtient à chaque fois 70-120 mg de produits sous forme de cristaux blancs, lesquels sont indiqués au tableau 9.

Tableau 9

Corrélation entre les substrats, les précurseurs des CoA acylés et les produits substrats précurseurs des CoA acylés

produits principaux

acylation du groupe hydroxyle acylation du groupe hydr

en position 3

oxyle en position 4"

tylosine .

acide a-aminobutyrique

—

3-propionyltylosine tylosine acide a-aminobutyrique

DL-norvaline

3-propionyl-4"-n-butyryltylosine tylosine acide a-aminobutyrique

L-leucine

3 -propionyl-4"-isovaléryltylosine angolamycine acide a-aminobutyrique

-

3-propionylangolamycine angolamycine acide a-aminobutyrique

DL-norvaline

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine angolamycine acide a-aminobutyrique

L-leucine

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine spiramycine I

acide a-aminobutyrique

-

spiramycine m spiramycine I

acide a-aminobutyrique

DL-norvaline

4"-n-butyrylspiramycine IH

spiramycine I

acide a-aminobutyrique

L-leucine

4"-isovalérylspiramycine III

Note:

Les dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine obtenus aux exemples 1-8 ont été analysés et les structures identifiées au spectre UV, au spectre IR, au spectre 45 NMR, au spectre de masse, ainsi que par détermination du point de fusion, du pouvoir rotatoire spécifique, par analyse élémentaire, Chromatographie gazeuse de la formation d'acide organique par hydrolyse alcaline etc... et, si nécessaire, les composés sont comparés et identifiés conjointement par déter- so mination du point de fusion et Chromatographie en couche mince.

Exemple 9

Les mêmes micro-organismes sont cultivés comme dans ss l'exemple 1, en utilisant les mêmes méthodes de culture, et 10

litres du bouillon de culture sont centrifugés pour rassembler les cellules, lesquelles sont mises en suspension dans 5 litres d'une solution tampon au phosphate (pH 7,0), 100 ml de ladite suspension dans la solution-tampon sont placés dans, respectivement, 46 flacons de 500 ml. 100 mcg/ml de substrats et 0,1 g/dl de précurseurs acylés, comme indiqué au tableau 10, sont ajoutés auxdits flaconi: et la réaction est effectuée pendant 12 heures à 37°C sous agitation. Les mélanges ayant réagi sont rendus faiblement alcalins et les produits sont extraits au benzène en vue d'être analysés par chormatogra-phie en couches minces. Les produits sont identifiés par comparaison avec d'authentiques dérivés de la tylosine, de l'angolamycine et de la spiramycine, en employant la technique de développement parallèle et de développement par double tache. La corrélation entre les substrats, les précurseurs acylés et les produits est illustrée au tableau 10.

substrats

Tableau 10—1

Corrélation entre les substrats, les précurseurs acylés et les produits précurseurs acylés produits tylosine tylosine

4"-n-butyryltylosine 4"-n-butyryltylosine 4"-isovaléryltylosine 4"-isovaléryltylosine acide a-cétoburyrique propionate de sodium acide a-cétobutyrique propionate de sodium acide a-cétobutyrique propionate de sodium

3-propionyltylosine

3-propionyl-4"-n-butyryltylosine

3-propionyl-4"-isovaIéryItylosine

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

23 619 267

Tableau 10-1 (suite)

Corrélation entre les substrats, les précurseurs acylés et les produits substrats précurseurs acylés produits

3-acétyltylosine acide a-céto-n-valérique

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyltylosine n-butyrate de sodium

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyltylosine n-butyrate d'éthyl

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyltylosine n-butyrylamide

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine tylosine acide isovalérique

4"-isovaléryltylosine tylosine isovalérate d'éthyl

4"-isovaléryltylosine tylosine isovalérylamide

4"-isovaléryltylosine

3-acétyltylosine acide isovalérique

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

3-acétyltylosine isovalérate d'éthyl

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

3-acétyltylosine isovalérylamide

3 -acétyl-4"-isovaléryltylosine

Tableau 10-2

—

Corrélation entre les substrats, les précurseurs acylés et les produits substrats précurseurs acylés produits angolamycine acide a-cétobutyrique

