DE2604697C2

DE2604697C2 -

Info

Publication number: DE2604697C2
Application number: DE2604697A
Authority: DE
Inventors: Ian Dunlop Chalfont St. Peter Buckinghamshire Gb Fleming; David Noble; Geb. Gillett Hazel Mary Marlow Buckinghamshire Gb Noble; Wilfred Frank High Wycombe Buckinghamshire Gb Wall
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1975-02-07
Filing date: 1976-02-06
Publication date: 1992-10-29
Also published as: SE7601337L; AU509313B2; CH624956A5; US4367175A; SE421796B; FR2368276B1; ES444948A1; IE43790L; DE2604697A1; JPS51101994A; DK141099B; US4490294A; YU40452B; IT1066098B; IT1059403B; AT353409B; FI760285A; DK49876A; YU29076A; AU1089176A

Description

Es ist bekannt, daß bei der Fermentierung von Streptomyces clavuligerus und insbesondere des Stammes NRRL 3585 eine Anzahl von antibiotischen Substanzen gebildet wird. Die britische Patentschrift 13 15 177 beschreibt die Kultivierung von Streptomyces clavuligerus, Stamm NRRL 3585, bis zur Herstellung einer wesentlichen Menge von zwei Antibiotika, die als Antibiotika A 16886 I und A 16886 II bezeichnet werden. Es wurde gemäß der DE-OS 25 17 316 außerdem gefunden, daß ein weiteres Antibiotikum aus diesem Organismus erhalten werden kann, nämlich (2R,5R,Z)-3-(2-Hydroxyäthyliden)-7-oxo-4-oxa-1-aza- bicyclo-[3,2,0]-heptan-2-carbonsäure der Formel I

die im folgenden als "Clavulansäure" bezeichnet wird.

Diese neue Säure kann auch Salze bilden, wie Alkalimetallsalze, z. B. Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze; Erdalkalimetallsalze, z. B. Calcium-, Magnesium- und Bariumsalze; Ammoniumsalze und Salze organischer Basen, beispielsweise Salze, die sich ableiten von primären, sekundären, tertiären, N-quaternären Aminen, z. B. mono-, di- oder tri-Alkylammoniumsalze, wie Methylammonium- und Triäthylammoniumsalze, und Salze heterocyclischer Basen, wie Piperidiniumsalze.

Die Salze anorganischer Basen und die meisten Salze der organischen Basen sind im allgemeinen in wäßriger Lösung stabiler als die freie Clavulansäure. Die Salze können in Form von Solvaten vorkommen, z. B. mit Wasser und/oder Kristallisationslösungsmittel.

Clavulansäure und ihre Salze wurden in einer Reinheit von mindestens 75% und im allgemeinen mindestens 85% erhalten, d. h. mit nicht über 25% und im allgemeinen nicht über 15%, bezogen auf das Gewicht, an Verunreinigungen und Isomeren, die von der Herstellung stammen.

Clavulansäure und ihre Salze können aus der Fermentationsbrühe, hergestellt durch Kultur eines Stammes von Streptomyces clavuligerus, z. B. des Stammes NRRL 3585, oder einer Motante davon gemäß dem britischen Patent 13 15 177 isoliert werden, wobei die Isolierung unter Anwendung von an sich bekannten Fraktioniertechniken zur Entfernung unerwünschter Komponenten aus der Brühe, wie Proteine und Enzyme und insbesondere anderer β- Lactamantibiotika, durchgeführt wird. Jedoch ist eine derartige Reinigung unter Anwendung üblicher Techniken schwierig, insbesondere aufgrund des ähnlichen Verhaltens der verschiedenen β-Lactamcarbonsäuren, wie die Antibiotika A 16886 I und II, die vorstehend erwähnt wurden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein zuverlässig und einfach durchzuführendes Reinigungsverfahren für Clavulansäure und ihre Salze zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß unter Ausnutzung der hierfür besonders günstigen Eigenschaften von Lithiumclavulanat gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von Clavulansäure der Formel I

und ihrer Salze, herstellbar durch Fermentieren von Streptomyces clavuligerus, Stamm NRRL 3585, bei einer Temperatur von 25 bis 30°C und einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 7,5 unter Bewegen und Belüften, Entfernen von Feststoffen aus der Fermentationsbrühe und gegebenenfalls Anreicherung der Clavulansäure und/oder ihrer Salze durch Absorption an Absorptions- bzw. Aktivkohle oder an einem Ionenaustauscherharz und anschließende Desorption bzw. Eluierung, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Säure und/oder das Salz bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8 mit einer wäßrigen Lösung einer ionischen Lithiumverbindung umsetzt und aus der dabei erhaltenen wäßrigen Lösung das Lithiumclavulanat durch Aussalzen oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in sehr hohen Konzentrationen ausfällt, den Niederschlag aus der wäßrigen Lösung abtrennt und das Lithiumclavulanat anschließend gegebenenfalls in ein anderes Salz der Clavulansäure oder in Clavulansäure umwandelt.

Auf diese Weise ist es möglich, nach den im folgenden beschriebenen Techniken Clavulansäuresalze mit hohem Reinheitsgrad zu erhalten, die im wesentlichen frei von Verunreinigungen und Isomeren von der Produktion sind und beispielsweise eine Reinheit von 98% oder darüber aufweisen, d. h. weniger als 2 Gew.-% an Verunreinigungen oder Isomeren von der Herstellung enthalten. Es wurden so Lithiumclavulanat und verschiedene andere Clavulanatsalze in kristalliner Form erhalten. Die Salze waren im wesentlichen rein, was ihre molaren Extinktionskoeffizienten, bestimmt bei 259±1 nm in 0,1 m wäßrigem Natriumhydroxid von mindestens 16 200 zeigten. Die molaren Drehungen, [M]-Werte in wäßriger Lösung, betrugen mindestens +137°±5°. Die freie Säure, hergestellt aus ihren Salzen, zeigt einen Extinktionskoeffizienten E in 0,1 m wäßrigem Natriumhydroxid bei 259 nm von 590 oder darüber und eine spezifische optische Drehung [α] (c=1,0) in Dimethylsulfoxid von etwa +54°.

Der hier verwendete Ausdruck "Reinheit" bezieht sich auf den Prozentsatz an Clavulansäure und/oder deren Salz, bezogen auf die vorhandenen Gesamtfeststoffe auf der Basis des Gewichts, jedoch ohne assoziiertes Wasser oder andere Lösungsmittel.

Im allgemeinen sind Clavulansäure und ihre Salze in wäßrigen Lösungen außerhalb des pH-Bereiches 5,5 bis 8 ziemlich instabil, und es ist daher während der nachstehenden Arbeitsgänge erwünscht, den pH-Wert innerhalb dieses Bereiches und vorzugsweise in der Nähe von etwa 6,5 zu halten, falls dies nicht anders angegeben wird.

Im allgemeinen ist die ionische Lithiumverbindung im Verfahren der Erfindung ein Salz. Bevorzugt ist Lithiumchlorid, jedoch sind Lithiumbromid, -jodid oder -sulfat oder Lithiumcarboxylate, wie das Acetat, Propionat, Formiat, Benzoat oder Lactat, auch geeignet. Die Wahl des Salzes kann von den anderen vorhandenen Materialien beeinflußt werden. Ist beispielsweise das zu reinigende Clavulansäuresalz das Bariumsalz, so kann es bevorzugt sein, Lithiumsulfat zu verwenden, um zunächst eine Ausfällung von Bariumsulfat vor der Ausfällung des Lithiumclavulanats zu bewirken.

Vor der Ausfällung liegt das Lithiumclavulanat zweckmäßig in einer Konzentration von mindestens 0,1 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 2% vor, und höhere Konzentrationen, beispielsweise bis zu 12% oder sogar bis zu 20%, bezogen auf das Gewicht, ergeben natürlich größere prozentuale Ausbeuten.

Das Salz der Clavulansäure, das gereinigt werden soll, kann beispielsweise ein Alkalimetallsalz (wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder auch das Lithiumsalz, falls dieses nur einen kleinen Anteil des gesamten Clavulansäurematerials ausmacht), ein Erdalkalimetallsalz (z. B. das Calcium-, Barium- oder Magnesiumsalz) oder das Salz einer organischen Base, wie vorstehend beschrieben, oder ein mit einem basischen Ionenaustauscherharz gebildetes Salz sein.

Nach einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann die wäßrige Lösung des Lithiumclavulanats auch eine ausreichende Menge einer ionischen Lithiumverbindung enthalten, gewöhnlich dasjenige Lithiumsalz, das zur Bildung des Lithiumclavulanats verwendet wird, um letzteres durch Anheben der Konzentration der Lithiumionen auszusalzen, so daß das Löslichkeitsprodukt von Lithiumclavulanat bei der jeweiligen Temperatur stark überschritten wird. Da das Clavulanat bei niedrigen Temperaturen weniger löslich ist, ist es im allgemeinen zweckmäßig, die Temperatur der Lösung zur Erzielung einer maximalen Ausfällung zu verringern, beispielsweise auf etwa 0-5°C.

Für ein derartiges Aussalzen liegt die Konzentration der ionischen Lithiumverbindung in der wäßrigen Lösung, die das Lithiumclavulanat enthält, vorzugsweise im Bereich von 4 m bis 10 m und insbesondere von 5 m bis 8 m.

Es kann vorteilhaft sein, nach Abtrennung einer ersten Ausfällung von Lithiumclavulanat die Mutterlauge weiter zu konzentrieren und eine zweite Ausfällung zu gewinnen.

Im Falle des Bariumsalzes kann die Anwendung einer hohen Konzentration an Lithiumchlorid zu einer gewissen Kopräzipitation von Bariumchlorid mit dem Lithiumclavulanat führen. Das Bariumchlorid kann jedoch leicht durch erneute Auflösung der Mischung in Wasser und Zugabe von Lithiumsulfat unter Ausfällung von Bariumsulfat entfernt werden, das beispielsweise abfiltriert wird, worauf zu der Lösung erneut Lithiumchlorid zur Ausfällung von reinem Lithiumclavulanat zugesetzt wird.

Nach einer besonders nützlichen Ausführungsform der Erfindung wird als Ausgangsmaterial ein Salz der Clavulansäure mit einem basischen Ionenaustauscherharz verwendet, und dieses wird mit einer wäßrigen Lösung eines Lithiumsalzes in Kontakt gebracht, um eine wäßrige Lösung von Lithiumclavulanat zu ergeben. Das Harzsalz wird normalerweise in Form einer Säule verwendet, die mit verunreinigter Clavulansäure und/oder einem Salz davon beladen wird und von der unter Anwendung einer wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Lithiumsalzes, z. B. von Lithiumchlorid, eine wäßrige Lösung von Lithiumclavulanat eluiert wird. Das Harz wird normalerweise vor dem Eluieren gewaschen, beispielsweise mit Wasser.

Das Harz trägt im allgemeinen Amino- oder tertiäre Aminogruppen (schwach basisch) oder quaternäre Ammoniumgruppen (stark basisch). Das Harz kann beispielsweise ein Polystyrol-, Polyacryl-, Epoxypolyamin-, phenolisches Polyamin- oder quervernetztes Dextranharz sein und kann makroreticulär oder mikroreticulär sein.

Der hier verwendete Ausdruck "Harz" soll auch Cellulosederivate und die vorstehenden Dextranderivate umfassen, die sich von natürlich vorkommenden Polymeren herleiten. Typische schwach basische Ionenaustauscherharze umfassen Amberlite IRA68 (Mikroreticulär: Polyacrylat quervernetzt mit Divinylbenzol: tertiäre Aminogruppen), Amberlite IRA93 (Makroreticulär: Polystyrol quervernetzt mit Divinylbenzol: tertiäre Aminogruppen), jeweils Handelsprodukte der Rohm (U.K.) Ltd. Typische stark basische Ionenaustauscherharze umfassen Zerolit FF und Zerolit FF(iP) (Handelsprodukt der Zerolit Co., Ltd.).

Basische Ionenaustauscherharze liegen vorteilhaft bereits in der Salzform vor, wenn sie mit der verunreinigten Clavulansäure und/oder deren Salz in Kontakt gebracht werden; das Anion ist vorzugsweise das gleiche wie das des als Eluiermittel verwendeten Lithiumsalzes, zweckmäßig das Chloridion.

Die Konzentration der als Eluiermittel verwendeten wäßrigen Lithiumsalze liegt vorzugsweise im Bereich von 0,02 m bis 8 m. Jedoch ergeben die geringen Konzentrationen sehr verdünnte Lösungen von Lithiumclavulanat und gestalten die anschließende Ausfällung schwieriger. Im allgemeinen sind Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 2,5 m bevorzugt.

Während Adsorptions-/Elutions-Techniken üblicherweise derart durchgeführt werden, das das gewünschte Produkt einer chromatographischen Abtrennung von anderem adsorbiertem Material unterzogen wird, hat es sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße nachfolgende Ausfällungsstufe derart wirksam zur Abtrennung von unerwünschten Verunreinigungen von Lithiumclavulanat ist, daß es gewöhnlich bevorzugt ist, die Kolonne unter Anwendung relativ hoher Konzentrationen an Lithiumsalz in dem Eluiermittel im wesentlichen vollständig abzustreifen. Dies ergibt ein enges Band an Clavulanat auf der Säule, das unter Bildung eines relativ geringen Volumens an Eluat eluiert werden kann, wodurch die nachfolgende Ausfällung erleichtert wird.