3 -propionylangolamycine angolamycine propionate de sodium

3 -propionylangolamycine

4"-n-butyrylangolamycine acide a-cétobutyrique

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

4"-n-butyrylangolamycine propionate de sodium

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

4"-isovalérylangolamycine acide a-cétobutyrique

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

4"-isovalérylangolamycine propionate de sodium

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

3-acétylangolamycine acide a-céto-n-valérique

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

3-acétylangolamycine acide n-butyrique

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

3-acétylangolamycine n-butyrate d'éthyl

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

3-acétylangolamycine n-butyrylamide

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine angolamycine acide isovalérique

4"-isovalérylangolamycine angolamycine isovalérate d'éthyl

4"-isovalérylangolamycine angolamycine isovalérylamide

4"-isovalérylangolamycine

3-acétylangolamycine acide isovalérique

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

3-acétylangolamycine isovalérate d'éthyl

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

3-acétylangolamycine isovalérylamide

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

Tableau 10-3

Corrélation entre les substrats, les précurseurs acylés et les produits substrats précurseurs acylés produits spiramycine I

acide a-cétobutyrique spiramycine III

spiramycine I

propionate de sodium spiramycine III

4"-n-butytylspiramycine I

acide a-cétobutyrique

4"-n-butyrylspiramycine III

4"-n-butyrylspiramycine I

propionate de sodium

4"-n-butyrylspiramycine III

4"-isovalérylspiramycine I

acide a-cétobutyrique

4"-isovalérylspiramycine III

4"-isovalérylspiramycine I

propionate de sodium

4"-isovalérylspiramycine III

spiramycine II

acide a-céto-n-valérique

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine II

acide n-butyrique

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine II

n-butyrate d'éthyl

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine II

n-butyrylamide

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine I

acide isovalérique

4"-isovalérylspiramycine I

spiramycine I

isovalérate d'éthyl

4"-isovalérylspiramycine I

spiramycine I

isovalérylamide

4"-isovalérylspiramycine I

spiramycine II

acide isovalérique

4"-isovalérylspiramycine II

spiramycine II

isovalérate d'éthyl

4"-isovalérylspiramycine II

spiramycine II

isovalérylamide

4"-isovalérylspiramycine II

Exemple 10 Après 30 heures, 1200 ml de bouillon (12 flacons) sont filtrés

On utilise comme micro-organismes le Streptomyces ther- pour rassembler les cellules vivantes, lesquelles sont mises en motolerans ATCC 11 416, le Streptomyces Fungicibus subsp. 60 suspension dans 1200 ml d'une solution-tampon de tris(hydr-

espinomuceticus ATCC 21 574, le Streptomyces hygroscopicus oxyméthyl) amino-méthane HCl (pH 7,2; M/10) et les cellules

ATCC 21 582 et le Streptomyces mycarofaciens sont broyées à la presse du type «presse française». 3 ml de

ATCC 21 454, et leurs culture et réaction sont effectuées de ladite solution-tampon contenant les cellules broyées sont manière similaire, excepté pour la température de culture, de placés dans les tubes-test de fermentation type L. A chaque la manière suivante: 65 tube de fermentation, on ajoute 40 mcg/ml d'antibiotiques

On emploie le même milieu que dans l'essai 1. Le Strepto- comme substrats, puis différentes sortes de CoA acylés qui myces thermotolerans ATCC 11 416 est cultivé à 37°C et sont indiqués au tableau 11, à leurs concentrations molaires d'autres souches sont cultivées à 28°C sur un secoueur rotatif. équivalentes. Les tubes de fermentation sont secoués lente

619 267

24

ment durant la réaction, pendant 1 heure. La réaction est avec les micro-organismes ci-dessus mentionnés.

achevée par addition d'une solution-tampon de glycine-NaOH. La corrélation entre les substrats, les acyl CoA et les pro-

Les produits sont extraits au benzène et identifiés de la même duits est illustrée au tableau 11.