Das Eluat enthält normalerweise das Lithiumsalz, z. B. Lithiumchlorid, in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,5 m, während der Aussalzeffekt am wirksamsten bei Konzentrationen im Bereich von 5 m bis 10 m ist. Das Eluat wird daher bevorzugt aufkonzentriert, beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum, z. B. um einen Faktor von etwa 5. Die Löslichkeit von Lithiumclavulanat in wäßrigem Lithiumchlorid verschiedener Konzentration wird in der folgenden Tabelle angegeben (bei etwa 20°C):

Molarität von LiCl
Löslichkeit von Lithiumclavulanat in mg/ml (etwa)
2,5
23,5
3,75	10,2
5,0	4,1
6,25	1,8
7,5	0,8

Um die Eluierung von adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz auf ein Miniumum herabzusetzen, kann es vorteilhaft sein, in das Eluiermittel ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in hoher Konzentration einzubringen. Alternativ kann nach dem Eluieren in Abwesenheit eines derartigen Lösungsmittels, letzteres zu dem Eluat hinzugesetzt werden, um eluierte Verunreinigungen auszufällen, und diese Ausfällung kann vor der Weiterbehandlung abgetrennt werden. Das Lösungsmittel kann beispielsweise ein Keton sein, wie Aceton, ein Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Isopropylalkohol oder Äthylenglykol, ein Äther, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder ein substituiertes Amid, Imid oder ein Sulfoxidlösungsmittel, wie Dimethyhlformamid oder Dimethylsulfoxid. Im allgemeinen sind als derartige Lösungsmittel Alkohole bevorzugt, z. B. Äthanol oder Isopropylalkohol.

Für eine derartige Abtrennung von unerwünschten Verunreinigungen durch Ausfällen beträgt die bevorzugte Konzentration an Alkohol in dem Eluiermittel oder dem Eluat nach Zugabe des Alkohols 70 bis 97 Vol.-%.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gebildete Lithiumclavulanat mittels eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels unter Anwendung sehr hoher Konzentrationen derartiger Lösungsmittel ausgefällt. So können Clavulansäure und/oder ein Salz davon mit einem Lithiumsalz in einer relativ geringen Konzentration in Konakt gebracht werden, entweder durch Eluieren von einer Säule oder durch Auflösen der Salze in einer einzigen Lösung, und die gewünschte Ausfällung wird ohne Konzentrieren der Lösung direkt durch Zusatz des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels durchgeführt. So sind beispielsweise Konzentrationen eines Alkohols von mindestens 90 Vol.-%, vorzugsweise mindestens 95%, wirksam zur Ausfällung von Lithiumclavulanat. Es kann notwendig sein, eine erste Ausfällung von Lithiumclavulanat abzutrennen und anschließend die Mutterlauge im Vakuum aufzukonzentrieren, z. B. um etwa das Vierfache, um eine zweite Ausfällung zu erzielen.

Das vorstehend erwähnte basische Ionenaustauscherharz kann mit der Clavulansäure und/oder dem Salz durch direkten Einsatz einer Fermentationsbrühe, aus der das feste Material vorher entfernt wurde, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, beladen werden. Diese Möglichkeit besteht aufgrund der beträchtlichen Reinigungswirkung, die durch den anschließenden Ausfällungsschritt unter Gewinnung von Lithiumclavulanat bewirkt wird. Vorzugsweise wird jedoch die Brühe nach der Entfernung von Feststoffen zunächst mit adsorbierender Kohle behandelt, um die Clavulansäure und/oder das Salz daran zu adsorbieren. Diese Maßnahme wirkt sich günstig auf die Abtrennung anderer Salze von dem Clavulanat aus, und es wird eine unerwünschte Beladung des basischen Ionenaustauscherharzes mit verunreinigendem ionischem Material vermieden.

Im allgemeinen kann die geklärte Brühe durch ein Kohlebett, z. B. in einer Säule, geleitet werden, vorzugsweise unter Anwendung einer gerade ausreichenden Menge an Aktivkohle bzw. Absorptionskohle, um die Clavulansäure und/oder deren Salz daran zu adsorbieren, gewöhnlich reicht eine Menge von etwa 1 Vol.-Teil Kohle auf 3-10 Vol.-Teile geklärte Brühe hierfür aus.

Die Absorptionskohle kann anschließend mit einem wäßrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zwecks Desorption der Calvulansäure und/oder ihres Salzes abgestreift werden, z. B. einem Keteon, wie Methyl-Äthylketon, Methyl-Isobutylketon oder vorzugsweise Aceton, vorteilhaft in einer Konzentration von 30% bis 95% Keton, bevorzugt 50 bis 70%. Vor dem Abstreifen wird die Kohle vorzugsweise gewaschen, beispielsweise mit Wasser, um restliche Brühekomponenten zu entfernen.

Eine weitere Variation der vorstehenden Arbeitsweise ist die Herstellung eines Harz-Salzes von Clavulansäure, wie vorstehend beschrieben, und seine Eluierung mit einem von einem Lithiumsalz unterschiedlichen Salz, z. B. einem Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalz, beispielsweise einem Chlorid oder Acetat, oder einem Ammonium- oder Pyridiniumsalz, z. B. Ammoniumformiat oder -acetat oder Pyridinhydrochlorid. Man erhält so eine wäßrige Lösung des entsprechenden Clavulanats. Zu diesem Eluat setzt man einem Überschuß eines wasserlöslichen Lithiumsalzes zu, und Lithiumclavulanat wird, wie vorstehend beschrieben, ausgefällt.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird eine phenolische Lösung, welche durch Kontaktieren von Adsorbenskohle oder einem basischen Ionenaustauscherharz mit einer Fermentationsbrühe, die Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthält, Eluieren der Clavulansäure oder ihres Salzes mit einem wäßrigen Eluiermittel, Aufkonzentrieren des Eluats, gegebenenfalls Ausfällen unerwünschter organischer Verunreinigungen durch Zusatz von einem oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und/oder Extrahieren solcher Verunreinigungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel und anschließendes Extrahieren der konzentrierten wäßrigen Lösung von Clavulansäure und/oder einem Salz davon mit einem phenolischen Lösungsmittel erhalten worden ist, mit einer wäßrigen Lithiumhydroxidlösung extrahiert.

Bei dieser Arbeitsweise führt man die Extraktion zweckmäßig bei einem pH-Wert der wäßrigen Phase von etwa 6,5 durch.

Vorteilhafterweise kontaktiert man den wäßrigen Extrakt vor dem Ausfällen des Lithiumclavulanats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff.

Die vorstehende Technik kann auch zur Herstellung von anderen Salzen als den Lithiumsalzen der Clavulansäure verwendet werden durch Extrahieren der phenolischen Lösung mit einer entsprechenden Base, z. B. einem Erdalkalimetallhydroxid, wie Calcium- oder Bariumhydroxid. Eine Ausfällung, die sich bildet, z. B. Bariumsaulfat, sollte entfernt werden, und anschließend kann das Salz isoliert werden, z. B. durch Gefriertrocknung. Die Reinigung durch Umwandlung in das Lithiumsalz kann anschließend wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.

Das phenolische Lösungsmittel enthält vorteilhaft eine Base, wie N,N-Dimethylanilin, und ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff. Die Extraktion wird vorteilhaft mehrfach unter Anwendung von etwa 2/3 Volumen Lösungsmittel für jede Extraktion durchgeführt. Die Extrakte können anschließend vereint werden, und Wasser, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1/15 des Lösungsmittelvolumens, kann zur Bildung einer separaten Phase zugesetzt werden. Das Antibiotikum kann anschließend durch Zugabe einer Base zu der wäßrigen Schicht, vorzugsweise eines Alkalimetallhydroxids, z. B. Lithiumhydroxid, oder eines Erdalkalimetallhydroxids, z. B. Barium- oder Calciumhydroxid, bis auf einen pH-Wert von etwa 6,5, rückextrahiert werden. Die wäßrige Schicht wird von der phenolischen Schicht abgetrennt, und der Rückextraktionsarbeitsgang wird vorteilhaft wiederholt, wonach die wäßrigen Extrakte vereint werden. Nach der Abtrennung von jeglichem Niederschlag, z. B. Bariumsulfat, können Restanteile des phenolischen Lösungsmittels aus der wäßrigen Lösung durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, entfernt werden, und zur Gewinnung des Antibiotikum-Salzes kann die wäßrige Phase gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet werden.

Gereinigtes Lithiumclavulanat, hergestellt nach der vorstehenden Arbeitsweise, kann in andere Salze durch Ionenaustausch, z. B. unter Anwendung eines Ionenaustauscherharzes, umgewandelt werden.

Freie Clavulansäure kann durch Ansäuern, z. B. auf einen pH- Wert von etwa 2,6, einer wäßrigen Lösung des Lithiumsalzes, vorzugsweise mit großer Ionenstärke, z. B. gesättigt mit Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Clavulansäure, beispielsweise eines Esterlösungsmittels, wie Äthylacetat, gebildet werden. Falls notwendig, kann die wäßrige Phase mit weiterem Lösungsmittel extrahiert werden, und die Lösungsmittel können vereint werden. Im allgemeinen eignet sich jede Säure, die einen ausreichend niedrigen pH-Wert ergibt, zum Ansäuern, z. B. eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure. Das Lösungsmittel kann anschließend unter Bildung der freien Säure, gewöhnlich in Form eines Öls, entfernt werden.

Die Lösung der freien Säure im mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel kann zur Herstellung eines weiten Bereiches von Clavulansäuresalzen durch Extraktion mit einer wäßrigen Lösung einer geeigneten Base und Isolieren des Salzes verwendet werden.

Da die freie Säure ziemlich instabil ist, sollte sie vorzugsweise sobald wie möglich nach ihrer Bildung verwendet werden, beispielsweise zur Herstellung von Salzen oder anderen Derivaten.

Die folgenden Herstellungsverfahren und Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Die Clavulansäuregehalte von Verfahrensflüssigkeiten und Feststoffen wurden gemessen durch:

1. UV-Spektroskopie

Wäßrige Lösungen von Clavulansäure und ihren Salzen zeigen eine sehr geringe UV-Absorption bei über 230 nm, und beispielsweise beträgt der molare Extinktionskoeffizient ε bei 280 nm etwa 60.

Beim Auflösen in Alkali entwickelt sich jedoch rasch eine intensive UV-Absorption bei λ_max 259±1, und diese kann dazu verwendet werden, die Clavulansäure und/oder ihre Salze zu bewerten. Zur Bewertung wurden Feststoffe genau ausgewogen und in einer verdünnten Natriumhydroxidlösung (0,1 m) unter Bildung eines bekannten Volumens an Lösung entsprechend etwa 0,01 mg/ml Clavulansäure gelöst. Die optische Dichte der Lösung bei einem Absorptionsmaximum bei oder bei etwa 259 nm wurde auf einem geeigneten Spektrophotometer gemessen. Die Reinheiten der Feststoffe können berechnet werden unter der Annahme, daß der Wert ε für Clavulansäure 16 700 beträgt. Molare Extinktionskoeffizienten können aus den E-Werten berechnet werden, d. h. den Extinktionskoeffizienten für eine 1%ige Lösung in einer 1-cm-Zelle. In ähnlicher Weise wurden Verfahrensflüssigkeiten, falls notwendig nach Entfernung von organischen Lösungsmitteln, genau mit verdünnter Natriumhydroxidlösung verdünnt, um ähnliche Konzentrationen von Alkali und Clavulansäure zu ergeben, wenn die Clavulansäurekonzentration in der Originalflüssigkeit wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde. Die Werte für rohe Feststoffe und Verarbeitungsflüssigkeiten wurden auf die Absorption von Verunreinigungen hin unter Verwendung von Lösungen der gleichen Konzentration in Wasser korrigiert.

2. Biologische Aktivität

Bestimmt durch Vergleich von Lösungen von Feststoffen von bekanntem Clavulansäuregehalt in Agar-Schalen (agar cup plate)-Versuch gegen Acenitobacter sp., im wesentlichen nach der Methode von Lees und Tootill (Lees, K. A. & Tootill, J. P. R., Analyst, 1955, 80 [947], 95-110; ibid 110-123; 80 [952], 531-535).

Alle Medien wurden vor der Fermentation mit Dampf destilliert. Die Temperaturen sind in °C angegeben.

Herstellungsverfahren 1 Herstellung des Bariumsalzes a) Entwicklung des Inoculums

10 ml steriles destilliertes Wasser wurden zu einer 14 Tage alten Malz/Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 gefügt, und es wurde eine Suspension hergestellt.

Ein Teil von 1,5 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:

und Wasser auf 100% in einem 2-l-Kolben (florence flask).

Dieser Kolben wurde 48 Stunden bei 220 U/min bei 26°C auf einem Rotationsschüttler mit einem Auswurf von 5,08 cm (2 inch) inkubiert. 150 ml dieses Inoculums wurden zum Animpfen von 4 l eines Mediums verwendet, das enthielt:


% Gew./Vol.
Sojabohnenmehl
2,1
Distillers' solubles	0,52
Kaseinhydrolysat	0,52
FeSO₄ · 7 H₂O	0,01
lösliche Stärke	4,7
Glukose	0,78

und Wasser auf 100% in einem 5-l-Fermentationsgefäß mit Belüftung (0,75 Vol./Vol./Min.) und wurde bei 28°C unter Rühren gehalten (750 U/min) während 20 Stunden.

b) Fermentation

7,5 l des 20stündigen Inoculums von (a) wurden in 150 l eines Mediums eingeimpft, das enthielt:


Gew./Vol.
lösliche Stärke
4,7
Sojabohnenmehl	2,1
Distillers' solubles	0,52
Kaseinhydrolysat	0,52
Glukose	0,78
FeSO₄ · 7 H₂O	0,01
Polyglykol (P. 2000: Dow Chemical Co.)	0,05

und Wasser auf 100% in einem 220-l-Gefäß. Es wurde 90 Stunden bei 28°C unter Belüften (2 Vol./Vol./Min.) und Bewegen (350 U/min) fermentiert.

c) Isolierung

Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde auf den pH-Wert 6,3 eingestellt und durch Zentrifugieren geklärt. Die klare überstehende Flüssigkeit (89 l) wurde auf eine Säule, die Pittsburg-CAL-Entfärbungskohle (20 l) enthielt, aufgebracht.

Die Entfärbungskohle wurde mit 40 l destilliertem Wasser gewaschen und dann so trocken wie möglich von Flüssigkeit befreit. Die Entfärbungskohle wurde mit 10 l Aceton und anschließend 40 l 90%igem wäßrigem Aceton eluiert. 5×10 l Eluatfraktionen wurden gesammelt, und jede Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons verdampft.

Die Fraktion 1 (5 l wäßrige Lösung) wurde durch Gefriertrocknen auf 2,2 l konzentriert, und es wurde Aceton auf eine Endkonzentration von etwa 84% Aceton zugefügt. Zu der Fraktion 2 (0,5 l wäßrige Lösung) wurde Aceton auf eine Endkonzentration von etwa 84% Aceton gefügt. Die Fraktionen 1 und 2 wurden anschließend durch eine Filterhilfe (Celite 535) filtriert, und die Filtrate wurden unter vermindertem Druck verdampft, um das Aceton zu entfernen, und die resultierenden wäßrigen Lösungen wurden vereint.