manière que dans l'essai. Des résultats identiques sont obtenus

Tableau 11-1

Corrélation entre les substrats, les acyl CoA et les produits substrat acyl CoA

produits tylosine acétyl CoA

3-acétyltylosine tylosine propionyl CoA

principalement 3-propionyltyiosine tylosine n-butyryl CoA

principalement 4"-n-butyryltylosine tylosine isovaléryl CoA

4"-isovaléryltylosine

3-acétyltylosine acétyl CoA

pas de réaction

3-acétyltylosine n-butyryl CoA

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

3-acétyltylosine isovaléryl CoA

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

3-propionyltylosine n-butyryl CoA

3-propionyl-4"-n-butyryItylosine

3-propionyltylosine isovaléryl CoA

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

4"-n-butyryltylosine acétyl CoA

3-acétyl-4"-n-butyryltylosine

4"-n-butyryltylosine propionyl CoA

3-propionyI-4"-n-butyryltylosine

4"-isovaléryltylosine acétyl CoA

3-acétyl-4"-isovaléryltylosine

4"-isovaléryltylosine propionyl CoA

3-propionyl-4"-isovaléryltylosine

Tableau 11—2

Corrélation entre les substrats, les acyl CoA et les produits substrats acyl CoA

produits angolamycine acétyl CoA

3-acétylangolamycine angolamycine propionyl CoA

principalement 3-propionyl-angolamycine angolamycine n-butyryl CoA

principalement 4"-n-butyrylangolamycine angolamycine isovaléryl CoA

4"-isovalérylangolamycine

3-acétylangolamycine acétyl CoA

pas de réaction

3-acétylangolamycine n-butyryl CoA

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

3-acétylangolamycine isovaléryl CoA

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

3-propionylangolamycine n-butyryl CoA

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

3 -propionylangolamycine isovaléryl CoA

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

4"-n-butyrylangolamycine acétyl CoA

3-acétyl-4"-n-butyrylangolamycine

4"-n-butyrylangolamycine propionyl CoA

3-propionyl-4"-n-butyrylangolamycine

4"-isovalérylangolamycine acétyl CoA

3-acétyl-4"-isovalérylangolamycine

4"-isovalérylangolamycine propionyl CoA

3-propionyl-4"-isovalérylangolamycine

Tableau 11—3

produits spiramycine I

acétyl CoA

spiramycine II

spiramycine I

propionyl CoA

spiramycine III

spiramycine I

n-butyryl CoA

principalement 4"-n-butyrylspiramycine I

spiramycine I

isovaléryl CoA

4"-isovalérylspiramycine I

spiramycine II

acétyl CoA

pas de réactio spiramycine II

n-butyryl CoA

4"-n-butyrylspiramycine II

spiramycine II

isovaléryl CoA

4"-isovalérylspiramycine II

spiramycine III

n-butyryl CoA

4"-n-butyrylspiramycine III

spiramycine III

isovaléryl CoA

4"-isovalérylspiramycine IH

4"-n-butyrylspiramycine I

acétyl CoA

4-n-butyrylspiramycine II

4"-n-butyrylspiramycine I

propionyl CoA

4"-n-butyrylspiramycine in

4"-isovalérylspiramycine I

acétyl CoA

4"-isovalérylspiramycine II

4"-isovalérylspiramycine I

propionyl CoA

4"-isovalérylspiramycine IH

B

33 feuilles dessins

Claims

619 267 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de dérivés O-acylés d'antibiotiques macrolides à 16 membres et des sels d'addition acides de ces dérivés, caractérisé en ce qu'on effectue l'acylation d'au moins un groupe hydroxyle aux positions 3 et 4 d'un substrat antibiotique macrolide à 16 membres, au moyen d'un microorganisme du genre Streptomyces ou d'une préparation enzyma-tique de ce micro-organisme capable d'une telle acylation en présence de donneurs acyles en C2-C5 biochimiques.

1 ch2ch3 -0—ch2

dans laquelle Ri et R2 sont tous deux des hydrogènes, ou l'un d'eux est un hydrogène et l'autre est un groupe acyle en C2— Cs.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat antibiotique macrolide à 16 membres est la spiramy-cine ou ses dérivés ayant la formule générale (III):

3

619 267

H,C

w « ■ q Lr'2w>

HO CH

"3\ /ct''3 V J

H .—0 —

^0/v>CH

m ;