Die wäßrigen Lösungen der Fraktionen 3 bis 5 wurden vereint und unter Bildung eines Feststoffs gefriergetrocknet. Die wäßrige Lösung der vereinten Fraktionen 1 und 2 wurde anschließend zu dem Feststoff der vereinten Fraktionen 3 und 5 gegeben, wobei man eine Lösung erhielt, die durch Gefriertrocknen auf 0,76 l konzentriert wurde. Die Lösung (pH 4) wurde sofort mit Butan-1- ol extrahiert (1×1,52 l, 5×380 ml).

Die wäßrige Phase wurde nach Entfernen des Butanols durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf den pH-Wert 4,2 (von 5,6) mit Schwefelsäure gebracht und mit einem gleichen Volumen von 72% wäßrigem Phenol/N,N-Dimethylanilin/Tetrachlorkohlenstoff (53 : 5 : 15, bezogen auf das Volumen) extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde anschließend mit 500 ml wäßrigem Bariumhydroxid extrahiert, wobei man eine wäßrige Lösung vom pH-Wert 6,5 erhielt. Suspendiertes Bariumsulfat wurde durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wurde mit Diäthyläther gewaschen und gefriergetrocknet, wobei man 11,1 g festes Bariumsalz erhielt; E 220.

Herstellungsverfahren 2 Herstellung des Bariumsalzes

Eine Fermentationsbrühe, die auf gleiche bzw. ähnliche Weise wie beim Herstellungsverfahren 1 (a) und (b) erhalten wurde, wurde wie folgt hergestellt: 135 l Fermentationsbrühe vom pH-Wert 6,5 wurden auf einer Zentrifuge geklärt, wobei man 112 l überstehende Flüssigkeit vom pH-Wert 6,3 erhielt. Diese wurde durch eine Säule von 25 l Pittsburg-CAL-Entfärbungskohle geleitet, und die Säule wurde mit 50 l Wasser durchgewaschen. 10 l Aceton wurden langsam auf das obere Ende des Bettes gegossen, und es wurde mit dem Eluieren begonnen. Anschließend folgten 60 l 90%iges wäßriges Aceton. Das Eluat wurde in Fraktionen (1×10 l, 2×25 l) gesammelt.

Jede Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons destilliert. Die zurückbleibende wäßrige Lösung wurde mit 1-m-Natriumhydroxid auf den pH-Wert 6,0 eingestellt. Die Fraktionen werden anschließend vereint und weiter auf 2,9 l destilliert, in einen geeigneten Behälter überführt und mit den Waschlösungen des Behälters (Boiler) auf 3,3 l gebracht. 17 l Aceton und 500 g Celite 535 wurden zu dem Konzentrat unter kräftigem Rühren gefügt. Die resultierende Suspension wurde filtriert, und der Kuchen wurde mit 4 l 85%igem wäßrigen Aceton gewaschen.

Das vereinte Filtrat und die Waschlösungen wurden unter vermindertem Druck auf 4,0 l destilliert. Der pH-Wert wurde von 5,65 auf 6,0 mit 1-m-Natriumhydroxid eingestellt, und es wurde weiter destilliert, bis das Volumen 1,0 l betrug. Das resultierende Konzentrat wurde mit 20%iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0 angesäuert und mit 4×750 ml und 1×500 ml Butan-1-ol gewaschen. Das gelöste Butan-1-ol wurde unter Vakuum aus der wäßrigen Phase abdestilliert.

Nach Einstellen des pH-Werts mit 20%iger Schwefelsäure auf 4,2, wurde das Konzentrat 3× mit einer Mischung von 265 ml verflüssigtem Phenol (B.P.), 75 ml Tetrachlorkohlenstoff und 25 ml N,N- Dimethylanilin extrahiert. Der pH-Wert wurde für jeden Extrakt auf 4,2 eingestellt. Die vereinten Lösungsmittelextrakte wurden mit 250 ml Wasser gerührt, und der pH-Wert wurde mit 70 ml gesättigtem wäßrigem Bariumhydroxid auf 6,5 eingestellt. Nach Trennung der Phasen wurde das Lösungsmittel mit 200 ml Wasser und 7 ml gesättigtem wäßrigem Bariumhydroxid erneut extrahiert.

Die vereinten wäßrigen Phasen wurden mit 3×200 ml Diäthyläther gewaschen, im Vakuum auf 200 ml verringert und gefriergetrocknet, wobei man 29,4 g eines blaßbraunen Feststoffs erhielt; E=152.

Herstellungsverfahren 3 Herstellung eines Entfärbungskohle- bzw. Aktivkohleeluats, das Clavulansäure enthält a) Entwicklung des Inoculums

Ein Teil von 2,0 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:


% Gew./Vol.
Sucrose
2,0
Distillers' solubles	1,5
Hefeextrakt	0,5
K₂HPO₄	0,02
Trypton	0,5
Glycerin	1,0

und Wasser auf 100%.

Es wurde in einem 2-l-Kolben (florence flask) gearbeitet.

Der Kolben wurde 48 Stunden bei 26°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert (5 cm Reichweite; 220 U/min).

Der Inhalt von 6 derartigen Kolben (insgesamt 900 ml) wurde zur Animpfung von sechs 5-l-Fermentoren verwendet, die jeweils 4,5 l eines Mediums enthielten, das enthielt:


% Gew./Vol.
Sojamehl
2,1
Distillers' solubles	0,52
Kaseinhydrolysat	0,52
Eisen-II-sulfat-Heptahydrat	0,01
lösliche Stärke	4,7
Glukose	0,78
Silikon-Antischaumemulsion	0,05 (Vol./Vol.)

und Wasser auf 100%.

Die Fermentoren wurden belüftet (0,67 Vol./Vol./Min.) und bewegt (750 U/min; zwei Flügelrührer von 7,5 cm Durchmesser), wobei 20 Stunden bei 28°C gearbeitet wurde.

b) Fermentation

25 l Inoculum aus der 5-l-Fermentorstufe wurden zum Animpfen von 475 l eines Mediums verwendet, das enthielt:


% Gew./Vol.
Sojamehl
3,0
Eisen-II-sulfat-heptahydrat	0,01
K₂HPO₄	0,01
lösliche Stärke	4,7
Silikon-Antischaumemulsion	0,05 (Vol./Vol.)

und Wasser auf 100%, das in einem 700-l-Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl enthalten war und mit 350 U/min (25-cm-Durchmesser-Rührer und vier 7,5-cm-Leitbleche bzw. Trennwände) und mit 0,56 Vol./Vol./Min. belüftet wurde. Die Fermentation wurde 92 Stunden bei 28°C durchgeführt, und je nach Notwendigkeit wurde weiteres Antischaummittel zugesetzt. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 6,5 gehalten.

c) Isolierung

Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde mit starker Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,45 eingestellt und auf einem Rotationstrommelfilter mit einer Cellulosevorbeschichtung filtriert. Das Filtrat (430 l), das das Antibiotikum enthielt, wurde auf Entfärbungskohle (Pittsburgh CAL; 135 l) in Säulen adsorbiert. Die Aktivkohle wurde mit 90 l Wasser gewaschen, um die filtrierte Brühe zu ersetzen, und das Antibiotikum wurde mit wäßrigem Aceton eluiert (60% Vol./Vol.; 180 l).

Beispiel 1 (i) Herstellung des Calciumsalzes

a) 8,83 g des rohen Bariumsalzes des Herstellungsverfahrens 2 wurden zu 50 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von (NH₄)₂SO₄ gefügt. 50 ml Äthylacetat wurden zugefügt, und die Mischung wurde gerührt, ein pH-Wert-Meßgerät wurde in die Mischung eingebracht, und der pH-Wert wurde mit etwa 15 ml 1 m H₂SO₄ von 6,8 auf 2,6 eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde von dem Äthylacetat abgetrennt und erneut mit einer frischen Protion von 50 ml Äthylacetat gerührt. Die beiden Äthylacetatextrakte wurden vereint, 100 ml destilliertes Wasser wurden zugesetzt, und die Mischung wurde in Anwesenheit des pH-Meßgerätes gerührt. Etwa 40 ml einer gesättigten Lösung von Calciumhydroxid wurden zugesetzt, um den pH-Wert der Mischung auf 6,6 zu bringen. Die wäßrige Lösung wurde von dem Äthylacetat abgetrennt, durch eine Filterhilfe filtriert und gefriergetrocknet, wobei man 1,44 g festes Calciumsalz erhielt.

b) Der Feststoff von (a) wurde in 15 ml destilliertem Wasser gelöst, durch ein Millipor-Filter filtriert und auf eine Sephadex- G15-Kolonne aufgebracht, die in Wasser gepackt war, um eine Betthöhe von 152,4 cm (60 inch) und einen Durchmesser von 2,54 cm (1 inch) zu ergeben. Es wurde mit destilliertem Wasser eluiert, und es wurden Fraktionen von 20 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden nach Dünnschichtchromatographie (Cellulose, Eastman-Kodak- 6005-Platten; Lösungsmittel Acetonitril-Wasser, 7 : 3 Vol.) durch Überlagern mit Nährmedium-Agar, das Staphyolcoccus aureus enthielt, bewertet. Die Fraktionen 33-37 wurden vereint und unter Bildung von 490 mg gefriergetrocknet. Der Feststoff wurde über P₂O₅ im Vakuum während 60 Stunden gehalten. Das Calciumsalz von (b) hatte folgende Charakteristika:

pKa

Der pKa-Wert der entsprechenden Säure erwies sich als etwa 2,4 durch potentiometrische Titration des Salzes.

Optische Drehung

[α]_D bei 22°C, +44,9° (c=0,287 g/100 ml Wasser).

UV-Spektrum

Eine Probe von 0,00148 g wurde in 100 ml NaOH gelöst und zeigte ein Absorptionsmaximum (λmax) bei 258 nm mit einem E- Wert von etwa 550.

IR-Spektrum

Das Infrarotspektrum in Nujol einer Probe zeigte Absorptionsmaxima bei den Wellenzahlen (cm^-1):

Das gesamte Spektrum ist in der Fig. 3 aufgeführt.

NMR-Spektrum

Das protonenmagnetische Resonanzspektrum einer Lösung der Probe in schwerem Wasser zeigte Gruppen von Peaks (τ-Werte), die zentriert waren bei etwa 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.

Dünnschichtchromatographie

Teile der Probe, gelöst in Wasser, wurden auf den Ausgangspunkt von entweder Eastman-Kodak-Cellulose-TL-Platten (plastic-backed, EK 6065) oder Eastman-Kodak-Siliciumdioxid-TL-Platten (plastic- backed, EK 6060) aufgebracht. Die Platten wurden mit Lösungsmittel bei Raumtemperatur entwickelt und anschließend luftgetrocknet und mit einem Agar-Nährmedium, das Staphylococcus aureus enthielt, überlagert. Die Rf-Werte, berechnet als die Entfernung von dem Ausgangspunkt zum Zentrum jeder Zone des inhibierten Bakteriumwachstums, dividiert durch die Entfernung von dem Ausgangspunkt zur Lösungsmittelfront, sind im folgenden für fünf Systeme aufgeführt:

Papier-Ionophorese

Teile der Probe wurden einer Ionophorese auf Whatman-541-Papier, während 1 Stunde bei 400 Volt angelegt an 20 cm, unterzogen. Die Aktivität, bestimmt durch Überlagerung des luftgetrockneten Papiers mit Staphylococcus aureus enthaltendem Agar-Nährmedium hatte eine Mobilität, bezogen auf Cyanocobalamin, von 4,5 cm gegen die Anode beim pH-Wert 4,8 (0,01 m Acetat), pH 6,9 (0,01 m Phosphat) und pH 9,5 (0,01 m Pyrophosphat).

(ii) Herstellung des Lithiumsalzes

1 g Calciumsalz (E=590) rein, gemäß UV-Bewertung), hergestellt wie in (i) (b) beschrieben, wurde in 10 ml Wasser gelöst und 10 ml einer gesättigten Lösung von Lithiumchlorid in Wasser wurden zugefügt. Die Kristallisation trat ohne Kratzen oder Animpfen auf. Nach dem Kühlen auf 0° wurden die Kristalle filtriert, mit 5 ml Äthanol, 5 ml Aceton und 2×5 ml Diäthyläther gewaschen. Die Kristalle wurden unter vermindertem Druck (0,1 mm Hg) über Siliciumdioxidgel 2 Stunden getrocknet, wobei man 495,5 mg festes Lithiumsalz erhielt. Dieses Salz hatte folgende Eigenschaften:

Elementaranalyse

Gef.: (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben):
C 45,5, 45,8 (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li 3,2 Schwefel wurde nach der Methode von N. D. Cheronis & J. B. Entriki (1947), Semimicro Qualitative Analysis, Seite 93, Crowell, New York, nicht entdeckt. Berechnet für C₈H₈NO₅Li · 1/4 H₂O: C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31%.

Der vorstehend aufgeführte Wert der Li-Analyse (3,2%) wurde durch Atomabsorptions-Spektrophotometrie bestimmt. Die Sulfatasche betrug 26,8%, was berechnet als Li₂SO₄ äquivalent 3,38% Lithium entspricht.

pKa

Der pKa-Wert der korrespondierenden Säure erwies sich durch potentiometrische Titration des Salzes als etwa 2,3.

Optische Drehung

Die [α]_D-Werte für eine 0,145% (Gew./Vol.) wäßrige Lösung bei 24° betrug +66,0°.

Ultraviolettspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum einer 0,00091%igen Lösung in 0,1 m Natriumhydroxid hatte ein Absorptionsmaximum (λmax) bei 258 nm mit einem E-Wert von 788.

Infrarotspektrum

Das IR-Spektrum in Nujol zeigte Absorptionspeaks (cm^-1) bei etwa

Das gesamte Spektrum ist in der Fig. 1 aufgeführt.