o-R,

dans laquelle Ri et R2 sont tous deux des hydrogènes, ou l'un d'eux est un hydrogène et l'autre est un groupe acyle en C2-Cs.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le micro-organisme du genre Streptomyces capable de l'acylation d'au moins un groupe hydroxyle en positions 3 et 4" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, est choisi dans le groupe comprenant le Streptomyces thermotolerans ATCC 11 416, le Streptomyces fungicidicus subsp. espinomy-ceticus ATCC 21 574, le Streptomyces mycarofaciens ATCC 21 454 et le Streptomyces hygroscopicus ATCC 21 582 et est utilisé en présence du donneur acylé en C2-C5.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'acylation est effectuée dans le bouillon de culture d'un micro-organisme du genre Streptomyces et capable de l'acylation d'au moins l'un des groupes hydroxyle en positions 3 et A" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, en présence d'au moins un donneur acyle choisi dans le groupe comprenant l'acétyl CoA, le propionyl CoA, le n-butyryl CoA, l'isovaléryl CoA et les précurseurs des CoA acylés.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'une quantité de sources de carbone et d'azote dans le milieu et une sorte de substrat sont ajustées en fonction des groupes acylés utilisés pour l'acylation des groupes hydroxyles aux positions 3 et 4" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'un micro-organisme est utilisé sous la forme d'une suspension de cellules dans un milieu liquide choisi dans le groupe comprenant l'eau, une solution-tampon et le filtrat de bouillon, en présence d'au moins un donneur acylé choisi dans le groupe comprenant l'acétyl CoA, le propionyl CoA, le n-butyryl CoA, l'isovaléryl CoA et les précurseurs des CoA acylés, ladite suspension étant préparée en cultivant un microorganisme du genre Streptomyces capable de l'acylation d'au moins un groupe hydroxyle en positions 3 et 4" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, en rassemblant les cellules ainsi produites et en les mettant en suspension dans ledit milieu liquide.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'acylation est effectuée par voie enzymatique en présence d'une préparation enzymatique d'un micro-organisme du genre Streptomyces capable de l'acylation d'au moins un groupe hydroxyle en positions 3 et 4" du substrat antibiotique macrolide et en présence d'au moins un donneur acyle choisi dans le groupe comprenant l'acétyl CoA, le propionyl CoA, le n-butyryl CoA et l'isovaléryl CoA.

25

35

40

45

50

60

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, 8 et 9, caractérisé en ce que le groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un hydrogène ou un groupe acyle, est acylé.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un hydrogène, est une acétylation.

12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un groupe n-butyryle, est une acétylation.

13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique à 16 membres, dans lequel R2 en position 4 est un groupe isovaléryle, est une acétylation.

14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un hydrogène, est une propionylation.

15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un groupe n-butyryle, est une propionylation.

16. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel R2 en position 4" est un groupe isovaléryle, est une propionylation.

17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, 8 et 9, caractérisé en ce que le groupe hydroxyle en position 4 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un hydrogène ou un groupe acyle, est acylé.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un hydrogène, est une n-butyrylation.

19. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un hydrogène, est une isovalérylation.

20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un groupe acétyle, est une n-butyrylation.

21. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4 du substrat

619 267

4

26. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres est une acétylation, et en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4" du substrat est une isovalérylation.

27. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres est une propionylation, et en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4" du substrat est une n-butyrylation.

28. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres est une propionylation, et en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position A" du substrat est une isovalérylation.

29. Utilisation du produit obtenu selon le procédé de la revendication 1 comme additif à des denrées fourragères favorisant la croissance des animaux.

30. Utilisation selon la revendication 29, des dérivés de la tylosine ayant la formule (I):

antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un groupe acétyle, est une isovalérylation.

22. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position A" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en posi- s tion 3 est un groupe propionyle, est une n-butyrylation.

23. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 4" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres, dans lequel Ri en position 3 est un groupe propionyle, est une isovalérylation. io

24. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, 8 et 9, caractérisé en ce que les groupes hydroxyles aux positions 3 et A" du substrat antibiotique macrolide à 16 membres sont acylés chacun avec des groupes acylés différents. JS

25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position 3 du substrat antibiotique macrolide à 16 membres est une acétylation, et en ce que l'acylation du groupe hydroxyle en position A" du substrat est une n-butyrylation. 20

5

619 267

dans laquelle Ri est H, un groupe acétyle ou propionyle, R2 est 32. Utilisation selon la revendication 29 des dérivés de la H, un groupe n-butyryle ou isovaléryle, en excluant le cas où spiramycine ayant la formule (III):

Ri et R2 sont tous deux H.

H,C CH.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le substrat antibiotique macrolide à 16 membres est la tylosine ou ses dérivés ayant la formule générale (I):

H,C CH,

V

ho

CH, CHgCIIO

\f3

0

(I)

dans laquelle Ri et Ri sont tous deux des hydrogènes, ou l'un 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le d'eux est un hydrogène et l'autre est un groupe acyle en Ci— substrat antibiotique macrolide à 16 membres est l'angolamy-

Cs. 35 cine ou ses dérivés ayant la formule générale (II):

HaC CH

hö ch ch3 ÇH5cko

— O— 3-

O^CH

(II)

3

H3Cx /CH3

î0 c Kj

\,

CH3 ci^cho

0-

0—J?2

CH3

m dans laquelle Ri est H, un groupe acétyle ou propionyle, R2 est un groupe n-butyryle ou isovaléryle.