N.M.R.-Spektrum

Ein 100-MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum des Lithiumsalzes, gelöst in schwerem Wasser, zeigte Peaks (τ-Werte mit Multiplizitäten und Kopplungskonstanten - Hz - in Klammern) zentriert bei etwa 4,26 (d, 3), 5,05 (t, 8), 5,06 (s), 5,81 (d, 8), 6,43 (dd, 3 und 17) und 6,89 (d, 17).

(s, d, dd, t und m = Singulett, Dublett, Doppeldublett, Triplett bzw. Multiplett.)

Beispiel 2 Umkristallisieren des Lithiumsalzes

0,1 g Lithiumsalz, hergestellt in Beispiel 1 (ii) wurden in 1,0 ml Wasser gelöst und sorgfältig mit 19 ml Isopropanol verdünnt. Das Produkt kristallisierte langsam bei 0° und wurde in zwei Anschüssen nach Absieden unter vermindertem Druck auf 5 ml für den zweiten Anschuß gewonnen. Die Kristalle des Lithiumsalzes wurden über Siliciumdioxidgel im Vakuum 3 Tage lang getrocknet.

Erster Anschuß:
20,0 mg, λ_max 259 nm, E=814 in 0,1 m Natriumhydroxidlösung bei 10 µg/ml.

Elementaranalyse für C₈H₈NO₅Li · 1/4 H₂O:
Ber.: C 45,84, H 4,06, N 6,68%;
gef.: C 46,2, 46,0, H 4,10, 3,85, N 6,8, 6,7%.

Zweiter Anschuß:
67,0 mg, λ_max 259 nm, E=800 in 0,1 n Natriumhydroxid bei 10 µg/ml.

Elementaranalyse für C₈H₈NO₅Li · 1/4 H₂O:
Ber.: C45,84, H 4,06, N 6,68, Li 3,31%;
gef.: C 46,15, 46,5, H 3,9, 4,0, N 6,65, 6,5, Lithium 3,4% (Sulfatasche).

Beispiel 3

30 g des Bariumsalzes (E 274, hergestellt wie im Herstellungsverfahren 2) wurden in 40 ml Wasser gelöst, und 300 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung wurden zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 23,0 ml 20%iger Schwefelsäure auf 2,3 eingestellt, und anschließend wurde mit 2×300 ml Äthylacetat extrahiert. 200 ml Wasser wurden zu den vereinten Extrakten gefügt. Die Mischung wurde kräftig gerührt, und 89,3 ml 1-m-Natriumhydroxidlösung wurden zugegeben, bis der pH-Wert 6,8 erreichte wurde. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 33 ml destilliert. 770 ml Butan-1-ol wurden zu dem wäßrigen Konzentrat gefügt und anschließend vermischt und erwärmt auf 40°C unter heftigem Schütteln. Unlösliches Material wurde abfiltriert, und es wurde erneut mit Wasser : Butan-1-ol (1 : 23 Vol./Vol.) bis alles aufgelöst war, extrahiert. Die vereinten Lösungen wurden über Nacht auf 4°C gekühlt. Der gebildete kristalline Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen, mit Butan-1-ol und Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 3,34 g des Natriumsalzes erhielt (E 648).

2,92 g dieses Natriumsalzes wurden in 20 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde bei 0°C gerührt, und es wurden 20 ml bei 20°C gesättigte Lithiumchloridlösung während 5 Minuten eingebracht. Es wurde eine weitere Stunde gerührt und gekühlt, wonach die Kristalle durch Filtrieren gewonnen, mit 20 ml Äthanol, zweimal 20 ml Aceton und zweimal 25 ml Diäethyläther gewaschen wurden und an der Luft unter Bildung von 2,275 g des Lithiumsalzes in Form von länglichen flachen Prismen (E=770) getrocknet wurden.

Beispiel 4

7,99 g rohes Bariumsalz (E=288), hergestellt wie im Herstellungsverfahren 2 beschrieben, wurden in 60 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde anschließend portionsweise mit 4,0 g Lithiumsulfat unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt, bis sich kein Test mehr für Barium auf einer separaten Testplatte mit Natriumrhodizonat ergab. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren geklärt, und die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und unter vermindertem Druck auf etwa 35 ml abgesiedet. 9,0 g Lithiumchlorid wurden portionsweise unter Rühren und Kühlen zugesetzt; nach 1 Stunde bei 0°C wurde das Lithiumsalz durch Filtrieren gewonnen, mit 10 ml Äthanol, 2×25 ml Aceton und 2×20 ml Diäthyläther gewaschen und an der Luft im Filtertrichter getrocknet, wobei man 1,590 g weiße Prismen erhielt (E= 790).

Beispiel 5

Eine Probe des Entfärbungskohleeluats, hergestellt wie beim Herstellungsverfahren 3, wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons konzentriert. Das resultierende Konzentrat (1 l enthaltend 1,28 g Clavulansäure, bestimmt durch Biountersuchung) wurde auf eine Säule von 100 ml IRA 68-Harz (Chloridzyklus) aufgebracht. Die Säule wrude mit 300 ml Wasser gewaschen und mit 5%iger (Gew./Vol.) wäßriger Lithiumchloridlösung eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 ml gesammelt wurde.

Die Fraktionen 1 und 2 wurden vereint (200 ml), unter vermindertem Druck auf 40 ml verdampft und bei 4°C über Nacht stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, nacheinander mit 10 ml Äthanol, 50 ml Aceton und 50 ml Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 530 mg eines weißen Feststoffes erhielt (E 802), was eine 40,8%ige Ausbeute aus dem Kohleeluat darstellt. Durch Zugabe eines gleichen Volumens an gesättigten wäßrigen Lithiumchlorid zu den Mutterlaugen, gefolgt von Stehenlassen bei 4°C erhielt man einen zweiten Anschuß, der wie vorstehend aufgearbeitet 178 mg (E 740) ergab, was einer weiteren Ausbeute von 12,7% entspricht.

In einer Reihe von gleichen Untersuchungen wurden die Konzentration des Lithiumchlorideluiermittels, des Ionenaustauscherharzes und die Natur des eluierenden Kations und des Gegenanions variiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:

Beispiel 6

Eine Probe von 4 l von Kohleeluat, hergestellt wie im Herstellungsverfahren 3, wurde durch eine Säule von IRA 68 (Chloridzyklus 250 ml) nach unten geleitet, die anschließend mit Wasser (250 ml) gewaschen wurde und mit 5%iger (Gew./Vol.) Lithiumchloridlösung eluiert wurde. 200 ml des Eluats, die 73% der eingesetzten biologischen Aktivitäten enthielten, wurden gewonnen. Eine Probe von 70 ml dieses Eluats wurde mit 5 Volumen von Propan-2-ol unter Rühren behandelt, wobei man einen teerartigen Niederschlag erhielt. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und unter vermindertem Druck auf 7 ml konzentriert. Nach Stehen über Nacht bei 4°C wurde das kristalline Produkt abfiltriert, nacheinander mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Durch biologische Bewertung wurde angenommen, daß der trockene Feststoff (870 mg) rein war und eine Ausbeute von 94% des Harz-Säulen-Eluats darstellte.

Beispiel 7

Eine Säule von 50 ml IRA 68-Harz (Chloridzyklus) wurde mit 840 ml Kohleeluat (gemäß Herstellungsverfahren 3) beschickt, mit 100 ml Wasser gewaschen und mit 5%igem (Gew./Vol.) Lithiumchlorid in Propanol-2-ol zu Wasser (5 : 1) eluiert. Die ersten fünf Bettvolumen wurden unter vermindertem Druck konzentriert und das Antibiotikum wurde wie in Beispiel 6 kristallisiert. Der Feststoff wog 292 mg (Biountersuchung 970 mg Lithiumclavulanat/mg Feststoff) und stellte eine Ausbeute von 45% des Kohleeluats dar.

Beispiel 8

Eine Brühe wurde wie in Herstellungsverfahren 3 fermentiert und filtriert, und eine Probe der filtrierten Brühe von 1 l, die 0,43 g Clavulansäure (biologische Untersuchung) enthielt, wurde durch eine Säule von 100 ml IRA 93-Harz (Chloridzyklus) abwärts geleitet. Die Säule wurde mit 200 ml verdünnter Essigsäure (0,25 m) und 750 ml Wasser gewaschen und mit 1 m wäßriger Lithiumchloridlösung eluiert. Die ersten 150 ml des Eluats, die 0,28 g Clavulansäure enthielten (biologische Untersuchung) wurden unter vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert und über Nacht bei 4°C gehalten. Das Produkt wurde filtriert, nacheinander mit Äthanol Aceton und Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 668 mg Feststoff (E 245) erhielt, was einer Ausbeute von der filtrierten Brühe von 47% entsprach.

Beispiel 9

Wie bei der Herstellung 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert, und eine Probe der filtrierten Brühe (2 l), die 1,23 g Clavulansäure enthielt (biologische Untersuchung), wurde abwärts durch eine Säule von 240 ml IRA 93-Harz (Chloridzyklus) geleitet. Die Säule wurde mit 500 ml Wasser, 400 ml Propan-2-ol zu Wasser (5 : 1) gewaschen und anschließend mit 5%igem (Gew./Vol.) Lithiumchlorid in Propan-2-ol zu Wasser (5 : 1) eluiert. Die ersten 970 ml des Eluats wurden unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert und 2 Tage bei 4°C gehalten. Das Produkt wrude filtriert und wie in Beispiel 8 gewaschen, wobei man 286 mg Feststoff (E 662) erhielt, was ener Ausbeute von der filtrierten Brühe von 19% entsprach.

Beispiel 10

Wie im Herstellungsverfahren 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert, und 500 ml des Filtrats wruden auf 50 ml IRA 93 (Chloridzyklus) beladen. Die Säule wurde mit 50 ml Wasser und 100 ml 95%igem wäßrigem Äthanol gewaschen, worauf mit Lithiumchlorid (1% Gew./Vol. in 95% wäßrigem Äthanol; 50-ml-Fraktionen) eluiert wurde. Die Fraktionen 2 und 3 wurden vereint und unter vermindertem Druck bis zur beginnenden Auskristallisation eines Feststoffs verdampft. Das Konzentrat wurde 3/4 Stunden bei +4°C gekühlt, und der Feststoff wurde auf einem Sinterfilter gesammelt. Der Feststoff wurde mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und 1/2 Stunde bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen getrocknet, wobei man 89 mg Lithiumclavulanat (E 770) erhielt, was 32%, bezogen auf die filtrierte Brühe, entsprach.

Beispiel 11

5 l des wie im Herstellungsverfahren 3 hergestellten Kohleeluats wurden abwärts durch ein Bettvolumen von 500 ml IRA 68 im Chloridzyklus mit einer Rate von 1 l/Stunde geleitet. Die Säule wurde mit 1 l Wasser gewaschen und mit 0,5 m Natriumchloridlösung eluiert. Der erste Liter des Eluats wurde durch Rotationsverdampfen auf 90 ml konzentriert. Ein Teil des Konzentrats von 10 ml wurde mit 50 ml Propan-2-ol unter Rühren behandelt. Die überstehende Lösung wurde von der teerigen Ausfällun, die sich gebildet hatte, abdekantiert, durch Rotationsverdampfen auf ein Volumen von 3 ml eingeengt und mit 3 ml 30%iger (Gew./Vol.) Lithiumchloridlösung behandelt. Nach Stehen über Nacht bei 4°C wurde das Produkt filtriert, nacheinander mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und getrocknet, wobei man 280 mg eines weißen Pulvers vom E 770 erhielt.

Beispiel 12

2,0 g Lithiumclavulanat (E 667), hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, mit anschließender Behandlung mit Isopropylalkohol, wurden in 16 ml Wasser gelöst und filtriert. 64 ml Äthanol wurde sorgfältig zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Der zunächst erhaltene Niederschlag enthielt kein Lithiumclavulanat, was durch UV-Spektroskopie bestimmt wurde, und wurde verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 16 m gesättigter Lithiumchloridlösung verdünnt und 2½ Stunden zur Kristallisation abgestellt. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen, trocken gesaugt, mit 2×15 ml Aceton und 2×20 m Diäthyläther gewaschen und im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet (1,350 g, E=735).

Der hier verwendete Stamm Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 ist beim United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt und ist der Öffentlichkeit frei zugänglich.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Clavulansäure der Formel I und ihre Salze, herstellbar durch Fermentieren von Streptomyces clavuligerus, Stamm NRRL 3585, bei einer Temperatur von 25 bis 30°C und einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 7,5 unter Bewegen und Belüften, Entfernen von Feststoffen aus der Fermentationsbrühe und gegebenenfalls Anreicherung der Clavulansäure und/oder ihrer Salze durch Absorption an Absorptions- bzw. Aktivkohle oder an einem Ionenaustauscherharz und anschließende Desorption bzw. Eluierung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säure und/oder das Salz bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8 mit einer wäßrigen Lösung einer ionischen Lithiumverbindung umsetzt und aus der dabei erhaltenen wäßrigen Lösung das Lithiumclavulanat durch Aussalzen oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels in sehr hohen Konzentrationen ausfällt, den Niederschlag aus der wäßrigen Lösung abtrennt und das Lithiumclavulanat anschließend gegebenenfalls in ein anderes Salz der Clavulansäure oder in Clavulansäure umwandelt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu reinigendes Clavulansäuresalz das mit den Ankergruppen eines basischen Ionenaustauscherharzes gebildete Salz (Harzsalz) einsetzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Harzsalz mit der wäßrigen Lösung einer ionischen Lithiumverbindung kontaktiert und das wäßrige Eluat vom Harz abtrennt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lithiumclavulanat enthaltende wäßrige Eluat, das auch noch überschüssige ionische Lithiumverbindung enthält, aufkonzentriert und hierdurch das Lithiumclavulanat aussalzt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluierungsmittel eine wäßrige Lösung einer ionischen Lithiumverbindung verwendet, die außerdem ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Ausfällen des Lithiumclavulanats zu dem Eluat ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zusetzt und die ausfallenden Verunreinigungen abtrennt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser mischbares Lösungsmittel Isopropylalkohol oder Äthanol einsetzt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für das Aussalzen eine molare Konzentration eines wasserlöslichen Lithiumsalzes im Bereich von 4 m bis 10 m und vorzugsweise von 5 m bis 8 m verwendet.